Guião do aluno

VERSÃO B
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ÍNDICE:

Introdução……………………………………………………………………...… 3

Parte I – Enquadramento teórico da actividade………………………… 4

Parte II – Problematização da actividade….………………………….…. 9

Parte III – Procedimentos protocolares........................................... 12

Parte IV – Análise e discussão dos resultados…………………….……. 16

Parte V – Actividades complementares……………………………….….. 17

Parte VI – Glossário…………………………………………………….……… 26

Apêndices……………………………………………………………………….… 28

Referências Bibliográficas………………………………………………..….. 34

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Introdução
O kit “BioExperimentando” é uma actividade prática, de laboratório, que se baseia numa
simulação de uma triagem genética numa família que possui uma doença hereditária fictícia. Nesta
actividade pretende-se que se integre a compreensão de processos genéticos, com as técnicas associadas,
e as respectivas questões éticas.
Os alunos terão que determinar a probabilidade de um determinado casal ter um filho doente,
através da análise das amostras de DNA, após restrição e separação electroforética.

O kit BioExperimentando vai permitir que o aluno:

estude a transmissão de determinada característica hereditária, através de técnicas de
Engenharia Genética;
analise e interprete casos de mutação, sua génese e consequências;
explore procedimentos laboratoriais de manipulação do DNA;
compreenda a importância e modo de funcionamento das enzimas de restrição;
manipule o material de laboratório de forma autónoma e responsável;
desperte a curiosidade relativa à metodologia desta investigação;
compreenda a utilidade de algumas técnicas utilizadas em Engenharia Genética no
quotidiano dos cidadãos;
use o pensamento crítico para resolver problemas;
discuta algumas questões éticas inerentes à manipulação do DNA.

Este kit foi concebido para alunos do Ensino Secundário do Curso de Ciências e Tecnologias do
12ºano, no âmbito da disciplina de Biologia.

Kit BioExperimentando (versão B)

Etapas de implementação Vantagens da utilização Ajuda a ensinar

Cultura de bactérias Preparação e manutenção de culturas Preparar meios de cultura

Extracção do DNA de bactérias.
plasmídico Aquisição de técnicas laboratoriais na
Introdução aos perfis de área da microbiologia e da biologia
DNA molecular.
Restrição das amostras Uso de enzimas de restrição reais e
de DNA realização de electroforese com
Electroforese em gel de fragmentos de DNA real.
agarose A actividade pode ser realizada em três
Análise e interpretação sessões de 90 minutos (no entanto o
de resultados professor poderá reajustar o tempo).
Material suficiente para 23 alunos.
Extrair DNA plasmídico
Estrutura do DNA
Hereditariedade clássica
Mendeliana (autossómica ou
ligada ao sexo)
Análise de restrição do DNA
Preparar um gel de agarose para
electroforese
Determinar o tamanho molecular.
Simulação de perfis de DNA
Análise de mapas de restrição
Questões éticas inerentes aos
testes genéticos.

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Medidas de segurança
Não é permitido comer, beber ou fumar no laboratório/área de trabalho.
É recomendado a utilização de luvas e de uma bata de algodão.
Os alunos devem lavar as mãos com água e sabão antes e depois da actividade.
Se alguma solução entrar em contacto com os olhos, estes devem ser imediatamente lavados
com água.

Parte I – Enquadramento teórico da actividade

A análise de DNA humano tem aplicações em duas grandes áreas:

1. Cuidados de saúde – inclui o diagnóstico de doenças hereditárias, mutações cromossómicas e cancro.
2. Sistema judicial – identificação de suspeitos em casos criminais (homicídio, rapto, roubo…) e análise
de relações familiares em casos de disputa da paternidade e de imigração.

Na presente actividade simula-se o diagnóstico de uma doença fictícia, que afecta vários membros de uma
família. São vários os conceitos e técnicas inerentes à implementação e compreensão da actividade:

Cultura de bactérias

As bactérias são conhecidas desde 1674, sendo a sua estrutura ainda objecto de estudo. São os
seres vivos mais simples do ponto de vista estrutural, e os de menor tamanho. As bactérias são
microorganismos unicelulares, procariontes.

A cultura de bactérias é o crescimento de colónias de microorganismos induzida pelo Homem

para facilitar o seu estudo. Para a realização de uma cultura bacteriana, precisamos de um inoculo e de
um meio de cultura. Os meios de cultura podem ser de dois tipos: meios líquidos ou meios sólidos. Os
meios líquidos são normalmente utilizados para enriquecimento das bactérias, enquanto que os meios
sólidos são utilizados para o seu isolamento. O meio de cultura permite a nutrição, o crescimento e a
multiplicação dos microorganismos do inoculo. Os meios de cultura são seleccionados consoante o tipo
de bactéria. As bactérias multiplicam-se em meios de cultura apropriados desde que sejam respeitadas
as condições de temperatura, pH, humidade e composição.

Um bom meio de cultura deve possuir as seguintes características:

- Um teor de humidade entre os 75% e os 95%.
- Os nutrientes necessários
- Possuir um pH adequado
- Ser estéril
- Possuir as propriedades físicas desejáveis (límpido, líquido, sólido…)

Os meios de cultura podem ser usados na selecção e crescimento de um determinado microrganismo

ou na identificação de uma espécie em particular. Desta forma, a função de um dado meio depende da
sua composição. O isolamento de uma determinada estirpe bacteriana pode ser feito através do recurso
e/ou combinação dos seguintes tipos de meios:

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 Meios selectivos – suprimem o crescimento de determinados microrganismos em benefício de

outros.
 Meios diferenciais – permitem a distinção entre diferentes grupos de microrganismos com base
na capacidade de metabolizar componentes específicas do meio de cultura ou na morfologia
(aparência) das colónias. Permitem, por vezes, a identificação de microrganismos com base nas
suas características biológicas.

No apêndice I “Guia prático de microbiologia”, ou no site www.bioexperimentando.blogspot.com

encontra-se informação necessária à preparação de diferentes meios de cultura para estirpes
de E.coli.

Manutenção de estirpes de E. coli

Há diferentes métodos para manutenção de estirpes de E.coli, dependendo do tempo de
armazenamento que se deseje. Os stocks de glicerol e as culturas “Stab” permitem um longo tempo de
conservação das bactérias, enquanto que placas de agar podem ser usadas para um período de
manutenção mais curto.
O kit BioExperimentando fornece as bactérias em cultura “Stab”. Para que possa implementar o
trabalho experimental do kit várias vezes, com menos custos, é necessário manter as culturas de bactérias
viáveis. Para tal, após a recepção das primeiras bactérias em cultura “Stab”, proceda como é sugerido no
ponto 1 dos procedimentos protocolares. Após a incubação das bactérias em meio líquido durante a noite,
poderá manter novas culturas em placas de agar, ou em cultura “Stab”. Os procedimentos para a
realização dos meios de cultura para placas de agar ou cultura “Stab” encontram-se no apêndice I “Guia
prático de microbiologia”, ou no site: www.bioexperimentando.blogspot.com

Extracção de DNA plasmídico

A lise enzimática, também denominada “Método de fervura” ou Boiling lysis é um método rápido
utilizado para extracção do DNA plasmídico, especialmente recomendado para um grande número de
culturas de E.coli de volume reduzido. A qualidade do DNA plasmídico isolado é inferior do que a obtida
por lise alcalina, mas é suficiente para análise de restrição. As bactérias sofrem lise através do tratamento
com lisozima, Triton-X-100 e calor. A lisozima enfraquece a parede das células bacterianas e o calor
rompe-as. Também pela acção do calor é desnaturado o DNA cromossómico e as proteínas. As cadeias do
DNA plasmídico circular fechado não se separam uma da outra devido à forma como estão entrelaçadas.
O DNA cromossómico permanece ligado à membrana bacteriana, e juntamente com as proteínas, é
removido por centrifugação. O DNA plasmídico fica no supernadante, o qual é precipitado com
isopropanol. Este procedimento é eficaz com plasmídios pequenos (tamanho inferior a 15 kb), e com a
maioria das estirpes de Escherichia coli (excepção das estirpes de E.coli que expressem a endonuclease A,
a qual não é completamente inactivada pelo calor, e de que resulta a degradação do plasmídio durante a
incubação na presença de Mg2+).

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Enzimas de restrição
As endonucleases (endo = dentro, nuclease = enzima que corta ácidos nucleicos) ou enzimas de
restrição são enzimas que reconhecem sequências específicas de bases no DNA e são capazes de
hidrolisar as cadeias de DNA.
Uma enzima de restrição liga-se a uma molécula de DNA e desliza ao longo da hélice até reconhecer
sequências especificas de pares de bases que indicam que esta deve parar de deslizar. A enzima corta
então quimicamente o DNA naquele local, chamado local de restrição. Se um local de restrição específico
ocorrer em mais do que um local numa molécula de DNA, a enzima de restrição irá cortar em cada um
desses locais, resultando múltiplos fragmentos. O tamanho de cada fragmento vai depender da localização
dos locais de restrição na molécula de DNA.
Quando as enzimas de restrição são usadas para cortar cadeias de plasmídios circulares de DNA, tal
como acontece neste kit, fragmentos de diferentes tamanhos são produzidos. O DNA que se cortou pode
ser observado usando um processo conhecido como electroforese em gel de agarose.

O gel de agarose
O gel de agarose prepara-se dissolvendo uma suspensão de agarose numa solução tampão e
deixando arrefecer num recipiente apropriado. A agarose deve ser previamente pesada para a
concentração pretendida do gel e deve ser dissolvida na solução tampão com a ajuda de uma fonte de
calor (em banho–maria ou no microondas). Assim que a solução levantar fervura deve ser retirada da
fonte de calor, pois se deixarmos ferver a malha do gel pode ficar laxa, o que poderá trazer implicações na
electroforese e nos resultados que deveremos obter.
A solução deve ser vertida num molde apropriado (figura 1) quando atinge uma temperatura de
cerca de 50ºC (ou seja, quando pudermos pegar no recipiente directamente com a mão sem nos
queimarmos).
Antes de vertermos a solução de agarose no molde, devemos colocar as borrachas adaptadoras e
um pente junto da extremidade orientada para o pólo negativo da tina de electroforese (uma vez que o
DNA irá migrar para o pólo positivo) para obtermos um gel com uma fileira de poços.
Após solidificação do gel, vertemos tampão de electroforese sobre o gel, e cuidadosamente
retiramos o pente, tendo o cuidado de não danificar os poços (nunca retirar o pente sem o gel estar
submerso em tampão de electroforese!). Posteriormente vertemos um pouco mais de tampão de
electroforese sobre os poços para eliminar eventuais resíduos de agarose que não tenha sido
polimerizada.

Figura 1 – Gel de agarose

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Electroforese
A electroforese consiste em fazer migrar biomoléculas por uma matriz, sob a influência de um
campo eléctrico, permitindo separá-las segundo os seus tamanhos. Esta técnica permite analisar
fragmentos de DNA e determinar o seu tamanho.
O DNA antes de ser carregado nos poços tem que ser tratado com tampão de amostra que tem
várias funções: dá cor à amostra (azul de bromofenol ou xilenocianol), confere densidade (tem sacarose
ou glicerol) e mantém o pH alcalino. Os fragmentos de DNA são então descarregados em poços, no gel de
agarose, que é colocado numa tina cheia de tampão de electroforese (TAE ou TBE). O tampão de
electroforese fornece condutibilidade eléctrica e mantém o pH que é necessário para a manutenção da
carga e estabilidade das moléculas. O carregamento dos poços é um procedimento que deve ser feito com
muito cuidado para não danificar os poços do gel (figura 2). O conteúdo deve ser expelido da pipeta
devagar e continuamente, carregando no êmbolo da pipeta até ao primeiro ponto de resistência. Quando
é sentida esta primeira resistência, deve-se aguardar uns breves segundos antes de retirar, lentamente, a
ponta da pipeta do poço.
Após o carregamento dos poços, ligam-se os eléctrodos à fonte de alimentação, determinando
previamente a voltagem e o tempo de electroforese (figura 3).
A corrente eléctrica é passada entre os eléctrodos que estão nos terminais da tina de electroforese. Desde
que os fragmentos de DNA estejam carregados negativamente, eles vão avançar para o pólo positivo
(cátodo) quando estiverem sujeitos a um campo eléctrico. No decorrer da electroforese, verifica-se junto à
extremidade que contém o eléctrodo negativo a libertação de H2. Na extremidade que contém o pólo
positivo observa-se a libertação de O2. Se não estiver a ocorrer a electroforese não há formação deste
gases, pelo que a observação da libertação destes gases sob a forma de “bolhinhas” é um bom indicador
da ocorrência ou não deste processo.
A matriz do gel de agarose funciona como uma malha molecular através da qual cada fragmento
pequeno de DNA se move mais facilmente do que os fragmentos maiores. No entanto, a razão entre o que
cada fragmento de DNA migra através do gel é inversamente proporcional ao seu tamanho em pares de
bases. Após um determinado período de tempo, os fragmentos menores de DNA vão migrar até mais
longe do que os maiores. Fragmentos do mesmo tamanho ficam juntos, e migram numa única banda de
DNA. Estas bandas irão ser vistas posteriormente no gel após o DNA ser corado.

Figura 2 – Carregamento dos poços Figura 3 – A electroforese

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Visualização do DNA
O DNA é incolor, por isso os fragmentos no gel não podem ser vistos durante a electroforese.
Corando as bandas de DNA é possível a sua localização no gel. Habitualmente nas escolas utiliza-se o
corante Azure A: 100% inócuo, e com um grau de eficácia muito elevado, já que permite uma boa
visualização do DNA, num espaço de tempo reduzido (figura 4).

Quando o gel é imerso no corante Azure A, as moléculas do

corante atacam o DNA que se encontram na malha do gel de
agarose. Quando as bandas ficam visíveis, é possível comparar
os padrões de restrição do DNA em diferentes amostras de
DNA.
Dada a relação qualidade/preço/segurança, o corante
seleccionado para esta actividade é o Azure A. No caso da
escola possuir transiluminador UV sugere-se a utilização do
corante GelRed. No caso da escola possuir uma fonte de luz
azul, pode optar-se pela utilização do GelGreen.
Figura 4 – Corante para o visualização do
DNA - Azure A

Testes genéticos
Um teste genético é o mais recente e sofisticado procedimento utilizado para identificar
alterações genéticas, e envolve a análise directa do DNA.
As finalidades dos testes genéticos podem ser o diagnóstico, o rastreio ou a monitorização. Os testes
genéticos podem ser utilizados para diagnosticar uma doença genética, para determinar se um indivíduo é
portador de uma doença associada a uma mutação, para prever o desenvolvimento de uma doença
genética, para determinar a susceptibilidade de um indivíduo para uma determinada doença, ou ainda
para aplicações na ciência forense.
Actualmente são realizados centenas de testes genéticos e muitos outros estão em desenvolvimento.

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Parte II – Problematização da actividade

O problema apresentado à turma é o seguinte:

Transmissão da doença “Raritose”

A família Antunes é afectada há quatro gerações sucessivas pela doença “Raritose”. A Ana, bisneta da D. Maria e do Sr Joaquim,
casou com o André, e pretendem ter um filho. Tendo o André conhecimento de que a família de Ana tem problemas com essa
doença, este sugere a Ana que façam um teste genético para averiguar a probabilidade dos seus eventuais filhos serem doentes
ou portadores da doença. A árvore genealógica desta família encontra-se disponível na figura 6.

Questão- problema: Será possível pela análise do DNA descobrirmos se os filhos de Ana e André serão doentes?

Mulher

Homem

Sexo
Indefinido

D. Maria Sr Joaquim
Legenda

José Rosa Paulo Elisabete Agostinho Manuel Helena Joana António

Rita Tiago Rui Josefina Serafim Diana Marta

Ana André
Carlos Pedro Vera

Filho A Filho B

Figura 5 – Árvore genealógica da família Antunes

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Para simplificação de identificação, a cada membro da família será atribuído um número, como mostra a
figura 6.

1 2

Parte III – Procedimentos protocolares

Trabalho laboratorial:

3 4 5 6 7 8 9 10 11
- Material/Métodos
- Notas para o professor
- Informação adicional
Pipetagem

12 13 Electroforese
14 15 16 17 18

Parte IV – Análise e discussão dos resultados

20 21
19 22 23

Filho A Filho B
Figura 6 – Árvore genealógica da família Antunes

Membros da família Antunes:

1 – D. Maria 9 – Helena 17 – Diana

2 – Sr. Joaquim 10 – Joana 18 – Marta
3 – José 11 – António 19 – Carlos
4 – Rosa 12 – Rita 20 – Ana
5 – Paulo 13 – Tiago 21 – André
6 – Elisabete 14 – Rui 22 – Pedro
7 – Agostinho 15 – Josefina 23 – Vera
8 – Manuel 16 - Serafim

No sentido de dar resposta à questão formulada anteriormente, foram recolhidas amostras de

cada um dos membros da família Antunes. De referir que cada amostra de DNA recolhida contém parte do
gene responsável pela doença, amplificado previamente por PCR (Reacção de Polimerização em Cadeia).
Existem apenas dois alelos diferentes para o locus que está ser investigado. Um indivíduo que seja
homozigótico para o alelo dominante (genótipo RR) terá apenas DNA do tipo R. Um indivíduo que seja
homozigótico para o alelo responsável pela doença (genótipo rr) terá apenas DNA do tipo r. Por sua vez,

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um indivíduo que seja heterozigótico (genótipo Rr), terá DNA dos dois tipos. A amplificação da região de
interesse do DNA origina fragmentos de mesmo tamanho para ambos os alelos, neste caso, 6500 pb.
O objectivo é detectar que formas de DNA estão presentes em cada amostra, e para isso
sujeitam-se as amostras a restrição com a enzima BamHI e analisar os fragmentos de DNA resultantes, no
gel de electroforese.
A diferença na sequência de DNA dos alelos R e r é tal que, no alelo r existe uma sequência de
bases que pode ser reconhecida e cortada pela enzima de restrição BamHI. O alelo R não possui local de
restrição para a enzima BamHI e assim não vai ser cortada pela enzima.
Um marcador de DNA, que consiste num conjunto de fragmentos de tamanhos conhecidos, é
sujeito a electroforese juntamente com as amostras, para se poder confirmar que os fragmentos mais
pequenos obtidos, quando combinados, formam o fragmento maior (4000 + 2500 = 6500 bp).

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Parte III – Procedimentos protocolares

Segue-se o trabalho de laboratório que implica o cumprimento de todas as regras de segurança

já mencionadas na introdução deste guião. De referir que quando se manuseia DNA, deve ter-se sempre
em atenção que todo o material que entre em contacto com o DNA deve ser esterilizado, com particular
atenção às pontas das micropipetas. Estas nunca devem ser tocadas com as mãos ou entrar em contacto
com material não esterilizado, para que não haja contaminação do DNA.

1. Cultura de bactérias para extracção de DNA plasmídico

a) Seleccionar um conjunto de culturas em stock (em placa petri, cultura “Stab”, ou meio líquido LB
mais Ampicilina), dependendo de como são mantidas as bactérias no laboratório, e proceder à propagação
das bactérias através de cultura líquida, transferindo perto da chama, para um tubo estéril que continha já
10 mL de meio de cultura (tabela 4):
- uma colónia de cada cultura de bactérias no caso de estarem em meio sólido;
- uma picada de cada cultura de bactérias caso sejam retiradas da cultura “Stab”;
- 10 µL de cada cultura de bactérias, no caso de estarem em meio líquido.
b) Agitar de modo a provocar a dispersão das bactérias no meio.
c) Incubar a 37ºC durante a noite.

Culturas
pCR2.1 pUC 18 pCard
(meio LB+Ampicilina)
Volume final da
10mL 10mL 10mL
cultura

Tabela 4: Cultura de bactérias seleccionadas para extracção de

DNA plasmídico

2. Extracção do DNA plasmídico

a) Perto da chama, transferir 1,5 mL de cada cultura bacteriana para os respectivos tubos de 1,5 mL
estéreis.
b) Centrifugar à velocidade média durante 3 minutos para recolher as bactérias no fundo do tubo, e
verter o sobrenadante.
c) Perto da chama transferir novamente 1,5 mL de cada cultura bacteriana para os respectivos tubos
de 1,5 mL.
d) Centrifugar à velocidade média durante 3 minutos para recolher as bactérias no fundo do tubo, e
verter o sobrenadante.
e) Ressuspender os sedimentos em 300 de STET e adicionar 4 uL de lisozima (50mg/mL) a cada
tubo.
f) Incubar à temperatura ambiente durante 5 minutos.
g) Ferver durante 45 segundos.
h) Centrifugar durante 5 minutos à velocidade máxima, para que as estruturas celulares sedimentem
no fundo.
i) Remover o sedimento de cada tubo com um palito.
j) Adicionar a cada tubo 300 µL de isopropanol (insolubiliza o DNA) e agitar.

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k) Centrifugar os tubos à velocidade máxima, durante 10 minutos, para sedimentar o DNA.

l) Eliminar o sobrenadante e deixar secar até desaparecer o odor de isopropanol, evitando que os
sedimentos sequem em demasia.
m) Adicionar 100 µL de etanol, a 70% e deixar evaporar.
n)Ressuspender os sedimentos em 30-40 µL de água destilada estéril, agitando a base dos tubos com
os dedos.
o) Utilizar o DNA dissolvido directamente, ou conservar a preparação de DNA a -20ºC para posterior
utilização.

3. Preparação das amostras de DNA

Nesta actividade experimental, se o corante de DNA a utilizar for o Azure A, será necessário 0,3 µg de
DNA para cada banda visível – num volume de 20 µL a carregar nos poços.
As soluções de plasmídios são normalmente fornecidas em concentrações de 1 µg/µL, que necessitam de
ser diluídas para uma concentração de 0,06 µg/µL (ver tabela 5). 5 µL dessas soluções contêm 0,3 µg de
DNA.
Para este trabalho, é necessário preparar 3 misturas diferentes de plasmídios, que vão posteriormente ser
utilizadas. A tabela 6 indica as quantidades de cada mistura que são necessárias para a realização da
actividade experimental. As amostras de DNA vão conter 20 µL de uma das misturas, pelo que a
quantidade de DNA em cada amostra vai ser 0,3 µg, 0,9 µg, ou 0,6 µg, dependendo se contem a mistura
A (1 plasmídio), a mistura B (3 plasmídios) ou a mistura C (2 plasmídios).

Plasmídio Volume Final

Água
(1 µg/µL) (0,06 µg/µL)
3 µL 47 µL 50 µL
6 µL 94 µL 100 µL
9 µL 141 µL 150 µL
Tabela 5 - Preparação das soluções de plasmídios para a
15 µL 235 µL 250 µL concentração final de 0,06 µg/µL

Volume necessário
Amostra de DNA
Amostra de DNA A Amostra de DNA C de plasmídio
B
(o,o6 µg/µL)
pUC 18 ------------------------ 60 µL 20 µL 80 µL
pCR 2.1 ------------------------ 60 µL 20 µL 80 µL
pCArd 45 µL 60 µL ----------------------- 105 µL
Água 135 µL 60 µL 40 µL
Volume total 180 µL 240 µL 80 µL
Nº de amostras
de 20 µL 8 tubos 11tubos 3 tubos
necessárias

Tabela 6 - Preparação das misturas de plasmídios (amostra de DNA A, B e C)

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4. Distribuição das amostras de DNA

a) No topo de cada um dos tubos que contêm enzima liofilizada, proceder à identificação dos mesmos
com os números de 1 a 23 (utilizar caneta de tinta permanente).
b) Colocar 20 µL de cada amostra de DNA (amostra A, B e C) no respectivo tubo (figura 8) que
continha já enzima de restrição liofilizada (9 tubos recebem a amostra de DNA A, 11 tubos recebem a
amostra de DNA B, e 3 tubos recebem a amostra de DNA C).
c) Proceder à mistura da solução de DNA com a enzima, fazendo leves batimentos com os dedos no
fundo do tubo.

Tubos que recebem a amostra de DNA A: tubos 3, 9, 10, 12, 14, 17, 18, 19, 22

Tubos que recebem a amostra de DNA B: tubos 1, 2, 4, 5, 6, 8, 13, 16, 20, 21, 23
Figura 8 – Distribuição das
Tubos que recebem a amostra de DNA C: tubos 7, 11, 15 diferentes amostras de DNA

5. Restrição enzimática
a) Com os tubos dispostos num suporte adequado, incubar as amostras de DNA numa estufa a 37ºC,
durante cerca de 40 minutos.

6. Preparação do gel de agarose

a) Pesar 0,4 g de agarose num matraz, adicionar 50 mL de tampão TAE (1x) (ver nota para o
professor 2).
b) Tapar o matraz com película aderente, e furar a película antes de o levar ao microondas (não
utilizar parafilme).
c) Proceder à sua dissolução no microondas durante 2 minutos (ter atenção para a solução não
levantar fervura, uma vez que se ferver a malha do gel vai ficar laxa, havendo implicações na
electroforese).
d) Retirar o matraz do microondas com o auxílio de uma pega, e agitar suavemente, certificando de
que toda a agarose se encontrava totalmente dissolvida.
e) Deixar arrefecer até à temperatura aproximada de 60ºC.
f) Colocar o pente junto ao eléctrodo negativo da tina de electroforese.
g) Verter continuamente o volume de agarose derretida na tina de electroforese, (evitando assim a
criação de bolhas de ar) de modo a encher a cavidade central, e a circundar os dentes do pente.
h) Aguardar a polimerização da agarose durante cerca de 20 minutos.

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7. Carregamento do gel
a) Após a solidificação do gel de agarose, cobrir toda a
sua superfície com TAE (0,25x).
b) Remover cuidadosamente o pente do gel bem como
as placas laterais.
c) Adicionar 2 µL de tampão de amostra que contém azul de
bromofenol a cada um dos tubos que contem as amostras de DNA.
d) Agitar suavemente no sentido de misturar o tampão de
amostra com a solução de DNA.
Figura 9 – Carregamento do gel de
e) Pipetar 5 µL do marcador molecular Lambda DNA/HindIII e adicionar agarose

2µL de tampão de amostra.

f) Carregar 5 µL da solução anterior no primeiro poço do gel.
g) Pipetar 20 µL de cada amostra de DNA, pela ordem numérica dos tubos, e carregar nos poços do
gel (figura 9).

8. A electroforese
a) Verificar se os eléctrodos estão bem colocados.
b) Regular a voltagem para os 120 volts.
c) Submeter o DNA a electroforese durante 20 a 30 minutos (figura 10).
d) Interromper a electroforese quando o azul do tampão alcançar o
fim do gel.

Figura 10 - Electroforese
9. Coloração do DNA
a) Remover a solução tampão TAE da tina, reservando-a para posteriores utilizações (tem que se ter
o cuidado de segurar o gel, e assim evitar que este se parta).
b) Verter cerca de 10mL de corante do DNA, Azure A, na superfície do gel .
c) Deixar actuar cerca de 4 minutos.
d) Retirar o corante da superfície do gel e guarda-lo para posterior reutilização, anotando no frasco o
nº de vezes que este já tinha sido utilizado.
e) Retirar o corante da superfície do gel, lavando-o com 5ml de etanol a 70%, durante uns segundos.
f) Eliminar o álcool e lavar o gel com água corrente, durante 3 ou 4 minutos, não deixando água no
gel, para que não seja removido do gel a totalidade do corante.
g) Aguardar até que as bandas se tornem visíveis.
h) Observar os resultados.
i) Registar o número de bandas na respectiva árvore genealógica.

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Parte IV – Análise e discussão dos resultados

1. Elabore um desenho do gel resultante do trabalho laboratorial, com os poços devidamente

assinalados (apêndice II).

2. Na árvore genealógica fornecida (apêndice III), registe o número de bandas obtido em cada
indivíduo (para cada amostra de DNA poderá visualizar uma, duas ou três bandas).

3. Indique, justificando, qual o modo de transmissão da doença.

4. Identifique os indivíduos que são portadores da doença.

5. Refira os indivíduos que podem ter falecido devido à doença “Raritose”.

6. Indique o genótipo e o fenótipo dos indivíduos 1, 15 e 22.

Parte VI – Actividade complementar

7. Comente a seguinte afirmação: A probabilidade de o André e a Ana terem um filho doente é igual
à probabilidade de terem um filho portador. (Sugestão: Faça um xadrez mendeliano).
Parte V - Actividade complementar – Mapeamento de plasmídios (Plasmid Mapping)

8. A Ana e o André optaram na realidade pela realização de um teste genético, antes de terem filhos,
Plasmídios
para saberemese enzimas de restrição de terem um filho doente. Alguns membros da família apoiam a
há a possibilidade
decisão tomada pelo casal,
O mapeamento de plasmídios mas há outrosa membros
revolucionou que se opõem.
biologia molecular e abriu oEnumera
caminho dois
para argumentos
a indústria daque
possam ter sido referidos a favor da realização do teste genético e dois argumentos que possam ter
biotecnologia. Esta técnica permite aos biólogos moleculares avaliar rapidamente o sucesso de
sido referidos contra.
experiências de clonagem assim como identificar facilmente plasmídios e tratamentos associados em
diferentes organismos. Embora os verdadeiros perfis de DNA sejam conseguidos a partir do DNA
9. Complete o “V de Gowin” relativo à actividade experimental desenvolvida (apêndice IV).
genómico, a actividade que se segue utiliza DNA plasmídico para simular como os verdadeiros perfis de
DNAElabore
10. são analisados.
uma resposta para a questão-problema formulada inicialmente “Será possível pela
análise
Após odo DNAdos
corte descobrirmos se os
plasmídios pelas filhos de
enzimas de restrição,
Ana e André
estesserão
podemdoentes?”
ser ligados a um fragmento de DNA
proveniente de um outro organismo que tenha sido cortado com a mesma enzima de restrição. O

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 Guião do Aluno

Parte V – Actividades complementares

Actividade complementar 1 – Mapeamento de plasmídios

Plasmídios e enzimas de restrição

O mapeamento de plasmídios revolucionou a biologia molecular e abriu o caminho para a
indústria da biotecnologia. Esta técnica permite aos biólogos moleculares avaliar rapidamente o sucesso
de experiências de clonagem assim como identificar facilmente plasmídios e tratamentos associados em
diferentes organismos. Embora os verdadeiros perfis de DNA sejam conseguidos a partir do DNA
genómico, a actividade que se segue utiliza DNA plasmídico para simular como os verdadeiros perfis de
DNA são analisados.
Após o corte dos plasmídios pelas enzimas de restrição, estes podem ser ligados a um fragmento
de DNA proveniente de um outro organismo que tenha sido cortado com a mesma enzima de restrição. O
plasmídio resultante que possui DNA híbrido pode ser incorporado em células bacterianas (transformação).
O plasmídio híbrido replica-se na bactéria da mesma forma que o plasmídio original, incluindo o fragmento
de DNA estranho que foi introduzido. Assim, cada plasmídio híbrido contém uma cópia do DNA estranho
incorporado. Diz-se que o fragmento de DNA foi “clonado” e o plasmídio de DNA que o transporta é
designado “vector”.
Os plasmídios podem ser descritos em termos de localização dos locais de restrição usando
simples procedimentos e lógica. O procedimento geral é digerir um plasmídio com duas enzimas de
restrição separadamente e com as duas em simultâneo (digestão dupla). Os tamanhos dos fragmentos de
DNA resultantes são determinados usando a lógica para determinar a localização relativa dos locais de
restrição.
Uma vez que os plasmídios são circulares, o número de fragmentos representam o número de
cortes ou locais de restrição.

Ler um mapa de um plasmídio

Um mapa de um plasmídio contém informações relativas ao tamanho do plasmídio, aos genes
presentes, à origem do local de replicação, e aos locais de restrição para as enzimas de restrição. Os
plasmídios utilizados nesta actividade laboratorial foram o plasmídio pUC 18, o plasmídio pCR2.1.TOPO, e
o plasmídio pCard (resulta da adição de um insert de 1500bp no plasmídio pCR 2.1 TOPO). Foi utilizada a
enzima de restrição BamHI, embora outras enzimas pudessem ter sido utilizadas para cortar estes
plasmídios (exemplo da enzima HindIII). Os locais de restrição são marcados no mapa com um número
que indica o local de restrição. Uma vez que o plasmídio é circular, existe um local zero arbitrário. Todos
os locais de restrição são indicados com um número entre zero e o número total de pares de base do
plasmídio. O tamanho dos fragmentos pode ser calculado pela simples subtracção (e nalguns casos
adição) entre pontos do plasmídio.

Plasmídios utilizados neste kit

O mapa de um plasmídio mostra as posições (numeradas pelos pares de bases do DNA) dos
locais onde o plasmídio pode ser cortado por determinadas enzimas de restrição. O nome do plasmídio e o
seu tamanho em pares de base de DNA é mostrado dentro do círculo, assim como a Origem de Replicação

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 Guião do Aluno

(Ori). Dois dos plasmídios utilizados neste kit são plasmídios comerciais: o pUC18 e o pCR2.1 (figura 10 e
11).

Figura 10 – Plasmídio pUC 18

Fonte da imagem: http://www.taq-dna.com/puc18-dna-_149.html

Figura 11: Plasmídio pCR2.1

Fonte da imagem: http://www.imagenes-bio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml

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 Guião do Aluno

Questões:
1. A partir do mapa do plasmídio pCR2.1 enumere as enzimas de restrição que podem cortar o plasmídio.

2. Qual dos plasmídios, pUC 18 ou pCR2.1, é o maior e qual é o seu tamanho?

3. Utilizando o plasmídio pUC18 como exemplo, procure os locais de restrição para a enzima AvaII.
Quantos locais de restrição existem? Se a enzima AvaII for usada para restrição deste plasmídio, quantos
fragmentos iremos obter?

4. Determine o tamanho dos fragmentos obtidos da restrição do plasmídio pUC18 com a enzima AvaII.
Confirme que a soma dos fragmentos obtidos é igual ao tamanho total do plasmídio.

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 Guião do Aluno

Actividade complementar 2 – Restrição e análise do gel, virtual, utilizando o software

pDrwa32

Para se realizar restrições virtuais em plasmídios, e visualizar o padrão de restrição obtido num gel
virtual, pode-se utilizar um software gratuito: o “pDRAW32 DNA analysis software”, AcaClone software.

1. Proceda à instalação do software pDRAW32 DNA analysis, acedendo ao site

http://www.acaclone.com/ e seguindo todas as instruções.

Figura 1: Instalação do programa “Pdraw32 DNA analysis software”

2. Abra o programa já instalado “pDRAW32 DNA analysis”. De seguida, clique em “File” (ficheiro),
New (novo) e “Enter new sequence” (introduzir nova sequência).

Figura 2: Menus de abertura do programa pDRAW32

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 Guião do Aluno

3. Acedendo ao site https://www.lablife.org/ escolha a sequência do plasmídio que pretende

analisar (sugere-se que escolha a sequência do plasmídio pCR2.1). De seguida cole a sequência
seleccionada no local indicado no programa pDRAW.

Figura 3: Selecção da sequência de nucleotídios do plasmídio pCR2.1

4. Clique em “Edit” (editar), e seleccione a opção “Edit Sequence”.

Figura 4: Sequência do plasmídio pCR2.1 linearizada, mostrando também os locais de restrição de dezenas de enzimas
de restrição. Está indicado também o comprimento da sequência do DNA.

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 Guião do Aluno

5. Clique em “Edit”, seleccione “DNA name, properties and annotations”, e registe os dados como se
indica no exemplo abaixo:

Figura 5: Designação do nome correcto do plasmídio (pCR2.1), e indicação da forma que se pretende visualizar o DNA
(forma circular)

6. Clique em “Preview, e aparecerá no ecrã o plasmídio pretendido – pCR2.1, com todos os locais de
restrição enzimática.

Figura 6: Mapa do plasmídio pCR2.1, circular, com locais de restrição das respectivas enzimas

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 Guião do Aluno

7. Clique em “Settings” (opções), e seleccione “Enzime selection” (selecção das enzimas).

Figura 7: Menu de opção para selecção das enzimas

8. Introduza a informação que deseja relativamente às enzimas que pretende utilizar para a
restrição do plasmídio.

Figura 8: Selecção das enzimas e das características pretendidas

Nota: no exemplo apresentado foram seleccionadas algumas características, podendo no entanto

serem seleccionadas outras.

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 Guião do Aluno

9. Após ter clicado em “Apply”, vai aparecer no ecrã o plasmídio pCR2.1 apenas com os locais de
restrição para as enzimas que apresentam as características anteriormente definidas.

Figura 9: Mapa do plasmídio pCR2.1 com os locais de restrição das enzimas anteriormente definidas

10. Uma vez que aparecem ainda muitos locais de restrição para as enzimas anteriormente
seleccionadas, a melhor opção será seleccionar as enzimas que só cortam duas vezes o
plasmídio.

Figura 10: Mapa do plasmídio pCR2.1 com os locais de restrição das enzimas que cortam apenas duas vezes

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11. Obtido o mapa virtual do plasmídio pCR2.1. com os respectivos locais de restrição para enzimas que
só cortam duas vezes, pode-se agora realizar a restrição virtual e respectiva electroforese em gel virtual.
Clique em “View – agarose gel electrophoresis”.

Figura 11: Mapa de restrição do plasmídio pCR2.1, em gel virtual

Discussão:

Que conclusões se podem retirar, após observação do padrão de restrição do plasmídio pCR2.1, com
enzimas que apenas cortam duas vezes?

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Parte VI - Glossário

Glossário

Ácido desoxirribonucleico – vulgarmente conhecido por DNA, é um polímero orgânico complexo formado por duas
cadeias de nucleótidos emparelhadas entre si, com uma disposição antiparalela. Cada nucleótido que constitui o DNA é
composto por um açúcar, a desoxirribose, um grupo fosfato e uma das quatro bases azotadas (timina, adenina,
guanina e citosina).

Ácido ribonucleico – vulgarmente conhecido por RNA, é um polímero orgânico formado por uma cadeia simples de
nucleótidos. Cada nucleótido que constitui o RNA é composto por um açúcar, a ribose, um grupo fosfato e uma das
quatro bases azotadas (adenina, guanina, citosina e uracilo).

Adenina – base azotada púrica presente nos nucleótidos que constituem o DNA e o RNA.

Agarose – polímero constituído por unidades de galactose. Após dissolução em água a ferver, seguido de
arrefecimento, toma uma consistência gelatinosa.

Alelos – formas diferentes de um determinado gene.

Base Azotada – moléculas que entram na constituição dos ácidos nucleicos. No DNA podemos encontrar quatro bases
azotadas: a adenina, timina, citosina e guanina. A adenina e a timina são bases complementares, emparelhando entre
si. De igual modo a citosina e a guanina emparelham por complementaridade.
No RNA encontram-se também quatro bases azotadas: guanina, citosina, adenina e uracilo em vez da timina. As bases
emparelham do mesmo modo que no DNA à excepção da adenina que vai emparelhar com o uracilo.

Cariótipo – conjunto dos cromossomas presentes nas células de cada ser vivo.

Centrómero – parte central dos cromossomas. O centrómero é importante no processo de mitose e de meiose para a
separação dos cromossomas.

Citosina – base azotada pirimídica presente nos nucleótidos que constituem o DNA e o RNA.

Co-dominância – situação em que há expressão individual dos dois alelos de um locus, num heterozigótico.

Cromatídio – componente de um cromossoma contendo uma molécula de DNA.

Cromatina – denso material do núcleo constituído principalmente por DNA e proteínas.

Cromossoma – estrutura filamentosa constituída por DNA associado a proteínas estruturais (histónicas e não
histónicas). Os cromossomas encontram-se no núcleo das células eucarióticas.

Cromossoma homólogo – cada um dos cromossomas de um par de cromossomas idênticos, que apresenta os
mesmos loci genéticos. Cada cromossoma de um desses pares é homólogo do outro e emparelha com ele durante a
meiose.

DNA – ver ácido desoxirribonucleico.

DNA fingerprinting – técnica de separação de segmentos de DNA que permite a identificação genética dos
indivíduos.

DNA polimerase – enzima presente nas células procarióticas e eucarióticas, responsável pela polimerização das novas
cadeias de DNA.

Dominante – refere-se a um carácter que se exprime quando há heterozigotia para o gene que o determina. A
expressão ocorre na presença de uma cópia normal do alelo.

Enzimas de restrição - enzimas responsáveis por cortar o DNA. Estas enzimas são produzidas por bactérias e
recebem o nome da espécie da bactéria de onde foram extraídas. Enzimas de restrição diferentes reconhecem e cortam
DNA em diferentes sequências de bases.

Electroforese – é uma técnica que permite a separação de moléculas (DNA, proteínas…) de acordo com o tamanho,
carga e forma que apresentam, quando sujeitas a uma corrente eléctrica. As moléculas vão movimentar-se no meio de
suporte (gel de agarose ou de poliacrilamida, por exemplo) a velocidades diferentes consoante as características que
apresentam (tamanho, carga e forma).

Engenharia genética – manipulação do material genético.

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 Guião do Aluno

Feniltiocarbamida – a feniltiocarbamida (PTC) é uma proteína, descoberta na década 30,

Fenótipo – características observáveis num organismo. O fenótipo resulta da combinação de factores genéticos e
ambientais.

Gene – é a unidade básica da hereditariedade. Corresponde a uma sequência nucleotídica de DNA que codifica uma
determinada sequência polipeptídica, responsável por determinada característica ou função no organismo. Cada gene
encontra-se num local específico de um cromossoma (locus) e pode apresentar várias variantes (alelos) que
determinam uma forma particular dessa característica (exemplo: a característica “cor dos olhos” pode ter vários alelos:
alelo que determina a cor azul, alelo que determina a cor castanha, etc).

Genética – ciência que estuda os genes e a hereditariedade.

Genoma - conjunto de todos os genes de um organismo.

Genótipo – constituição génica de um indivíduo no que diz respeito aos alelos de um locus.

Guanina - base azotada púrica presente nos nucleótidos que constituem o DNA e o RNA

Hereditariedade – mecanismo através do qual as características genéticas passam dos progenitores para os
descendentes.

Heterozigótico – um indivíduo diz-se heterozigótico quando possui dois alelos diferentes para o mesmo gene.

Histona – proteínas básicas, associadas ao DNA nos cromossomas. Têm baixo peso molecular, e são ricas nos
aminoácidos lisina ou arginina.

Homozigótico – um indivíduo diz-se homozigótico quando possui alelos iguais para o mesmo gene.

Locus – localização de um gene num cromossoma.

Primer – pequena sequência específica de oligonucleótidos que se liga ao DNA alvo, para permitir o início da síntese da
cadeia complementar pela DNA polimerase.

Reacção de polimerização em cadeia (PCR) - reacção que permite a amplificação de porções específicas de DNA
que estejam presentes numa mistura complexa de DNA, desde que sejam conhecidas as suas extremidades.

Recessivo – gene ou carácter que só se manifesta em homozigotia ou em hemizigotia (presença de um único alelo no
genoma).

RNA – ver ácido ribonucleico.

SNP (Single nucleotide polymorphism) – variação numa sequência de DNA que envolve uma alteração num único
nucleótido.

Southern blot – método descrito por E.Southern em que fragmentos de restrição são separados num gel de
electroforese e transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou de nylon. Esta membrana é posteriormente
tratada com uma sonda (fragmento de DNA ou RNA com uma sequência de bases conhecida, e complementar ao DNA
contido na membrana) que vai hibridar com o fragmento de DNA que se pretende identificar. A sonda de DNA é
marcada radioactivamente para permitir a sua detecção.

Taq polimerase – é uma DNA polimerase termoestável, utilizada na amplificação de fragmentos de DNA através da
técnica de PCR. O seu nome é devido a ter sido identificada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticus. A Taq
polimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida enzimática de 40 minutos (a 94ºC).

Teste genético – teste que permite detectar a presença, ausência ou alteração, num gene particular, cromossoma ou
num produto genético.

Timina – base azotada pirimídica presente nos nucleótidos que constituem o DNA (ausente no RNA).

Uracilo – base azotada pirimídica encontrada nos nucleótidos do RNA.

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 Guião do Aluno

Apêndices:

Apêndice I – Guia prático de Microbiologia

Meio Liquido

Culturas líquidas de E.coli, podem geralmente fazer-se crescer no meio LB (Luria-Bertani). Há diferentes
meios LB, com diferentes composições. Fórmulas diferentes contêm diferentes concentrações de NaCl e
dão origem a quantidades variadas de DNA plasmídico. Para obter grande quantidade de DNA plasmídico
a composição LB recomendada é a seguinte:

Composição do meio LB por litro

Triptona 10 g
Extracto de
5g
levedura
NaCl 10 g

Tabela 1: Composição do meio LB por litro

Preparação do meio LB

Para preparar um litro de meio LB, adicione 10g de NaCl, 10 g de triptona e 5 g de extracto de levedura a
950 mL de água destilada e desionizada, e agite até se dissolver. Ajuste o volume da solução para um litro
com água destilada e desionizada. Decante para pequenos reservatórios e esterilize na autoclave.

Nota 1: é aconselhável autoclavar o meio líquido em vários frascos pequenos, do que apenas num frasco
grande, para evitar uma possível contaminação de todo o meio. Depois de autoclavar, não utilizar o meio
durante 24 h para garantir que está devidamente esterilizado e livre de contaminação por microorganismos.

Esterilização do meio

Esterilize o meio líquido ou sólido na autoclave, utilizando uma pressão e um período de tempo adequado
ao tipo de meio, tamanho do frasco, e tipo de autoclave.

Nota 2: Encha apenas ¾ da capacidade dos frascos com meio, e solte as rolhas antes de autoclavar para
evitar que o meio a ferver verta para fora. Aperte as rolhas quando o meio estiver frio (por volta dos 40ºC)
para o manter completamente estéril.

Nota 3: Os antibióticos e os nutrientes como os aminoácidos são inactivados pelas altas temperaturas de
uma autoclave. Eles devem ser adicionados ao meio frio e autoclavado a partir de soluções stock
adequadas.

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 Guião do Aluno

Meio sólido

Estirpes de E. coli podem geralmente ser riscadas e armazenadas em placas de petri com meio LB que
contenham 1,5% de agar e o antibiótico apropriado.

Preparação: prepare o meio LB de acordo com a composição dada na tabela acima. Mesmo antes de
autoclavar, adicione 15 gramas de agar por litro e misture. Depois de autoclavar, agite o meio suavemente
para distribuir o agar dissolvido por toda a solução. Tenha o cuidado para que o líquido quente não verta
para fora enquanto o agita.

Nota 4: Deixe arrefecer o meio de agar autoclavado até aos 50ºC, antes de adicionar antibióticos e nutrientes
sensíveis ao calor. Misture muito bem.

Nota 5: Faça o plaqueamento das placas com o meio numa câmara de fluxo laminar, ou numa superfície
limpa, próximo de uma chama. Use 30-35 mL de meio para placas de petri de 90mm de diâmetro (1 litro de
meio dá para cerca de 30 placas).

Nota 6: Após o plaqueamento, quaisquer bolhas de ar podem ser removidas passando rapidamente uma
chama perto da superfície da placa. Não se deve demorar com a chama pois esta pode destruir os
antibióticos.

Seque as placas directamente quer após a solidificação ou logo antes de usar removendo as tampas e
colocando as placas na câmara de fluxo laminar durante 1 hora. Em alternativa, se não houver câmara de
fluxo laminar, as placas podem ser secas com as tampas ligeiramente abertas numa estufa a 37ºC durante
30 minutos, ou deixe-as invertidas com as tampas à temperatura ambiente durante 2-3 dias.

Nota 7: Guarde as placas invertidas a 4ºC, protegidas da luz, para preservar os antibióticos sensíveis à luz.
Não guarde as placas por períodos superiores a 3 meses, já que os antibióticos podem degradar-se.

Antibióticos

Estirpes bacterianas que contêm plasmídios ou genes com marcadores selectivos de antibióticos devem
sempre ser postas num meio de cultura liquido ou sólido que contenha o agente selectivo. Os antibióticos
devem ser adicionados ao meio apenas quando este estiver a uma temperatura abaixo dos 50ºC.

Antibiótico Soluções stock Concentrações a utilizar (diluidas)

Concentração Armazenamento
Ampicilina
50 mg/mL em água -20ºC 100 ug/mL (1/500)
Clorofenical
34 mg/mL em etanol -20ºC 170 ug/mL (1/200)
Kanamycin
10 mg/mL em água -20ºC 50 ug/mL (1/200)
Streptomycin
10 mg /mL em água -20ºC 50 ug/mL (1/200)
Tetraciclina
5 mg/mL em etanol -20ºC 50 ug/mL (1/100)

Tabela 2: concentrações de antibióticos frequentemente utilizados

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 Guião do Aluno

Culturas “Stab”

As estirpes de E.coli podem ser mantidas durante um ano em cultura “Stab”. As culturas “Stab” são
utilizadas para transportar bactérias de uns laboratórios para outros.

Preparação das culturas “Stab”:

1. Preparar e autoclavar o meio LB como descrito anteriormente,
tendo em conta que se pretende um meio LB que contenha 0,7% de agar.
2. Arrefecer o meio LB até cerca dos 50ºC, e adicionar o
antibiótico apropriado. Enquanto o agar ainda estiver líquido,
adicionar 1 mL de agar para um tubo de 2 mL, em condições estéreis,
e deixar solidificar.
3. Com uma ansa esterilizada, retirar uma única colónia
de bactérias de uma placa de petri e introduzir a ansa no fundo do frasco
com agar diversas vezes (figura 1).
4. Incubar o tubo a 37ºC durante 8 a 12 h deixando a tampa
do tubo ligeiramente aberta.
5. Após incubação, retirar o tubo, apertar muito bem a tampa, Figura 1-Inoculação de uma cultura “Stab”
e guardar no escuro a uma temperatura de 4ºC. Fonte da imagem: www.qiagen.com

Placas de agar

Placas com riscado de bactérias podem ser seladas com Parafilme, e guardadas invertidas a 4ºC
durante várias semanas.
O riscado de bactérias deve ser sempre feito em placas que contenham o antibiótico apropriado.

Para se obter colónias de bactérias bem isoladas, riscar uma placa de agar como se descreve de seguida:

1. Passar uma ansa de inoculação pela chama, e arrefece-la

numa placa esterilizada que contem agar, mas que não vá ser utilizada.
2. Utilizando a ansa, proceder ao riscado de bactéria
(a partir de uma cultura stock em glicerol, cultura “Stab” ou de uma
colónia isolada de outra placa) a partir de uma canto da placa de
agar fresco.
3. Passar a ansa pela chama mais uma vez e arrefece-la.
Passar a ansa sobre o primeiro riscado e riscar de novo a partir
de um canto fresco da placa.
4. Repetir o processo até formar o padrão visível na figura 2. Figura 2: Riscado de bactérias em
placas de agar
5. Incubar a placa invertida a 37ºC durante 12 a 24 h, até as colónias
Fonte da imagem: www.qiagen.com
se desenvolverem.

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 Guião do Aluno

Apêndice II – Registo das bandas de DNA resultantes no gel de agarose

31
 Guião do Aluno

Apêndice III – Árvore genealógica

Mulher

Homem

Sexo
Indefinido

Legenda

32
 Guião do Aluno

Apêndice IV – “V de Gowin”

33
 Guião do Aluno

Referências Bibliográficas

(1) Ministério da Educação, Direcção-Geral de Inovação e de Desenvolvimento Curricular, Departamento da Educação

Básica, Orientações Curriculares
http://www.dgidc.min-edu.pt/fichdown/programas/ciencias_fisicas_naturais.pdf

(2) Ministério da Educação, Direcção-Geral de Inovação e de Desenvolvimento Curricular

http://eec.dgidc.min-edu.pt/programas/biologia_12.pdf

Para mais informações consultar:

Bailey J (1995) A Genética – A Nova Enciclopédia das Ciências, Círculo de Leitores.

Regateiro F (2003) Manual de Genética Médica - Imprensa da Universidade de Coimbra.

Sambrook J., Fritsch E. F., e Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory.

Videira A (2001) Engenharia Genética – Princípios e Aplicações, Lidel.

Corantes
Biotium Microbiologia
www.biotium.com
QIAGEN News
Carolina www.qiagen.com
http://www.carolina.com

BioRad Plasmídios
http://www.bio-rad.co.jp/LifeScience/pdf/
Invitrogen
www.invitrogen.com
Biotecnologia – conceitos e técnicas
The European Initiative for Biotechnology Education Source BioScience ImaGenes
http://www.eibe.info/ http://www.imagenesbio.de/info/vectors/pCR2.1_pic.shtml

Learn.Genetics - Science Learning Center LabLife

http://learn.genetics.utah.edu/ https://www.lablife.org/

Roy J. Carver Biotechnology Center

http://www.biotech.uiuc.edu/

Orientações curriculares do Ministério da Educação

Ministério da Educação, Direcção-Geral de Inovação e de Desenvolvimento Curricular
http://eec.dgidc.min-edu.pt/programas/biologia_12.pdf

Ministério da Educação, Direcção-Geral de Inovação e de Desenvolvimento Curricular, Departamento da Educação

Básica, Orientações Curriculares
http://www.dgidc.min-edu.pt/fichdown/programas/ciencias_fisicas_naturais.pdf

Kits comerciais
Nature`s dice – Teacher`s guide
http://www.ncbe.reading.ac.uk/NCBE/MATERIALS/DNA/PDF/DiceTG.pdf

Bio-Rad Laboratories
http://www3.bio-rad.com

Testes genéticos
Understanding Gene Testing
http://www.accessexcellence.org/AE/AEPC/NIH/gene19.php

Software:
pDraw32 DNA Analysis
http://www.acaclone.com/

34