Sunteți pe pagina 1din 8

Cromatografia si electroforeza

I. Noţiuni teoretice
1. Cromatografia
Cromatografia reprezintă o tehnică de separare a componentelor unui amestec, între două faze:
una mobilă şi alta staţionară, ca urmare a deplasării fazei mobile de-a lungul celei staţionare şi a antrenării
compo-nentelor amestecului în mişcare, cu viteze diferite, ocupând astfel poziţii diferite de-a lungul fazei
staţionare. În acest mod componentele sunt separate şi apoi identificate.
În funcţie de natura fazelor se disting următoarele tipuri de cromatografie:
Faza mobila Faza staţionara Denumire
lichid lichid lichid - lichid (LL)
lichid solid lichid - solid (LS)
gaz solid gaz - solid (GS)
gaz lichid gaz - lichid (GL)

Metodele de separare cromatografice se împart în:


- metode bazate pe afinitatea diferită a componenţilor (repartiţie de fază, adsorbţie, absorbţie,
schimb ionic, afinitate);
- metode bazate pe mărimea diferită a componenţilor (excluziune sferică).
Din punct de vedere practic cele mai utilizate metode de cromatografie sunt: cromatografia pe
coloană, cromatografia pe hdrtie, cromatografia în strat subţire, gaz cromatografia.
Cromatografia pe coloană - Coloanele cromatografice sunt confecţionate din sticlă. Pentru o
bună rezoluţie se folosesc coloane lungi dar în condiţiile în care se doreşte separarea unei cantitati mari de
substanţe se folosesc coloane cu un diametru mai mare.
În interiorul coloanei se introduce faza staţionară ce trebuie, într-o primă etapă, echilibrată cu
solventul de lucru.
Amestecul ce urmează a fi separat se pipetează în partea superioara a tubului.
Se conectează rezervorul cu solvent (faza mobilă) la coloană şi se aşteaptă până ce are loc
separarea.
Datorită deplasării fazei mobile de-a lungul celei staţionare are loc antrenarea componentelor din
amestec într-o mişcare descendentă, în lungul coloanei astfel încât în timp vor ocupa poziţii diferite.
Fracţiile sunt colectate în tuburi şi apoi analizate.
Figura 4.1. Cromatografie pe coloană.

Cromatografia pe hârtie - reprezintă una din cele mai simple metode de analiză. În această
metodă faza fixă este reprezentată de o suprafata de hârtie specială sau hârtie de filtru, iar faza mobilă
(eluentul) de un lichid ce se deplasează de-a lungul fazei fixe datorită forţelor de adeziune şi forţelor
gravitaţional. Se împarte în: cromatografie pe hârtie verticală (ascendentă sau descendentă) şi orizontală
(Pfeiffer). În figura 4.2 se poate urmări diferenţa dintre aceste metode.

Figura 4.2. Cromatografie pe hârtie verticală ascendentă şi descendentă

Identificarea compuşilor izolaţi în timpul cromatografiei se face fie cu ajutorul spoturilor martor,
fie calculând timpul de reţinere al fiecărui component separat (Rj), definit ca raportul dintre distanţa fata
de linia de start pe care a migrat componentul respectiv (notată cu Xj) şi distanţa pe care a migrat eluentul
(notată cu Y):
X, J
Y
Timpul de reţinere depinde de: natura fazei fixe, natura fazei mobile, natura substanţei,
temperatură; se găseşte tabelat pentru diferite substraturi, eluenţi şi substanţe, de regulă pentru
temperaturi de 20°C.
2. Electroforeza
Reprezintă metoda de separare bazată pe migrarea sub influenţa câmpului electric a substanţelor
încărcate cu sarcină electrică.
Eletroforeza poate fi folosită atât în scop analitic (separarea componenţilor şi dozarea lor),
preparativ (obţinerea unor componenţi în stare pură) dar şi ca metodă de studiu a proprietatilor
superficiale ale unor celule sau organite celulare.
O particulă încărcata electric, când este dizolvată sau suspendată într-un mediu lichid, sub
influenţa unui câmp electric uniform, atinge o viteză constantă de migrare. Speciile încărcate pozitiv se
vor îndrepta către catod, iar speciile încărcate negativ către anod. Viteza de migrare a ambelor specii va fi
determinate de forţele care acţionează asupra lor. Aceste forte sunt:
- forţa de atracţie electroforetică: Fx = Q • E

- forţa de frecare Stokes: F2 = 6• n■ r| • r • v

- forţa de frânare electroforetică: F3 = (Q-S • \ ■ r)-E

- forţa F4 datorata efectului de relaxare


Imediat după aplicarea câmpului electric, suma vectorială a acestor patru forte este egală cu zero
şi viteza electroforetică devine constantă (figura 4.3). Neglijând efectul de relaxare şi ţinând cont de
direcţiile celor trei forte se obţine viteza electroforetică:
8-E-E
v=
6-7T-T1

unde: - 8 = permitivitatea absolută a mediului


- ^ = potenţialul electrocinetic
- E = intensitatea câmpului electric
- r| = coeficientul de vâscozitate
Mobilitatea electroforetică se defmeşte ca raportul dintre viteză şi intensitatea câmpului electric:
v
H=—
E
Datorită încărcării electrice nete de la suprafaţa particulelor biologice, în acestă regiune se
organizează, se structurează, un strat dublu electric alcătuit dintr-o zonă compactă de grosime (a) şi una
difuză, în care pentru simplitate, suprafaţa de demarcare a particulei fata de mediu este considerată plană
(figura 4.3).
Când particula este pusă în mişcare de către câmpul electric aplicat, aceasta antrenează o dată cu
ea un strat de lichid mai gros decât eel compact, notat cu (b). Planul care se află la distanţa b>a de
particulă se numeşte plan hidrodinamic de alunecare, iar potenţialul în acest plan se numeşte potenţial
electrocinetic (Q. Valoarea potenţialului electro-cinetic se poate determina indirect pe baza măsurării
mobilitătii electroforetice a particulei în câmp electric.

Figura 4.3. Forţele ce acţionează asupra unei particule încărcate cu sarcină electrică suspendatfi într-un mediu lichid. Distribuţia
ionilor în stratul dublu electric de la suprafaţa unei particule scufundate într-un electrolit.
Metoda microscopică de electroforeză - acestă metodă este singura tehnică disponibilă pentru
determinarea vitezei electroforetice a particulelor mari, cum ar fi celulele sanguine, microorganisme,
particule coloidale, etc. Se bazează pe observarea directă, la microscop a migrării particulelor suspendate
într-o soluţie tampon adecvată ca urmare a aplicării unui câmp electric creat de un curent continuu.
Pentru această tehnică este necesară o celulă electroforetică (figura 4.4), prevăzută cu doi
electrozi, un sistem de umplere şi golire, ce se poate introduce în câmpul unui microscop. Celula poate fi
plană sau cilindrică (capilară).
A K

Figura 4.4. Electroforeza microscopică: cuva electroforetică folosită şi


imaginea observată la microscop prevăzut cu micrometru ocular.

Electroforeza la joasă tensiune - Este o metodă ce permite separarea proteinelor plasmatice.


Dispozitivul experimental folosit este prezentat în figura 4.5.
Ca suport al electrolitului (al soluţiei tampon) se foloseşte atât hârtie specială pentru electroforeză
(de tip Whatman) cât şi membrane de celuloză. Dintre avantajele utilizării membranelor de celuloză
amintim, în primul rând: rezoluţia mult mai bună şi un timp de migrare mai mic.
Figura 4.5. Electroforeza la joasă tensiune - dispozitiv experimental.

După separarea proteinelor urmează un procedeu de fixare şi colorare. În primul rând, mediul
suport este fixat prin introducere în etanol, metanol sau acid, ori prin încălzire făcând astfel proteinele
insolubile.
Benzile sunt colorate cu ajutorul unor coloranţi specifici proteinelor (albastru de brom fenol), se
spală în mai multe băi cu acid acetic 2% şi sunt trecute prin vapori de amoniac pentru regenerarea
colorantului (figura 4.6).

Figura 4.6. Electroforeza - mediul suport după procedeele de fixare şi colorare.

După aceste procedee benzile sunt scanate cu ajutorul unor densitometre prin reflexie, transmisie sau
combinate, ce permit trasarea spectrelor caracteristice probelor oferind totodată cantitatea în g/lOOml.
Electroforeza pe un mediu suport acetat de celuloză a serului uman este prezentată în figura 4.7.

Figura 4.7. Electroforeza pe un mediu suport acetat de celuloză a serului uman.

Este cunoscut faptul că scăderea albuminelor survine de regulă în toate disproteinemiile, find însă
mai accentuată în cazul unui deficit în aportul de proteine, în deficitul de sinteză (ciroză hepatică), sau în
pierderi de proteine (sindrom nefrotic, arsuri).
Creşterea ah a2 - globulinelor se însoţeşte de regulă de o creştere a fibrinogenului şi a
glicoproteinelor şi de o accelerare a VSH-ului. O creştere marcată a a2 - globulinelor se întâlneşte în
sindromul nefrotic.
Modificările (3 - globulinelor au o important mai redusă, dar creşterea y - globulinelor indică
prezenţa unor inflamaţii cronice, sau sugerează o proliferare reactivă sau tumorală a imunocitelor
producătoare de imunoglobuline. Scăderea y - globulinelor survine în sindromul nefrotic, malnutriţie.
Toate aceste modificări au ca rezultat forme diferite ale spectrlor electroforegramelor analizate
(figura 4.8).

Figura 4.8. Tipuri de disproteinemie: (A) Inflamaţie acută, (B) Inflamaţie cronică, (C) Sindrom nefrotic, (D) Enteropatie
exudativă, (E) Ciroză hepatică, (F) Mielom multiplu, (G) Hipogamaglobulinemie.

Focalizarea izoelectrica (electrofocusing) - reprezintă o metodă de separare a particulelor cu


puncte izoelectrice diferite într-un gradient de pH sub acţiunea unui câmp electric omogen.
Punctul izoelectric al unei particule (sau molecule) corespunde valorii pH-ului la care sarcina
electrica netă este nulă.
Dispozitivele de electrofocusing folosesc o coloana în care se realizează un gradient natural de
pH prin utilizarea unor amfoliţi transportori cu următoarele proprietati: bună capacitate de tamponare şi
bună conductivitate la punctul izoelectric, masă moleculară mică, solubilitate bună la punctul izoelectric,
absorbţie mică a luminii peste 260nm, nu reacţionează chimic cu componenţii amestecului ce urmează a
fi descompus.
Cei mai utilizaţi sunt acizii poliaminopolicarboxilici având masa moleculară între 300-1000D şi
puncte izoelectrice situate în domeniul de pH=3-10.