Tipuri de preparate microscopice si coloratii

I. Preparatul nativ ( proaspat , umed , necolorat, intre lame si

lamele )
- se fol. pt decelarea unor protozoare ( chisturi , trofozoiti ) ,
helminti ( ouale , larvele ) sau fungi. E mai putin folosit pt
studiul bacteriilor ( poate depista mai ales bacteriile mobile
dintr-un produs patologic lichid/solid sau dintr-o cultura
bacteriana dezvoltata pe un mediu de cultura solid sau in
interiorul unuia lichid
- pe lama de sticla curata si degrasata se aplica cu pipeta o
picatura din produsul de examinat ( fie direct din acesta
daca produsul e lichid , fie dintr-o suspensie a lui in ser fiz.
steril , daca produsul e solid ) . Se ia o lamela care se aseaza
cu o latura pe lama , se inclina la 45 de grade si se lasa sa
cada usor peste picatura de lichid . Examinarea la microscop
se face cu obiectivele uscate ale microscopului ( adica cele
mici x10 x20 x40 )

II. Preparatul fixat ( frotiu ) . Se poate realiza din :

- produs patologic recoltat de la un bolnav/animal de
laborator
- cultura bacteriana dezvoltata fie pe un mediu solid , fie intr-
unul lichid
Are 4 etape :
1) Etalarea – intinderea sau dispersia prod.patol. Se face in
functie de starea de agregare a produsului
 dintr-un produs lichid , pe o lama , se aplica cu pipeta
sau ansa bucla o picatura de lichid , care se intinde
 apoi cu ansa bucla prin miscari circulare intr-un strat
cat mai subtire
 dintr-un produs solid se aplica pe lama o picatura de
ser fiz. , in apropierea careia se descarca cu ansa bucla
o mica cantitate de produs . Cele 2 se amesteca
circular , omogenizandu-le
 din sange . Se pune picatura de sange recoltata din
sangele capilar si cu o alta lama amestecam sangele in
lungul lamei. Un frotiu corect e transparent si nu
atinge marginile lamei
2) Uscarea – se face in aer , acoperite cu capacul unei cutii
Petri. Se executa miscari de agitare
3) Fixarea – se produce aderarea produsului de lama si
pregatirea colorarii. Se poate face prin mai multe moduri:
 prin caldura ( cea mai fol. metoda ) – se trece frotiul cu
fata in sus de 3, 4 ori pe deasupra flacarii , apoi se
aplica lama pe tegumentul fetei dorsale a mainii,
considerand fixarea suficienta daca simtim arsura
suportabila . Fixarea prea indelungata distruge
produsul , iar o fixarea insuficienta va produce spalarea
produsul de pe lama in mom. colorarii
 prin subst. chimice ( pt. bacteriile mai sensibile ) –
consta in scufundarea lamei intr-un solvent
4) Colorarea – bacteriile vii necolorate sunt greu vizibile la
microscop . De aceea frotiurile trebuiesc colorate inainte
examinarii
 colorarea e rez. unor interactiuni fizico-chimice dintre
colorant si constituienti ai bacteriei.
  colorantii sunt compusi colorati capabili sa-si transfere
culoarea unui substrat care , datorita struct. sale
chimice , prezinta afinitate pt acestia . Orice colorant
are in struct. sa 2 grupari chimic active
- cromofora => determina culoarea
- auxocroma => colorarea substratului ( -OH , -COOH , -NH2 ,
- SH ) . Aceasta grupare imprima colorantului caracterul
acid / bazic . Majoritatea bacteriilor se coloreaza cu
coloranti bazici ( albastru de metilen , fuxina bazica , violet
de Gentiana )
 coloratiile se clasifica dupa :
a) nr. de coloranti folositi
b) dificultatea realizarilor

Coloratiile uzuale ( evidentiaza morfologia bacteriana

cum ar fi forma , dimensiunea , gruparea , raportul
bacteriilor cu celulele organismului ):

- simple ( cu un singur colorant )

- compuse ( diferentiale , cu mai multi coloranti – acestea pot
evidentia si tinctorialitatea/ afinitate bacteriei pt un anumit
colorant )
Coloratiile speciale ( evidentiaza componente
bacteriene care nu prea se coloreaza cu coloranti uzuali )

Coloratiile uzuale simple – cu albastru de metilen

 Frotiu fixat -> se acopera cu o solutie fenicata -> albastru
de metilen 1% , 1-2 min
 Se spala colorantul de pe lama , se usuca frotiul , se exam.
microscopic cu obiectivul de imersie ( cel mai mare : x90 )
 folosind o picatura de ulei de cedru ( intre lama si
obiectiv)
Mecanismul de colorare :
albastrul de metilen e bazic => realiz. schimburi ionice
cu gruparile acide ( -COOH ) din struct. bacteriei . Se
observa bacterii si celule umane

Coloratii uzuale simple – fuxina bazica

 mecanism similar , doar ca elementele vor fi colorate in
rosu

Coloratiile compuse ( diferentiale )

 Coloratia GRAM ( se realizeaza in 4 etape )
/// colorarea => se face acoperind frotiul cu violet de
Gentiana 1% 1-2 min . Se varsa colorantul de pe lama.
/// mordansarea => se acopera frotiul cu un mordant
( solutie Lugol ( I2 + KI in H2O distilata ) 1-2 min. Se
varsa apoi mordantul
/// decolorarea => pe lama tinuta inclinat se toarna un
amestec decolorant ( alcool – acetona 5:1 ) cateva sec ,
pana cand lichidul care se scurge devine incolor. Se
spala frotiul cu apa de robinet
/// recolorarea => se acopera frotiul cu sol. fenicata de
fuxina bazica 1% 1-2 min . Se spala cu apa si se
examineaza
Mecanismul coloratiei GRAM :
- colorantul ( violetul de Gentiana ) coloreaza toate
elementele de pe lama prin schimburi ionice intre gruparile
sale bazice si cele acide ale peretelui bacterian
- pe parcusul mordansarii , mordantul doar fixeaza culoarea
( iodul din sol Lugol care are afinitate si pentru colorant si
pentru constituentii peretelui bacterian va patrunde in
bacterie , formand complexe insolubile cu colorantul legat la
randul lui de elementele peretelui bacterian
- pe parcursul decolorarii , am. decol. va dizolva lipidele .
Asadar , in cazul bacteriilor GRAM ( - ) care au continut
ridicat de lipide in perete ( 90% ) se va produce decolorarea
pt ca violetul de Gentiana e eliminat din celula odata cu
lipidele . In cazul bacteriilor GRAM ( + ) care sunt mai sarace
in lipide ( doar 10% ) colorantul se mentine in celula , ele
ramanand colorate violet
- in recolorare , se vor colora in rosu bacteriile GRAM ( - )

Bacteriile GRAM + = SSPDATL ( stafilo , strepto , pneumo ,

bacilul difteric , bacilul antrax , bacilul tetanic , levuri )
Bacteriile GRAM – “ –ella “ ( Salmonella , Schigella ,
Klebsiella ) , Neisseria ( meningitidis ( meningococul ) ,
gonorrhoeae ) , genul Vibrio ( vibrionul holeric ) , genul
Escherichia ( E.coli )
 coloratia Ziehl – Nielsen ( are 3 etape , fara
mordansare )
/// colorarea => frotiul fixat se acopera cu fuxina bazica
1% , dupa care e incalzit pe dedesubt pana la emisie de
 vapori. Se raceste si se repeta incalzirile de 2-3 ori ( in
interval de 10 min )
/// decolorarea => cu alcool- acid. Se spala pe urma cu
apa de robinet
/// recolorarea => cu albastru de metilen 1% 1-2 min
Aceasta coloratie se fol. pt bacteriile cu continut ridicat
de lipide ( dar nu cele GRAM - ) , care se coloreaza
dificil numai la temp. ridicate si coloranti puternici.
Aceste bacterii au AAR ( acido-alcoolo rezistenta ),
proprietate data de un hidroxiacid din struct. lipidelor (
ac. micolic ) .
Ex . genul Mycobacterium ( Mycobacterium
tuberculosis = bacilul Koch )
Bacteriile vor aparea colorate cu rosu

Coloratiile speciale => coloreaza sporii si capsula bacteriana , care din

cauza struct. sale chimice , nu se coloreaza cu coloranti uzuali . Apare ca
o zona refringenta stralucitoare in jurul corpului bacterian

 se foloseste o picatura de tus ( tus de China ) si

fuxina bazica
 sporii vor aparea tot stralucitori , dar vor fi atasati
de peretele bacterian. Au continut dens si
afinitate scazuta pt coloranti. Se coloreaza la temp
mari si cu coloranti puternici . Se foloseste
deobicei verde malahit si fuxina bazica . Sporii vor
aparea verzi, iar corpul bacteriei rosu