TEMA 6.

CULTIVOS CELULARES

ÍNDICE

1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………….…… 2

2. CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES ………………………………………….….. 3

2.1 Métodos de obtención de cultivos celulares …………………………………….. 3

2.2 Tipos de cultivos celulares ……………………………………………………… 4

2.4 Tipos especiales de cultivos celulares ……………………………………………6

2.4.1 Cultivos de células madres …….……………………………………… 6

2.4.2 Hibridomas …………………….……………………………………… 7

2.5 Ventajas e inconvenientes del uso de cultivos celulares en experimentación ……8

2.6 Morfología y tipos de crecimiento de las células de cultivo …………………….. 9

2.7 Fases de cultivo celular …………………………………………………………. 10

3. TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS EN CULTIVO …………………………………... 10

4. FUENTES CONSULTADAS ………..………………………………………………… 11

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1- INTRODUCCIÓN

La técnica de cultivos celulares se comenzó a utilizar a principios de este siglo como un

método para estudiar el comportamiento de las células animales o vegetales sin la influencia
de las múltiples variables que implicaba un organismo entero. Desde entonces dichas técnicas
han sido mejoradas, extendidas y aplicadas por un número creciente de biólogos y
actualmente son muy utilizadas en investigación médica y biológica.

Se entiende por cultivo celular un conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de

células in vitro, preservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas.
Dependiendo del grado de preservación de la estructura del tejido o del órgano de origen y de
su duración hablaremos de diferentes tipos de cultivos: de órganos, de explantes, cultivos
primarios o secundarios...

Podemos dividir el cultivo de tejidos en dos grupos de técnicas:

• El cultivo de órganos: se puede definir como el mantenimiento de fragmentos de tejidos u

órganos completos in vitro. Este tipo de cultivos mantienen la estructura tridimensional
del tejido u órgano pero no proliferan, por lo tanto es necesario partir en cada
experimento de nuevo material animal lo que conlleva una elevada heterogeneidad.

• Explantes primarios: son fragmento de tejidos u órganos que se adhieren a una superfície
y la que proliferan las células de la periferia del explante.

• El cultivo de células: supone una disgregación celular del tejido u ógano original. La
suspensión celular obtenida puede ser cultivada tanto en suspensión como en monocapas
sobre cristal o plástico. Por lo tanto en este tipo de cultivos se pierde la organización
espacial tridimensional propia del tejido original, las interacciones entre distintos tipos
celulares y entre las células y la matriz extracelular y las células carecen de los
componentes sistémicos de regulación implicados en la regulación de la homeostasis “in
vivo”, especialmente los sistemas nervioso y endocrino. Además se pierde la
heterogeneidad celular de partida.

La mayoría de células animales y vegetales pueden vivir, proliferar e incluso diferenciarse si

se las cultiva en placas de plástico y con medios de cultivo adecuados. En estas condiciones
las células en cultivo se han convertido en una herramienta ampliamente utilizada en biología
molecular y celular, proporcionando un excelente sistema modelo para diferentes estudios,
como por ejemplo:

• Investigar el comportamiento fisiológico y/o bioquímico de las células. Por ejemplo

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 estudios del metabolismo celular, envejecimiento, interacción y señalización celular.

• Testar el efecto de diferentes drogas o compuestos químicos sobre un tipo de células en

concreto (normales o tumorales) para analizar su posible efecto tóxico, carcinogénico o
terapéutico.

• Estudios biotecnológicos de generación de tejidos artificiales.

• Estudios de producción de agentes biológicos útiles, producidos por cultivos celulares a

gran escala (bioreactores), como por ejemplo: vacunas, anticuerpos monoclonales o
proteínas terapéuticas producidas por cultivos celulares genéticamente manipulados.

2. CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES

2.1 Métodos de obtención de cultivos celulares.

El primer paso para obtener células aisladas de un mismo tipo a partir de un tejido u órgano,
consiste en separar la matriz extracelular que las mantiene unidas. Para ello es necesario tratar
la muestra con diversas enzimas proteolíticas que degradarán las proteínas de la matriz (por
ej. tripsina y colagenasa) y con agentes quelantes que secuestran calcio (como el EDTA, acido
etilendiaminotetraacètico), del cual depende la adherencia celular. De esta forma y mediante
una agitación suave se conseguirá una suspensión de todas las células del tejido.

El siguiente paso consiste en la separación de los distintos tipos celulares del tejido. Para ello
se pueden usar varios métodos:

- Por centrifugación, que permite separar las células por tamaño.

- Según su capacidad de adherencia al vidrio o plástico.

- Mediante anticuerpos específicos contra determinados componentes celulares de membrana.

Estos anticuerpos pueden estar conjugados a una matriz o soporte sólido permitiendo su
separación por inmunoprecipitación o cromatografía de afinidad, o bien con anticuerpos
marcados con fluorescencia permitiendo su selección
por citometría de flujo (ver Tema 55).

- Por microdisección de captura por láser (LCM). Esta

metodología consiste en la disección de un grupo de
células a partir de una sección de tejido preparada para
microscopía. La región que contienen las células de
interés es irradiada con un láser y posteriormente
trasnferidas a un contenedor para su posterior análisis.
Esta metodología es muy utilizada para el aislamiento

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de células tumorales de un tejido.

2.2 Tipos de cultivos celulares.

Se distinguen tres tipos principales de cultivos celulares:

Es importante diferenciar los siguientes conceptos:

• Cultivo Primario: se denominan así aquellos cultivos obtenidos directamente por

tripsinización del tejido original. Pueden iniciarse sin o con fraccionamiento previo para
separar los distintos tipos celulares. En este tipo de cultivos las células aisladas se
mantienen vivas y conservan sus características originales pero su proliferación es
limitada. En estas condiciones las células pueden mantenerse hasta su confluencia
pudiendo entonces subcultivarse para la obtención de cultivos secundarios. Aunque
potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido,
normalmente los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a
que su grado de diferenciación es menor y su capacidad de división mayor.

Es importante diferenciar entre:

Cultivo primario. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano. Estas células

mantienen su viabilidad un período de tiempo limitado y no se reproducen en cultivo.

Línea primaria. Cultivo a partir de un tejido u órgano que se mantiene un periodo de

tiempo limitado pero con capacidad de proliferar en el cultivo. Por ejemplo: fibrobalstos
dérmicos, células endoteliales del cordón umbilical (HUVEC), etc…

• Cultivo Secundario: Si uno o varios tipos de células de un cultivo primario se re-

siembran (sub-cultivo), el cultivo obtenido se denomina cultivo secundario. En este caso

la heterogeneidad celular es menor y puede seleccionarse que células se desarrollarán

mediante el cultivo con medios selectivos.
• Líneas celulares: son las que se obtienen por sub-cultivo y selección de cultivos
secundarios.

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 Las líneas celulares derivadas
de un cultivo primario son
finitas, es decir pueden
dividirse un número limitado
de veces y después pierden la
habilidad de proliferar (proceso
llamado senescencia celular).
Sin embargo un número de
células puede convertirse en
inmortal mediante un proceso
llamado transformación. Este proceso puede ser espontáneo o puede ser inducido
químicamente o mediante virus. Cuando una línea celular es sometida a un proceso de
transformación y adquiere la habilidad de dividirse indefinidamente se convierte en una línea
celular continua. Por ejemplo, los fibroblastos humanos normales se dividen entre 25 y 40
veces en cultivo, antes de detenerse. Esta capacidad limitada de proliferación es resultado de
un acortamiento progresivo de los telómeros (porción de ADN que se encuentra en los
extremos de los cromosomas). En las células somáticas el gen encargado de mantener la
integridad de los telómeros (telomerasa) está silenciado, por lo que los telómeros se acortan
en cada división celular. Las células en cultivo pueden ser forzadas a proliferar
indefinidamente si se les provee del gen que codifica para la telomerasa. Sin embargo no
todas las líneas celulares se convierten en inmortales por el mismo proceso. Algunas células a
pesar de que sus telómeros se mantienen íntegros, pueden frenar sus divisiones mediante
mecanismos de control del ciclo celular o check-points. Para inmortalizar estas células es
necesario introducir oncogenes mediante la utilización de virus (por ejemplo adenovirus).

Existen otros casos como las células de ratón, que no tienen silenciado el gen de la telomerasa
por lo que sus telómeros se mantienen íntegros a lo largo de las divisiones celulares. Pero
cuando son cultivadas, estas células experimentan unos cambios genéticos que inactivan los
mecanismos de control del ciclo celular check-point, produciendo líneas celulares inmortales
espontáneamente.

A pesar de la gran similitud que las células de una línea celular tienen entre sí, no son
idénticas. La uniformidad genética en una línea celular puede mejorarse por clonado celular a
partir de una sola célula que proliferará para formar una línea de células clonales idénticas.
Una de las aplicaciones más importantes de esta estrategia es el aislamiento de líneas
celulares mutantes para ciertos genes en concreto.

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Existen diferencias muy importantes entre una línea celular continua y una línia primaria o
cultivo primario tanto desde el punto de vista físico-químico (tumorogenicidad, ploídia,
anclaje, crecimiento, marcadores), como de requerimientos y rendimineto/eficiencia de
crecimiento.

2.3 Tipos especiales de cultivos celulares

2.3.1 Cultivos celulares de células madre

Entre los cultivos celulares más prometedores des del punto de vista terapéutico, se
encuentran las líneas de células madre. Denominamos Célula Madre (Stem Cell ,SC) a
aquella con capacidad de auto-renovación (habilidad ilimitada de regenerar células iguales a
ella) y pluripotencialidad (capaz de diferenciarse en cualquier tipo celular).

Las Células Madre (SC), en ausencia de condiciones de diferenciación específicas,

mantendrán su auto-renovación por un periodo infinito. Estas células, que poseen la habilidad
de diferenciarse en cualquier tipo celular presente en el organismo, se han convertido en un
foco de interés en diferentes campos de investigación. Actualmente el principal objetivo de la
investigación con SC consiste en su derivación (cultivo) como soporte para la creación de
células pre- o diferenciadas para su posterior aplicación en medicina regenerativa. Los
campos de aplicación incluyen ensayos clínicos y farmacológicos de enfermedades
neurodegenerativas, cardiovasculares y diabetes (entre otras), la generación de células
donantes universales y la ingeniaría tisular.

Existen diferentes tipos de células madre según su orígen

1- Células madre embrionárias (ESC) que derivan de la masa celular interna del blastocito.
Estas células pueden proliferar indefinidamente reteniendo su habilidad de diferenciarse en
cualquier tipo de célula en función de los estímulos externos a los que sean expuestas
(pluripotencia). Por ejemplo existen un gran número de líneas celulares embrionarias de ratón
(mESC) que representan una excelente herramienta para el estudio de modificaciones
genéticas, inducidas o seleccionadas para el análisis de du función en el animal entero. La
investigación con células madre embrionarias humanas (hESC) está regulada por directrices
europeas muy estrictas que controlan el seguimiento de las condiciones de derivación y
propagación.

2- Células madre adultas. Son células no diferenciadas que se encuentran en tejidos y órganos
adultos y que poseen la capacidad de diferenciarse para dar lugar a células adultas del tejido
en el que se encuentran, por lo tanto se consideran células multipotentes. Existen diferentes
fuentes de células madre adultas derivadas de diferentes tejidos, por ejemplo: células madre

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de la línea hematopoiéticas (en la médula ósea), células madre neurales, epiteliales o incluso
derivadas de las láminas basales de la epidermis.

3- Céluals madre fetales, aisladas a partir de embriones muertos y sangre del cordón
umbilical.

Para su derivación (mantenimiento en cultivo) las colonias formadas a apartir de células

madre aisladas o de la masa interna del blastocito (en el caso de ESC) son disgregadas y
sometidas a pases sucesivos hasta obtener líneas celulares estables que posteriormente podrán
diferenciarse mediante la activación o desactivación de determinados genes en resuesta a
distintos mecanismos celulares (miRNA, factores de crecimineto, receptores de membrana,
etc…). Durante este proceso de cultivo y diferenciación se producen cambios en la
composición antigénica de superfície, en proteínas intracelulares y factores de trasncripción.
La detección de estos cambios mediante marcadores es ampliamente utilizada para
caracterizar el estado de pluripotencia o diferenciación de las SC.

Una vez establecida la línea celular de SC, como cualquier tipo de línea celular será necesario
mantenerla en cultivo bajo condiciones controladas de crecimiento y cada tipo celular tendrá
unos requerimientos distintos de sustrato, nutrientes, hormonas y factores de crecimiento.

2.3.2 Hibridomas

Por último una variante de cultivo celular son los hibridomas (ver Tema 55). Se sabe que es
posible fusionar dos células formando un heterocarionte, es decir una célula con dos núcleos
separados pero con los contenidos citoplasmáticos compartidos. Eventualmente este
heterocarionte puede entrar en mitosis produciendo una célula híbrida en la que las envolturas
de ambos núcleos se han disgregado permitiendo juntar su dotación cromosómica. Estos
hibridomas pueden clonarse y establecerse como línea celular continua aunque durante este
proceso parte del material genético puede perderse.

2.4 Ventajas e inconvenientes del uso de cultivos celulares en experimentación.

Ventajas:

1- Permiten un control preciso y fino del entorno. En un cultivo se puede controlar los
factores del entorno ya sea físico-químicos (O2, CO2, temperatura pH, osmolaridad, etc…) y
fisiológicas (factores de crecimeinto, hormonas, etc…).

2- La células en cultivo son fáciles de manipular y controlar.

3- La existencia de numerosas línias celulares internacionales en bancos de células de fácil

acceso ofrece una espectro muy amplio de variedad de células en cultivo fiables.

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4- La utilización de cultivos celulares permite economizar en el uso de reactivos o drogas ya
que las concentraciones y cantidades a usar son mucho menores.

5- Son una alternativa al uso de animales ya que ofrecen la posibilidad de realizar un

screening previo para su posterior análisis en un número más reducido de animales.

6- Las límeas celulares pueden mantenerse congeladas por largos periodos de tiempo sin
perder su viabilidad.

7- Es posible trabajar a pequeña, media y gran escala ya que, si es necesario, es posible

obtener grandes cantidades de cultivo.

Inconvenientes:

1- Validez del modelo “in vitro”. Hay que tener en cuenta que los resultados obtenidos con
cultivos celulares no siempre son extrapolables a los resultados esperados con animal entero
ya que el entorno es totalemente distinto: no existe interacción con otros tejidos, cambian la
organización tridimensional, las condiciones de crecimiento y carecen de componentes
sistémicos de regulación (especialmenet sistema nervioso y endocrino).

2- Inestabilidad genética. Probablemente la capacidad de una línea celular para crecer de

forma continua es un reflejo de su capacidad de variación genética sobre la que se puede
establecer una selección. Esto se corresponde con las observaciones de que líneas celulares
que nunca se establecen como estables se mantienen euploides mientras que otras líneas
frecuentemente se convierten en aneuploides y se transforman en líneas celulares continuas.
Además las células pueden adaptarse a las diferentes condiciones de cultivo (nutrientes,
temperatura, osmolaridad, etc…) modificando por ejemplo sus actividades enzimáticas.

3- Falta de diferenciación: se puede decir como norma que una línea celular será tanto más
fácil de establecer o cultivar cuanto más indiferenciada sea (con las excepciones de las líneas
tumorales de células diferenciadas).

4- La contaminación del cultivo por microorganismos (bacterias, hongos, levaduras, virus,

micoplasmas). Esto supene la necesidad de mantener las condiciones de asepsia en todo
momento.

2.5 Morfología y tipos de crecimiento de las células de cultivo

Las células en cultivo pueden clasificarse en diferentes categorías en función de su

morfología:

• Fibroblasticos (fibrobals-like): células bi- o multipolares de forma elongada y

crecimiento adherido al sustrato.

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 • Epiteliales (epithelial-like): células poligonales de dimensiones regulares y
crecimiento adherido al sustrato.

• Linfoblàsticos (lymphoblast-like): células esféricas que normalmente crecen en

suspensión.

Además, existen dos sistemas de crecimiento de las células en cultivo: 1) crecimiento en

monocapa y 2) en suspensión.

1- El crecimiento en monocapa significa que las células se adherirán al sustrato y en esta

forma inician la proliferación hasta llegar a la confluencia, inhibiendose el crecimiento
por contacto. Muchas líneas celulares son anclaje dependientes, es decir, no inician la
proliferación hasta que se han adherido al sustrato. Este es el modo normal de
proliferación de la mayor parte de las células, con excepción de las células
hematopoyéticas maduras. Algunas células transformadas no se inhiben por contacto de
manera que pueden crecer en varias capas. Para obtener grandes producciones de células
adherentes se pueden utilizar microcarriers. Son unas esferas pequeñas que proveen un
soporte y facilitan la adhesión y crecimiento de las células. Proveen una mayor ratio
área de superficie/volumen, incrementando la producción en un menor espacio.Este tipo
de cultivos requiere la disgregación de la unión sustrato-célula cada vez que es necesario
efectuar un pasaje. Para ello pueden usarse métodos mecánicos (rascado o “scrapping” de
la placa), químicos (iones divalenets o quelantes del calcio) o enzimáticos (proteasas
como tripsina)

2- El crecimiento en suspensión es propio de aquellas células capaces de proliferar sin

necesidad de adherirse al sustrato, independientes de anclaje y es propio de las células
hematopoyéticas, algunas líneas celulares transformadas y de células procedentes de
tumores. Estas células pueden crecer en frascos de cultivo normales pero cuando se
incrementa el volumen de cultivo puede ser necesaria la agitación del medio mediante
spinners. Este tipo de crecimiento presenta la ventaja que no es necesario disociar el
cultivo del sustrato cada vez que es necesario pasar las células.

2.6 Fases del cultivo celular

Una vez establecido el cultivo celular (sea primario, secundario o estable), este seguirá
diferentes fases:

• Fase de latencia: durante este período se efectuará la fijación de las células al sustrato
(en el caso de crecimiento en monocapa), su adaptación al medio de cultivo e inicio del
ciclo celular.

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 • Fase de crecimiento exponencial. El número de células se duplica aproximadamente
cada 24-48 horas(dependiendo del tiempo de duplicación de cada cultivo).

• Fase de confluencia. Las células del cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse
(monocapa: inhibición por contacto; suspensión: consumo del medio).

• Fase de muerte. Si el cultivo se prolonga por demasiado tiempo, las células entran en
una fase de senescencia que termina con la muerte de las células en cultivo.

Para mantener el cultivo en condiciones óptimas es necsario subcultivar las células (pasaje o
pase). El subcultivo permitirá la renovación del medio de cultivo y llevar la relación nº de
células/medio de cultivo/sustrato a las condiciones iniciales.

3. TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS EN CULTIVO

La transfección de células consiste en la introducción de ácidos nucléicos (por ejemplo ADN

o constructos de RNA de interferencia) exógenos dentro de una célula. La introducción de
este material genético heterólogo en las célualas permite analizar in vivo la función de un gen
o bien identificar las secuencias reguladoras que controlan su expresión. También puede
utilizarse como sistema de expresión de proteínas recombinantes.

Para la introducción del material a trasferir existen diferentes metodologías y su elección

dependerá de la naturaleza de las células empleadas. Todas estas metodologías buscan
facilitar la introducción del material genético dentro de las células, para ello pueden usarse
métodos químicos i físicos:

- Producir poros en la membrana celular a través de los cuales el material exógeno

podrá entrar. Ello puede conseguirse bien con fosfatocálcico o por electroporación.

- Producción de liposomas cargados con el material a transferir, que se fusionaran con

la membrana.

- Introducción del material por endocitosis del material mediante conjugación del ADN
con polimeros catiónicos (por ejemplo dextran-DEAE).

- Por microinyección. Esta metodología es más laboriosa pero muy efectiva y es la que
se emplea para la transfección de células embrionárias en el proceso de obtención de
animales transgénicos.

- Mediante la utilización de virus. Un ejemplo de ello es la transfección de células de

insecto por baculovirus para la producción a gran escala de proteínas recombinantes.
Esta metodología se ha revelado como una de las más potentes alternativas a la
expresión heteróloga de proteínas recombinantes en células de mamífero ya que las

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 células de insecto tienen un patrón enzimático para la modificación postraduccional de
proteínas muy similar al de las de mamífero y además, su uso resuelve los problemas
de solubilidad de proteínas cuando son expresadas a gran escala.

La transfección puede ser transiente o estable. En el primer caso el DNA introducido es

eliminado por dilución durante la división celular o por degradación. Sin embargo en algunos
casos el DNA introducido puede integrase en el genoma de la célula transfectada, tratandose
entonces de una transfección estable. Estas células transfectadas establemente pueden ser
seleccionadas mediante la cotransfección de un gen marcador que le confiere alguna ventaja
para crecer en medios selectivos, por ejemplo resistencia a algún antibiótico (por ejemplo
higromicina) o toxina (por ejemplo geneticina que puede ser neutralizada con la expresión de
neomicina).

4. FUENTES CONSULTADAS

- Cell Cultire basics. Handbook. Invitrogen-Gibco. Life technologies.

- Cultivos celulares. Cultek
http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?p=Aplicacion_Cultivos_Celulares&opc=tecnicas
- Transfección. Cultek
http://www.cultek.com/inf/otros/Notas_tecnicas/transfeccion.pdf

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