Biotransformări cu drojdii

1. Introducere

Pentru a răspunde presiunilor socio-economice tot mai puternice

guvernele solicită tot mai insistent companiilor farmaceutice producerea unor
medicamente mai „bune“ la un preţ mai scăzut [ [1] ]. Medicamentele mai „bune“
sunt acele medicamente cu specificitate mai ridicată şi cu mai puţine efecte
secundare, ceea ce inevitabil înseamnă molecule complexe. În 1997, de
exemplu, 50 din cele mai bine vândute 100 de medicamente au fost
comercializate sub forma unui singur izomer [ [2] ].

Importanţa obţinerii compuşilor enantiomeric puri a căpătat o nouă

dimensiune începând cu anul 1992 când Administraţia alimentelor şi
medicamentelor din S.U.A. (F.D.A) a impus producătorilor de medicamente să
sintetizeze, caracterizeze şi testeze ambii enantiomeri ai oricărei substanţe
chirale ce este introdusă pe piaţă. FDA recomandă să nu fie interzisă
comercializarea medicamentelor sub formă racemică, dar aprobarea finală a
produselor farmaceutice să se bazeze pe o informare completă asupra
farmacocineticii şi farmacodinamiei fiecărui izomer ca şi a amestecului. De
exemplu, printre cerinţele obligatorii este inclusă necesitatea demonstrării
biodisponibilităţii medicamentului. Enantiomerii manifestă în general proprietăţi
farmacocinetice destul de diferite, ceea ce face ca determinarea biodisponibilităţii
să fie un obiectiv complex care va include separarea enantiomerilor şi
investigarea proprietăţilor farmacocinetice ale acestora consideraţi ca entităţi-
molecule individuale.

Această situaţie pare să semene într-o oarecare măsură cu cazul benzinei

fără plumb. Autorităţile nu au interzis categoric folosirea benzinei cu plumb,
alegând o cale mult mai subtilă pentru a o face mai puţin atractivă în comparaţie
cu benzina fără plumb şi anume prin instituirea de penalităţi. Deşi rezultatul final
este practic acelaşi (scoaterea de pe piaţă a benzinei etilate), metoda utilizată a
fost mult mai acceptabilă pentru cei vizaţi.

Deşi atenţia autorităţilor s-a concentrat în prima etapă asupra

medicamentelor şi alimentelor propuse avizării, acestea sunt îndeaproape
urmate de substanţele agrochimice. Deja, în Olanda, folosirea erbicidelor pe
bază de acid α -fenoxipropionic sub formă de racemic a fost sever îngrădită.
Tendinţa actuală, în acord cu principiile ecologice, conduce către utilizarea unor
agenţi bioactivi enantiomeric puri.

Utilizarea sistemelor enzimatice în sinteza organică a devenit un

instrument fundamental pentru realizarea unor reacţii selective, cu eficacitate
ridicată, atunci când dorim scăderea consumului de solvenţi, condiţii de reacţie
blânde şi căi de reacţie mai scurte.
 Principalele aplicaţii se referă la sinteza compuşilor chirali enantiomeric
puri şi transformările regio- şi chemoselective ale substraturilor complexe,
polifuncţionale, deoarece biocatalizatorii pot discrimina între enantiomeri, între
diastereoizomeri, între funcţiuni organice identice existente într-o moleculă
organică, etc.

Progresul înregistrat în obţinerea unor cantităţi mari de enzime purificate

cu capacităţi catalitice cunoscute prin utilizarea microorganismelor modificate
genetic a lărgit semnificativ domeniul de utilizare a biocatalizatorilor în sinteza
organică fină.

Este bine cunoscut că enzimele hidrolitice pot fi utilizate ca „reactivi“

datorită faptului că sunt secretate mai uşor, că au o stabilitate bună ce poate fi
crescută prin diferite tehnici de imobilizare şi mai ales că nu necesită cofactori.

Alte enzime cum ar fi oxidoreductazele sunt mai puţin utilizate ca atare în

biotransformări de importanţă industrială, deoarece costul şi stabilitatea
enzimelor ca şi regenerarea cofactorilor sunt încă probleme nerezolvate
satisfăcător. De aceea, în cazul reacţiilor de reducere sunt preferate
biotransformările microbiene. În prezent, dintre drojdii, doar drojdia de panificaţie
(S.cerevisiae) este acceptată de chimiştii organicieni ca biocatalizator. Din cele 8
biotransformări publicate în Organic Synthesis, 5 sunt reacţii de hidroliză
enzimatică iar 3 de reducere. Dintre ultimele două sunt catalizate de
S.cerevisiae.

2. Strategia dezvoltării proceselor de biotransformare microbiană

Atunci când se proiectează un nou proces ce are drept scop sinteza

(chimică sau biochimică) unei substanţe, una din principalele probleme ce
trebuie rezolvate o constituie găsirea unui (bio)catalizator potrivit. Dacă un
anumit substrat este transformat cu o viteză convenabilă şi cu o
enantioselectivitate acceptabilă (ee³95%), se poate preconiza trecerea la scară
industrială. De regulă, succesul integrării unei biotransformări ca etapă cheie în
sinteza moleculelor complexe utilizate în industria farmaceutică şi agricultură
depinde de îndeplinirea a trei cerinţe [ [3] ]:

· găsirea unui substrat ieftin care să poată fi transformat cu un randament

acceptabil (tehnic şi economic) în intermediarul vizat;

· intermediarul respectiv să poată fi funcţionalizat stereo şi enantioselectiv în

etapele ce urmează după etapa biochimică a procesului;

· să poată fi obţinuţi ambii enantiomeri ai intermediarului pentru a asigura

sinteza izomerilor optici ai moleculei ţintă [4]
 Această sarcină este considerabil îngreunată de faptul că în majoritatea
cazurilor substratul ce trebuie transformat este un compus artificial, fiind extrem
de dificilă dacă nu imposibilă identificarea a priori a unui biocatalizator capabil să
realizeze transformarea dorită cu enantioselectivitate rezonabilă [ [5] ].

Obţinerea unor biocatalizatori noi sau cu proprietăţi superioare se

bazează pe două tipuri de metode: screeningul surselor naturale şi
mutageneza. Selecţia celulelor microbiene, de plante sau animale reprezintă
metoda tradiţională de obţinere a unor noi biocatalizatori. Microorganismele sunt
preferate datorită vitezei mari de creştere şi a marii diversităţi de căi metabolice
şi enzime de care dispun.

În descoperirea organismelor producătoare de noi enzime se utilizează

tehnici de îmbogăţire a culturii, susţinute de metode de detecţie rapide ce se
pretează la automatizare şi miniaturizare (metodele uzuale de analiză utilizate în
domeniul biotransformărilor cum sunt cromatografia de gaze sau cea de înaltă
performanţă sunt metode lente). Există doar câteva tehnici de selecţie cu
aplicabilitate generală, metodele de selecţie fiind în general specifice cazului
investigat.

O strategie de selecţie a microorganismelor se poate construi în principiu,

folosind una din următoarele 3 abordări:

1) selecţia nişelor ecologice specifice în care este posibilă găsirea activităţii

enzimatice dorite;

2) selecţia materialelor compozite (de exemplu probe de sol) pentru

microorganisme cu activităţi specifice în condiţii fizico-chimice speciale de pH,
temperatură, concentraţie ionică;

3) selecţia organismelor deja identificate, existente în colecţii pentru

descoperirea unei noi activităţi enzimatice.

Mutageneza situs specifică reprezintă alături de evoluţia direcţionată

(directed evolution) căile complementare ce pot fi urmate pentru modificarea
structurii şi specificităţii enzimelor [[6] , [7] ]. Genele ce codifică exprimarea unei
enzime cu o anumită enantioselectivitate sunt de regulă izolate direct din
organismele provenite din habitate naturale, în ultimul timp căpătând o
importanţă din ce în ce mai mare identificarea in silico (pe calculator) din
numărul crescând de secvenţe cunoscute, disponibile în bazele de date.
Deoarece pentru aplicarea acestor metode este necesară cunoaşterea
secvenţei de aminoacizi, a structurii tridimensionale şi a localizării exacte a
situsului (situsurilor) activ(e) al(e) enzimelor, în ultimul timp s-au făcut eforturi
intense pentru mărirea bazelor de date ce conţin structuri ale proteinelor de
interes biotehnologic (între ianuarie 1999 şi ianuarie 2000 au fost introduse în
Protein Data Bank structurile a peste 1000 de proteine).

Tabelul 1. Comparaţie întreavantajele şi dezavantajele diferitelor tipuri de

biocatalizatori utilizaţi în biotransformǎri.

Tip biocatalizator Avantaje Dezavantaje

· concentraţii mici de
substrat
· nu este necesară
celule întregi · raport mare
reciclarea cofactorilor
biomasă/substrat

· reacţii secundare
· cantităţi mari de
celule celule vii în biomasă
condiţii · activităţi ridicate
fermentative · cantităţi mari de produşi
secundari
celule viabile · separare uşoară · productivitate scăzută
· separare/purificare
celule
mai simplă şi mai · activităţi scăzute
imobilizate
ieftină
enzime · procedură simplă
pentru realizarea
biotransformării

· separare uşoară a
produsului
· este necesară
enzime libere
· concentraţii mari regenerarea cofactorului
de substrat

· productivităţi
ridicate

· aparatură ieftină
enzime · separarea uşoară· pierderea activităţii în
 timpul imobilizării
imobilizate a enzimei
· viteze mai reduse de
reacţie

Una din primele decizii ce trebuie luate în cazul utilizării biocatalizatorilor se

referă la alegerea între celule şi enzime. O comparaţie între
avantajele/dezavantajele utilizării celor două tipuri de biocatalizatori este
prezentată succint în Tabelul 1.

De regulă, celulele microbiene sunt preferate atunci când enzimele ce

catalizează biotransformarea sunt intracelulare (mai dificil de separat şi deci mai
scumpe), sunt labile şi/sau necesită cofactori. Utilizarea celulelor permite
regenerarea cofactorilor pe seama consumului unor surse de carbon ieftine cum
sunt glucoza sau zaharoza, asigurând şi stabilitatea biocatalizatorului (enzime şi
cofactori) la acţiunea mediului exterior.

Biotransformările microbiene au o productivitate scăzută comparativ cu

cele enzimatice deoarece substratul şi produsul biotransformării sunt toxice
pentru celule fiind tolerate în concentraţii mici (0,1-0,3%). Deoarece pentru
mărirea vitezei biotransformării se utilizează cantităţi mari de biomasă (mai ales
în cazul drojdiilor) –motiv pentru care drojdia e considerată de multe ori
„reactant“- separarea produselor este îngreunată.

În cazul utilizării celulelor viabile doar o cantitate mică din sursa de

carbon este consumată pentru regenerarea cofactorului (<5%), cea mai mare
parte fiind transformată în biomasă şi metaboliţi care cresc dificultatea etapelor
de separare şi purificare a produsului biotransformării.

3. Principiile stereodiferenţierii: recunoaşterea chirală

După cum se ştie cei doi enantiomeri ai unui amestec racemic au

proprietăţi fizice şi chimice identice în condiţii normale. Plasaţi într-un mediu
chiral, enantiomerii au proprietăţi diferite. Aceasta permite unei substanţe chirale
(cum este o enzimă) să facă diferenţa între cei doi enantiomeri pe baza
configuraţiei sterice diferite. Acest fenomen este cunoscut sub numele de
diferenţiere sau recunoaştere chirală. Recunoaşterea chirală poate fi întâlnită
şi în cazul interacţiei dintre molecule achirale şi unii reactivi sau catalizatori
chirali.

3.1. Sinteza asimetrică versus separare cinetică

Există două metode principial diferite prin care un substrat achiral poate fi
transformat într-un compus chiral: separarea cinetică şi sinteza achirală.
 Separarea cinetică se bazează pe faptul că cei doi enantiomeri ai unui
amestec reacţionează cu viteze diferite cu un reactiv sau catalizator chiral cum
este o enzimă. Pe de altă parte, sinteza asimetrică implică transformarea unui
compus achiral (prochiral) într-un compus chiral prin introducerea în moleculă
a unui centru de chiralitate (stereogen). Se mai spune că substratul conţine un
centru de prostereoizomerism.

Separarea cinetică implică existenţa selectivităţii de substrat în timp ce

sinteza asimetrică se bazează pe selectivitatea de produs. Pentru a deosebi
aceste două tipuri de enantioselectivitate unii autori se referă la prima metodă ca
fiind enantiospecifică în timp ce ultima este enantioselectivă (în separarea
amestecurilor racemice prin metode chimice s-a încetăţenit termenul enzime D
sau L specifice).

Figura 1. Stereoselectivitatea în reducerea cetonelor a) enantioselectivitate b)

diasteroselectivitate

Separarea cinetică este probabil cea mai utilizată metodă pentru

obţinerea substanţelor enantiomeric pure [ [8] ]. Există însă două dezavantaje
majore ale aplicării acestei metode. Pe de-o parte, randamentul teoretic de
obţinere a unuia din enantiomeri este de 50%, iar pe de altă parte separarea
produsului de substratul nereacţionat necesită în multe cazuri aplicarea unor
proceduri laborioase şi costisitoare. În prezent sunt puse la punct metode
alternative pentru transformarea directă a racemicului în enantiomerul dorit.
Aceste metode constau în combinarea secvenţială sau simultană a unei
transformări enzimatice enantioselective cu o racemizare spontană, catalizată
chimic sau enzimatic, a enantiomerului nereacţionat. Pe acest principiu general
se bazează metodele de separare/re-racemizare ciclică, separare dinamică ca şi
cele de stereoinversie [ [9] , [10] , [11] , [12] ].

3.2. Sinteză enantioselectivă versus sinteza diastereoselectivă

Aşa cum s-a arătat anterior, sinteza enantioselectivă implică reacţia unei
molecule prochirale cu o moleculă chirală. Un al doilea tip de sinteză implică
formarea preferenţială a unui singur diastereoizomer prin crearea unui nou
centru de chiralitate într-o moleculă chirală (sinteză diastereoselectivă). În
ambele cazuri se produce o inducţie asimetrică. În cazul sintezei
enantioselective, asimetria, adică stereoselectivitatea, este indusă cu ajutorul
unui catalizator chiral (extern). Spre deosebire de aceasta, o sinteză asimetrică
nu necesită un catalizator chiral. Centrul stereogen preexistent în moleculă este
capabil să inducă stereoselectivitatea, în ipoteza că se porneşte de la un singur
enantiomer.

4. Biotransformări mediate de drojdii

Drojdia de panificaţie (Saccharomyces cerevisiae) şi cea de bere

(Saccharomyces carlsbergensis) sunt microorganisme industriale produse în
industria alimentară în cantităţi mari (în SUA se produc anual 70-80´10 6 kg
drojdie de panificaţie şi aproximativ 55´106 kg drojdie de bere).Drojdiile au jucat
un rol foarte important în dezvoltarea biocatalizei în ultimii 30 de ani. Mulţi
chimişti organicieni au încercat să obţină molecule chirale cu ajutorul drojdiilor.
De aceea se poate afirma că biotransformările mediate de drojdii au avut un rol
formativ extrem de important. Alături de numeroasele reacţii de interes
academic, drojdiile sunt utilizate, de asemenea, în procese tehnologice
industriale. Deşi metabolismul drojdiei S.cerevisiae a fost unul din domeniile
investigate intens, motiv pentru care producerea şi reglarea enzimelor implicate
în metabolismul carbohidraţilor în timpul creşterii şi fermentaţiei este relativ bine
cunoscută, despre biotransformările substraturilor neconvenţionale există foarte
puţine informaţii sistematice. Încercările de raţionalizare şi sistematizare a
acestui tip de informaţii nu au fost încă încununate de succes datorită
complexităţii interacţiunilor dintre aceste substraturi şi celule. Principalele
aspecte ce sunt investigate în scopul realizării unor biotransformări eficiente
sunt: (a) reproductibilitatea; (b) condiţiile de operare; (c) identificarea activităţilor
enzimatice, izolarea enzimelor determinarea preferinţelor stereochimice,
studierea -condiţiilor de biosinteză a enzimelor; (d) îmbunătăţirea selectivităţii
prin modificarea substratului, inhbiţia selectivă a unei enzime, efectul solvenţilor
organici, efectul imobilizării; (e) separarea şi purificarea produsului; (f) utilizarea
microorganismelor modificate genetic.

4.1. Reproductibilitatea

Reproductibilitatea biotransformărilor microbiene este inferioară

standardelor din sinteza organică. În cazul biotransformărilor, asigurarea unei
reproductibilităţi acceptabile impune cel puţin utilizarea aceleiaşi tulpini, crescută
în aceleaşi condiţii şi realizarea biotransformării cu aceleaşi cantităţi de celule şi
de substrat. În cele mai multe din biotransformările mediate de drojdii publicate în
literatură se utilizează drojdie proaspătă sau uscată disponibilă în băcănii sau
supermarket. Este bine cunoscută diferenţa de activitate fermentativă existentă
între diferitele sorturi de drojdii disponibile în comerţ şi nu e de mirare că acestea
au activităţi enzimatice diferite în biotransformarea substraturilor
neconvenţionale. Atunci când sunt folosite în reacţii de reducere, diferenţele între
vitezele de reacţie şi stereochimia produşilor de reacţie între diferitele mărci sunt
relativ reduse [ [13] ]. Aceste diferenţe provin probabil din capacitatea drojdiilor
de a produce o cantitate suficientă de coenzimă care să menţină activitatea
enzimatică. Existenţa unor sisteme enzimatice cu viteze de reacţie şi selectivităţi
diferite ce acţionează asupra aceluiaşi substrat va conduce la produşi cu
compoziţie enantiomerică diferită în cazul limitării prin coenzimă. Diferenţele în
cantitatea de coenzimă disponibilă provin atât din tulpinile utilizate cât şi din
vârstele diferite ale biomasei şi conţinutul de glucide din produsul condiţionat.
Între reacţiile catalizate de drojdii, de un mare interes sunt biotransformările care
nu au fost întâlnite în reacţiile catalizate de enzime. Produsul biotransformării
este deseori rezultatul mai multor reacţii enzimatice consecutive. Micile diferenţe
existente între activităţile enzimatice ale diferitelor microorganisme în condiţii de
reacţie asemănătoare se cumulează conducând la manifestarea unor capacităţi
catalitice surprinzătoare şi obţinerea unor produşi extrem de interesanţi [ [14] ,
[15] ].

4.2. Condiţiile de operare

Condiţiile de operare sunt foarte importante în biotransformările cu drojdii

deoarece determină în mod hotărâtor calitatea şi cantitatea produsului obţinut,
deci eficienţa procesului. Evaluarea performanţei se poate face prin calcularea
productivităţii exprimată în (mmol produs/kg biomasă x h). În biotransformările
enzimatice se obţin productivităţi de câteva zeci de mii. Atunci când
biocatalizatorul este celula microbiană ce conţine o cantitate redusă de enzimă
pe unitatea de substanţă uscată se obţin productivităţi de 20-100, sau chiar mai
mici.

De regulă, drojdia este dispersată în apă şi amestecată cu sursa de

carbon (în majoritatea cazurilor un glucid timp de 30-60 minute înaintea adăugării
substratului. Substratul se adaugă peste soluţia ce conţine drojdia în fermentaţie
la temperaturi cuprinse între 25-36oC ca atare sau dizolvat în etanol. În timpul
biotransformării care poate dura între câteva ore şi câteva zile se adaugă
cantităţi suplimentare de drojdie şi sursă de carbon la intervale fixe. În timpul
incubării iniţiale glucidele sunt utilizate ca donori de hidrogen pentru producerea
NAD(P)H, necesar pentru reducere. Totuşi, trebuie subliniat faptul că reducerea
substratului reprezintă un eveniment accidental în economia celulei, în sensul că
înainte ca echivalenţii de reducere din celulşă să fie transferaţi substratului se
produc un mare număr de reacţii enzimatice.Energia necesară este asigurată
prin metabolizarea glucidelor şi enzimele reducătoare sunt sintetizate la sfârşitul
acestor căi metabolice. Substratul neconvenţional va fi în competiţie cu cel
natural (acetaldehida) pentru a fi redus.

În majoritatea cazurilor reducerea dorită nu este foarte eficientă din punct de

vedere energetic comparativ cu consumul endogen al puterii reducătoare.
Utilizând drojdia de panificaţie ca reactiv microbian în reacţii de reducere, sunt
produşi sute de moli de etanol pentru fiecare mol de produs dorit, deci doar o
mică fracţie din NAD(P)H este folosit în reacţia dorită [[16] ].

Puterea reducătoare generată în acest tip de biotransformare este de obicei

foarte mare. În timpul fermentaţiei se formează metaboliţi secundari cum ar fi
agenţii activi de suprafaţă şi bioxidul de carbon, care îngreunează separarea şi
purificarea produsului biotransformării. Valoarea pH scade de la 7 până în jur de
3, valoarea exactă depinzând de condiţiile concrete de reacţie. Deşi echilibrul
între NAD(P) şi NAD(P)H (şi între forma redusă şi oxidată a substratului) este
considerabil influenţat de pH, valoarea pH a mediului exterior celulei nu
influenţează foarte mult concentraţia ionilor de hidrogen din interiorul celulei.
Oricum, pH are o influenţă semnificativă asupra biotransformării. Se ştie că
reducerea 3-oxo esterilor la (S) şi (R) 3-hidroxiesteri este catalizată de enzime
NADPH dependente. Consumul de glucoză pentru regenerarea substratului
(Figura 2) este de aproximativ 5 ori mai mare decât NADPH consumat pentru
reducerea substratului. Deoarece reducerea continuă şi după epuizarea
glucozei, s-a presupus că în aceste condiţii este consumat etanolul format în
timpul regenerării cofactorului.

Figura 2. Regenerarea NADPH în drojdiile ce folosesc glucoza ca sursă de

energie.
 Utilizând etanolul ca sursă de carbon şi energie, s-a observat că viteza
specifică de consum a acestuia este de aproximativ două ori mai mare decât cea
de reducere a substratului. Reducerea are loc în condiţii aerobe, dar este
complet blocată în condiţii anaerobe. Randamentele de transformare şi
compoziţia produsului de reacţie pentru cele două surse de energie sunt
comparabile, etanolul prezentând avantajul absenţei produşilor secundari.

Pentru regenerarea cofactorilor în cazul utilizării etanolului ca sursă de

energie, au fost propuse două mecanisme (Figura 3, 4). În primul caz, valabil
pentru reducerea acetolului la propilenglicol de către alcool dehidrogenaza
NADH dependentă, etanolul este oxidat la acetat care intră apoi în ciclul acizilor
tricarboxilici. Această reacţie pare a nu fi influenţată de aerare. În cel de-al doilea
caz, aplicabil pentru reducerea acetoacetatului de etil de către cetoester
reductaza NADPH dependentă, NADP+este regenerat pe seama transformării
malatului în piruvat, eficienţa reacţiei fiind puternic influenţată de aerare.

Figura 3. Mecanismul regenerǎrii NAD+ în reducerea acetolului la propilen glicol

cu drojdii.
 Figura 4. Mecanismul regenerǎrii NADP+ în reducerea 3-oxo-butiratului la 3-
hidroxibutirat cu drojdii utilizând etanolul ca sursǎ de energie.

O alternativă la biotransformările cu drojdie în condiţii fermentative o

reprezintă utilizarea resting cells. În acest caz, cofactorul este regenerat pe
seama glucidelor de rezervă din celulă. De obicei biomasa (drojdie liofilizată sau
drojdie presată) este activată o scurtă perioadă de timp (30 minute) după care
este centrifugată, spălată şi suspendată în mediul de biotransformare (apă sau
soluţie tampon). Principalul dezavantaj al acestei proceduri îl constituie viteza de
reacţie mai mică şi necesitatea utilizării unei cantităţi mai mari de biomasă.
Astfel, pentru reducerea 2-oxo-ciclopentan carboxilatului de etil în condiţii
fermentative au fost necesare 2 g drojdie/g substrat (productivitatea 50
mmol/kgh), în timp ce în cazul reducerii acetoacetatului de etil cu resting cells s-
au folosit 25 g drojdie/g substrat (productivitatea 5 mmolkgh). Din acest motiv,
această variantă de realizare a biotransformării se pretează foarte bine pentru
lucrări la nivel de laborator. Principalele avantaje ale evitării condiţiilor
fermentative sunt modul de lucru mai simplu (nu necesită aparatură sau
cunoştiinţe de specialitate) şi simplificarea procedurilor de separare şi purificare
datorită absenţei produşilor secundari (este mai curată).

Unii autori susţin că utilizarea celulelor imobilizate prezintă avantaje

semnificative comparativ cu celulele suspendate în mediu. Prin imobilizarea
celulelor de drojdie pe alginat de sodiu şi utilizarea biocatalizatorului astfel
condiţionat într-un reactor cu pat fluidizat a fost posibilă realizarea unor reduceri
cu drojdie în sistem de operare continuu timp de mai multe săptămâni.
Stabilitatea biocatalizatorului s-a menţinut aproximativ constantă după 4 cicluri
de regenerare. Deşi în unele cazuri imobilizarea poate îmbunătăţi excesul
enantiomeric, randamentul global al procesului nu este îmbunătăţit semnificativ
prin imobilizare, separarea biomasei neinfluenţând preţul de cost al produselor
cu valoare mare.

Utilizarea solvenţilor organici este o alternativă extrem de interesantă,

mai ales în cazul substraturilor cu solubilitate redusă în mediu apos. Deoarece
inhibiţia prin produs constituie în majoritatea biotransformărilor o problemă,
scăderea raportului produs/substrat în mediu apos prin utilizarea solvenţilor
organici reprezintă o metodă eficientă de îmbunătăţire a performanţei
bioprocesului. De asemenea, această alternativă permite evitarea reacţiilor
secundare nedorite ce au loc în mediu apos cum ar fi reacţiile de hidroliză a
produsului sau a substratului. Solvenţii organici permit micşorarea rezistenţelor la
transferul de substanţă atât prin permeabilizarea peretelui celular, cât şi prin
mărirea disponibilităţii substratului datorită adeziunii biomasei la faza organică.
Creşterea excesului enantiomeric sau chiar schimbarea configuraţiei produsului
de reacţie ce au fost observate în unele cazuri pot fi datorate fie inhibiţiei
selective a unei enzime, fie măririi diferenţei de reacţie dintre două enzime
competitive, fie modificării concentraţiei substratului în interiorul celulei.
Solvenţii organici afectează permeabilitatea membranei plasmatice fără ca
integritatea întregii celule să fie distrusă. Astfel, substratul va avea acces la
enzimele intracelulare mărindu-se viteza biotransformării. Însă, deoarece celulele
aflate în această stare nu mai sunt viabile, şi proteinele se degradează rapid în
celulele neviabile, unul din criteriile ce stau la baza selectării solvenţilor pentru
biotransformări îl constituie menţinerea viabilităţii biomasei. Au fost propuse mai
multe proceduri de mărire a permeabilităţii membranei pentru utilizarea biomasei
astfel condiţionate în biotransformări. În cele mai multe cazuri se utilizează
etanolul, alcoolul izopropilic, toluenul sau amestecurile lor [ [17] , [18] , [19] ].

Asocierea solvenţilor organici cu agenţi tensioactivi poate conduce la

formarea unor emulsii foarte stabile în care celulele sunt solubilizate. Aceste
celule sunt viabile şi permit obţinerea unor productivităţi ridicate. Separarea
produşilor de reacţie cu mase moleculare mici este însă practic imposibilă în
aceste condiţii.

4.3. Selectivitatea

Principalul scop al transformărilor biocatalitice îl reprezintă utilizarea marii

selectivităţi manifestate de enzime.

În cazul biotransformărilor catalizate de celulele microbiene,

selectivitatea este redusă comparativ cu cea obţinută în sinteza asimetrică din
chimia organică datorită acţiunii mai multor enzime cu preferinţe stereochimice
diferite ce acţionează asupra substratului.

Configuraţia şi puritatea optică a produsului depind de o serie de factori

ce influenţează biosinteza şi activarea enzimelor sau regenerarea cofactorilor.

Biotransformările pot concura cu metodele chimice de sinteză doar dacă

produsul obţinut are puritate optică ridicată şi nu trebuie separat de izomeri sau
de substratul nereacţionat. Din acest motiv sunt intens studiate metodele ce pot
conduce la mărirea selectivităţii procesului.

În principiu, orice parametru ce influenţează creşterea şi metabolismul

celular poate fi utilizat pentru îmbunătăţirea selectivităţii. Cele mai bune rezultate
au fost obţinute în practică prin modificarea structurii substratului, inhibiţia
selectivă a enzimelor şi prin utilizarea solvenţilor organici. De exemplu,
modificarea restului alchil alcoolic din cetoesteri poate modifica puritatea optică şi
chiar configuraţia hidroxi esterului rezultat în urma reducerii microbiene. Acest
concept pare general valabil pentru reducerea grupării carbonil. Cu cât diferenţa
de volum dintre cei doi radicali legaţi de gruparea carbonil este mai mare cu atât
selectivitatea reducerii creşte. Trebuie menţionat că acest tip de modificare a
structurii substratului are rezultate slabe în cazul reducerii cetoesterilor substituiţi
când se obţin amestecuri de diastereoizomeri.
 Pentru inhibiţia selectivă a enzimei ce conduce la obţinerea produsului
nedorit este suficientă introducerea în amestecul de reacţie de inhibitori
enzimatici care în majoritatea cazurilor sunt compuşi organici cu mase
moleculare mici. Printre cei mai utilizaţi în cazul reducerilor microbiene se
numără alcoolul alilic, bromura de alil, vinil metil cetona, ciclohexanona,
cloracetatul de etil, diferiţi acizi carboxilici, 2-propanolul, ciclopentanolul.

Inhibitorii sunt adăugaţi de obicei în concentraţii mai mari decât cele

corespunzătoare valorilor stoechiometrice corespunzătoare cantităţii de enzimă
sau celei de substrat implicate în reacţie.

Deşi cercetările au vizat un număr mare de substraturi din clase diferite

(cetone, dicetone, esteri α şi β cetonici şi derivaţi ai acestora) datele nu au putut
fi sistematizate astfel încât atât structura cât şi concentraţia inhibitorului se
determină experimental.

4.4. Drojdii modificate genetic

Deşi există numeroase lucrări ce tratează introducerea şi exprimarea

unor gene străine în genomul drojdiilor, există puţine date privind comportarea
acestor noi organisme în biotransformări. Majoritatea cazurilor descrise în
literatură se referă la producerea unor proteine specifice sau la modificarea
metabolismului microbian în scopul acumulării unui anumit compus. O excepţie
interesantă o constituie introducerea genei ciclohexanon-monooxigenazei din
Acinetobacter sp. în S.cerevisiae pentru a realiza oxidarea Baeyer-Viliger

Figura 5. Oxidarea Baeyer-Viliger a derivaţilor ciclohexanonei cu S.cerevisiae

15C(pHR001).

Oxidarea derivaţilor ciclohexanonei catalizată de acest nou

microorganism a fost realizată la scară de 1 mmol. Randamentele de
transformare au fost bune, selectivitatea procesului fiind îmbunătăţită la
concentraţii celulare mici (când reducerea cetonei a fost neglijabilă). Spre
deosebire de oxidarea Baeyer-Viliger clasică realizată cu Acinetobacter sp., în
cazul drojdiei nu a fost necesară incubarea prealabilă a microorganismului cu
substratul în scopul inducerii enzimei.

4.5. Separarea produsului

 Separarea produsului din amestecul de reacţie poate fi realizată fie prin
extracţia directă cu solvenţi, dacă nu se formează emulsii stabile, fie prin
extracţia supernatantului rezultat în urma separării biomasei prin filtrare sau
centrifugare.

O variantă ce elimină necesitatea separării prealabile a biomasei constă

în amestecarea mediului reacţie cu un volum egal de solvent şi separarea fazelor
după câteva ore. După separarea fazei apoase, stratul organic este filtrat (de
exemplu prin pat de celită). Faza ce conţine biomasa poate fi reextrasă cu
solvent.

Alte variante de separare constau în utilizarea schimbătorilor de ioni

(Amberlite, XAD7, etc.) în special în cazul compuşilor hidrofili sau parţial solubili
în apă. Separarea răşinii se poate face prin filtrare pe filtre de sticlă sinterizată de
porozitate adecvată.
 Bibliografie

[1] LYE, G., WOODLEY, J. –TIBTECH 17, 395-402 (1999).

[2] STIMSON, S., C., Chem.Eng.News 76, 83-104 (1998).

[3] JOHNSON, C., WELLS, G., Curr. Opin. Chem.Biol 2, 70-75 (1998).

[4] BRADSHAW, C., W., HUMMEL, W., WONG, C., H., J.Org.Chem 57, 1532-
1536 (1992).

[5] BECCU, E., HERBERT, C., GIANFERRARA, T., LINDA, P., Biotechnol.
Bioeng., 35, 928-934 (1990).

[6] BRADSHAW, C., W., HUMMEL, W., WONG, C., H., J.Org.Chem 57, 1532-
1536 (1992).

[7] BRADSHAW, C., W., FU, H., SHEN, G., J., WONG, C., H. J.Org.Chem 57,
1526-1531 (1992)

[8] AZERAD, R., BUISSON, D., Curr. Opin. Biotechnol. 11, 565-571 (2001).

[9] STECHER, H., FABER, K., Synthesis, 1-16 (1997).

[10] STRAUSS, U.,T., FELFER, U., FABER, K., Tetrahedron - Asymmetry

10,107-117 (1999).

[11] KROUTIL, W., FABER, K., Tetrahedron - Asymmetry, 9,2901-2913 (1998).

[12] El GIHANI M, T., WILLIAMS, J., M., J., Curr Opin. Chem Biol, 3, 11-15
(1999).

[13] PEREIRA, R., S., Appl.Biochem.Biotechnol. 55,123-132 (1995).

[14] Takesita, M., Akutsu, N., Tetrahedron:Asymmetry 3, 1381-1384 (1992).

[15] Meth-Cohn, O., Horak, R., M., Fouche, G., J.Chem.Soc.Perkin Trans. I
1517-1527 (1994).

[16] Bucciarelli, M., Forni, A., Moretti I., Torre, G., Synthesis 897-899 (1983).
[17] Inonue, Y., Tsuchiyama, H., Kimura, A., Process Biochem. 29, 271-275
(1994).

[18] Liu, Y., Hama, H., Fujita, Y., Kondo, A., Inonue, Y., Kimura, A., Fukuda, H.,
Biotechnol. Bioeng 64, 54-60 (1999).

[19] Liu, Y., Fujita, Y., Kondo, A., Fukuda, H., J.Biosci Bioeng. 89, 554-558
(2000).
BIOTRANSFORMARI CU DROJDII

STUDENT:

CALIN ALEXANDRU

GRUPA 2408

ANUL 4 I.M.