LP RECOLTAREA PROBELOR DE SANGE

Pentru probarea diagnosticului, se recomanda urmatoarele analize si investigatii:

Pregatirea pacientului
Este foarte important ca pacientului sa i se explice procedura la care va fi supus si sa se obtina
intreaga lui complianta.
1. Recoltarea probelor se face cu pacientul in conditii bazale, inaintea oricarei proceduri
diagnostice sau terapeutice (ideal intre orele 7 si 9 dimineata, in conditii ”à jeun”- pe
nemancate); pentru evaluarea metabolismului lipidic se recomanda ca recoltarea sa se efectueze
dupa 12 ore de la ultima masa.
2. Cand probele de sange nu sunt recoltate in conditii bazale, trebuie tinut seama de efectele
aditionale pe care le pot produce efortul fizic (chiar si efortul fizic moderat poate determina o
crestere a glucozei, acidului lactic, proteinelor serice, CK), precum si a starii emotionale sau
ritmului circadian care poate afecta anumiti parametri.
3. Recoltarea probelor biologice se poate face sub forma unei probe unice (de exemplu, pentru
determinarea glicemiei bazale) sau sub forma probelor multiple (de exemplu, testul de toleranta
la glucoza sau recoltarea urinii din 24 ore).
4. Asigurati-va ca pacientul sta intr-o pozitie comoda (in pozitie sezanda sau in decubit dorsal).
5. Verificati cu mare atentie ca toate datele demografice ale pacientului sa fie corect scrise pe
formularul cu care este insotit acesta la punctul de recoltare a sangelui si etichetati corect
recipientul de recoltare.

Flebotomia – introducerea unui dispozitiv la nivelul unei vene pentru extragerea de sange.

1. Instructiuni (sistem seringa):

- Inainte de punctionarea venei, introduceti acul in tubul de recoltare, fixati-l prin rotire usoara
in sensul acelor de ceasornic.
- Punctionati vena, slabiti garoul si trageti incet pistonul, pana la oprirea fluxului sanguin.
- Scoateti tubul din ac rotindu-l in sens invers acelor de ceas; acul ramane in vena!
- Pentru recoltarea mai multor probe, fixati tubul urmator in ac si procedati conform
instructiunilor de mai sus.
- ATENTIE: Intai se scoate tubul din ac, apoi acul din vena!

2. Instructiuni (sistem vacuum):

- Fixati pistonul la baza tubului, apoi indepartati-l.
- Inaintea inceperii recoltarii, acul trebuie sa fie in vena.
- Slabiti garoul si fixati tubul in acul aflat deja in vena, rotindu-l in sensul acelor de ceasornic.
- Asteptati oprirea fluxului sanguin.
- Scoateti tubul din ac rotindu-l in sens invers acelor de ceasornic; acul ramane in vena.
- Pentru recoltarea mai multor probe, fixati tubul urmator in ac si procedati conform
instructiunilor de mai sus.
- ATENTIE: Intai se scoate tubul din ac, apoi acul din vena!
B. Probele de sange sunt recoltate cu sistemul holder-vacutainer:

Inaintea recoltarii sangelui, desfaceti acul prin rasucirea capacului sigilat. Inlaturati capacul si
expuneti partea filetata (1), avand grija sa nu indepartati teaca sterila in care se gaseste acul (2).
Asamblati acul la holder (3). Toate tuburile (4) pot fi acum umplute unul dupa altul in
concordanta cu instructiunile de mai jos:
a. Aplicati un garou pe antebratul pacientului si intepati pielea din plica cotului, ajutandu-va de
degetul mare si indexul mainii drepte.
b. Inversati pozitia mainilor cat mai curand posibil dupa ce acul a penetrat vena; apasati
vacutainerul cu degetul mare al mainii drepte, indexul si degetele mijlocii sustinandu-l.
c. Sangele este atras de vacuumul din vacutainer si curge in tub cu viteza proprie; eliberati garoul
din jurul bratului pacientului imediat ce sangele a aparut in vacutainer, ajutandu-va cu mana
stanga, sustinand in continuare holderul.
d. Retrageti vacutainerul cu mana dreapta, apasand usor cu degetul mare pe una dintre marginile
holderului.
e. Pentru a asigura optima omogenizare a sangelui cu anticoagulantul, efectuati 8-10 miscari de
inversiune a tubului.
f. Daca se recolteaza mai mult de un vacutainer, inserati cel de-al doilea tub si repetati pasii
descrisi mai sus (a-e).

Recoltarea sangelui capilar

Este utila in special in cazul pacientilor pediatrici si pentru efectuarea frotiurilor de sange. Cele
doua locuri de electie pentru recoltare sunt suprafata palmara a falangei distale a degetului si
suprafata plantara laterala sau mediala a calcaiului. Se obtine un amestec de sange provenit din
arteriole, venule si capilare care la randul sau poate fi diluat cu lichid interstitial si intracelular.

Nu se va recolta niciodata din pulpa degetului la nou-nascuti deoarece exista riscul de a leza osul
falangei.

Aditivi
Pentru a impiedica procesul de coagulare a sangelui integral, unele vacutainere contin substante
anticoagulante; anticoagularea se produce fie prin legarea Ca2+ (EDTA, citrat), fie prin inhibarea
trombinei (heparinat de litiu sau sodiu, hirudina).
Pentru a nu exista nici o confuzie in identificarea tubului de recoltare, capacele vacutainerelor
sunt colorate diferit, in functie de aditivul folosit.
Codurile de culoare pentru substantele anticoagulante sunt descrise in ISO/DIS 6710:
1. Capac mov/roz - foloseste ca anticoagulant EDTA-ul si are utilitate in hematologie, biologie
moleculara, unele teste imunochimice (ex. ACTH).
2. Capac bleu/verde - contine Citrat 9+1 si se foloseste pentru analiza coagularii.
3. Capac negru/mov - contine Citrat 4+1 si se foloseste pentru VSH.
4. Capac verde/portocaliu - contine Heparinat si se utilizeaza plasma pentru testele de chimie.
5. Capac rosu/incolor - este un tub fara anticoagulant. Serul este folosit pentru testele de chimie,
imunologie si serologie.
Unele vacutainere destinate obtinerii serului contin un activator de coagulare (care accelereaza
formarea cheagului) si un gel separator, care permite mentinerea serului dupa centrifugare in
tuburile primare, in cursul fazei preanalitice (transport catre laborator), analitice si postanalitice
(stocarea probelor in laborator).
ORDINEA SELECTARII VACUTAINER-ului functie de tipul de determinare biologica

1. Volumul optim de proba

Una din erorile cel mai des intalnite este trimiterea la laborator a unei cantitati
insuficiente de proba. Pentru a va asigura ca exista un volum adecvat de proba, recoltati
intotdeauna sange intr-o cantitate de 2 ori si jumatate mai mare decat volumul necesar
efectuarii unui anumit test (la fiecare test este precizat volumul minim de ser sau plasma
necesar procesului analitic).
In acelasi timp, trebuie sa se evite recoltarea excesiva de sange, in special la varstnici,
copii mici, pacienti internati in sectiile de terapie intensiva.
In cazurile frecvente, in care pacientilor le sunt indicate mai multe teste, tineti cont de
urmatoarele volume de sange recomandate in cazul folosirii analizoarelor automate
actuale:
- 4-5 mL sange pentru efectuarea unui profil de investigatii biochimice uzuale;
- 1 mL sange pentru efectuarea a 3-4 teste de imunochimie.

Prelucrarea probelor de sange dupa recoltare

Componentele sangelui:
In medie, un adult de 70 kg are aproximativ 4,75 - 5,6 L sange, din care aproximativ 60%
sunt plasma si 40% celule sanguine.
Celulele sanguine (hematii, leucocite si trombocite) sunt suspendate in plasma (formata din
apa si constituenti dizolvati: hormoni, anticorpi, enzime, ce sunt transportate catre tesuturi,
iar produsii lor de excretie sunt transferati apoi catre plamani si rinichi).
Prin centrifugare se pot separa atat plasma, cat si ser.
Diferenta dintre plasma si ser este ca plasma retine fibrinogenul și factori de coagulare , din
Din ser prin procesul de coagulare in vivo fibrinogenul și factori de coagulare raman in
cheagul format.
Sangele pacientului, recoltat intr-un tub fara substante anticoagulante, cu sau fara gel
separator, este lasat sa sedimenteze/sa coaguleze, dupa care va fi centrifugat si se separa
serul. Seru separat contine 2 tipuri de proteine: albumina si globuline.
Plasma este obtinuta din sangele recoltat intr-un tub cu anticoagulant si apoi centrifugat.
Anticoagulantul inhiba formarea coagulului. Plasma contine trei tipuri de proteine: albumina,
globuline si fibrinogen.
Pentru anumiti analiti exista diferente semnificative intre rezultatele obtinute la testarea din
ser si cea din plasma: potasiu, magneziu, fosfor, proteine totale, lactat etc.Se va specifica
intodeauna in care dintre cele doua fluide s-a efectuat determinarea.

Diferentele dintre valorile obtinute din ser si din plasma se datoreaza unor factori ca:
- analitul poate fi consumat in timpul procesului de coagulare: fibrinogen, trombocite,
glucoza;
- analitul poate fi eliberat din celule in timpul coagularii: potasiu, LDH, fosfor, lactat;
- anticoagulantul poate interfera cu metoda de determinare in cazul GGT, Li.

Factori care pot influența rezultatele:

- Aspectul serului :
o Hiperbilirubinemia (concentratia crescuta de bilirrubina) (eprubeta 2)-
influențiază determinarea creatininei, acidului uric și trigliceridelor
o Hemoliza (eprubeta 3) – hemoliza ușoară deterimină creșterea valorilor pentru
ASAT, LDH, K si CPK. Hemoliza masivă (>5g/l influențiază toate determinările
enzimatice, hormonii și markerii tumorali).
 o Serul lactescent (eprubeta 4) – determină valori fals crescute pentru toți
constituenții hidrofili datorită efectului hidrofob al lipidelor.

2. Plasma Versus Ser

1. Avantaje:
- Procesare accelerata: etapa formarii coagulului este eliminata; timpul de centrifugare se
poate scurta prin cresterea vitezei de rotatie.
- Cantitate mai mare: dintr-o proba de sange se obtine aprox.15-20% mai multa plasma
decat ser.
- Lipsa interferentelor legate de coagularea post-centrifugare: in ser se mai pot produce
coaguli dupa o centrifugare precoce; acest lucru nu apare niciodata in plasma.
- Rezultatele obtinute la testarea analitilor din plasma exprima mai fidel statusul in vivo
al pacientului comparativ cu cele din ser.
- Risc mai mic de aparitie in plasma a hemolizei si trombocitolizei decat in ser.
2. Dezavantaje:
- Electroforeza proteinelor este alterata in plasma de prezenta fibrinogenului (pseudo-
peak in regiunea g, ce poate mima un component monoclonal).
- Anticoagulantul poate interfera cu metoda de determinare.
- Interferenta cationica: cand se foloseste plasma heparinizata, litiul sau amoniul din
anticoagulant pot interfera cu metodele de determinare a acestora.

3. Faza precentrifugare
Serul sau plasma trebuie separate fizic de celulele sanguine cat mai repede posibil, pentru
a nu exista riscul producerii unor rezultate eronate; se recomanda astfel o limita maxima
de 2 ore din momentul recoltarii probei.
Un contact mai redus cu celulele sanguine (<2 ore) este recomandat pentru potasiu,
ACTH, cortizol, catecolamine, acid lactic si homocisteina.
Studiul efectuat de Laessig si colaboratorii sai a indicat faptul ca 17 analiti nu au fost
afectati de un contact prelungit al serului cu celulele sanguine (timp de 48 ore la
 temperatura camerei): albumina, fosfataza alcalina, ALT, bilirubina, calciu, colesterol,
CK, creatinina, magneziu, fosfor, proteine totale, trigliceride, T3, T4, uree, acid uric. Pe
de alta parte, rezultatele au fost semnificativ alterate in cazul urmatorilor analiti:
- timp de contact ~ 2 ore: glucoza (scade), potasiu (creste), LDH (creste);
- timp de contact ~ 8 ore: sideremie (creste).
Intr-un studiu mai recent, Zhang si colaboratorii sai au evaluat stabilitatea a 63 analiti in
serul care a ramas timp de 24 ore in contact cu celulele sanguine. S-a stabilit ca serul
trebuie separat in 3 ore pentru glucoza, potasiu si fosfor si in 6 ore pentru albumina,
bicarbonat, clor, peptid C, HDL colesterol, sideremie si proteine totale. Ceilalti analiti au
fost stabili timp de 24 ore in serul separat. Acest studiu demonstreaza faptul ca
laboratoarele trebuie sa revizuiasca stabilitatea analitilor testati, pentru a reduce numarul
respingerilor nenecesare de probe, in cazurile in care transportul de la punctele de
recoltare este prelungit.
Refrigerarea probelor de sange inhiba metabolismul celulelor sanguine si stabilizeaza
anumiti constituenti termolabili. Nu se recomada ca probele de sange integral sa fie
refrigerate decat daca exista recomandari specifice in acest sens. Astfel, este
contraindicata refrigerarea in cazul probelor pentru determinarea potasiului, deoarece
temperatura scazuta inhiba glicoliza si favorizeaza eliberarea potasiului din celule,
obtinandu-se astfel rezultate fals crescute. Pe de alta parte, probele din care se vor testa
ACTH, PTH, acid lactic, catecolamine si gastrina vor fi racite prin plasarea intr-un
recipient ce contine un amestec de apa cu gheata.

Centrifugarea
Centrifugarea probei in vederea obtinerii serului trebuie efectuata numai dupa ce se
constata ca sangele a coagulat complet. In mod normal coagularea se produce dupa cca.
30 minute, insa in cazul pacientilor care primesc tratament anticoagulant sau prezinta
defecte de coagulare aceasta se produce cu intarziere.
Centrifugarea probelor pentru obtinerea de ser sau plasma se efectueaza in general la
3000 g timp de 5 minute. Pentru obtinerea unei plasme deplachetate este nevoie ca proba
sa fie centrifugata timp de 15-30 minute la 2000-3000 g.
Dupa separarea serului sau plasmei, probele nu vor mai fi recentrifugate (pentru a obtine
un volum suplimentar de proba); de asemenea este contraindicata recentrifugarea in cazul
probelor recoltate in vacutainere cu gel separator.
Transferul probelor in tuburi secundare trebuie efectuat cu mare atentie, pentru a evita
contactul cu un material potential infectant.
In cazul tuburilor cu gel se va verifica obligatoriu integritatea acestuia la sfarsitul
centrifugarii. Anumite teste (ex.: hemoglobina glicozilata, plumb) necesita o proba de
sange anticoagulat si neseparat; in aceste cazuri probele nu vor fi centrifugate.

4. Transportul probelor
Timpul de transfer al probelor catre laborator poate fi:
- scurt, cand locul de recoltare/clinica este in acelasi loc cu laboratorul;
- mediu, cand locul de recoltare/clinica este in aceeasi localitate cu laboratorul, dar nu in
acelasi loc;
- lung (24 ore sau mai mult), cand locul de recoltare/clinica este in alta localitate decat
laboratorul si se trimit probele prin posta sau curieri. Aceasta situatie se intalneste mai
des in cazul trimiterii probelor pacientilor de la studiile clinice, cand toate probele se
colecteaza intr-un laborator de la pacientii situati in centre diferite, localizate geografic
diferit.
Exista mai multe tipuri de transport al probelor, in functie de natura produsului si de
stabilitatea analitilor care trebuie testati:
- transport in conditii ambientale;
- transport la rece (probe refrigerate);
- transport in gheata carbonica (probe congelate).

Reguli generale:
- in cazul unui timp de transfer scurt sau mediu, toate probele de sange vor fi
transportate ambiental in containere sau pungi speciale (daca nu exista recomandari
specifice de refrigerare a probelor) in pozitie verticala;
- nu se recomanda agitrea probelor in timpul transportului
- in cazul transferului la distanta, in special prin curieri sau posta, trebuie evitat a fi
transportat sange integral;
- probele transportate ambiental trebuie protejate de temperaturi extreme, prin
ambalarea in materiale izolante (containere sau cutii de polistiren);
- probele refrigerate trebuie plasate in apropierea pungilor cu gheata si nu direct pe
acestea;
- in cazul probelor congelate se va verifica daca dimensiunile containerului permit sa fie
introdusa o cantitate suficienta de gheata carbonica care sa reziste pe durata
transportului;
- vor fi folosite dispozitive de monitorizare a temperaturii pe durata transportului.

Stocarea probelor in laborator

Dupa incheierea procesului analitic, o parte din probe vor fi pastrate o anumita perioada
de timp, in conditii bine stabilite, astfel incat sa permita confirmarea rezultatelor,
verificarea identitatii probelor sau efectuarea unor teste suplimentare.
Reguli generale:
- procedura de stocare a probelor trebuie sa tina cont de stabilitatea analitilor;
- probele trebuie intotdeauna sa fie pastrate in tuburi inchise (pentru a evita evaporarea
acestora);
- probele pot fi depozitate in frigidere in tuburile primare, cu conditia ca acestea sa
contina gel separator;
- in congelatoare probele sunt pastrate de obicei in tuburi secundare; este posibila
depozitarea si in tuburile primare care contin gel, daca producatorul specifica acest lucru;
- se va evita pe cat posibil stocarea sangelui integral; oricum sangele integral destinat
obtinerii serului/plasmei nu trebuie pastrat in frigider;
- intervalul de pastrare a probelor este cu atat mai mare cu cat temperatura de stocare este
mai scazuta (exceptii: probele pentru electroforeza lipoproteinelor si determinarea de
apolipoproteine A1 si B nu trebuie pastrate la congelator);
- dupa decongelare proba trebuie omogenizata prin miscari de inversiune a tubului, fara a
se produce spuma; Se evita decongelarea – recongelarea.
-

1. Probele pentru hematologie contin sange pe EDTA, pot fi stocate 24 ore la 2-4º C;
2. Probele pentru biochimie si imunochimie (exceptie fac probele mentionate mai jos)
contin ser, se pot pastra 1 saptamana la 2-4º C;
3. Probele pentru determinarea PSA contin ser si se pastreaza 2 saptamani la -20º C;
4. Probele pentru screeningul prenatal al anomaliilor fetale, profil TORCH, serologie
sifilis la care s-au obtinut rezultate pozitive contin ser si se pastreaza 1 luna la -20º C;
5. Probele pentru teste de alergologie si cele pentru boli autoimune contin ser si se
pastreaza 2 saptamani la -20º C.
Probele de plasma destinate determinarii incarcaturii virale B si C, precum si probele de
toxicologie (metale) sunt consumate de obicei aproape integral in procesul analitic, de
aceea nu vor mai putea fi disponibile pentru retestari (se va solicita repetarea recoltarii).