Lp 25: Identificarea spirochetelor. Diagnosticul de laborator al sifilisului.

Diagnosticul de laborator al leptospirozei

Obiective:
1. Cunoașterea principalelor caractere utilizate pentru identificarea spirochetelor
2. Cunoașterea metodelor de diagnosticul în suspiciunea de sifilis
3. Cunoașterea metodelor de diagnostic în suspiciunea de leptospiroză

1. Identificarea spirochetelor

Treponema Borrelia Leptospira

Caractere
microscopice Au perete de tip gram-negativ, spiralate, mobile

- subțiri, capete efilate - groase - fine, unul sau

ambele capete îndoite
în cârlig
- spire regulate - spire laxe și - spire regulate,
neregulate strânse, puțin adânci
- pot fi observate în - pot fi observate pe - pot fi observate în
microscopie pe fond frotiu colorat microscopie pe fond
întunecat și pe Giemsa sau Wright întunecat
preparate colorate prin și în microscopie pe - nu pot fi observate
impregnare argentică fond întunecat pe preparate colorate
- nu pot fi observate pe Gram sau prin
preparate colorate impregnare argentică
Gram sau Giemsa
Mobilitate - fibre axiale - fibre axiale - axistil format din 2
periplasmice înrulate periplasmice flageli periplasmici
în jurul proroplastului în jurul cărora se
înrulează protoplastul
Caractere de - strict aerobe sau - microaerofile - strict aerobe
cultură microaerofile
- foarte pretențioase - pretențioase - pretențioase nutritiv
nutritiv nutritiv - temperatura optimă
- speciile patogene nu - cultivă lent 28 – 30 ⁰ C
cultivă pe medii
acelulare

1
2. Diagnosticul de laborator în suspiciunea de sifilis

Diagnostic direct

Produse patologice:
– serozitate exprimată prin comprimarea bazei şancrului (stadiul I)
– aspirat din puncţia ganglionilor afectaţi (stadiul I)
– raclat din elemente eruptive cutanate sau mucoase (stadiul II)

Microscopie optică pe fond întunecat (preparat umed lamă – lamelă)

- treponeme strălucitoare, subţiri, spiralate, cu capete efilate, mobile
- poate da reacţii fals pozitive (treponeme orale) /fals negative (sensibilitatea redusă)
- risc de contaminare pentru personalul de laborator
IFD – metodă sensibilă şi specifică
Impregnare argentică- pe secţiuni histologice

Diagnostic indirect (util pentru screening și stadiul III)

Teste serologice nespecifice / non-treponemice: testele pozitive se confirmă prin teste

specifice
o VDRL (Venereal Disease Research Laboratory)
o RPR (Rapid Plasma Reagin)
- depisteaza Ac tip reagine faţă de Ag cardiolipinic
- sunt rapide şi ieftine
- utilizate pentru urmărirea eficienţei terapiei
- reacţii fals pozitive: boli acute febrile, vaccinare recentă, sarcină, boli autoimune sau de
colagen, infecţii hepatice cu distrucţie tisulară, etc.
- numai VDRL poate fi utilizat pentru testarea LCR la pacienţi suspectaţi de neurosifilis

Teste serologice specifice / treponemice:

- evidenţiază anticorpi specifici (specificitate 97-99%)
- se pozitivează înaintea celor nespecifice
- rămân pozitive cand cele nespecifice sunt negative (sifilis tertiar)
- sunt mai puţin influenţate de terapie
o FTA-ABS (Fluorescent treponemal antibody absorption)
- IF indirectă cu seruri adsorbite cu suspensii de T. Reitter;
- departajează Ac IgM de cei IgG (util pentru diagnosticul infecției la nou-născut)

o TPHA (Treponema pallidum hemagglutation)

- hemaglutinare pasivă
- reacţie calitativă
- testele pozitive persistă după vindecare

Variante ale TPHA:

TPPA (Treponema pallidum particle agglutination) - foloseşte particule inerte în locul
hematiilor
MHA-TP (test de microhemaglutinare)

Altele: EIA și WB
TPHA, FTA-Abs și EIA – utilizate, de regulă, ca teste de confirmare

2
 o Western blot (alternativă, ca test de confirmare în loc de FTA-Abs și MHA-TP)
Folosește antigene recombinante din membrana lipidică. Este mai specific.

WB – diagnostic sifilis (sursa: Hagedorn H-J et all, Evaluation of INNO-LIA Syphilis Assay
as a confirmatory test for syphilis, 2002).

Diagnosticul sifilisului congenital

- titrarea în dinamică la interval de 6 luni a Ac
- depistarea Ac tip IgM

3. Diagnosticul de laborator al leptospirozei

Diagnosticul direct in leptospiroza:

Clasificarea leptospirelor:
- tulpinile patogene sunt reunite în specia Leptospira interrogans (e.g. serovaruri
Icterohaemorrhagiae, Autumnalis, Canicola, Pomona etc.)
- tulpinile nepatogene au fost încadrate în specia Leptospira biflexa (serovar Patoc).

Produse patologice:
- sânge
- LCR
- urină
- postmortem: microfragmente de ficat, corticală renală, plămâni, suprarenale.
Examen microscopic:
a. Microscopia pe fond întunecat:
→ indicată pentru sedimentul urinar şi LCR
→ în sânge expansiunile fibrilare ale hematiilor pot fi confundate cu leptospirele
→ leptospirele = filamente regulat spiralate, luminiscente, foarte mobile, descriind mişcări de
„sfredel”
→ metodă lipsită de sensibilitate şi nespecifică
b. Imunofluorescenţa directă = metodă specifică
Cultivarea:
→ Izolare din sânge sau LCR în primele 10 zile de boală;
→ Izolare din urină după prima săptămână de boală, timp de 3 luni;
3
→ Sunt necesare mai multe probe deoarece concentraţia leptospirelor poate fi scăzută;
→ Cultivă optim la 28-30 ºC, în aerobioză, pe mediu de cultură lichid Korthof îmbogăţit cu
ser de iepure;
→ Culturile se urmăresc până la 30 de zile prin microscopie pe fond întunecat la intervale de
5 zile.

Tehnici de biologie moleculară

- PCR
- Metode de hibridizare directă

Diagnosticul serologic in leptospiroza

Reacţia de aglutinare microscopică = metoda de referinţă
- măsoară capacitatea serului pacientului de a aglutina leptospire vii;
- utilizează antigene specifice de tip preparate din tulpini patogene;
- practicată doar în laboratoarele de referinţă.

Aglutininele apar în a doua săptămână de boală.

Titrul la pacienţii infectaţi este > 100 (în cazul seroconversiei) și > 400, pe probă unică.

Se mai utilizează în studii de supraveghere, pentru depistarea unor infecții latente (pentru
grupe profesionale cu risc crescut – lucrătorii în salubritate).

Teste alternative:
- hemaglutinarea indirectă
- aglutinarea pe lamă
- ELISA
→ mai puţin sensibile sau specifice
→ folosesc antigene preparate din tulpini saprofite
Mai există și alte teste rapide: lateral flow assay, LA
Sursa: https://www.slideshare.net/GRFDavos/diagnosis-of-leptospirosis

Bibliografie: Buiuc D. Microbiologie Medicală, ed. a VI-a, Editura “Gr. T. Popa” Iaşi, 2003,
cap. 20, pag. 261-271.
În sală se găsește cultură de Leptospira biflexa pentru examinarea la microscopia pe fond
întunecat.