NOŢIUNI GENERALE DE FOTOMETRIE

Definiţii
Fotometria se ocupă cu studiul şi măsurarea mărimilor caracteristice radiaţiilor luminoase, mai exact cu
studiul absorbţiei energiei luminoase la trecerea prin soluţii.
Colorimetria se ocupă cu studiul şi măsurarea intensităţii culorii unor compuşi coloraţi generaţi prin
reacţii chimice prin compararea directă cu o soluţie etalon
Spectrofotometria se ocupă cu studiul şi măsurarea absorbţiei energiei luminoase în funcţie de
concentraţia soluţiei unor compuşilor chimici incolori.

Lumina naturală contine toate lungimile de undă, începând cu domeniul ultraviolet (UV), continuând
cu cel vizibil (VIS) şi terminând cu infraroşu (IR).
Când lumina trece printr-o soluţie a unei substanţe , ea suferă o serie de modificări dependente de natura
substanţei. O radiaţie de o anumită lungime de undă şi energie parcurgând un mediu, poate fi absorbită
parţial sau total. În cazul în care nu există nici o absorbţie, mediul este transparent iar energia radiaţiei care
străbate mediul rămâne practic nemodificată, dar poate scădea în mod apreciabil viteza radiaţiei. Când o
parte din energia radiantă este absorbită, în dreptul lungimii de undă absorbite, apar în spectru, linii sau
benzi întunecate. În acest caz se vorbeste de spectrul de absorbţie al compusului respectiv.
Diferitele lungimi de undă ale radiaţiei luminoase sunt absorbite în mod diferit în funcţie de
particularităţile energetice ale moleculelor străbătute. Absorbţia radiaţiei este echivalentă cu un transfer de
energie către mediul parcurs, depinzând de energia radiaţiei şi de natura moleculelor din mediul parcurs.
Starea de excitaţie a unei molecule care a absorbit o cuantă luminoasă este de foarte scurtă durată (10-12
sec.). De obicei această energie se pierde foarte repede sub formă de caldură. Măsurarea absorbţiei radiaţiei
în funcţie de energia ei respectiv de lungimea ei de undă, ca şi de particularităţile mediului parcurs,
constituie domeniul spectrofotometriei de absorbţie.

Principiu
Dacă un mediu absorbant, având o anumită grosime, este parcurs de o radiatie luminoasă
monocromatică de intensitate I0, o parte a acestei radiaţii este absorbită (Ia), iar o parte este transmisă (It).
It
În acest caz, I0 = Ia+ It. De aici rezultă că transmisia (T) este egală cu raportul .
I0

It
T%   100
I0
unde: I0 = intensitatea luminoasă a fasciculului iniţial;
Ia = intensitatea luminoasă absorbită;
It = intensitatea luminoasă transmisă (a fasciculului care a traversat mediul).

1
 Ca urmare, absorbţia reprezintă micsorarea energiei cinetice a unui fascicul la traversarea lui
printr-o soluţie.
Conform legii Lambert – Beer, între intensitatea radiaţiei transmise şi intensitatea radiaţiei incidente
există următoarea relaţie exponenţială:
It
It= I0 x e-kcd de unde: T %   e kcd
I0
e = baza logaritmilor naturali;
k = constanta de absorbtivitate;
d = grosimea stratului parcurs;
c = concentratia molară (M) a soluţiei.

Trecând de la logaritmi naturali la cei zecimali, obţinem:

I t  I 0  10 cd sau T  10 cd
unde ε = coeficientul de absorbanta (extinctie) molară.
k
Relaţia dintre ε şi k este dată de raportul  
2,3
Atât coeficientul de absorbtivitate (k) cât şi coeficientul de absorbanta molară (ε) depind de lungimea
de undă a radiaţiei luminoase şi de proprietăţile absorbante ale substanţei.
Coeficientul de absorbanta molară reprezintă absorbanţa unei soluţii de concentraţie 1M, având
grosimea stratului de 1 cm.
Transmisia scade logaritmic cu concentraţia şi grosimea stratului de soluţie străbătut.
Logaritmul zecimal cu semn schimbat al transmisiei (-lgT sau lg1/T) este direct proporţional cu
concentraţia şi grosimea stratului. De obicei, grosimea stratului soluţiei este constantă şi reprezintă
lăţimea cuvei de spectrofotometru, care în condiţii standard, este de 1 cm. Logaritmul cu semn schimbat
al transmisiei procentuale se numeste absorbanţă (A) sau densitate optică (DO).
1
A  lg(  100)  2  lg T
T

După legea Lambert – Beer, absorbanta este direct proportională cu concentraţia soluţie (A= ε c d ).
Pornind de la valoarea absorbantei A= 2- lgT şi dând diferite valori transmisiei, obţinem următoarea
corespondenţă între absorbanta (A) şi transmisie (T):

A ∞________________________________________________0
2 1

1 10
T 0_________________________________________________100%

2
 Această corespondenţă între A şi T se poate observa cu uşurinţă pe scala instrumentului de
măsură: galvanometrul spectrofotometrului SPEKOL- Zeiss Jena sau a altor fotometre.
Din relaţia : A= ε x c x d se poate calcula concentraţia (c):
A A
c 
 d  d
Este necesar să se cunoască valoarea coeficientului de absorbanta molară (εM), care se exprimă în
M-1cm-1 şi care depinde strict de lungimea de undă. De exemplu: εM pentru NADH sau NADPH este
6.22x103 M-1cm-1 la lungimea de undă λ=340 nm şi de numai 3.4x103 M-1cm-1 la lungimea de undă λ=365
nm. Pentru uşurarea calculelor, în laborator se foloseşte submultiplul coeficientului de absorbanta molara
εM, adică coeficientul de absorbanta milimolara , εmM.
O importanţă cu totul deosebită o are în biochimie cunoşterea lui εmM pentru cele două
piridinnucleotide reduse NADH şi NADPH, deoarece marea majoritate a reacţiilor enzimatice de
determinare a unor metaboliţi au la bază reacţia directă sau în sistem de reacţii cuplate, o reacţie catalizată
de o dehidrogenază NAD(P)- dependentă ce evoluează cu reducerea sau oxidarea acestor
piridinnucleotide.
Formulele de calcul utilizate în cazul unor astfel de determinări vor fi prezentate în cadrul
lucrărilor respective.
Prezentăm mai jos spectrul de absorbţie al piridinnucleotidelor reduse şi oxidate.

Aparatura utilizată în fotometrie

Instrumentele utilizate pentru măsurarea intensităţii radiaţiei luminoase se numesc în general
fotometre. În funcţie de lăţimea benzii spectrale utilizate, aceste aparate se împart în colorimetre
(fotocolorimetre) şi spectrofotometre.
În funcţie de lăţimea benzii spectrale şi de tehnica de măsurare, metodele utilizate la determinări
bazate pe absorbţia radiaţiei luminoase se împart în metode colorimetrice şi metode fotometrice.
Metodele colorimetrice se bazează pe compararea absorbţiei a două soluţii de concentraţii
diferite ale aceleiaşi substanţe colorate. Măsurătorile se execută într-un domeniu larg al spectrului,
eventual în lumina albă, rezultatele obţinute fiind independente de puritatea spectrală a luminii utilizate.

3
În colorimetrie nu se fac determinări de absorbanta, ci numai comparări vizuale (colorimetrie vizuală)
sau fotoelectrice (fotocolorimetrie). Exemple de colorimetre sunt: colorimetrul Dubosq, fotometrul
Pulfrich şi fotocolorimetrul FEK-M. În timp ce colorimetrul Dubosq utilizează lumina albă, fotometrul şi
fotocolorimetrul utilizează lumina monocromatică realizată de filtre colorate. Aceste măsurători sunt
considerate imprecise şi de aceea nu vor constitui obiectul descrierilor noastre.
Instrumentele utilizate în spectrofotometria de absorbţie se numesc spectrofotometre. Indiferent
de tipul de construcţie si de gradul de automatizare, principalele părţi componente ale unui
spectrofotometru sunt: sursa luminoasă, monocromatorul, dispozitivul cuvelor, dispozitivul fototraductor,
instrumentul de măsură şi dispozitivul de înregistrare a datelor.
Sursa luminoasă pentru domeniul vizibil al spectrului este o lampă de incadescenţă cu filament
de wolfram (cu domeniul de emisie între 330-1000 nm), iar pentru domeniul ultraviolet- lămpi cu
descărcare în gaze, cum ar fi cea cu deuteriu (care emite între 200-400 nm) sau cu mercur. Spre deosebire
de lampa de deuteriu, care asigură un spectru continuu în domeniul UV, lampa de mercur emite radiaţii
discontinue. Benzile de emisie ale lămpii cu mercur sunt la 334 nm, 365 nm, 405 nm, 436 nm şi 546 nm.
Monocromatorul este un selector de radiaţii spectrale care permite obţinerea unui fascicul de
radiaţie monocromatică. Lumina monocromatică este alcătuită din radiaţii care au o singură lungime de
undă (λ) şi care este percepută de ochiul omului ca având o singură culoare. În cazul fotometrelor,
monocromatorul este reprezentat de filtre de culoare, iar în cazul spectrofotometrelor, de prisme sau reţele
(grile) de difracţie.
În cazul fotometrelor cu linii spectrale, sursa de lumină este o lampă cu mercur, care emite benzi
de emisie. Cu ajutorul unor filtre de interferenţă, se izolează radiaţii monocromatice cu lăţimea benzii de
1nm. Aceste aparate sunt convenabile pentru majoritatea analizelor biochimice dintr-un laborator clinic.

Spectrofotometrele moderne au radiaţia monocromatică exprimată ca număr de undă ( ) şi nu ca

lungime de undă (λ), cu precizarea că numărul de undă se exprimă în cm-1, iar lungimea de undă în nm (mμ).
Raţiunea este că energia unei cuante de lumină (foton) este direct proporţională cu numărul de
1
undă şi invers proporţională cu lungimea de undă:   (cm 1 )

Lungimea de undă Număr de undă
λ [nm] 1
 (cm 1 )

200 50 000
300 33 333
400 25 000
500 20 000
600 16 666
700 14 286
800 12 500
900 11 111
1000 10 000

4
 Dispozitivul cuvelor cuprinde lăcaşurile pentru una sau mai multe cuve care conţin soluţiile de
cercetat. Cuva martor conţine numai solventul, în general apă distilată, în timp ce cuva de măsurat conţine
soluţia de analizat. Cuvele pot fi din sticlă sau masă plastică pentru soluţii care absorb energia luminoasă
în domeniul vizibil al spectrului sau din cuarţ pentru domeniul ultraviolet. Grosimea standard a stratului
de soluţie din cuva de reacţie este de 1 cm. Sistemul portcuvă poate fi termostatat sau netermostatat, după
caz.
Se utilizează termostatarea cuvelor când se urmăreşte activitatea enzimatică.

Dispozitivul fototraductor reprezintă instrumentul care permite transformarea energiei

luminoase transmise de soluţie în energie electrică. Fototraductoarele utilizate sunt diferite din punct de
vedere al sensibilităţii lor şi al domeniului spectral utilizat.
Acestea pot fi: fotodiode, fotocelule sau fotomultiplicatoare.

Instrumentul de măsură poate fi un galvanometru sau un potenţiometru înregistrator şi afişaj

digital sau înregistrare pe hârtie.

Dispozitivul de înregistrare a datelor, prezent la spectrofotometrele moderne dotate cu

microprocessor, este reprezentat de diferite tipuri de imprimante grafice.
Cele mai moderne tipuri de spectrofotometre sunt computerizate, operaţiile putând fi
automatizate, iar prelucrarea datelor facându-se automat.

Din punct de vedere constructiv, diferitele tipuri de spectrofotometre pot fi clasificate astfel:
- spectrofotometre monofascicul;
- spectrofotometre dublu fascicul: a) cu fascicule identice (fascicul despicat sau
“split beam”);
b) cu fascicule neidentice (cu dublu fascicul cu λ diferite
sau “double beam wave-length”);
- spectrofotometre cu “succesiune de diode” (“diode array spectrophotometer”).

Spectrofotometrul monofascicul este prevăzut cu un singur monocromator, cuva martor şi cuva

cu probă fiind plasate succesiv în calea fasciculului monocromatic unic.
În cazul spectrofotometrului VSU-2 (Zeiss Jena), fotocurentul este determinat prin compensare
potenţiometrică şi se raportează la fotocurentul cuvei martor.
Spectrofotometrul Spekol (Zeiss Jena), pe care îl vom utiliza la efectuarea determinărilor
practice, lucrează la lungimi de undă cuprinse între 350-700 nm, având ca sursă de lumină o lampă de
incandescenţă cu filament de wolfram, iar ca monocromator, o reţea de difracţie.

5
 În cazul spectrofotometrului Spekol, pentru citirea absorbanţei se foloseşte metoda deviaţiei: se
aşează succesiv în calea luminii monocromatice, cuva martor şi apoi cuva cu probă şi se citeşte deviaţia
acului indicator al galvanometrului care este etalonat în valori de transmisie şi de absorbanta.
Etalonarea aparatului se face faţă de apă distilată, pentru transmisia 0 (zero) - când fasciculul de
lumină monocromatică este obturat şi pentru transmisia 100% - când energia fasciculului trece integral
prin cuva cu apă distilată.
Etalonarea aparatului se execută pentru fiecare schimbare a lungimii de undă cât şi în cazul
aceleiaşi lungimi de undă – când citirile durează mai mult deoarece aparatul prezintă o alunecare în timp a
semnalului electric.
Spectrofotometrul cu dublu fascicul identic este prevăzut cu un singur monocromator.
Despicarea fasciculului este realizată de un disc “despicator” (“chopper”), care se roteşte cu turaţie mare.
Radiaţia monocromaţică trece alternativ fie prin spaţiul gol al discului “chopper”, fie este reflectată de
disc spre o oglindă realizându-se un al doilea fascicul paralel, de aceeaşi lungime de undă.
În calea unuia dintre fascicule este plasată cuva martor, iar în calea celui de-al doilea, cuva cu
probă. Instrumentul de măsură înregistrează diferenţa de absorbanta dintre cele două cuve, la aceeaşi
lungime de undă.
Un astfel de aparat este Specord UV-VIS (Zeiss Jena) care permite înregistrarea automată a
spectrului de absorbţie al unui compus chimic.
Spectrofotometrul cu dublu fascicul cu lungimi de undă diferite este prevăzut cu două
monocromatoare care lucrează independent. Radiaţia monocromatică a unuia dintre monocromatoare este
reflectată de o oglindă spre discul “chopper” care la rândul lui o reflectă spre cuva unică cu probă.
Radiaţia monocromatică a celui de-al doilea monocromator, la altă lungime de undă, poate străbate cuva
de reacţie cu probă alternativ, când în calea sa, discul “chopper” prezintă spaţiul gol. Aceeaşi cuvă de
reacţie este deci străbătută alternativ de două radiaţii monocromatice, instrumentul de măsură înregistrând
diferenţa de absorbanta la cele două lungimi de undă diferite. Aparatul este astfel utilizat pentru
înregistrarea spectrelor diferenţiale.
Spectrofotometrul cu “succesiune de diode” este o realizare recentă.
Principiul de construcţie al acestui aparat este complet diferit de cel al spectrofotometrelor
clasice, aparatul neavând nici o piesă în mişcare.
În cazul spectrofotometrelor clasice, realizarea unei lumini monocromatice cuprinsă între 200nm
şi 900nm, necesită rotirea monocromatorului, ceea ce durează un anumit interval de timp.
La spectrofotometrul cu succesiune de diode, sursa de lumină emite lumină albă, cuprinsă între
200nm şi 900nm, care trece integral prin cuva de reacţie. O parte dintre aceste radiaţii sunt absorbite de
compusul chimic din cuvă; ceea ce se transmite, purtând benzile de absorbţie caracteristice compusului
chimic, întâlneşte reţeaua de difracţie holografică, radiaţiile monocromatice fiind reflectate pe o suprafaţă
acoperită de o succesiune de diode, fiecare din ele realizând un fotocurent proporţional cu intensitatea

6
radiaţiei monocromatice incidente. Se realizează astfel instantaneu (sub 0.1 sec.) întregul spectru de
absorbţie al compusului cercetat. Prelucrarea datelor se face de către un computer.
Spectrofotometrul permite realizarea unui studiu dinamic în timp al întregului spectru de
absorbţie al unui compus chimic.

Determinarea concentraţiei unui compus cu ajutorul curbei de etalonare

Curba de etalonare (curba standard) urmăreşte stabilirea corelaţiei între concentraţia unui
compus şi absorbanta sa în limitele legii Lambert – Beer. Se porneste de la faptul că două probe
prelucrate identic, una de concentraţie cunoscută, numită standard şi alta de concentraţie necunoscută,
numită proba de analizat, vor avea extinctii proporţionale cu concentraţiile compusului respectiv. Este
deci suficient să se măsoare absorbanta unei probe de concentraţie cunoscută pentru ca apoi să se poată
calcula concentraţia probei de analizat. Pentru mai multă rigurozitate, se măsoară absorbanta mai multor
probe cu concentraţie cunoscută, în ordine crescătoare. Absorbantele se citesc faţă de proba martor, care
conţine toţi reactivii utilizaţi la analiză cu excepţia compusului care trebuie determinat. Valorile obţinute
se reprezintă grafic aşezând pe ordonată valorile absorbantei iar pe abscisă cele ale concentraţiei. Se
obţine o linie care trece prin origine şi care este dreaptă pe o anumită porţiune. În afara domeniului de
liniaritate, legea Lambert-Beer nu mai este respectată şi, în consecinţă, această porţiune a curbei nu poate
fi utilizată. Raportând absorbantele unor soluţii de concentraţie necunoscută la curba standard se poate
determina pe abscisă concentraţia lor.
În domeniul de liniaritate, curba standard este caracterizată de un factor de pantă (F) care
c
reprezintă raportul dintre concentraţia soluţiei şi absorbanta obţinută. Deci F Deoarece
A
g moli
concentratia se poate exprima în μg sau μmoli, factorul de pantă devine: , sau F 
A A
De regulă, F se calculează ca medie a valorilor individuale a fiecărui punct de pe curba standard.
Înmulţind direct absorbanta probei necunoscute (ΔAp) cu factorul de pantă F, se poate afla direct
concentraţia probei necunoscute. Trebuie menţionat că atât curba de etalonare cât şi factorul de pantă al
curbei sunt proprii setului de reactivi şi aparatului cu care se lucrează. Schimbarea reactivilor sau a
aparatului de fotometrare impune efectuarea unei noi curbe standard.

De retinut!!!!
1. principiul metodelor prezentate;
2. determinarea cantitativa pe baza curbei etalon sau standard.

7
8