Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Ultimul deceniu al secolului XX-lea ştiinţa oenologică s-a impus printr-o amplă
desfăşurare a investigaţiilor, ce ţin de unii microcomponenţi endogeni cu proprietăţi
deosebit de importante pentru organismul uman. În aspect geografic, aceste cercetări
cuprind toate continentele unde se cultivă viţa de vie. Substanţele, care au focalizat în
mod deosebit atenţia cercetătorilor oenologi, chimişti, iginienişti, fa rmacişti sunt :
resveratrolul și proantocianidinele-componenți de natură fenolică, laitmotivul
binecunoscutului ―paradox francez‖( Scutaru I., 1995).
De mai bine de zece ani, britanicii şi americanii încearcă să dezlege miracolul
francez. Deşi francezii au o dieta bogată în grăsimi, unt, brînză, carne, foie gras(ficat
de pasăre gras, produs printr-o tehnologie specială) şi toate deliciile din fructe pe care
inima le cere, tot ei sunt cei care suferă cel mai puţin de boli de inimă.Mult mai puţini
francezi suferă de cancer intestinal sau boli reumatice decît americanii, mai puţin au
probleme la circulaţia sîngelui, au şanse mai puţine să se îmbolnăvească de
osteoporoză şi cu mult mai puţini tineri francezi decît cei americani au probleme de
digestie sau fac alergie la anumite alimente. În acest context e de menţionat şi
problema obezităţii :doar 10% dintre francezi sunt declaraţi supraponderali, în timp ce
22% dintre britanici și 33% dintre americani sunt declaraţi obezi.
Compuşii biologici activi descoperiţi în vinul roşu, alune sau alte produse
vegetale au prezentat, în urma cercetărilor, capacităţi de prelungire a duratei de
activitate vitală la organisme cu regim limitat de calorii.
Savantul David Sinclair, doctor în ştiinţe medicale şi cercetător la Harvard
Medical School, a observat în studiile sale că resveratrolul și proantocianidinele au un
puternic efect antioxidant și anticoagulator, împiedicînd blocarea vaselor
sangvine,care este cea mai frecventă cauză a atacurilor cardiace şi congestiilor
cerebrale.
Studiile efectuate la Universitatea din Harvard explică, într -o ultimă măsură, de
ce persoanele care consumă moderat vin ro şu alături de fructe, legume şi cărnoase(nu
grase) prezintă un risc minim în ceea ce priveşte accidentele cardio -vasculare.
Această descoperire ar putea duce la crearea unor noi medicamente sau aditive
alimentare pentru prelungirea durata vieţii, pentru pr evenirea sau tratarea maladiilor
cardiovasculare şi celor legate de îmbatrînire(Gaina B.,Roman O., Bourzeix M. et al.,
2007).
1
1. Rolul curativ şi nutritiv al compuşilor biologic activi din struguri şi vin
Încă din cele mai vechi timpuri în medicină se foloseşte tratamentul cu struguri.
Razes din Babilon (a. 950 p. Ch.) şi Hipocrate din Grecia Antică foloseau pe larg
strugurii şi mustul la tratarea multor boli.O utilizare mai amplă datează din secolul al
XlX-lea, cînd ampeloterapia, bazată pe rezultatele obţinute în medicină, biologie,
biochimie se aplică pe larg în Franţa, Germania, Italia, Elveţia.
În Moldova leagănul ampeloterapiei este oraşul balnear Camenca, unde la
începutul secolului al XlX-lea contele P. H. Vihtphenschtein a folosit pantele sud -
vestice ale Nistrului pentru cultivarea soiurilor de masă aduse din Franţa, Italia şi
Elveţia cu înalte proprietăţi curative. Contele a deschis pe teritoriul moşiei sale un
spital, în care se aplica ampeloterapia la tratarea invalizilor războiului ruso -francez
din 1812. În prezent, pe locul unde se află acest spital mic a fost construit un
sanatoriu cu peste 500 de locuri. Aici se aplică pe larg ampeloterapia şi se tratează
pacienţi din toate ţările fostei U.R.S.S. (KARPOV S., 1997). Conform rezultatelor
obţinute, bobiţele de struguri exercită asupra organismului diferite acţiuni: diuretică,
purgativă, sudorifică şi, după cum s-a mai menţionat, ameliorează schimbul de
substanţe şi normalizează tensiunea arterială. Ampeloterapia se recomandă la tr atarea
anemiei, astmului bronhic, a hemoroizilor, bolilor hepatice de rinichi etc. Este
necesar să menţionăm că strugurii sunt contraindicaţi în cazul ulcerului gastric şi
duodenal, bolilor tractului intestinal, diabetului zaharat, obezităţii , iar în cazul
acidităţii ridicate a stomacului vinul se consumă atent, selectîndu -se vinuri cu
aciditate scăzută.
Vinurile de struguri conţin cantităţi minime de vitamine, care nu pot satisface
pe deplin cerinţele organismului, însă diversitatea şi acţiunea complexă a vitaminelor
determină importanţa lor. Vitaminele B 1 , B 2 , B 6 , B 12 , PP şi acidul pantotenic sunt
prezente în cantităţi ce satisfac aproximativ 10% din necesităţile zilnice ale omului.
Biotina şi acidul folic se găsesc într-o măsură mai mică, iar mezoinozitul —în
cantităţi ce corespund aproximativ necesarului zilnic al omului. În vinurile roşii multe
vitamine (mai ales vitamina P) se găsesc în cantităţi mai mari comparativ cu cel e
albe. Substanţele tanante din struguri şi vinurile roşii posedă acţiune antiradioactivă,
iar pectina stimulează eliminarea din organism a stronţiului.
În vin s-au descoperit multiple microelemente, dintre care 24 de elemente,
inclusiv mangan, zinc, rubidiu, fluor, vanadiu, iod, titan, cobalt etc. care sunt de o
importanţă vitală, cînd trec din struguri în vin. Dintre substanţele minerale cele mai
2
mari cantităţi (până la 4 g/l) se întâlnesc în vinurile supuse fermentării pe boştină, în
special în vinurile roşii seci și de tip Madeira. Predominant este potasiul şi fosforul,
care joacă un rol important la reglarea echilibrului acido - alcalin şi prevenirea
deficitului în schimbul de săruri. Vinurile albe seci conţin mai puţine substanţe
minerale - pînă la 2 g/l.
S-a dovedit că vinul înlătură oboseala organismului, intensifică activitatea
slăbită a inimii. Bunăoară, pentru întreţinerea activităţii slăbite a inimii împreună cu
alte remedii profesorul Zaharin G. A. aplica şi vinul de struguri. Iar cunoscutul
medic, profesor al Universităţi din Moscova, Golubev N., timp de 50 de ani a
practicat vindecarea cu vin de struguri. El considera că cea mai bună băutură pentru
ridicarea tonusului vital şi a activităţii slăbite a inimii este vinul spumant.La
vindecarea bolnavilor epuizaţi şi slăbiţi el folosea vinurile tari de tip Madeira şi
Portwein, prescriindu-le doar cîteva linguri pe zi. Vinurile albe seci posedă, după
părerea lui, acţiune tonică asupra sistemului nervos şi a inimii şi se pot prescr ie
bolnavilor în cantitate de pînă la 0,5 1 pe zi.
La tratarea cu vin este important să se ţină cont de starea organismului şi
posibilele contraindicaţii. La Institutul de Cercetări Ştiinţifice a Metodelor Fizice de
Tratament şi Medicină Climatologică „I. M. Secenov‖ din lalta s -a acumulat o
experienţă pozitivă de tratare cu vin a bolnavilor cardio -vasculari. S-a demonstrat că
vinurile naturale din struguri acţionează favorabil asupra oamenilor de vârstă
avansată, normalizînd somnul, și totodată se consideră ca fiind secretul sănătății bune
și a vieții lungi, după cum afirma și Platon "Vinul este laptele bătrînilor".
În rezultatele cercetărilor efectuate asupra acţiunii de vindecare cu vinuri,
efectuate de doctorul Eilo (Bordeaux, Franţa), s -a făcut încercarea de a crea un cod
oenoterapeutic. În acest cod, de exemplu, se recomandă, în caz de anemie,consumarea
înainte de masă a vinurilor roşii seci în cantitate de două pahare ; în caz de
ateroscleroză se recomandă vinuri albe seci cu apă minerală în cantitate de 0, 5 l pe zi;
în caz de vome-vin spumant rece; în tuberculoză acută se recomandă vin roşu în
cantităţi mici; în diabet- vinuri de masă tinere; suferinzilor de avitaminoză li se
recomandă toate varietăţile de vinuri în cantităţi dieteti ce; în caz de dizenterie se
consumă vinuri roşii seci. Bolnavii de gripă, pneumonie şi pneumonie bronhică
deseori folosesc vinuri roşii fierbinţi cu zahăr, aşa-numitele «glintwein». În Moldova
este binecunoscută practica tratării răcelilor, guturaiului, gripelor cu vin îndulcit cu
miere şi picant cu piper roşu numit « izvar ».
3
Prof. Siniţkin V. a constatat că victimelor avariei de la Ce rnobîl le este foarte
indicat cîte un pahar de vin roşu sec zilnic. Astfel, în 3-5 săptămîni conţinutul
cesiului radioactiv din sânge scade de 3 ori. Aceasta ne vorbeşte despre efectul de
protecţie al vinurilor roşii împotriva contaminării radioactive.
4
2. Principalii compuşi biochimici activi din struguri şi vinuri
Rolul benefic al vinurilor roşii asupra organismului uman este bine cunoscut,
datorită conținutului în alcool, acizi organici, substanțe azotate, polifenoli, substanțe
minerale etc., vinul se constituie și ca un aliment energetic (Ț îrdea C., Sîrbu Gh.,
Țîrdea A., 2000). Un litru de vin sec are un potențial energetic de 600 -800 kcal, iar un
vin licoros care este mai bogat în alcool și glucide - în medie 1700 kcal (Gaina
B.,2000).
Datorită conținutului în acizi organic, a ionilor de hidrogen (p H), a compușilor
fenolici și, în primul rînd, a taninurilor, l -a determinat pe Louis Pasteur pe bună
dreptate să afirme încă din secolul al XIX-lea că "Vinul este cea mai sănătoasă și cea
mai igienică băutură". Aceasta se datorează, mai întîi de toate, prezenţei legăturilor
fenolice, multe dintre care întăresc vasele sangvine astfel împiedicînd dezvoltarea
aterosclerozei şi a altor boli cardiovasculare, posedă o acţiune bactericidă şi o
activitate antioxidantă înaltă .
Acțiune antioxidantă
Acțiune antiinflamatorie Acțiune
anticancerigenă
S-a constatat că în țările în care se consumă zilnic vin roșu, cum ar fi Franța
(Bordeaux), Italia, Spania, frecvența maladiilor cardio-vasculare este cu mult mai
scăzută decît în țările în care se preferă preponderant băuturi tari și mai puțin vin.
Ca urmare consumului zilnic de vin, longevitatea este mai mare, iar infarctul
miocardic și accidentele vasculare cerebrale sînt mai reduse (Pomohaci N., Cotea
V.D., Stoian V., și col.,2000).
5
Despre acțiunile benefice ale vinului roșu asupra organismului uman se vorbește tot mai
frecvent, datorită conținutului compușilor fenolici,și în primul rînd, a proantocianidinelor, cu
însușiri biologic active importante.( Brenna O., Pagliarini E., 2001 ; Положишникова М .,
Перелыгин О.Н., 2005).
6
Acizii aromatic (acizii fenolcarbonici) joacă un rol semnificativ în formarea
caracteristicilor organoleptice ale vinului(buchetul şi gustul), participă la procesele biochimice
de producere şi păstrare a vinurilor. Conţinutul calitativ şi cantitativ a acizilor fenolcarbonici şi a
flavonolilor este cercetat prin metoda HPLC ( Положишникова М ., Перелыгин О.Н., 2005).
Conform datelor experimentale (Tabelul 1), cea mai mare parte din conţinutul sumar de
acizi fenolcarbonici identificaţi în vinurile roşii seci este atribuită acidului galic (50-85%) .
7
2.1.RESVERATROLUL
2.1.1 Generalităţi. Structura chimică și proprietățile resveratrolului.
Resveratrolul (3,5,4-trihidroxistilben) este o fitoalexină ce aparține clasei
compușilor polifenolici numiți stilbeni, care sunt produși de unele specii de plante cu
ajutorul sintezei enzimei stilbene, ca răspuns la stres, infecţii micotice și radiații
ultraviolete (UV).
Aceste substanţe vegetale posedă proprietăţi biochimice remarcabile şi reprezintă
un compus solubil în grăsimi care apare în 2 configuraţii : cis- şi trans (figura 3).
trans-resveratrol cis-resveratrol
E-resveratrol Z-resveratrol
Numai izomerul trans-resveratrol este produs natural în timpul maturării strugurilor, însă el
poate suferi o izomerizare în forma cis-resveratrol prin intermediul unui proces fotochimic, prin
iradierea cu raze UV sau printr-un proces enzimatic (figura 4) :
9
2.1.3. Interactivitatea moleculei de resveratrol cu ciuperca Botrytis cinerea.
Resveratrolii pot fi sintetizaţi de plantă ca mijloc de autoprotejare cu proprietăţi
antimicotice în raport cu Botrytis cinerea şi Plasmopara viticola. Biosinteza în frunze
şi bobiţe este stimulată de condiţiile neprielnice, de razele ultraviolete, de pre zenţa
unor cantităţi relativ mari de metale grele (în special de cupru) etc.
După cele menționate anterior, rezultă că resveratrolul este secretat de către
strugurii de viță de vie atunci cînd aceștia sunt atacați de către ciupercile și bacteriile
parazite, în acest fel se declanşează o reacţie a viţei de vie care se va opune
dezvoltării ciupercii, în special a ciupercii Botrytis cinerea, unde este des întilnit
efectul său de eliberare a etilenei asupra strugurilor infectați (figura 5).Dezvoltarea
acesteia fiind favorizată de anumiți factori externi: umiditatea, temperatura, țesuturile
moarte, leziunile plantelor,lumina.
10
100
% Germinare 75
50
25
Timpul (min)
Vinul rezultat din acest tip de recoltă nu numai că nu conţine resveratrol, dar are
şi o barieră antioxidantă diminuată. Vinul este oxidat, brun şi dezvoltă arome
maderizate deseori neplăcute (de sol, de petică, alteori –de fungi).
11
2.1.4. Activitatea biologică a resveratrolului și a derivaților săi.
Molecula de bază, produsă de către vița-de-vie este izomerul trans- al
resveratrolului,care împreună cu derivații săi (figura 8) posedă proprietăți
antioxidante importante.
12
Din datele prezentate, se observă o relație invers proporțională între activitatea
antioxidantă și valorile EQ și EC 50 : cu cît e mai puternic antioxidantul cu atît e mai
mică valoarea acestora. În toate cele 3 teste, trans-resveratrol (I) a demonstrat cea
mai mare activitate antioxidantă, în timp ce compusul V nu exercită nici un efect
semnificativ. Figura 9 demonstrează efectele trans-resveratrolului (I) și derivatele pe
producție TBARS indusă de TBHP în fibroblaste umane normale.
16
Spre exemplu, la tratarea vinului brut cu pectinază și β-glicozidază s-a atestat o diminuare
de 3% a resveratrolilor, însă cea mai mare diminuare a avut loc la preucrarea cu bentonită a
vinului brut în doze de 1mg/dm3, în aceste condiții,concentrația reziduală a resveratrolilor a
constituit 5,4 mg/dm3 din 8,8 mg/dm3 conținut inițial. Bentonita, în calitate de sorbent natural,
absoarbe cantități importante de resveratrol datorită suprafeței sale bine structurate și deschise
comparativ cu alți compuși fenolici, sorbția cărora este mult mai inferioară.
Este important de menționat, că, deși orice operațiune de filtrare a vinului brut poate
diminua conținutul de resveratroli de la 12% pînă la 23 % (filtrarea grosieră, fină și prin
membrane), totuși suma totală a înlăturării compușilor cercetați atinge 54%, ceea ce este puțin
mai mult decît jumătate din conținutul inițial a acestor compuși.
O înlăturare considerabilă a resveratrolului din vin s -a depistat în urma
interacţiunii acestuia cu levurile din vin, fapt demonstrat în urma unui studiu realizat
de Gaina B. și Roman O. la Institutul Universitar al Viei şi Vinului din Dijon, Franţa
în colaborare cu profesorul Gougeon Regis; sedimentarea levurilor după finalizarea
fermentaţiei alcoolice diminuază conţinutul resveratrolilor prin adsorbţia lor pe
suprafaţa membranelor celulare cu cca 80%( Gaina B., Roman O., Gougeon R., 2007 ).
Despre proprietățile biologic active ale compușilor fenolici din struguri,must,suc
și vinuri, și rolul lor în tratarea maladiilor din domeniul uv oterapiei și oenoterapiei
(Gaina B., Savin Gh., Bejan V. și al., 2005) atestă a cademicianul Boris Gaina, în
lucrarea sa, unde se menționează că pentru utilizarea vinurilor în oenot erapie, se
recomandă de a folosi vinurile brute netratate (Primeur, Mlado, Tulburel), iar în
uvoterapie- struguri și must proaspăt, la fel netratați și conservați la frig.(Gaina B.,
2000)
În ultimul deceniu a crescut semnificativ interesul consumatorilor de vinuri față de
producția vitivinicolă ecologică. Studiile recente, realizate la Institutul Național al Viei și
Vinului din Moldova, în colaborare cu Institutul Național de Cercetări Agronomice din
Narbonne (Franța) au avut ca scop determinarea concentrației resveratrolilor în vinurile
ecologice obținute din unele soiuri noi rezistente la factori biotici și abiotici ai mediului
ambiant. Despre tratarea limitată a acestor soiuri contra bolilor și vătămătorilor s-a menționat în
diverse publicații din R.Moldova (Gaina B.,2000; Gaina B.,2002; Duca G.,Gaina B.,Covaleov
O.,și al.,2004), însă primele rezultate obținute începînd cu anul 2005 privind conținutul
resveratrolilor în vinurile ecologice (tabelul 7) au fost expuse în lucrarea Gaina B.(2007).
17
Tabelul 7
Concentrația resveratrolilor în vinurile ecologice obținute din soiuri noi(Chișinău, 2005).
Nr Denumirea vinului Originea Concentrația de resveratrol, mg/dm3
d/o (soiul de viță de vie) strugurilor
(localitatea) Trans-resveratrol Cis-resveratrol Suma totală de
resveratrol
1. Riton (alb) Chișinău, INVV 1,07 0,93 2,63
2. Legenda (alb) Chișinău, INVV 1,44 1,12 2,56
3. Viorica (alb) Chișinău, INVV 1,92 1,41 3,33
4. Perveneț Magaracia Vulcănești, SEV 2,01 1,33 3,34
(alb)
5. Negru de Ialoveni Chișinău, INVV 5,13 4,71 9,84
(roșu)
6. Rubin Tairova (roșu) Cahul,SÎS 4,41 3,19 7,60
7. Iubilei Magaracia Cahul,SÎS 5,01 3,66 8,67
(roșu)
Un conţinut mai redus al resveratrolilor se atestă la vinurile albe din soiurile Riton,
Legenda, Viorica şi Perveneţ Magaracia (de la 2,63 mg/dm3 pînă la 3,34 mg/dm3) în comparaţie
cu o concentraţie sporită a resveratrolilor în vinurile roşii din varietăţile Negru de laloveni, Rubin
Tairova şi lubilei Magaracia (de la 7,60 mg/dm3 pînă la 9,84 mg/dm3). E de menționat că aceste
vinuri au fost netratate, deci, doar în vinurile materie primă s-ar putea determina concentrații
palpitabile de resveratroli.
Analiza cromatografică HPLC aduce clar informaţie mult mai bogată decît
analiza spectrofotometrică, deoarece aceasta permite detectarea izomerilor şi a
dimerilor resveratrolului. Se observă, de fapt, şi prezenţa dehidromerului a trans -e-
viniferina, care ar putea implica contaminarea soluţ iei mamă de resveratrol (Jeandet
P.,Breuil A.C., Adrian M., et al.,1997). S-a observat pentru prima dată că conţinutul de
viniferină creşte odată cu creşterea conţinutului de resveratrol în soluţie, după cum este
prezentat în figura 11.
Așa cum se arată în figura 12, vinul roșu conține o cantitate mai mare de
compuși fenolici decât vinul alb.Proeminent vîrfurile corespuns acidul protocatechinic
și acidului galic, identificate cu numerele 1 și 2, respectiv, (+) -catechina și (-)-
epicatechina, (vîrfurile 3 și respectiv 4), trans-resveratrolul (vîrf 5) și rutina (vîrf 6),
au fost prezente doar în vinul roșu.Interesul sporit faţă de resveratroli şi unii derivaţi
ai săi este strîns legat de rolul pe care l-ar putea exercita aceştia în diminuarea
riscului maladiilor cardiovasculare a consumatorilor de vinuri roşii şi care cultivă un
mod sănătos de viaţă (Frankel E.N.,1993).
Un rol aparte este atribuit unui alt reprezentant al acestor compuşi biologici şi
anume - piceida (Lamuela-Raventos R.M., Romeo-Perez A.I.,1995;), în cadrul acestei
lucrări, în anul 2006 la Institutul Universitar al Viei şi Vinului(IUVV, Dijon), în
19
colaborare cu Laboratorul de CEnologie - din Universitatea Reims s-a utilizat o
metodă HPLC care a permis de a realiza separarea şi analiza izomerilor cis şi trans a
celor 4 stilbeni - resveratrol, piceida, pterostilben şi un dimer al resveratrolului.
Această metodă a permis determinarea concentraţiei fiecăruia din stilbeni într-o
selecţie de vinuri, în funcţie de soiul, de regiunea de producere, inclusiv de AOC* şi
de metodele de vinificare.
Printre polifenoli care atrag cea mai mare atenție, sunt resverat rolul și
cuazercina din cauza abundenței lor relative în produsele alimentare și a potențialului
terapeutic și efectelor lor biologice multiple în tratarea diferitor boli.
Resveratrolul, cuazercina și standardele lor interne au fost cuantificate la 320 nm
(resveratrol), 286 nm (4,4 '-dihidroxibifenil) și 370 nm (cuazercină și 2 ", 5,7 -
Trihydroxyflavone). Cromatogramele la aceste lungimi de undă sunt prezentate în
fig.13.
mAU R-S
40 R-S R Glucuronidase
30
R-G
20 Sulfatase
10
No treatment
0
0 5 10 15 20 25 30 35 Time(min)
Figura 14: Cromatogramele HPLC-UV (320 nm) a unei probe de sânge retrasă
după 4 ore de la administrare intragastrică RGS (0,22 mmol / kg); cromatogramele
reprezintă alicote de aceeași probă, fără nici un tratament enzimatic și după
tratamentul cu sulfatază sau cu glucuronidaza, cum este indicat: R -S: resveratrol-
sulfat;R-G: resveratrol-glucuronid, R: resveratrol.
21
În 2005, oamenii de știință italieni (Vita J.A.,2005) au obținut primul rezultat
pozitiv de suplimentare a resveratrolului la vertebrate(figura 16) în ceea ce privește
efectele pozitive ale resveratrolului la nivelul activității celulare.
23
Figura 17 B : Acumularea stilbenilor ca răspuns la Harpin în Pinot noir și Vitis
rupestris.
Pentru a întelege funcția biologică a acumulării de resveratrol, au fost
investigate în continuare răspunsurile celulare exogene la resveratrol (figura 18).
25
dar dezvoltată mai rapid în Vitis rupestris (Figura 18C). Doză-răspuns a pH (figura
18D) au arătat o creștere proporțională cu concentrațiilor de resveratrol atingînd o
valoare maximă de 1,25 unități, deși a fost prezentată această creștere,nu a fost la fel
de pronunțată în Pinot Noir. Totuși în majoritatea liniilor de celule sunt prezente
fluctuații necontrolate ale pH-ului, în consecință are loc defalcarea vacuolară și
moartea celulelor.
Un al doilea aspect al hipersensibilității legate de moartea celulară programată
este reorganizarea Actin (Lamb C, Dixon RA., 1997 ; Franklin-Tong VE, Goutay CW.,
2008). În figura 19 este reprezentat reacția microfibrelor și a filamentelor Actin la
resveratrol.
26
Spre deosebire de microtubuli, răspunsul filamentelor de actină la resveratrol a
fost pronunțat în Vitis rupestris (figura 20). În comparație cu controlul netratat, în
cazul în care s-au observat fire fine de actină în periferia celulelor,filamentele de
actină au fost puternic combinate și contractate spre nucleu după 30 minute tratament
cu resveratrol.
27
Toate imaginile au fost capturate cu ajutorul unui microscop AxioImager Z.1
(Zeiss), echipat cu un slider microscop ApoTome prin seturi de filtre de 38 HE pentru
FITC sau GFP (excitație la 470 nm, fascicule la 495 nm, iar emisiile la 525 nm) sau
43 HE pentru PIN1-RFP (excitație la 550 nm, fascicule la 570 nm, iar emisiile la 605
nm).
Cînd filamentele Actin au fost eliminate de Latrunculin B, reintegrarea PIN1-
RFP în membrana plasmatică a fost afectată rezultînd aglomerări intracelulare (figura
20C, rîndul de sus). În mod similar, 50 µM resveratrol au fost capabili de a induce o
aglomerare similară, dar cu o întîrziere de aproximativ 15 min, comparativ cu
tratamentul cu Latrunculin B (figura 20C, rîndul de jos). Acest răspuns rapid celular
la resveratrol a fost urmat, o zi mai tîrziu, de o scădere a indicelui mitotic, și o
stimulare de celule moarte. Aceste răspunsuri au fost dependente de concentrația de
resveratrol și au fost afectate deja la cea mai scăzută concentrație testată a 1 µM
resveratrol. În plus, sincronia diviziunii celulare,un diagnostic pentru activitatea de
transport a actin-auxin( Nick P.,2010), a fost perturbată rezultînd o scădere
progresivă a unui vîrf-6 de frecvență diagnosticate peste vîrful-5 cînd concentrația de
resveratrol a ajuns la 10 µM.
28
2.1.6. Rolul resveratrolului în protecția organismului uman contra radicalilor
liberi. Acțiuni benefice.
Resveratrolul protejează celulele endoteliale de stresul oxidativ indus de
oxidarea LDL(colesterolului negativ,rău) fie prin intermediul activității directe de
neutralizarea a radicalilor liberi,cît și prin inhibarea acțiunii nicotinamid adenin
nucleotid fosfat oxidazei (NOX). Resveratrolul are o acțiune anti-inflamatorie prin
inhibarea ciclooxigenazei COX și prin reducerea sintezei de prostaglandine pro -
inflamatorii și vaso-protectivă, prin creșterea producției de oxid nitric și producția
redusă de peptide vasoactive demostrînd o eficacitate înaltă în protecția cardio -
vasculară.
În ciuda multitudinii de acțiuni observate, mecanismul de acțiune al acestui compus nu este
încă complet deslușit. Există studii care indică modificarea expresiei unor enzime precum COX-
2 și ODC, inhibarea unor enzime active la nivelul cyt P450 și activarea unei proteine reglatoare
Sir-2, o protein-deacetilaza NAD-dependentă. Se pare ca mecanismul din urmă a fost asociat cu
creșterea longevității. De asemenea se pare ca resveratrolul mimează efectele protective ale
SIRT1 (o proteina tip Sir-2 specifică mamiferelor). Aceste efecte sunt similare restricției calorice
(RC), acesta fiind si unul dintre mecansimele posibile de acțiune ale polifenolului.
29
Schema 1 : Acțiunile molecului de resveratrol asupra organismului uman
Astfel, ei au utilizat culturi celulare neuro2a neuroblastoma, care au fost tratate cu 10 µM
resveratrol. Apoi a fost urmarită activarea AMPK prin utilizarea de anticorpi fosfo-AMPK
specifici. După circa 2 ore, cercetătorii au observat o importantă creștere a fosforilării AMPK,
creștere menținută pînă la 72 de ore de la tratare. Pentru a confirma această observație, cei doi
oameni de stiință și-au concentrat atenția asupra fosforilării acetilcoenzimei A carboxilazei
(acetil-CoA carboxilaza sau ACC), țintă primară a AMPK-ului activat. Ca urmare, experimentul
lor a confirmat ipoteza inițială că resveratrolul prezintă acțiuni asemanătoare RC (promovarea
biogenezei mitocondriale și a eficienței bioenergetice).
31
Viovalabilitatea resveratrolului depinde de formele sale conjugate: glucuronat și sulfonat,
chiar dacă majoritatea studiilor in vitro folosesc forma agliconică a resveratrolului.
Mecanismele prin care molecula de resveratrol ar putea prelungi viața nu sunt încă bine
înțelese, dar acest lucru pare să funcționeze prin inhibarea lipazei, reducînd absorbția grăsimii în
pereții intestinali. Numai în forma trans- molecula este capabilă să activeze gena SIRT 1 in vitro.
Recent, Kaeberlein și coleg. au adus în discuție această teorie, care reunește resveratrolul, SIRT
1 și reducerea de calorii. Molecula de resveratrol pare să potenteze efectul unor medicamente
antiretrovirale, împotriva HIV in vitro.
Un grup de cercetători de la National Institutes of Aging laboratory din Baltimore,
împreună cu specialiști din Australia și Spania, sub conducerea dr. David Sinclair, profesor de
patologie la Harvard Medical School, au efectuat recent un studiu (2010-2012) pe baza
moleculei de resveratrol, prin care s-a demonstrat ca va fi posibil ca populația să fie ferită de
efectele dăunatoare ale dietelor bogate în calorii și grăsimi, o problema majoră a societății
moderne.
32
Făcînd o sinteză a informației anterioare, putem enumera principalele efecte ale
resveratrolului :
Antioxidant
Antibacterian Antiinflamator
Neuroprotector Antitumoral
trans-resveratrol
Cardioprotector Antimutagen
33
2.2 Proantocianidinele
În mod cronologic, prima sursă explorată de tanine condensate a fost scoarţa de pin.
Ulterior, una dintre sursele preferabile ale acestor compuşi au devenit seminţele de struguri,
graţie faptului disponibilităţii lor în cantităţi industriale. În rezultat, pe piaţa produselor
secundare vinicole au apărut un şir de extracte din seminţe de struguri, reprezentînd surse sigure
de tanine. Taninele reprezintă nişte compuşi polihidroxilaţi cu structură aromatică care în primul
rînd sunt caracterizaţi de proprietatea de a forma complexe insolubile cu proteinele salivare.
Deaceea prezenţa acestor compuşi în vin contribuie la proprietăţile lui organoleptice, în primul
rînd la culoare şi astringenţă.(Vidal S., Cartalade D., Souquet J.M., et al. 2002;Jorgensen E.M.,
Marin A.B., Kennedy J. A., et al. 2004; Gonzalez-Manzano S., Santos-Buelga C., Perez-Alonso
J.J, et al. 2006; Peyrot des Gachons C., Kennedy J. A., et al. 2003).În afară de aceasta, derivaţii
flavan-3-olului reprezintă antioxidanţi importanţi în celulele vii. De aceea taninele din seminţe
de struguri sunt examinate în primul rînd datorită activităţii lor antioxidante. Se cunoaşte că
potenţialul de oxido-reducere a compuşilor fenolici este sufficient de mic pentru a interacţiona cu
diferite specii oxidante prin intermediul diferitor mecanisme, de regulă prin un mecanism de
captare a radicalilor liberi(Freitas V., Glories Y., Laquerre M., și al. 1998 ; Uchida S., Edamatsu
R., Hiramatsu R., și al. 1987).
34
degradării oxidative a AND-ului precum şi o acţiune benefică în inhibarea preventivă a
carcinogenezei (Pinelo M., Laurie V.F., Waterhouse A.L., et al. 2006). De rînd cu proprietăţile
lor antioxidative, proantocianidinele pot influenţa eliberarea oxidului de azot de către celulele
endoteliale (Fitzpatrick D.F., Fleming R.C., Bing B., et al. 2000). Bazîndu-se pe aceste
mecanisme de acţiune, compuşii polifenolici din produsele vinicole au fost prezentaţi în diferite
publicaţii ca substanţe cu acţiune antibacteriană, antivirală, anticarcinogenică, antiinflamatorică,
antialergică şi vasodilatatorie. De asemenea taninele respective au demonstrate capacitatea de a
inhiba agregarea trombocitelor, de a îmbunătăţi permeabilitatea vaselor sangvine şi de a diminua
fragilitatea lor.Au mai fost relatate studii despre efectul enotaninelor asupra sistemelor
enzimatice cum ar fi fosfolipazele A2,ciclooxigenazele şi lipooxigenazele. În rezultat beneficiul
potenţial al enotaninelor pentru sănătatea umană a fost recunoscut pe larg(Santos-Buelga C.,
Scalbert A., et al. 2000). Aceasta a condus la aplicaţii fitofarmaceutice diverse a enotaninelor
condensate: prevenirea maladiilor cardiovasculare,reducerea edemelor, îmbunătăţirea circulaţiei
periferice, îmbunătăţirea vederii,tratarea retinopatiei diabetice,hipercolesterolemiei,stabilizarea
tonusului ţesuturilor conjunctive,reducerea reacţiilor alergice şi inflamatorii, ameliorarea
tratamentului plăgilor precum şi îmbunătăţirea funcţiei imunitare(Murray M, Pizzorno J., 1999).
35
2.2.2 Structura chimică și proprietățile proantocianidinelor
31
21
41 OH OH
8 11
HO 7 O 2 C HO O
51
A B 61
6 3 OH OH
5 4 OH OH
OH OH
1 2
Figura 23: Structura chimică a catehinei(1) și epicatehinei (2)
În urma condensării oxidative între atomii de carbon C-4 ai catehinei1 sau epi-catehinei2
cu atomii de carbon C-6 sau C-8 ale aceloraşi molecule se formează lanţuri oligomerice. Aceşti
oligomeri reprezintă o pletoră de compuşi ce diferă prin gradul de polimerizare (GP), modul de
joncţiune a monomerilor şi succesiunea lor. Proantocianidinele B1-B4 (figura 24), care conţin
legătura C4-C8 sunt cei mai răspîndiţi dimeri (da Silva J, Rigaud J, Cheynier V, et al. 1991).În
multe cazuri oligomerii formaţi au grupa hidroxil la atomul de carbon C-3 esterificată cu acidul
galic(Fitzpatrick D.F., Fleming R.C., Bing B., et al. 2000; da Silva J, Rigaud J, Cheynier V, et al.
1991).
OH OH
HO O HO O
4
3 OH 4
3 OH
OH OH
OH OH OH OH
HO O HO O
8 8
3 OH 3 OH
R1 R1
R2 R2
OH OH
3 R1=OH; R2=H Proantocianidina B1 5 R1=OH; R2=H Proantocianidina B3
4 R1=H; R2=OH Proantocianidina B2 6 R1=H; R2=OH Proantocianidina B4
OH OH
HO O HO O
3 3
4 OH 4 OH
OH OH
HO HO
HO OH HO OH
6 6
R2 3
R2 3
O O
R1 R1
HO HO
HO HO
OH OH
HO O HO O
4
3 OH 4
3 OH
OH OH
OH OH OH OH
HO O HO O
8 8
3 OH 3 OH
OH OH
OH OH OH OH
HO O HO O
8 8
3 OH 3 OH
OH OH
OH OH
11 Proantocianidina C1 12 Proantocianidina C2
37
În rîndul compuşilor esterificaţi sunt dimeri şi trimeri ai flavan-3-olului, unii din ei conţin
două fragmente de acid galic. Dimerul B-2 (4) predomină în grupa respectivă. Proantocianidinele
descries diferă nu numai după numărul şi succesiunea unităţilor flavan-3-olice, modul de
esterificare, dar şi după modul diferit de joncţiune a monomerilor (C-4 – C-8 sau C-4 – C-6) şi
configuraţia la atomul de carbon C-4 (α sau β). Lucrarea în cauză prezintă numai un singur
tetramer descris, el consistînd numai din unităţi ale epi-catehinei [epi-catehina (4β-8)- epi-
catehina (4β-8)- epi-catehina (4β-8)- epi-catehina]. Izolarea taninelor polimerice individuale
reprezintă o sarcină dificilă. Toate exemplele din literatură relatează numai izolarea unor fracţii
ce conţin amestecuri ale cîtorva polimeri individuali(Gabetta B., Fuzzati N., Griffini A., et al.
2000).
Conform studiilor realizate pînă în prezent se cunosc mai multe metode moderne de
cercetare a proantocianidinelor, după cum ar fi cromatografia de performanţă înaltă cu lichide
(HPLC) şi spectrometria de masă (MS). Însă pentru a putea fi cercetate, este nevoie de a
cunoaște metodele de extragere a acestora. Astfel, în lucrarea unui grup de autori ( V. Kulciţki,
P. F. Vlad*, Gh. Duca, T. Lupaşcu, 2007) sunt menționate unele metode de extracţie utilizate în
izolarea proantocianidinelor din seminţele de struguri folosind amestecul de acetonă-apă în
diferite proporţii (70:30 în prezenţă de silicagel, 60:40 la +4oC, 50:50 la temperature camerei),
methanol pur la temperatura camerei, methanol cu adaus de acid ascorbic (1g/l) la -20oC, urmat
de amestecul methanol-apă (1:1) la -24oC şi acetonă-apă (75:25), totul în atmosferă de azot
(Santos-Buelga C., Francia-Aricha E.M., Escribano-Bailon M.T, 1995; Monagas M., Gomez-
Cordovez C., Bartolomea B., et al. 2003). Metanolul a fost utilizat de asemenea şi în combinaţie
cu alţi solvenţi pentru extracţia taninelor din seminţe de struguri. Cîteva exemple includ extracţia
cu methanol acidulat cu HCl,() amestec metanol-apă (75:25) la temperatura camerei şi iradiere
ultrasonică. Etanolul apos a fost utilizat pentru extracţia taninelor din seminţele de struguri, (de
Freitas V., Glories Y., Laquerre M., et al. 1998; Darne G., Madero T.J., 1979) precum şi a
38
proantocianidinelor din Rhodiola semenovii( Kuliev R.Z., Akhmedov U.;, Khalmatov Kh.Kh., et
al. 2004).
Un alt exemplu interesant de extracţie (Kuliev, R.Z.; Akhmedov, U.; Khalmatov, Kh.Kh.,
et al. 2004), include fracţionarea unui extract etanolic apos prin extracţie succesivă cu eter
dietilic şi etilacetat, ce a condus la fracţii mai simple ale proantocianidinelor. Partea eterică a
inclus (+)-catehina (1), (+)-galocatehina (13), (-)-epi-catehina (2), (-) – epi-catehingalat (14), (-
)-epi-galocatehină (15), (-)-epi-galocatehingalat (16) şi acid galic (17). Fracţia din etilacetat a
inclus următorii dimeri: (+)-catehin-(4α-8)-(+)-catehină (18), (-)-epi-catehingalat-(4β-8)-(-)-epi-
catehingalat (19) şi (-)-epi-catehin-(4β-8)-(-)-epi-catehingalat (20).
OH OH OH
HO O HO O
OH
HO O 3 OH 3
OH
4 4
OH R1
3 R2
R1 OH OH OH OH
HO O HO O
8 8
OH
13 R1=-OH; R2=OH
3 OH 3 OH
OH R2
14 R1=-OGalloyl; R2=H
OH OH
15 R1=-OH; R2=OH 19 R1=R2=-OGalloyl
18
16 R1=-OGalloyl; R2=OH HO 20 R1=-OH; R2=-OGalloyl
HO COOH
HO 17
Figura 26: Fracțiile pronatocianidinelor
Astfel s-a constatat că extractul din semințe de struguri este benefic pentru prevenirea și
tratamentarea unei boli neurodegenerative. Acest extract de semințe de struguri conținînd unul
sau mai mulți compuși derivați din acestea au puterea de a reduce acumularea, agregarea și / sau
39
depunerea de β amiloid sau oligomerii săi și / sau pentru a reduce misfolding-ul, acumulare și /
sau agregarea Tau proteinelor sau a altor proteine. Bolile neurodegenerative sunt asociate cu
condițiile în care celulele neuronale se deteriorează, își pierd funcția, și de multe ori mor.
Consecințele bolilor neurodegenerative sunt de multe ori devastatoare. Pacienții cu boli
neurodegenerative pot suferi deteriorări grave în abilitățile cognitive sau legate de sistemul
locomotor. Ca urmare, calitatea lor de speranța de viață și a vieții pot fi reduse considerabil. În
cazul organismului uman, aceste boli includ boala Alzheimer, boala Parkinson, scleroză laterală
amiotrofică, boala Huntington, demență fronto-temporală.
Precum am atestat în lucrarea autorilor (V. Kulciţki, P. F. Vlad*, Gh. Duca, T. Lupaşcu,
2007) importanța proantocianidinelor, structura lor chimică și metodele de cercetare, în final, în
cadrul unui experiment HPLC semipreparativ a fost descoperit un compus individual și conform
datelor MS acest compus e un trimergaloilat, structura 21 (figura 27) a fost propusă în baza
numai a experimentelor MS-MS. Dar pentru a stabili definitive structura acestui compus, în
special stereochimia lui sunt necesare studii adaugătoare.
OH
HO O
OH
OH
OH OH
HO O
OH
OH
OH OH
HO O
OH
O
OH
O OH
21
OH
OH
In acest mod, un grup de savanți (Giulio Maria Pasinetti, Lap Ho, Jun Wang, 2010), au
realizat o invenție care prevede o metodă de reducere a misfolding-lui, acumulare, agregarea sau
depunere de Aβ (amiloid β peptid) oligomeric Aβ, proteinele Tau sau alte proteine asociate cu o
bolile neurodegenerative. Și totodată, au stabilit structura compusului tructura 21, precum și
stereochimia lui. Metoda implică administrarea unei cantități eficiente dintr-o compoziție
farmaceutică care cuprinde un extract de semințe de struguri sau unul sau mai mulți compuși
derivate din acestea (figura 28).
40
Figura 28: Structura moleculară a unui proanthocianidin tipic heteropolimeric.
Compoziția farmaceutică poate să conțină un ingredient activ, ales din grupul format de
un antioxidant, un inhibitor acetilcolinesterazei, și combinații ale acestora. Într-o variantă
particulară, extractul din semințe de struguri cuprinde aproximativ 12% în greutate din
proantocianidingalloylated raportat la greutatea totală a proantocianidinei în extract.
41
Figura 29 : Efectul MNG-AZ GSE privind conversia Aβ peptidic în formele lor oligomerici
solubile în vitro. Fig. 2A și 2B, dodecil sulfat de electroforeza gelului de poliacrilamidă de sodiu
(SDS-PAGE) a produsului de incubare Aβ1-42 (2A) și A β1-40 (2B), cu diferite cantități de MNG-
AZ GSE. Fig. 2C și 2D – rezultatul SDS-PAGE a Aβ 1-42 (2C) și Aβ1-40 (2D), în prezența sau
absența MNG-AZ GSE urmărind Foto-induse Reticularea Proteine nemodificate (PICUP)
42
Figura 30: ilustrează o Aβ cu efect de inhibare a MNG-AZ investigat de metabolismul
MTT. Fig. 3A (și 3C) arată toxicitatea cu greutate moleculară mică Aβ1-40 (și Aβ1-42) și efectul de
MNG-AZ în reducerea toxicității. Fig. 3B (și 3D) arată toxicitatea Aβ1-40 agregare (și Aβ 1-42
Figura 31: 4A și 4B arată efectul de MNG-AZ GSE asupra funcției cognitive la tulpina, varsta si
sex-potrivit animalelor sălbatice de tip masurate prin teste Morris-labirint de apă.
43
În acest mod, administrarea preparatului MNG-AZ la un individ ce suferă de boala
Huntington are un efect benefic la tratarea acesteia manifestîndu-se prin mărirea numarului de
organisme și perioada de supravețuire. Acest efect poate fi examinat conform Fig.32 și Fig.33.
În acest caz grupul de organisme a fost tratat cu un extract de semințe de struguri unde,
cercurile hașurate reprezintă rezultate din grupul de control iar cele nehașurate –ale insectelor
cărora le-a fost administrat preparat.
În acest caz, același efect a fost obținut, însă, s-a folosit metodă de tratare, prepartul MNG-AZ,
unde diamantele umbrite reprezintă rezultate din grupul de control iar cele neumbrite-rezultatele
din grupul supus tratării.
44
Experimentul pe baza Drosophilei nu a fost unicul experiment care a servit la luarea
deciziilor referitor la rolul inhibitor al extractului din semințe de struguri. Deasemenea, acestea
cercetări au fost elaborate prin administrarea în creierul șoarecilor Tg2576 (șoareci transgenici
care exprimă proteine amiloid mutantă precursor și prezintă deteriorarea AD-tip cognitiv), și
semnificativ îmbunătățește sau încetiniște pierderea funcției cognitive la șoareci Tg2576
(comparativ cu șoarecii netratați).
Figura 34: schema de evaluare test folosind posterioarele extensive la nivelul membrelor pentru
unun șoarec JNPL3 model transgenicde tauopathy.
Folosind aceast exemplu prin tratarea șoarecelui, s-au observat anumite schimbări care
pot fi explicate analizînd graficele urmatoare :
45
Figura 35: efectul unui tratament GSE pe un model de șoarece JNPL3 transgenic
tauopathy. Fig. 7A arată depreciere cu motor la șoareci JNPL3, la vârsta de 5 luni și 13 luni,
respectiv, atunci cand sunt tratați cu GSE, în comparație cu cele care nu sunt tratate cu GSE. Fig.
7B prezintă în comparație rata de mortalitate între soarecii JNPL3 netratați și cei tratași cu GSE,
grafice de linie caracterizează prin aceea că reprezintă % de indivizi supraviețuind în timp.
46
la procese de eschemie și infracturi. Din aceste considerente, medicii-savanți caută remediul
potrivit și cît mai inofensiv pentru sănătatea umană.
47
Aceste materiale au fost colectate în diferite ţări viti-vinicole, printre care
Franţa, Elveţia şi Moldova.În studiul realizat au fost utilizate în calitate de marqeuri ,
resveratrolii ; procesul sorbţiei resveratrolilor au fost analizate pe levuri selectate şi
pregătite special.
Vinurile din Bourgogne au fost furnizate de Biroul Interprofesional de Vinuri din
Bourgogne (BIVB), cît şi de producători de vinuri elaborată pe baza soiului Pinot
noir. Vinurile au fost filtrate mai apoi injectate(20 µl) direct în sistemul HPLC. în
condiţii de analiză deja descrise în literatura de specialitate(Jeandet P., Breuil A.C.,
Adrian M., et al., 1997).
II.2. METODE
48
etalonat la lungimea de undă de absorbţie a substanţei chimice ce trebuie studiată.
Pentru izoterma de adsorbţie, concentraţiile în resveratrol în soluţiile limpezite
obţinute în urma ultracentrifugării au fost măsurate prin spectroscopie UV la lungimea
de undă 305nm, folosind o cuvă din cuarţ de l cm şi referindu-ne la o dreaptă de
etalonare externă (y=0,1179x ; r 2 =0,9996 ; n=6, figura II.1). Diluările necesare au fost
făcute astfel încît să satisfacă legea lui Beer -Lambert.
49
detectate a fost realizată referindu-ne la o dreaptă de etalonare externă (y=76530x ;
r 2 =0,9979; n=9, gama de la 1 la 50mg/kg, fig. 2).
Odată cu progresul remarcabil al tehnicilor HPLC, această metodă a fost pe larg utilizată la
analiza polifenolilor de diferită origine botanică, inclusiv a taninelor condensate din vin, struguri
şi seminţe de struguri. Punctul forte al acestei metode constă în posibilitatea de a separa
compuşii polifenolici cu polaritate avansată la tmperatură ambientală, fără a recurge la
derivatizare sau la încălzirea probei. În ultima decadă metodele HPLC au cunoscut o serie de
inovaţii, care au promovat efficient performanţa metodei. În primul rind e necesar de a menţiona
introducerea larga a detectoarelor cu grilă de diode pentru monitorizarea procesului de separare
în domeniile UV-Vis. Aceasta a dat posibilitate de a analiza eluatul de pe coloana HPLC pe toată
50
banda spectrală, făcînd astfel posibilă înregistrarea în regim continuu (―on fly‖) a spectrelor UV-
Vis ale picurilor individuale sau chiar ale secţiunilor din picurile cromatografice. În aşa fel a
devenit posibil de a identifica componentele separate ale amestecurilor analizate în baza
spectrelor UV-Vis, precum şi de a estima puritatea compuşilor separaţi şi eficienţa separării.
Altă îmbunătăţire revoluţionară, care a avut un impact colosal asupra utilizării foart largi a
tehnicii HPLC a fost combinarea aparatului HPLC cu spectrometrul de masă. Aceasta a fost
posibil în urma apariţiei metodelor eficiente de ionizare, mai ales a metodei de ionizare prin
electro-spray, şi nu în ultimul rind de apariţia micro-coloanelor HPLC care au redus substanţial
debitul solvenţilor şi volumele picurilor cromatografice. În aşa fel metoda hibridă LC-MS a
devenit cea mai universală tehnică analitică pentru studiul unui şir larg de compuşi, începînd de
la compuşi cu masă moleculară mică pînă la biololimeri.
În baza acestor progrese, HPLC şi-a găsit aplicare în diferite domenii ale studiului
compuşilor naturali, inclusiv în studiul polifenolilor din struguri. Lucrările de pionierat cu
utilizarea metodei HPLC în oenologie aparţin lui Nagel şi Wulf, care printre primii au publicat o
serie de articole în acest domeniu.42-44 În timp ce aceste prime investigaţii au tins să evidenţieze
noutatea metodei, în particular rapiditatea analizei, oenologii au început în scurt timp să aplice
această tehnică în monitorizarea calităţii vinului, inclusiv în monitorizarea schimbărilor în
conţinutul de flavonoide în timpul fermentării şi maturării vinurilor roşii. (Nagel C.W., Wulf
L.W., 1979) Metoda HPLC a fost de asemenea aplicată în studiul conţinutului de procianidine în
vinuri şi băuturi slab alcoolizate, precum şi în studiul profilului de antocianidine în vinuri pe
durata anilor de maturare.( McCloskey L.P., Yengoyan L.S., 1981)
Pentru proantocianidinele din alimente, analiza HPLC e efectuată în cele mai dese cazuri în
varianta fazelor reversate (RP). Dozarea cantitativă este efectuată în baza detectoarelor UV, de
obicei la 280 nm. Însă detectarea UV nu este specifică pentru proantocianidine, în condiţia
prezenţei în matricea analitică a altor compuşi polifenolici. Deaceea uneori se recurge la
detectarea prin fluorescenţă (excitare la 276 nm şi emisie la 316 nm), ceea ce oferă sensitivitate
crescută şi selectivitate faţă de procianidine.( Lazarus SA, Adamson GE, Hammerstone JF, et al.
1999) Coloanele RP C18 au fost utilizate pentru a separa de la monomeri la trimeri în produse
51
alimentare din Spania,(de Pascual-Teresa S., Santos-Buelga C., Rivas-Gonzalo J.C., 2000) de la
monomeri la tetrameri în vin(Carando S., Teissedre PL., Rascual-Martinez L. et al. 1999; Fuleki
T., da Silva R.J.M., 1997) şi seminţe de struguri. (Fuleki T., da Silva R.J.M., 1997 ; Peng Z.,
Hayasaka Y., Iland P.G., et al. 2001) Oligomerii proantocianidinici se separă în dependenţă de
gradul lor de polimerizare (de la monomeri la tetrameri) ca compuşi individuali, însă ordinea de
eluare nu este în concordanţă cu masa moleculară. Analiza oligomerilor superiori tetramerilor nu
a dat rezoluţie satisfăcătoare a picurilor pe coloane cu fază reversată. Cu mărirea masei
moleculare se observă o suprapunere avansată a picurilor şi coeluare a oligomerilor izomerici
superiori.
Multe relatări despre utilizarea metodei HPLC în analiza TSS sunt dedicate investigaţiilor
activităţii lor biologice. Fitzpatrick şi colaboratorii au descris izolarea din seminţele de struguri şi
caracterizarea unor compuşi responsabili de relaxarea endotelium-dependentă a activităţii vaselor
sanguine. Seminţele de struguri de soiul Concord au fost extrase cu methanol şi compuşii
obţinuţi au fost analizaţi prin metoda HPLC analitică şi semipreparativă după o fracţionare
preliminară. A fost folosit un system cromatografic Waters, cuplat cu un detector Waters 481
UV-Vis, precoloană şi coloană cu fază reversată Radial Pak NovaPak C18. Eluarea a fost
efectuată în regim de gradient al componenţei eluantului, utilizînd doi solvenţi. Faza mobilă A a
fost apa, iar faza mobilă B a fost soluţia de 10% acid acetic în apă. Gradientul a evoluat de la
25%B pînă la 100% B în regim isocratic, timp de 55 min conform unui profil complex. Debitul
eluentului a fost de 1.0 ml/min, iar detectarea UV la 280 nm. Extractele integrale au arătat un
profil complex, cu puţine picuri separate şi identificate. Ecxepţie au făcut acidul galic,
epicatehina şi epicatehingalatul. Una din fracţiile obţinute după o fracţionare preliminară prin
gel-filtrare a fost separată satisfăcător, iar compuşii individuali au arătatactivitate biologică
elevat.
II.2.4 Metodă de obținere, din semințe de struguri, a unui extract sub formă de pulbere, cu
un conținut ridicat de proantocinidine
52
ulterior, se purifică și se îmbogățește prin trecerea pe o coloană cromatografică având faza
inversă. Acest produs obținut poate fi utilizat ca ingredient cu proprietăți antioxidante în
industria alimentară, cosmetică și farmaceutică sau ca supliment alimentar. Dacă primele invenții
aveau la bază metode de extracșie cu solvenți organici cum sunt metanolul și/sau acetona sau
acetatul de etil (brevet OSIM 99206/1990, cerere de brevet US 5484594/1996-01-16, cerere de
brevet US 5773262/1998-06-30, cerere de brevet US 5912363/1999-06-15, brevet
6544581/2003-04-08), în ultimul timp datorită reglementărilor impuse în industria alimentară,
farmaceutică și cosmetică a fost necesar să se găsească soluții pentru înlocuirea lor cu metode
alternative, ecologice, de extracție, purificare și concentrare.
Procedeul de obținere din semințe de struguri a unui extract sub formă de pulbere cu un
conținut bogat în polifenoli, cuprinde:
Obținerea unui extract lichid brut prin extracția componentelor polifenolice din semințe de
struguri cu apă sau cu o soluție de 5-50 % alcool etilic în apă, la temperatură de
max.120°C și o presiune de 1 atm, timp de 45-60 mn, raportul în volume între semințe și
faza lichidafiind cuprns între 1:2 și 1:3;
Obținerea unui extract lichid total prin concentrarea, centrifugurea și filtrarea extractului
lichid brut ;
Opțional, obținerea unui extract lichid total îmbogățit în proantocianidine monomerice prin
trecerea extractului lichid total pe o coloană cromatografică de silice cu lanțuri alchilice
C8 și eluare cu o soluție de alcool etilic 50-96%;
Obținerea unei pulberi prin liofilizarea extractului lichid total sau a extractului lichid
îmbogățit.
Concluzie
Rezultatele investigaţiilor din ultimii ani ne permit să constatăm existenţa efectelor
benefice ale polifenolilor din semințe de struguri. Capacitatea acestei categorii de polifenoli de a
consuma radicalii liberi de oxigen din mediu în care aceștia se află este superioară altor
antioxianți bine cunoscutți, cum ar fi vitamna C, E, betacaroten. Substanțele polifenolice sunt de
10-20 de ori mai puternice decît vitamina E în protecţia anti-oxidativă a LDL-colesterolului.
Fiind consumatori de radicali liberi ai oxigenului, cum sunt superoxizii – anionul superoxid,
oxigenul singlet și radicalii hidrozxil, aceștia inhibă agregarea trombocitelor, intervin în reacțiile
53
de sinteză și eliberae a multor substanțe care provoacă inflamații, inhibă enzimele care pot
vătăma integritatea și elasticitatea capilarelor, a pelii și a altor țesuturi. Conferă protecţie
materialului genetic (ADN), ferindu-l de mutaţii. Protejează ficatul, inima şi sistemul nervos de
agresiunea radicalilor liberi.
Bibliografie
1. Adrian M., Jeandet P., Veneau J., Weston LA, Bessis R., Biological activity of resveratrol, a
stilbenic compound from grapevines, against Botrytis cinerea, the causal agent for gray
mold. J Chem Ecol 23: 1689-1702.
2. Arpenti G.N. Основы технологии столовых вин с повышеннй пищевой ценностью и их
медико-биологическая оценка. 1994. P. 124-136
54
3. Bejan V., Elaborarea procedeelor tehnologice de obţinere a vinurilor de calitate în plaiul
„Pleşna -Mîndreşti‖ din Codrii Moldovei, Autoref. Tezei doctor în tehnică, 2007, Chişinău,
INVV, pag. 10-13.
4. Belcaro G., Burki C., Ferrari V. Combination of proanthocyanidins and Centellaasiatica for
the treatment atherosclerosis. Horphang Research IP (PYC) LTD., Limasol (CY). 2012Pub.
No.: US 2012/0164244 A1
5. Blanche D., Rustan I., Durand P., Lesgards G., Loreau N. GasChromatography analysis of
resveratrol in plasma, lipoproteins and cells after in vitro incubation, J.Chromat. 1997; 702;
pag.103-110.
6. Bourzeix M., Le vin-aliment. Station d'Oenologie et Technologie Vegetale, Narbonne, 1995,
pag.17
7. Brenna O., Pagliarini E., Multivariate analysis of antioxidant power and polyphenolic
composition in red wines-J. Agr. And Food Chem. 2001. 49. Nr. 10. pag 484.
8. Burghelea B., Câmpeanu R.I.,Kontek A.C., Porumb R., Procedeu de obținere, din semințe de
struguri, a unui extract sub formă de pulbere, cu uncontinutridicat de proantocianidine.
16.07.2007
9. Carando S, Teissedre PL, Rascual-Martinez L, Cabanis JC. Levels of flavan-3-ols in French
wine. J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 4161–4166.
10. Carpov S., Tehnologia generală a Industriei Alimentare,Chișinău-București: Ed. Ştiinţa,
1997. pag. 300.
11. Cotea V.D., Tratat de oenologie, București, 1995, 1998, vol.1,2, pag.628.
12. Darne, G.; Madero, T.J. Mise au point d’une methode d’extraction des lipides solubles
totaux, des glusides solubles totaux et des composes phenoliques solubles totaux des organes
de la vigne. Vitis. 1979, 18(3), 221-228.
13. Duca G., Gaina B., Covaleov O., Экологичеески чистое виноделъческое производство,
Ed.Știința, Chișinău, 2004, pag.13-72
14. Felix G., Regenass M., Boller T.,Specific perception of subnanomolar concentrations of
chitin fragments by tomato cells: induction of extracellular alkalinization, changes in protein
phosphorylation, and establishment of a refractory state, 1997, Plant J 4, pag. 307–316.
15. Fitzpatrick, D.F.; Fleming, R.C.; Bing, B.; Maggi, D.A.; O’Malley, R.M. Isolation and
Characterization of Endothelium-Dependent Vasorelaxing Compounds from Grape Seeds. J.
Agric. Food Chem.2000, 48, 6384-6390.
16. Franklin-Tong VE., Goutay C.W ., A role for actin in regulating apoptosis/programmed cell
death: evidence spanning yeast, plants and animals, 2008, Biochem J 413: 389–404.
55
17. deFreitas, V., Glories, Y.; Laquerre, M. Incidence of Mollecular Structure in Oxidation of
Grape Seeds Procyanidins. J. Agric. Food Chem.1998, 46, 376-382.
18. deFreitas, V.; Glories, Y.; Bourgeois, G.; Vitry, C. Characterisation of oligomeric and
polymeric procyanidins from grape seeds by liquid secondary ion mass spectrometry.
Phytochemistry, 1998, 49, 1435.
19. Fuleki T, da Silva R.J.M. Catechin and procyanidin composition of seeds from grape
cultivars grown in Ontario. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 1156–1160.
20. Gabetta, B.; Fuzzati, N.; Griffini, A.; Lolla, E.; Pace, R.; Ruffilli, T.; Peterlongo, F.
Characterization of proanthocyanidins from grape seeds. Fitoterapia.2000, 71, 162-175.
21. Gaina B., Via,Vinul și Civilizația.Chișinău : Ed.Litera-Poliproject,2000, pag. 68.
22. Gaina B., Produse ecologice vitivinicole, Ed Litera,Chișinău, 2002, pag.136
23. Gaina B., Savin Gh., Bejan V.et al., Uvologie și Oenologie. Tip AȘM.Chișinău,2005,
pag.15-202
24. Gaina B., Roman O., Bourzeix M., Gougeon R., Date recente privind resveratrolii în must și
vinuri, Viticultura și Vinificația în Moldova , Chișinău, 2007
25. Geny, L.; Saucier, C.; Bracco, S.; Daviaud, F.; Glories, I. Composition and cellular
localization of tannins in grape seeds during maturation. J. Agric. Food Chem. 2003, 51,
8051-8054.
26. Goldberg D.M., Yan J., Diamandis E.P., Karumchiri A., Soleas G., Waterhouse A.L., The
trans-resveratrol concentration of wine; a global survey. Am. J. Enol. Vitic. 1994; 66; pag.
3959-3963.
27. Gonzalez-Manzano, S.; Santos-Buelga, C.; Perez-Alonso, J.J.; Rivas-Gonzalo, J.C.;
Escribano-Bailon, M.T. Characterization of the Mean Degree of Polymerization of
Proanthocyanidins in Red Wines Using Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-
MS). J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 4326-4332.
28. Hayasaka, Y.; Waters, E.J. Cheynier, V.; Herderich, M.J.; Vidal, S. Characterization of
Proanthocyanidins in Grape Seeds Using Electrospray Mass Spectrometry. Rapid Commun.
Mass Spectrom. 2003, 17, 9-16.
29. Jang M., Cai L., Udeani G.O., Slowing K.V., Thomas C.F., Beecher C.W.W., Fong H.H.S.,
Farnsworth N.R., Kinghorn A.D., Mehta R.G., Moon R.C., Pezzuto J.M., 1997, Science,
volumul 10:218-221.
30. Jeandet P., Bessis R., Gautheron B. The production of resveratrol (3,5,4ɑ-tihydroxystilbene)
by grape berries in different developmental stages, 1991, J.Agric.Food Chem., pag. 43, 316-
319
56
31. Jeandet P., Bessis R., Maume B.F., Meunier P., Peyron D., Trolla T P., Effect of enological
practices on the resveratrol isomer content of wine, 1995, J. Agric. Food Chem, 43, pag.316-
319.
32. Jeandet P., Bessis R., Sbaghi M., Meunier P., Trolla T.P., Resveratrol content of wines of
different ages : relationship with fungal disease pressure in the vineyard, 1995b, Am. J. Enol.
Vitic, 46, pag.1-4.
33. Jeandet P., Breuil A.C., Adrian M., Weston L.A., Debord S., Meunier P., Maume G., Bessis
R., HPLC analysis of grapewine phytoalexins coupling photodiode aray detection and
fluorimetry, 1997, Anal. Chem., 69, 24, 5172-5177.
34. Jorgensen, E.M.; Marin, A.B.; Kennedy, J. A. Analysis of the Oxidative Degradation of
Proanthocyanidins under Basic Conditions. J. Agric. Food Chem.2004, 52, 2292-2296.
35. Kaeberlein M., McDonagh T., Heltweg B., Hixon J., Westman E.A., Caldwell S., Napper A.,
Curtis R., DiStefano P.S., Fields S., Bedalov A., Kennedy B.K., (April 2005). "Substrate-
specific activation of sirtuins by resveratrol". Journal of Biological Chemistry 208 (17):
Retrieved November 14, 2012, pag. 17038–7045.
36. Kovac, V.; Bourzeix, M.; Heredia, N.; Ramos, T. Etude des catechines et proanthocyanidols
de raisin et vins blancs. Revue France d’Oenologie. 1990, 125, 7-14.
37. Kovac, V.; Alonso, E.; Revilla, E. The effect of adding supplementary quantities of seeds
during fermentation on the phenolic composition of wines. Am. J. Enol. Vitic. 1995, 46, 363-
367.
38. Kuliev, R.Z.; Akhmedov, U.; Khalmatov, Kh.Kh.; Kuliev, Z.A. Dimeric Proanthocyanidins
from Rhodiola semenovii. Chem. Nat. Comp.2004, 40 (1), 94-95.
39. Labarbe, V.; Cheinier, V.; Brossaud, F.; Souquet, J.M.; Moutounel, M. Quantitative
fractionation of grape proanthocyanidins according to their degree of polymerization. J.
Agric. Food Chem. 1999, 47, 2719-2723.
40. Lamb C., Dixon RA., The Oxidative Burst in Plant Disease Resistance, 1997, An. Rev Plant
Physiol Plant Mol Biol 48, pag. 251–275.
41. Lamuela-Raventos R.M., Waterhouse A.L., Occurence of resveratrol in selected California
wines by a new HPLC method, 1993, J. Agric. Food Chem., 41. pag.521-523.
42. Lamuela-Raventos R.M., Romero-Perez A.I., Direct HPLC analysis in selected California
wines by a new HPLC method, 1995, J. Agric. Food Chem., 43, 2, pag.281-283.
43. Langcane P., Pryce R.J., : Thе produсtion оf rеsvеratrol by Vitis vinifеra and anоthеr
mеmbеrs of thе Vitaсеaе as rеsponsr to infесtiоn injury. Рhysiol. Plant Рathol. 1976:9;77-86.
44. Lea, A.G.H. High performance liquid chromatography of cider procyanidins. J. Sci. Food
Agric.1979, 30, 833-838.
57
45. Lea, A.G.H.; Bridle, P.; Timberlake, C.F.; Singleton, V. The procyanidin of white grapes and
wines. Am. J. Enol. Vitic. 1979, 30, 289-300.
46. Lea, A.G.H. Reversed-phase gradient high-performance liquid chromatography of
procyanidins and their oxidation products in ciders and wines, optimized by Snyder’s
procedures. J. Chromatogr.1980, 194, 62-68.
47. Lazarus SA, Adamson GE, Hammerstone JF, Schmitz HH. High-performance liquid
chromatography/mass spectrometry analysis of proanthocyanidins in foods and beverages. J.
Agric. Food Chem. 1999, 47, 3693–3701.
48. Mattivi F., Solid phase extraction of trans resveratrol from wines for HPLC analysis. 1993,
Z. Lebensm Unters Forsch. 196, pag. 522-525.
49. McCloskey, L.P.; Yengoyan, L.S. Analysis of anthocyanins in Vitisvinifera wines and red
colour versus aging by HPLC and spectrophotometry. Am. J. Enol. Vitic. 1981, 32,257-261.
50. Merken HM, Beecher GR. Measurement of food flavonoids by high-performance liquid
chromatography: A review. J. Agric. Food Chem.2000, 48, 577–599.
51. Michaud, J.; Lacaze, P.; Masquelier, J. Fractionement des oligomersflavanolique du raisin.
Bull. Soc. Pharm. Bordeau. 1971, 110, 111-116.
52. Monagas, M.; Gomez-Cordovez, C.; Bartolomea, B.; Laureano, O.; Ricardo da Silva, J.M.
Monomeric, Oligomeric, and Polymeric Flavan-3-ol Composition of Wines and Grapes from
Vitisvinifera L. Cv. Graciano, Tempranillo, and Cabernet Sauvignon. J. Agric. Food
Chem.2003, 51, 6475-6481.
53. Murray M, Pizzorno J. Procyanidolic oligomers. In: Murray M, Pizzorno J, eds. The
Textbook of Natural Medicine. 2nd ed. London: Churchill Livingston; 1999, 899-902.
54. Nagel, C.W.; Wulf, L.W. Changes in anthocyanins, flavonoids and hydroxycinnamic acid
esters during fermentation and aging of Merlot and Cabernet Sauvignon. Am. J. Enol. Vitic.
1979, 30, 111-116.
55. Nick P., Probing the actin-auxin oscillator, 2010, Plant Signaling Behav 5: 4–9.
56. Nonaka, G.J.; Miwa, N.; Nishioka, I.; Stilbene glycoside gallates and proanthocyanidins
from Polygonummultiflorum. Phytochemistry. 1992, 21(2), 429-432.
57. Oszmianski, J.; Sapis, J.C. Fractionation and Identification of Some Low Molecular Weight
Grape Seed Phenolics. J. Agric. Food Chem.1989, 37, 1293-1297.
58. Pace-Asciak R., Hahn S., Diamandis E.P., Soleas G., Goldberg D.M., The red wine phenolics
trans-resveratrol and quercetin block human platelet aggregation and eicosanoid synthesis:
implications for protection against coronary heart disease. Clin. Chim. Acta.1995, 235,
pag.207–219.
58
59. de Pascual-Teresa S, Santos-Buelga C, Rivas-Gonzalo JC. Quantitative analysis of flavan-3-
ols in Spanish foodstuffs and beverages. J. Agric. Food Chem. 2000, 48, 5331–5337.
60. Pasinetti G.M., Ho L., Wang J. Methods for preventing and treating neurodegenerative
diseases. Pub.No.: US 2011/0111072 A1.
61. Pekic, B.; Kovac, V.; Alonso, E.; Revilla, E. Study of the Extraction of proanthocyanidins
from grape seeds. Food Chem.1998, 61(1-2), 201-206.
62. Peng Z, Hayasaka Y, Iland PG, Sefton M, Hoj P, Waters EJ. Quantitative analysis of
polymeric procyanidins (tannins) from grape (Vitisvinifera) seeds by reverse phase high-
performance liquid chromatography. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 26–31.
63. Pezet R., Pont V., Cuenat P., Method to determine resveratrol and pterostilbene in grape
berries and wines using HPLC and highly sensistive fluorimetric detection. J. Chromatogr.,
A, 663, 1994, pag.191-197.
64. Peyrot des Gachons, C.; Kennedy, J. A. Direct method for determining seed and
skeenproanthocyanidins extraction into red wine. J. Agric. Food Chem.2003, 51, 5877-5881.
65. Pinelo, M.; Laurie, V.F.; Waterhouse, A.L. A Simple Method To Separate Red Wine
Nonpolymeric and Polymeric Phenols by Solid-Phase Extraction. J. Agric. Food Chem.2006,
54, 2839-2844.
66. Pomohaci N., Cotea V.D., Stoian V., Nămoloșanu I., Popa A., Sîrghi C., Antoce A.,
Oenologie.București : Ed.Ceres, 2000, Vol.1, pag. 367.
67. Qiao F, Chang XL, Nick P., The cytoskeleton enhances gene expression in the response to
the Harpin elicitor in grapevine, 2010, J Exp Bot 61, pag.4021–4031.
68. Ribéreau-Gayon P., Dubourdieu D., Danéche B., et autres, Traite d’œnologie 1.
Microbiologie du vin. Vinification, Edition Dunod, Paris, 1998.
69. Rolinski, O. J., Martin, A., Birch, D. J. Ann. NY Acad. Sci. 2008, 1130, pag.314-319.
70. Romeyer, F.M.; Macheix, J.; Sapis, J. Changes and importance of oligomericprocyanidins
during maturation of grape seeds. Phytochemistry.1986, 25, 219-221.
71. Roy H., Lundy S., Resveratrol. Pennington Nutrition Series,2005 No.7
72. Santos-Buelga, C.; Francia-Aricha, E.M.; Escribano-Bailon, M.T. Comparative flavan-3-ol
composition of seeds from different grape varieties. Food Chem. 1995, 53, 197-201
73. Santos-Buelga, C.; Scalbert, A. Proanthocyanidins and Tannin-like Compounds – Nature,
Occurrence, Dietary Intake and Effect on Nutrition and Health. J. Sci. Food Agric.2000, 80,
1094-1117.
74. Scutaru I., „Paradoxul francez şi vinurile din Moldova‖, Universitatea Tehnică din Moldova,
1995, pag.7
59
75. Siemann E.H., Creasy L.L., Concentration of the phytoalexin resveratrol in wine. 1992. Am.
J. Enol. Vitic., 43, pag. 49-52.
76. da Silva, R.J.M.; Bourzeix, M.; Cheynier, V.; Moutounet, M. Procyanidin composition of
Chardonnay, Mauzac and Grenache blanc grapes. Vitis. 1991, 30, 245-252.
77. da Silva J, Rigaud J, Cheynier V, et al. Procyanidin dimers and trimers from grape seeds.
Phytochemistry. 1991, 30, 1259-1264.
78. da Silva, R.J.M.; Rosec, J.P.; Bourzeix, M.; Mourgues, J.; Moutounet, M. Dimer and
trimerprocyanidins in Carigan and Mourvedre grapes and red wines. Vitis. 1992, 31, 55-63.
79. Sîrghi.C., Zironi R., Aspecte innovative ale enologiei moderne. Editura ’’Sigma’’, Chişinău,
1994.
80. Sun, B.S.; Leandro, C.; da Silva J.M.R.; Spranger, I. Separation of Grape and Wine
Proanthocyanidins According to their Degree of Polymerization. J. Agric. Food Chem. 1998,
46, 1390-1396.
81. Teissedre, P.L.; Waterhouse, A.L.; Frankel, E.N. Principal Phenolic Phytochemical in French
Syrah and Grenache Rhone Wines and Their Antioxidant Activity in Inhibiting Oxydation of
Human Low Density Lypoproteins. J. Inter. Sci. de la Vigne et du Vin.1995, 29(4), 205-212.
82. Țîrdea C., Sîrbu Gh., Țîrdea A.,Tratat de vinificație. Iași : Ed."Ion Ionescu de la Brad",2000.
83. Uchida, S.; Edamatsu, R.; Hiramatsu, R.; Mori, A.; Nonaka, G.I.; Nishioka, I.; Ozaki, M.
Condensed tannins scavenge active oxygen free radicals. Med. Sci. Res.1987, 15, 831-832.
84. Vidal, S.; Cartalade, D.; Souquet, J.M.; Fulgrand, H.; Cheinier, V. Changes in
Proanthocyanidin Chain Length in Winelike Model Solutions. J. Agric. Food Chem.2002, 50,
2261-2266.
85. Vita J.A., Polyphenols and cardiovascular disease: effects on endothelial and platelet
function, 2005, Am J.Clin nutr.81 (1 suppl): 292S-297S.
86. Xiao J., Suzuki M., Jiang X., Chen X., Yamamoto K., Ren F., Xu M., J. Agric. Food. Chem.
2008, 56, pag.2350-2356.
87. Агеева Н. М. Гугучкина, Гонтарева Е.Н., Влияние микотоксинов на преврашение
летучих компонентов и органических кислот виноградных вин. Виноделие и
виноградарство, 2006, N3, стр. 22-24.
88. Положишникова М ., Перелыгин О., Н. Определение биологической ценности и
идентификация красных виноградных вин по содержанию флавонолов и
фенилкарбоновых кислот, Журнал : " Виноделие и Виноградарство", Москва,2005, №
6, стр.22-24.
89. http://www/quackwatch.org/01 QuackeryRelatedTopics/DSH/resveratrol.html
60
61