moleculară
definitie, istoric, organisme model,
descoperirea rolului genetic al acizilor
nucleici
Biologia moleculară este ramura biologiei care se ocupă cu studierea structurii si
functiei genelor în cadrul celulei, la nivel molecular.
• Este un mamifer
• Se creşte uşor în laborator, se reproduce rapid
obţinându-se mai mulţi descendenţi de la acelaşi cuplu
ceea ce permite studiul apariţiei şi transmiterii anumitor
însuşiri
• Prezintă un grad înalt de omologie cu organismul uman,
multe dintre genele murine având omologie structurală şi
funcţională cu gene umane
• În anul 2002 a fost comunicată secvenţa completă de
nucleotide a genomului său
• În prezent există numeroase organisme mutante, obţinute
prin tehnici clasice de ameliorare (de ex.
Immunodeficient nude mice, fără păr şi timus ceea ce
înseamnă cu el nu produce limfocite T şi nu manifestă
răspuns celular imun – sunt utili pentru cercetări în
imunologie şi transplant;
• Severe combined immunodeficient (SCID) la care
sistemul imunitar lipseşte aproape complet) sau prin
tehnici de inginerie genetică: şoareci de dimensiuni foarte
mari ca urmare a integrării în genomul lor a genei pentru
hormonul de creştere de la şobolan;
• Oncomice la care a fost activată o oncogenă ceea ce
determină o incidenţă crescută a apariţiei cancerului;
• Doogie mice care prezintă o îmbunătăţirea a memoriei
şi a capacităţii de învăţare;
• knockout mice la care o genă specifică a fost inactivată
– animalele sunt utilizate în studiile legate de stabilirea
funcţiilor unei gene sau a produsului codificat de aceasta
sau pentru simularea unei boli umane).
Peştele zebră (zebrafish, Danio rerio)
adenina (A), guanina (G), timina (T) şi citozina (C), în structura ADN,
adenină (A), guanină (G), uracil (U) si citozina (C), în structura ARN.
Cei cinci atomi de carbon ai pentozei sunt numerotați cu: 1’, 2’, 3’, 4’ si 5’.
Deoxiriboza are un oxigen mai puțin decât riboza
Structura nucleosidelor
Acidul fosforic se află sub formă de ortofosfat conferind moleculei caracterul
acid şi numeroase sarcini negative.
• Datorită acestor sarcini, acizii nucleici sunt molecule puternic ionizate.
In vivo, la eucariote sarcinile negative sunt neutralizate de histone în timp ce la
procariote neutralizarea se face cu ajutorul unor proteine asemănătoare
histonelor (“histone-like proteins”).
o extremitate 3’-OH
Această particularitate implică
existenţa unei polarităţi a catenei
polinucleotidice.
Prezenţa legăturilor fosfodiesterice
internucleotidice conferă catenei un
grad important de flexibilitate care
permite realizarea structurilor
secundare şi terţiare ale moleculelor,
cu semnificaţie funcţională.
Structura secundară a moleculei
ADN (modelul Watson-Crick)
• Rezultă din asamblarea coaxială a două catene
polinucleotidice prin înfăşurarea lor, una în jurul
celeilalte şi cu orientare spre dreapta.
Principiul complementarităţii şi
Principiul antiparalelismului.
PRINCIPIUL COMPLEMENTARITĂŢII
Fenomenul de complementaritate este determinat de faptul că cele două catene
polinucleotidice sunt menţinute împreună prin legături de hidrogen intercatenare,
care se stabilesc între bazele azotate:
• astfel ca, secvenţa bazelor din una dintre catene specifică obligatoriu secvenţa
bazelor în catena opusă, cele două catene ale ADN avand astfel secvenţe
complementare.
Principiul complementaritatii : secvenţa bazelor din una dintre catene
specifică obligatoriu secvenţa bazelor în catena opusă
Spre deosebire de ARN , care este format de regula dintr-o singura catena
polinucleotidica, ADN este alcatuit din 2 catene antiparalele legate intre ele
intotdeauna printr-o legatura intre o baza azotata purinica si una pirimidinica.
Datorită acestui fapt legăturile G-C sunt mai stabile, ceea ce influenţează proprietăţile
fizice, chimice şi biologice ale moleculei.
Stă la baza unor procese fundamentale cum sunt cele de recombinare genetică şi de
reparare a leziunilor ADN produse de factorii de mediu.
PRINCIPIUL ANTIPARALELISMULUI
Pentru scrierea unei secvenţe de baze dintr-o anumită moleculă de ADN există o
anumită convenţie:
Dpdv al structurii chimice molecula de ADN dublu catenară este stabilizată de cel
puţin trei categorii de forţe:
LEGĂTURILE DE HIDROGEN
• asigură împerecherea bazelor si, cu toate ca sunt slabe, contribuie la stabilizarea
moleculei datorită numărului lor mare (energia necesară pentru ruperea acestor legături
de hidrogen este de ~ 5,6 cal/mol);
INTERACŢIUNILE ELECTRONICE: legăturile Van der Waals şi atracţiile dipol-
dipol dintre planurile bazelor suprapuse
părţile hidrofile ale moleculei (pentoza + fosfat) sunt îndreptate spre exteriorul dublei
elice, iar cele hidrofobe (bazele azotate) sunt situate spre interiorul ei, conferind
maximum de stabilitate moleculei.
Masa moleculară şi dimensiuni
Sub raportul masei moleculare sunt cele mai
mari molecule din sistemele vii,
ajungând la 107 – 4 x 109 daltoni. Genome Sizes (in base pairs)
In cazul ADN viral acesta poate conţine
câteva sute de perechi de baze, iar ADN SV40 (monkey 5,243
al bacteriei Escherichia coli are virus)
aproximativ 4 milioane de perechi de
baze. Lambda 48,502
La om lungimea ADN per complement (bacterial virus)
haploid (genom, n = 23 cromozomi),
corespunde la 3,3 x 109 perechi baze sau Escherichia coli 4,639,221
3,3 x 106 Kbaze = 1m lungime. (bacterium)
Dacă ţinem cont că în organismul uman
există aproximativ 1013 celule diploide şi Saccharomyces 12,070,521
se calculează lungimea totală a ADN cerevisiae
conţinut în aceste celule, se poate ajunge (yeast)
la o valoarea astronomică, de ordinul Human 2.9 billion
diametrului sistemului solar (Elliott şi
Elliott, 1997).
Conformaţia moleculară a moleculelor poate fi
determinată prin utilizarea electroforezei în gel de
agaroză şi a microscopiei electronice.
Moleculele de ADN dublu catenar pot suferi modificări ale proprietăţilor lor fizice
ca rezultat al acţiunii unor factori fizici sau chimici.
Temperatura ridicata;
pH ridicat
• Iniţial, cele două catene se derulează parţial dar rămân reunite prin anumite
segmente dublu catenare în care bazele continuă să formeze perechi.
• Când temperatura a atins punctul de topire are loc separarea completă a celor
două catene.
Temperatura de denaturare este influenţată de mai mulţi factori dintre care cel
mai important este proporţia de GC.
Temperatura de topire este cu atât mai mare cu cât procentul GC este mai ridicat.
Dacă soluţia de ADN denaturat este răcită brusc, catenele complementare rămân
separate, ceea ce înseamnă că procesul de denaturare a devenit permanent.
În schimb, dacă răcirea este lentă, are loc procesul de refacere a legăturilor de hidrogen
dintre bazele complementare ale catenelor şi deci refacerea moleculelor dublu
catenare.
PCR are la baza o tehnologie in vitro care imita capacitatea naturala de replicare a
ADN si care consta in generarea rapida a unor copii multiple a unei secvente
nucleotidice tinta (ADN sau ARN) dintr-o gena de interes .
• Tehnologia PCR care este folosită într-o varietate foarte mare de domenii: biologie
moleculară, ştiinţele mediului, criminalistică, ştiinţe medicale, biotehnologie,
microbiologie, industria alimentară, epidemiologie etc.
• Din punct de vedere chimic, reacţia PCR este constituită din cicluri succesive de
replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizează cu cele
2 catene ale secvenţei originale (folosită ca matriţă în replicare).
O reacţie PCR este formată din n cicluri (între 25 şi 40), în fiecare ciclu fiind
parcurse 3 etape principale:
• denaturarea termică a matriţei (deci, desfacerea dublului helix ADN),
• ataşarea primerilor şi polimerizarea propriu-zisă.
La terminarea unui ciclu de replicare in vitro (de amplificare), cantitatea de ADN
rezultată este dublă faţă de matriţă. Mai mult, produsele rezultate într-un
ciclu sunt folosite ca matriţă în ciclul urmator.
Este de subliniat faptul că moleculele acumulate exponenţial reprezintă copii
ale matriţei care la capete au incorporaţi primerii.
Produsul de reactie este analizat apoi in gel de agaroza.
• In concluzie, reacţia PCR este o metodă prin care se obţin cantităţi mari
dintr-o anumită secvenţă ADN.
2. Tehnica Southern Blot.
Acest procedeu tehnic a fost imaginat în 1975 de către Edward M. Southern.
• Este o metoda utilizata in biologia moleculara pentru detectia unei secvente specifice de ADN
dintr-o proba. Metoda permite localizarea unei gene specifice dintr-un genom (Khalsahttp,
2000)
• Vizualizarea hibrizilor ADN-ADN este posibilă deoarece fragmentul de ADN utilizat este
întotdeauna marcat (cu izotopi radioactivi sau cu fluorocromi sau/şi enzime).
Vizualizarea se realizeaza prin autoradiografie (raze X).
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/southBlotg.html
• Tehnica Northern Blot.
Această metoda a fost numită
arbitrar faţă de numele lui
Southern.
• Cu excepţia etapei de denaturare
care nu este necesară (ARN
fiind monocatenar) blotarea de
tip Northern se petrece
asemănător metodei Southern.
Deosebirea mai consta din
faptul ca molecula tinta nu este
ADN ci ARN.
ORGANIZAREA
MATERIALULUI GENETIC
Cromozomii sunt structuri genetice ce contin materialul genetic.
Termenul de genom se refera la setul complet de material genetic dintr-un compartiment celular
special.
Pentru bacterii, genomul este de obicei un singur cromozom circular.
Pentru eucariote, genomul nuclear se referă la un set complet de cromozomi care se află în
nucleul celular.
In afara de genomul nuclear, eucariotele mai au un genom mitocondrial, iar plantele au un genom
cloroplasmatic.
Sistemele biologice cuprind două tipuri fundamentale de organizare:
acelulara (virala) si
celulara – procariotă si eucariotă.
Caracteristici generale:
organizare simplă, acelulară;
sunt paraziti intracelulari obligatorii;
cei mai multi gazda-specifici (specificitatea de gazda este determinata de situsuri specifice de
atasare ale gazdei si de factori celulari)
Virusurile nu conţin echipament enzimatic de biosinteză şi catabolism, deci nu au
metabolism; In afara celulei virusurile sunt inerte.
Nu cresc, nu se divid, iar multiplicarea este strict dependentă de celula gazdă infectată;
Virusurile pot exista în mai multe stări:
virion sau virus infecţios matur;
virus vegetativ sau genom viral -liber în citoplasma celulei infectate; poate fi replicat cu ajutorul
echipamentelor enzimatice ale gazdei; faza vegetativă este neinfecţioasă;
provirus sau genom viral integrat în cromosomul celulei gazdă; nu este patogen;
Virionul (particula virală completă) – ca unitatea de structură şi funcţie- este alcătuit din:
o capsidă proteică alcatuita din capsomere (uneori completată cu un înveliş suplimentar extern-anvelopa)
de forme variate şi
niciodată împreună.
Cu simetrie helicala. Multe astfel de virusuri sunt anvelopate- de exemplu Influentza virus;
• Anumite tipuri de virusuri au mecanisme specifice prin care produc o cantitate mai
mare de ARNm, ceea ce conduce la o economie semnificativă de material genetic.
S-a dovedit insa, că acesta determină sinteza a 11 proteine virale diferite, ceea ce
înseamnă că, la nivelul genomului său există gene suprapuse (de fapt mai multe
cadre de citire cu situsuri de iniţiere diferite), fapt constatat si in cazul altor
virusuri, precum:
Bacteriofagul φ X174
parvovirusurile (virusuri animale care au genom ADN monocatenar),
• Genomul viral conţine informaţia genetică necesară pentru propria replicare şi pentru devierea
metabolismului gazdei în sensul sintezei constituenţilor virali (echipamentul enzimatic necesar
replicării genomului viral, transcrierii genelor virale şi sintezei proteinelor virale) şi a asamblării
noilor particule virale.
• Particula virală rezultă din autoasamblarea componentelor sale moleculare sintetizate de celula
gazdă pe baza instrucţiunilor înscrise în acidul nucleic viral.
• Etapele replicarii virale sunt:
1. Atasarea (adsorbtia) la receptorii specifici de pe suprafata celulara;
2. Patrunderea in celula gazda:
Virusurile neanvelopate patrund printr-un proces de pinocitoza sau fagocitoza
https://www.youtube.com/watch?v=HhhRQ4t95OI
• O atenţie specială a fost acordată virusurilor cu genom ARN segmentat; se pare că
fiecare segment codifică pentru un anumit tip de proteine.
• In majoritatea cazurilor, fragmentele de ARN genomic sunt închise în aceeaşi capsidă,
chiar dacă este vorba de 10-12 segmente.
• De ex. virusul gripal al cărui genom este alcătuit din 8 segmente de ARN
monocatenar, reunite în aceeaşi capsidă.
• Aceştia reprezintă cele mai mici particule infecţioase, mai mici decât cel mai simplu virus, ei fiind alcătuiţi din câte o
moleculă de ARN “nud”, neasociat cu nici un fel de proteine.
• Spre exemplu, viroidul ce determină infecţii severe la cocotier este alcătuit dintr-o moleculă de ARN formată din 246
ribonucleotide, ea prezentând regiuni bicatenare ce alternează cu regiuni monocatenare (datorită formării de
legături de hidrogen intracatenare)
Infectarea celulelor vegetale depinde de existenţa unor răni la nivelul unor organe ale gazdei.
Prionii
Particule infectioase de natura proteica. Sunt transmisibile prin ingestie, transplant, instrumente chirurgicale
Cauzeaza encefalopatii spongiforme:
- scrapia oilor,
- Boala Creutzfeldt-Jakob
- Boala vacii nebune etc.
Izolarea, Cultivarea si Identificarea Virusurilor
Virusurile ce infecteaza celulele animale trebuie sa fie cultivate in culturi de celule animale sau in animale vii.
Identificarea Virusurilor
Efecte citopatice
Teste serologice
Identificarea anticorpilor la pacient
Utilizarea anticorpilor pentru identificarea virusurilor (teste
Elisa, de hemaglutinare, Western blot)
Identificarea tipului de genom viral (ADN/ARN) prin tehnici
moleculare (RFLP, PCR)
Metode noi de identificare (metoda biofotonica)
ORGANIZAREA CELULARĂ – GENOMUL PROCARIOT
• Elementele genetice extracromozomale sau elemente genetice accesorii (EGA) sunt reprezentate de:
plasmide,
secvenţe de inserţie (SI),
transpozoni (Tn) şi
de unii bacteriofagi
• Comparativ cu informaţia genetică cromozomală, elemente genetice accesorii prezintă anumite proprietăţi:
Includ informaţie genetică accesorie, neesenţială pentru reproducerea organismului purtător (unele dintre ele
nu conferă nici o proprietate detectabilă);
Sunt capabile de replicare (şi chiar suprareplicare) independentă faţă de cromozomul bacteriei purtătoare.
Plasmidele
• Plasmidele sunt molecule de ADN dublu catenare, covalent închise sau, în anumite cazuri lineare, care conţin
informaţie genetică suplimentară pentru bacteriile posesoare.
• Plasmidele sunt spaţial separate de cromozom, au capacitatea de a se replica autonom faţă de acesta şi pot fi
perpetuate stabil în această stare
• Reprezintă 1-2% din cromozomul bacterian putand fi considerate “cromozomi miniaturali”.
Plasmidele conţin informaţie genetică neesenţială pentru creşterea normală a celulelor gazdă, ele putând fi
pierdute sau dobândite fără să afecteze viabilitatea celulei gazdă.
• Masa moleculară a plasmidelor variază în limite foarte largi: de la 1,5 x 106 Da până la 150 x
106 Da sau chiar mai mult la unele plasmide mari.
• Cercetări recente au arătat că proprietăţile de nodulare şi fixare a azotului la bacteriile din
genul Rhizobium sunt determinate de gene localizate pe plasmide mari (megaplasmide) ce ajung la
400-450 Mda.
Plasmidele poartă de multe ori gene care conferă trăsături avantajoase bacteriei gazda, cum ar
fi:
Rezistența la antibiotice, rezistența la metale grele, sinteza de antibiotice, sinteza de
bacteriocine, metabolizarea unor compusi (lactoza, sucroza etc.), fixarea azotului
(plasmidele Nif de la Rhizobium -proprietăţile de nodulare şi fixare a azotului la bacteriile din
genul Rhizobium sunt determinate de gene localizate pe plasmide)
inducerea de tumori la plante cum ar fi plasmidele Ti de la Agrobacterium tumefaciens si
plasmidele Ri de la Agrobacterium rhizogenes.
Exista mai multe tipuri diferite de plasmide: plasmide F (de fertilitate), plasmide R (de
rezistenta), plasmide virulente, plasmide metabolice etc. toate acestea fiind importante
pentru supraviețuirea organismului.
Plasmidele sunt denumite şi clasificate în general, după efectul cel mai evident produs asupra
celulelor gazdă.
• Plasmidele sunt utilizate frecvent în tehnologia ADN recombinant ca vectori
de clonare a unor gene de interes.
• In acest scop, plasmidele trebuie sa conțina trei componente:
o origine a replicării,
un polilinker pentru clonarea genei de interes (numit situs de clonare multipla
pentru enzimele de restricție) și
o genă de rezistență la antibiotice (ca marker selectabil).
Un exemplu de plasmidă folosită ca vector de clonare a ADN este plasmida
numită pUC18.
Această plasmidă conține:
• o genă care ii confera celulei gazdă rezistența la ampicilină.
• o gena care îi permite să producă beta-galactozidază, o enzimă care
degradează anumite zaharuri.
Enzima produce un pigment albastru atunci când este expusa unui substrat
analog specific.
Acest lucru permite celulelor recombinante să fie ușor identificate și izolate.
Elementele genetice transpozabile de la bacterii
• Elementele genetice transpozabile (EGT), (denumite si gene saritoare sau secvente mobile de ADN)
reprezinta segmente de ADN capabile să se replice în mod independent și să-si introducă copiile într-o
nouă poziție fie pe acelaşi cromozom, fie pe cromozomi diferiţi, proces numit transpunere.
• Rezultatul este modificarea constitutiei genetice a organismului.
• Iniţial, au fost identificate, in anii 1940, la porumb (Zea mays) de către Barbara McClintock, care a
observat pigmentarea boabelor.
• Elementele genetice transpozabile au fost evidenţiate şi alte organisme (bacterii, fungi, insecte, plante,
mamifere). De exemplu, in organismul uman ele reprezintă cel puțin 50% din ADN.
• Cele mai simple elemente genetice transpozabile sunt secvenţele de inserţie (SI) - sunt secvente de
dimensiuni mici (aproximativ 800 perechi de baze).
• Secventele de insertie codifica doar proteinele necesare pentru a-și asigura propria transpozitie (de
exemplu, gena pentru transpozază, enzima ce catalizează procesul de transpoziţie).
• Secvenţele de inserţie sunt flancate de segmente de nucleotide terminale repetate inversat (lungi de 9-41
pb) (Figura ), care servesc drept situsuri de recunoaştere pentru transpozază.
• Mecanismele de transpoziţie
• au fost descrise două mecanisme de transpunere a SI: replicativă sau conservativă.
• În transpoziția replicativă, o copie a elementului transpozabil este inserată la nivelul unui nou locus, în timp ce
vechea copie rămâne la locusul iniţial; astfel, numărul de copii ale elementului transpozabil crește.
• În transpoziția conservativă, elementul transpozabil este excizat din locusul iniţial şi apoi este inserat la nivelul
unui nou locus, astfel încât numărul de secvenţe de inserţie per moleculă de ADN nu se modifică.
• Uneori, două secvenţe de inserţie alăturate pot prelua în timpul transpoziţiei segmente specifice de ADN
aparţinând cromosomului în care sunt integrate.
• Rezultă în acest fel un transpozon (Tn) ce conţine două secvenţe de inserţie marginale şi, în plus, gene
specifice ce conferă un fenotip decelabil celulelor purtătoare (de exemplu, rezistenţă la acţiunea unor
antibiotice cum ar fi ampicilină, kanamicină, cloramfenicol etc).
• De exemplu transpozonul Tn10 are o marime de 9,3 kb și include un ADN central de 6,5 kb (gena pentru
rezistența la tetraciclină) și doua elemente IS inversate de 1,4 kb.
• In alte cazuri transpozonii prezintă secvenţe terminale repetate care nu sunt însă secvenţe de inserţie
(de exemplu, transpozonul Tn3).
Materialul genetic este localizat într-un spaţiu delimitat de o membrană nucleară tipică,
dublu stratificată – NUCLEU;
Prin localizarea sa în nucleu, materialul genetic este separat de “sediul” sintezei proteice,
astfel ca transcrierea genetică nu mai este cuplată cu traducerea;
Pentru ca acest ADN să se potrivească în nucleu, sunt necesare împachetări și plieri extraordinare realizate în
urma complexării ADN cu alte componente moleculare, în primul rând, cu proteine bazice denumite
HISTONE.
Complexarea permanentă a ADN cromozomal cu histonele face ca, la eucariote, substanţa nucleară (cromatina) să
prezinte la nivel ultrastructural un aspect fibros.
– heterocromatina constitutivă formată din regiuni care nu sunt exprimate (transcrise), (aceasta
include sateliţii) si are un rol structural pentru cromozom.
– Deseori aceste secvenţe sunt concentrate la nivelul unor regiuni specifice, de obicei în jurul
centromerului;
– heterocromatina facultativă care ia forma unor cromozomi întregi în anumite tipuri celulare.
Cel mai cunoscut exemplu este cromatina sexuală ce reprezintă unul dintre cromozomii X de la
femelele de mamifere care se inactivează permanent, randomic, prin heterocromatinizare.
CLASELE DE SECVENŢĂ DIN ADN CROMOZOMAL EUCARIOT
• Tehnicile biochimice şi biofizice care implică secvenţierea (stabilirea ordinii nucleotidelor în molecula de ADN),
au pus în evidenţă un tip particular de secvente de baze ce apar de un anumit numar de ori in genom.
Există 3 tipuri distincte de secvenţe în ADN eucariot:
Secvenţe unice sau nerepetate, prezente într-o singură sau in cateva copii în genom.
sunt localizate la nivelul eucromatinei;
corespund genelor structurale ce codifică pentru sinteza proteinelor şi a genelor reglatoare adiacente.
Secvenţe moderat repetate
Sunt secvenţe simple, cu lungimea de 100-150 pb repetate de 102-105 ori în genom.
Sunt localizate la nivelul regiunilor de eucromatină;
Uneori, aceste secvente reprezinta copii multiple ale aceleasi gene cum ar fi de ex. genele ce codifica pentru
ARNr ce intra in structura ribozomilor, ARNt sau pentru histone.
Reprezintă aproximativ 30-60% din ADN total.
Secvenţe înalt repetate
Sunt secvențe foarte scurte, repetate în tandem; sunt prezente în sute de mii până la milioane de
exemplare;
Unitatea de repetiţie este formată dintr-un număr mic de nucleotide care sunt repetate de până la un
milion de ori per genom haploid;
Dacă aceste secvenţe sunt alcătuite din câteva zeci de nucleotide repetate sub formă tandemică se vorbeşte
despre microsateliţi.
Sunt localizate mai ales la nivelul heterocromatinei din regiunea centromerului, a telomerelor şi a
constricţiilor secundare.
PROTEINELE HISTONICE
ADN eucariot cu localizare nucleară este asociat în permanenţă cu proteine bazice denumite histone.
• Complexul nucleo-histonic rezultat se numeşte cromatină.
• Aceste proteine au încărcătură pozitivă şi interacţionează cu grupările fosfat ale ADN.
• Legarea histonelor la ADN:
se realizează prin intermediul unor legături ionice între grupările fosfat (- PO4) ale ADN şi grupările amino (- NH2) ale
histonelor si
nu are specificitate de secvenţă dar există anumite preferinţe de legare a resturilor de lizină la perechile A-T şi de arginină la
G-C.
• Asocierea ADN – histone este realizată în egală măsură la nivelul eucromatinei şi heterocromatinei, si a secvenţelor unice
sau repetitive din ADN.
PROTEINELE HISTONICE
au un rol structural în menţinerea şi controlul conformaţiei cromosomului
asigură reglarea genică grosieră.
acţionează ca represori ai activităţii genetice deoarece condensarea cromatinei şi superspiralizarea ADN determină inhibiţia
sterică a transcrierii, starea condensată a ADN nefiind propice pentru transcriere.
La eucariotele superioare, au fost descrise 5 tipuri de histone, care se pot separa prin cromatografie pe schimbători de
ioni: H1, H2A, H2B, H3 şi H4.
Cu excepţia histonei H1, toate celelalte histone se află în raport echimolar cu ADN.
Prin clonarea genelor pentru histone de la ariciul de mare în E.coli s-a demonstrat faptul că aceste gene pentru histone
sunt linkate, fiind localizate pe acelaşi segment de ADN (de aproximativ 7000 pb), ordinea acestor gene fiind:
H1 – H4 - H2B − H3 – H2A
• Acest tandem repetându-se de aproximativ 1000 ori, iar regiunile codificatoare sunt separate de secvenţe
spaţiatoare (necodificatoare) intergenice.
• Activarea acestor gene se realizează prin interacţiunea respectivelor segmente de ADN cu proteine nonhistonice
fosforilate care au probabil capacitatea de a recunoaşte specific aceste gene.
Sinteza histonelor se desfăşoară în citoplasmă şi odată sintetizate ele sunt transferate rapid în nucleu.
• Când sinteza ADN este blocată, producerea de histone scade şi ea rapid. Activarea acestor gene are loc prin
interacţiunea respectivelor segmente de ADN cu proteine nonhistonice fosforilate care au probabil capacitatea de
a recunoaşte specific aceste gene.
PROTEINELE NONHISTONICE SAU HERTONE
In afara histonelor, în structura cromatinei nucleare, intim asociate cu ADN, mai intră un grup heterogen de proteine
numite proteine nonhistonice sau hertone, bogate în aminoacizi cu caracter acid aşa cum sunt triptofanul şi
acidul aspartic.
Este un grup foarte heterogen şi numeros, cu peste 120 tipuri diferite, cu greutăţi moleculare cuprinse între 10.000 şi
150.000 Da.
Au specificitate de specie dar mai ales de ţesut, variind calitativ şi cantitativ în funcţie de intensitatea proceselor
metabolice ale ţesuturilor respective.
Sunt implicate în reglajul fin al activităţii genelor, prin interacţiunea lor cu histonele asigurând activarea
specifică a genelor care trebuie să funcţioneze la un moment dat. Activarea genelor se realizează în special prin
fosforilare.
Nonhistonele cuprind o serie de enzime ale metabolismului nuclear, cum ar fi: ADN-polimeraze, ARN-
polimeraze, NAD-sintetaze, nucleozid-trifosfataza, metilaze, fosfokinaze, proteine cu caracter contractil de tipul
miozinei, actinei, tubulinei (proteine implicate în “mişcările” cromosomilor).
Ca şi proteinele histonice, proteinele nonhistonice sunt sintetizate în citoplasmă şi apoi transferate în nucleu.
• Activitatea lor presupune interacţiuni complexe atât cu histonele cât şi cu ADN şi ARN.
Cromatina eucariotelor este alcatuita din unitati ce se repeta denumite NUCLEOSOMI cu o forma aproximativ
sferică si un diametru de 11 nm.
NUCLEOSOMUL reprezintă un corpuscul histonic asociat cu un segment de ADN de 146 pb, partea internă
corespunzând miezului globular histonic.
- O zona bazală, tetrameră constituită din 2H3 şi 2H4, deasupra căreia este localizată cealaltă
• Cercetările de citogenetică efectuate la Drosophila melanogaster au evidenţiat faptul că, în celulele glandelor
salivare ale larvelor există un tip special de cromozomi ce au primit denumirea de CROMOZOMI POLITENI.
• In anumite condiţii anormale sau sub acţiunea unor factori mutageni care afectează funcţiile celulare, replicarea
cromosomilor nu este urmată de replicarea nucleului şi de diviziunea celulară ceea ce are drept consecinţă
formarea DIPLOCROMOZOMILOR, care nu se separă.
• Acest proces determină dublarea, triplarea, multiplicarea cantităţii iniţiale de ADN fenomen cunoscut sub numele
de ENDOCICLU.
• De exemplu, endocicluri apar la înţeparea plantelor de către unele insecte sau în cazul infecţiilor virale sau cu
micoplasme, urmate de formarea galelor sau a altor malformaţii.
• Aşa este cazul glandelor salivare de la larvele de diptere ca şi în cazul glandelor sericigene de la viermele de
mătase, endociclurile respective ducând la formarea cromozomilor uriaşi sau politeni.
Cromozomii politeni se formează în timpul interfazei, în anumite celule specializate (glande salivare de la
larve de diptere, la angiosperme, protozoare) în cursul unui proces ce presupune mai multe evenimente.
Astfel,
• In celulele glandelor salivare ale larvelor de Drosophila (2n=4), fiecare cromozom este supus unui ciclu de
replicări mitotice (10 cicluri);
• In aceste replicari, cromatidele rezultate nu se mai separa deoarece nici celulele în care se desfăşoară
fenomenul (celulele glandelor salivare) nu se mai divid (la începutul metafazei ele degenerând); fenomenul
de acest tip se numeşte ENDOMITOZA sau ENDOREDUPLICARE.
• Cei patru cromozomi de politeni sunt uniti între ei prin regiunile apropiate de centromerii lor, formand
un punct central numit CROMOCENTRU.
• Endoreplicarea apare în celulele glandelor salivare larvare ale multor specii de Diptera și crește
producția de ARNm pentru proteina adezivă pe care larvele o utilizează pentru a se ancora, de exemplu, de
pereții vaselor de cultură.
• La microscopul optic, la nivelul fiecărui cromozom politen
pot fi observate numeroase benzi întunecate ce alterneaza cu
benzi mai clare - interbenzi.
• Benzile transversale întunecate (5149 benzi la Drosophila
melanogaster) ale cromozomilor politeni sunt constituite din
cromomerele tuturor fibrelor de cromatină (1024) aşezate
paralel; pe baza aspectului lor fiind alcătuită o aşa numita
hartă citologică.
• Benzile întunecate alternează cu cele clare într-un model ce
are specificitate de specie -reprezintă o caracteristică a
fiecărei specii.
• In cromozomii politeni aproximativ 95% din ADN este
prezent în benzi, iar restul de 5% se află în interbenzi.
• Aspectul microscopic al cromozomilor politeni
• http://annex.exploratorium.edu/imaging_station/galler
y.php?Asset=<I>Drosophila%20melanogaster</
Examinarea cromozomilor politeni a permis evidenţierea creşterii diametrului anumitor regiuni şi un aspect lax al acestora.
Explicatia:
Datorită activării unor gene de la nivelul cromomerelor, acestea se despiralizează şi capătă un aspect de fundă.
În funcţie de dimensiunea pe care o au acestea au fost numite PUFE (au dimensiuni mici) sau INELE BALBIANI
(cand au dimensiuni mai mari).
• Aceste zone reprezintă sediul unor bogate sinteze de ARN, astfel că pufele şi inelele Balbiani reprezintă sediul
transcrierii genetice la nivelul cromozomilor politeni.
• In cursul dezvoltării larvare, pufele apar şi dispar într-un mod caracteristic, specific de stadiul larvar şi de ţesut.
• Cromozomi politeni au mai fost descrişi la unele plante angiosperme, la protozoare şi chiar în celule maligne.
CROMOZOMII PERIE DE LAMPĂ (LAMPBRUSH)
• Axul principal al fiecărui cromozom de acest tip este format din două
filamente longitudinale care reprezintă cele patru cromatide.
prima categorie este ireversibilă (ei nu mai revin niciodată la forma iniţială), pe când cei
lampbrush sunt structuri reversibile (după ce îşi îndeplinesc funcţia de sinteza intensă de ARNr
sau alte tipuri de ARN revin la forma normală de bivalenţi)
https://www.biologyexams4u.com/2012/11/lamp-brush-
chromosomes.html#.XI6FkigzbDc
GENELE SI STRUCTURA LOR
MOLECULARA
DEFINITIA GENEI
Noţiunea de genă a fost introdusă în 1909 de către geneticianul olandez W. Johannsen, ea înlocuind-o pe cea de
factor ereditar folosită de G. Mendel elaborata in a 2 –a jumatate a secolului 19.
Genele controlează toate aspectele vieţii unui organism, codificând produşi care sunt responsabili pentru
dezvoltarea, reproducerea, metabolismul etc. unui organism.
Genele sunt reprezentate de secvenţe specifice de nucleotide care determină diferitele caracteristici ale unui
organism.
Gena este unitatea de stocare a informației genetice, capabilă de a suferi replicare, exprimare, mutație și
recombinare.
• Genele sunt localizate pe cromozom, intr-o anumita pozitie numita locus.
• În cazul organismelor haploide (n) gena se gaseste într-un singur exemplar, iar
• la organismele diploide (2n) ea se afla sub formă de pereche numite gene alele, care pot fi identice
(homozigote) sau diferite (heterozigote).
• DEFINITIA GENEI
In conceptia clasica, gena reprezintă unitatea de bază a eredităţii, ea fiind plasată pe cromozom, într-un singur
exemplar în cazul organismelor haploide (n) sau sub formă de pereche (alele) la cele diploide (2n).
Genele prezentau 3 caracteristici de baza:
1. Unitate functionala – determina producerea unui anumit fenotip;
2. Unitate mutationala – prin care gena normala (tipul salbatic) se transforma, prin mutatie, in alela sau alelele
sale care afecteaza acelasi caracter;
3. Unitate de recombinare genetica – prin care genele de pe un cromosom se pot transfera pe cromosomul sau
pereche prin fenomenul de crossing- over.
In conceptia actuala
Gena poate fi definita drept un segment de ADN sau ARN (în cazul ribovirusurilor) format dintr-o anumita
secventa de nucleotide, care conţine informaţia genetică ce determină ordinea de succesiune a
nucleotidelor intr-o molecula de ARNm (transcriere genetica), respectiv a aminoacizilor dintr-o catenă
polipeptidică (traducere genetica) sau sinteza altor biomolecule (ARNr, ARNt, ARNsn etc).
Clasificarea genelor
Pe baza localizarii lor pe cromozomi (autozomi sau heterozomi), genele pot fi:
autozomale sau
heterozomale.
• Totalitatea materialului genetic al unui organism (ADN, ARN, gene, cromozomi) se numeste GENOM.
Numărul genelor din genomul unui organism (întregul set de cromozomi) variază semnificativ între specii.
De exemplu:
bacteria Mycoplasma genitalium are cel mai mic număr de gene, doar 517
Arabidopsis thaliana - are aproximativ 25.500 de gene; genomul său este unul dintre cele mai mici cunoscute
din regnul plantelor.
• Unul dintre cele mai importante concepte din genetică este distincția între insusirile unui organism și gene.
Insusirile unui organism nu sunt moștenite direct.
Genele sunt mostenite si, impreuna cu factorii de mediu, determina expresia insuririlor organismului
respectiv.
Informația genetică pe care o posedă un organism individual reprezinta genotipul său, care, pe baza
interactiunii cu factorii de mediu determina insusirile sale sau fenotipul său.
De exemplu, grupa de sânge A este un fenotip, iar informațiile genetice care codifică antigenul de tip A din
sânge reprezinta genotipul.
Genotipul unui organism reprezinta setul de gene pe care acesta îl are.
Fenotipul unui organism reprezinta toate caracteristicile sale observabile - care sunt influențate atât de
genotipul său, cât și de mediul înconjurător.
EXPRIMAREA GENEI
Atunci când este necesară producerea unui anumit produs - codificat de o gena, gena respectiva este
copiata printr-un proces numit transcriere.
Rezultatul procesului de transcriere (care are loc in nucleu) este o molecula de ARNm care poarta
mesajul genetic copiat.
ARNm trece apoi in citoplasma, la ribozomi, unde are loc convertirea mesajului genetic purtat de acesta
la o secvenţă de aminoacizi dintr-o catenă polipeptidică.
Sinteza proteinelor la nivelul ribozomilor, se realizeaza pe baza succesiunii codonilor din ARNm.
Acest proces poartă denumire de traducere.
Procesul prin care o genă este copiată şi apoi tradusa, determinand sinteza unui anumit produs, poartă
numele de exprimare a genei.
“O genă – o enzimă”
• G.W. Beadle si E.L. Tatum (1941) au elaborat pe baza unor cercetari experimentale ipoteza:
“o genă – o enzimă”
conform căreia o genă este responsabilă de producerea unei enzime sau a unui lanț polipeptidic.
s-a constatat că nu toate genele codifică o enzimă și că unele enzime sunt alcătuite din mai multe catene
polipeptidice codificate de două sau mai multe gene.
De exemplu, hemoglobina umana A este alcatuita din 4 catene polipeptidice identice 2 cate 2, (2α si 2β) ea
fiind codificata deci de 2 gene diferite.
• Un operon este alcatuit din una sau mai multe gene structurale legate la o gena operator.
• Operatorul conține codul necesar pentru a începe procesul de transcriere a mesajului, continut de genele
structural, în ARNm.
• Activitatea operonului este controlată de o genă de reglatoare, care produce o moleculă de proteină numită
represor.
La eucariote genele au o lungime mai mare iar numărul acestora nu mai este
corelat cu lungimea moleculei de ADN.
• Experimentele efectuate de Chambon în 1977 asupra genei ce codifică ovalbumina
din albuşul de ou de găină au evidenţiat că lungimea ARNm este mai mică decât
cea a genei corespunzătoare.
• Prin examinarea la microscopul electronic a hibrizilor moleculari ADN-ARNm
pentru ovalbumină s-au observat şapte bucle monocatenare la nivelul catenei de
ADN.
• Pe baza acestei descoperiri, Gilbert a propus în 1978
terminologia corespunzătoare pentru acest fenomen:
Secvenţele de nucleotide (portiunile din gena) ce sunt
transcrise în ARNm se numesc exoni, iar cele necopiate,
care sunt eliminate in cursul transcrierii, se numesc
introni.
• Termenul este folosit pentru a include grupuri de gene implicate în biosinteza catenelor diferite ale aceleiaşi proteine
sau a unor gene înrudite;
• Avantajul este că, al un moment dat se poate sintetiza o cantitate mai mare din anumite proteine, asigurându-se în
acest fel o adaptare mai eficientă la mediu.
• Termenul de pseudogene a fost inventat in 1977 (Jacq si colab., 1977) si se refera la gene nefuncţionale, silenţioase
care provin dintr-o genă ancestrală, comună cu alte gene înrudite, care aveau funcţii precise.
• Pseudogenele pot rezulta prin mutații ale unei gene ancestrale, comună cu alte gene înrudite functionale.
• De exemplu, în familia genelor pentru hemoglobină de la om există două pseudogene notate psiβ1 si psi β2 care
sunt inrudite ca structura cu genele normale dar care prezinta aberatii fiind astfel nefunctionale.
• Rolul acestor gene este de a participa la realizarea arhitecturii normale a cromozomilor şi de a acumula
mutaţii, constituind o adevărată sursă de variabilitate prin posibila dobândire a unor funcţii noi.
GENE SUPRAPUSE
• Genele suprapuse au fost descoperite la virusuri.
• Astfel, la bacteriofagul φ X174 care are genomul viral
reprezentat de ADN monocatenar cu 5.375 nucleotide, s-au
identificat 11 gene care au fost notate de la A până la K.
• Genele A si B determina sinteza a 2 proteine diferite si sunt
suprapuse, la fel si genele D si E.
• Deci, aceeaşi porţiune din ADN poate fi folosită pentru a
specifica două catene polipeptidice diferite.
Acelaşi fenomen a fost observat şi în cazul virusului SV40.
Avantajele acestui fenomen:
economia de material genetic cu păstrarea cantităţii sporite de
informaţie genetică.
Principalul dezavantaj:
este acela că o mutaţie care afectează o genă, afectează şi gena
suprapusă astfel că virusul poate să piardă însuşiri importante.
REPLICAREA SEMICONSERVATIVĂ
A ADN (sinteza ADN)
REPLICAREA SEMICONSERVATIVA A ADN
Pentru ca informatia genetica sa fie transmisa de la parinti la descendenti, materialul genetic trebuie
copiat.
Are loc in interfaza ciclului celular cand se produce dublarea cantităţii de ADN (in faza de sinteza)
cantitate care apoi revine la normal în urma diviziunii celulare.
In timpul acestui proces, numit “Replicarea ADN”, cele două catene ADN servesc fiecare drept model
sau matriţă pentru sinteza unei noi catene complementare care se numeşte REPLICĂ.
Moleculele de ADN nou formate vor avea fiecare o
catena veche, care a servit drept matrita, si o catena
nou sintetizata.
Ei eu dezvoltat o metoda experimentala pentru a deosebi catenele fiice nou sintetizate de cele parentale cu
ajutorul tehnicilor de separare a moleculelor de ADN, în funcţie de densitatea lor (prin centrifugare în
gradient de clorură de cesiu).
• Initial, ei au cultivat bacteria E. coli pe un mediu de cultură în care sursa unică de azot, clorura de amoniu
(NH4Cl), NU conţine azotul normal 14N ci izotopul greu al acestuia 15N.
• Dupa mai multe generaţii de cultura pe un astfel de mediu a rezultat o populatie celulara in care toate
moleculele de ADN contineau incorporat 15N in bazele azotate.
• La fiecare generatie (incepand cu generatia “0”) bacteriile erau trecute pe mediu normal, cu 14N.
• Dupa multiplicare, bacteriile contineau pe langa molecule de ADN originale, cu 15N incorporat, si
molecule de ADN nou sintetizate, cu 14N.
• Analizand densitatea de ADN prin centrifugare in gradient de CsCl, s-a constatat ca ADN replicat avea o
densitate intermediara intre 14N si 15N.
Reprezentarea schematică a experimentului lui Meselson şi Stahl de demonstrare a modelului de replicare semiconservativa a ADN
• Prin ultracentrifugarea ADN izolat de la ambele tipuri de bacterii (de la cele cultivate pe mediu
cu 14N şi respectiv de la cele cultivate pe mediu cu 15N) s-a evidenţiat prezenţa a mai multor tipuri
de ADN care sedimentează (formează benzi compacte) în tubul de centrifugă la niveluri diferite sub
forma unor benzi:
Daca ambele catene ADN contin 15N, apare o bandă “grea”, spre baza tubului de centrifugă
(densitate mare);
Daca ambele catene ADN contin 14N, apare o bandă “uşoară”, dispusă mai spre vârful tubului
(densitate mica).
Daca una dintre catenele ADN contine 14N iar cealalta 15N (densitate intermediara), apare o banda
intermediara.
• Celulele bacteriene care au desfăşurat un singur ciclu de diviziune prezintă un model de
bandare intermediar între cele ce au crescut pe mediu cu izotopul greu şi cele ce au crescut pe
mediu cu izotopul uşor al azotului.
• De aici s-a tras concluzia că acest ADN este un hibrid, având catena matriţă grea, iar replica
conţine izotopul uşor.
• Aceasta a fost prima dovadă experimentală la nivel molecular a modelului semiconservativ de
replicare a ADN
• La eucariote -prin aplicarea aceleiaşi metode de marcare a ADN - a permis evidenţierea
faptului că, după o rundă de replicare în prezenţa timidinei radioactive, fiecare moleculă de
ADN rezultată este alcătuită dintr-o catenă polinucleotidică radioactivă şi o alta neradioactivă.
• Dacă celulele eucariote sunt lăsate să realizeze încă o rundă de replicare în absenţa timidinei
marcate, celulele rezultate vor conţine două tipuri de molecule de ADN:
unele molecule vor fi “hibride” (cu o catenă radioactivă şi cealaltă neradioactivă), iar
alte molecule vor avea ambele catene neradioactive.
• Toate aceste rezultate experimentale indică faptul că, atât la procariote cât şi la eucariote,
replicare a ADN cromozomal este de tip semiconservativ.
Sinteza de noi molecule de ADN se realizează printr-un sistem de copiere unic în lumea macromoleculelor;
Replicarea este un proces caracteristic numai acizilor nucleici.
Structura acizilor nucleici este foarte potrivită pentru realizarea replicării lor: astfel dintr-o moleculă rezultă două
molecule fiice, identice între ele şi totodată, identice cu molecula iniţială.
Se asigură astfel:
reproducerea fidelă şi continuitatea fenomenului ereditar de-a lungul generaţiilor si
dublarea cantităţii de informaţie genetică (respectiv multiplicarea sistemelor biologice).
Cantitatea dublată de material genetic este repartizată în mod echilibrat, prin procesul diviziunii celulare, la cele
două celule fiice.
• Pentru ca procesul de replicare sa aiba loc sunt necesare cel putin trei grupuri majore de componente:
1. O matriţă de ADN monocatenar;
2. Nucleotide - sub forma de trifosfati (dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP) care urmează să fie asamblate într-o nouă
catenă polinucleotidică;
3. Enzime și alte proteine care "citesc" catena matriţă și asamblează nucleotidele într-o moleculă nou sintetizată de
ADN.
In general, sinteza ADN dupa modelul semiconservativ se realizeaza astfel:
Procesul este initiat la nivelul unei secvente specifice numita originea replicarii.
intai are loc ruperea legaturilor de H2 dintre cele 2 lanturi polinucleotidice de catre helicaza
ruperea se continua de-a lungul macromoleculei asemanator cu desfacerea unui fermoar;
In acelasi timp are loc o derulare a catenelor polinucleotidice, fiecare catena rotindu-se in plan exterior in jurul
radicalilor fosforici;
separarea si desfasurarea moleculei initiale determina formarea unei structuri asemanatoare literei Y numita furca de
replicare.
• Catenele noi sunt sintetizate concomitent in ambele directii (proces bidirectional).
ENZIME ASOCIATE PROCESULUI DE REPLICARE
• La procesul de replicare a ADN participă numeroase enzime care constituie un adevărat "aparat de replicare"
denumit replisom. O importanta deosebita in procesul de replicare il au ADN polimerazele:
• Aceste enzime polimerizeaza legarea nucleotidelor, iar cele mai multe dintre ele poseda si o activitate
nucleazica prin care taie legaturile fosfodiesterice dintre glucid- radical fosfat ale lantului polinucleotidic.
Enzimele Pol I si Pol III de la E.coli au activitate exonucleazica la capatul 3’.
• Două dintre acestea, ADN POLIMERAZA I ȘI ADN POLIMERAZA III, efectuează sinteza ADN asociată cu
replicarea; celelalte trei au funcții specializate în repararea ADN.
• 3. Utilizeaza nucleotide sub forma de trifosfati (dNTP-uri) pentru sinteza noii catene de ADN;
• 5. Catalizează, pe catena in creștere, formarea unei legături fosfodiesteice prin legarea grupului 5 fosfat al
unei nucleotidei cu grupa 3-OH a nucleotidei precedente;
• 6. Produc sinteza de catene noi care sunt complementare și antiparalerale față de catenele matrita; și
In citoplasma se afla nucleotide diferite care au fost sintetizate in celula si care contin cele 4 baze:
adenina, guanina, citozina si timina;
Tinandu-se seama de corespondenta care trebuie sa existe intre bazele purinice si pirimidinice, o
nucleotida care contine adenina se va lega prin punti de H2 cu o nucleotida ce contine timina, iar una
care contine guanina se va lega cu una ce contine citozina;
In felul acesta are loc replicarea macromoleculelor de ADN, fiecare molecula fiica fiind formata
dintr-o catena veche si una noua.
ETAPELE REPLICARII
Atat la procariote cat si la eucariote replicarea are loc în trei etape majore:
• iniţierea replicării,
• terminarea sintezei.
In 1963 Jacob, Brenner şi Cuzin au enunţat ideea funcţionării cromosomului bacterian ca unitate de
replicare pe care au denumit-o replicon.
Ulterior noţiunea de replicon, prin care se înţelege secvenţa de ADN la nivelul căreia se desfăşoară
un proces individual de replicare (cu cele trei etape distincte), s-a extins asupra tuturor elementelor
genetice capabile de replicare autonomă.
1. Iniţierea procesului de replicare
• Replicarea începe la nivelul regiunii ori şi constă în recunoaşterea acesteia de către factorii de iniţiere.
• La procariote (bacterii) cromozomul prezintă o singură regiune de origine a replicării, oriC, deci un singur
replicon,
• La eucariote, unde cromozomii sunt reprezentaţi de molecule lineare de ADN numărul originilor de replicare
este mult mai mare.
La nivelul regiunii ori unde dublul helix de ADN suferă un proces local de denaturare şi despiralizare catalizat de
enzima helicază – care taie legaturile de hidrogen dintre cele 2 catene.
Factorii de initiere (proteine inițiator) se leagă de oriC și provoacă o scurtă incizie in molecula de ADN in
care are loc un proces de derulare.
Această derulare permite helicazei și altor proteine (proteine de legare la ADN monocatenar; SSB „single-
strand DNA-binding proteins”) să se atașeze la cele două catene de ADN.
• Proteinele de legare la ADN monocatenar (SSB) stabilizează bifurcaţia de replicare, obligatorie pentru realizarea
biosintezei ADN.
• In absenţa proteinelor SSB, cele două catene de ADN ar interacţiona între ele prin formarea de legături de
hidrogen între nucleotidele complementare intercatenare sau intracatenare.
• Despiralizarea ADN dintr-o regiune a macromoleculei circulare de ADN este obligatoriu urmată de un proces de
supraspiralizare într-o altă regiune a ADN.
• Pentru ca procesul de replicare să se desfăşoare normal, suprarăsucirile pozitive trebuie eliminate, fenomenul fiind
catalizat de giraze.
• O altă familie de enzime, topoizomerazele de tip I, relaxează constrângerile structurale printr-un mecanism diferit.
• După ce procesul de replicare a început procesul de despiralizare şi de formare a
unor suprarăsuciri negative a ADN continuă şi dincolo de regiunea ori, fenomenul
realizându-se în ambele direcţii (bidirecţional).
• Rezultatul procesului de despiralizare şi denaturare localizată este formarea unei
regiuni de ADN monocatenar, în care cele două catene vor servi drept matriţă pentru
replicare.
• Separarea celor două catene la nivelul originii replicării determină formarea unei
“bifurcaţii de replicare” (“replication fork”) sau punctul de creştere al ADN, zona de
înaintare a replicării pe cromozom
• Furca de replicare este o structura asimetrica din cauza ca cele 2 catene au
sensuri diferite datorită polarităţii diferite a celor două catene.
Natura lor antiparalelă face ca una din catene să aibă o extremitate 3'–OH, iar
cealaltă una 5'–P.
La nivelul bifurcaţiei de replicare se găsesc şi enzimele ce declanşează sinteza noilor catene de ADN:
• ADN polimeraza poate cataliza sinteza diferitelor tipuri de ADN celular dar trăsătura caracteristică a
bifurcaţiei de replicare, formată la nivelul regiunii ori, nu este ADN polimeraza ci un complex proteic
• ARN polimeraza (primaza) recunoaşte secvenţa ori şi determină sinteza unei scurte secvenţe
Capătul 3’-OH al primerului este apoi recunoscut de ADN-polimerază care adaugă deoxiribonucleotidele
• ADN–polimeraza nu poate copia, în mod continuu, decât una din catene, pe cea care are orientarea 3'→5', care
a fost denumită catena în avans (“leading chain”), sinteza noii catene facandu-se in directia 5'→3' .
• Replicarea celeilalte catene trebuie făcută în sens invers faţă de direcţia de înaintare a bifurcaţiei de
replicare.
• De aceea, o altă moleculă de ADN polimerază trebuie să aştepte ca bifurcaţia de replicare să fie suficient de
lungă înainte de a-şi începe activitatea în sens opus (la nivelul unui nou primer sintetizat tot de primază).
• Sinteza noii catene, complementară catenei matriţă şi orientată în direcţia 5'→3' se face deci discontinuu şi
în întârziere faţă de catena “leading”, motiv pentru care ea se mai numeşte catenă în întârziere (“lagging
chain)”.
• In 1968, Okazaki şi colab. au demonstrat că sinteza catenei în întârziere se realizează discontinuu, sub forma
unor fragmente nucleotidice intermediare scurte, care au fost numite fragmente Okazaki
3. Terminarea procesului de replicare
• Terminarea replicării se realizează, de obicei, la nivelul unui punct fix în replicarea bidirecţională.
• eliminarea ARN primer sub acţiunea RN-azei H sau a unor exonucleaze (de exemplu, ADN-
polimeraza I care are funcţie exonucleazică 5’→3’ şi 3’→5’);
• “umplerea” breşelor rămase prin eliminarea ARN primer sub acţiunea unor ADN-polimeraze cu
funcţii reparatorii;
• ADN ligaza catalizează formarea legăturilor fosfodiesterice dintre extremitatea 3’OH a unui fragment
Okazaki şi cea 5’ P a fragmentului următor, procesul realizându-se cu consum energetic.
O genă este definită ca un segment de ADN care este utilizat pentru sinteza unui anumit produs (o moleculă
de ARN sau o polipeptidă).
La nivel molecular, exprimarea informatiei genetice este procesul prin care informația din cadrul unei gene
este utilizată pentru a produce un produs funcțional, cum ar fi de exemplu o polipeptidă.
Primul pas în acest proces se numește TRANSCRIERE, care înseamnă literalmente procesul de realizare a
unei copii a unei secvente de ADN.
Rezultatul procesului de transcriere (care are loc in nucleu) este o molecula de ARNm care poarta mesajul
genetic copiat.
ARNm trece apoi in citoplasma, la ribozomi, unde are loc convertirea mesajului genetic purtat de acesta la
o secvenţă de aminoacizi dintr-o catenă polipeptidică, proces numit TRADUCERE.
TRANSCRIEREA
TRANSCRIEREA GENETICĂ reprezintă procesul de
sinteză a moleculelor de ARN, prin care o catena de ADN
este transcrisa intr-o catena de ARN.
Atat la procariote cat si la eucariote, prin transcriere
genetica se sitetizeaza toate tipurile de ARN celular cum
ar fi:
ARNm (mesager),
ARNt (de transfer),
ARNr (ribozomal),
ARNhn (heterogen nuclear).
Dintre acestea, ARNm este singurul tip de ARN celular
TRADUS în structura proteinelor, el reprezentând circa 5%
din cantitatea de ARN total.
Transcrierea genetică se realizează numai în celule,
existând diferenţe în ceea ce priveşte locul
transcrierii genetice la procariote şi eucariote,
impuse de specificul organizării celulare.
Termenii „în amonte” (upstream) și „în aval” (downstream) - indica direcția de transcriere și localizarea
secvențelor de nucleotide care flanchează secvența de codificare a ARN
Promotorul
Este o secventa specifica de ADN -localizata la extremitatea 5' a secvenţei genice ce va fi transcrisă- si are rol in initierea a
transcrierii.
Este regiunea de recunoastere si de legare a ARN-polimerazei.
LA PROCARIOTE
Secventa promotor cuprinde 2 secvente, de la regiunea -10 la regiunea -35
Astfel, există o secvenţă TATAAT, denumită “cutia Pribnow” sau regiunea –10 (deoarece este centrată pe aprox. 10 perechi de
baze in amonte fata de situsul de initiere a transcrierii, ea fiind conservată la toate secvenţele promotor de la procariote.
O a doua secvenţă, denumită regiunea –35, este comună procariotelor şi este localizată la aproximativ 35 pb în faţa (în
direcţia de transcriere) situsului de start al transcrierii (este centrată pe nucleotida din poziţia –35).
Ambele regiuni, -10 (TATAAT) şi –35 (TTGACA) reprezintă SECVENŢE CONSENS, adică se regăsesc la majoritatea
promotorilor bacterieni.
• LA EUCARIOTE
• Promotorul contine o structura numita cutia TATA, similara cutiei Pribnow de la procariote.
• Aceasta structura este recunoscuta si legata de catre o subunitate a ARN polimerazei in timpul initierii
transcrierii.
APARATUL DE TRANSCRIERE
In cazul transcrierii enzima care catalizeaza reactia de polimerizare este ARN
polimeraza care NU are nevoie de primer pentru initierea reactiei.
Acțiunea ARN polimerazei este îmbunătățită de un număr de proteine auxiliare care
se alătură și părăsesc polimeraza în diferite etape ale procesului.
ARN-polimerazele, indiferent de origine, au în general aceleaşi trei funcţii
esenţiale:
“aleg” catena purtătoare de informaţie
recunosc începutul şi sfârşitul mesajului genetic
răspund la acţiunea unor factori de reglare pozitivă sau negativă.
Enzima “citeşte” catena de ADN matrita pe care o copiază în sensul 3’→5’, iar
sinteza ARN se realizează în sensul 5’→3’.
Astfel, rNTP sunt adăugaţi pe rând la nivelul grupării 3’OH a ribonucleotidei
anterioare, în urma reacţiei de polimerizare fiind eliberate grupări pirofosfat
ARN polimeraza (transcriptaza) este un complex enzimatic si catalizeaza aceeasi
reactie in toate celulele, atat la procariote cat si la eucariote.
LA PROCARIOTE
Miezul enzimatic al ARN-polimerazei poate realiza sinteza de ARN dar nu poate iniţia în mod corect
procesul de transcriere fara factorul σ.
După iniţierea transcrierii, dupa ce lungimea catenei de ARN a ajuns la 8-9 ribonucleotide, factorul σ se
desprinde de holoenzimă, apoenzima (2α ß ß’) continuând singură sinteza ARN.
LA EUCARIOTE
Celulele eucariote posedă trei tipuri distincte de ARN polimeraze cu localizare nucleară (fie în nucleoplasmă fie la
nivelul nucleolului), fiecare dintre acestea fiind responsabilă pentru transcrierea unei clase diferite de ARN:
ARN polimeraza I transcrie pentru ARNr;
ARN polimeraza II transcrie pentru ARNm,; și
ARN polimeraza III transcrie în mod specific pentru ARNt
.
TRANSCRIEREA LA PROCARIOTE
In procesul de transcriere este implicată o unitate transcripţională ce se întinde de la nivelul
promotorului până la secvenţa de terminare.
Procesul incepe la nivelul unui “punct de start” situat pe catena ADN matrita şi se desfăşoară
până când ARN-polimeraza ajunge la nivelul unei secvenţe de terminare (“terminator
sequence”).
Etapele procesului de transcriere:
• 1. inițierea, - aparatul de transcriere se asamblează pe promotor și începe sinteza ARN;
• 2.alungirea- ARN polimeraza se deplasează de-a lungul catenei de ADN matrita, deruland-o,
adăugând noi nucleotide, una câte una, până la capătul 3’ al catenei de ARN în creștere; și
• 3. terminarea - recunoașterea sfârșitului unității de transcriere și are loc separarea moleculei de
ARN de matrita ADN.
INIŢIEREA TRANSCRIERII
Are loc la nivelul unei secvenţe specifice de ADN numită promotor care interacţionează cu enzima
ARN-polimeraza.
Iniţial, ARN-polimeraza recunoaşte şi se leagă la nivelul regiunii –35, considerată de unii autori ca fiind
situsul R ("recognition"),
după care contactul cu ADN se extinde şi la regiunea –10 (situsul B, de legare strânsă).
Spre deosebire de ADN-polimerază care are numai specificitate de direcţie, ARN-polimeraza are şi
specificitate de secvenţă recunoscând promotorul genei care trebuie să funcţioneze la un moment dat.
Iniţierea transcrierii- face să fie ataşat la matriţă primul rNTP care oferă gruparea
3'-OH ce va fi pusă în legătură de către ARN-polimeraza cu gruparea 5'- fosfat a
nucleotidului următor.
Reacţia poartă numele de atac nucleofilic.
ALUNGIREA MOLECULEI DE ARN
Cele mai importante diferenţe provin din structura diferită a genelor de la eucariote, acestea având de regulă
o structură discontinuă (sunt alcătuite din secvenţe informaţionale numite EXONI ce alternează cu secvenţe
noninformaţionale numite INTRONI).
In celulele eucariote s-a demonstrat că există trei tipuri de ARN-polimeraze care realizează transcrierea
diferenţiată a genelor:
ARN-polimeraza III – transcrie genele pentru ARNt şi pentru alte molecule de ARN de dimensiuni
mici (ARNsn).
Nici una dintre cele trei categorii ARN-polimeraze de la eucariote NU recunosc promotorul în mod direct
ci prin intermediul unor factori de transcriere (proteine specifice), iniţiindu-se astfel procesul de
transcriere.
Etapele procesului de transcriere sunt aceleaşi ca şi la procariote:
iniţiere,
alungire şi
terminare,
aspecte deosebite apărând doar în procesul de iniţiere.
INITIEREA
Două clase largi de secvențe ADN sunt importante pentru inițierea transcrierii:
Promotori și
Elemente activatoare sau secvenţe de tip “enhancer”, ce stimulează declanşarea transcrierii .
• Elementele activatoare sunt secvenţe de ADN ce stimulează declanşarea transcrierii, localizate fie spre capătul 5’ fie
spre capatul 3’ al regiunii de ADN.
O clasă de proteine auxiliare cuprinde factori generali de transcriere care, împreună cu ARN polimeraza,
formează aparatul de transcriere care se asamblează în apropierea situsului de pornire.
Factorii generali de transcriere includ: TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF și TFIIH.
TFII reprezintă factorul de transcriere pentru ARN polimeraza II, iar litera indică factorul individual.
ARN Pol II formeaza un complex de pre-initiere.
Odata format enzima incepe sa adauge ribonucleozid-trifosfaţi (rNTP).
ALUNGIREA CATENEI DE ARN
O enzimă specială taie produsul de transcriere la o scurtă distanţă după secvenţa AAUAAA, după care, o altă
enzimă independentă de matriţă (poliA polimeraza), adaugă o serie de nucleotide cu adenină (aproximativ
200), utilizând ca sursă de energie ATP, formând “coada poliA” (poliadenilată) la nivelul căreia se leagă proteine
specifice.
Deoarece coada poli A lipseşte în cazul ARNm pentru histone, înseamnă că aceasta nu este esenţială pentru
transcriere.
Se pare că această secvenţă, adăugată după ce procesul de transcriere s-a încheiat, ar fi implicată în
asigurarea stabilităţii moleculei de ARN în celulă.
Prelucrări post-transcripţionale ale moleculei de ARN
Majoritatea moleculelor de ARN rezultate în urma transcrierii sunt supuse unor modificări specifice în
urma cărora, moleculele respective devin biologic active.
Produsul rezultat în urma transcrierii a primit denumirea de TRANSCRIPT PRIMAR (sau produs
primar de transcriere) la procariote, iar la eucariote ARN PRE-MESAGER.
De regulă acest produs primar este instabil, atât la procariote cât şi la eucariote, el “suferind” unele
prelucrări post-transcripţionale.
In cazul procariotelor, produsul primar este fie degradat rapid, după ce şi-a îndeplinit funcţia (ARNm),
fie este clivat pentru a forma produşi funcţionali (ARNr sau ARNt).
La eucariote, produsul primar ce a copiat o genă discontinuă este prelucrat prin eliminarea secvenţelor
non-informaţionale (intronii) sau prin adăugarea unor secvenţe specifice de nucleotide la extremităţile
moleculei.
Formarea moleculelor de ARN matur implică adiţia, deleţia sau modificarea unor nucleotide.
LA EUCARIOTE
• Prelucrarile post-transcripţionale ale moleculei de ARN pre-mesager constau din doua tipuri de
evenimente:
1. Modificarea portiunilor terminale ce constau din:
adăugarea secvenţei 5’ Cap (7-metilguanozina);
adăugarea cozii poliA (~200 nucleotide cu adenina);
2. Eliminarea intronilor (secventelor netraduse) şi asamblarea exonilor.
Această structura rezulta prin adăugarea unei nucleotide suplimentare la capătul 5’ al ARNpre-m și prin
metilarea (adăugarea unei grupări metil - CH3) bazei azotate din nucleotida nou adaugata.
Secventa Cap este adăugata la scurt timp după inițierea transcrierii si consta dintr-o nucleotidă cu 7-metil
guanină (7-metilguanozina) atașată la ARN pre-mesager printr-o legătură unică 5’ – 5’.
• ADĂUGAREA COZII POLIADENILATE POLI(A)
Cele mai multe molecule de ARNm matur de la eucariote au la capătul 3’ de la 50 la 250 nucleotide de adenină (o
coadă poli (A).
Aceste nucleotide nu sunt codificate în ADN, ci sunt adăugate după transcriere printr-un proces numit
POLIADENILARE.
ARNm este în acelaşi timp singura categorie de ARN celular care prezintă o structură integral
monocatenară, cel puţin în momentul traducerii mesajului genetic la nivelul ribozomilor.
Fiind purtătoare de mesaj genetic, moleculele de ARNm au lungimi variabile deoarece şi mărimea
genelor de la care preiau informaţia sunt variate ca dimensiune.
• Fiecare aminoacid dintr-o proteină este specificat printr-un set de trei nucleotide în ARNm, numit CODON.
• La procariote, cu excepţia arhebacteriilor, ARNm matur corespunde ca lungime secvenţei genice pe care a
transcris-o, fenomen denumit colinearitate.
In timpul traducerii, ARNm este “citit” conform unui cod genetic in care un grup de 3 nucleotide din ARNm
formeaza un codon, fiecare codon specificand pentru un tip particular de aminoacid.
Astfel, o secventa de ARNm este utilizata ca matrita pentru asamblarea aminoacizilor intr-o catena polipeptidica
(proteina).
Din punct de vedere structural, ARNm prezintă trei regiuni distincte:
secvenţa “leader” de la capătul 5’ al moleculei;
secvenţa codificatoare şi
regiunea 3’ terminală.
Regiunea “leader” - este o secvență de nucleotide localizate la capătul 5’ al moleculei de ARNm; această secvenţă nu
este tradusă; este importantă pentru iniţierea traducerii.
În ARNm bacterian, această regiune conține o secvență consens numită secvența Shine-Dalgarno, care servește ca situs
de legare la ribozom în timpul traducerii – (este complementară cu o secvenţă formată din 3–7 nucleotide aflată la capătul 3'
al moleculei ARNr).
Secvența Shine-Dalgarno se găsește la aproximativ șapte nucleotide în amonte de primul codon tradus într-un
aminoacid (codon start).
La eucariote, ARNm nu are o secvență consens echivalentă în regiunea 5’ netradusă.
În celulele eucariote, ribozomii se leagă la capatul 5’ al ARNm (secventa CAP).
Secvenţa codificatoare determină structura primară a unei catene polipeptidice - constituie matriţa pentru sinteza
unei catene polipeptidice);
Regiunea de codificare a proteinei începe cu un codon start și se termină cu un codon stop.
Regiunea terminală este o secventa de nucleotide care nu vor fi traduse în proteina
rolul său fiind legat de asigurarea stabilităţii moleculei de ARNm.
La procariote ARNm este policistronic (cistron= temen utilizat pentru a specifica o secventa ce codifica o singura
catena polipeptidica) pentru că el contine informatia pentru secventele de aminoacizi ale mai multor catene
polipeptidice diferite.
• Utilizarea ARNm policistronic la procariote reprezintă o cale economică de a regla sinteza unor proteine în mod
coordonat, cu ajutorul unui singur semnal de reglare.
La eucariote de regulă ARNm este monocistronic (copiază o singură genă), el este sintetizat sub forma unui precursor
numit ARN pre-mesager (e) care este supus prelucrărilor post-transcripţionale în urma cărora se obţine ARNm matur
Durata de “viaţă” a unei molecule de ARNm
• La eucariote durata de viaţă a unei celule este mai mare decât la procariote şi deci ARNm este mai
stabil.
Aceasta se datorează faptului că, la organismele pluricelulare, celulele se găsesc într-un mediu intern
mult mai stabil în privinţa parametrilor săi.
ARN ribozomal (ARNr)
• ARNr reprezintă aproximativ 80-85% din cantitatea totală de ARN celular, intrând în structura
ribozomilor.
• Ribozomii sunt particule nucleoproteice citoplasmatice implicate în sinteza proteinelor, respectiv în
traducerea mesajului genetic dintr-o secvenţă de nucleotide din ARNm într-o secvenţă de aminoacizi din
catena polipeptidică.
• Ribozomii joacă un rol esențial în transferul informațiilor genetice.
• Ribozomul este una dintre particulele cele mai abundente din celulă: o singură celulă bacteriană poate conține
până la 20.000 de ribozomi, iar celulele eucariote posedă și mai mult.
• In medie, diametrul unei particule ribozomale mature este de 12-23 nm.
• Ribozomii conțin de obicei circa 80% din ARN celular total.
• Un ribozom funcțional constă din două subunități: o subunitate mare și o subunitate mică, fiecare dintre
ele fiind constituita din una sau mai multe molecule de ARNr și un număr din proteine.
• Dimensiunile ribozomilor și componentele
lor moleculare de ARN sunt masurate în
unități Svedberg (S) (o unitate de timp egală cu
10-13 secunde ce măsoara coeficientul de
sedimentare a unei substante într-un câmp
centrifugal).
• Unitățile Svedberg nu sunt aditive; cu alte
cuvinte, combinarea unei structurii de 10 S și a
unei structurii de 20 S nu produce neapărat o
structură de 30 S, deoarece rata de
sedimentare este afectată atat de structura
tridimensională, precum și de masa particulei
respective.
• La procariote - particula ribozomală prezintă o
constantă de sedimentare de 70S si este formată din două
subunităţi:
o subunitate mică de 30S şi o subunitate mare de 50S.
În subunitatea ribozomală mică intră o moleculă de ARNr
de 16S asociată cu 21 de tipuri de proteine ribozomale
caracteristice subunităţii mici, notate de la S1 la S21
(S = small).
În subunitatea mare intră o moleculă de ARNr de 23S şi 34
tipuri diferite de proteine ribozomale notate de la L1 - L34
(L = large).
• La eucariote - ribozomii au o constantă de sedimentare
de 80S, cu o subunitate mică de 40S şi o subunitate mare de
60S. Subunitatea ribozomală mică conţine o moleculă de
ARNr 18 S şi 33 tipuri de proteine ribosomale, iar
• în subunitatea mare se găsesc 3 tipuri de ARNr (28 S;
5,8 S şi 5 S) si 50 tipuri de proteine ribozomale.
• Proteinele ribozomale sunt sintetizate în citoplasmă şi apoi transportate în nucleu, unde sunt
asamblate în subunităţile ribozomale prin ataşarea lor la precursorii ARNr.
• După asamblare la nivelul nucleolului, subunităţile ribozomale sunt transferate în citoplasmă.
Proteinele ribozomale sunt bogate în arginină şi lizină (70% din resturile de aminoacizi) ceea ce le conferă un
caracter bazic (pH 8.5 – 10) cerut la complexarea cu moleculele de ARN acide spre a constitui ribozomii.
Proteinele respective se dispun la suprafaţa ribozomilor împachetând ARNr.
• Ribozomii din organitele celulelor eucariote (mitocondrii şi cloroplaste) sunt de tip procariot cu o
constanta de sedimentare 70S.
• Moleculele de ARNr au o conformaţie complexă, în care alternează regiuni mono-catenare cu regiuni
bicatenare (acolo unde se realizează împerecheri de baze azotate complementare).
• Genele pentru sinteza ARNr sunt localizate în regiunea organizatorului nucleolar (NOR) situată la
nivelul constricţiilor secundare ale unor cromozomi ai complementului cromozomal denumiţi cromozomi
organizatori nucleolari.
ARN de transfer (ARNt)
Structura codului genetic este determinată de secvenţa specifică a celor 4 baze (ATCG).
Presupunând că toate unităţile fundamentale de codificare, denumite codoni, au aceeaşi lungime, s-a emis
ipoteza că cea mai scurtă secvenţă nucleotidică necesară pentru a codifica un aminoacid constă din trei
baze (cod triplet), ceea ce permite formarea a 64 de combinaţii.
Astfel, potrivit relatiei 43 = 64 rezulta un numar de combinatii a cate 3 baze care nu numai ca asigura
codificarea celor 20 de aminoacizi, dar asigura si posibilitati suplimentare de codificare.
• Ca urmare, codul genetic reprezinta totalitatea celor
64 de codoni care este forma cea mai simplă ce asigură
codificarea celor 20 de aminoacizi naturali.
Ansamblul codonilor determina ordinea
succesiunii aminoacizilor in catena polipeptidica.
Fiecare codon codifica un singur aminoacid – de
ex. Codonul UUU codifică fenilalanina.
Codonii sunt scrisi in directia 5’ – 3’, așa cum apar
în ARNm.
Codonul AUG, pe lângă funcţia de a specifica
metionina, îndeplineşte şi rolul universal de codon
iniţiator în sinteza proteică (este semnalul de start al
traducerii).codonii: UAA, UAG și UGA sunt codoni
stop – de terminare a traducerii.
Astfel, din cei 64 de codoni, 61 codoni, numiți codoni
sens, codifică aminoacizii.
CARACTERISTICILE CODULUI GENETIC
1. codul genetic este nesuprapus, în sensul că 2 codoni succesivi, nu au nici o nucleotida comuna.
Nesuprapunerea codonilor determină trei posibilităţi de traducere a aceleiaşi secvenţe de nucleotide, în funcţie de
punctul de start, acestea fiind denumite “cadre de citire” (“reading frames”).
Orice modificare a secvenţei de nucleotide prin adăugarea sau eliminarea (deleţia) unei nucleotide determină
modificarea cadrului de citire corect, începând de la nivelul nucleotidei modificate (mutaţiile fiind de tip
“frameshift”)
Într-un codon suprapus, unele nucleotide
aparțin mai multor codoni.
Într-un codon nesuprapus, fiecare
nucleotidă aparține unui singur codon.
Codul genetic folosit în aproape toate
organismele vii nu este suprapus.
2. Codul genetic este "degenerat", această caracteristică decurgând din faptul că mai mulţi codoni
diferiţi specifică acelaşi aminoacid si sunt numiţi CODONI SINONIMI.
Caracterul degenerat al codului genetic nu este uniform: unii aminoacizi cum ar fi serina, arginina, leucina sunt
codificaţi de câte 6 codoni; alţi aminoacizi ca alanina, glicocolul, prolina, treonina şi valina sunt codificaţi
de câte 4 codoni diferiţi, în timp ce alţi nouă aminoacizi sunt specificaţi de câte 2 codoni.
Excepţie fac aminoacizii metionină şi triptofan care sunt codificaţi de câte un singur codon: AUG ptr.
Metionina si UGG ptr. Triptofan
Codonul AUG, pe lângă funcţia de a specifica metionina, îndeplineşte şi rolul universal de codon iniţiator
în sinteza proteică (este semnalul de start al traducerii).
Esenţial este faptul că fiecare aminoacid este desemnat numai de codoni specifici, respectiv că nici un
cuvânt de cod nu codifică mai mult de un aminoacid.
3. Flexibilitatea codului genetic se referă la codonii sinonimi la care primele două baze ale tripletei
sunt constante, în timp ce a treia poate varia, deci această poziţie este variabilă sau oscilantă
• Semnificaţia acestui fenomen se referă la faptul că aceeaşi moleculă de ARNt asigură traducerea mai
multor codoni ceea ce permite celulei să sintetizeze mai puţine tipuri de ARNt.
4. Codul genetic este” fără virgule”, ceea ce însemnă că între sfârşitul unui codon şi începutul
celui următor nu există nici un semn de punctuaţie.
5. Ambiguitatea codului genetic este caracteristica prin care anticodonul din ARNt recunoaşte doi
codoni diferiţi din ARNm.
Ordinea succesiunii aminioacizilor in catena polipeptidica este dirijata de ARNm. Fiecarui codon din
ARNm ii corespunde un anticodon din ARNt.
De exemplu, codonul GUG aflat la începutul mesajului genetic (în molecula de ARNm) este recunoscut de
ARNt pentru formil metionină, pe când acelaşi codon aflat în interiorul moleculei de ARNm este
recunoscut de ARNt pentru valină.
6. Utilizarea preferenţială a unor codoni. Faptul că există mai mulţi codoni pentru un acelaşi
aminoacid a pus problema dacă aceşti codoni sinonimi sunt folosiţi mai frecvent decât alţii.
Folosirea unuia sau altuia dintre codonii sinonimi se datorează întâmplării dar este cert că, în cadrul
grupelor taxonomice mari,există o anumită preferinţă pentru anumiţi codoni sinonimi.
Un capat din lantul polipeptidic are gruparea amino (NH2) liberă formand capatul amino- sau N-
terminal, iar celalalt capat al lantului are gruparea carboxil (COOH) liberă sau C-terminal.
In procesul de sinteză, lantul polipeptidic este alungit de la capătul amino către capătul carboxil.
• Pentru a fi biologic active, lanțurile polipeptidice liniare trebuie pliate într-o structură tridimensionala.
Unele proteine sunt alcătuite dintr-o singură catenă polipeptidică, altele au mai multe catene polipeptidice
identice sau diferite.
În acest din urmă caz, fiecare catenă este sintetizată pe baza informaţiei genetice inclusă în gene diferite.
Aşa se explică de ce formularea iniţială o genă – o enzimă, a fost înlocuită cu expresia: o genă – o catenă
polipeptidică, ce exprimă mai bine realitatea la nivel molecular.
• In anumite cazuri, catenele polipeptidice pot fi asociate şi cu grupări neproteice (prostetice), formând
macromolecule funcţionale aşa cum este exemplul hemoglobinei (formată din patru catene polipeptidice, 2α şi 2β,
asociate cu o grupare hem, ceea ce conferă macromoleculei capacitatea de a lega oxigenul).
Din punct de vedere al organizării structurale, proteinele pot
manifesta diferite tipuri de structuri:
aminoacil-ARNt-ligaza
aminoacil-ARNt-ligaza 1
• Două molecule de fosfat sunt scindate din ATP, rezulta aminoacil - adenozin monofosfat (AMP) și
pirofosfat (PPi);
• Aminoacilul este legat la ARNt rezulta aminoacil - ARNt (ARNt cu aminoacidul atașat) cu eliberarea
adenozin monofosfat.
A doua etapa in iniţierea unei catene polipeptidice se desfăşoară la nivelul ribozomului.
1. ARNm se leagă de subunitatea mică a ribozomului.
2. Anticodonul ARNt inițiator se leagă la un codon ARNm.
3. Subunitatea mare a ribozomului se alătură complexului de inițiere.
Iniţierea precisă a traducerii depinde de recunoaşterea corecta a cadrului de citire.
Spre exemplu, dacă regiunea codificatoare a ARNm începe cu secvenţa:
5’ AUGUUUAAACCCCUG . . . . 3’, teoretic cadrele de citire ar putea fi:
AUG UUU AAA CCC CUG sau
UGU UUA AAC CCC UG sau
GUU UAA ACC CCU G,
neexistând nimic care să indice care dintre nucleotide este prima nucleotidă a primului codon.
• S-a dovedit că primul codon cu care se începe procesul de traducere, atât la procariote cât şi la eucariote, este,
de regulă, AUG (mai rar GUG sau UUG), ceea ce înseamnă că există anumite mecanisme specifice care
determină alegerea corectă a codonului AUG start.
• Codonul AUG codifică metionina, indiferent dacă se
găseşte la începutul secvenţei ce urmează a fi tradusă fie
în interiorul acesteia.
• La procariote, iniţierea sintezei catenei polipeptidice este asigurată si de intervenţia unor factori proteici
citoplasmatici de iniţiere, desemnaţi IF1, IF2, IF3.
La eucariote, ARNm nu conţine secvenţa Shine-Dalgarno, dovedindu-se că ribozomii citoplasmatici nu se leagă
direct la situsul de iniţiere al traducerii.
In acest caz, primul eveniment ce precede iniţierea traducerii la eucariote este recunoaşterea de către subunitatea
ribozomală mică (40S) a secvenţei terminale 5’, metilată (secvenţa 5’cap) de la nivelul ARNm, după care el
migrează de-a lungul moleculei de ARNm până când localizează primul codon AUG.
Identificarea codonului AUG start este facilitată de prezența unei secvențe de consens (numită secvența Kozak)
care înconjoară codonul de start:
O altă diferență importantă fata de procariote este că inițierea la eucariote necesită mai mulți factori de inițiere
(10).
Coada poli (A) la capătul 3 al ARNm eucariot joacă, de asemenea, un rol în inițierea traducerii.
Proteinele care se atașează la coada poli (A) interacționează cu proteinele care se leagă la secventa 5’, îmbunătățind
legarea subunității mici a ribozomului la capătul 5’ al ARNm.
2. Alungirea catenei peptidice
Primul ARNt initiator ARNtMet ocupa locusul donor P iar cealalta locusul donor A aminoacil.
Odata formata prima legatura peptidica, ARNt initiator , ramas fara aminoacid, paraseste situsul P.
Situsul P eliberat, va putea primi cel de-al 2-lea aminoacil-ARNt, care a trecut in prealabil prin situsul A spre a
realiza recunoasterea codon-anticodon.
Se formeaza astfel cea de-a 2-a punte peptidica iar translocarea succesiva din A in P permite citirea codon
dupa codon, de catre anticodonii complexelor aminoacil-ARNt, a intregului mesaj continut de catre ARNm.
Aceasta translocarea succesiva din A in P, cu formarea de fiecare data de legaturi peptidice, asigura alungirea
catenei.
Reacţia este catalizată de enzima peptidil-polimeraza, care face parte din proteinele ribozomale.
In procesul de elongare intervin şi factorii de elongaţie (EF-Ts, EF-Tu si EF-G) - (proteine ribozomale care se
ataşează în această fază la particula ribozomală (la subunitatea mare).
3. Terminarea sintezei proteice
Are loc când, in deplasarea sa pe ARNm, ribozomul ajunge cu situsul său A la nivelul unui codon nonsens (stop,
codon terminator, UAA, UAG, UGA).
La acest nivel, nu se mai ataşează nici un complex aminoacil–ARNt deoarece nu exista anticodoni care sa
recunoasca codonii STOP. Astfel se asigură terminarea sintezei catenei polipeptidice.
Codonii stop sunt recunoscuţi de factori de eliberare sau de terminare: factorii TF–R1, TF–R2 şi TF–R3 la
bacterii şi factorul RF la eucariote. Factorul TF-R3 asigură desfacerea grupului carboxil al aminoacidului
terminal de ARNt transportor.
In urma acestui proces are loc eliberarea de pe ribozom atât a catenei polipeptidice cât şi a ARNt precum şi separarea
ribozomilor în cele două subunităţi ale sale.
Modificări post-translaţionale ale proteinelor
Impachetarea proteinelor este un proces esenţial pentru ca anumite proteine să dobândească proprietăţile funcţionale specifice.
La începutul anilor ’90 s-a pus în evidenţă o familie specială de proteine care au primit denumirea de “chaperone” care au
capacitatea de a recunoaşte şi lega proteinele parţial “împachetate” sau, altfel spus, “desfăşurate” parţial. Asocierea
chaperonelor cu asemenea proteine asigură stabilizarea acestora până în momentul în care sunt îndeplinite condiţiile de
împachetare corectă, proces ce necesită ATP.
Rolul chaperonelor:
participarea la împachetarea corectă a proteinelor nou sintetizate;
stabilizarea proteinelor denaturate şi
“îndrumarea” („targeting”) proteinelor “îmbătrânite” pentru distrugere la nivelul lizozomilor;
sunt implicate în procesul de translocare a proteinelor prin membranele mitocondriale şi în rearanjarea subunităţilor
proteice în complexele macromoleculare.
Secreţia proteinelor. Odată sintetizate, proteinele sunt redistribuite la nivelul celulelor în vederea îndeplinirii funcţiei pe care o au.
Majoritatea proteinelor sunt citoplasmatice deoarece, după sinteză rămân la nivelul citoplasmei.
O altă parte a proteinelor celulare sunt localizate la nivelul membranei plasmatice sau sunt liberate în spaţiul extracelular.
In cazul celulelor eucariote, proteinele sintetizate în citoplasmă trebuie să ajungă la nivelul mitocondriilor, a lizozomilor, a
peroxizomilor sau a nucleului (proteinele nucleare).
REGLAJUL GENETIC
Genele nu funcţionează toate simultan şi continuu pentru a determina sinteza tuturor proteinelor
codificate în structura lor, deoarece aceasta ar aduce perturbări grave ale metabolismului celular.
Ca urmare, cantitatea de proteine şi în special de enzime sintetizate în celule nu este constantă în
timp, ci se află sub controlul unui mecanism de reglare genetică.
Mecanismele de reglare reprezintă un sistem de coordonare prin care se face selecţia adecvată, în
raport cu mediul, a informaţiei genetice care urmează a fi exprimată fenotipic.
Reglarea activităţii genelor, intrarea lor în funcţiune după un program riguros controlat este evidentă
atât la procariote cât şi la eucariote.
• La bacterii se aproximează că, în condiţii determinate de mediu, nu se sintetizează decât cca 1 % din
totalitatea proteinelor structurale şi enzimelor pentru care există informaţie genetică.
• La eucariotele superioare, numai cca 7 – 10 % din secvenţele de ADN din genom sunt transcrise în
ARN.
Nivelurile de control ale exprimarii genei
In general, mecanismele de reglare a expresiei genetice se
exercită, la 4 niveluri principale, cu sensibilitate diferită:
1. Reglarea la nivelul transcrierii genetice – este cel mai
important si implica decizia blocării sau sintezei ARNm;
2. Reglarea la nivelul traducerii genetice - asigură producerea
proteinelor în cantităţile necesare şi la momentul potrivit;
3. Reglarea directă a activităţii enzimelor existente la nivelul
celulei- este nivelul cel mai sensibil şi mai rapid, influenţându-se
în acest fel desfăşurarea diferitelor căi metabolice;
4. Reglarea la nivelul procesului de degradare a proteinelor,
proces în urma căruia rezultă o parte a aminoacizilor necesari
sintezei altor proteine.
Principii generale ale reglajului genetic
Cele mai bine studiate mecanisme de reglare genetica au fost cele de la bacterii.
La bacterii, cea mai comună modalitate de reglare a exprimarii genelor este prin influențarea ratei la care
este inițiată transcrierea.
Aceasta inseamna ca la nivelul transcrierii, rata de sinteză a ARN poate fi crescută sau scăzută.
În majoritatea cazurilor, reglarea transcripțională implică acțiunile unor PROTEINE REGLATOARE:
O proteină reglatoare, care se leagă de gena ce trebuie transcrisa și inhibă astfel transcrierea, numita:
REPRESOR
Alta proteină reglatoare crește rata de transcriere si este numita:
ACTIVATOR
În combinație cu proteinele reglatoare, un rol critic în reglarea transcrierii il au MOLECULELE
EFECTOR.
O moleculă efector își exercită efectele prin legarea la un ACTIVATOR sau REPRESOR (provoacă o
modificare conformațională a proteinei reglatoare și, prin urmare, influențează dacă proteina se poate lega
sau nu de ADN).
Proteinele reglatoare sunt denumite dupa modul în care acestea afectează transcrierea atunci când sunt
legate de ADN (represor sau activator).
Dimpotrivă, moleculele efector sunt denumite dupa modul în care acestea afectează transcrierea atunci când
sunt prezente în celulă la o anumita concentrație.
Dupa modul în care este afectata rata de transcriere de catre efector, exista doua tipuri de sisteme de reglare:
Mecanismele de reglare a activităţii genelor au fost cel mai bine studiate la bacterii.
• un promotor,
• un operator şi
• una sau mai multe gene structurale care sunt transcrise într-un ARNm policistronic (o moleculă de
ARNm ce codifică pentru mai mult decât o proteină).
Promotorul
• este o secvenţă de ADN,
• reprezintă situsul de recunoaştere a enzimei ARN polimeraza
• are rol în procesul de iniţiere a transcrierii.
În sinteza ARN, promotorul indică:
- care gene ar trebui utilizate pentru sinteza ARNm,
- şi prin alungire (elongare), controlează ce proteine vor fi sintetizate.
Operatorul
• este un segment de ADN,
• reglează activitatea genelor structurale din cadrul operonului, prin interacţiunea cu un represor
sau un inductor specific.
• Genele promotor si operator sunt precedate de o genă reglatoare.
• Ea este separată de genele operonului, asupra căruia actionează.
• Gena reglatoare, prin produsul său chimic (proteina represor), dirijează activitatea genei operatoare
si a genelor structurale prin inductia sau represia transcriptiei
Reglarea operonului lactozei la Escherichia coli (operonul lac)
• Primul operon, descris în 1960 de către F. Jacob, D. Perrin, C. Sanchezsi J. Monod, a fost OPERONUL lac de
la Escherichia coli.
• Elucidarea mecanismului de reglare a operonului lactozei de la E.coli fiind legată de numele cercetătorilor francezi
F.Jacob şi J.Monod.
• La E. Coli se consideră a fi cca 200 de operoni, dintre care numai activitatea unora este mai bine cunoscută.
Operonul lac este alcătuit din cele 3 gene structurale şi o serie de elemente reglatoare.
• lac A (codifică tiogalactozid transacetilaza care, în mod normal, acetilează lactoza şi alte β-galactozide cu
ajutorul acetil-CoA).
• Elementele reglatoare sunt reprezentate de:
Controlul negativ al operonului lac este mediat de represor, codificat de gena lac I, care se leagă
specific de regiunea operator, împiedicând transcrierea în absenţa lactozei.
Dacă lactoza (sau un alt inductor, cum ar fi IPTG = izopropil-β-D tiogalactopiranozid) este prezentă
în mediu, ea se cuplează cu represorul inactivându-l, astfel că genele structurale sunt transcrise
la ARNm, deci operonul funcţionează.
Inducţia, represia şi retroinhibiţia enzimatică
Inducţia şi represia enzimatică, sunt fenomene opuse ca acţiune
(antagoniste) şi care controlează cantitatea de substanţe sintetizate. .
La procariote Reglajul genetic este de două tipuri:
1. Sistem inductibil – intervine în sinteză enzimelor catabolismului;
2. Sistem represibil - intervine în sinteza enzimelor anabolismului.
Astfel, dacă însă se adaugă lactoză în mediu, cele 3 gene sunt rapid activate şi încep sinteza celor 3
enzyme (B-galactozidaza, permeaza, transacetilaza).
• Când în celulă s-a acumulat o cantitate mare de histidină, expresia acestor gene este
represată şi sinteza histidinei încetează.
In reglajul pozitiv, genele functionează numai în prezenta unor proteine inductoare.
Operonul lac poate fi reglat transcripțional printr-un al doilea mod, cunoscut sub numele de represie prin
catabolit.
Această formă de reglare transcripțională este influențată de prezența in mediul de cultura a glucozei,
care este un catabolit - o substanță care este scindată în interiorul celulei.
Prezența glucozei conduce în final la represia operonului lac.
• De exemplu: La E coli s-a observat că prin cultivarea pe un mediu ce conţine atât glucoză cât şi
lactoză, bacteriile utilizează preferenţial mai întâi glucoza, lactoza rămâne nemetabolizată
până când în mediu nu mai există glucoza, fenomen numit diauxie.
• Aceasta înseamnă că atâta timp cât există glucoză în mediu, genele lac sunt inactivate.
S-a remarcat faptul că biosinteza celor trei enzime (β-galactozidază, permează şi transacetilază) se face în
raport molar de 1:1/2:1/5, diferenţele datorându-se reglării la nivelul traducerii.
Fenomenul se poate realiza pe două căi:
1. gena lac Z este tradusă prima.
• Se pare că, în cazul moleculelor de ARNm policistronic, imediat după sinteza polipeptidului codificat de
prima genă, are loc separarea de ribozomi, si se formeza un nou complex de iniţiere la nivelul codonului
AUG al celei de-a doua gene.
• Frecvenţa cu care se realizează acest proces este corelată cu probabilitatea reiniţierii la fiecare
codon AUG următor.
• Se formează astfel un gradient în cantitatea de polipeptide sintetizate de la capătul 5’ spre
cel 3’ al ARNm.
• Aceste efect, numit polaritate, se realizează în cazul majorităţii moleculelor de ARNm policistronic.
2. Toate moleculele de ARNm sunt degradate la nucleotide după câteva runde de traducere.
• Degradarea este înceată si uneori începe imediat după primul eveniment de traducere.
• Degradarea ARNm policistronic începe, cel mai frecvent, la nivelul genei lac A, apoi continuă
cu gena lac Y şi, abia la sfârşit, cu gena lac Z.
• Consecinţa: la un moment dat, sunt mai multe copii ale genei lac Z decât lac Y şi, evident, cu
mult mai multe decât lac A.
REGLAREA EXPRIMĂRII GENELOR LA
EUCARIOTE
La eucariote reglarea genetică are un caracter mult mai complex deoarece:
Genele NU sunt organizate în operoni, reglajul genetic se realizează la nivelul genelor individuale;
Ca urmare, fiecare moleculă de ARNm poartă mesajul genetic pentru o singură catenă polipeptidică el fiind
monocistronic.
La eucariote genele sunt alcatuite din exoni si introni, astfel că sinteza ARN se realizează în mai multe etape prin
care se elimină intronii;
ADN eucariot este asociat cu histone formand fibra de cromatina; Structura cromatinei afectează exprimarea
genelor în celulele eucariote, molecula de ADN trebuie să se desocieze de proteinele histonice înainte ca transcrierea
să poată avea loc;
La eucariote, ARN este sintetizat in nucleu, iar sinteza proteinelor are loc in citoplasma;
Toate celulele unui organism eucariot, derivând prin diviziuni mitotice ale celulei-ou, moştenesc acelaşi număr de
cromozomi şi deci aceeaşi informaţie genetică, cu toate acestea apar diferenţieri celulare specifice;
Aceste diferentieri pot fi explicate prin faptul că unele gene funcţionează permanent, în timp ce altele funcţionează
diferenţiat, în anumite momente specifice ale ontogenezei;
De exemplu, genele care dirijează sinteza pigmentului din iris de la om sunt distribuite în toate celulele corpului, dar
nu se exprimă fenotipic decât la nivelul celulelor irisului, în celelalte celule genele respective sunt permanent represate.
La eucariotele superioare, în mecanismele de reglaj genetic intervin şi o serie de substanţe de tip
hormonal care activează sau, din contră, inhibă exprimarea specifică a genelor.
• REGLAREA POZITIVĂ – activarea unor gene are loc în prezenţa unei MOLECULE EFECTOR care
poate fi o proteină, o moleculă activator de mici dimensiuni sau un complex molecular;
• Acest sistem , în anumite situaţii, necesită prezenţa AMPc şi a proteinei CAP/CRP (proteina
receptor de legare a AMPc), care iniţiază transcrierea genetică.
• REGLARE NEGATIVĂ - în celulă este prezent un INHIBITOR (represor) care împiedică transcrierea.
• Acest inhibitor interacţionează cu o anumită regiune plasată în faţa genelor reglate. Pentru
iniţierea transcrierii este necesară prezenţa unui antagonist al inhibitorului, numit INDUCTOR.
• In plus, la eucariote mai pot există două tipuri de reglare a activităţii genelor:
1. REGLARE PE TERMEN SCURT
se bazează pe mecanisme moleculare reversibile, reprezentate de modificări în activitatea unor gene;
Are loc:
la nivelul transcrierii,
la nivelul prelucrării ARNm,
la nivelul transportului ARNm în citoplasmă,
la nivelul sintezei proteinelor,
la nivelul degradării ARNm,
la nivelul cromatinei sau la nivel cromozomal; si
2. REGLARE PE TERMEN LUNG
are loc prin evenimente ce conduc la diferenţierea celulară;
de regulă, este ireversibila şi implică fenomene legate de diferenţierea celulară ce au loc în cursul
ontogenezei.
A. REGLAJ PE TERMEN SCURT
Controlul transcripţional determină care dintre gene este transcrisă la un moment dat şi rata cu care se
realizează procesul de transcriere.
La eucariote genele contin secventa promotor, care reprezinta situsul de recunoastere si de legare a enzimei
ARN polimeraza. În cele mai multe cazuri, reglajul transcripțional are scopul de a controla inițierea
transcrierii la nivelul promotorului.
Abilitatea ARN polimerazei de a se lega la promotor si de a transcrie o anumita gena este influentata de un
grup de proteine numite FACTORI GENERALI DE TRANSCRIERE.
Factorii generali de transcriere sunt necesari pentru un nivel bazal al transcrierii.
În plus, celulele eucariote mai posedă o gamă variată de FACTORI REGLATORI DE TRANSCRIERE care
servesc la reglarea ratei de transcriere a genelor țintă.
Aceștia recunosc, de regulă, secvențe de ADN (analoage cu situsurile operator din apropierea promotorilor
bacterieni) situate în vecinătatea promotorului.
La eucariote, aceste secvențe de ADN sunt în general cunoscute ca elemente de control sau elemente
reglatoare.
Când un factor de reglare a transcrierii se leagă de un element de
control, acesta afectează transcrierea genei asociate, putand creste rata
de transcriere - caz in care factorul de transcriere este denumit
ACTIVATOR, iar secvența la care se leagă se numește
AMPLIFICATOR (enhancer)
sau poate acționa ca REPRESORI ai transcrierii prin legarea la
elemente numite silențiatoare (silencers).
Proteinele reglatoare pot modifica compoziția sau aranjamentele
nucleosomilor în vecinătatea unui promotor, afectând astfel transcrierea.
Acest fenomen se numește control combinatorial deoarece combinația a Reglaj transcripțional prin factorii de reglare a
mai multor factori determină expresia oricărei gene ținta. transcrierii
Aceste proteine pot acționa ca:
(a) activator pentru creșterea ratei de transcrierii sau
(b) (b) represor pentru scăderea ratei de transcriere.
Reglarea transcrierii genelor la eucariote se mai poate
realiza şi prin procesul de metilare a ADN.
Astfel, imediat după replicare, o parte din bazele azotate
(în special citozina) suferă un proces de metilare (prin
intervenţia unei metil transferaze).
O primă condiţie pentru ca procesul de transcriere să poată fi iniţiat este ca nucleosomii să poată fi îndepărtaţi de la nivelul
regiunii de interes.
Proteinele nonhistonice îndeplinesc rolul unor activatori specifici ai genelor asigurând transcrierea diferenţiată a genelor ,
ele interacţionând cu histonele pe care le îndepărtează de la nivelul genelor ce urmează a fi transcrise
Histonele, la rândul lor, pot să influenţeze proprietăţile de transcriere ale ADN prin modificări chimice (fosforilare,
acetilare, metilare) afectând astfel interacţiunea ADN- histone.
2. Reglajul genetic la nivelul maturării ARNm
Odată prelucrat, ARNm migrează din nucleu în citoplasmă, la nivelul porilor din membrana nucleară.
Reglajul genetic este acela care decide ce secvenţe de ARNm vor fi degradate în nucleu şi care
vor fi exportate în citoplasmă, acolo unde se realizează sinteza proteică.
Numai o mică parte din ARNm sintetizat în nucleu, migrează în citoplasmă, cea mai mare parte din
ARNm fiind degradat în nucleu cu ajutorul unor enzime.
Acestea sunt enzime diferite ce operează în tipuri variate de celule, fapt ce determină ce sinteze
proteice caracteristice vor realiza celulele respective.
Constă în faptul că nu toate moleculele de ARNm matur migrate în citoplasmă vor fi utilizate în
procesul sintezei proteice.
Are rolul de a selecta moleculele de ARNm matur, migrate în citoplasmă, care vor fi
degradate.
De exemplu, în cazul genelor hemogobinei, ARNm are o mare stabilitate în timp, astfel că el
serveşte repetat pentru sinteza proteică.
Dupa sinteza, proteinele pot fi modificate chimic prin adăugarea de grupuri de metil, fosfat,
acetil și proteine (ubiquitina).
Modificările chimice apar ca răspuns la stimuli externi, cum ar fi: stresul, lipsa de nutrienți,
căldură sau expunerea la lumină ultravioletă.
Reglaj prin intermediul hormonilor
La eucariotele superioare, reglarea pe termen scurt (la nivelul transcrierii genetice), este în mare
parte mediată de hormoni.
Un anumit hormon poate avea drept ţintă una sau mai multe tipuri de celule, fiecare tip
răspunzând diferit la acelaşi hormon.
Unii hormoni reglează activitatea genelor influenţând transcrierea, traducerea sau funcţionarea
unor enzime cum este adenilat ciclaza.
De exemplu, cei mai mulţi hormoni polipeptidici îşi exercită efectele lor iniţiale la nivelul
membranei celulelor ţintă, stimulând activitatea adenilat- ciclazei care converteşte ATP la
AMPc, capabil să stimuleze sinteza genelor, ca şi în cazul procariotelor.
Hormonii steroizi acţionează direct la nivelul transcrierii genetice, fără intervenţia AMPc, în timp
ce alţi hormoni pot afecta histonele stimulând astfel procesul de transcriere.
Hormonii steroizi funcționează ca molecule de semnalizare care se leagă direct la factorii de reglare a
transcrierii modificandu-le funcția. Aceasta permite unei celule să răspundă la un hormon prin reglarea unui
set special de gene.
Acțiunea finală a unui hormon steroid este de a afecta transcrierea genei.
La animale, hormonii steroizi acționează ca molecule de semnalizare care sunt sintetizate de glandele
endocrine și secretate în sânge, dupa care sunt preluați de celule care pot răspunde la hormoni în moduri
diferite. Exemple:
Ecdisonul, un hormon steroid identificat la insecte, inclusiv la Drosophila, interacţionează cu receptori
nucleari şi controlează procesul de metamorfoză (transformarea larvei în adult);
Vitamina D3, un derivat steroidic, are rol important în reglarea metabolismului calciului şi în diferenţierea
oaselor. Acţionează prin legarea la nivelul unui receptor nuclear similar receptorilor pentru hormonii
steroidici;
Receptorii pentru tiroxină şi acid retinoic sunt localizaţi în nucleu şi sunt foarte asemănători cu receptorii
pentru hormonii steroizi; Tiroxina si acidul retinoic sunt substanţe morfogenetice, adică induc sau controlează
diferenţierea celulară. Tiroxina induce transformarea mormolocilor în broaşte, iar acidul retinoic determină axul
antero-posterior în cursul dezvoltării membrelor.
LA PLANTE, au fost identificate numeroase substanţe care au diferite roluri în controlul creşterii şi
dezvoltării, ele fiind denumite hormoni vegetali. Hormonii vegetali sunt de cinci tipuri:
• Etilena induce, pe lângă alte activităţi, coacerea fructelor, maturarea florilor şi senescenţa plantelor.
• Giberelinele- la fel ca şi hormonii steroizi animali, stimulează transcrierea şi, în acest fel, determină
creşterea cantitativă a anumitor proteine specifice implicate în anumite procese majore de formare şi
diferenţiere celulară.
Atunci când sunt aplicate plantelor giberelinele produc o serie de efecte, aşa cum sunt cele observate
în cazul plantelor pitice („dwarf”) la care determină creşterea în înălţime.
Deşi acţiunea giberelinelor a fost intens studiată, până în prezent nu s-au evidenţiat receptori pentru
aceşti hormoni iar mecanismul molecular nu este pe deplin clarificat
B. REGLAREA PE TERMEN LUNG
Heterocromatina, puternic condensată, este prezentă mai ales în celulele înalt diferenţiate care
sintetizează foarte puţine proteine comparativ cu celulele nediferenţiate.
• De exemplu, în leucocitele normale apar mase mari de heterocromatină sub forma unor blocuri
puternic condensate la periferia nucleului, în timp ce în cazul leucemiilor aceste aspecte sunt
absente, celulele trecând în starea nediferenţiată, cu sinteze proteice intense şi capabile de
diviziuni celulare rapide.
Reglarea procesului de citodiferenţiere
Procesul de diferenţiere celulară sau citodiferenţierea este specific organismelor eucariote pluricelulare;
El se refera la modificările structurale şi funcţionale pe care le suferă celulele ce rezultă (în urma unor
diviziuni mitotice repetate) din celula-ou sau zigot.
La organismele eucariote, conţinutul în ADN este acelaşi, indiferent de tipul celular, ceea ce înseamnă că
diferenţierea celulară şi dezvoltarea organismului reprezintă rezultatul unor evenimente programate genetic
ce determină activarea sau represia genelor.
Reglarea procesului de citodiferenţiere, se realizează la niveluri diferite:
la nivelul cantităţii de ADN şi a replicării materialului genetic,
la nivelul transcrierii şi traducerii
la nivel cromozomal sau al întregului genom.
Deşi se consideră că toate celulele unui organism conţin aceeaşi cantitate de ADN, s-a dovedit că există unele
variaţii ce se datorează unor procese de replicare diferenţiată precum:
suprareplicarea anumitor regiuni cromozomale şi subreplicarea altora (mai ales a regiunilor
heterocromatice).
Fenomenul diferenţierii celulare se realizează într-o ordine cronologică strictă,
după un program extrem de riguros a cărui nerespectare conduce la modificări
anormale ale organismului.
De exemplu: la om unde există aproximativ 1013 celule, în cursul dezvoltării
ontogenetice are loc diferenţierea a peste 150 tipuri diferite de celule,
deosebite ca formă, mărime, structură sau funcţie.
Studiul diferenţierii celulare la mamifere este dificil, motiv pentru care cercetătorii au
ales un sistem model la care dezvoltarea embrionară să poată fi urmărită cu
uşurinţă, este reprezentat de cel de la Drosophila melanogaster.
Avantajele alegerii datorându-se următoarelor caracteristici:
– genom de dimensiuni mici
– număr mic de cromozomi (patru perechi) şi existenţa cromozomilor
politeni (uriasi);
– prezintă mai multe stadii larvare, dezvoltarea fiind prin metamorfoză (ou-
larvă-pupă-adult), întregul proces de metamorfoză (dezvoltarea de la ou la
adult) durează aproximativ nouă zile.
Genele implicate în controlul dezvoltării la D.melanogaster, au fost identificate şi studiate pe baza
mutaţiilor produse la nivelul lor, care au condus fie la apariţia unor structuri anormale fie la moartea
organismului. Aceste gene pot fi incluse în cel puţin trei grupuri:
gene de segmentare: sunt exprimate după fecundare la nivelul zigotului şi determină numărul şi
organizarea segmentelor corpului.
genele homeotice: se exprimă după genele segmentare şi determină identitatea fiecărui segment
individual.
La plante -există diferenţe între cantitatea de ADN din meristeme şi cea din diferite organe:
la nivelul celulelor meristematice cantitatea de ADN este mai mică în timp ce în alte organe, cum
sunt cotiledoanele care sunt alcătuite din celule înalt diferenţiate, cantitatea de ADN este mai mare.
Diferenţierea celulară ce apare în cazul organismelor multicelulare se datorează nu numai intervenţiei
genelor menţionate ci şi unor mecanisme specifice de comunicare şi semnalizare ce se realizează
între celule.
In aceste mecanisme sunt implicate o serie de proteine ce interacţionează cu receptori caracteristici
aflaţi la suprafaţa celulelor ţintă.
In urma interacţiunii dintre semnalul molecular şi receptorul său specific sunt generate alte semnale
intracelulare care “informează” nucleul asupra necesităţii stimulării proliferării celulare, fenomen
numit proces de transducţie a semnalelor.
In realizarea acestui proces participă o serie de factori cu funcţii distincte:
factori de creştere celulară (de exemplu, factorul de creştere epidermic),
receptori membranari proteici,
transmiţători citoplasmatici fosforilanţi,
factori nucleari de transcriere.
O mare parte a acestor factori este determinată de o categorie aparte de gene denumite proto-oncogene.
MUTAȚIILE GENETICE ȘI
REPARAREA ADN
• Funcția primară a ADN este aceea de a stoca informații pentru sinteza proteinelor celulare.
• ADN este o moleculă foarte stabilă care replică cu o precizie uimitoare, cu toate acestea, în cazuri relativ
rare, poate să apară o mutație.
• Termenul de mutație se referă la modificările apărute în structura şi funcţia materialului genetic, care se
transmit de la o generaţie la alta şi care nu sunt rezultatul segregării genetice sau recombinării genetice.
• Capacitatea materialului genetic de a suferi mutaţii se numeşte mutabilitate.
• Termenul de mutant se referă la un individ care rezultă dintr-un organism normal dar care, fenotipic,
prezintă anumite diferenţe, mai mult sau mai puţin evidente.
• Uneori aceste modificări pot fi reparate iar celulele respective redobândesc fenotipul normal.
• Deoarece mutațiile pot fi destul de dăunătoare, organismele au dezvoltat mai multe moduri de a repara
molecula de ADN deteriorata.
Există cazuri în care nu toate modificările de la nivelul genelor sunt urmate de efecte fenotipice
evidente; în acest caz se poate spune că genele sunt tăcute sau silenţioase (silent genes).
• Atunci când mutaţia determină modificarea genei de tip sălbatic şi conduce la apariţia unei alele
mutante, ea se numeşte mutaţie înainte (forward mutation),
• iar mutaţia de la tipul mutant la tipul normal se numeşte mutaţie înapoi (back mutation).
Importanța mutațiilor
1. Mutația este sursa tuturor variațiilor genetice, materia primă a evoluției. Fără mutații și variațiile pe care le
generează, organismele nu s-ar fi putut adapta la mediile schimbătoare;
2. Mutațiile servesc ca instrumente importante ale analizei genetice (experimentele lui Mendel la mazare, ale lui
Morgan la D. melanogaster);
3. Mutațiile sunt utile pentru cercetarea proceselor biologice fundamentale.
Astfel, descoperirea mutațiilor care afectează diferitele componente ale unui sistem biologic și studierea efectelor lor
poate duce adesea la o mai buna înțelegere a respectivului sistem.
mutantele condiţionat letale – sunt organisme care prezintă anumite modificări ce determină moartea acestora în
anumite condiţii (restrictive sau nonpermisive) sau supravieţuirea lor în alte condiţii (condiţii permisive).
De exemplu, la Bacillus stearothermophilus, o mutantă termosensibilă sintetizează anumite
proteine, inactive atunci când bacteria este cultivată la 55o C (temperatură nonpermisivă), în
timp ce, la temperatura de 47oC (temperatură permisivă) proteinele sintetizate prezintă funcţii
normale.
Deseori, mutaţiile determină moartea celulelor afectate, fiind astfel letale, sau alteori, le
conferă acestora anumite avantaje selective (de exemplu, rezistenţă la anumite antibiotice, la
acţiunea unor virusuri etc.).
Clasificarea mutaţiilor
După mărimea segmentului de ADN afectat, se deosebesc:
Mutaţiile genice care afectează structura şi funcţia genei; când este afectată doar o pereche
de nucleotide mutaţia se numeşte mutaţie punctiformă.
Mutaţiile cromozomale- determinând modificări ale structurii şi numărului cromozomilor la
eucariote.
MUTATII GENICE
O mutație genica apare atunci când secvența de ADN dintr-o gena este modificată într-un mod
permanent.
Când este afectată doar o singura pereche de nucleotide mutaţia se numeşte mutaţie
punctiformă.
Mutaţiile punctiforme
Mutaţiile punctiforme se pot datora:
1. Substituției unei perechi de nucleotide de către o alta (mutaţii prin substituţie);
2. Eliminarii (deleţia) unei perechi de nucleotide;
3. Inserării unei noi perechi de nucleotide (adiţie);
4. Inversării unei anumite secvenţe de nucleotide (inversii); si
5. Duplicatiilor - datorate copierii unei anumite secvenţe de ADN şi integrarea sa în continuarea celei
iniţiale.
MUTAŢII PRIN SUBSTITUŢIE
In acest caz, o secvența de ADN este modificată prin înlocuirea unei baze cu o altă bază.
O substituție a unei baze duce, de obicei, la o substituție a perechii de baze din secventa de
ADN.
In funcţie de nucleotida înlocuită, mutaţii prin substituţie pot fi clasificate în :
mutaţii de tip tranziţie – constau în înlocuirea unei purine cu o altă purină [A sau G] sau a
unei pirimidine cu o altă pirimidină [C sau T] (AT → GC ; TA → CG ; GC → AT ; CG → TA) si
mutaţii de tip transversie – constau în înlocuirea unei purine cu o pirimidină şi invers (AT ↔
TA ; AT ↔ CG ; GC ↔ CG ; GC ↔ TA).
O tranziție - este substituția unei purine cu o purină sau a unei pirimidine cu o pirimidină;
O transversie este substituția unei pirimidine cu o purină sau a unei purine cu o pirimidină
• Schimbarea succesiunii normale a nucleotidelor conduce la greşeli de împerechere
în cursul proceselor de replicare, recombinare sau reparare.
• Consecinţa modificărilor ce apar în succesiunea normală a nucleotidelor din
structura ADN poate fi modificarea cadrului de citire al mesajului genetic (frameshift)
şi, prin urmare, a fenotipului determinat de acesta. In acest caz mutatiile prin
substitutie pot fi:
Mutaţie cu sens greşit (missense mutation);
Mutaţie nonsens (nonsense mutation);
Mutaţie cu acelaşi sens (same sense mutation);
Mutaţie neutră (neutral mutation)
1. MUTAŢIA CU SENS GREŞIT (MISSENSE MUTATION)
• Are drept rezultat terminarea anormală a sintezei proteinei, determină apariţia unui codon stop
(TAA, TAG sau TGA) într-o poziţie diferită decât cea normal.
De exemplu, boala numita fibroza chistica, apare ca urmare a inlocuirii Citozinei din codonul CAG pentru
glutamina, cu Timina fiind astfel convertita in TAG - un codon STOP.
Proteina produsa nu poate functiona normal deoarece, in urma unei astfel de mutatii, va avea numai
493 amino acizi in timp ce lantul normal este alcatuit din 1480.
Proteina codificată de gena normala controlează secreția glandelor exocrine din numeroase organe,
mutațiile determinând îngroșarea secrețiilor și afectarea funcției sistemului bronhopulmonar, sistemului
digestiv, reproductiv și a altor organe.
sau mutaţie ‘tăcută’ (silent mutation) are loc cand substituirea unei nucleotide din genă nu determină
modificări în succesiunea aminoacizilor din structura proteinei (datorită degenerării codului genetic);
Daca, de exemplu, a 3-a baza din codonul TCT pentru serina, este inlocuita cu oricare dintre cele 3 baze,
serina va fi in continuare sintetizata.
Astfel de mutatii se numesc tacute deoarece ele nu modifica structura proteinei.
4. MUTAŢIA NEUTRA (NEUTRAL MUTATION)
Mutaţia neutră (neutral mutation) are loc cand deşi mutaţia determină anumite modificări în
succesiunea aminoacizilor din catena polipeptidică, funcţia proteinei nu este modificată.
Datorită caracterului degenerat al codului genetic, mutaţia rămâne fără consecinţe fenotipice.
Mutaţiile prin deleţie - presupun eliminarea uneia sau mai multor nucleotide din molecula de ADN.
La bacterii, s-a dovedit că prin deleţie pot fi eliminate chiar şi gene întregi.
• Cu toate acestea pentru ca bacteriile mutante să supravieţuiască este necesar ca gena
eliminată să nu fie esenţială supravieţuirii.
• Mutaţiile prin deleţie ocupă, ca frecvenţă, un loc important între mutaţiile spontane.
• Astfel, la E. coli, ele reprezintă aproximativ 5% din totalul mutaţiilor spontane.
Inactivarea completă a produsului codificat de o genă- prin eliminarea unei părţi din aceasta
sau a genei în întregime ;
Determină uneori fuziunea unei gene cu o alta, astfel că amândouă ajung să fie controlate
simultan;
Determină modificarea cadrului de citire a mesajului genetic (mutaţii de tip frameshift), iar
modificările fenotipice sunt evidente; ele nu permit apariţia de mutaţii de reversie cu
excepţia cazurilor în care are loc inserarea corectă a secvenţei lipsă.
MUTAŢIILE PRIN ADIŢIE SAU INSERŢIE
• Mutaţiile prin adiţie sau inserţie sunt cauzate de inserarea unei nucleotide sau a unei
secvenţe de nucleotide la nivelul unei regiuni a ADN.
Integrarea unei anumite secvenţe de nucleotide într-o genă, determină de obicei inactivarea
acesteia, prin modificarea cadrului de citire.
De cele mai multe ori, asemenea mutaţii se datorează integrării elementelor genetice
transpozabile: transpozonilor (Tn- secvente de ADN ce pot migra in diferite pozitii in cadrul
genomului ) sau secvenţelor de inserţie (IS- fragmente mici de ADN -1-2 gene).
Mutaţiile de acest tip produse de Tn sau de IS, pot suferi reversii la tipul normal, deoarece
eliminarea secvenţelor integrate se elimină în mod corect.
• Insertiile si deletiile (engl. indel) uneia sau a doua (sau mai multe) perechi de nucleotide, pot avea
consecinte devastatoare asupra unei gene datorita translatiei acesteia in cadrul fragmentului de
citire.
• In figura se arata cum in cadrul de citire, prin simpla reorientare a unei nucleotide spre dreapta ,
aceeasi secventa de nucleotide va codifica secvente diferite de aminoacizi.
Inserțiile și delețiile din secvențele care codifică proteinele pot conduce la mutații de tip
frameshift (modificări ale cadrului de citire).
Codonul de inițiere din ARNm stabilește cadrul de citire:
după codonul de inițiere, alți codoni sunt citiți ca grupuri succesive de trei nucleotide
nesuprapuse.
MUTAŢIILE PRIN INVERSIE
Sunt determinate de situaţia în care anumite secvenţe de ADN nu sunt
eliminate ci sunt integrate în ADN de origine, în orientare inversă decât
cea normlă.
Reprezintă o categorie de mutaţii datorate copierii unei anumite secvenţe de ADN şi integrarea
sa în continuarea celei iniţiale (în tandem).
De cele mai multe ori regiunile duplicate sunt alcătuite din copii multiple ale aceleiaşi secvenţe,
având astfel lungimi foarte mari.
Cea mai importantă proprietate a mutaţiilor prin duplicaţie este instabilitatea lor, ele putând
reveni cu uşurinţă la tipul normal.
Se pare că mutaţiile prin duplicaţie au avut un rol important în evoluţia materialului genetic.
• De obicei o genă nu se poate modifica fără ca funcţia sa originară să se schimbe, iar dacă
funcţia respectivă este una esenţială, organismul respectiv nu poate supravieţui.
• Atunci când au loc duplicaţii, rezultă două copii ale aceleiaşi gene, dintre care una poate suferi la
rândul ei, mutaţii putând dobândi funcţii noi.
• Acest tip de mutatii pot modifica functia proteinei rezultate.
Acest mecanism permite vieţuitoarelor de a deveni din ce în ce mai complexe, prin mărirea numărului
de gene şi a cantităţii de informaţie genetică.
Reparaţia genetică
Repararea ADN poate fi definită în sens general ca un ansamblu de răspunsuri celulare asociate cu
refacerea instrucţiunilor genetice asigurate de secvenţe normale de ADN.
La nivel molecular, mijloacele de apărare sunt de natură ereditară şi sunt cunoscute ca procese
de corectare a erorilor de copiere ce se pot produce în cadrul replicării ADN, fie ca procese
reparatorii ale leziunilor induse în structura ADN.
Totalitatea mecanismelor de reparare a leziunilor induse în structura ADN prin acţiunea agenţilor
mutageni se numeşte PROCES REPARATOR.
In funcţie de tipul de mutaţii, de modul de apariţie şi de mecanismul implicat în corectare, procesul reparator se
poate realiza prin mai multe căi, grupate în următoarele mecanisme :
Repararea directă a ADN – prin intervenţia unor enzime de tipul ADN polimerazelor, alkiltransferazelor sau
prin fotoreactivare;
Mecanismele de reparare directă nu înlocuiesc nucleotidele modificate, ci le schimbă înapoi în structurile
lor originale (corecte).
Excizia reparatorie– eliminarea nucleotidelor modificate (dimerizate) de catre un complex enzimatic şi
sinteza unui nou fragment la restul catenei de ADN prin intervenţia enzimei ADN polimeraza I;
Sistemul SOS -presupune activarea anumitor gene ce codifică produşii necesari procesului reparator, ca
• Celulele care conțin factorul F sunt denumite F+, iar celulele care nu au F sunt notate F-.
• Fenomenul conjugării a fost descoperit în 1946 (de către Lederberg şi Tatum) în urma
experimentelor cu tulpini de Escherichia coli ce conţineau sau nu o plasmidă specifică notată F.
Etape:
I n prima etapă :
• are loc sinteza de către celula donatoare a pililor de sex – structuri specializate, tubulare,
localizate la suprafaţa celulară, alcătuite din molecule de pilină (proteină a cărei sinteză este
codificată de gene plasmidiale).
A 2-a etapă a conjugării presupune:
• Replicarea are loc tot după modelul inelului rotativ numai că, de aceasta
dată în prelungirea monocatenei factorului F angajată cu capătul 5’ în
deplasarea prin tubul de conjugare se află, legată covalent, şi un
fragment din cromozomul bacterian principal.
• Cantitatea de informaţie genetică transferată, proprie celulei donatoare, este direct proporţională cu timpul
în care cele două celule au stat în contact: cu cât contactul este mai lung, cu atât segmentul de ADN
transferat va fi mai mare.
Astfel, la E. coli, pentru transferul complet al ADN cromozomal sunt necesare aproximativ 90 - 120 minute
de contact între celule,
• Procesul de conjugare dintre celulele Hfr şi celulele de tip F – serveşte la realizarea hărţilor cromosomale
la bacterii , distanţa dintre gene (dispuse în ordine pe segmentul transferat) exprimându-se în unităţi de timp
(minute).
• Procesul de transfer de segmente cromozomale din bacteria donor Hfr în cea acceptoare F – este urmat de
cele mai multe ori de transformare genetică (fenomen controlat de o serie de enzime sintetizate de gazdă) astfel
ca, porţiuni din respectivul segment se integrează în genomul noii gazde fiind menţinut şi transmis constant
în generaţiile următoare.
Conjugarea F′ x F – (sexducţia)
In cazul bacteriilor Hfr, plasmidele F rămân în mod normal integrate, astfel încât diviziunile celulare
succesive produc clone Hfr.
In anumite situaţii, tulpinile Hfr au tendinţa de a redeveni F+, prin reversia plasmidei F de la starea
integrată la starea autonomă în citoplasmă.
Excizia plasmidei F poate fi corectă sau eronată, în ultimul caz având loc un schimb de material
genetic între plasmida F şi cromosomul gazdei, prin care plasmida incorporează una sau mai
multe gene cromozomale.
Ca urmare, se formează o plasmidă F modificată, denumită F′ (F prim) care, în cursul procesului de
conjugare, este capabilă de a transmite genele cromozomale integrate unei alte bacterii
acceptoare.
Transferul de gene cromozomale bacteriene mediat de plasmidele de sex este numit SEXDUCŢIE.
In urma conjugării F’x F- se obţin doar celule de tip F’ care sunt parţial “diploide” (merozigoţi) -
celule conţinând alături de genele proprii şi gene similare provenite de la bacteria donoare.
Conjugarea F′ x F
-
• Fenomenul de transformare genetică a fost evidenţiat prima dată în 1928 de către Griffith, în
urma experimentelor realizate cu pneumococii Pneumococcus pneumoniae (cunoscut in prezent
Streptococcus pneumoniae) asupra şoarecilor, iar apoi la Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Haemophilus influenzae, Staphylococcus sp., etc.
• Ulterior, în 1944, Avery, Mac Leod şi McCarthy, au descoperit că agentul transformant este
reprezentat de ADN izolat din celulele bacteriene.
• Se poate întâmpla în mod natural atunci când bacteriile moarte se descompun și eliberează
fragmente de ADN în mediu.
• Informaţia genetică nou integrată în cromozomul bacteriei receptoare este transmisă stabil de-a
lungul generaţiilor bacteriene.
• Pentru a putea prelua ADN exogen din mediul extracelular, celulele receptoare trebuie să
manifeste o anumită stare specifică numită stare de competenţă.
• La unele specii bacteriene, starea de competenţă este o stare naturală, fiziologică, apărând într-o anumită
etapă a ciclului de viaţă şi durează un anumit interval de timp. De exemplu, la Azotobacter, Staphylococcus,
Pneumococcus competenţa este maximă pe parcursul fazei logaritmice, în timp ce la alte specii, precum:
Bacillus, Pseudomonas, Methylobacterium- competenţa este maximă la trecerea de la faza logaritmică la
cea staţionară.
• În cazul altor specii, starea de competenţă poate fi indusă prin tratamente specifice (şoc de temperatură,
adăugarea unor ioni etc.).
Într-o populaţie bacteriană, proporţia celulelor capabile de a prelua ADN exogen poate fi
estimată pe baza frecvenţei de transformare, urmărind un anumit marker genetic.
Multe bacterii se pot liza în mod natural, mai ales în timpul etapelor finale ale ciclului celular.
• În aceste condiţii, ADN este eliberat în mediu extracelular de unde poate fi preluat de alte
bacterii aflate în aceeaşi populaţie.
In acest caz, procesul natural de transformare genetică (cu fragmente de ADN cromozomal
eliberat prin metoda lizei celulelor bacteriene) se realizează în mai multe etape:
Preluarea ADN exogen de către celulele
competente;
• Această concluzie este întărită şi de observaţia că transferul de gene prin transformare genetică
are loc nu numai pe orizontală (între bacterii înrudite) ci şi între grupe de organisme neînrudite
(fenomen ce explică, de exemplu, răspandirea rezistenţei la antibiotice).
Transferul orizontal de gene numit si transfer lateral de gene este procesul prin care un
organism incorporeaza material genetic de la un alt organism fara a fi un descendent al acestuia.
In general in genetica s-a studiat mai mult transferul vertical de gene, dar acum se stie ca
transferul orizontal de gene este un fenomen semnificativ.
Transferul artificial de gene este folosit in ingineria genetica.
1. transducţie generalizată şi
2. transducţie specializată.
• Transducția specializată are loc la sfârșitul ciclului lizogen, când profagul este excizat din cromozomul
bacterian și bacteriofagul intră în ciclul litic.
• În timpul procesului de excizie din cromozomul gazdă, un fag poate îndepărta ocazional unele segmente de
ADN bacterian din apropierea situsului de integrare virală.
• ADN fagic și cel al gazdei, de la un capăt sau de la ambele capete ale situsului de integrare, sunt ambalate
în capsidă și transferate la noua gazdă infectată.
• Deoarece ADN transferat de către fag nu este ambalat în mod aleatoriu, ci este o secventă specifică de ADN
din apropierea locului de integrare a fagului, acest mecanism de transfer de gene este denumit transducție
specializată.
• În cazul fagilor ce determină transducţia specializată, ei produc particule ce conţin atât gene
fagice (majoritare) cât şi gene cromosomale bacteriene provenite dintr-o anumită regiune a
cromozomului bacterian.
• În forma lui naturală, fagul λ poate prelua, ca fag transductor, doar scurte secvenţe de ADN
din genomul gazdei în care s-a multiplicat (după ce a parcurs ciclul lizogen), dimensiunea
acestora fiind limitată de capsida fagică.
Diferența dintre transducția
generalizată, care este
procesul de transfer a oricărei
gene bacteriene la o alta
bacterie, printr-un bacteriofag
și o transducție specializată,
care este procesul de transfer a
anumitor gene bacteriene intr-o
alta bacterie.
În timp ce transducția
generalizată poate să apară
aleatoriu și mai ușor,
transducția specializată
depinde de localizarea genelor
pe cromozom și de excizia
incorectă a unui profag.
Mecanismele moleculare ale recombinării genetice
2. Recombinarea la situs specific. În acest caz, schimburile apar doar la o anumită secvență de ADN.
3. Recombinarea «nelegitimă» (neomoloaga). Este procesul prin care se unesc două segmente dublu
catenare de ADN neinrudite.
Există în plus o gamă largă de rearanjări genetice neobișnuite pentru care nu a fost încă propus niciun
mecanism sau scop, cum ar fi:
Modelul "rupere-reunire”
Modelul copierii alternative
Modelul "rupere şi copiere“
1. Recombinarea genetică generală sau recombinarea omologă
Se poate produce între molecule de ADN cu un grad mic sau chiar absent de omologie.
Acest tip de recombinare se realizează la nivelul unor situsuri particulare, localizate pe una
sau pe amândouă dintre catenele parentale.
In derularea procesului respectiv sunt implicate enzime care recunosc în mod specific aceste
secvenţe.
Acest tip de recombinare este utilizată atât de eucariote, cât și de procariote pentru a regla
expresia genelor și pentru a crește gama genetică a organismelor.
3. Recombinarea «nelegitimă» (neomoloagă)
• Este procesul prin care se unesc două segmente dublu catenare de ADN neinrudite (cum ar fi, de
exemplu, formarea fagului transductor specializat prin excizie eronată).
• Recombinarea ilegitimă este un proces natural care a fost întâi descoperit ca fiind prezent la E. coli.
• Prin acest mecanism secvențe genetice scurte sunt introduse în alte locații din genomul bacterian
fapt ce conduce adesea la o schimbare a expresiei gene învecinate.
• Una dintre căile primare prin care acest lucru se va întâmpla este mecanismul de reparare cunoscut sub
numele de îmbinare finală neomoloagă prin care două secvente de ADN neomoloage vor fi unite
prin mecanismele de reparare a genei .
• Acest proces este comun pentru celulele eucariote și tinde să acționeze ca un mecanism de
reparare, dar poate duce la mutații dacă se produce recombinarea ilegitimă.
• Intr-un organism eucariot recombinarea ilegitimă va lua adesea forma unor aberații
cromozomiale mari, deoarece segmentele de ADN sunt mult mai mari decât cele din celulele
procariote.
• Modelul "rupere-reunire", derivat din studiile genetice efectuate pe bacteriofagi, presupune ca prim
eveniment al recombinării, ruperea celor două genomuri parentale la nivele similare pe ambele molecule
de ADN.
• Fragmentele rezultate se reunesc apoi încrucişat, prin crossing-over, formând genomuri recombinate.
• Recombinarea determină formarea de molecule ce provin, integral, din moleculele de ADN parentale.
• În acest fel informaţia genetică este transferată între cele două genomuri parentale.
• Modelul copierii alternative consideră că nu ar exista un schimb de ADN între genomul donatorului şi
cel al receptorului iar sinteza moleculei de ADN recombinat are loc în cursul replicării prin folosirea
alternativă, ca matriţă, a unei catene de ADN de la donator şi a alteia de la receptor.
• Ca urmare, în una dintre catenele de ADN nou sintetizat o secvenţă de nucleotide a avut ca model
secvenţa omologă din ADN exogen si nu cea corespunzatoare.
• În conformitate cu această ipoteză, cromozomii recombinaţi sunt integral sintetizaţi "de novo" şi nu rezultaţi
prin reunirea încrucişată a unor fragmente din cromozomii parentali preexistenţi.
• Modelul "rupere şi copiere" preconizează formarea cromozomilor recombinaţi prin secţionarea fizică a
unui genom parental şi copierea celuilalt.
• Prin acest mecanism, în cazul existenţei a doi cromozomi parentali, se poate forma un cromozom
recombinat prin legarea unor fragmente vechi cu fragmente nou sintetizate ce au fost copiate după
celălalt cromozom parental.