PCR en tiempo real

¿Qué se hace en la Real time PCR?

Monitorización de la amplificación
Evaluación de los productos de amplificación

PCR en tiempo real

¿Qué se hace en la Real time PCR?

OBJETIVO: estimar la cantidad inicial de un DNA diana

La PCR en tiempo real detecta la fluorescencia emitida en

cada ciclo con un mecanismo que genera un señal
fluorescente proporcional a la cantidad de diana
amplificada.
Principios:
• Se basa en un agente fluorescente ( reporter )
• El primer incremento significativo de la candidad de producto de
PCR ( ciclo Ct) correlaciona con la cantidad inicial de diana.

PCR en tiempo real

Aplicaciones

1 22 3

Curvas de fusión

1
 PCR en tiempo real

Tipos de marcadores

¾ Marcadores inespecificos
( SybrGreen)

¾ Sondas

Ch 1 Ch 2 Ch 3 Ch 4 Ch 5 Ch 6 Fluorescein
530 nm 555 nm 610 nm 640 nm 670 nm 710 nm Hex
Red 610
Red 640
Cy5
Red 705

450 500 550 600 650 700 750 800 850

Wavelength nm

PCR en tiempo real

Fluorescencia

PCR en tiempo real

Marcadores inespecíficos

SYBRGreen®
El SYBR green es una molécula que se une específicamente al DNA de doble
cadena, incrementando de manera muy importante su florescencia. Durante la
fase de extensión, mas y mas DNA se unirá al producto de PCR incrementándose
el señal. En cada ciclo de PCR se genera un señal mayor. .

2
 PCR en tiempo real

Marcadores inespecíficos

SYBRGreen®

PCR en tiempo real

Marcadores inespecíficos

SYBRGreen®

• Emite un fuerte señal al unirse al DNA

• Es una unión inespecífica
• Requiere una extensiva optimización
• Permite hacer análisis de curvas de fusión
• Amplicones largos generan señales mayores
• Es mucho mas económico que trabajar con sondas
• Una buena opción para secreening o para análisis en los que
se conoce muy bien el tipo de muestra.

PCR en tiempo real

Marcadores específicos

Sondas FRET, Fluorocromo-Reporter

Hyb Probes
Sondes de Quencher-Reporter:
Taqman ( hidrólisis)
Molecular Beacons
Scorpion
Eclipse
Sondas Lux
…plexor, Universal probeLib.

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PCR en tiempo real

Sondas Fluorocromo-Reporter

Fluorocromo & Reporter

• Fluorochrome+Reporte = light emission

• Both molecules have to be very close together for the reporter to
absorb the emitted fluorescence

F R F R F Light
R

F R F R F R
NO light

PCR en tiempo real

Hybridization probes

PCR en tiempo real

Hybridization probes

Sondas de Hibridación (Hyb Probes) FRET

LC Red
Fluorescein

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 PCR en tiempo real

Sondas Fluorocromo-Quencher

• Sondas Hidrólisis: TaqMan

• Sondes de Reporter-Quencher (no hidrólisis):

Molecular Beacons
Scorpion
Eclipse

PCR en tiempo real

Fluorocromo- Quencher: fundamento

Fluorocromo & Quencher

• Un fluorocromo es una molécula que absorbe la luz de una longitud

de onda específica y emite luz (la fluorescencia) de una longitud de
onda más baja
• Un quencher es una molécula que absorbe la luz emitida por un
fluorocromp

F Q F Q F Q

light

PCR en tiempo real

Fluorocromo- Quencher: fundamento

Fluorocromo & Quencher

• Fluorochrome+quencher = no light emission

• Both molecules have to be very close together for the quencher to
absorb the emitted fluorescence

F Q F Q F Q NO light

light
F Q F Q F Q

light Light

5
 PCR en tiempo real

Sondas Taqman

• A specific probe that will hybridize

within the amplified product
– It requires the identification of a third
signature sequence

• Probe is labeled with a F and a Q

• The 5’-exonuclease activity of the Taq

polymerase hydrolyze the probe,
releasing the F from the Q

PCR en tiempo real

Sondas Taqman

Sondas de Hidrólisis (TaqMan Probes)

reporter
quencher

PCR en tiempo real

Elcipse probes

-Son similares a las sondas

Taqman, pero sin hidrólisis
- Presentan bases modificadas y
MGB, que mejoran el
funcionamieno de la sonda e
incrementan su Tm

6
 PCR en tiempo real

Molecular Beacons

– Contiene un F y un Q

– La hairpin structure acerda

F y el Q si estan en
disolución

– En la fase de hibridización
la sonda se une a su diana

• No se destruye durante la
reacción

• En cada cilo se une a su

diana

PCR en tiempo real

Molecular Beacons

F-Q interaction is based on FRET

‘fluorescence resonance energy
transfer’

PCR en tiempo real

Scorpion probes

-Son verdaderamente
bifuncionales, actuan como
primer y sonda ( a diferencia de
las lux). Mantienen el doble nivel
de especificidad.
- Señales más estables y
intensos, tiempos de reacción
cortos y discriminaciones
excelentes.
- Diseño complejo

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 PCR en tiempo real

Scorpion probes

http://www.dxsgenotyping.com/0608.swf

PCR en tiempo real

Comparación de curvas de PCR usando diferentes marcadores.

PCR en tiempo real

Lux primers

Lux Primers ( Light Upon eXtension)

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 PCR en tiempo real

Lux primers

Lux Primers ( Light Upon eXtension)

PCR en tiempo real

Lux primers

Lux Primers ( Light Upon eXtension)

PCR en tiempo real

¿El futuro ?

Universal ProbeLibrary

The unique combination of online

available assay design software and
only 165 prevalidated, real-time PCR
probes allows to quantify virtually any
transcript in the transcriptomes of a
large number of organisms.

http://www.roche-applied-science.com/publications/multimedia/upl/wbt.htm

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PCR en tiempo real

• http://biosearchtech.com/download/flash_guides/f
ormats_explained.html

PCR en tiempo real

78%
TaqMan probes

19%
Molecular Beacons

FRET probes 15%

LUX fluorogenic
9%
primers

MGB Eclipse probes 9%

Other 3%

2%
Scorpion probes

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80%

Detection Chemistries

www.scienceboard.net (2003)

PCR en tiempo real

Curvas de fusión

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PCR en tiempo real

Curvas de fusión

Fluorescence -d (F1) / dT
Fluorescence (F1)

Temperature °C Temperature °C

La derivada de las curvas de fusión genera picos de fusión

PCR en tiempo real

Curvas de fusión

Gram positivas Brucella Gram negativas

PCR en tiempo real

Curvas de fusión

Tm depende de

Low GC 41 °C High GC secuencia

50 bp 10 °C 10,000 bp tamaño

Tm varía por:
— Salt concentration
— MgCl2 concentration
— SYBR Green I concentration

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PCR en tiempo real

Niveles de especificidad

Primers
Melting peaks
Sondas fluorescentes
(especificas)

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