2. Fiziologia bacteriană. Clasificarea bacteriilor după necesităţile de cultivare.

Mediile de
cultură. Clasificarea mediilor de cultură.

FIZIOLOGIA BACTERIANĂ
CONSTITUłIA CHIMICĂ A BACTERIILOR
CompoziŃia chimică a celulei bacteriene este controlată genetic. Toate procesele care
au loc în celula bacteriană sunt asociate cu importante transformări chimice ale
constituenŃilor săi si de aceea cunoasterea compoziŃiei chimice a celulei bacteriene
contribuie la cunoasterea proceselor metabolice care conferă bacteriei marea sa putere de
adaptare si capacitatea de supravieŃuire în cele mai vitrege condiŃii de mediu.
 Apa, reprezintă 75 - 85% din greutatea umedă a bacteriei. Există apă liberă
(mediu de dispersie), fie apă legată fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au
puŃină apă si aceea sub formă de apă legată.
Rol:
- mediu de dispersie;
- reactiv în reacŃiile metabolice;
- etapă finală a unor reacŃii oxidative.
 SubstanŃele minerale reprezintă 2-30% din greutatea uscată a bacteriei (P, K,
Na, Ca, S, Cl, Fe, oligoelementele, Cu, Mg, Zn) si variază cu specia, vârsta
culturii, compoziŃia chimică a mediului. Unele elemente intră în compoziŃia
diferitelor structuri si enzime având astfel un rol foarte important în viaŃa celulei
bacteriene:
- favorizează schimburile cu mediul;
- reglează presiunea osmotică;
- stimulează cresterea si funcŃia bacteriei;
- activează unele sisteme enzimatice;
- contribuie la reglarea pH-ului si a potenŃialului de oxido-reducere;
 Glucidele reprezintă 10-25% din greutatea uscată a celulei bacteriene în raport
cu specia, vârsta si condiŃiile de dezvoltare. În structura bacteriană se pot găsi
glucide simple (mono si dizaharide) cu rol în metabolismul intermediar glucidic
precum si glucide complexe (polizaharide) care participă la realizarea structurii
peretelui celular si fac parte din capsula unor bacterii. Testele biochimice care
evidenŃiază utilizarea sau imposibilitatea utilizătii unui anumit zahar de către o
bacterie permit identificarea bacteriei respective.
 Proteinele reprezintă între 40-80% din greutatea uscată a bacteriei, aproximativ
jumătate din proteine funcŃionând ca enizme restul având rol structural.
Proteinele pot fi:
- simple sau holoproteine (albumine, globuline, histone, etc.) cu rol în metabolismul
intermediar protidic;
- complexe, de exemplu heteroproteinele:
mucoproteine – mucopolizaharidul de grup al S.pneumoniae;
cromoproteine – catalaze, peroxidaze, citocromi;
nucleoproteine – acizii nucleici.
 Lipidele reprezintă 1-10% din greutatea uscată a bacteriilor (excepŃie
micobacteriile unde pot ajunge până la 20 - 40%). Cantitatea de lipide variază în
raport cu specia, vârsta culturii si compoziŃia mediului. Lipidele bacteriene se pot
 găsi libere în vacuole, combinate sau făcând parte din structuri ale celulei
bacteriene (perete, membrană, mezozomi).
Lipidele bacteriene pot fi:
- fosfolipidele – lipoidul Treponemei pallidum;
- lipidul A din structura lipopolizaharidului bacteriilor Gram negative;
- acizi grasi, obisnuiŃi si speciali (acidul mycolic la Mycobacterii);
- ceruri la Mycobacterii
 PigmenŃii bacterieni, prezenŃi la bacteriile cromogene, pigmentogeneza fiind
dependentă de specie si de condiŃiile de cultivare. Constituie un criteriu important
de identificare a unor specii bacteriene: Staphylococcus, Pseudomonas, Sarcina.
După localizarea pigmentului bacteriile pot fi:
- cromofore, pigmentul rămâne legat de citoplasmă;
- paracromofore, pigmentul este prezent în perete sau în stratul mucos (S.aureus);
- cromopare, pigmentul este difuzibil în mediu (Pseudomonas).
După natura lor chimică pigmenŃii pot fi:
- carotenoizi: Staphylococcus, Sarcina;
- chinoinici: Mycobacterium;
- fenazinici Pseudomonas etc.
Roluri:
- protecŃie faŃă de radiaŃiile UV (pigmenŃi carotenoizi);
- enzimatic
- antibiotic (piocianina produsă de P.aeruginosa faŃă de B.anthracis).
 Enzimele bacteriene sunt elaborate sub control genetic, existând peste 2.000 de
determinanŃi genetici diferiŃi, în producerea enzimelor intervenind si mecanisme
de control care pot modifica bagajul enzimatic după necesităŃile bacteriei si în
funcŃie de variaŃiile mediului extern.
După locul de acŃiune, enzimele bacteriene se pot împărŃi în:
- enzime intracelulare sau endoenzime care rămân în celulă;
- enzime ectocelulare situate în membrana citoplasmatică, reglând permeabilitatea selectivă
(permeaze, translocaze);
- enzime extracelulare sau exoenzime, care sunt eliberate în mediu (hidrolaze).
În raport cu reacŃia catalizată enzimele pot fi:
- hidrolaze (fosfataza, proteaza);
- transferaze (aminotransferaza);
- oxido-reductaze (catalaza, oxidaza, peroxidaza);
- izomeraze etc.
După modul de apariŃie distingem enzime:
- constitutive, care există întotdeauna în celulă indiferent de natura mediului;
- adaptative (inductibile), sintetizate de către bacterie numai ca răspuns la anumiŃi compusi
apăruŃi în mediu (penicilinaza).
Pe lângă importanŃa inestimabilă pe care o are în natură, agricultură, industrie,
medicină, etc. activitatea enzimatică a bacteriilor este foarte utilă si în taxonomia
bacteriană.
 SubstanŃe cu acŃiune antibiotică sunt produse de către unele bacterii:
- bacteriocine produse sub controlul plasmidic, cu efect asupra altor bacterii receptive
înrudite: colicinele elaborate de E.coli; megacina produsă de B.megaterium;
- antibiotice polipeptidice produse de unele specii de Bacillus: polimixina produsă de
B.polymyxa; bacitracina produsă de B. licheniformis.
  Vitaminele bacteriene secretate de unele specii:
- tiamina (vitamina B1) sintetizată de E.coli, B.subtilis
- biotina produsă de E.coli, B.anthracis
- vitamine de grup B, K sintetizate sub influenŃa florei bacteriene intestinale umane.
 Factorii de crestere, sunt metaboliŃi esenŃiali pe care bacteria nu-I poate sintetiza
dar care sunt necesari, în cantităŃi mici, dezvoltării microorganismelor. Necesitatea
în aceste substanŃe variază după specia microbiană. Cantitatea mică necesară,
demonstrează că nu au rol plastic sau energetic în celulă, sunt doar biocatalizatori.

NUTRITIA BACTERIANĂ
Prin nutriŃie bacteriană se înŃelege suma proceselor metabolice care concur la
producerea de materiale convertibile în energie si în diferite componente celulare. Cu alte
cuvinte nutriŃia bacteriană este procesul de asimilare de către bacterii a substanŃelor
nutritive din mediul extern, fie ele organice sau anorganice, necesare metabolismului.
NutrienŃii sunt substanŃele nutritive care sub formă de soluŃie pot traversa membrana
citoplasmatică pentru a participa la reacŃiile metabolice specifice celulei bacteriene.
Pentru nutriŃie bacteriile folosesc compusii din mediile naturale pe care îi transformă în
nutrienŃi prin:
- solvire – minerale, CO2, O2;
- digestie extracelulară prealabilă, cu ajutorul unor hidrolaze – se formează aminoacizi din
proteine, monozaharide din polizaharide, acizi grasi si glicerol din lipide etc.
NutrienŃii pătrund în citoplasma celulei bacteriene traversând membrane citoplasmatică
prin:
- difuziune simplă, pe baza diferenŃelor de concentraŃie;
- difuziune facilitată (prin proteine carrier), tot pe baza gradientului;
- transport activ, contragradient, cu consum de energie .

NecesităŃi nutritive de bază

Elementele cu rol structural si funcŃional necesare majorităŃii bacteriilor sunt carbonul,
azotul, oxigenul si elemente minerale. Carbonul reprezintă aproape jumătate din greutatea
uscată a bacteriei, azotul este necesar pentru sinteza proteinelor iar oxigenul este prezent
sub formă de atomi în multe molecule biologice (aminoacizi, nucleotide) si este necesar ca
oxigen molecular pentru generarea energiei în cadrul respiraŃiei aerobe a bacteriilor.
Elementele minerale sunt reprezentate de:
- Sulf – prezent în unii aminoacizi, enzime, vitamine;
- Fosfor – pentru sinteza acizilor nucleici, fosfolipidelor de membrană;
- Fier, nichel, seleniu – în compoziŃia unor enzime: citocromi, peroxidaze;
- Sodiu, potasiu, magneziu, clor – asigură echilibrul fizico-chimic al celulei;
- Cobalt, cupru, mangan - activatori enzimatici.
În raport cu sursele folosite ca material de sinteză (sursa de azot si carbon), bacteriile se
împart în:
a) Bacteriile autotrofe, capabile să îsi sintetizeze metaboliŃii esenŃiali din compusii
anorganici, folosind CO2 ca sursă de carbon si azotul atmosferic sau săruri de amoniu ca
sursă de N. În funcŃie de energia utilizată pot fi fototrofe si chimiotrofe. Sunt bacterii care
trăiesc liber în natură, bacterii saprofite care trăiesc în sol, apă, etc. având rol în circuitul
materiei în natură.
b) Bacteriile heterotrofe, dependente de prezenŃa unor compusi organici, utilizează surse
organice de carbon, în special carbohidraŃi dar si proteine si lipide ce servesc în acelasi
timp ca surse de energie, iar azotul poate fi atât de natură anorganică cât si organică.
Prezintă în totalitate un metabolism de tip chimiosintetic, cu o mare diversitate de tipuri
metabolice.
Se disting următoarele tipuri principale:
b1. bacterii fixatoare de azot - folosesc surse organice de carbon si azot molecular,
atmosferic, trăiesc în sol, în simbioză cu plantele (genul Clostridium.);
b2. bacterii care folosesc carbon organic si azot din legături anorganice (E.coli);
b3. bacterii care folosesc atât carbon cât si azot organic- majoritatea speciilor saprofite si
potenŃial patogene, prezente în cavităŃile naturale ale omului, precum si speciile patogene
pentru om.
c) Bacterii paratrofe - bacterii citoparazite, trăiesc numai în interiorul unei celule vii; nu se
cultivă pe medii artificiale (Rickettsia, Chlamydia, Mycobacterium leprae).

Factori de crestere
Unele bacterii sunt capabile să-si realizeze integral sinteza metaboliŃilor esenŃiali
utilizând nutrienŃii prezenŃi în mediul lor de viaŃă. Mecanismele de sinteză sunt catalizate
de enzime a căror sinteză se află sub control genetic. O astfel de bacterie se numeste
prototrofă.
Dacă în cursul multiplicării bacteriene apare o mutaŃie în urma căreia nu se mai
sintetizează o enzimă, secvenŃa metabolică ce era catalizată de enzima respectivă va fi
blocată. Nu se va sintetiza un anumit metabolit esenŃial. Bacteria mutantă rezultată se
numeste auxotrofă si va supravieŃui doar dacă în mediu va fi prezent metabolitul
respectiv.
Bacteriile patogene, în urma adaptării la viaŃa parazitară au devenit dependente de
numerosi metaboliŃi esenŃiali pe care nu îi mai pot sintetiza, unele atât de dependente
încât nu pot fi cultivate in vitro.
MetaboliŃii esenŃiali pe care o bacterie nu mai poate să îi sintetizeze si trebuie oferiŃi
ca nutrienŃi preformaŃi se numesc factori de crestere.
Acesti factori de crestere pot fi oferiŃi de altă specie bacteriană care sintetizează
factorul de crestere respectiv, fenomen cunoscut sub numele de sintrofie. Un exemplu
elocvent îl constituie Haemophilus influenzae care creste satelit în jurul coloniilor de
S.aureus. ExplicaŃia constă în capacitatea stafilococului auriu de a sintetiza factor V
(NAD), metabolit necesar dezvoltării tulpinilor de Haemophilus influenzae. Cunoasterea
necesităŃilor nutritive ale bacteriilor face posibilă cultivarea lor în vederea izolării din
produsele patologice, a identificării si studierii lor.

Medii de cultură
Substratul nutritiv bogat în nutrienŃi si factori de crestere care satisface specia
bacteriană ce urmează a fi cultivată se numeste mediu de cultură.
CondiŃiile impuse mediilor de cultură:
- să fie nutritive;
- să fie sterile;
- să aibă un ph neutru (7,2 – 7,4)
- să aibă o anumită presiune osmotică;
- să asigure umiditate optimă etc.
Mediile de cultură se pot clasifica după foarte multe criterii.
 După provenienŃa nutrienŃilor:
- medii naturale – provin din produse de origine animală sau vegetală: cord, creier, ficat, ou,
cartof, soia etc.
- medii sintetice – cu compoziŃie riguros controlată, include componente chimic pure.
 După valoarea nutritivă a mediului:
- medii simple – permit cresterea germenilor nepretenŃiosi, conŃin numai ingrediente de
bază;
- medii îmbogăŃite – permit cresterea bacteriilor pretenŃioase, conŃin un plus de nutrienŃi
asigurat prin adaos de sânge, ser, plasmă, ou, extract de levuri etc.
 După consistenŃă:
- lichide – permit cultivarea unui produs monobacterian; sunt utile pentru studiul caracterelor
biochimice
- medii semisolide – conŃin o cantitate mică de agar, sunt utile pentru menŃinerea în viaŃă
a tulpinilor bacteriene, pentru studiul mobilităŃii bacteriilor sau pentru studiul unor caractere
biochimice;
- medii solide – care permit fixarea bacteriilor în punctul de inoculare, multiplicarea lor în
acel punct determinând apariŃia unui conglomerat vizibil cu ochiul liber numit colonie.
Mediile solide se obŃin prin:
coagularea termică a proteinelor din ser sau ou;
gelificare prin includerea în mediu a unui fitocoloid obŃinut din alge marine numit agar.
Acesta are următoarele proprietăŃi:
o se lichefiază la temperatura de fierbere a apei;
o se solidifică la aprox. 42ºC;
o meŃine starea de soliditate a mediului la temperaturi cuprinse între 0 - 80ºC;
o nu are aport nutritiv si nu este degradat în cursul metabolismului bacterian.
 După scopul utilizării:
- medii de izolare
o uzuale – pentru un număr mare de bacterii;
o selective – conŃin substanŃe inhibitorii pentru unele bacterii favorizând dezvoltarea
preferenŃială a altora;
o de îmbogăŃire – inhibă selectiv flora de asociaŃie favorizând multiplicarea unei specii
bacteriene
o diferenŃiale – conŃin un substrat pentru anumite enzime, utilizarea substratului respectiv
de către bacterie permiŃând identificarea bacteriei din culturi primare.
- medii de identificare – conŃin substraturi pentru anumite enzime, indicatori de pH, utilizaŃi
la încadrarea bacteriei într-o unitate taxonomică.
- medii de conservare, medii de transport etc.

CRESTEREA SI MULTIPLICAREA BACTERIILOR

În urma nutriŃiei bacteriilor si a activităŃilor lor de metabolism are loc cresterea celulei
bacteriene ca mărime si ca masă. Întrucât cresterea volumului cellular raportată la
cresterea suprafeŃei este mai mare la un moment dat se ajunge la un punct critic ce
impune restabilirea echilibrului optim între cele două variabile. Acest lucru se realizează prin
diviziune binară, mecanismul de înmulŃire pentru majoritatea bacteriilor. Înmugurirea sau
ramificarea este caracteristică unui număr foarte mic de specii bacteriene.
Pentru că bacteriile sunt prea mici cresterea este studiată la nivel de populaŃie
bacteriană si nu la nivel de celulă. Prin urmare când vorbim de cresterea bacteriană facem
referire la cresterea numărului de celule într-o populaŃie bacteriană si nu la mărimea celulei
bacteriene.
 Pentru a vorbi despre cresterea si multiplicarea bacteriană folosim următoarele noŃiuni:
- timp de generaŃie: timpul necesar dublării populaŃiei bacteriene, acesta fiind în medie
20 – 30 minute;
- rata de crestere: numărul de generaŃii în unitatea de timp;
- colonia bacteriană: totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule
bacteriene;
- cultura bacteriană: totalitatea coloniilor de pe suprafaŃa mediului solid;
o cultura mixtă: formată din mai multe tipuri de colonii (mai multe specii bacteriene);
o cultura pură: formată dintr-un singur tip de colonie (un singur germen).
- inocularea: depunerea unui produs biologic în cultura de celule, în oul de găină
embrionat, animale de laborator
- însămânŃare: depunerea unui produs biologic pe / în mediu de cultură.
Cresterea bacteriană este studiată pe medii de cultură optime pentru fiecare specie în
parte. În medii lichide celulele bacteriene sunt dispersate determinând modificări ale
aspectului mediului: tulburare uniformă, inel aderent de peretele flaconului, peliculă la
suprafaŃa mediului sau depozit. Pe medii de cultură solide multiplicarea unei celule
bacteriene formează colonia vizibilă cu ochiul liber după 18 – 24 de ore de la depunerea
germenului pe mediu. O colonie bacteriană provine dintr-o celulă bacteriană sau din bacterii
atasate (unităŃi formatoare de colonii = UFC). În funcŃie de dimensiuni, contur,
consistenŃă, transparenŃă, aspectul suprafeŃei, pigment, aderenŃa la mediu etc. coloniile
bacteriene pot fi:
- colonii tip S (smooth) – rotunde, bombate, suprafaŃă netedă, lucioase, margini circulare,
suspensionează omogen în ser fiziologic, produc tulburare în mediul lichid, caracteristice
bacteriilor patogene;
- colonii tip R (rough) – margini neregulate, plate, suprafaŃa rugoasă, uscată, aderente de
mediu, aglutinează spontan în ser fiziologic, în mediul lichid produc depozit cu supernatant
clar, sunt caracteristice pentru germeni degradaŃi, cu modificări antigenice, de virulenŃă.
Există trei specii bacteriene care fac excepŃie, crescând sub forma de colonii R pentru
tulpini patogene: Mycobacterium Tuberculosis; Corynebacterium diphtheriae; Bacillus
anthracis;
- colonii M (mucoid) – foarte mari, lucioase, suprafaŃa netedă, aspect uleios, caracteristice
pentru bacterii cu capsulă;
- colonii untoase – rotunde, bombate, margini regulate, suprafaŃa netedă, mate,
consistenŃă păstoasă (cremoasă), uneori pigmentate, caracteristice pentru levuri;
- colonii pufoase: reŃea de filamente (hife) aeriene, caracteristice fungilor filamentosi.
- fenomen de căŃărare (invazie, migrare, roire): cresterea se exprimă printr-un strat continuu, sub
forma unor valuri succesive; fenomen caracteristic pentru Proteus spp.

DINAMICA MULTIPLICĂRII BACTERIILOR

ÎnsămânŃate în mediu adecvat, incubate la 37° C, urm ărite din oră în oră bacteriile vor
urma 4 faze caracteristice ale multiplicării populaŃiei bacteriene:
a) Faza de latenŃă (faza de lag): reprezintă perioada de adaptare a bacteriilor la condiŃiile
de mediu, perioadă în care numărul germenilor rămâne nemodificat sau scade. Bacteriile
au un metabolism activ de sinteză al enzimelor ceea ce face ca celula bacteriană să
crească în dimensiuni. În această fază bacteria este foarte sensibilă la agenŃi
antibacterieni. Durata acestei faze este de aproximativ 2 ore, cuprinsă între momentul
însămânŃării mediului si momentul în care bacteria începe să se multiplice.
b) Faza de crestere logaritmică (faza exponenŃială): celulele bacteriene încep să se
dividă permanent, ritmic. Timpul de generaŃie în această fază este caracteristic pentru o
anumită specie: 10 minute pentru V. cholerae, 20-30 minute pentru majoritatea bacteriilor
patogene, 18 – 14 ore pentru M. tuberculosis. Numărul bacteriilor creste în progresie
geometrică. Bacteriile aflate în fază exponenŃială au toate caracteristicile speciei: afinitate
tinctorială, proprietăŃi biochimice si de metabolism, structura antigenică, virulenŃa si
toxigeneza sunt tipice specie respective. Sunt sensibile la acŃiunea agenŃilor
antibacterieni. Este etapa optima pentru studierea bacteriilor sau pentru recoltarea lor în
vederea preparării de vaccinuri si pentru testarea sensibilităŃii la antibiotice. Durata fazei
este de 8-12 ore.
c) Faza staŃionară (faza de concentraŃie "M"): mediul de viaŃă devine mai puŃin
favorabil prin consumul substanŃelor nutritive, acumularea de metaboliŃi toxici.
Numărul bacteriilor vii rămâne constant prin:
- persistenŃa bacteriilor vii, absenŃa multiplicării datorită epuizării unui nutrient din mediu
(factor limitant al cresterii);
- echilibru între bacteriile care mor si cele care iau nastere prin diviziune datorită acumulării
de cataboliŃi toxici si a pH-ului mediului.
Bacteriile au morfologia caracteristică speciei dar sunt mai puŃin sensibile la acŃiunea
agenŃilor antibacterieni. În această fază realizăm identificarea germenilor. La speciile
sporogene începe formarea sporilor. Durata acestei faze variază în raport cu specia si
condiŃiile de cultură, de la o oră la câteva zile, pentru unele bacterii poate dura câteva
săptămâni.
d) Faza de declin: substratul nutritiv sărăceste, metaboliŃii toxici sunt în cantitate mare
ceea ce face ca bacteriile moarte să depăsească progresiv numărul celor vii, până la
autosterilizarea culturii. În această fază bacteriile prezintă modificări morfo-tinctoriale, ale
caracterelor biochimice si de metabolism, de virulenŃă si toxigeneză. Apar forme de
involuŃie. La bacteriile sporulate fenomenul de sporogeneză devine foarte intens. Durata
fazei depinde de specia microbiană (N. gonorrhoeae 2-3 zile, la M. tuberculosis 2-3
săptămâni).
Cultivarea bacteriilor are ca scop:
- identificarea agentului etiologic al unei infecŃii – pentru identificarea bacteriilor se folosesc
culturi în faza staŃionară, în vârstă de 18 -24 de ore;
- determinarea farmacorezistenŃei microorganismelor izolate – ca inocul se folosesc culturi
în medii lichide, aflate în fază logaritmică, după 4 – 6 ore de incubare, însămânŃate pe
medii solide nutritive adecvate;
- preparare de seruri si vaccinuri, pentru obŃinerea unor produse de metabolism bacterian
(vitamine, antibiotice etc) - se folosesc culturi continue: cultura bacteriană se menŃine în
fază exponenŃială în permanenŃă prin adăugarea de mediu proaspăt culturii, în vase
speciale, turbidistat sau chemostat.