Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
38
- medii de cultură solidificate – provin din medii lichide prin adăugarea
unor substanţe de solidificare. Solidificarea se poate face cu agenţi de
solidificare: agar – agar (geloza), gelatina, silicagel, carboximetilceluloza.
Cel mai utilizat agent de solidificare este agar – agarul (geloza) – un polizaharid
format din agaroză şi agaropectina, izolat sau obţinut din alge (genul Gelidium). Din
punct de vedere chimic este format din D – galactoză şi 3,6 dehidrogalactoză, legate
1,3 sau 1,4. Agarul are proprietăţi absorbante. Păstrat în apă, nu se solubilizează. Prin
absorbţia apei îşi măreşte volumul de 16 – 17 ori. Se topeşte la temperaturi mai mari
de 100°C în apă şi se transformă în gel prin răcire la temperatura de 45°C. Pentru
solidificarea mediilor se adaugă 1,5 – 2 g la 100 ml mediu lichid.
Agarul nu este degradabil din punct de vedere biologic, de aceea este ideal
pentru cultivarea microorganismelor. Mediile solidificate cu agar se folosesc pentru
cultivarea şi numărarea microorganismelor deoarece pe medii solidificate celulele
formează colonii caracteristice distincte. Agarul, în mediu foarte acid (pH < 4,5), dacă
este supus unor temperaturi de sterilizare, îşi pierde proprietăţile de gel. În concluzie,
în cazul mediului cu pH acid întâi se face sterilizarea mediului, apoi se adaugă soluţie
acidă (acid organic sau anorganic) pentru corectarea pH-ului.
Gelatina, din punct de vedere chimic, este o proteină cu structură asemănătoare
colagenului obţinut din piele de porc, cartilagii şi oase. În apă rece îşi măreşte volumul
de 3-6 ori şi se fluidifică în apă caldă uşor iar transformarea în gel are loc foarte lent
la temperaturi sub 30ºC.
Pentru solidificarea mediului de cultură cu gelatină se adaugă 12-15 g la 100
ml. La temperaturi ridicate de sterilizare (mai mari de 110ºC), îşi pierde proprietăţile
de gelifiere. Mediile cu gelatină se sterilizează la temperaturi de 100 – 105ºC. Gelatina
poate fi hidrolizată enzimatic de microorganisme care produc proteaze extracelulare.
Gelatina se foloseşte pentru medii destinate cultivării drojdiilor, pentru identificarea
activităţii proteolitice a microorganismelor.
Ceilalţi agenţi de solidificare au o arie mai restrânsă de folosire, mai ales pentru
mediile sintetice anorganice.
În tehnica microbiologică se folosesc medii gata preparate obţinute de firme
autorizate care pot fi livrate în diferite forme (cel mai adesea se prezintă sub formă de
praf sau pulbere). Pe sticlă se menţionează compoziţia mediului şi cantitatea de
pulbere care trebuie dozată la 1l de apă pentru obţinerea mediului de cultură. După
dizolvare se face sterilizarea mediului.
Mediile fermentative sunt destinate cultivării la scară industrială a
microorganismelor şi majoritatea lor sunt medii lichide care se sterilizează mai uşor.
Aceste medii sunt ieftine deoarece conţin o cantitate mică de substanţe dizolvate şi se
pretează procesului de automatizare.
39
La obţinerea mediilor fermentative se folosesc pe scară largă produsele
secundare rezultate din industria alimentară.
Ca surse hidrocarbonate se folosesc:
- melasă (produs secundar rezultat la fabricarea zahărului) ce conţine 60%
zahăr, săruri minerale, biotină;
- zer (4,5% lactoză);
- plămezi amidonoase (se obţin prin măcinarea cerealelor, fierberea, gelifierea
amidonului şi zaharificare);
- tărâţe (20 % amidon, săruri minerale, vitamine), în mediu lichid sau
solidificat. Tărâţele se amestecă cu apă şi alte ingrediente.
Sursele cel mai des folosite de azot sunt::
- făinuri proteice (de soia + amidon + azot proteic vegetal);
- făină de peşte;
- îngrăşământ complex cu 16 % azot, uree, (NH4)2SO4.
Surse de factori de creştere: extract de porumb (se obţine de la înmuierea
porumbului şi favorizează fermentaţia lactică), radicele de malţ sub formă de extract,
autolizat de drojdie, germeni de grâu, de porumb.
Diversitatea mediilor de cultură este datorată capacităţii de adaptare a
numeroaselor microorganisme întâlnite în habitaturile naturale dar şi faptului că prin
modificarea compoziţiei mediilor de cultură se pot obţine randamente superioare în
produşi de metabolism cu valoare economică.
Mediile de cultură sunt utilizate frecvent în tehnici microbiologice de laborator,
pentru izolarea, cultivarea şi întreţinerea culturilor pure şi pentru controlul
microbiologic al produselor alimentare.
40
CAPITOLUL IV
CULTURI PURE
Cultura pură reprezintă biomasa de celule de acelaşi tip provenită prin înmulţire
din o singură celulă situată într-un mediu nutritiv steril adecvat.
În cazul în care, pe un mediu solidificat, prin dezvoltarea unei celule unice s-a
obţinut o colonie, în cadrul coloniei biomasa dezvoltată reprezintă cultură pură.
Pentru perpetuarea şi întreţinerea purităţii culturilor, după obţinere, prin diferite
metode de izolare a culturii pure, celule de acelaşi fel se pot transfera în vase cu mediu
steril, transfer care se numeşte repicare şi conduce la obţinerea unei culturi pure.
Obţinerea culturilor pure are o importanţă deosebită pentru tehnicile
microbiologice şi în biotehnologii.
Izolarea în culturi pure permite identificarea şi caracterizarea morfologică şi
fiziologică a microorganismului izolat.
Pe culturi pure se fac studii pentru selecţionarea tulpinilor cu performanţe de
biosinteză şi sub formă de culturi pure se face întreţinerea şi conservarea culturilor
valoroase. În industria alimentară, în subramurile în care microorganismele sunt
folosite pentru obţinerea de produse alimentare acestea se folosesc sub formă de
cultură pură, condiţie obligatorie pentru a obţine produse cu o anumită calitate. Astfel,
în industria prelucrării laptelui, la fabricarea vinului, a spirtului, a berii, în panificaţie,
se folosesc culturi pure de microorganisme, care prezintă anumite proprietăţi
biotehnologice.
41
striuri. Aceste metode se folosesc şi în cazul în care o cultură pură este contaminată în
perioada de păstrare cu microorganisme străine şi aceasta trebuie să fie salvată.
Metode scarificate
În placa Petri se repartizează un mediu de cultură adecvat (MMA/BCA) şi
după solidificarea mediului, cu firul ansei se recoltează celule din mediul natural şi se
execută trasări pe suprafaţa mediului, astfel încât diversele celule rămân distanţate
între ele. Prin termostatare 2-3 zile, din colonia care corespunde microorganismului ce
trebuie să fie izolat, se face repicare într-o eprubetă cu mediu solid înclinat şi astfel se
obţine o cultură pură.
Metoda culturală Koch este folosită în special pentru izolarea de drojdii. Ca
mediu de răspândire se foloseşte mustul de malţ cu gelatină repartizat în trei eprubete,
fluidificat şi menţinut la 40° C. Din mediul natural, de exemplu un must în fermentaţie,
se recoltează o ansă care se introduce succesiv în cele trei eprubete, cu agitare, care să
asigure desprinderea celulelor. După inoculare şi uniformizare, conţinutul fiecărei
eprubete se repartizează în câte o placă Petri; prin solidificare, celulele rămân fixate în
gel şi prin multiplicare vor forma colonii/clone izolate. În funcţie de densitatea
celulelor recoltate iniţial, în placa a doua sau a treia coloniile sunt suficient de
distanţate (2cm), pentru a putea face izolarea din colonia adecvată a culturii pure.
42
must de malţ agar se adaugă câţiva ml din o suspensie diluată, cu o concentraţie mică
de spori; după clătirea suprafeţei mediului, lichidul se scurge iar unii spori, cei reţinuţi
de suprafaţa mediului, conduc la colonii izolate.
Metoda lui Naumov izolează picături de MMA în care în prealabil s-au
introdus un mediu restrâns de spori. În mediu încă fierbinte, după inoculare, se adaugă
picături pe capacul plăcii Petri, iar după solidificare şi cultivare se alege picătura de
mediu solid care prezintă o singură colonie.
Metoda cu micromanipulator este o metodă mecanică. Micromanipulatorul
este alcătuit dintr-un sistem de tuburi capilare cu care se poate lucra sub microscop, cu
posibilitatea de a recolta prin absorbţie în microcapilar unele celule izolate. Apoi
celula este introdusă în mediu nutritiv adecvat.
43
A
B C
Timpul
Figura 6: Dinamica de dezvoltare a celulelor microbiene
AB este faza lag sau faza de latenţă în care nu are loc o creştere substanţială a
numărului de celule. Aceasta este etapa în care celulele se adaptează la condiţiile de
mediu, are loc o creştere importantă (de 3-10 ori) a concentraţiei în acid ribonucleic.
Are loc o biosinteză a enzimelor induse sau adaptive şi creşterea în dimensiune a
celulelor. Această fază, în cazul drojdiilor, durează 2 ore şi se poate reduce dacă se
repetă cultivarea celulelor pe medii cu aceeaşi compoziţie.
Deci cunoaşterea comportării celulelor în această perioadă face ca, în practică,
când urmărim înmulţirea celulelor, să se recurgă la cultivarea repetată a
microorganismelor în medii cu aceeaşi compoziţie cu cea a mediului industrial în care
acestea urmează să fie cultivate.
BC este perioada de declanşare a înmulţirii - faza de accelerare a creşterii. În
această fază celulele cresc în dimensiune, ceea ce favorizează declanşarea procesului
de reproducere.
După această etapă urmează faza exponenţială sau faza logaritmică care are
importanţă deoarece în acest interval de timp are loc creşterea cu viteză maximă a
celulelor.
44
la obţinerea inoculului folosit industrial în toate biotehnologiile în care este important
să obţinem rapid un număr cât mai mare de celule.
Faza exponenţială va depinde de natura microorganismelor şi de condiţiile de
mediu.
La un moment dat viteza de înmulţire începe să scadă. DE reprezintă faza de
încetinire a creşterii, care se explică printr-o modificare a conţinutului în factori de
creştere.
Urmează faza EF – faza staţionară de creştere – în care nu mai are loc o
creştere a numărului de celule şi dacă se face o numărare globală a tuturor celulelor
apare un echilibru între numărul celulelor nou formate şi numărul celulelor care mor.
Faza se explică prin scăderea concentraţiei în substanţe nutritive, epuizarea din mediu
a unor substanţe cu rol vital (bioelemente, factori de creştere), acumularea în mediu a
unor substanţe rezultate prin catabolism care exercită un efect toxic asupra celulelor
care au produs aceste substanţe.
Perioada staţionară este succedată de perioada FG - faza de declin care constă
în scăderea treptată a numărului de celule vii ca urmare a pierderii viabilităţii acestora
(prin procese de autoliză).
Din punct de vedere fiziologic, fazele AB, BC, CD, DE se caracterizează prin
creşterea celulelor şi prin biosinteza produşilor primari de metabolism. Aceste faze
formează tropofaza.
Fazele EF, FG formează idiofaza caracteristică perioadei în care celulele
sintetizează produsele secundare de metabolism care nu au rol vital pentru celulă
(toxine, antibiotice, alcaloizi, alţi compuşi).
Faza staţionară are importanţă în practică când se urmăreşte prelungirea
timpului aferent deoarece se doreşte păstrarea în stare vie a microorganismelor din
culturile pure.
În condiţii de limitare a mediului nutritiv, prin acumularea unor compuşi de
catabolism, au loc modificări de pH şi rH intracelular la valori care devin optime
pentru enzimele proteolitice intracelulare. Se produce o eliberare a acestor proteaze din
lizozomi şi are loc moartea, inactivarea prin autoliză (solubilizarea sub acţiunea
enzimelor proprii).
Dacă menţinem o cultură de microorganisme într-un mediu un timp îndelungat,
se ajunge la o autosterilizare a mediului.
Pentru a evita moartea tuturor celulelor din cultura pură, celulele rămase vii se
transferă prin repicare într-un mediu proaspăt. La repicare se introduc numai celule de
microorganisme nu şi mediu, pentru a evita suplimentarea mediului proaspăt cu
substanţe toxice.
45
S-a constatat că în faza de declin apare o uşoară stimulare a creşterii numărului
de celule explicabilă prin aceea că celulele vii pot să folosească în nutriţie substanţe
care s-au eliberat prin liza celulelor moarte.
Cunoscând evoluţia dezvoltării în practica cultivării microorganismelor cu
importanţă industrială, se aplică diferite metodologii de cultivare. Dintre utilizările
culturilor pure în care ţinem cont de această dinamică face parte şi prepararea
inoculului.
Inoculul reprezintă biomasa de celule aparţinând unei culturi pure – celule vii şi
active folosite într-o anumită concentraţie drept starter (cultură de pornire) pentru
declanşarea proceselor fermentative.
Pentru obţinerea cantităţii necesare de inocul, în industrie, se urmăreşte o
înmulţire succesivă a celulelor pornind de la o cultură pură în stadiu de cultivare în
eprubetă şi ajungând la volume folosite în producţie.
Transferul celulelor în acest scop se face în volume de lichid din ce în ce mai
mari, iar cantitatea de transfer este în medie :
- 1-3 % când preparăm inocul pentru bacterii;
- 3-5 % când preparăm inocul pentru drojdii;
- 5-10 % când preparăm inocul pentru mucegaiuri.
Creşterea procentului de volum transferat este explicabilă prin variaţia
dimensiunii celulelor. La prepararea de inocul transferul se realizează din mediul steril
cu aceeaşi compoziţie ca a mediului ce urmează a fi fermentat pentru a elimina faza de
adaptare.
Durata de timp între două multiplicări succesive este echivalentă cu durata fazei
exponenţiale de creştere (transferul dintr-un volum mai mic într-un volum mai mare se
face la sfârşitul fazei exponenţiale de creştere).
46
În funcţie de natura microorganismului pe care dorim să-l obţinem se fac studii la nivel
pilot (industrial) pentru menţinerea tropofazei (când urmărim creşterea de
celule). Dacă se urmăreşte obţinerea unui produs intracelular, corelat cu
creşterea microorganismului, se prelungeşte faza staţionară. Dacă scopul
cultivării este obţinerea de produşi secundari de metabolism se ajunge la un
randament maxim de acumulare a produşilor respectivi prin prelungirea fazei
staţionare. sau dacă nu cultivarea este prelungită până se obţine randamentul
maxim în produsul ce urmează să fie obţinut.
Metodele continue sunt tehnici care se pretează la automatizare, se lucrează cu
medii lichide, iar cultivarea se face pe principiul chemostatului sau turbidistatului.
Principiul chemostatului presupune menţinerea constantă a compoziţiei
mediului cu o rată de alimentare stabilită experimental. Concomitent se elimină mediul
fermentat (cu celule) ceea ce asigură continuitatea procesului.
Când se foloseşte principiul turbidistatului, continuitatea procesului este dirijată
şi presupune determinarea pe cale turbidimetrică a concentraţiei de celule aflate la un
moment dat în vasul de cultură.
47
Stimularea activităţii fiziologice şi de biosinteză a microorganismelor se poate
realiza şi prin metode de bioinginerie care constau în modificări în genomul celular
(modificări genetice în structura acizilor nucleici), în transfer de gene, de plasmide,
modificări structurale genetice. Aceste metode conduc la obţinerea de mutanţi –
microorganisme care au suferit transformări genotipice asociate de obicei cu
transformări fenotipice (modificări de formă).
În acest scop se folosesc agenţi mutageni dintre care cei mai utilizaţi sunt:
• agenţi mutageni fizici (radiaţii ultraviolete, λ = 250 nm) care pot produce
transformări în structura secundară a acizilor nucleici;
• agenţi mutageni chimici (β -propiolactona, β -naftolul, antibiotice).
Prin mutaţii se pot selecta agenţi cu performanţe de biosinteză mult superiori
faţă de celula parentală (cantitatea de penicilină obţinută din mutant de Penicillium
este mult mai mare).
Pentru conservarea culturilor valoroase în practica de laborator se folosesc
diferite tehnici care urmăresc prelungirea fazei staţionare de creştere un timp cât mai
îndelungat şi se evită apariţia fazei de declin care poate duce la pierderea culturii.
Această prelungire se poate realiza astfel:
• prin scăderea temperaturii faţă de temperatura optimă (sunt încetinite
procesele de metabolism) – procedeele de păstrare în domeniul de refrigerare sau
păstrarea culturilor congelate.
• prin reducerea cantităţii de apă liberă şi menţinerea culturilor în stare uscată –
procedee aplicate la conservarea bacteriilor sporulate şi a mucegaiurilor.
• prin privare de O2, condiţie în care, după ce a avut loc dezvoltarea culturii în
condiţii de aerobioză, biomasa se acoperă cu un strat de ulei de parafină (vaselina) de 1
cm înălţime deasupra culturii, care asigură păstrarea culturilor ani de zile.
Cea mai modernă tehnologie de păstrare a culturilor pure este liofilizarea.
Celulele vii sunt suspendate într-un lichid protector (glicerol 10% sau amestec de 3%
glutamat de sodiu, 3% dextran, 6% zaharoză în proporţie de 1:1:2) şi se supun
congelării astfel: se face congelarea lentă în fiole de sticlă până la -20°C după care
urmează o congelare rapidă la -70°C, urmată de uscarea celulelor în vid până când
umiditatea acestora ajunge la 5%. Apoi fiolele de sticlă se efilează şi se închid ermetic.
Culturile liofilizate îşi menţin procentul de viabilitate ridicat ani de zile.
În practica de laborator, când numărul de celule este mic, se folosesc tehnici de
repicare care constau în transferul celulelor din mediul epuizat pe mediu proaspăt.
Culturile pure standard (cu anumite caractere) precum şi culturi cu performanţă
în biosinteză sunt păstrate în colecţii numite micoteci – întâlnite în mari laboratoare de
cercetare, în laboratoare de microbiologie uzinale, în instituţii de învăţământ superior.
48