Sunteți pe pagina 1din 11

Mediul conţine substanţe inhibitoare pentru alte microorganisme fără ca acestea

să deranjeze dezvoltarea microorganismelor pe care dorim să le selectăm.


Aceste medii sunt folosite la analiza microbiologică a alimentelor, când din
totalul microorganismelor aflate în produs pot fi puse în evidenţă anumite grupe.
BLBV este mediul selectiv pentru bacterii coliforme şi conţine bulion de carne,
lactoză, bila, verde briliant. Factorul selectiv este bila la care bacteriile coliforme sunt
adaptate, în timp ce alte bacterii care pot să fermenteze lactoza sunt inhibate.
Mustul de malţ cu 60 % zahăr reprezintă mediul selectiv pentru drojdii
osmotolerante. Celelalte drojdii, neadaptate, suferă plasmoliza.
Dacă într-un mediu în care există celule de drojdie şi bacterii se adaugă
actidionă, drojdiile sunt inhibate şi se dezvoltă bacteriile.
În funcţie de compoziţie mediile de cultură pot fi:
- anorganice – în care substanţele nutritive se adaugă sub formă de săruri;
sunt destinate microorganismelor litotrofe (independente de compuşii organici) –
microflorei din sol.
- organice – foarte diversificate şi folosesc diferitele produse de natură
organică, animală sau vegetală, care după sterilizare servesc pentru cultivarea
microorganismelor.
Mediile organice de origine animală pot fi sub formă lichidă (bulionul de carne,
laptele, sângele, urina) sau sub formă solidă (carnea fiartă, ficatul, ouăle).
Mediile organice de origine vegetală se pot obţine în formă lichidă (mustul de
malţ, sucuri de fructe, infuzii de plante, mustul de struguri), sau în formă solidă
(fructe, legume, pâine).
- medii de cultură mixte a căror sursă hidrocarbonată este de natură
organică iar nutriţia minerală şi azotată este asigurată de săruri anorganice.
Mediul Czapek este folosit pentru identificarea caracterelor morfologice ale
mucegaiurilor, are o compoziţie foarte bine definită. Sursa de carbon constă în
zaharoză, sursa de azot este constituită din KNO3, iar fosfaţii de potasiu, MgSO4
reprezintă sursele minerale.
După consistenţa mediilor de cultură, acestea pot fi:
- medii de cultură lichide – se folosesc pentru cultivarea microorganismelor
facultativ anaerobe şi pentru microorganismele aerobe când li se oferă o
suprafaţă mare de contact cu aerul sau în culturi statice prin agitare şi
barbotare de aer steril.
- medii de cultură solide – se folosesc pentru microorganismele aerobe,
pentru creşterea mucegaiurilor şi sunt de obicei medii naturale, cu umiditate
favorabilă dezvoltării microorganismelor.

38
- medii de cultură solidificate – provin din medii lichide prin adăugarea
unor substanţe de solidificare. Solidificarea se poate face cu agenţi de
solidificare: agar – agar (geloza), gelatina, silicagel, carboximetilceluloza.
Cel mai utilizat agent de solidificare este agar – agarul (geloza) – un polizaharid
format din agaroză şi agaropectina, izolat sau obţinut din alge (genul Gelidium). Din
punct de vedere chimic este format din D – galactoză şi 3,6 dehidrogalactoză, legate
1,3 sau 1,4. Agarul are proprietăţi absorbante. Păstrat în apă, nu se solubilizează. Prin
absorbţia apei îşi măreşte volumul de 16 – 17 ori. Se topeşte la temperaturi mai mari
de 100°C în apă şi se transformă în gel prin răcire la temperatura de 45°C. Pentru
solidificarea mediilor se adaugă 1,5 – 2 g la 100 ml mediu lichid.
Agarul nu este degradabil din punct de vedere biologic, de aceea este ideal
pentru cultivarea microorganismelor. Mediile solidificate cu agar se folosesc pentru
cultivarea şi numărarea microorganismelor deoarece pe medii solidificate celulele
formează colonii caracteristice distincte. Agarul, în mediu foarte acid (pH < 4,5), dacă
este supus unor temperaturi de sterilizare, îşi pierde proprietăţile de gel. În concluzie,
în cazul mediului cu pH acid întâi se face sterilizarea mediului, apoi se adaugă soluţie
acidă (acid organic sau anorganic) pentru corectarea pH-ului.
Gelatina, din punct de vedere chimic, este o proteină cu structură asemănătoare
colagenului obţinut din piele de porc, cartilagii şi oase. În apă rece îşi măreşte volumul
de 3-6 ori şi se fluidifică în apă caldă uşor iar transformarea în gel are loc foarte lent
la temperaturi sub 30ºC.
Pentru solidificarea mediului de cultură cu gelatină se adaugă 12-15 g la 100
ml. La temperaturi ridicate de sterilizare (mai mari de 110ºC), îşi pierde proprietăţile
de gelifiere. Mediile cu gelatină se sterilizează la temperaturi de 100 – 105ºC. Gelatina
poate fi hidrolizată enzimatic de microorganisme care produc proteaze extracelulare.
Gelatina se foloseşte pentru medii destinate cultivării drojdiilor, pentru identificarea
activităţii proteolitice a microorganismelor.
Ceilalţi agenţi de solidificare au o arie mai restrânsă de folosire, mai ales pentru
mediile sintetice anorganice.
În tehnica microbiologică se folosesc medii gata preparate obţinute de firme
autorizate care pot fi livrate în diferite forme (cel mai adesea se prezintă sub formă de
praf sau pulbere). Pe sticlă se menţionează compoziţia mediului şi cantitatea de
pulbere care trebuie dozată la 1l de apă pentru obţinerea mediului de cultură. După
dizolvare se face sterilizarea mediului.
Mediile fermentative sunt destinate cultivării la scară industrială a
microorganismelor şi majoritatea lor sunt medii lichide care se sterilizează mai uşor.
Aceste medii sunt ieftine deoarece conţin o cantitate mică de substanţe dizolvate şi se
pretează procesului de automatizare.

39
La obţinerea mediilor fermentative se folosesc pe scară largă produsele
secundare rezultate din industria alimentară.
Ca surse hidrocarbonate se folosesc:
- melasă (produs secundar rezultat la fabricarea zahărului) ce conţine 60%
zahăr, săruri minerale, biotină;
- zer (4,5% lactoză);
- plămezi amidonoase (se obţin prin măcinarea cerealelor, fierberea, gelifierea
amidonului şi zaharificare);
- tărâţe (20 % amidon, săruri minerale, vitamine), în mediu lichid sau
solidificat. Tărâţele se amestecă cu apă şi alte ingrediente.
Sursele cel mai des folosite de azot sunt::
- făinuri proteice (de soia + amidon + azot proteic vegetal);
- făină de peşte;
- îngrăşământ complex cu 16 % azot, uree, (NH4)2SO4.
Surse de factori de creştere: extract de porumb (se obţine de la înmuierea
porumbului şi favorizează fermentaţia lactică), radicele de malţ sub formă de extract,
autolizat de drojdie, germeni de grâu, de porumb.
Diversitatea mediilor de cultură este datorată capacităţii de adaptare a
numeroaselor microorganisme întâlnite în habitaturile naturale dar şi faptului că prin
modificarea compoziţiei mediilor de cultură se pot obţine randamente superioare în
produşi de metabolism cu valoare economică.
Mediile de cultură sunt utilizate frecvent în tehnici microbiologice de laborator,
pentru izolarea, cultivarea şi întreţinerea culturilor pure şi pentru controlul
microbiologic al produselor alimentare.

40
CAPITOLUL IV
CULTURI PURE

Cultura pură reprezintă biomasa de celule de acelaşi tip provenită prin înmulţire
din o singură celulă situată într-un mediu nutritiv steril adecvat.
În cazul în care, pe un mediu solidificat, prin dezvoltarea unei celule unice s-a
obţinut o colonie, în cadrul coloniei biomasa dezvoltată reprezintă cultură pură.
Pentru perpetuarea şi întreţinerea purităţii culturilor, după obţinere, prin diferite
metode de izolare a culturii pure, celule de acelaşi fel se pot transfera în vase cu mediu
steril, transfer care se numeşte repicare şi conduce la obţinerea unei culturi pure.
Obţinerea culturilor pure are o importanţă deosebită pentru tehnicile
microbiologice şi în biotehnologii.
Izolarea în culturi pure permite identificarea şi caracterizarea morfologică şi
fiziologică a microorganismului izolat.
Pe culturi pure se fac studii pentru selecţionarea tulpinilor cu performanţe de
biosinteză şi sub formă de culturi pure se face întreţinerea şi conservarea culturilor
valoroase. În industria alimentară, în subramurile în care microorganismele sunt
folosite pentru obţinerea de produse alimentare acestea se folosesc sub formă de
cultură pură, condiţie obligatorie pentru a obţine produse cu o anumită calitate. Astfel,
în industria prelucrării laptelui, la fabricarea vinului, a spirtului, a berii, în panificaţie,
se folosesc culturi pure de microorganisme, care prezintă anumite proprietăţi
biotehnologice.

4.1 TEHNICI GENERALE DE IZOLARE DIN MEDII


NATURALE ŞI OBŢINEREA CULTURILOR PURE

Pentru obţinerea culturilor pure se aplică metode fizice, metode fizico-mecanice


şi metode biologice. În prima etapă de izolare, ştiind că densitatea celulelor în mediul
natural poate fi ridicată, se fac diluări ale suspensiilor de celule în ser fiziologic steril.
Tehnica de diluare folosită este tehnica diluţiilor decimale. Se folosesc eprubete cu ser
fiziologic steril ( 0,8 % NaCl) pentru a preveni turgescenţa celulelor.

• Metodele bazate pe tehnici de răspândire au la bază principiul răspândirii


celulelor prin diluare în medii lichide sau prin diseminare mecanică pe suprafaţa
mediilor sterile.
Metoda în strii foloseşte drept suprafaţă de răspândire mediul înclinat din două
trei eprubete, prin transferul de celule din mediul natural, prin realizarea succesivă de

41
striuri. Aceste metode se folosesc şi în cazul în care o cultură pură este contaminată în
perioada de păstrare cu microorganisme străine şi aceasta trebuie să fie salvată.
Metode scarificate
În placa Petri se repartizează un mediu de cultură adecvat (MMA/BCA) şi
după solidificarea mediului, cu firul ansei se recoltează celule din mediul natural şi se
execută trasări pe suprafaţa mediului, astfel încât diversele celule rămân distanţate
între ele. Prin termostatare 2-3 zile, din colonia care corespunde microorganismului ce
trebuie să fie izolat, se face repicare într-o eprubetă cu mediu solid înclinat şi astfel se
obţine o cultură pură.
Metoda culturală Koch este folosită în special pentru izolarea de drojdii. Ca
mediu de răspândire se foloseşte mustul de malţ cu gelatină repartizat în trei eprubete,
fluidificat şi menţinut la 40° C. Din mediul natural, de exemplu un must în fermentaţie,
se recoltează o ansă care se introduce succesiv în cele trei eprubete, cu agitare, care să
asigure desprinderea celulelor. După inoculare şi uniformizare, conţinutul fiecărei
eprubete se repartizează în câte o placă Petri; prin solidificare, celulele rămân fixate în
gel şi prin multiplicare vor forma colonii/clone izolate. În funcţie de densitatea
celulelor recoltate iniţial, în placa a doua sau a treia coloniile sunt suficient de
distanţate (2cm), pentru a putea face izolarea din colonia adecvată a culturii pure.

• Metode bazate pe tehnici de diluare


Din suspensia de celule din care dorim să facem izolarea se fac diluări în mediu
steril şi sub control microscopic se verifică dacă s-a făcut diluarea corespunzător şi la o
picătură de lichid se află o celulă.
Metoda Lindner este cea mai cunoscută metodă folosită la selectarea culturilor
pure de drojdii în industria fermentativă.
Pe o lamelă se plasează cu ajutorul unui toc cu peniţă topografică steril o serie
de picături. Apoi lamela se plasează cu picăturile în jos pe o lamă cu escavaţie. Apoi se
studiază la microscop şi se notează picătura care conţine o singură celulă. Cu ajutorul
unei hârtii de filtru sterilizată, luată cu o pensetă sterilă, se absoarbe picătura, prin
absorbţie va trece şi celula de drojdie. După ce se absoarbe această picătură, hârtia care
conţine celula se introduce într-o eprubetă care conţine must de malţ steril. Celula va
da naştere prin înmulţire în condiţii favorabile la o biomasă care va reprezenta cultura
pură.
Metoda Hansen constă în diluări decimale în mediu steril, după care se
numără celulele din 1 ml diluţie şi se realizează însămânţarea pe mediu nutritiv
solidificat pentru obţinerea de colonii.
Pentru izolarea culturilor de mucegaiuri se folosesc metode scarificate de
antrenare a sporilor în plăci cu must de malţ agar. O altă metodă care ne permite
obţinerea de colonii izolate de mucegaiuri este metoda inundării. În placa Petri cu

42
must de malţ agar se adaugă câţiva ml din o suspensie diluată, cu o concentraţie mică
de spori; după clătirea suprafeţei mediului, lichidul se scurge iar unii spori, cei reţinuţi
de suprafaţa mediului, conduc la colonii izolate.
Metoda lui Naumov izolează picături de MMA în care în prealabil s-au
introdus un mediu restrâns de spori. În mediu încă fierbinte, după inoculare, se adaugă
picături pe capacul plăcii Petri, iar după solidificare şi cultivare se alege picătura de
mediu solid care prezintă o singură colonie.
Metoda cu micromanipulator este o metodă mecanică. Micromanipulatorul
este alcătuit dintr-un sistem de tuburi capilare cu care se poate lucra sub microscop, cu
posibilitatea de a recolta prin absorbţie în microcapilar unele celule izolate. Apoi
celula este introdusă în mediu nutritiv adecvat.

• Metodele biologice au la bază principiul proprietăţilor diferenţiate ale culturii


ce urmează a se izola (proprietăţi diferenţiate de ale microorganismelor asociate). Ca
proprietăţi distincte amintim comportarea faţă de temperatură, pH, relaţia faţă de
oxigen, rezistenţa la plasmoliză sau rezistenţa la anumite substanţe chimice sau
antibiotice.
Metoda Burri este metoda clasică care constă în izolarea bacteriilor aerobe de
cele anaerobe prin metode biologice.
Din suspensia de microorganisme în care se află în amestec aerobi şi anaerobi
se face însămânţare în mediul BCA (bulion de carne cu agar) fluidificat şi răcit la
45°C, turnând într-un tub de sticlă prevăzut la partea inferioară cu un dop de cauciuc.
Se acoperă apoi tubul cu dop de vată şi se termostatează. În zona unde mediul este în
contact cu aerul se vor dezvolta bacteriile aerobe. În restul mediului vor fi fixate
bacteriile anaerobe.
Pentru a înţelege modul de înmulţire a microorganismelor în culturile pure este
important să cunoaştem comportarea culturii într-un mediu nutritiv steril limitat
cantitativ.

4.2 DINAMICA DE DEZVOLTARE A CELULELOR


MICROBIENE
Log N
Dacă într-un mediu nutritiv lichid (steril ) este inoculat un număr de celule X 0
D E F se face determinarea
care aparţin unei culturi pure şi la diferite intervale de timp
numărului de celule rezultat prin înmulţire, se poate aprecia viteza de înmulţire şi se
pot distinge etapele de dezvoltare ale culturii precum şi valoarea nutritivă a
componentelor din mediu.
G

43
A
B C

Timpul
Figura 6: Dinamica de dezvoltare a celulelor microbiene

AB este faza lag sau faza de latenţă în care nu are loc o creştere substanţială a
numărului de celule. Aceasta este etapa în care celulele se adaptează la condiţiile de
mediu, are loc o creştere importantă (de 3-10 ori) a concentraţiei în acid ribonucleic.
Are loc o biosinteză a enzimelor induse sau adaptive şi creşterea în dimensiune a
celulelor. Această fază, în cazul drojdiilor, durează 2 ore şi se poate reduce dacă se
repetă cultivarea celulelor pe medii cu aceeaşi compoziţie.
Deci cunoaşterea comportării celulelor în această perioadă face ca, în practică,
când urmărim înmulţirea celulelor, să se recurgă la cultivarea repetată a
microorganismelor în medii cu aceeaşi compoziţie cu cea a mediului industrial în care
acestea urmează să fie cultivate.
BC este perioada de declanşare a înmulţirii - faza de accelerare a creşterii. În
această fază celulele cresc în dimensiune, ceea ce favorizează declanşarea procesului
de reproducere.
După această etapă urmează faza exponenţială sau faza logaritmică care are
importanţă deoarece în acest interval de timp are loc creşterea cu viteză maximă a
celulelor.

xt = x02n – ecuaţia generală de înmulţire;

xt - numărul de celule la un moment t;


n - numărul de diviziuni;
x0 – numărul iniţial de celule inoculate.

Numeroase cercetări urmăresc să se obţină un mediu de cultură în care faza


exponenţială să aibă o pantă cât mai mare, să dureze mai puţin - condiţii care se impun

44
la obţinerea inoculului folosit industrial în toate biotehnologiile în care este important
să obţinem rapid un număr cât mai mare de celule.
Faza exponenţială va depinde de natura microorganismelor şi de condiţiile de
mediu.
La un moment dat viteza de înmulţire începe să scadă. DE reprezintă faza de
încetinire a creşterii, care se explică printr-o modificare a conţinutului în factori de
creştere.
Urmează faza EF – faza staţionară de creştere – în care nu mai are loc o
creştere a numărului de celule şi dacă se face o numărare globală a tuturor celulelor
apare un echilibru între numărul celulelor nou formate şi numărul celulelor care mor.
Faza se explică prin scăderea concentraţiei în substanţe nutritive, epuizarea din mediu
a unor substanţe cu rol vital (bioelemente, factori de creştere), acumularea în mediu a
unor substanţe rezultate prin catabolism care exercită un efect toxic asupra celulelor
care au produs aceste substanţe.
Perioada staţionară este succedată de perioada FG - faza de declin care constă
în scăderea treptată a numărului de celule vii ca urmare a pierderii viabilităţii acestora
(prin procese de autoliză).
Din punct de vedere fiziologic, fazele AB, BC, CD, DE se caracterizează prin
creşterea celulelor şi prin biosinteza produşilor primari de metabolism. Aceste faze
formează tropofaza.
Fazele EF, FG formează idiofaza caracteristică perioadei în care celulele
sintetizează produsele secundare de metabolism care nu au rol vital pentru celulă
(toxine, antibiotice, alcaloizi, alţi compuşi).
Faza staţionară are importanţă în practică când se urmăreşte prelungirea
timpului aferent deoarece se doreşte păstrarea în stare vie a microorganismelor din
culturile pure.
În condiţii de limitare a mediului nutritiv, prin acumularea unor compuşi de
catabolism, au loc modificări de pH şi rH intracelular la valori care devin optime
pentru enzimele proteolitice intracelulare. Se produce o eliberare a acestor proteaze din
lizozomi şi are loc moartea, inactivarea prin autoliză (solubilizarea sub acţiunea
enzimelor proprii).
Dacă menţinem o cultură de microorganisme într-un mediu un timp îndelungat,
se ajunge la o autosterilizare a mediului.
Pentru a evita moartea tuturor celulelor din cultura pură, celulele rămase vii se
transferă prin repicare într-un mediu proaspăt. La repicare se introduc numai celule de
microorganisme nu şi mediu, pentru a evita suplimentarea mediului proaspăt cu
substanţe toxice.

45
S-a constatat că în faza de declin apare o uşoară stimulare a creşterii numărului
de celule explicabilă prin aceea că celulele vii pot să folosească în nutriţie substanţe
care s-au eliberat prin liza celulelor moarte.
Cunoscând evoluţia dezvoltării în practica cultivării microorganismelor cu
importanţă industrială, se aplică diferite metodologii de cultivare. Dintre utilizările
culturilor pure în care ţinem cont de această dinamică face parte şi prepararea
inoculului.
Inoculul reprezintă biomasa de celule aparţinând unei culturi pure – celule vii şi
active folosite într-o anumită concentraţie drept starter (cultură de pornire) pentru
declanşarea proceselor fermentative.
Pentru obţinerea cantităţii necesare de inocul, în industrie, se urmăreşte o
înmulţire succesivă a celulelor pornind de la o cultură pură în stadiu de cultivare în
eprubetă şi ajungând la volume folosite în producţie.
Transferul celulelor în acest scop se face în volume de lichid din ce în ce mai
mari, iar cantitatea de transfer este în medie :
- 1-3 % când preparăm inocul pentru bacterii;
- 3-5 % când preparăm inocul pentru drojdii;
- 5-10 % când preparăm inocul pentru mucegaiuri.
Creşterea procentului de volum transferat este explicabilă prin variaţia
dimensiunii celulelor. La prepararea de inocul transferul se realizează din mediul steril
cu aceeaşi compoziţie ca a mediului ce urmează a fi fermentat pentru a elimina faza de
adaptare.
Durata de timp între două multiplicări succesive este echivalentă cu durata fazei
exponenţiale de creştere (transferul dintr-un volum mai mic într-un volum mai mare se
face la sfârşitul fazei exponenţiale de creştere).

4.3 METODE DE CULTIVARE A MICROORGANISMELOR

Metodele discontinue (staţionare) folosesc volume limitate de mediu.

46
În funcţie de natura microorganismului pe care dorim să-l obţinem se fac studii la nivel
pilot (industrial) pentru menţinerea tropofazei (când urmărim creşterea de
celule). Dacă se urmăreşte obţinerea unui produs intracelular, corelat cu
creşterea microorganismului, se prelungeşte faza staţionară. Dacă scopul
cultivării este obţinerea de produşi secundari de metabolism se ajunge la un
randament maxim de acumulare a produşilor respectivi prin prelungirea fazei
staţionare. sau dacă nu cultivarea este prelungită până se obţine randamentul
maxim în produsul ce urmează să fie obţinut.
Metodele continue sunt tehnici care se pretează la automatizare, se lucrează cu
medii lichide, iar cultivarea se face pe principiul chemostatului sau turbidistatului.
Principiul chemostatului presupune menţinerea constantă a compoziţiei
mediului cu o rată de alimentare stabilită experimental. Concomitent se elimină mediul
fermentat (cu celule) ceea ce asigură continuitatea procesului.
Când se foloseşte principiul turbidistatului, continuitatea procesului este dirijată
şi presupune determinarea pe cale turbidimetrică a concentraţiei de celule aflate la un
moment dat în vasul de cultură.

4.4 CONSERVAREA CULTURILOR PURE

În momentul în care au fost obţinute dintr-un mediu natural, în prima etapă,


culturile pure se numesc izolate. Această denumire însoţeşte cultura până când, pe
baza studiului morfologic şi fiziologic a izolatului pe mediu standard, se face
identificarea pe baza criteriilor taxonomice şi ştim că acest izolat aparţine unei specii.
Odată identificată cultura, ea poate fi comparată cu cultura standard ce
caracterizează specia şi sunt studiate anumite proprietăţi ale tulpinii respective, în
scopul evidenţierii unor proprietăţi valoroase. În natură numeroase tulpini care aparţin
aceleiaşi specii pot prezenta caractere fiziologice diferenţiate.
În scopul selectării tulpinilor cele mai valoroase dintre cele aparţinând aceleiaşi
specii izolate din natură , în laboratorul de microbiologie se aplică metode de
screening (ecranare) specifice. Prin screening se aplică criterii de selectare din ce în ce
mai riguroase alegând tulpina cea mai bună.
După selectare, în scopul stimulării activităţii de metabolism în sensul dorit, se
practică fie metode culturale, prin care se modifică condiţiile de cultivare (prin
modificarea compoziţiei mediului, a temperaturii, a pH-ului, a gradului de aerare,
cultivare staţionară, cultivare pe agitator etc). Prin metode culturale se produce o
creştere însemnată a activităţii fiziologice a microorganismelor, aplicându-se tehnici
pentru obţinerea de enzime, acizi, alcooli (produse de catabolism).

47
Stimularea activităţii fiziologice şi de biosinteză a microorganismelor se poate
realiza şi prin metode de bioinginerie care constau în modificări în genomul celular
(modificări genetice în structura acizilor nucleici), în transfer de gene, de plasmide,
modificări structurale genetice. Aceste metode conduc la obţinerea de mutanţi –
microorganisme care au suferit transformări genotipice asociate de obicei cu
transformări fenotipice (modificări de formă).
În acest scop se folosesc agenţi mutageni dintre care cei mai utilizaţi sunt:
• agenţi mutageni fizici (radiaţii ultraviolete, λ = 250 nm) care pot produce
transformări în structura secundară a acizilor nucleici;
• agenţi mutageni chimici (β -propiolactona, β -naftolul, antibiotice).
Prin mutaţii se pot selecta agenţi cu performanţe de biosinteză mult superiori
faţă de celula parentală (cantitatea de penicilină obţinută din mutant de Penicillium
este mult mai mare).
Pentru conservarea culturilor valoroase în practica de laborator se folosesc
diferite tehnici care urmăresc prelungirea fazei staţionare de creştere un timp cât mai
îndelungat şi se evită apariţia fazei de declin care poate duce la pierderea culturii.
Această prelungire se poate realiza astfel:
• prin scăderea temperaturii faţă de temperatura optimă (sunt încetinite
procesele de metabolism) – procedeele de păstrare în domeniul de refrigerare sau
păstrarea culturilor congelate.
• prin reducerea cantităţii de apă liberă şi menţinerea culturilor în stare uscată –
procedee aplicate la conservarea bacteriilor sporulate şi a mucegaiurilor.
• prin privare de O2, condiţie în care, după ce a avut loc dezvoltarea culturii în
condiţii de aerobioză, biomasa se acoperă cu un strat de ulei de parafină (vaselina) de 1
cm înălţime deasupra culturii, care asigură păstrarea culturilor ani de zile.
Cea mai modernă tehnologie de păstrare a culturilor pure este liofilizarea.
Celulele vii sunt suspendate într-un lichid protector (glicerol 10% sau amestec de 3%
glutamat de sodiu, 3% dextran, 6% zaharoză în proporţie de 1:1:2) şi se supun
congelării astfel: se face congelarea lentă în fiole de sticlă până la -20°C după care
urmează o congelare rapidă la -70°C, urmată de uscarea celulelor în vid până când
umiditatea acestora ajunge la 5%. Apoi fiolele de sticlă se efilează şi se închid ermetic.
Culturile liofilizate îşi menţin procentul de viabilitate ridicat ani de zile.
În practica de laborator, când numărul de celule este mic, se folosesc tehnici de
repicare care constau în transferul celulelor din mediul epuizat pe mediu proaspăt.
Culturile pure standard (cu anumite caractere) precum şi culturi cu performanţă
în biosinteză sunt păstrate în colecţii numite micoteci – întâlnite în mari laboratoare de
cercetare, în laboratoare de microbiologie uzinale, în instituţii de învăţământ superior.

48

S-ar putea să vă placă și