Sunteți pe pagina 1din 35

4.

Biomasă de drojdii pe substrat etanolic


Introducere

Drojdiile sunt fără îndoială, cel mai important grup de microorganisme folosite de om
de la începuturile istoriei sale ca fiinţă socială şi până în prezent. Din acest punct de vedere
biotehnologia a fost mereu contemporană cu istoria umană, la început prin aspectele sale -
acum numite tradiţionale- de fabricare a pâinii sau a vinului, până în prezent când dezvoltarea
geneticii şi a biologiei moleculare a dus la dezvoltarea biotehnologiilor moderne.
Aplicaţiile în terapeutică ale drojdiilor sunt cunoscute din antichitate şi apar pentru
prima dată în scrierile lui Hippocrates şi Plinius cel bătrân.
bătrân Se pare că vechii egipteni
prescriau berea ca cicatrizant al plăgilor şi arsurilor.
Menţionarea drojdiei în farmacopee se face însă abia la sfârşitul secolului 19, fiind
vizată în special drojdia Saccharomyces cerevisiae. În 1899 Brocq a fost primul care a studiat
efectul drojdiilor în afecţiunile cutanate, pornind de la constatarea că muncitorii din fabricile
de bere nu făceau furunculoză.
Următorul pas important se datorează cercetărilor efectuate de echipa lui Max
Dellbruck la Berlin în 1910. Datorită lor, s-au dezvoltat primele bioprocese de obţinere a
biomasei cu drojdii, biomasă folosită ca supliment de proteine şi vitamine în timpul primului
război mondial în Germania. Problema asigurării necesarului de proteine în hrana umană a
rămas un aspect de strictă actualitate. La o populaţie ce se apropie de cifra de 6 miliarde,
aproape 10% suferă în continuare de foame, fiind localizată în ţările în curs de dezvoltare.
Hrana ca atare nu este ea însăşi o problemă, existând rezerve suficiente de zaharuri şi grăsimi.
Componenta deficitară o constituie proteinele care asigură aminoacizii esenţiali. Populaţia din
ţările în curs de dezvoltare îşi asigură cea mai mare parte din aportul de proteină din hrană din
surse vegetale care sunt mult prea repede epuizate.
Comparativ cu plantele şi animalele, microorganismele se caracterizează printr-o
viteză mult mai mare de sinteză a proteinei şi printr-un conţinut proteic mai ridicat. De
asemeni, sunt mult mai puţin pretenţioase în ceea ce priveşte nutrienţii necesari creşterii decât
animalele. De exemplu, microorganismele acceptă surse de azot anorganice, pe când în cazul
animalelor drept nutrienţi pot fi folosite substanţe cu azot legat organic. Acelaşi raţionament
este valabil şi pentru sursa de carbon. Dacă ţinem seama de independenţa producerii

133
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

proteinelor microbiene, de condiţiile pedo-climatice şi sezoniere rezultă că acest domeniu îşi


va păstra actualitatea şi în viitor.
Organizaţia Mondială a Sănătăţii, recomandă folosirea concentratelor proteinico-
vitaminice obţinute cu tulpini de drojdii în condiţii strict controlate, ca cea mai eficientă sursă
de vitaminizare a alimentelor pentru copii. Aceeaşi biomasă uscată este folosită ca adaos în
concentrate de supe, budinci sau în compoziţiile din care se prepară pastele făinoase. De
exemplu, în ultimul caz biomasa adăugată conferă pastelor un gust mai bun şi o culoare mai
plăcută decât concentratele din soia.
O direcţie nouă de utilizare a biomasei obţinută prin cultivarea drojdiilor este în
terapeutică, sub formă de medicament-aliment, destinat prevenirii şi tratamentului unor
afecţiuni cu incidenţă crescută.
Comparativ cu medicamentele clasice, medicamentul aliment prezintă o serie de
avantaje notabile:
- pot fi utilizate timp îndelungat fără a provoca reacţii secundare;
- sunt acceptate de bolnavi fără a induce reacţii psihologice adverse;
- au un rol deosebit în reglarea metabolismului perturbat în bolile de nutriţie (în
special în cazul dereglărilor apărute în urma tratamentelor îndelungate cu
antibiotice).
Drojdia-medicament se poate administra sub două forme:
- drojdie viabilă, obţinută prin liofilizare, care îşi păstrează toate principiile active;
- drojdie inactivată, obţinută prin plasmoliză sau autoliză al cărei principal atu îl
reprezintă valoarea nutritivă, aportul de vitamine şi microelemente furnizate
organismului uman sub o formă uşor asimilabilă.
Printre recomandările terapeutice ale drojdiei medicament se numără:
- prevenirea şi tratamentul accidentelor digestive (diaree, candidoze) ce apar în
urma tratamentului cu antibiotice;
- tratamentul gastroenteritelor acute;
- tratamentul diareelor ce apar datorită colonului iritabil.
Explicaţia exactă a modului de acţiune a drojdiei-medicament nu este încă cunoscută,
fiind propuse mai multe modele de acţiune:
- efectul de antagonism ``in vivo`` a fost demonstrat de Ducluzean pentru tulpini
din genul Saccharomyces contra unor tulpini din genul Candida (albicans
albicans,
krusei,
krusei pseudotropicalis).
pseudotropicalis Procesul a fost descris ca:``primul exemplu al unui

134
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

antagonism microbian exercitat „in vivo” de microorganisme care nu fac parte


integrantă din ecosistemul tubului digestiv, dar pe care îl tranzitează în număr
ridicat fără a-şi pierde viabilitatea [1];
- modularea efectului de producere a toxinelor bacteriene: la administrarea
preventivă de probiotic obţinut cu tulpini de Saccharomyces se observă
reducerea mortalităţii şoarecilor infectaţi cu Clostridium difficile,
difficile la şoarecii
supravieţuitori constatându-se diminuarea citotoxinei şi scăderea numărului de
Cl. Difficile;
Difficile
- activitatea imunomodulatoare datorată prezenţei în peretele celulelor de drojdie a
unui glucan denumit ``stimulent cu larg spectru al mecanismelor de apărare``;
Drojdiile viabile pot interveni favorabil în menţinerea microflorei intestinale normale,
atât prin acţiunea antagonică cât şi prin produşii de metabolism care stimulează microflora
lactică.
Un domeniu de actualitate situat la graniţa dintre biotehnologia clasică şi sinteza
chimică organică de mare fineţe este obţinerea de produşi biologic şi fiziologic activi prin
biotransformări.
Aportul biotehnologiei în acest domeniu s-a concretizat prin folosirea enzimelor sau a
celulelor întregi ca biocatalizator în procesele de obţinere a unui anumit enantiomer (de obicei
a celui cu activitate terapeutică mai ridicată).
În condiţiile experimentale aflate la dispoziţie am optat pentru utilizarea biomasei de
S.cerevisiae pentru obţinerea esterului etilic al acidului 4-cloro-3-hidroxibutiric, prin reducere
microbiană, deoarece acest compus reprezintă intermediarul cheie în obţinerea L-carnitinei
prin semisinteză.

4.1. Studii biologice, biochimice şi tehnologice privind drojdiile


consumatoare de etanol

4.1.1. Drojdii consumatoare de etanol

Obţinerea biomasei pe diferite substraturi cu ajutorul microorganismelor a fost şi este în


continuare un capitol important al industriei de biosinteză. Dacă la început această masă
celulară, cunoscută sub denumirea de „proteine monocelulare” (S
Single Cell Protein) a fost
utilizată în special ca aditiv furajer pentru îmbogăţirea hranei animalelor în proteine şi

135
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

vitamine, astăzi destinaţiile ei s-au diversificat. Biomasa microbiană este utilizată ca:[2, 3, 4, 5,
, ]:
6 7

- biocatalizator pentru obţinerea unor produşi optic activi utilizaţi în industria de


medicamente;
- produse de tip ``aliment-medicament`` pentru uz uman, în special ca
normalizator bi ologic (probiotic) al florei intestinale saprofite [8, 9, 10, 11, 12];
- aditivi în hrana umană.
Pentru obţinerea biomasei utilizate în alimentaţia şi terapia umană sunt preferate în
special drojdiile datorită atât unor motive subiective cât şi obiective:
- drojdiile sunt utilizate în alimentaţia umană de mii de ani, fiind stâns legate de
istoria civilizaţiei umane (pâine, vin), atfel încât nu mai trebuie să depăşească
bariera psihologică ce apare la introducerea în alimentaţia/terapia umană a unui
nou produs biotehnologic;
- datorită marii adaptabilităţi pot utiliza diferite surse de carbon cu randamente de
transformare suficient de ridicate pentru a le face atractive ecconomic;
- datorită dimensiunilor mai mari pot fi separate mai uşor din mediul biologic în
care se dezvoltă, fără a necesita aparatură scumpă.
În literatura de specialitate sunt citate numeroase specii de drojdii utilizate (utilizabile)
pentru obţinerea de biomasă pe etanol, cele mai multe aparţinând genurilor Saccharomyces
[13, 14, 15, 16, 17, 18, 19] şi Candida (Candida
Candida acidothermophilum, C. ethanothermophilum, C.
utilis [20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27], Hansenula (Hansenula
utilis) Hansenula anomala)
anomala
Laskin [28] citează drojdii din genurile Candida,
Candida Debaromyces,
Debaromyces Endomycopsis,
Endomycopsis
Hansenula,
Hansenula Mycoderma,
Mycoderma Pichia,
Pichia Rhodotorula şi Saccharomyces pentru care compania Exxon-
Nestle a inţiat proiecte de dezvoltare a unor procese de obţinere a biomasei pe substrat de
etanol.
Hitzman [29] menţionează tulpini de drojdii din genurile Candida,
Candida Pichia,
Pichia Hansenula şi
Torulopsis testate de compania Provesta-Philipps în cursul dezvoltării unor procese de
obţinere a biomasei de drojdie la densităţi celulare mari. Principalele criterii de selecţie a
tulpinilor pentru utilizare industrială s-au referit la obţinerea unor randamente de substrat mari
şi constante, stabilitatea tulpinii pe parcursul unor bioprocese cu durată mare în timpul cărora
pot apărea condiţii de cultivare adverse determinate de disfuncţionalităţi ale utilajelor, apariţia
contaminării, etc. Deoarece biomasa obţinută de firma Provesta-Philipps era destinată

136
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

utilizării în alimentaţie un conţinut proteic în jur de 60% reprezenta un parametru esenţial în


alegerea tulpinii producătoare.

4.1.2. Aspecte biochimice ale creşterii drojdiilor pe etanol


Drojdia S.cerevisiae este unul dintre cele mai simple organisme eucariote, cu o mărime a
genomului doar de trei ori mai mare decât al bacteriei E.coli.
E.coli. Metabolismul acestei drojdii este
extrem de adaptabil, ea fiind capabilă să crească pe o varietate foarte mare de substraturi, în
condiţii favorabile putând creşte în prezenţa unor concentraţii mari de etanol [30].
Figura 1 ilustrează calea metabolică de utilizare a etanolului de către drojdii,
prezentând importanţa ciclului glioxilatului pentru metabolizarea etanolului.
În prima etapă, etanolul este oxidat la acetaldehida. Shachar-Nishri şi Freeman [31]
prezintă două căi metabolice prin care poate avea loc această reacţie:

1. Reducerea etanolului la acetaldehidă cu ajutorul alcool - dehidrogenazei,


conform reacţiei:
ADH
CH3CH2OH +NAD+ CH3CHO +NADH +H+
aceasta reacţie este specifică drojdiilor S.cerevisiae,
S.cerevisiae Candida utilis.
utilis
2.Oxidarea etanolului la acetaldehidă cu ajutorul alcool-oxidazei :

AOX
CH3CH2OH +O2 CH3CHO +H2O2
reacţie caracteristică speciilor Candida boidinii şi Pichia pastoris .

Figura 1. Reacţiile biochimice ale ciclului glioxilatului.

137
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

Acetaldehida formată este oxidată în continuare la acetat. Ca rezultat al acestor oxidări,


se produc 2 molecule de NADH pentru fiecare moleculă de etanol transformată în acetat.
Acetatul produs se poate acumula în mediul extracelular sau poate fi transformat în acetil-
CoA,
CoA în funcţie de concentraţia de etanol şi activitatea metabolică a microorganismului.
Acetil-CoA formată intră în ciclul TCA,
TCA transformandu-se în malat.
Indiferent de sursa de carbon folosită, drojdiile elimină în mediu oxalilacetat şi alţi
intermediari metabolici. În cazul microorganismelor ce cresc pe substrat C2 (etanol, acetat)
alimentarea cu precursori ai acidului oxalilacetic este realizată cu ajutorul enzimelor izocitrat
liaza [32, 33] şi malat sintetaza.
sintetaza Acţiunea acestor două enzime cheie permite compusului C2
(acetil-CoA
acetil-CoA) să intre într-un al doilea punct în ciclu, având drept rezultat sinteza
intermediarilor din ciclul TCA (acizilor tricorboxilici).
tricorboxilici) S-a demonstrat că această cale este
controlată de concentraţia intracelulară de fosfoenolpiruvat, care inhibă activitatea izocitrat
liazei.
Atunci când singura sursă de carbon disponibilă este un compus C2 (acetat sau etanol)
este necesară utilizarea ciclului glioxilatului, acesta fiind necesar şi suficient pentru
reaprovizionarea cu intermediari în timpul creşterii pe etanol. Acest ciclu este supus
controlului exercitat asupra sintezei şi activităţii izocitratliazei. Deşi mecanismele de reglare
nu sunt perfect cunoscute, s-a emis ipoteza conform căreia atât controlul genetic cât si cel al
activitătii enzimatice sunt realizate prin intermediul concentraţiei aceluiaşi compus:
fosfoenolpiruvatul.
fosfoenolpiruvatul
Atunci când sursa de carbon utilizată este un zahar, intermediarii ciclului TCA sunt
menţinuţi la un nivel suficient astfel încât nu mai este necesară sinteza izocitrat liazei. În cazul
unui aport insuficient de fosfoenolpiruvat, va fi derepresată sinteza izocitratliazei, creîndu-se
astfel posibilitatea utilizării acetatului (ca produs de metabolism al etanolului)
Un alt mecanism al căii metabolice de utilizare a etanolului de către drojdii este propus
de HUMPHREY [34] , completând teoria anterioară.
O parte din acetil-CoA intră în ciclul TCA şi evoluează direct la malat. În acest caz, cea
mai mare parte din NADH citoplasmatic este implicat în oxidarea etanolului astfel încât
malatul este transformat mai degrabă în piruvat pentru sinteza componenţilor celulari şi
creşterea microorganismului, decât în oxalilacetat care necesită NAD.
NAD Pe măsură ce
concentraţia de etanol scade şi acetatul extracelular este adus înapoi în celulă de o variaţie în
echilibrul acetatului, mai mult NAD devine disponibil pentru transformarea malatului în
oxalilacetat. Astfel o proporţie crescută de acetil CoA trece prin întreg ciclul TCA.
TCA Deci la
138
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

concentraţii scăzute de etanol şi ridicate de acetat, o mai mare parte a substratului este
utilizată pentru menţinere, decât pentru creşterea celulară.

Figura 2. Metabolismul celular al etanolului.

De aceea este posibil să se observe o creştere a coeficientului respirator atâta timp cât
un procent mare din acetil CoA trece prin tot ciclul, deoarece se produce mai mult CO2 în
timp ce consumul de oxigen ramâne acelaşi. În plus, nivelele de NADH scad o dată cu
declinul conversiei etanolului si creşterea consumului de acetat extracelular.
Utilizarea etanolului în celulă este prezentată în Figura 2.
2 Etanolul este oxidat la
II [35, 36, 37, 38, 39].
acetaldehidă de către alcool dehidrogenază (izoenzima ADH II)
Obţinerea etanolului ca produs final al glicolizei şi utilizarea acestuia ca sursă de carbon
şi energie pentru creştere, depind de activitatea acestei enzime [40]. Izoenzimele ADH din
139
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

S.cerevisiae reprezintă o familie de enzime NAD dependente, diversificate funcţional [41, 42,
43
, 44, 45]. Ele aparţin grupului de enzime Zn-dependente
Zn prezentând identitate secvenţială [46,
47 48 49
, , ].
ADH I,
I izoenzima fermentativă clasică, localizată în citosol, este responsabilă pentru
ultima etapă din ciclul glicolitic la drojdii (reducerea acetaldehidei la etanol) [50, 51].
II izoenzima oxidativă este represată în condiţii fermentative [52] şi derepresată
ADH II,
în absenţa unaui zahar ce poate fi fermentat, cum este glucoza. În celula drojdiilor, ADH II
oxidează etanolul la acetaldehidă, intermediar în gluconeogeneză [53, ]. Enzima este
54

extramitocondrială. ADH 2,
2 gena structurală pentru ADH II este reglată la nivel
transcripţional de represia catabolică prin intermediul unui efector pozitiv specific, codificat
de gena ADR 1.
1
Izoenzima ADH III a fost descoperită de Lutsdorf şi Megnet [55]. Este localizată în
mitocondrii, fiind prezentă la drojdii crescute pe glucoză sau etanol. Funcţia metabolică a
acestei enzime nu este clar cunoscută, dar există indicaţii că nu funcţionează fermentativ:
tulpini ce conţin doar ADH III nu pot supravieţui ca tulpini „petit” care obţin energia doar
prin fermentaţie. Este posibil ca ADH III să fie implicată în metabolismul respirator, ţînând
seama şi de localizarea ei mitocondrială.
Genele structurale ADH 1 şi ADH 2 care codifică izoenzimele ADH I şi ADH II sunt
cunoscute şi caracterizate [53, 56]. La S.cerevisiae
S. au fost identificate încă două gene ADH:
ADH
ADH 3 [57, 58] care codifică enzima mitocondrială şi ADH 4 care nu manifestă nici-un fel de
similaritate semnificativă cu celelalte gene ADH [59, 60].
Următoarea etapă în metabolizarea etanolului este oxidarea acetaldehidei la acetat, reacţie
catalizată de acetaldehid-dehidrogenază. Au fost izolate două acetaldehid-dehidrogenaze
ACDH) din S.cerevisiae [61, 62, 63]. Una dintre aceste enzime este localizată în mitocondrii şi
(ACDH
poate folosi atât NAD+ cât şi NADP+, fiind activată de K+ şi de diverşi tioli [64, 65, 66]. Cea de-a

doua enzimă este activată de Mg2+, este NADP+ dependentă şi este localizată în citosol [67, 68,
69
].
Cercetările experimentale au demonstrat că enzima mitocondială are
un rol important în creşterea drojdiei pe etanol; mutantele ce nu au
această enzimă nu cresc pe etanol [70]. Enzima citosolică pare a fi implicată
în sintetizarea acetil-CoA din acetaldehida produsă de PDC în cazul
creşterii drojdiei pe glucoză. Aceste reacţii au ca rezultat reducerea
140
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

concomitentă a 2 NAD+. Acetatul este apoi transformat în acetil-CoA,


acetil-CoA cu
ajutorul acetil-CoA sintetazei,
sintetazei, ATP dependente, din citoplasmă [71, 72
].
Grupările acetil activate pot urma în principal două căi. Ele pot intra în
ciclul glioxilatului localizat în citoplasmă în cursul căruia două grupări
acetil se unesc pentru a forma succinat [73]. Succinatul poate intra în
matricea mitocondrială pe ruta malat-succinat [74]. Alternativ, grupările
acetil pot intra în mitocondrie direct pe ruta acetil carnitinei. Pe această
cale, grupările acetil sunt transferate de la CoA la carnitina din citoplasmă
prin acţiunea carnitin-acetil transferazei. Ele intră apoi în matricea
mitocondrială unde sunt transferate înapoi la CoA.
CoA
Succinatul format în ciclul glioxilatului desfăşurat în citoplasmă, intră în ciclul TCA
din matricea mitocondrială. Excesul de succinat iese din ciclul TCA sub formă de malat care
va fi transformat în oxalilacetat, cel ce va intra pe calea gluconeogenezei din citoplasmă. O
anumită parte a acestui traseu metabolic va fi funcţională doar în absenţa glicolizei. Astfel,
piruvat kinaza [(PK
PK) EC 2.7.1.40] şi fosfoenolpiruvat carboxikinaza (PEPCK
PEPCK) EC 4.1.1.49
sunt prezente în celulă în acelaşi timp, dar catalizează reacţii opuse: prima este obligatorie
pentru gluconeogeneză, iar cea de-a doua pentru glicoliză [75]. Enzimele cheie pentru
gluconegeneză şi glicoliză sunt bine caracterizate în multe microorganisme, inclusiv în
S.cerevisiae [76, 77, 78].
Reacţiile specifice catalizate de PEPCK şi PK sunt antagoniste metabolic; când aceste
două enzime şi piruvat carboxilaza [(PC
PC) EC 6.4.1.1.]
6.4.1.1 sunt prezente în celulă în acelaşi timp
ele intră într-un ciclu metabolic (care se repetă) şi care duce la irosirea energiei celulare [79].
În drojdia S.cerevisiae piruvatul este un intermediar cheie în catabolismul zaharurilor,
ca şi un precursor în sinteza unor aminoacizi cum sunt alanina, leucina, izoleucina şi valina
[80]. În cazul creşterii pe etanol sau acetat, piruvat kinaza nu participă la catabolismul sursei de
carbon, dar prezenţa ei este necesară pentru sinteza aminoacizilor menţionaţi anterior. Sinteza
piruvatului se poate face teoretic prin două mecanisme: (1) din fosfoenolpiruvat sub acţiunea
piruvat kinazei şi (2) prin decarboxilarea malatului sub acţiunea enzimelor participante le
metabolismul malatului [81, 82].
Creşterea drojdiilor pe compuşi C2 depinde de activitatea enzimelor din ciclul
glioxilatului, una dintre cele mai importante fiind izocitratliaza. Activitatea aceastei enzime
este extrem de redusă în cazul creşterii pe glucoză, devenind importantă către sfârşitul

141
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

fermentaţiei atunci când în mediu se acumulează etanol şi acetat. Conform datelor prezentate
în literatură, factorii ce afectează activitatea izoenzimei ADH II influenţează şi activitatea
izocitratliazei.

4.1.3. Toleranţa la etanol


Drojdia S.cerevisiae fiind o tulpină cu multiple întrebuinţări industriale a constituit
obiectul unui număr mare de studii privind influenţa unor factori de stres asupra vitezei
specifice de creştere şi a celei de fermentaţie a zaharurilor. Deşi influenţa etanolului a fost
intens studiată, concluziile asupra concentraţiilor inhibitoare şi asupra comportării culturilor
de drojdie sunt foarte diferite. În Figura 3 este prezentată influenţa concentraţiei etanolului
asupra vitezei specifice de creştere a drojdiei S.cerevisiae [83, 84, 85, 86, 87, 88, 89]. Aşa cum se
poate observa influenţa etanolului exogen (adăugat în mediul de cultură) diferă de cea a
etanolului endogen (produs de celule). Una din dificultăţile determinării toleranţei la etanol
provine din faptul că nu există un mod de definire a acestei noţiuni şi o tehnică de
determinare unanim acceptată [90, 91, 92].
Au fost propuse mai multe mecanisme pentru a explica inhibiţia prin etanol [93, 94
].
Acestea includ afectarea proprietăţilor de permeabilitate ale membranei celulare, efecte
directe asupra enzimelor implicate în metabolismul etanolului, inhibiţia prin produs sau
acumularea de metaboliţi toxici [95, 96, 97, 98]

Figura 3. Efectul alcoolului etilic asupra vitezei specifice de creştere [83] µ =


viteza specifică de creştere ; µ m = viteza specifică maximă de
creştere ;
Sursa de etanol : —— adăugat, ------ autogen
a) Continuu [84] ; b) Batch [85]; c) Continuu
142[86]; d) Continuu [87] ; e) Batch [88] ; f)
Batch [88]; g) Continuu ; h) Batch [89]
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

Studii relativ recente [99] s-au ocupat de toleranţa la etanol a drojdiilor. Autorul
presupune trei efecte majore ale alcoolului în concentraţii mari asupra celulelor de drojdie.
Etanolul afectează creşterea celulei, viabilitatea ei şi capacitatea fermentativă. Conform
aceleiaşi surse bibliografice, etanolul exogen, adăugat unei culturi de S.cerevisiae,
S.cerevisiae este mai
puţin toxic decât etanolul endogen produs de drojdie [100].
Locurile de atac ale etanolului în celula de drojdie sunt ilustrate în Figura 4.
4

Figura 4. Ţintele posibile ale etanolului în celula de drojdie (D`AMORE (1990).

Unul din efectele etanolului poate fi alterarea organizării şi permeabilităţii


membranelor. Jimenez şi Van Uden [101, 102
] au propus o metodă bazată pe acidificarea
extracelulară pentru testarea rapidă a toleranţei la etanol a drojdiilor. Conform autorilor citaţi,
drojdiile etanol - tolerante vor manifesta o valoare de pH extracelular mai scăzută decât
drojdiile netolerante. Acest comportament se bazează pe faptul că etanolul provoacă o
reintrare pasivă accelerată a protonilor în celulă, ceea ce are ca efect general creşterea valorii
de pH extracelular. Celulele etanol - tolerante vor fi mai puţin afectate de etanol şi, de aceea,
vor avea o valoare mai scăzută a pH-ului extracelular.
PRELL şi colab. [20 ] explică în lucrarea lor legatura dintre fluxurile de ioni provocate
de adăugarea etanolului şi concentraţia oxigenului dizolvat în mediul de cultură în cazul
drojdiei Candida utilis.
utilis
Scopul studiului lor este elucidarea influenţei presiunii parţiale a oxigenului în faza
gazoasă asupra activităţii catabolice, transportului de ioni prin membrana plasmatică şi stării
energetice a populaţiei de celule.
Candida utilis poate metaboliza etanolul numai în condiţii aerobe. Atunci când este
folosit numai aerul, viteza de oxidare a etanolului a fost relativ scăzută. O parte mai mare din
etanol este complet oxidat la CO2 si H2O şi o fracţie mai mică de acetat este eliminată din

143
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

celulă. În concordanţă, viteza de acidificare a mediului cauzată de eliminarea ionilor H+ şi


acizilor din celulă este, de asemeni scăzută.
S-au făcut observaţii pentru celulele aflate la începutul fazei de lag şi pentru celulele în
creştere exponenţială. În cazul primelor, după două ore de cultivare cu limitare de etanol,

valorile de pH extern şi ale concentraţiei K+ sunt aproximativ aceleaşi indiferent de pO2 în


aerul introdus în bioreactor. În cazul cultivării continue, pentru celulele aflate în faza
exponenţială de creştere, efluxul H+ este mult mai puternic, depinzând de rata de diluţie.

Schimbul H+/K
K+ conduce la formarea unei diferenţe de pH transmembranare care este treptat

Figura 5. Procesele ce au loc după adăugarea etanolului în mediu în cazul drojdiei C.utilis.

mascată de producerea şi eliminarea de acetat şi lactat, o dată cu scăderea presiunii parţiale a


oxigenului dizolvat în mediu. Prin analogie cu alte specii de drojdie (S.cerevisiae
S.cerevisiae,,
Kluyveromyces lactis)
lactis Prell presupune că acizii sunt eliminaţi din celulă sub formă de anioni
(transport activ), în timp ce intrarea lor în interiorul celulei are loc prin simpla difuzie sub
forma moleculelor nedisociate. Procesul este prezentat schematic în Figura 5.
5
Eliminarea de lactat şi acetat este însoţită de un influx de potasiu şi o scădere a
concentraţiilor de ATP,
ATP ADP şi piruvat intracelulare. Corespunzător, o scădere în încărcarea
energetică a celulei dă naştere unui eflux de K+ [103]. Variaţiile în nivelul piruvatului
intracelular reflectă producerea de intermediari şi energie prin metabolizarea etanolului ceea
ce afectează metabolismul endogen. Acetatul şi lactatul sunt rapid eliminate din celule,
probabil datorită acţiunii rapide a alcoolului, a aldehid-dehidrogenazei şi lactat
dehidrogenazei. Dispariţia lor ulterioară rapidă din mediu se poate pune pe seama pornirii
procesului metabolic propriu-zis, în care se consumă aceşti acizi.
O dată cu scăderea concentraţiei O2 din mediul de cultură, consumul de acetat şi de

144
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

lactat se diminuează şi nivelul concentraţiilor lor din mediu creşte din nou. La concentraţii
scăzute de etanol, în condiţii de limitare de O2, viteza de consum a acetatului şi lactatului
extra/intra celular depăşeşte viteza de producere şi eliminare din celule.
Eliminarea lactatului în mediu este o dovadă a limitării prin O2 pentru că lactatul apare
din fermentaţia substanţelor de rezervă cum este glicogenul. Eliminarea acetatului este o
consecinţă a timpilor morţi (cauzaţi de vitezele de reacţie scăzute) ce apar în etapele ciclului
TCA după formarea acetatului, sau în reacţiile şuntului glioxalic, precum şi a reglării pH
intracelular într-un domeniu optim pentru celule.
Oscilaţiile nivelelor de acetat şi lactat extracelulare reflectă dinamica vitezei pe fiecare
treaptă atât în oxidarea etanolului cât şi în metabolismul endogen [104].
Diferenţa de pH transmembranar depinde direct de nivelul de etanol din mediu.
Eliminarea etanolului înseamnă dispariţia barierei de pH datorită consumului rapid de H+,

oglindit de efluxul K+. Nivelul ridicat de etanol nu creşte permeabilitatea pasivă a membranei

celulare pentru ionii H+. Concentraţia inhibitoare de etanol încetineşte formarea barierei de

pH, modificând fluxurile H+ şi K+. Indiferent de concentraţia de etanol din mediu, fluxul
ionilor de potasiu îl depăşeste pe cel al ionilor de hidrogen, dar diferenţa devine mai mare la
concentraţii inhibitoare de etanol.
Natura complexă a acţiunii etanolului asupra celulei sugerează implicarea unui mare
număr de gene în achiziţia toleranţei la etanol.
Etanolul prezent în concentraţii mari este fără îndoială un factor de stres pentru celulă
[105]. Un răspuns imediat al drojdiei este producerea unor compuşi cu rol de protecţie a
componentelor celulare de efectele distructive ale stresului [106, 107
, 108
, 109
, ]. Sunt activate
110

imediat căile de producere a semnalelor ce au ca efect ulterior inducerea exprimării mai


multor gene. Produşii controlaţi de acestea conferă protecţia celulei [111, 112 ].
Un aspect interesant al răspunsului la stres al celulelor de drojdie este fenomenul
dobândirii rezistenţei la stres care se produce atunci când celula este supusă în prealabil
unei forme de stres similară sau nu cu cea la care se doreşte să se capete rezistenţă dar în
condiţii mai puţin severe [113, 114, 115].
De exemplu, atunci când celulele sunt expuse la şocuri blânde de temperatură, ele
capătă rezistenţă la acţiunea diferiţilor factori de stres, care în mod normal le-ar fi letale [116,
117
, ]. Toleranţa la stres poate fi indusă fie prin tratamente termice, fie prin tratamente cu
118

substanţe chimice cum ar fi etanolul [119]. Expunerea celulelor la acţiunea factorilor de stres
145
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

poate determina inducerea formării unui grup de proteine cunoscute sub numele de „proteine
de şoc termic” -hsp
hsp (heat shock protein). O mare parte din proteinele de şoc termic sunt
constitutive fiind prezente în celulele crescute la temperaturi normale. S-a arătat că în
S.cerevisiae inducerea hsp 104 neexprimată la temperatură normală, este necesară pentru a
dobândi toleranţa la tratamente termice prelungite [120, ]. În acelaşi timp, preexpunerea la
121

şocuri de temperatură conduce la dobândirea de toleranţă la etanol [122], dar sistemul nu


funcţionează şi în sens invers [123, 124].
Un alt factor potenţial important în dobândirea termotoleranţei este prezenţa
trehalozei. Termotoleranţa drojdiilor este crescută chiar în absenţa proteinei hsp 104 , dacă în
celulă există acumulări de trehaloză [125, 126].
Expunerea la etanol determină sinteza unor proteine hsp [127]. În timpul expunerii la o
concentraţie de 7% [v/v] etanol, sunt sintetizate 6 proteine, dintre care 4 sunt similare ca
mărime cu hsp sintetizate atunci când celulele sunt supuse unui şoc termic de la 23 la 37oC
[128].
Eficacitatea preexpunerii la şoc prin concentraţii mărite de alcool depinde de lungimea
catenei alcoolului folosit, cea mai mare rezistenţă la stres fiind indusă de tratamentul cu
butanol şi cea mai mică de tratamentul cu metanol.

4.4. Aspecte tehnologice ale obţinerii biomasei cu drojdii consumatoare de


etanol
Cercetările din ultimile două decenii asupra obţinerii biomasei cu drojdii s-au orientat
în două direcţii [129]:
-utilizarea unor substraturi regenerabile (deşeuri celulozice) cu preţ foarte scăzut pentru
obţinerea unor produse de uz furajer şi
-obţinerea unor produse cu calităţi superioare, pornindu-se de la substraturi cu grad
ridicat de puritate si compoziţie constantă destinate consumului uman (etanol).
În comparaţie cu substraturile clasice, etanolul are câteva avantaje demne de subliniat
aşa cum reiese din Tabelul 1.
1
De exemplu, etanolul poate fi produs din cereale sau alte surse regenerabile, cu o
puritate ridicată. Ca urmare, este acceptat ca materie primă în industria alimentară. Etanolul
este uşor de depozitat şi de transportat, comparativ cu alte substraturi, de exemplu metanul.
Nu este toxic ca alcoolul metilic. Este complet solubil în apă (spre deosebire de metan,
146
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

motorină) ceea ce permite obţinerea unui mediu de cultură omogen, impunând astfel cerinţe
mai reduse pentru asigurarea transferului de masă în timpul bioprocesului.
Etanolul nu este un inhibitor marcant al activităţii microorganismelor (în special a
drojdiilor) ceea ce permite utilizarea unui domeniu mai mare de concentraţii în timpul
procesului de biosinteză şi realizarea unor productivităţi ridicate.

Tabelul 1. Avantajele şi dezavantajele utilizării etanolului ca substrat pentru


obţinerea biomasei.
Avantaje Dezavantaje
Disponibil ca materie primă foarte pură Cost relativ ridicat
Volatilitate relativ mare în soluţii
Acceptat ca ingredient alimentar
diluate
Poate fi utilizat de multe specii de
Uşor de manipulat şi depozitat microoganisme, prezentând deci un
risc ridicat de contaminare
Complet solubil în apă
Nu este un inhibitor marcant pentru majoritatea
microorganismelor
Datorită gradului de reducere scăzut, necesită
mai puţin oxigen pentru metabolizare şi degajă
o cantitate mai mică de căldură în comparaţie
cu n-parafinele
Poate fi obţinut în cantităţi mari, cu o calitate
ridicată şi din materii prime noi

Fiind un produs parţial oxidat, alcoolul etilic necesită pentru metabolizare mai puţin
oxigen şi degajă mai puţină căldură. Consumul mai scăzut de oxigen este un avantaj
tehnologic foarte important ţinând seama de faptul că majoritatea proceselor industriale de
biosinteză funcţionează în regim cu limitare de oxigen, acesta fiind unul din impedimentele
majore ale operării proceselor la concentraţii celulare ridicate.Un consum de oxigen mai
scăzut conduce la reducerea cantităţii de căldură degajată pe două căi :
-se reduce cantitatea de caldură generată în timpul proceselor metabolice şi
-se reduce puterea consumată prin agitare care se regăseşte în cele din urmă tot sub
formă de căldură ce trebuie îndepartată din proces pentru menţinerea unei temperaturi
constante.
Din punct de vedere tehnologic eliminarea căldurii generate este o problemă
147
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

costisitoare deoarece creşterea temperaturii apei de răcire este limitată la maxim 8-10oC,
coeficientul parţial de tranfer termic de la mediul de fermentaţie la suprafaţa de schimb
termic în cazul mediilor aerate fiind destul de redus.
Aceste avantaje sunt parţial contrabalansate de câteva dezavantaje, prezentate de
asemenea în Tabelul 1.
1.
Volatilitatea ridicată în soluţiile diluate existente în bioreactor duce la pierderi de
substrat în aerul exhaustat, scăzând astfel randamentul global.
Datorită faptului că etanolul poate fi utilizat de multe specii de microorganisme, se
impun condiţii mai severe pentru operarea aseptică a procesului.

Tabelul 2. Randamente în procesele de obţinere a biomasei din etanol.

Sursa bibliografică X [g/l] t [h] So [g/l] Randament


limitare de etanol
ZIEGLER (1979) 41, 7 19, 5 60, 5 0, 69
PROKOP (1978) 15, 0 9, 0 20, 0 0, 75
LASKIN (1977 ) 12, 0 12, 0 16, 0 0, 75
fără limitare de etanol
WATTEEUW (1977) 13, 0 35 37, 2 0, 35
LASKIN (1977) 7, 0 - 0, 46
MOR (1968) 4, 7 - 0, 46
* X = concentraţia de biomasă uscată ; So = concentraţia de etanol alimentat

Atunci când microorganismul este crescut în condiţii de limitare de etanol, se poate


atinge un randament de 0,75 g biomasă/g etanol. Datele din literatură sugerează că rezultatele
optime se obţin pentru tulpinile din genul Candida la viteze de creştere cuprinse între 0,25-
0,35 [h-1]. Atunci când se lucrează la concentraţii celulare mari, în domeniul 40-60 [g/l],
consumul pentru menţinere creşte. Explicaţia acestui comportament ţine seama de consumul
energetic superior pentru menţinerea unor concentraţii mari de etanol şi metaboliţi în
interiorul celulei, necesare păstrării activităţii celulare la densităţi celulare mari [102].
În cazurile în care etanolul nu limitează creşterea celulară, se obţin randamente
variate, dar mai scăzute. Valori de 0,35 [g biomasă/g etanol] sunt destul de obişnuite [130]
(Tabelul 2).
Date cinetice asupra comportării unei tulpini de Saccharomyces cerevisiae H1022 în
cultivare continuă sunt prezentate de Mor şi Fiechter [131] -Tabelul
Tabelul 3.
3.
148
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

Tabelul 3. Comportamentul drojdiei S.cerevisiae in cultivare continuă (MOR şi


FIECHTER, 1968).

D X S Y Qo2 Qco2 RQ
-1
[h ] [g/l] [g/l] [ml/g.h] [ml/g.h]
0, 011 4, 08 0, 12 0, 43 9, 9 5, 6 0, 57
0, 029 4, 39 0, 09 0, 461 21, 8 12, 6 0, 57
0, 066 4, 71 0, 06 0, 493 45, 1 23, 3 0, 52
0, 071 4, 70 0, 07 0, 493 45, 3 28, 3 0, 53
0, 102 4, 77 0, 07 0, 500 64, 3 31, 1 0, 49
0, 127 4, 78 0, 22 0, 509 76, 9 38, 3 0, 49
0, 150 4, 69 0, 39 0, 508 87, 9 44, 1 0, 47
0, 166 1, 87 4, 43 0, 362 99, 9 47, 3 0, 47
Obs. X= conc. biomasă ;Y = randamentul de substrat ; Q = consumul specific de oxigen, respectiv
degajarea bioxidului de carbon; RQ= coeficientul respirator; S=concentraţia substratului.

După cum se poate vedea din acest tabel, la valori mici ale ratei de diluţie randamentul
de substrat are valori mici. Pe masură ce rata de diluţie creşte, consumul pentru menţinere se
păstrează relativ constant, devenind deci relativ mai puţin important, astfel încât randamentul
de substrat creşte. În condiţiile unor diluţii mari se observă din nou o scădere a randamentului
de substrat.
Paca si Gregr [132] au studiat dezvoltarea drojdiei Candida utilis pe substrat de etanol
într-un fermentator tip coloană cu agitare la o rată de diluţie de 0,33 [h-1]. Concluziile lor pot
fi rezumate astfel:
1. Utilizarea fermentatorului tip coloană cu agitare în mai multe trepte permite
utilizarea unor concentraţii mari de etanol fără pierderi însemnate de etanol în aerul exhaustat;
2. Asigurarea unei recirculări controlate asigură o reinoculare continuă cu celule de
drojdie adaptate la concentraţii crescute de etanol, ceea ce permite folosirea unor diluţii
mărite;
3. Concentraţia maximă de acid acetic este atinsă în cea de-a doua treaptă. În etapele
următoare, acidul acetic este folosit ca sursă de carbon de către celule, deşi există o
concentraţie suficientă de etanol;

4. O concentraţie mare de etanol în alimentare şi un randament acceptabil în biomasă

149
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

fac posibilă atingerea unor concentraţii de substanţă umedă mari în al patrulea etaj;
5. O rată de diluţie şi concentraţie de etanol în alimentare mari asigură o
productivitate bună;
6. Creşterea concentraţiei de etanol în alimentare peste 20 [g/l] nu are nici-un efect
asupra conţinutului în proteină al celulei;
7. Ţinând cont de randament, de viteza de transfer a oxigenului, de conţinutul în
proteină al celulei şi de productivitatea procesului, valoarea de 50 [g/l] este optimă pentru

concentraţia de etanol în alimentare, la o rata de diluţie de 0, 3 [h-1]. Valorile numerice sunt


prezentate în Tabelele 4 şi 5;

Tabelul 4. Creşterea drojdiei Candida utilis într-un fermentator multietajat


(PACA
PACA şi GREGR,
GREGR 1977 ).

Parametrul Etajul 1 Etajul 2 Etajul 3 Etajul 4 So


X [ g/l] 5 6 7 8 10
9, 5 9, 8 10 10, 2 20
13 16 20 22 50
17 22 27 30 75
5 6 8 10 80
3 5, 5 8, 5 11 100
Yx/s 60 72 45 0 10
59 37 47 0 20
51 40 48 5 50
53 42 38 15 75
32 17 15 22 80
40 60 55 21 100
Obs: So=concentratia de etanol in alimentare

Tabelul 5. Conţinutul de proteină (Cp) în funcţie de concentraţia de etanol în

influent.

So [g/l] 10 20 50 65 75 80

Cp (Etajul 1) 52 37 37 37 36 34
Cp (Etajul 2) 48 30 29 30 29 29

150
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

Figura 6 ilustrează variaţiile în randament şi productivitate calculate pentru întregul


sistem.Valoarea maximă a randamentului (66%) se obţine la So=10 [g/l]. În domeniul de

concentraţie So=20-75 [g/l], randamentul scade de la 55 la 45%. Depăşind concentraţia de 75


g/l apare o scădere bruscă a eficienţei de utilizare a sursei de carbon.
Productivitatea fermentatorului creşte o dată cu concentraţia de
etanol în alimentare până la valoarea de 75 [g/l]. Peste această valoare şi
productivitatea înregistrează o scădere drastică. Productivitatea maximă

-2, 2 [g/l/h]- se obţine la So = 75 [g/l]. Acest maxim se datorează realizării

celei mai mari concentraţii de biomasă. Dar la această valoare a lui S o


pierderea de etanol în efluent este prea mare.Ţinând cont de acest aspect,
concentraţia optimă de etanol în alimentare este de 50 [g/l], caz în care
treapta a 4-a a fermentatorului este alimentată cu 0, 6 [g/l], iar
productivitatea globală atinge valoarea de 1,7 [g/l/h].

70 2.5

60
2
Productivitatea [g/l/h]
Randament [g/g]

50

40 1.5

30 1
20
R andament 0.5
10 Pr
0 0
0 20 40 60 80 100 120

S o [g/l]

151
Figura 6. Influenţa concentraţiei substratului asupra randamentului şi productivităţii.
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

Într-o comunicare ulterioară [133], aceiaşi cercetători demonstrează că o presiune


parţială mărită a oxigenului în gazul cu care este alimentat fermentatorul duce la creşterea
concentraţiei de biomasă, a randamentului şi, implicit a productivităţii, comparativ cu
condiţiile standard. Pentru determinarea regimului optim de aerare s-a studiat concentraţia de
oxigen dizolvat în fiecare din cele 4 trepte ale fermentatorului.Cum era de aşteptat, ultima
treaptă funcţionează în regim de limitare de oxigen. Această observaţie explică scăderea
concentraţiei biomasei observate anterior. Introducându-se aer îmbogaţit în oxigen (Po2=263,5
tori) se observă o creştere a concentraţiei de oxigen dizolvat în toate cele patru trepte,
creşterea fiind mai mare în cea de-a 4-a treaptă comparativ cu primele trei.
Utilizarea aerului îmbogăţit în oxigen determină creşterea concentraţiei celulare în cea
de-a 2-a şi în cea de-a 4-a treaptă şi scăderea ei în prima treptă. Aceste rezultate experimentale
pot fi explicate dacă admitem existenţa unui efect inductor al oxigenului la concentraţii
moderate şi a unuia inhibitor în cazul concentraţiilor mari.Astfel, în prima treaptă este
posibilă manifestarea unui efect inhibitor combinat datorat concentraţiilor mari de etanol şi
oxigen (în aceste condiţii o parte semnificativă din substrat este oxidată la acetat). Prezenţa
unei concentraţii crescute de acetat demonstrează că celulele de drojdie au o capacitate
scăzuta de a utiliza acetatul via TCA şi glioxilat,
glioxilat ceea ce duce la o generare modestă de
energie în procesul fosforilării oxidative.
Deoarece utilizarea aerului îmbogăţit în oxigen măreşte substanţial preţul de cost al
produsului finit, PACA (1980) studiază posibilitatea utilizării unei alimentări periodice cu aer
îmbogăţit în oxigen. Procedura optimă de aerare propusă de autorul menţionat constă în
folosirea unei Po2 = 263,5 tori în aerul alimentat timp de 24 de ore, urmată de o perioadă de
50-55 h de aerare normală (Po2=165,9 tori). Acest procedeu economiseşte 55-60% din
oxigenul pur comparativ cu procedeul de aerare continuă cu aer îmbogăţit în oxigen. În
Tabelul 6.
6. se prezintă câţiva parametri ai procesului în 3 variante de operare:

I. Utilizarea unui aer îmbogătit în oxigen Po2 = 263,5 tori timp de 24 h, după care se
continuă aerarea cu aer obişnuit Po2 = 165, 9 tori

II. Aerare normală Po2 =165, 9 tori

III. Menţinerea unei Po2=208 tori constantă, în aerul alimentat, corespunzatoare


aceluiaşi consum de oxigen pur ca şi în primul caz.
152
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

Tabelul 6. Parametrii procesului de obţinere a biomasei pe etanol în


sistem continuu în funcţie de aerare.

X4 [g/l] S4 [g/l] Yx/s [g/g] Pr [g/l/h]

I 34 0,5 0,69-0,7 2,55-2,6


II 17 15-18 0,51-0,52 1,4
III 25 14 0,61 1,74

Schugerl şi colab. [134] compară parametrii procesului de obţinere a biomasei cu Candida


boidinii,
boidinii în funcţie de sursa de carbon şi energie utilizată pentru creştere (Tabelul
Tabelul 7)
7).

Tabelul 7. Compararea valorilor µ m, Yx/s, Yo, pentru o tulpina de


Candida boidinii,
boidinii pe diferite substraturi.

Substrat So şg/lţ -1
µ m şh ţ YX/S YO
Metanol 5 0,104 0,42 0,38
Etanol 5 0,208 0,68 0,66
Glucoza 5 0,327 0,48 1,42

În cazul creşterii fără limitare de substrat se obţine cea mai mare productivitate
folosind glucoza şi cea mai mică atunci când substratul este metanolul. Dacă creşterea este
limitată de transferul de masă al oxigenului, cele mai mari productivităţi se înregistrează tot
pentru glucoză datorită randamentului mare faţă de oxigen.Cele mai mici productivităţi se
obţin tot în cazul metanolului din cauza valorilor scăzute ale coeficientului de transfer de
masă şi a randamentului faţă de oxigen. Etanolul are o poziţie intermediară în ceea ce priveşte

productivitatea din cauza valorilor medii pentru µ m şi Yo. Randamentul de substrat are însă

valoarea cea mai mare pentru etanol [135].

4.1.5. Obţinerea de biomasă liofilizată cu tulpini de Saccharomyces cerevisiae

4.1.5.1. Tulpini de drojdii utilizate

153
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

Pentru obţinerea de biomasă proteică viabilă s-au utilizat trei tulpini de drojdii din
genul Saccharomyces: Saccharomyces cerevisiae 224; Saccharomyces cerevisiae 225;
Saccharomyces cerevisiae 226.

4.1.5.2. Medii de cultură


Mediul de cultură pentru inocul şi pentru faza de fermentaţie conţine %
(W/V):KH2PO4 0,2, (NH4)2SO4 0,2, extract de porumb 0,2, MgSO4×7H2O 0,05,
microelemente 1 ml, pH 4,5, etanol 0,3.

4.1.5.3. Echipamente şi sisteme de cultivare


Echipament - Inoculul s-a cultivat în baloane Erlenmeyer de 500 ml cu 100 ml mediu
de cultură. Procesul de fermentaţie s-a realizat într-un bioreactor tip LKB, la un volum util de
9l. Parametrii de cultivare au fost: temperatura 280C, agitare 600 – 900 rpm, aerare 0,8 – 1,3
l/l/min. Nivelul oxigenului dizolvat a fost monitorizat de un electrod galvanic (Pb/Ag).
Concentraţia de CO2 din aerul exhaustat a fost măsurat cu ajutorul unui analizator IR tip
Infralyt 4 (Junkalor Dessau, Germania).
Fermentaţia - Cultivarea celor 3 tulpini de drojdii din genul S.
cerevisiae s-a realizat în sistemul de cultivare batch, după care biomasa a
fost separată din mediul de cultură prin centrifugare şi supusă procesului
de liofilizare într-un liofilizator tip L – MIN – D.

4.1.5.4. Metode analitice utilizate


Biomasa uscată (DCW) a fost determinată prin centrifugarea mediului de fermentaţie
la 5.000 rpm timp de 30’, apoi spălarea celulelor cu apă distilată şi uscarea acestora până la
greutate constantă la 1050C. Etanolul a fost analizat gaz – cromatografic. Densitatea optică
(DO) a fost citită la un spectrofotometru Karl Zeiss Jena, la λ = 570 nm.

4.1.5.5. Parametrii de cultivare şi caracteristicile biomasei liofilizate


Evoluţia parametrilor de cultivare în sistem batch a celor 3 tulpini de S. cerevisiae
precum şi rezultatele obţinute sunt prezentate în Tabelul 8 şi Figura 6 şi 7.

Tabelul 8. Parametrii de cultivare în sistem discontinuu a celor 3 tulpini de S. Cerevisiae.

Durată Concentraţ
Aer Agitare
cultivare pH ie etanol
(l/l/m/m) (rpm)
(ore) (%)
154
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

0 6 600 4,1 0,25


4 6 600 4,0 0,32
8 9 800 4,0 0,12
12 12 900 4,2 0,26
16 12 900 4,0 0,37
20 14 1000 4,1 0,18
24 15 1000 4,0 0,23
Dezvoltarea biomasei de Saccharomyces cerevisiae s-a realizat prin menţinerea
constantă a pH la valoarea 4 şi a concentraţiei de etanol din mediul de cultură între 0,1 –
0,35%, ajungându-se la 24 ore de cultivare la un DCW de 41,25 g/l. Odată cu creşterea
concentraţiei de biomasă, concentraţia O2 dizolvat a scăzut şi s-a menţinut la pragul de 30%,
prin creşterea ratei de aeraţie de la 0,8 la 1,3 l/l/m/m, şi a agitării de la 600 rpm la 1000 rpm.

100 2.5

Nivelul bioxidului de carbon


80 2
Nivelul oxigenului dizolvat

60 1.5

dizolvat
%

%
40 1

20 0.5

0 0
0 4 8 12 16 20 24
Time, hours

Figura 6. Nivelul oxigenului dizolvat si al bioxidului de carbon pe


parcursul cultivări tulpinilor Saccharomyces cerevisiae 224, 225, 226
în sistemul de fermentaţie batch.

155
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

100 50

80 40

Concentratia biomasei
Densitate optică

60 30

, g/l (DCW)
40 20

20 10

0 0
0 4 8 12 16 20 24
Timp, ore
Figura 7. Profilul fermentaţiei de cultivare batch cu Saccharomyces
cerevisiae 224, 225, 226.

Durata procesului de cultivare a fost de 24 de ore, obţinându-se 370


g biomasă prin consumarea a 612 g etanol. Consumul specific de etanol a
fost de 1,65, iar randamentul de bioconversie în biomasă a fost de 60,5%.
Viteza specifică de creştere a celor 3 tulpini de drojdii pe tot parcursul
celor 24 ore de cultivare a fost de 0,1 h-1, iar productivitatea celulară a
atins 5,77 g×l-1×h-1, cu un TD = 4,95 h.
Biomasa proteică a fost separată din broth prin centrifugare şi a fost supusă apoi
procesului de liofilizare, după ce în prealabil s-a adăugat mediu de protecţie (zaharoză 10%),
având după procesul de liofilizare o viabilitate de 7,53×1016celule/g biomasă. Caracteristicile
fizico – chimice ale biomasei liofilizate sunt prezentate în Tabelul 9.

Tabelul 9. Caracterizarea analitică a biomasei liofilizate de S. cerevisiae


224, 225, 226.

Nr. crt. Parametrii Valori


1 Aspect Biomasă liofilizat, amorfă
2 Culoare Alb – bej
3 Miros Caracteristic
4 Pierdere prin uscare (%) 4,67
5 Rezidiu sulfatat (%) 4,97
6 Metale grele (%) Absent
7 Azot total (%) 6,913

156
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

8 Azot amoniacal (%) 0,313


9 Proteină totală (% s.u.) 43,27
10 Acizi nucleici (%) 2,8
11 Lipide (%) 6,1

Biomasa obţinută în urma procesului de liofilizare şi caracterizată fizico – chimic şi


din punct de vedere al viabilităţii celulelor de drojdii a fost apoi formulată ca produs probiotic
sub formă de capsule gelatinoase.

4.2. Studii farmacologice preclinice asupra biomasei de S.cerevisiae


utilizată ca probiotic
Biomasa de S.cerevisiae ICCF 3.20/30-2 a fost separată prin centrifugare din mediul
de cultură, spălată de două ori cu apă distilată şi liofilizată (liofilizator de laborator MIM).
MIM
Deşi liofilizarea este un procedeu relativ scump, permite menţinerea viabilităţii celulelor,
păstrarea nealterată a proprietăţilor produsului şi asigurarea unei solubilităţi ridicate la
administrare.

Principalele condiţii ce trebuiesc îndeplinite de biomasa liofilizată sunt :


- viabilitate: [UFC/g] >5 x 109;
- umiditate < 5 %.
Trebuie menţionat faptul că drojdia liofilizată utilizată în testele de farmacologice a
avut o viabilitate de minim 1 x 1011 [ UFC/g].
Testele farmacologice preclinice au fost efectuate în cadrul Laboratorului de
Farmacodinamie al ICCF şi au urmărit:
- stabilirea toxicităţii acute la administrarea orală la şoareci;
- efectul administrării subacute a două doze asupra organismului animal cu
verificarea viabilităţii celulelor de drojdie la nivel intestinal;
- stabilirea efectului specific de normalizator biologic al florei saprofite intestinale;
- stabilitatea microbiologică.

4.2.1. Testarea toxicităţii acute şi subacute


În urma administrării orale, în doză unică (1-10g/kg corp) a pulberii de S.cerevisiae la
şoareci (şoareci albi linia SWISS, masculi) nu s-au înregistrat tulburări la nivelul SNC ale
animalelor de experienţă după 14 zile de observaţie. De aceea se poate considera că puberea
157
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

de drojdie este lipsită de toxicitate, iar doza de 10 g/kg corp poate fi considerată doza maximă
admisibilă (DMA
DMA)
În cadrul testării toxicităţii subacute s-a urmărit efectul administrării repetate a
pulberii de S. cerevisiae asupra parametrilor biochimici (glicemie, lipemie, colesterolemie,
proteinemie), hematologici şi asupra principalelor organe interne ale animalelor tratate timp
de 10 zile corespunzătoare la 1/10 (1g/kg corp), respectiv 1/20 (0,5 g/kg corp) DMA,
DMA stabilită
la şoareci.

Tabelul 10. Valorile parametrilor biochimici ai loturilor de animale


tratate cu pulbere liofilizată de drojdie.

Glicemie Lipemie Colesterolemie Proteinemie


LOT/Parametru
(mg/100) (mg/100) (mg/100) (g/100)
Martor 108± 7 179± 8 60± 4 6,2± 0,2
1g/kg 111± 9 182± 2 59± 3 6,1± 0,1
0,5 g/kg 106± 5 188± 9 57± 2 5,9± 0,3
Din Tabelul 10 se observă că administrarea repetată a celor două doze de pulbere
liofilizată nu a indus modificări semnificative ale valorilor parametrilor biochimici .
Examenul anatomopatologic (observaţii macroscopice ale principalelor organe şi
examinarea histologică a fragmentelor acestor organe) nu a evidenţiat existenţa modificări
faţă de lotul martor, cu excepţia tubului digestiv unde apare hiperemia şi edemul destul de
marcat în submucoasa gastro-intestinală.

4.2.2. Stabilirea viabilităţii celulelor de drojdie


Viabilitatea celulelor de S. cerevisiae la nivel ileo-cecal stabilită la sfârşitul
experimentelor ce au urmărit determinarea toxicităţii probioticului sunt prezentate în Tabelul
11.
11 Aşa cum se poate observa, administrarea sub formă de pulbere liofilizată înglobată în
hrana umedă zilnică a animalelor conduce la persistenţa celulelor viabile de drojdie în tractul
digestiv. Deşi viabilitatea celulelor a prezentat o uşoară scădere, trebuie remarcat că ordinul
de mărime al numărului de celule viabile se păstrează.

Tabelul 11. Viabilitatea celulelor de drojdie la nivel intestinal la sfârşitul


administrării subacute la şobolani (Titrul iniţial 6,8 x108 /g).

Titrul UFC/ ml
LOT 1 (1 g/kg) LOT 2 (0,5 g/kg)
8
2 x10 /ml 3,6 x 108/ml
158
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

4.2.3. Stabilirea efectului de normalizator biologic al pulberii de


S.cerevisiae
Pentru stabilirea efectului de normalizator biologic al florei intestinale (probiotic) s-au
făcut studii experimentale pe iepuri albi în comparaţie cu produsul ENTEROL ™
(Saccharomyces
Saccharomyces boulardii).
boulardii Animalele de experienţă au fost împărţite în 4 loturi după cum
urmează:
LOTUL 1 –martor
LOTUL 2 –iepuri cărora li s-a administrat antibiotice
LOTUL 3 - iepuri cărora li s-a administrat antibiotice, trataţi cu trataţi cu pulbere de
S.cerevisiae.
S.cerevisiae
LOTUL 4 - iepuri cărora li s-a administrat antibiotice, trataţi cu ENTEROL ™
Animalelor din lotul 1 li s-a administrat apă distilată în volum de 2,5 ml/kg corp.
LOTURILE 2, 3, 4 au primit o dată pe zi, un amestec format din următoarele
antibiotice: ampicilină 25 mg/kg/zi, neomicină 15 mg/kg/zi şi metronidazol 15
mg/kg/zi. Antibioticele au fost alese pe baza datelor din literatură, în dozele cunoscute
a produce un dismicrobism intestinal (doze maxime terapeutice) şi au fost administrate
în soluţie apoasă, prin gavaj, în volum de 2,5 ml/kg corp. Durata administrării a fost
de 5 zile după care o parte din animalele lotului 1 şi 2 au fost sacrificate pentru
evidenţierea florei microbiene şi s-au prelevat probe din principalele organe interne
pentru examen anatomopatologic.
La lotul 3 după 5 zile de antibioterapie a fost administrat preparatul liofilizat de
S.cerevisiae,
S.cerevisiae per os, într-o singură priză/24 h, sub formă de suspensie microbiană realizată în
apă distilată sterilă, cu o concentraţie de 4,32 x 109 UFC/ volum de 2 ml/animal. Durata
tratamentului a fost de 4 zile.
Lotul 4 a primit corespunzător timp de 4 zile, preparatul probiotic ENTEROL ™
conţinând liofilizat de S.boulardii per os, într-o singură priză/ 24 h, sub formă de suspensie
microbiană realizată în apă distilată sterilă, cu o concentraţie de 4 x 109 UFC/ volum de 4
ml/animal.
Au fost urmărite zilnic: apetitul, greutatea şi semnele de diaree.
După perioada de tratament animalele au fost sacrificate pentru evidenţierea florei
microbiene şi în vederea examenului anatomopatologic.

159
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

Pentru evidenţierea florei microbiene intestinale au fost recoltate de la fiecare animal,


fragmente de tub digestiv conţinând joncţiunea ileo-cecală de dimensiuni aproximativ egale.
Prelevatele cu conţinut intestinal au fost fragmentate, suspendate în apă distilată sterilă, şi
agitate timp de 5-10 minute pentru omogenizare. Suspensiile omogene au fost folosite pentru
realizarea unor diluţii zecimale care să permită numărarea coloniilor pe mediile de cultură
agarizate. Ca medii de cultură s-au folosit:
- geloză cu pH 7,0-7,2 pentru evidenţierea florei aerobe;
- geloză suplimentată cu acid tioglicolic 0,06% (incubare în condiţii special create
anaerobioză pentru evidenţierea florei anaerobe);
- mediul ISTRATE-MEITTERT pentru evidenţierea Enterobacteriaceaelor (E.coli
E.coli, Proteus,
Proteus
Shigella);
Shigella
- mediu CHAPMAN pentru evidenţierea stafilococilor;
- mediu ROGOZA (MRS
MRS) pentru evidenţierea florei lactice.
Antibioterapia, deşi rămâne cea mai valoroasă metodă terapeutică antibacteriană,
conduce la tulburări digestive care sunt de fapt expresia unor modificări profunde ale
microflorei normale. Astfel, în urma antibioterapiei, unele specii microbiene saprofite,
constante şi caracteristice pentru anumite segmente ale tractusului digestiv se reduc cantitativ
sau chiar dispar; în schimb apar alte specii sau tulpini microbiene atipice, străine, patogene şi
neîntâlnite în asemenea proporţii în condiţii normale. Din acest punct de vedere lactobacilii,
enterobacteriaceele şi E.coli sunt indicatori foarte preţioşi.
Antibioticele pot conduce la dezechilibre ale florei, fiind deja cunoscute efectele
administării prelungite sau a unor doze mari pe perioade scurte astfel:
- cefalosporinele conduc la reducerea cu două ordine de mărime până la eliminarea totală a
lactobacililor din microflora normală; la fel acţionează şi cloramfenicolul, neomicina singură
sau asociată cu metronidazolul;
- tetraciclina, ampicilina, conduc la aşa numita diaree de putrefacţie, al cărei agent patogen
este genul Proteus,
Proteus responsabil al dezvoltării excesive a florei de putrefacţie în detrimentul
speciei E.coli;
E.coli
- administrarea de neomicină cu metronidazol conduce atât la scăderea numărului de
lactobacili, cât şi la reducerea florei anaerobe.
Pentru a elimina efectele nedorite ale antibioterapiei şi a restabili echilibrul acestui
ecosistem se administrează aşa numitele tulpini probiotice (bacterii, drojdii) care tranzitează
în stare vie tubul digestiv, colonizează temporar acest loc şi prin mecanisme directe

160
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

(antagonism microbian, acţiune enzimatică) sau indirecte (stimularea imunităţii gazdei)


conduc la refacerea florei locale atât ca structură cât şi ca număr.
Amestecul de antibiotice utilizat în cursul experimentărilor preclinice a fost ales astfel
încât să se provoace un dezechilibru al florei intestinale după cum urmează:
- perturbarea raportului floră aerobă-floră anaerobă;
- diminuarea florei lactice, a stafilococilor;
- depresia selectivă a familiei Enterobacteriaceaelor.

Tabelul 12. Analiza cantitativă şi calitativă a florei microbiene după antibioterapie.

LOT martor LOT antibioterapie


Floră aerobă 3,1 x 107 8 x 106
Floră anaaerobă 1 x 107 5 x 105
Coci Gram (+)-stafilococi 1,32 x 107 2,4 x 104
8,3 x 107 5 x 105
Enterobacteriaceae ++
E.coli +++Proteus +++
Proteus

În Tabelul 12 este prezentată analiza cantitativă şi calitativă a florei microbiene după


antibioterapie.
În urma terapiei intensive cu antibiotice se evidenţiază următoarele aspecte:
- raportul dintre flora aerobă-flora anaerobă este perturbat prin reducerea considerabilă a
florei anaerobe la animalele tratate faţă de martor ca urmare în special a acţiunii
metronidazolului (chimioterapic);
- depresia selectivă a florei intestinale în sensul diminuării florei lactice cu aproape două
ordine de mărime şi scăderea uşoară a numărului de coci Gram (+) –stafilococi;
- dezechilibru în cadrul familiei Enterobacteriaceae unde se constată o diminuare numerică
de aproape un ordin de mărime, dar mai ales o schimbare a spectrului microbian. La lotul
martor se constată o floră microbiană dominată de E.coli, iar la lotul supus antibioterapiei se
evidenţiază o scădere semnificativă a numărului coloniilor acestei tulpini cu creşterea
excesivă a florei de putrefacţie dominată de tulpina Proteus.
Proteus.
Observaţiile macroscopice au relevat o scădere a apetitului după începerea administrării
antibioticelor la loturile 2,3,4 (obiectivat prin scăderea aportului alimentar) şi apariţia
scaunelor decolorate. De asemenea s-a constatat o scădere în greutate a acestor loturi în medie
cu 2,1± 0,4 (%) în a 5-a zi de antibioterapie faţă de lotul martor la care greutatea a crescut în
medie cu 1,8± 0,4 (%) în aceiaşi perioadă.
161
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

La 24 de ore de la începerea tratamentului cu pulbere de S. cerevisiae


cerevisiae şi respectiv
ENTEROL ™, s-au observat: redobândirea apetitului, normalizarea scaunelor şi o creştere în
greutate cu 0,44± 0,17 (%) pe zi la lotul tratat cu S. cerevisiae respectiv 0,37 ± 0,12 (%) pe zi
la cel tratat cu ENTEROL ™.
În Tabelul 13 este prezentată analiza calitativă şi cantitativă a florei microbiene după
tratament cu probiotice.
La loturile tratate cu probiotice postantibioterapie se observă o normalizare a florei
microbiene atât cantitativ cât şi calitativ.
În cazul lotului tratat cu pulbere liofilizată de S. cerevisiae analiza cantitativă şi
calitativă a florei microbiene intestinale a relevat următoarele aspecte:
- recuperarea florei anaerobe la valoarea martorului;
- recuperarea florei lactice;
- revenirea la normal atât numeric cât şi ca spectru al Enterobacteriaceaelor.
Enterobacteriaceaelor
În cazul lotului tratat cu ENTEROL ™ se constată o redresare a florei microbiene fără
a se ajunge la valorile normale (obţinute în cazul martorului) după o perioadă de tratament de
4 zile.

Tabelul 13.
13. Analiza cantitativă şi calitativă a florei microbiene după tratament cu
probiotice.

LOT LOT
LOT martor
S. cerevisiae ENTEROL ™
7
Floră aerobă 3,84 x 10 1,5 x 107 8 x 106
Floră anaaerobă 2 x 105 7,4 x 104 2,2 x 104
4 x 106 3,4 x 106 < 1 x 106
++ ++ ++
E.coli E.coli E.coli
Enterobacteriaceae +++
Proteus +++
Proteus +++
Proteus

În urma terapiei intensive cu antibiotice (neomicină, ampicilină) şi metronidazol se


constată un dezechilibru al florei microbiene intestinale atât cantitativ, dar mai ales calitativ.
Macroscopic, acest dezechilibru se traduce prin diminuarea apetitului, decolorarea scaunelor
şi scădere în greutate.
Tratamentul postbioterapie cu probioticul obţinut conduce la o normalizare a florei
intestinale, comparabilă cu martorul (netratat) atât ca valoare numerică cât şi ca spectru.
Macroscopic, se observă normalizarea apetitului şi a scaunelor urmată de creşterea în
greutate.
162
Biomasă de drojdii pe substrat etanolic

TM
Conform specificaţiei produsului franţuzesc ULTRALEVURE –probiotic de uz
uman- s-a testat stabilitatea microbiologică a probioticului obţinut în cadrul laboratorului
nostru atât sub formă de pulbere liofilizată ca atare cât şi condiţionată în capsule operculate.
TM
Fişa produsului ULTRALEVURE (liofilizat de S. cerevisiae)
cerevisiae prevede determinarea
viabilităţii celulelor de drojdie/capsulă valoarea admisă fiind 5 x 109 imediat după fabricaţie,

respectiv 1 x 109 la sfârşitul termenului de valabilitate a produsului (3 ani).


Se menţionează că determinarea viabilităţii şi a umidităţii (max. 5 %) sunt principalele
garanţii ale calităţii produsului –liofilizat activ conţinut în capsulă.
În acest sens, lucrările efectuate au urmărit viabilitatea prin testarea liofilizatului
imediat după liofilizare (respectiv imediat după condiţionare în cazul capsulelor) cât şi după
stocarea acestora timp de 2,4 şi 5 luni.
Tabelul 14. Stabilitatea microbiologică a liofilizatului de S.cerevisiae.

Titru [UFC/g] sau [UFC/capsulă]


Timp – luni
[UFC/g] To 2 4 5
11
1 2,3 x 10 - - 5,0 x 108
11
2 1,2 x 10 - 3,55 x 107 -
[UFC/ capsulă] To 2 4 5
3 1,0 x 1010 - 5,9 x 105
4 1,25 x 1010 - - 1,1 x 107
5 10 9 -
3,19 x 10 6,3 x 10

Rezultatele obţinute evidenţiază o scădere semnificativă a viabilităţii înregistrate atât


la liofilizat cât şi la capsule. Scăderea nu este proporţională cu timpul de stocare, diferenţele
fiind probabil cauzate de alţi factori (umiditatea produsului, temperatura de păstrare a
produsului între liofilizare şi condiţionare, etc).

Bibliografie

163
1. DUCLUZEAU R., BENSAADO M.; Ann. Microbiol 133: 491-496 (1985).
2. TANG Jenny., BRACKENRIDGE I., ANDREW J.; Tetrahedron 51: 13217-13238 (1995).
3. GOCHO S., TABOGAMI N.; KOMAI T.; Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:1571-1572 (1995).
4. FUGANTI C., SARRA Antonella, SERVI S.; Tetrahedron :Asym. 5: 1135-1138 (1994).
5. KOUL S., KROUT D.H.G., TAX J.; J.Chem. Soc. Perkin.Trans. 1, 23: 2969-2988 (1995).
6. CHARTRAIN M., KATZ L., KING A.; Bv. SUA 5 474 919 (1995).
7. PATEL R., LIU M., SZARKA L.M.; Bv. SUA 5 393 663 (1995).
8. BERGOGNE-BEREZIN E.; La Presse Medicale 24:145-156 (1995).
9. DOBIAS J., EBRINGER L.; Bv. SK 172897 (1999).
10. DZJAVGO L.A., MASLOV D.V., PANKRATOVA Tatiana M.; Bv. RU 2119796 (1998).
11. FULLER R.; J.Appl. Bacteriol. 66: 365-378 (1989).
12. KUNG L. J.r., KRECK E.M., TUNG R.S., HESSION A.O., SHEPERD A.C., COHEN M.A.,
SWAIN H.E., LEEDLE J.A.; J Dairy Sci 80:2045-2051 (1997).
13. JONG-GUBBELS, Patricia, VAN DIJKEN J., PRONK J.; Microbiology 142:1399-1407 (1996).
14. LARSSON C., PAHLMAN INGA., GUSTAFSSON LENA.; Yeast 14:347-359 (1998).
15. KEULERS M., SUZUKI T., KURIYAMA H.; Yeast 12: 673-682 (1996).
16. KEULERS M., SUZUKI T., KURIYAMA H.; FEMS Microbiol. Lett. 142:253-258 (1996).
17. RAHMAN D.R.J., SUDBERY P.E., MARISON I.W.; J. Gen. Microbiol. 134:2241-2248 (1988).
18. BAKER W.; Biochem. Ed. 23:216-217 (1995).
19. SATROUTDINOV A.D., KURIYAMA H., KOBAYASHI H.; FEMS Microbiol Lett. 77:261-267
(1992).
20. PRELL A., PACA J., SIEGLER K.; Folia Microbiol. 37:39-42 (1992).
21. PACA J., VOTRUBA J.; Folia Microbiol. 36: 478-484 (1991).
22. PACA J., VOTRUBA J.; Folia Microbiol. 36: 485-492 (1991).
23. PACA J., VOTRUBA J.; Folia Microbiol. 39: 65-70 (1994).
24. VOTRUBA J., PACA J.; Folia Microbiol. 37: 133-139 (1992).
25. PRELL A., PACA J., SIEGLER K.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 36:236-239 (1991).
26. MINKEVICH I.G., BAUMANN F., HEINRITZ B., Acta Biotechnol 8: 435-444 (1988).
27. PRELL A., SAFAR H., SOBOTKA M.; Lecture 4 –Lucrarile Conferintei CHISA 1997, Srni, Rep.
Ceha (1997).
28. LASKIN A.; Biotechnol. Bioeng. 7: 81-103 (1977).
29. HITZMAN D.O.; Ultra high cell density fermentation, presented in connection with People to
People Citizen Ambassador Program (1984).
30. WILLS C; Critical Rev. in Biochem. Mol. Biol. 225: 245-280 (1990).
31. SHACHAR – NISHRI Y., FREEMAN A.; Appl. Biochem. Biotechnol. 39/40: 387-399 (1993).
32. HEINISCH J.J., VALDEZ E., ALVAREZ J.; Yeast 12:1285-1295 (1996).
33. FERNANDEZ E., MORENO F., RODICIO R.; Eur.J.Biochem. 204:983-990 (1992).
34. HUMPHREY A.E. (1980); "Production of Single Cell Protein from Ethanol"; Presented at
Symposyum held in London, Ed.Pergamon Press Toronto
35. CHENG L., LEK L.; FEBS Lett 300: 251-253 (1992).
36. MAGONET E.; HAYEN P., REMACLE J.; Biochem. J. 287: 361-365 (1992).
37. GUOQIANG D., KAUL. R, MATTIASSON. B.; Biotechnol. Prog 11: 187-193 (1995).
38. CHO J-Y, JEFFRIES T.; Appl. Environ. Microbiol. 64: 1350-1358 (1998).
39. BENITEZ T., MARTINEZ P., CODON A. C.; Microbiologia 12: 371-384 (1996).
40. HEICK H. N. C.; Can. J. Microbiol 18: 23-28 (1972).
41. VALLARI R. O., COOK W. J., MORGAN N. J.; Mol. Cell. Biol 12: 1663-1673 (1992).
42. GOULD R.M., PLAPP V.B.; Biochemistry 29: 5463-5468 (1990).
43. HOFFMANN K.H., POLNISH E.; J. Basic Microbiol. 30 333-336 (1990).
44. PALMIERI L., WALKER I.E.; FEBS Lett 417: 114-118 (1997).
45. TRIVIC S, LESKOVAC V.; Biochem. Mol. Biol. Inter 32: 399-407 (1994).
46. REID M.F., FEWSON C.A.; Crit. Rev. Microbiol. 20: 13-56 (1994).
47. PETKOVA Elena .B.; Folia Microbiol 43: 210-211 (1998).
48. MACIVER F.H., DAWE I.W. GRANT C.M.; Curr. Genet. 31: 119-121 (1997).
49. SCHJERLING C.K., HUMMEL R., HANSEN J.K.; J.Biol. Chem. 271:22514-22521 (1996).
50. CIRIACY M.; Mutat Res. 29: 315-326 (1975).
51. GRIMM C., SHAER P., NUNZ P., KOHLI J.; Mol. Cell. Biol. 11: 289-298 (1991).
52. CHAO J.Y., JEFFRIES T. W.; Appl. Environ. Microbiol. 64:1350-1358 (1998).
53. RUSSEL D.W., SMITH M.; J.Biol.Chem 258: 2674-2682 (1983).
54. JONG- GUBBELS Patricia., VAN DIJKEN J.P.; Yeast 11 407-418 (1995).
55. LUTSDORF U., MEGNET R.; Arch. Biochem.Biophys. 126:933-944 (1968).
56. WILLIAMSON V.M., COX D. , YOUNG E.T., SMITH M.; Mol. Cell .Biol. 3: 20-31 (1983).
57. YOUNG E.T., PILGRIM D.; Mol. Cell .Biol. 5: 3024-3034 (1985).
58. YANG V.W.; MARK J.A. DAVID, B.P., JEFFRIES T.W.; Appl. Environ.Microbiol. 60:4245-4254
(1994).
59. SHAIN D.H., DENIS C.L.; Mol.Gen. Genet. 232:479-488 (1992).
60. MAZZONI C., SALIOLA M., FALCONE C.; Mol. Microbiol. 6:2279-2286 (1992).
61. MEADEN P.G., DIKINSON F.M., BUSHEL H., Yeast 13: 1319-1327 (1997).
62. BUSHELL H., KABACK D.B., ZHOUG W; Proc. Natl. Acad.Sci. USA 92: 3809-3813 (1995).
63. WANG X., MANN C.J., BAI Y., NI L., WEINER H.; J Bacteriol. 180:822-30 (1998).
64. DICKINSON F.M., HAYWOOD G.W.; Biochem J. 247: 377-384 (1987).
65. DICKINSON F.M.; Biochem J. 315: 393-399 (1996).
66. TESSIER W.D., MEADEN P.G., DICKINSON F.M., MIDGLEY M.; FEMS Microbiol. Lett.
164:29-34 (1998).
67. SAIGAL D., CUNNINGHAM S.J., FARRES J., WEINER H.; J. Bacteriol. 173:3199-3208 (1991).
68. FELDMANN H., AIGLE M., AJINOVICI G.; EMBO J. 13: 5795-5809 (1994).
69. GIETZ R.D., WILLEMS A.R., WOODS R.A.; Yeast 11: 355-360 (1995).
70. FLIKWEERT M.T., VAN DER ZANDEN L., PRONK J.T.; Yeast 12: 247-257 (1996).
71. SHU C.H., YANG S.T.; Appl. Environ. Microbiol. 62: 3152-3157 (1996).
72. DE VIRGILIO C., BURCKERT M., BARTH G., NEUHAUS J.M; Yesat 8:1043-1051 (1992).
73. MONTEIRO G.A., SA-CORREIA I.; Biochim. Biophys Acta 1370: 310-316 (1998)-cf. Medline
PMID 9 545 589.
74. HAARASILTA S., TASKINEN L., Arch. Microbiol. 113: 159-165 (1977).
75. WILSON A., BHATTACHARJEE J.K.; Can. J. Microbiol. 32: 969-972 (1986).
76. LARRSON C., PAHLMAN I.L., ANSELL R., GUSTAFSSON L.; Yeast 14: 347-357 (1998).
77. JIMENEZ J., OBALLE J.; Mol. Gen. Genet. 245:86-95 (1994).
78. FITTON V., RIGOULET M., OUHABI R., GUERIN B. Biochemistry 33:9672-9698 (1994).
79. BOLES E., JONG-GUBBELS Patricia, PRONK J.T.; J.Bacteriol. 180:2875-2882 (1998).
80. PRONK J.T., STEENSMA H.Y., VAN DIJKEN J.P.; Yeast 12:1607-1633 (1996).
81. VILJOEN M., SUBDEN R.E., KRIZUS A.VIUREN H.J.J.; Yeast 10:613-624 (1994).
82. FERNANDEZ M.J. MADRANA M., RUZ AMIL M, LASADA M.; Eur.J.Biochem. 3:11-18
(1967).
83. HOPPE G. K., HANSFORD G. S.; Biotechnol. Lett. 4 39 – 44 (1982).
84. BAZUA C. D., WILKE C. R., Biotechnol. Bioeng. Symp. 7:105 – 118 (1977).
85. HOLZBERG I., FINN R. K., STEINKRAUS K. H.; Biotechnol. Bioeng. 9: 413 – 427 (1967).
86. GHOSE T. K., TYAGI R. D.; Biotechnol. Bioeng. 21: 1401 – 1420 (1979).
87. EGAMBERDIEV N. B., IERUSALIMSKII N. D.; Microbiologiya 37: 687-694 (1968).
88. AIBA S., SHODA M., J. Ferment. Technol. 47: 790 – 794 (1969).
89. STREHAIANO P., MORENO M., GOMA G.; C. R. Acad. Sci. Ser. D. 286: 225-242 (1978).
90. CARLSEN E., DEGN H., LLOYD D.; J. Gen.Microbiol. 137: 2879-2883 (1991).
91. IGLESIAS R., FERREAS J.M., LLOYD D.; Biotechnol. Bioeng. 37:389-391 (1991).
92. ROSA M.F., SA-CORREIA I.; FEMS Microbiol Lett. 135: 271-274 (1996).
93. OLIVEIRA S.C., PAIVA T.C., VISCONTI A.E., GIUDICI R.; Appl Biochem Biotechnol
74:161-72 (1998).
94. CIESAROVA Z, SMOGROVICOVA D, DOMENY Z.; Folia Microbiol. 41:485-488 (1996).
95. KOUKON A.I., TSAUKATOS D., DRAINAS C.; J.Gen. Microbiol. 136: 1271-1277 (1991).
96. JONES R.P.; Enz. Microb. Technol 9:334-338 (1987); JONES R.P., GREENFIELD P.F.: Yeast
3:223-232 (1987).
97. JONES R.P., GREENFIELD P.F.; Enz. Microb. Technol 11:130-153 (1989).
98. CIESAROVA Z, DOMENY Z, SMOGROVICOVA D, PATKOVA J, STURDIK E.; Folia
Microbiol 43:55-58 (1998).
99. D' AMORE T., PANCHAL C., RUSSELL I., STEWART G.G.; Crit. Rev. Biotechnol. 9:287-304
(1990).
100. DASSARI G. ,WORTH M.A., CONNORS N.A, PAMMENT N.B.; Biotechnol. Bioeng., 35:109-
122 (1990).
101. JIMENEZ J., VAN UDEN N.; Biotechnol. & Bioeng. 25:1596-1605 (1985).
102. JIMENEZ J., BENITEZ H.; Trends Biotechnol. 4 :40-46 (1987).
103. SIGLER K., KNOTKOVA A., KOTYK A.; Biochim. Biophys. Acta 643: 572-582 (1981).
104. LENBURY Y, NEAMVONG A, AMORNSAMANKUL S, PUTTAPIBAN P.; Biosystems
49:191-203 (1999).
105. HOFFMANN S., MAGER W.H.; ``Yeast Stress responses`` (1997) Springer Verlag, Heidelberg,
Germany.
106. SINGH K.K., NORTON R.S.; Arch. Microbiol. 150:38-42 (1991).
107. MAGER W.H., VARELO J.C.S.; Mol. Microbiol 10:253-258 (1993).
108. CHOWDHURY S., SMITH K.W., GUSTIN N.C.; J.Cell Biol 118: 561-571 (1992).
109. ALEXANDRE H., PLOURDE L., CHARPENTIER C., FRANCOIS J.; Microbiology 144:1103-
1111 (1998).
110. HOUNSA C.G., BRANDT E.V., THEVELEIN J., HOHMANN S, PRIOR B.A.; Microbiology
144 :671-680 (1998).
111. MAGER W.H., DE KRUIJFF A.J.J.; Microb.Rev 59: 506-531 (1995).; Biochem.J. 290:1-13
(1993).
112. MAGER W.H., MORADAS FERREIRA P.N.; Biochem.J. 290:1-13 (1993).
113. DAVIES J.M., LOERY C.V., DAVIES K.J.A.; Arch. Biochem Biophys. 317:1-6 (1995).
114. COOTE P.J. COLE N.B., JONES M.V.; J.Gen. Microbiol. 137: 1701-1708 (1992).
115. PARASCANDOLA P, DE ALTERIIS E, SENTANDREU R, ZUECO J.; FEMS Microbiol Lett
150:121-126 (1997).
116. TAMURA K., MIYASHITA M.., IWAHASHI H.; Biotechnol.. Lett. 20:1167-1169 (1998).
117. COUTO J.A., PINA C., HOGG T.; Biotechnol. Lett. 19:487-490 (1997).
118. KOMATSU K.., KAUL S.C., OBUCHI K.; FEMS Microbiol. Lett. 72:159-162 (1990).
119. TANJI K., NATAORI S., SEKIMIZU K.; Biochim. Biophys. Acta 1129: 172-176 (1992).
120. HOTTIGER T., DE VIRGILIO C., HALL N.N., BOLLER T.; FEBS Lett. 219:187-193 (1994).
121. IWAHASHI H., KAUL S.C., KOMATSU K.; FEMS Microbiol Lett. 80: 325-328 (1991).
122. SANCHEZ Y., TAULIEN J.; EMBO J. 11: 2357-2364 (1992).
123. PIPER P.W.; FEMS Microbiol Lett. 134: 121-127 (1995).
124. PIPER P.W.; FEMS Microbiol Rev. 11: 339-356 (1993).
125. DE VIRGILIO C., HOTTIGER T., WIEMKEN A.; FEBS Lett. 219:179-186 (1994).
126. VAN DIJK P., THEVELEIN J.M.; Appl. Env. Microbiol. 61: 109-115 (1995).
127. GOLD R.S., HUTKINS R., CONWAY T..; J.Ind. Microbiol 10:45-54 (1992).
128. VOLKER U., MACH H., HECKER M.; J. Gen. Microbiol. 38:2125-2135 (1992).
129. ANGHEL I., HERLEA VICTORIA, VASSU TATIANA, SEGAL B., BERZESCU P., OANCEA
IOANA (1991) "Biologia si Tehnologia Drojdiilor " Ed. Tehnica Bucuresti.
130. PEJIN D.; RAZMOV S.K.I. R.; J.Appl. Bacteriol. 80:53-55 (1996).
131. MOR J., FIECHTER A.; Biotechnol. Bioeng.10:159-176 (1968).
132. PACA,J., GREGR,V.; Biotechnol. Bioeng. 19:539-554 (1977).
133. PACA, J.; Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 9:93-100 (1980).
134. SCHUGERL K.; Adv. Biochem. Bioeng. 8 p.106 (1978).
135. SHKIDCHENKO A. N.; Mikrobiologiia 53:58-62 (1984).