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BIOTECNOLOGIA
En el año 1987 el Centro para el Control de enfermedades Infecciosas (CDC) en Estados Unidos publicó las
Recomendaciones para la prevención de la transmisión del VIH en el personal de la salud, Posteriormente, en
1996 el mismo CDC publicó las Precauciones Estándar que enfatizan que la sangre, todos los fluidos
corporales, secreciones, excreciones, piel no intacta y membranas de todos los pacientes deben ser
consideradas potencialmente infecciosas, independientemente del contenido visible de sangre.
PRACTICAS DE TRABAJO
− EQUIPOS DE SEGURIDAD (Contención primaria). Los elementos de contención primaria deben permitir
al operador la preparación y transferencia del material potencialmente infeccioso sin romper la barrera. Estos,
incluyen elementos simples como guantes, delantal, mascarilla, tubos de centrífuga con tapón,
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homogenizadores de tejido con sistemas cerrados, propipetas, etc, y otros elementos de mayor tecnología y de
mayor importancia como las cámaras de bioseguridad.
− DISEÑO DEL LABORATORIO (contención secundaria). El diseño debe estar pensado para proteger al
personal de laboratorio, como también a las personas que trabajan en otras áreas de la institución y a la
comunidad.
Debe estar localizado fuera del área de atención de los pacientes, visitas, y con acceso limitado. El diseño y
los materiales de laboratorio deben permitir una fácil limpieza. Cada sección requiere además un lavamanos.
Según el nivel de bioseguridad que el laboratorio requiera deben cumplirse otras especificaciones resumidas
en la Tabla 1−1.
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA
PRACTICO N°1
Material de vidrio
Material Utilización
Tubos de ensayo Contener medios de cultivo
Tubos de hemólisis Contener medios de cultivo
Placas de Petri Siembra en medio sólido en superficie
Pipetas graduadas Traspaso de líquidos en volúmenes exactos
Pipetas Pasteur Traspaso de líquidos en volúmenes pequeños
Asa de Drigalsky Extensión de siembra en placa
Matraces Erlenmeyer Contener medios de cultivo
Determina turbidimétricamente del crecimiento
Matraces Monod
bacteriano
Filtración al vacío de medios de cultivo y otros
Matraces Kitasato
líquidos
Probetas Medición de volúmenes exactos
Portaobjetos Observaciones microscópicas
Cubreobjetos Observaciones microscópicas
Portaobjeto excavado Observaciones microscópicas
Campana Durham Detección de gases
Vasos de precipitado Contener y preparar soluciones
Material diverso
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Asa recta Siembra de microorganismos en picadura
Esterilización de medios líquidos termolábiles por
Filtros millipore
filtración
Discos de antibióticos Valoración de antibióticos
Mechero Bunsen Esterilización al rojo y flameado
Porta pipetas Contener pipetas estériles
Determinación del pH de medios de cultivo y
Papel pH
soluciones
Cestillo metálico Contener material a esterilizar en autoclave
Aparatos
En los prácticos de microbiología es necesario tener todo el material a usar libres de microorganismos viables
y limpio. De esta manera se impide el crecimiento de múltiples contaminantes que pueden interferir con un
microorganismo inoculado asépticamente que constituye el objeto de estudio.
El control de la transmisión de las enfermedades infecciosas es una medida esencial para evitar el desarrollo
de epidemias. Para el control de la transmisión se utilizan técnicas de esterilización, desinfección, antisepsia,
o simplemente de higiene (higienización), dependiendo del riesgo de contagio y de sí deben aplicarse a
materiales sensibles o resistentes, o al cuerpo humano.
ESTERILIZACION.
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basuras.
La esterilización puede realizarse mediante agentes físicos (calor, filtración o radiaciones) o químicos.
CUADRO 1
El calor húmedo (vapor de agua sobrecalentado) producido en autoclave es el agente esterilizante más
utilizado. Posee una buena capacidad de penetración, provocando la coagulación de las proteínas y
consiguiéndose una esterilización rápida.
Para medios de cultivo se emplea el vapor a 121°C (1 atmósfera sobrepresión) durante 15−30 minutos. El
tiempo depende del volumen de medio a esterilizar, ya que el calor debe alcanzar toda la masa
uniformemente. Al disponer los recipientes debe evitarse que puedan quedar bolsas de aire que no sean
desplazadas por el vapor, ya que no se alcanzaría la temperatura correcta.
El calor seco se emplea para estandarizar materiales en los que el vapor no puede penetrar (sustancias oleosas,
como la vaselina), o en los que no conviene que se deposite humedad (instrumental metálico o material de
vidrio). Actúa fundamentalmente por oxidación, y es menos eficaz que el calor húmedo, por lo que deben
emplearse temperaturas o tiempos de esterilización mayores. Se utilizan hornos de aire caliente (horno
Pasteur).
Los filtros de alta eficiencia (filtros HEPA), capaces de retener todo tipo de partículas en suspensión, se
emplean para esterilizar el aire de las campanas de flujo laminar y de algunas habitaciones.
En el laboratorio se emplean membranas de filtros para esterilizar soluciones sensibles al calor. Pueden
emplearse tamaños de poro de 0.45 micras, que retienen la mayor parte de las bacterias y hongos, o de 0.22
micras que eliminan hasta las bacterias mas pequeñas, pero no los virus (lo que no tiene importancia para el
cultivo de bacterias).
DESINFECCIÓN Y ANTISEPSIA
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todos los microorganismos. Puede distinguirse de desinfección de alto nivel, que supone la destrucción de
todas las formas vegetativas (pero no necesariamente las esporas) y la de nivel medio, que alcanza a
Mycobacterium tuberculosis, pero no a algunos virus y hongos, ni tampoco a las esporas. Por debajo de este
criterio se habla de desinfección de bajo nivel.
La antisepsia es la desinfección aplicada a las superficies del cuerpo humano. Las sustancias empleadas
(antisépticos) deben ser bien toleradas por los tejidos, por lo que son menos enérgicas que los desinfectantes
y, en consecuencia, menos eficaces. A veces se usan soluciones más diluidas de los mismos desinfectantes.
Las principales aplicaciones de los antisépticos son el lavado quirúrgico de manos, la desinfección de la piel
del paciente antes de una intervención quirúrgica y la desinfección de heridas.
La actividad de los desinfectantes y antisépticos se reduce por la suciedad (especialmente si contiene materia
orgánica) por la presencia de un gran número de microorganismos y por interferencias con algunas otras
sustancias y por un pH inadecuado.
La acción antimicrobiana de muchos agentes desinfectantes es poco específica, actuando sobre distintos
componentes o funciones del microorganismo, a menudo en función de la concentración empleada, y en otros
casos se ignoran los detalles.
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y un amebicida matan amebas.
Términos referidos a la
supresión de los
microorganismos.
Situación que inhibe el crecimiento
y multiplicación bacterianos pero La refrigeración es bacteriostática;
sin matar a las bacterias. Si se muchos compuestos químicos,
Bacteriostasis (estasis,
elimina el agente bacteriostático como los colorantes, son
detención)
puede reanudarse el crecimiento. La bacteriostáticos más que
fungistasia se refiere a la inhibición bactericidas.
del crecimiento fúngico.
La ausencia de patógenos en un
objeto o zona. Las técnicas de
asepsia están diseñadas para
La filtración del aire, la luz
prevenir la entrada de patógenos en
ultravioleta, las mascarillas, guantes
el organismo. La asepsia quirúrgica
Asepsia (asepsia, sin infección) y batas y la esterilización de
pretende evitar todos los
instrumentos son medidas para
microorganismos, mientras que la
conseguir la asepsia.
asepsia médica sólo los
responsables de enfermedades
transmisibles.
En el caso de las inyecciones se
Eliminación pasajera de microbios
utiliza con frecuencia un algodón
de la piel mediante limpieza
Desgerminación empapado en alcohol; antes de la
mecánica o el empleo de un
cirugía con frecuencia se utilizan
antiséptico.
productos que contienen fósforo.
La reducción del número de
Cualquier compuesto empleado
patógenos que hay en un objeto
debe ser compatible con la
Higienización hasta niveles aceptables para la
seguridad y con los caracteres
salud pública mediante lavado
organolépticos de los alimentos.
mecánico o con agentes químicos.
Temperatura.
Todo mundo está familiarizado con el uso del hielo o de la refrigeración mecánica para controlar el
crecimiento microbiano. Como todas las reacciones químicas las reacciones bioquímicas necesarias para el
crecimiento disminuyen considerablemente a bajas temperaturas. Frecuentemente los desinfectantes químicos
son también inhibidos por las bajas temperaturas. Ya que su actividad está en función de reacciones químicas
dependientes de la temperatura, los desinfectantes trabajan mejor en soluciones templadas. Es normal que las
instrucciones de los envases desinfectantes especifiquen que se utilice a una temperatura media.
Clase de microorganismos.
Muchos desinfectantes y antisépticos tienden a tener mayor efecto sobre las bacterias gram−positivas como
grupo que sobre las gram−negativas, aunque esta diferencia no es tan significativa como ocurre con la
actividad antibiótica. Por ejemplo, un cierto grupo de bacterias gram−negativa, pertenecientes al género
Pseudomonas, presentan una resistencia poco común a los agentes químicos e incluso crecen activamente en
algunos desinfectantes y antisépticos. Estas bacterias son capaces de mantenerse en substratos en
inverosímiles como una solución salina simple y son también resistentes a muchos antibióticos. Esta
resistencia a agentes antimicrobianos está relacionada probablemente con el tamaño de las porinas (estructuras
en forma de poro que hay en la membrana externa LPS) de Pseudomonas.
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MECANISMOS DE ACCION DE LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS.
Calor.
Probablemente es método más comúnmente empleado para destruir los microorganismos es el calor. Los
medios de cultivo, material de vidrio e instrumentos médicos son esterilizados normalmente por calor.
El calor no sólo es el agente de esterilización más ampliamente utilizado y el más eficaz sino también el más
económico y el más fácil de controlar. Aparentemente el calor mata a los microorganismos al desnaturalizar
sus enzimas. En la esterilización por calor cabe tenerse en cuenta el grado de resistencia de las bacterias a la
temperatura. La resistencia al calor varía entre los diferentes microorganismos; estas diferencias pueden
expresarse a través del concepto de punto térmico de muerte. El punto térmico de muerte (PTM) es la
temperatura más baja requerida para matar a todos los microorganismos de una suspensión líquida en 10
minutos.
Otro factor a considerar en la esterilización es el tiempo requerido para que el material quede estéril. Este se
expresa como tiempo de muerte térmica (TMT), el menor tiempo necesario para que todas las bacterias de
un cultivo líquido mueran a una temperatura determinada. Tanto el PMT como el TMT son guías útiles que
indican la severidad del tratamiento requerido para matar a una población dad de bacterias.
El tiempo de reducción decimal (TRD o valor D) es un tercer concepto relacionado con el grado de
resistencia al calor de las bacterias. Es el tiempo, en minutos, en que se destruye el 90% de la población de
bacterias a una temperatura determinada. El valor D es especialmente útil en la industria de conservas
enlatadas.
El calor utilizado en esterilización se puede aplicar en forma de calor húmedo o seco. El calor seco mata por
efectos de oxidación. Una analogía sencilla es la lenta carbonización del papel en un horno cuando la
temperatura está por debajo del punto de ignición del papel. El calor húmedo mata a los microorganismos más
rápidamente porque el agua acelera la rotura de los puentes de hidrógeno que mantienen la estructura
tridimensional de las proteínas.
CALOR HÚMEDO
Un tipo de esterilización por calor húmedo es la ebullición (100ºC al nivel del mar), que mata a las formas
vegetativas de las bacterias patógenas, muchos virus y hongos y sus esporas en unos 10 minutos. El vapor
fluente (sin presión) es el equivalente en temperatura al agua hirviendo. Las endosporas y algunos virus, sin
embargo, no se destruyen tan fácilmente. El virus de la hepatitis, por ejemplo, puede sobrevivir alrededor de
30 minutos de ebullición y algunas endosporas bacterianas han resistido a las temperaturas de ebullición
durante más de 20 horas. Por tanto la ebullición no es siempre un método de esterilización eficaz. Sin
embargo, unos pocos minutos de ebullición matan a la mayoría de los patógenos y suelen dejar los alimentos
y el agua en condiciones de seguridad para el consumo.
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Para esterilizar en forma eficaz mediante calor húmedo se necesitan temperaturas superiores a la ebullición
del agua. Estas altas temperaturas se consiguen normalmente mediante vapor a presión en un autoclave. Este
es el método preferido de esterilización y se utiliza a menos que el material a esterilizar pueda resultar dañado
por el calor o la humedad. En un autoclave el vapor a una atmósfera de sobre presión (121ºC) matará a todos
los microorganismos y a sus endosporas en unos 15 minutos o un poco más, dependiendo del tipo y volumen
del material que está siendo esterilizado.
El autoclave se utiliza para esterilizar medios de cultivo, instrumentos, ropas, instrumental de uso endovenoso
y externo, soluciones, jeringas, equipos de transfusión y muchos otros artículos que pueden soportar alta
temperatura y presión. Los autoclaves industriales pueden ser de gran tamaño, pero se utiliza el mismo
principio para la olla a presión para la olla a presión en la elaboración de conservas caseras.
PASTEURIZACION
La mayoría de los procesos de pasteurización utilizados hoy en día emplean temperaturas mayores, al menos
de 72ºC, pero sólo durante unos 15 segundos. Este tratamiento, es conocido como pasteurización rápida a
alta temperatura.
Uno de los métodos más sencillos de la esterilización con calor seco es el flameado.
Este método se utiliza muchas veces en el laboratorio de microbiología para esterilizar asas de siembra; todo
lo que hay que hacer es calentar el alambre al rojo y la eficacia es de 100%. Un principio similar se utiliza en
la incineración, una forma eficaz de esterilizar y eliminar recipientes de cartón, bolsas y ropa.
Otra forma de esterilización con calor seco es la esterilización por aire caliente. Los objetos a esterilizar por
este método se colocan en un horno, donde una temperatura, generalmente de unos 170ºC, mantenida durante
cerca de dos horas asegura la esterilización. Se requiere un período de tiempo mayor y una temperatura más
alta en comparación con el calor húmedo, ya que el calor del agua se transfiere más rápidamente a un cuerpo
frío que el calor del aire. Imagine, por ejemplo, los efectos de meter brevemente la mano en un baño de agua
hirviendo y de mantenerla en un horno a la misma temperatura (100ºC) y durante el mismo tiempo.
FILTRACION
La filtración es el paso de un líquido o gas a través de un material filtrante con poros lo suficientemente
pequeños para retener microorganismos (se usa a menudo el mismo aparato que para contar
microorganismos). Se crea un vacío en el frasco receptor que ayuda a la gravedad aspirando el líquido a través
del filtro. La filtración se utiliza para esterilizar materiales sensibles al calor, como algunos medios de cultivo,
enzimas, vacunas y soluciones de antibióticos.
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denominaron virus filtrables.
En los últimos años los filtros de membrana, compuestos por sustancias como ésteres de celulosa o
polímeros plásticos, se han hecho de uso frecuente en la industria y en el laboratorio. Estos filtros tienen tan
sólo 0,1 mm de espesor y sus poros están muy igualados en tamaño. Algunos fabricantes irradian una película
de plástico de modo que se graban orificios muy uniformes, por donde han pasado las partículas de la
radiación. Los poros de los filtros de membrana incluyen tamaños de 0,22 y 0,45 um, diseñados para retener
bacterias y llegan hasta tan sólo 0,01 um, tamaño que retiene virus, e incluso a algunas moléculas grandes de
proteínas.
RADIACIONES
Dependiendo de su longitud de onda, intensidad y duración, las radiaciones tienen distintos efectos sobre las
células. Hay dos tipos de radiaciones esterilizantes: las ionizantes y las no ionizantes.
Las radiaciones ionizantes, como los rayos gamma o los haces de electrones de alta energía, tienen una
longitud de onda más corta que las de las radiaciones no ionizantes, menor de 1nm y transportan por ello
mucha más energía. Los rayos gamma son emitidos por cobalto radiactivo y los haces de electrones
acelerados hasta altas energías en máquinas especiales. Los rayos gamma penetran profundamente pero
pueden ser necesarias horas para esterilizar masas grandes; los electrones de alta energía tienen un poder de
penetración mucho menor pero bastan unos segundos de exposición. El principal efecto de la radiación
ionizante es la ionización del agua, que forma radicales hidrolizo altamente reactivos.
Las radiaciones no ionizantes tienen la longitud de onda mayor que las ionizantes, normalmente superior a 1
nm. Un buen ejemplo de radiación no ionizante es la luz ultravioleta (UV). La luz UV lesiona el DNA de las
células, formando enlaces entre timidinas adyacentes en las cadenas de DNA. Estos dímeros de timidina
inhiben la replicación correcta del DNA durante la reproducción celular. La longitud de onda UV más eficaz
para matar a los microorganismos está alrededor de 260 nm; estas longitudes de onda son absorbidas de forma
específica por el DNA de la célula. La radiación UV se utiliza para controlar los microorganismos del aire. En
las habitaciones de hospitales, guarderías, quirófanos y cafeterías se encuentran normalmente lámparas UV o
germicidas. La luz UV se utiliza también para esterilizar vacunas, sueros y toxinas y ocasionalmente para las
aguas residuales y de bebida.
Hay que distinguir entre los métodos químicos de desinfección y los métodos químicos de esterilización.
Van a producir la destrucción de todos los microorganismos patógenos. Son los desinfectantes y los
antisépticos. Los desinfectantes son sustancias químicas aplicadas sobre objetos y superficies. Los antisépticos
son sustancias químicas aplicadas sobre la piel y mucosas.
− Ser económico.
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− Tener un olor agradable.
• Detergentes catiónicos: Se pueden utilizar diluidos al 1% para la desinfección de manos. Su uso más
corriente es para la limpieza y desinfección de paredes, suelos, ropa y objetos en general.
• Clorofenoles: Son muy eficaces y se suelen asociar con los detergentes catiónicos para mejorar el
grado de desinfección.
• Compuestos clorados: Son utilizados para desinfección de superficies, ropas, urinarios, etc. Se
suelen usar diluidos en agua y un ejemplo típico lo constituyen las lejías (hipocloritos).
• Alcoholes: Se utilizan para limpiar y desinfectar la piel, las manos, el filo del instrumental y algunas
superficies pequeñas. Se utiliza el etanol para tejidos y el metanol para superficies que no vayan a
estar en contacto con la piel.
• Derivados yodados: Son utilizados para preparar la piel antes de una intervención quirúrgica, en la
punción lumbar, antes de punción para hemocultivo, etc. Son extraordinariamente efectivos y ejercen
su acción por oxidación.
• Oxido de etileno: Se emplea en forma de gas, mezclado con dióxido de carbono, ya que el óxido de
etileno puro es muy oxidante y al mezclarse con el óxido del aire podría explotar. Presenta un gran
poder de penetración y como método de esterilización es muy efectivo y duradero. La esterilización se
va a producir a temperaturas bajas (de menos de 40 grados) con una humedad relativa alta (40−60%)
durante un tiempo de 3 a 8 horas (media de 5). Para que todo esto suceda se requiere de cámaras o
instalaciones especificas para ello, que son muy caras. El óxido de etileno se puede aplicar a cualquier
material sensible al calor y que no pueda esterilizarse por otros métodos, por ejemplo instrumentos de
endoscopia, plásticos termolábiles, cauchos, material eléctrico.
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