MINISTERUL SĂNĂTĂȚII, MUNCII ȘI PROTECȚIEI SOCIALE

AL REPUBLICII MOLDOVA

UNIVERSITATEA DE STAT DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

”NICOLAE TESTEMIȚANU”

Tamara COTELEA
Lidia SIMONOVA

Metoda cromatografiei gaz-lichide:

aplicarea în analiza chimico-toxicologică
(recomandări metodice pentru studenţii anului IV)

CHIŞINĂU
2019
1
CZU 615.015(076.5)
C 76

Lucrarea a fost aprobată la CMC al USMF Nicolae Trstemițanu

proces-verbal nr.2 din 20.11.14

Autori:
Tamara Cotelea – conferenţiar universitar, doctor în științe far­
ma­ceutice
Lidia Simonova – conferenţiar universitar, doctor în chimie

Recenzenţi:
V. Valica – profesor universitar
Corina Scutari – conferențiar universitar

Redactor: În redacția autorului

DESCRIEREA CIP A CAMEREI NAȚIONALE A CĂRȚII

Cotelea, Tamara.
Metoda cromatografiei gaz-lichide: aplicarea în analiza chimico-
toxicologică: (recomandări metodice pentru studenţii anului IV) / Tamara
Cotelea, Lidia Simonova; Univ. de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae
Testemiţanu”, Fac. de Farmacie, Catedra de chimie farmaceutică şi
toxicologică. – Chişinău : Medicina, 2019. – 59 p. : fig., tab.
Bibliogr. la sfârşitul temelor. – 50 ex.
ISBN 978-9975-82-125-4.
615.015(076.5)
C 76

ISBN 978-9975-82-125-4 © CEP Medicina, 2019

©T. Cotelea, L. Simonova, 2019
2
 INTRODUCERE

În ultimele decenii, arsenalul preparatelor medicamentoase s-a

completat cu un şir de preparate noi: sulfanilamidele, unele antibiotice,
vitamine, preparate antituberculoase, psihotrope, hormonale, cardiace ş.a.
Creşterea numărului de forme medicamentoase este însoţită de apa­riţia
unor noi metode de analiză calitativă şi cantitativă. Una dintre acestea este
metoda cromatografiei gaz-lichide.
Aceasta este o metodă sensibilă, universală şi specifică, care oferă
posibilităţi atât pentru identificarea și dozarea substanţelor medicamen­
toase din preparate și lichide biologice, cât şi pentru separarea ingre­di­en­
telor din amestec.
În prezent, cromatografia gaz-lichide se aplică în laboratoarele bio­
chimice, chimice, clinice ş.a. Însă literatura încă nu a descris suficient
această metodă pentru ca ea să poată fi aplicată în practica chimico-far­
maceutică.
Aceste recomandări metodice sunt destinate studenţilor, fiind un ghid
de orien­tare în domeniul analizei chimico-toxicologice a toxicilor volatili.
În această recomandare sunt incluse metodele de executare a lucrărilor in­
di­viduale, care cimentează cunoştinţele studenţilor în do­me­niul determi­
nării substanţelor toxice din materialul biologic: sunt for­mu­late scopu­rile,
expus planul, informațiile de ultimă oră, subiectele ce stau la baza studierii
temei, indicaţiile pentru lucrul practic al stu­den­ţilor în labo­rator.

3
 Lucrarea de laborator N 1

Tema: Cercetarea substanţelor toxice, care se izolează din materialul

biologic prin metoda antrenării cu vapori de apă, aplicînd
cromatografia gaz-lichidă

Scopul studierii temei: A-i învăţa pe studenţi să efectueze analiza

chimico-toxicologică a toxicilor volatili izolați din materialul biologic,
aplicînd metoda cromatografiei gaz-lichidă.

Obiectivele

1. Însuşirea tehnicii de lucru cu cromatograful: reglarea parame­tri­lor de

bază – temperatura, viteza gazului vector, verificarea lucrul prin­ci­
pii­lor de dozare.
2. Însuşirea tehnicii de analiză a probelor lichide şi gazoase cu con­ţi­nut
de substanţe toxice.
3. Prelucrarea cromatogramelor, calcularea timpului de retenţie corec­
tat şi relativ.
4. Identificarea toxicilor volatili prin metoda cromatografiei gaz-li­chi­­de.
5. Principiile de bază ale CGL.
6. Schema cromatografului gaz-lichid.
7. Măsurarea valorii „timpului de reţinere” pe cromato­gra­mă: de la
momentul introducerii probei, de la maximul picului de aer.
8. Definiţia timpului de reţinere corectat şi a celui relativ.
Echipamentul necesar pentru realizarea lucrării de laborator

1. Cromatograful gaz-lichid cu detector şi termostat la t°, microseringi

pentru 1mcl şi 10 mcl.
2. Flaconul cu lichide pentru spălarea microseringelor: cu alcool, cu eter.
3. Linia de măsurare, triunghiul, lupa.
4. Colba cu apă de săpun şi periuţa.
Obiectele de cercetare
Amestec model din 2 toxici volatili alcătuit din următoarele com­po­­nente:
cloroform, alcool metilic, etilic, butilic, izobutilic, acetonă, eti­lace­tat, toluen,
dioxan, benzen, tetraclorură de carbon, dicloretan, hexan, soluţie standard
intern de alcool propilic.

4
 Subiectele ce stau la baza pregatirii individuale
1. În ce compartiment al cromatografului se efectuează separarea
substan­ţelor?
2. Care este avantajul metodei CGL faţă de metodele chimice pentru
analiza toxicilor „volatili”?
3. Cum înţelegeţi noțiunea de „înălţime”, „talere teoretice echiva­lente”?
4. Ce fel de dozatoare se folosesc pentru transmiterea probelor ga­-
zoase şi lichide în coloana cromatografului?
5. Cum se schimbă mărirea tipului de retenţie a substanţelor în co­-
loană în timpul analizei calitative?
a. De la momentul introducerii probei.
b. De la maximumul picului de aer.
c. De la maximumul picului vecin?
6. Ce este timpul de retenţie corectat şi timpul de retenţie relativ şi de
care parametri ai cromatografului depind aceștia?
7. Explicaţi noțiunile:
− timpul reţinerii,
− distanţa de reţinere,
− volumul de reţinere.
8. Prin ce se determină selectarea fazei staţionare lichide?

Material informativ
Ca metodă de separare şi analiză a substanţelor, metoda cromato­grafică
a fost elaborată de savantul rus M.S. Tswet, în 1903. Prin acea­stă metodă au
fost separaţi pigmenţi vegetali pe o coloană umplută cu carbonat de calciu,
folosind ca eluent eterul de petrol. În urma acestor cercetări a fost stabilit,
că pigmentul verde al plantelor, clorofila, care se consideră omogen este de
fapt alcătuit din câteva substanţe. Aceasta s-a dovedit după ce extractul de
frunză (verde) a fost trecut printr-o coloană de praf de cretă, praful a fost
spălat cu solvenţi organici, pe care au apărut câ­teva zone colorate, ceea
ce arăta fără echivoc, că în extract sunt, incon­testabil prezente mai multe
substanţe. Ulterior, în urma aces­tei expe­rienţe, acest fapt a fost confirmat
şi de alţi cercetători. Această me­todă a fost numită cromatografie (grec.
chromatos – „culoare”, graphos – „scriere”).
În 1941, Martin şi Synge, bazându-se pe fenomenul deja cunoscut,
încearcă să separe aminoacizii, folosind o coloană umplută cu silicagel
saturat cu apă, iar în fază mobilă, folosesc cloroform amestecat cu adausuri
5
din ce în ce mai mari de alcool n-butilic. Astfel, apare croma­to­grafia de
separare pe coloană.
În 1944, Gordon şi Martin pun bazele cromatografiei pe hârtie. Fiind foarte
simplă, metoda cromatografiei pe hârtie se dezvoltă şi se aplică la separarea
amestecurilor de substanţe organice şi ulterior, a celor anor­ganice.
Această metodă oferă informaţii în timp foarte scurt şi necesită un efort
minim.
Cromatografia de gaze s-a dezvoltat datorită perfecționării detecto­ri­lor,
folosirii diferitelor faze staţionare şi mobile noi.

Clasificarea metodelor cromatografice

Metodele cromatografice fac parte din metodele de separare, ba­zate
pe echilibrul dintre faze. Aceste metode fac să apară clar diferenţa dintre
proprietăţile de separare a componenţilor amestecului între două faze: de
contact şi nemiscibilă. Caracteristica generală a metodei cro­ma­tografice
depinde de natura fazelor (I) și de procesele, care au loc la separare (II), de
efectuarea cromotografiei (III) (fig. 1).
Metodele de separare şi analiză cromatografică nu sunt specifice. În
procesul de analiză cromatografică se ia în considerare natura fa­zelor,
prezenţa compuşilor care interferează cu compuşii analizaţi. În alte cazuri,
este necesară izolarea unor compuşi necunoscuţi în vederea caracterizării
ulterioare a acestora sau a analizei complete a unui ames­tec complex,
necunoscut, prin separarea compo­nen­ţilor, urmată de ana­liza de structură
şi determinarea cantitativă.
Tehnicile de separare au fost create în funcţie de proprietăţile ames­
tecurilor (în limite extrem de mari), volatilitate şi alte proprietăţi.
Complexitatea tehnicilor de separare este corelată cu proprietăţile
componenţilor care vor fi separați. În unele cazuri, izomerii optici se pot
separa prin tehnici speciale. În alte cazuri, proprietăţile acestora sunt atât de
diferite, încât separarea poate fi realizată printr-o tehnică simplă (disti­larea).
După ce componenţii din amestec au fost separaţi, se poate alege
metoda adecvată de determinare.

6
 Cromatografie (C)

Cromatografie de gaze (CG) Cromatografie de gaze (CL)

Cromatografie Cromatografie Cromatografie Cromatografie

gaz-solid (CGS) gaz-lichid (CGL) lichid-solid (CLS) lichid-lichid (CLL)

Cromatografie Cromatografie Cromatografie Cromatografie Cromatografie

de absorbție de repartiție bazată pe procese prin excluziune bazată pe
chimice: schimb sterică interacțiunea
ionic, complexare, cu câmpul:
precipitare, oxido- electroforeză
reducere

Cromatografie capilară Cromatografie pe coloană Cromatografie pe strat subțire

Fig. 1. Schema clasificării metodelor cromatografice

Dinamica proceselor cromatografice

Determinarea parametrilor de retenţie
Separarea cromatografică se bazează pe distribuţia diferită a com­
ponenţilor unui amestec între două faze nemiscibile, dintre care una este
staţionară şi poate fi lichidă, solidă sau sub forma de gel, iar alta este
mobilă şi poate fi în stare gazoasă sau lichidă. Distribuţia componenţilor
amestecului care se va analiza între cele două faze se realizează, în ge­
ne­ral, prin diverse procese fizice (sorbţie-desorbţie, excluziune sterică),
fizico-chimice (repartiţie, dizolvare-eliminare), chimice (schimb ionic,
preci­pi­tare, complexare, oxido-reducere etc.). Din punct de vedere can­
titativ, repartiţia componenţilor amestecului analizat între cele două faze
este determinată de raportul dintre can­ti­tatea de component în faza sta­
7
ţionară şi mobilă şi se numeşte constantă de distribuţie a compo­nentului
în siste­mul dat:
C
K = s (1)
Cm


unde: K – constanta de distribuţie,
iar CS şi Cm – concentraţia (sau cantitatea) totală a tuturor formelor unui
component analizat, prezent la echilibru în faza staţionară şi respectiv
mobilă.

În funcţie de procesul predominant la momentul separării, când com­

ponentul analizat este prezent numai într-o anumită formă în ambele faze,
deose­bim constanta de repartiţie, constanta de adsorbţie etc. În acest caz,
procesele secundare sunt neglijabile. Aceste constante se no­tează şi se
calculează analogic constantei de distribuţie, iar CS şi Cm re­prezintă con­
centraţia (sau cantitatea) de component într-o anumită for­mă în ambele faze.
K – depinde de natura fazelor, tº, pH, forţa ionică a soluţiei (dacă faza
mobilă este lichidă) etc.
Substanţa este introdusă pe coloană în faza mobilă. Ea se tran­spor­tă
(se reţine) în faza staţionară total sau parţial, prin adsorbţie, repartiţie,
excluziune, reacţie chimică etc. Totodată, substanţa reţinută deja în faza
staţionară contactează încontinuu cu noi porţii de fază mobilă şi total
sau parţial se transferă din nou în faza mobilă. Faza mobilă deplasează
încontinuu substanţele analizate pe un sector nou unde, din nou, are loc
acelaşi act elementar de echilibru.
Să separăm, pe o coloană cromatografică, un ames­tec din doi com­
ponenţi A şi B. Cantitatea de substanţă în faza mobilă şi staționară va
fi: [A]m, [B]m şi [A]S, [B]S. Din momentul introducerii ames­tecului pe
coloană, la interfaţa dintre cele două faze nemiscibile, în conformitate
cu legea echilibrului chimic, se stabilesc echilibre dina­mice pentru fiecare
component. Fiecare component A şi B va avea respectiv coefi­ci­en­tul de
distribuţie KA şi KB (fig. 2).
Cu cât componentul se va reţine mai mult în prima fază, cu atât şi
concentraţia acestuia va fi mai mare în a doua fază şi mai mică în cea­
laltă fază, şi invers. De exemplu, dacă componentul A se reţine mai mult
în faza staţionară decât componentul B, atunci, coeficientul respec­tiv de
distribuţie va intra în relaţia: KA > KB.

8
 C
A,B [A]m↔ [A]s
A
B [B]m ↔ [B]s

A [A]s
K A=
[A]m
B
X [B]s
KB =
[B]m

Fig. 2. Coloana cromatografică. Schema de formare a zonei de component în

metoda de evoluţie şi repartizarea substanţei în zona de component

Orice separare cromatografică se caracterizează prin factorul de

retenţie (sau retenţia) – R, care este raportul dintre viteza de migrare a
componentului (VZ) şi viteza de migrare a fazei mobile (eluentului) – (V)
în faza staţionară dată:

R = Vz (2)
V

Valoarea numerică a lui R este subunitară (0 < R < 1). În condiţii
extreme, dacă Vz = 0, atunci R = 0 şi substanţa este totalmente reţinută pe
coloană. Dacă Vz = V, atunci R = 1 şi substanţa este purtată de faza mobilă
fără a interacţiona cu faza staţionară.
De aici rezultă, că factorul de retenţie şi viteza de migrare a substan­ţei prin
coloană sunt invers proporţionale cu constanta de distribuţie a aces­teia.
Viteza de migrare a substanţei prin coloană poate fi definită ca ra­portul
dintre înălțimea coloanei parcurse de substanţă (L) şi timpul de reţinere a
acesteia (tR) pe coloană:
L
Vz = (3)
tR

Deoarece înălțimea coloanei şi viteza fazei mobile în condiţiile date sunt
mărimi constante, timpul de reţinere este direct proporţional cu constanta
de distribuţie. Acesta este uşor măsurabil, serveşte ca para­metru de retenţie
în analiza calitativă cromatografică şi se numeşte timp de retenţie.

9
 Timpul de retenţie poate fi definit ca timpul în care substanţa a eluat
(s-a deplasat) prin coloană de la momentul introducerii şi până la detecţia
concentraţiei maxime la ieşirea ei din coloană.
Alt parametru de retenţie utilizat în cromatografie este volumul total
de retenţie (V2), care poate fi definit ca volumul de eluent măsurat de la
introducerea probei pe coloană şi până la ieşirea concentraţiei maxi­me a
componentului de pe coloană.
Volumul de retenţie (VR) este proporţional cu timpul de retenţie (tR):
VR = tR × F (4)

unde: F este viteza volumetrică a gazului purtător.

Parametrii de retenţie (tR, VR) depind de natura fazelor, de presiu­nea

fazei mobile, masa fazei staţionare, pH, tº, parametrii geometrici ai coloanei
etc. Dar aceste mărimi pot fi influenţate de diferiţi factori oca­zionali.
Pentru componenţii A şi B, parametrii de retenţie se vor afla în
următoarele relaţii:
K A > KB
VA < VB
tR (A) > tR (B) (5)
VR (A) > VR (B)
Prin urmare, componenţii amestecului analizat, având coeficienţi de
distribuţie diferiţi, se vor deplasa, în procesul eluţiei, cu diferite vi­teze şi
vor avea în condiţiile date un timp de reţinere diferit. În conse­cință, se va
realiza separarea componenţilor.
Constanta de distribuţie este factorul principal, care determină se­
pararea substanţelor pe coloana cromatografică. Cu cât mai mare va fi
diferenţa dintre valorile constantelor de distribuţie, cu atât mai efectivă va
fi separarea cromatografică în condiţiile date.
Cromatografia este un proces dinamic bazat pe realizarea mul­tiplă
a actelor de echilibru în cazul distribuţiei componenţilor ame­ste­­cului în
cele două faze nemiscibile ce vin în contact.
În cromatografia de gaze, separarea componentelor dintr-un ames­
tec complex se realizează între o fază mobilă gazoasă şi o fază staţio­na­ră
solidă (CGS) sau lichidă (CGL). Mecanismul separării poate fi un pro­ces

10
de adsorbţie (CGS) sau de repartiţie (CGL).
CG permite separarea atât a substanţelor volatile (stabile la tem­pe­
ratura de volatilizare), cât şi a celor care, în urma unor reacţii chi­mice
(derivatizare), pot fi transformate în derivaţi volatili şi stabili.
Faza mobilă este constituită dintr-un gaz inert: Heliu, Argon, Neon,
Hidrogen, numit şi gazul vector (purtător), care antrenează substanţele ce
se vor determina.
Faza fixă (staţionară) este formată dintr-un adsorbent în cazul CGS
sau dintr-un suport inert granulos (0,15-0,18 mm) impregnat cu un lichid
de impregnare, puţin volatil sau lichid selectiv, în cazul CGL. Faza fixă este
tasată în coloană sau depusă pe pereţii unor co­loane capilare.
Aparatul şi principiile de funcționare

În figura 3 este reprezentată schema principiului de funcționare a

unui cromatograf de gaze de tipul „Crom-5”. Componentele esenţiale
ale cromatografului cu gaz purtător permit acestuia să asume mai multe
funcții: fază mobilă (1); reductor de presiune (2); uscător puri­fi­­cator (3);
bloc de control fin (4); debitmetru (5); dispozitiv de injectare pentru
introducerea probei (6); coloane paralele (7); de­tector (8) şi imprimantă
(11). Dispozitivul de injectare, coloanele şi detectorul sunt amplasate în
cuptoare cu reglare şi control automatizat al temperaturii.
3 4
2
1 6
5
6
5
1 7
7

8
11 10

Fig. 3. Schema principiului de funcționare a cromatografului de gaze

Într-un cromatograf reglat la un anumit debit de reglatorul de debit, gazul
vector care provine de la „sursa de gaz” traversează camera de injectare

11
a probei şi antrenează substanţele volatile spre coloana cro­ma­tografică.
Volumul cuprins între capul de injectare şi capătul coloanei tre­buie să
fie cât mai mic posibil. O metodă mai nouă constă în in­jec­ta­rea direct în
coloană, la 1-2 cm mai jos de nivelul maxim. Din coloană, curentul de gaz
este introdus în detector. Detectorul transformă dife­ren­ţa unei proprietăţi
fizice dintre componentele probei şi gazul purtător într-un semnal electric,
proporţional cu concentraţia componenţilor din faza gazoasă; se produce
un semnal, care se înregistrează. Înregistra­to­rul trasează o curbă în formă
de clopot. Reprezentarea grafică a semna­le­lor detectorului se numește
cromatogramă (fig. 4).
Picul cromatografic. Parametrii de bază şi mărimile derivate
Picul este secţiunea cromatogramei trasată de detector la apariţia
componentului separat în gazul purtător. În cazul separării incomplete,
în acelaşi pic pot apărea mai multe componente. În gaz-cromatogramă se
înscrie linia de bază, care se înregistrează inițial, când din coloană iese
numai gazul purtător.
Componentele probei se separă din coloană şi o părăsesc una după alta
într-o anumită ordine, după intervale de timp determinate.

tR2
tR1
tR1
t0

w1/2.1
h1

1/2h1

a b 0,05h2
w1 w2

Fig. 4. Parametrii de bază ai picului şi mărimile derivate

Timpul de retenţie (tR) este timpul aflării substanţei analizate în siste­­mul

cromatografic. În practică, aceasta este intervalul de timp dintre mo­men­
tul introducerii probei în coloană până la momentul înregistrării amplitu­

12
dinii maxime a picului cromatografic. Fiecare substanţă, în unele şi aceleaşi
condiţii, îşi are timpul său de retenţie – parametru ce stă la baza identificării
componenţilor amestecului care se analizează.
Timpul „mort” (to) este timpul de trecere a eluentului prin sistemul cro­
matografic și mărimea, ce caracterizează un sistem cromato­grafic concret
cu o viteză dată a fluxului de eluent. Timpul mort este timpul de eluare al
componentului nereţinut. În practică, determinarea tim­pului mort este dificilă
și este legată de inexistenţa substanţelor ab­solut nereţinute, deaceea, până
în prezent nu este elaborată o metodă unică de determi­nare. Astfel, când se
determină to prin metoda HPLC cu fază inversă, se utilizează nitraţii, mai
rar bromurile sau nitrometanul.
Timp de retenţie corectat sau net (recalculat) (t′R ) – timpul mediu,
în decursul căruia moleculele substanţei se găsesc în faza staţionară. Se
determină ca diferinţă:

t′R = tR – to (6)

Factor de capacitate (coeficient de capacitate):

t (t _ t ) t _
K′ = tR = R t o = tR 1 (7)
o
o o

Aceasta este o mărime proporţională coeficientului de distribuţie a

sorbatului între faza mobilă şi staţionară. Este un parametru mai univer­sal
decât timpul de retenţie.
Înălţimea picului cromatografic (h) – distanţa dintre vârful picului şi
linia de bază. Practic aceasta este lungimea perpendicularei, dintre punctul
de vârf al picului și linia de bază interpolară. Mărimea aceasta se utilizează
la calcularea limitei de detecţie și la analiza cantitativă în același rând cu
aria picului.
Lăţimea la jumătatea înălţimii picului (ω1/2) – distanţa orizontală
dintre liniile, ce limitează profilul de pic la jumătatea înălţimii acestuia.
Pentru picul gaussian w1/2 =2,345 σ. Se utilizează la calcularea eficien­ţei
coloanei şi a altor mărimi.
Lăţimea la baza picului (w) – segmentul de linie cuprins între tan­
gentele trasate în punctele de inflexiune pe pantele picu­lui, sau distanţă
orizontală dintre punctele situate la nivelul 0,044 h. Pentru picul gaussian
ꞷ = 4 σ. În practică, este complicat de măsurat exact această valoare, de
aceea, de obicei se utilizează mărimea w1/2
13
 Factor de asimetrie (As) – mărimea ce caracterizează gradul de
asimetrie orizontală a picului. Pentru picurile simetrice, printre care şi cele
gaussiene, As = 1; mărimea As < 1 corespunde frontului ascendent mai
întins al picului „fronting”, iar când As > 1 este mai întins și frontul des­
cen­dent „tailing”. Există diverse procedee de determinare a facto­ru­lui de
asimetrie; cel mai adesea se aplică egalitatea:
(a0,05 + b 0,05) ꞷ0,05
As = = (8)
2a 2a

unde: a0,05 şi b0,05 – lăţimea ce corespunde porţiunii anterioare şi posterioare
a picului la nivelul 0,05 h.

Eficienţa coloanei (N) se exprimă prin numărul de talere teoretice şi

este legată de parametrii funcţiei Gauss:
tR
N=
s
Selectivitatea (factorul de separare) (a) capacitatea sistemului cro­ma­
tografic de a separa doi analiţi.
tR2 (tR2 – to) K'2
a = t = t – t = 2 (9)
R1 R1 o K 1

Ea reflectă doar gradul de separare a maximelor de pic fără a lua în

considerare lăţimile acestora.
Factorii care condiţionează separarea gaz-cromatografică:
1. Natura izotermei de repartiţie;
2. Volumul şi principiile de injectare în coloana probei de anali­zat;
3. Natura gazului vector;
4. Programarea temperaturii şi a debitului de eluant;
5. Natura fazelor;
6. Tipul de detector.
Forma picului cromatografic depinde de tipul izotermei de ad­sor­b­
ţie. La temperatură constantă, adsorbţia se măreşte la creşterea presiunii
gazului ori a concentraţiei soluţiei.
Izoterma de adsorbţie este dependenţa cantităţii substanţei adsor­bite
de presiunea gazului purtător sau concentraţia soluţiei la tempera­tură
constantă (fig. 5).
14
 CS c Cs
a
b a c
b

Cm v

Fig. 5. Diferite tipuri de izoterme Fig. 6. Forma picului în funcţie

de tipul izotermei de absorbție
În cazul adsorbţiei liniare (fig. 5a), forma picului cromatografic este
simetrică de tip goussian (fig. 6a). În prac­tică, deseori, dependenţa cantităţii
substanţiei adsorbite de concentraţia soluţiei sau de presiunea gazului nu
este liniară. Izoterma adsorbţiei poate fi de exemplu, curbă, convexă (fig. 5b)
şi atunci forma picului este asimetrică, cu coadă (fig. 6b), sau concavă (fig.
5c) şi atunci se obţin picuri „frontale” (fig. 6c).
Izoterma de repartiţie trebuie să fie liniară pentru a obţine picuri
cromatografice simetrice. În cazul izotermelor neliniare de adsorbţie se
recomandă blocarea parţială a centrilor activi de adsorbţie prin depu­ne­rea
unui lichid greu volatil sau să se lucreze cu diluţii mari.
Dispozitivul pentru introducerea probei (fig. 7) este amplasat astfel, încât
proba să fie introdusă direct în gazul de transport. El constă din corpul
propriu-zis (1), elementul termic (2), radiator metalic (3), septum pliabil
(4), prin care este injectată proba.
Pentru transferarea completă a substanţei pe coloană, blocul de injectare
este menţinut la o temperatură mai ridicată decât temperatura coloanei înseși.
Probele solide lichide sau gazoase sunt injectate cu ajutorul unei seringi
calibrate. Pentru gaze, se poate utiliza o seringă de 0,5-10,0 m
Lichidele se introduc sub formă de soluţii cu ajutorul microse­rin­gilor
Hamilton.
Pot fi injectate cantităţi de 0-50, 0-10 sau 0-1,0 m cu o reproducti­
bilitate satisfăcătoare. Proba este trasă de câteva ori în seringă pentru a se
asigura absenţa bulelor de gaz şi apoi este injectată rapid în curentul de gaz
purtător.
15
 4
3 He

5
1

Fig. 7. Schema simplificată a blocului de injectare

Probele care au presiuni de vapori scăzute sunt transformate pe cale

chimică în derivaţi volatili, apoi injectate în instalaţie. Acest pro­cedeu
util face să crească numărul compuşilor, care pot fi separaţi prin metoda
cromatografiei de gaze, ceea ce permite ca multe categorii de com­puşi, ca
aminoacizii, lipidele şi polimerii cu masa moleculară mare, care în mod
normal nu sunt volatili, să fie separaţi, după transformarea lor, în derivaţi
volatili. De exemplu, acizii organici cu presiuni de vapori scăzute pot fi
convertiţi în cloruri acide cu punctul de fierbere scăzut; steroizii pot fi
silanizaţi, ionii metalici pot fi complexaţi cu hexafluoro­acetilacetonă. În
toate cazurile, presiunea de vapori a derivaţilor este mult mai ridicată decât
presiunea de vapori a moleculei originale.
Mărimea probei trebuie să corespundă concentraţiilor, care se înca­
drează în domeniul liniar al izotermei de repartiţie. Se pot determina probe
gazoase, lichide şi solide. Gazele se introduc în injector prin prelucrarea
lor de către eluant din dispozitivele speciale; o cantitate de 0,1-10 μl de
substanţele lichide şi solide (după dizolvarea lor în solvenţi sau după
topire) se introduce cu ajutorul unor microseringi de o capa­ci­tate de 0,1-
10 μl (concentraţia componentelor în probe fiind de ordinul mcg, mg).
Introducerea probei în injector se face rapid; temperatura injectorului
trebuie să fie superioară punctului de fierbere al compo­nen­ţilor, pentru a se
realiza evaporarea instantanee a acestora.
Faza mobilă – gazul purtător. În mod obişnuit, în cromatografia
16
de gaze, drept fază mobilă, se foloseşte heliu sau azot. Aceste gaze sunt
folosite în majoritatea cazurilor, deoarece satisfac următoarele con­diţii:
− faza mobilă trebuie să fie inertă;
− faza mobilă trebuie să aibă un preţ de cost redus, deoarece se
folosesc cantităţi mari;
− faza mobilă trebuie să permită ca detectorul să răspundă în mod
efectiv.
În calitate de rezervor, pentru faza mobilă, se foloseşte o butelie de gaze,
rezistentă la presiune înaltă. La ea se ataşează un regulator de presiune
pentru a reduce şi controla scurgerea gazului prin coloană şi un debitmetru,
pentru a controla debitul de gaz.
Natura gazului vector are un rol însemnat, ea poate să influenţeze timpii
de retenţie a componentelor sau, prin adsorbţia acestuia pe supra­faţa fazei
staţionare, să-i modifice proprietăţile. Alegerea eluantului se face în funcţie
de sensibilitatea detectorului, de interacţiunea acestuia cu componentele
care se vor separa, cu faza staţionară.
În cromatografia cu gradient de temperatură, componentele se dis­tri­buie
în coloană pe direcţia gradientului în funcţie de volatilitatea aces­tora (cele
mai puţin volatile – la intrare, cele mai volatile – la ieşire).
În cromatografia cu programare de temperatură, o temperatură con­
stantă pe toată lungimea coloanei variază în timp după o funcţie liniară sau
neliniară.
Alegerea fazelor şi a suportului pentru un proces cromatografic se
realizează în funcție de natura substanţelor care urmează a fi separate.
Dacă fazele sau suportul reacţionează cu compuşii injectaţi în coloană,
aceasta poate genera picuri de eluţie eronate, pot surveni derive de fond ale
detectorului sau chiar distrugerea instalaţiei.
Numărul de suporturi inerte şi de faze lichide staţionare disponibile
pentru CGL este practic nelimitat. Pentru a realiza o separare satisfă­
cătoare, faza lichidă aleasă trebuie să satisfacă următoarele condiţii:
− să fie un solvent bun pentru componenţii probei;
− să posede o selectivitate sporită, pentru ca puterea sa de solva­tare
să fie diferită pentru fiecare component al probei;
− presiunea vaporilor să fie cât mai scăzută;
− să fie stabilă din punct de vedere termic;
− să fie inertă din punct de vedere chimic faţă de componenţii
probei analizate.
Criteriul cel mai important pentru alegerea fazei staţionare lichide
17
este polaritatea fazei şi a amestecului, care trebuie separat. Cea mai bună
separare este realizată atunci, când faza lichidă este similară din punct de
vedere structural cu componentele amestecului, deoarece eficienţa sepa­
rării depinde de presiunile de saturaţie a componentelor din amestec şi de
coeficienţii de activitate ai acestora în raport cu faza dată. În cazul unor
componente cu presiuni de saturaţie foarte apropiate, separarea va depinde
în cea mai mare măsură de coeficienţii lor de activitate.
Coeficientul de activitate (gα) reprezintă interacţiunile dintre mole­
culele componentului dizolvat în faza staţionară lichidă şi moleculele fazei
staţionare. Aceste interacţiuni se manifestă prin forţe Kesson (între două
molecule cu dipoli permanenţi), forţe de inducţie Debyl (între un dipol
permanent şi unul indus, fie al fazei staţionare, fie al fazei mobile) şi forţe
de dispersie sau forţe London (între moleculele nepolare), care se datorează
câmpului electric al dipolilor cu viaţă foarte scurtă, produşi de mişcarea
sistemului nucleu – electroni ai unei molecule.
Este avantajoasă folosirea umpluturilor, suprafaţa cărora este aco­pe­
rită cu o peliculă subţire de fază staţionară lichidă. Însă micşorarea gro­
simii peliculei este limitată atât de interacţiunea componentului cu suportul
fazei lichide prin fenomenul de adsorbţie, care se poate supra­pune peste
fenomenul de dizolvare, cât şi de necesitatea reducerii cores­punzătoare a
cantităţii de probă.
Fazele lichide pot fi clasificate astfel:
− faze lichide nepolare: hidrocarburi lichide, uleiuri siliconice
(cauciuc siliconic, SE-30 etc.). Aceste faze separă componentele în
ordinea creşterii temperaturii de fierbere;
− faze lichide polare: conţin o cantitate mare de grupe polare (poli­
etilenglicolii dimetilsulfolan etc.). Aceste faze separă numai
compuşi polari;
− faze lichide cu polaritate intermediară: cuprind fazele lichide cu
grupe polare sau polarizabile pe un schelet mare nepolar (SE-52,
dizodecilftalat, difenilbenzil etc.). Pe acestea se separă com­puşi cu
polaritate intermediară;
− fazele lichide cu punţi de hidrogen sunt faze polare, care conţin
un număr mare de atomi de hidrogen, capabili de a forma legă­turi
de hidrogen cu compuşii care vor fi separați.
S-a stabilit, că din toate fazele cunoscute, se preferă 12: acestea aco­peră
întreg domeniul de polarităţi. Aranjarea într-o scară a polari­tăţilor se face prin
18
distanţa faţă de squalan, care se determină pe faza con­stantelor Mc Reynolds.
Faza staţionară solidă în CGS este constituită din adsorbenţi de tipul:
silicagel, cărbune activ, site moleculare. Separarea se bazează pe un
proces de adsorbţie. Eficacitatea separării creşte odată cu impreg­na­rea
adsorbantului cu mici cantităţi de lichid nevolatili (siliconi) sau cu gaze care
se adsorb ireversibil (CO2, H2O, H2S). Mai recent, au început să se utilize­
ze coloane umplute cu polimeri organici cu porozitate mare, sub formă
de perle, de exemplu din seria „Porapak” (etilvinilbenzen-divinilbenzen).
Aceştia servesc în special la analiza apei, alcoolilor, gazelor cu masa mo­
leculară mică şi amestecurilor lichide.
În scop analitic, se utilizează coloane de 1-1,5 m lungime şi 3-6 mm
diametru, care pot fi confecţionate din metal, sticlă sau material plastic şi
au forma literei U sau formă de spirală.
Suporţii utilizaţi: cei de tip diatomit (Chromosorb P) Kieselgur
(Chromosorb G,W, Sterchamol) polifluoretilena (Fluoropak-80, perle
de sticlă). În cazul coloanelor capilare, rolul suportului îl joacă pereţii
capilarelor, pe care se depune un strat subţire de suport solid, care ulte­rior
va fi impregnat cu faza lichidă.
Capacitatea de separare a fazei staţionare lichide, în cazul ameste­cu­
rilor, depinde atât de raportul tensiunilor de vapori a componenţilor cât şi
de soliditatea legăturilor ce apar între moleculele componentelor şi cele
ale fazei staţionare. Deosebim legături ionice Van der Waals, legături de
hidrogen sau cu transfer de sarcină.
Pentru separarea componentelor cu puncte de fierbere foarte di­fe­rite,
se pot utiliza combinaţii de două sau mai multe coloane în serie sau în
paralel, cu un singur, respectiv cu doi detectori (ex. Coloana cu fază lichidă
nepolară – Squalan şi una polară – Carbowax).
Detectori. În cromatografia de gaze, pentru depistarea componen­telor,
care ies de pe coloană se folosesc detectorii. În funcţie de proprie­tatea
stabilită deosebim:
− detectori de ionizare (detectori de ionizare în flacără, detectori cu
captură de electroni);
− detectori care stabilesc volumul unei proprietăți fizice de (de­tec­tor
de conductibilitate termică);
− detectori optici (flamfotometru, spectrofotometru);
Condiţiile generale pentru detectori sunt: sensibilitatea, stabilitatea,
fiabilitatea şi emiterea unui semnal liniar pentru un anumit domeniu de
19
concentraţie a probei.
Detectorul de conductibilitate termică (DCT) sau catarometrul are cel
mai răspândit domeniu de utilizare (fig. 8). Acesta face parte din categoria
detectorilor universali. Este un detector nedestructiv şi poate fi utilizat şi în
cromatografia preparativă.

Fig. 8. Schema de principiu a unui detector

cu conductibilitate termică (DCT)
Principiul de funcţionare se bazează pe măsurarea diferenţei dintre
conductibilitatea termică a componentului şi a eluentului. În acest scop, se
foloseşte un montaj electronic cu două sau patru celule de conducti­bi­­litate
termică. În figura 8 este redată schema unui montaj cu patru celule. Două
dintre celule sunt spălate în continuu cu gaz purtător (R1 şi R4 – celule de
referinţă), celelalte două sunt spălate de amestecul binar debitat de coloană
(R2 şi R3 – celule de măsură). Din punct de ve­dere tehnic, celulele nu pot
fi identice. Pentru echilibrarea ini­ţială a punţii, se foloseşte potenţiometrul
4. Filamentele detectorului sunt confecţionate dintr-un material al cărui
rezistenţă electrică variază foarte mult în funcţie de temperatură. În timpul
funcţionării, filamentele se încălzesc la trecerea unui curent continuu
stabilizat, de la o sursă de curent 1. Stabilirea curentului se face cu un
potenţiometru 2 şi se măsoară cu miliampermetrul 3.
Temperatura detectorului în procesul de lucru trebuie să fie mai
înaltă decât temperatura coloanei. Atât timp cât la ieşirea din coloana
cromatografică va apărea numai gazul purtător, rezistenţele celulelor vor
fi aceleaşi, puntea va fi echilibrată şi instrumentul de măsură montat va
indica 0.
În registratorul 5 va fi trasată linia zero. Prezenţa unui component în
eluentul, care circulă prin celula de măsură, modifică conductibili­ta­tea
20
termică a mediului gazos din această celulă. În consecință, se mo­di­fică
rezistenţa electrică a filamentelor R2 şi R3, care provoacă dezichi­librul
punţii. Intensitatea curentului înregistrat în momentul dezichili­bră­rii punţii
este proporţională cu concentraţia componentului care iese din coloană.
Intensitatea semnalului detectorului depinde de diferenţa dintre con­
ductibilitatea termică a componentului şi de cea a eluentului. Conducti­
bi­litatea termică a substanţelor depinde de masa moleculară a acestora.
Hidrogenul, heliul şi azotul, având mase moleculare mici, posedă con­duc­
tibilităţi termice ridicate. Aceste gaze sunt ideale pentru a fi folosite ca
substanțe purtătoare în cromatografia de gaze.
Sensibilitatea detectorului depinde de factorul geometric al celule­lor
(dimensiunile, raza, lungimea filamentului) şi de valoarea curentului de
alimentare a punţii. Sensibilitatea creşte odată cu mărirea curentului în punte.
Depășirea unei intensități anumite a curentului poate duce la dis­tru­gerea
filamentelor şi de aceea, această valoare este limitată de natura gazului
purtător şi de temperatura optimă a detectorului.
Linia zero este sensibilă la variaţiile debitului de gaz purtător şi a
temperaturii. Pentru ca variaţiile temperaturii să fie cât mai mici, blocul
metalic al detectorului trebuie să aibă o masă cât mai mare, iar celulele, în
detectori, să fie dispuse simetric.
Detectorul de ionizare în flacără (DIF) este un detector universal, stabil
şi construit simplu. Principiul de funcţionare al detectorului cu ionizare
în flacără de hidrogen constă în măsurarea conductibilităţii elec­trice a unei
flăcări de hidrogen în prezenţa unui compus organic (fig. 9).

O2

H2
coloana

Fig. 9. Schema detectorului cu ionizare în flacără de hidrogen

La ieşirea din coloană, eluentul este amestecat cu un curent de hidrogen
şi este aprins la capătul unei duze din platină sau oţel inoxi­da­bil. Duza este
21
montată într-o cameră de ardere alimentată cu un curent de aer sau oxigen.
De asupra flăcării este montat un electrod colector (anod). Alimentarea
electrozilor se face de la o sursă de tensiune con­tinuă, de valoare mare
(100-350 V). La arderea H2, în prezenţa numai a gazului purtător între duză
şi electrodul colector, se stabileşte un curent foarte slab (10-14 A).
Apariţia în flacără a unui compus organic măreşte intensitatea cu­ren­
tului (datorită ionizării acestuia) care poate să ajungă până la 10-5 – 10-8A,
în funcţie de natura şi concentraţia componentului respectiv. Acest curent
va fi amplificat şi înregistrat.
Sensibilitatea detectorului se defineşte ca fiind cantitatea de sarcină
electronică, produsă de un gram de component prin ionizare în detec­to­
rul cu flacără. Sensibilitatea detectorului pe mol de substanţă este pro­
porţională cu numărul atomilor de carbon din moleculă legaţi numai de
hidrogen sau alţi atomi de carbon din moleculă, plus contribuţia atomi­lor de
carbon legaţi de halogeni, amine sau grupe hidroxil. Atomii de carbon din
moleculă (din grupa carboxil sau carbonil) oxidaţi complet nu contribuie
la valoarea sensibilităţii.
Detectorul de ionizare în flacără de hidrogen nu poate detecta ga­zele
permanente (N2, H2, He, Xe), oxizii de azot, compuşii, care conţin un atom
de carbon singur legat de oxigen sau sulf (CO2, Cs2, COS) gaze anorganice
(NH3, SO2), apă şi acid formic. Limita de detecţie constituie 10-13 g.
Determinări calitative
Aprecierea calitativă a unei gaz-cromatograme, care reprezintă un nu­
măr oarecare de picuri, se realizează de obicei astfel:
1) examinarea vizuală în comparaţie cu gaz-cromatograma unei probe
etalon;
2) compararea timpului (tR) sau a volumului de reţinere (VR) a pro­
bei de determinat cu a etalonului-pur, cromatografiat în condiţii
identice, sau cu datele menţionate în literatură pentru compusul
respectiv;
3) compararea cromatogramei amestecului care va fi determinat cu cro­­
ma­­tograma aceluiaşi amestec, la care s-a adăugat substanţa etalon
ce se bănuieşte a fi prezentă în probă. Dacă picul unui com­po­nent
apare mărit pe a doua cromatogramă, acesta este un indi­ciu al prezenţei
în amestec a substanţei adăugate în probă; în caz con­trar, substanţa
adăugată schițează un pic nou pe cromatograma următoare;
4) identificarea componentelor se mai poate realiza cu ajutorul de­tec­
22
 torilor specifici; DCE se utilizează pentru identificarea com­puşilor
cu afinităţi diferite pentru electroni (alcooli, eteri, esteri, derivaţi
carbonici, derivaţi halogenaţi). Spectrometrul de masă înregistrează
spectrul de masă (SM) al componentelor prezente în fracţiunea de
eluant introdusă în sursa de ioni a spectro­me­tru­lui, cu înregistrarea
concomitentă a cromatogramelor obţinute prin trecerea celeilalte
fracţiuni printr-un detector universal (CT);
5) identificarea prin sorbţie sau reacţie selectivă se realizează prin
intercalarea între injector şi coloana de separare a GC a unei coloane
umplute cu adsorbant, sau absorbant specific a unei anu­mite clase
de substanţe sau a unui microreactor, în care are loc transformarea
sau reţinerea prin reacţie chimică a unui com­po­nent.
Timpul de retenţie brut (tR), exprimat în secunde sau minute, este timpul
care se scurge între momentul introducerii probei în injector şi timpul când
picul atinge maximul.
Timpul relativ (tR) este timpul de retenţie al unui component (i) în raport
cu cel al unui component etalon (e) : tRi / tRe.
Timpul de retenţie corectat este egal cu diferenţa dintre timpul de
retenţie brut (tR) şi timpul la care se separă eluantul sau un component
nereţinut pe coloană (ideal) şi cel al componentului respectiv: Rx= tR /tRx.
Factorul de retenţie are valori cuprinse între 0,01-0,9; în cazul unei sepa­­
rări optime, când valoarea se apropie de 1, înseamnă că acel com­po­­nent X,
părăseşte coloana odată cu eluantul.
Factorul de separare pentru doi componenţi A şi B se definește astfel:
tR(A)
(AB) = t , care trebuie să aibă valori ≠ 1 (10)
R(B)
(
Eficacitatea coloanei
O importanţă deosebită în prezentarea teoretică a procesului cro­ma­
tografic de separare o au două teorii: teoria „Talerului teoretic” şi teoria
cinetică.
Teoria „talerului teoretic” a fost propusă de Martin şi Synge. Con­
form acestei teorii, coloana cromatografică se împarte imaginar într-un şir
de segmente elementare – talere – şi se presupune, că pe fiecare taler se
realizează un act elimentar de echilibru la distribuţia substanţei în faza
staţionară şi faza mobilă. Fiecare porţie nouă de fază mobilă pur­tă­toare
(gaz sau lichid) provoacă o deplasare a acestui echilibru, în urma căruia o
23
parte de substanţă se deplasează pe următorul taler, pe care la rândul său,
se stabileşte un nou echilibru distributiv şi are loc tre­cerea substanţei pe
următorul taler. În urma acestor procese, substanţa supusă cromatografiei
se distribuie pe câteva talerele. Concentraţia substanţei pe talerele din
mijloc este maximă în comparaţie cu talerele invecinate.
Talerul teoretic poate fi definit ca un segment imaginar din coloana
cromatografică în care se realizează un echilibru elementar complet de
distribuţie a componentului dintre cele două faze nemiscibile, care vin în
contact în procesul separării cromatografice.
Talerul teoretic din coloana cromatografică este analogic talerului
teoretic dintr-o coloană pentru distilare fracţionată. Deosebirea constă în
aceea, că componenţa amestecului, care ese de pe coloana cromato­gra­
fică în continuu se schimbă, dar în procesul de extracţie ori distilare pe
parcursul întregului proces se poate de obţinut una şi aceeaşi substanţă.
Numărul talerelor teoretice pentru componentul dat şi pentru lun­gi­mea
coloanei date diferă de numărul talerelor teoretice pentru alţi com­po­nenţi
în aceleaşi condiţii. Numărul talerelor teoretice este direct pro­por­ţional cu
lungimea şi diametrul coloanei.
Numărul de talere N este un număr adimensional şi se numeşte efi­cienţa
coloanei cromatografice, H şi n – parametrii teoretici, care carac­te­ri­zează
eficacitatea de separare a coloanei cromatografice şi determină dispersia
zonelor componentului.
Cu cât coloana va avea mai multe talere teoretice pe o unitate de lungime
şi cu cât înălţimea echivalentă unui taler teoretic va fi mai mică, cu atât mai
efectivă va fi coloana pentru separare în condiţiile date. Aşa dar, condiţiile
eficacităţii de separare pe coloana cromatografică sunt :
H să obţină valori cât mai mici şi N – cât mai mari.
Dacă vom raporta lungimea stratului de fază staţionară (L) în care s-a
produs separarea amestecului de substanţe la înălţimea talerului teo­re­
tic, vom obţine numărul de talere teoretice (N) necesare pentru sepa­rarea
amestecului dat de coloana dată (formula 11).
L
N= (11)
H

Teoria talerelor teoretice presupune realizarea procesului cromato­
grafic în trepte, dar în realitate procesul decurge incontinuu. Această teorie
permite să se calculeze parametrii cantitativi importanţi pentru caracterizarea

24
procesului cromatografic de separare. Aceşti parametri îşi menţin
importanţa şi în teoria cinetică a cromatografiei, care ţine cont de viteza
de migrare a substanţei, difuzie şi alţi factori cinetici, care caracterizează
cantitatea procesului.
Teoria cinetică a cromatografiei acordă o atenţie fundamentală ci­ne­
ticii procesului, asociind înălţimea echivalentă talerului teoretic (H) cu
procesele difuziei, stabilirea lentă a procesului.
Parametrul experimental care determină din punct de vedere dina­
mic eficacitatea separării unei coloane cromatografice este lăţimea pi­cu­
lui cromatografic, numită în literatură şi lărgirea zonei. Zona în­gustă şi
compactă a componentului de la partea de jos a coloanei (la introdu­ce­rea
probei) se va lărgi, astfel încât concentraţia pe unitate de volum de coloană
se va micşora (fig. 2).
Lărgirea zonei acţionează în sensul micşorării separării, ducând la o
reamestecare a componenţilor, respectiv la o suprapunere a picurilor cro­
matografice. Pentru practica cromatografică este necesară cunoaşte­rea
tuturor factorilor, care influenţează dispersia zonei în vederea acţiu­nii
asupra lor în sensul obţinerii unor picuri cât mai înguste.
Giddings a elaborat teoria privind lărgirea zonei (t) a moleculelor din
coloană, aceasta fiind considerată ca un proces haotic incontinuu. Prin­cipalii
fac­tori, care duc la lărgirea zonei unui component ce parcurge co­loa­na sunt:
a) difuzia moleculară longitudinală;
b) cinetica sorbţie-desorbţie;
c) transferul de masă în faza mobilă (format din difuzia transver­sa­lă
şi structurală sau turbulentă.
Prin însumarea acestor contribuţii, se obţine înălţimea echivalentă
talerului teoretic, care depinde de viteza fazei mobile. Într-o formă sim­pli­
ficată aceasta este cunoscută sub denumirea de ecuaţia lui Van Deemeter:
B (12)
+C×V H =A+
V

unde: ABC sunt constante; iar V – viteza fazei mobile.
Această ecuaţie se aplică în cazul cromatografiei cu gaze. Contri­bu­ţia
fiecărui termen al ecuaţiei (12) asupra înălţimii echivalente tale­rului teo­retice
(H) în funcţie de viteza fazei mobile (V) este reprezentată în fig. 10.
B
H=A+ + C×V
V

25
 H B
H=A+ +C+V
V
C×V

Hmin
A
B
V
O Vopt V
Fig. 10. Reprezentarea grafică a ecuaţiei Van Deemter
Constanta A este în legătură cu acţiunea difuziei de vârtej, care de­
pinde de mărimea particulelor şi de densitatea fazei staţionare din coloa­na
dată. Mărimea B este legată cu coeficientul de difuzie a moleculelor în
fază mobilă şi ia în considerare acţiunea difuziei longitudinale. Mă­rimea C
caracterizează cinetica procesului de sorbţie-desorbţie, transfe­­rul de masă
şi alte efecte. Primul termen difuzează un aport constant în H. Efectul celui
de-al doilea termen este esenţial pentru o viteză mică a fluxului. Odată cu
mărirea vitezei fazei mobile, creşte influenţa celui de-al treilea termen, iar
a celui de-al doilea se micşorează.
Factorii care influenţează eficacitatea de separare:
a) Viteza fazei mobile. Influenţa este redată prin ecuaţia lui Van
Deemter.
b) Mărimea şi suprafaţa specifică a particulelor fazei staţionare.
Numărul de talere creşte odată cu micşorarea dimensiunii parti­cu­le­lor
suprafeţei specifice. Dimensiunile particulelor nu pot fi prea mici, deoarece
creşte brusc rezistenţa opusă de coloană la trecerea fazei mobile
În literatura de specialitate există tabele în care se specifică relaţiile optime
dintre diametrul coloanei şi mărimea particulelor fazei staţio­nare.
c) Natura fazelor. Alegerea fazelor în funcție de natura probei
ce urmează a fi analizată. Cantitatea de fază staţionară, luată
pentru se­pa­rare, trebuie optimizată. În cazul cromatografiei gaz-
lichid, de exemplu, o can­titate prea mare de fază staţionară
lichidă face ca particulele de umplu­tură să devină lipicioase
şi să se aglomereze, afectând astfel, eficacitatea de separare
a coloanei şi condiţionează apariţia unor picuri cu cozi. Mic­şo­
rarea cantităţii de fază staţionară lichidă măreşte eficacitatea
26
 coloanei, dar o cantitate prea mică va spori interacţiunea fazei
purtătoare cu par­ti­culele suportului.
d) Parametrii geometrici ai coloanei (lungimea, diametrul,
forma). Din acest punct de vedere, coloanele capilare sunt cele
mai eficiente. Creş­terea lungimii şi micşorarea diametrului
coloanei conduce la creşterea numărului de talere. Dar totuşi,
există o lungime şi un diametru optim limitat de fenomenele
de curgere, care provoacă dispepsia zonelor (ten­dinţa de
reamestecare).
e) Temperatura. În cazul cromatografiei de repartiţie (gaz-lichidă,
mărirea temperaturii măreşte separarea, dar în cromatografia de
adsor­bţie mărirea temperaturii influenţează negativ separarea).
Eficacitatea coloanei se măsoară cu numărul talerelor teoretice. Pentru
compararea eficacităţii coloanelor trebuie identificată faza sta­ţionară,
substanţa de analizat, temperatura, viteza gazului vector şi mă­rimea probei.
Numărul talerelor teoretice (N) se determină după formula:

[ ]
2
X
N = 16 Y (13)

în care:
X – distanţa dintre momentul introducerii probei până la maximul
picului substanţei de analizat (mm)
Y – distanţa formată de linia de bază a picului cu tangentele duse în
punctele de inflexiune ale picului cu baza (mm).
1. Înălţimea echivalentă unui taler teoretic (H):

L
H = (14)
N
unde:
L – lungimea coloanei cromatografice în cm;
N – numărul de talere teoretice.
2. Se va trasa curba dependenţei H (pe ordonată) de viteza gazului
purtător (pe abcisă).
Se vor determina condiţiile optime.
Se va completa tabelul:
VHe X y X/y (X/y)2 N=16(x/y)2 H

27
 Calcularea reproductibilităţii experimentului prin metoda gaz-cro­­­
matografică
Fiecare student primeşte 3 cromatograme ale unei substanţe, descrie
condiţiile experienței, măsoară înălţimea picurilor în mm.
Eroarea unei determinări:
hmediu – h1 = a1
hmediu – h2 = a2
hmediu – h3 = a3
a + a2 + a3
Eroarea medie: 1 = b (15)
2
Eroarea medie relativă: b ×100 (16)
hmediu

b
Eroarea relativă medie = × 100. Eroarea relativă medie nu trebuie
hmediu
să fie mai mare de 3-4%.
3. Derivatizarea sau transformarea prealabilă a componentelor po­
lare (greu volatile sau care se descompun la temperatura lor de fier­bere)
în derivaţi mai puţin polari a permis separarea şi identificarea omologilor
aceleiaşi clase, a izomerilor etc. Astfel, substanţele cu grupe polare (OH,
COOH, NH2) se pot transforma în compuşi cu grupe mai puţin polare
(OCOR şi NHCOR).
Analiza cantitativă în cromatografie se bazează pe stabilirea unei relaţii
dintre mărimea semnalului dat de detector şi cantitatea de compus prezent
în probă. Semnalul detectorului este măsurat prin înălţimea sau aria picului
(aria picurilor poate fi calculată conform relaţiilor).
s = hw0 (17)
Aria picului poate fi măsurată cu ajutorul planimetrului, poate fi apreciată
după greutatea fâşiilor de hârtie tăiate după conturul picurilor. În prezent,
în acest scop se folosesc integratoare electronice şi micro­com­putere, care
înregistrează foarte rapid şi exact orice mărime de pe cromatogramă.
Metodele principale în analiza cromatografică cantitativă sunt:
a) Metoda standardului intern. În proba cu o compoziţie can­ti­ta­
tivă necunoscută se introduce preventiv o cantitate exactă de substan­ţă cu­
noscută, care nu face parte din amestecul dat, nu interacţionează chi­mic cu
componentele amestecului şi este stabilă la temperatura la care se efectuează
28
analiza. Proprietăţile fizico-chimice ale substanţei adău­gate (standardului intern)
trebuie să fie asemănătoare proprietăţilor com­po­nentelor amestecului cercetat.
Partea de masă (Xi) a fiecărui com­ponent (în %) se determină din relaţia:
Si× R
X1 = × 100 (18)
Sst

unde: Si şi Sst sunt ariile picurilor componentului analizat şi standardului,
co­respunzător;
R = m standardului / m amestecului de analizat (fără standard)
b) Metoda normării ariilor. Această metodă presupune, că suma tuturor
ariilor picurilor corespunzătoare componentelor amestecului cercetat
constituie 100%. Partea de masă (Xi) a componentului i (în %) se determină
din următoarea relaţie:
Si
Xi = n=i × 100 (19)
∑ Si

Relaţia de mai sus este valabilă numai în cazul în care sensibi­lita­tea detectorului
este aceeaşi pentru toate componentele probei, în caz contrar, se recomandă ca
etalonarea să se facă în prealabil cu ajutorul unor factori de corecţie.
Concentraţia se calculează după curba de etalonare ori după formula:
Setilnitrit
C= × F × R × 100,
Spropilnitrit
în care:
C – concentraţia
S – ariile corespunzătoare ale picurilor
F – factorul de corecţie a ariilor sau a înălţimii picurilor, ce se
determină în raport cu standardul în condiţiile experimentului
(faza staţionară, to injectorului, to termostatului, a detectorului;
viteza gazului vector)
F –
(factorul) se calculează după formula:
S
F = st × C%
Sx
în care:
Sst – aria picului standardului
Sx – aria picului substanţei de analizat

29
 ori
hst
F= × C%
hx
în care
Sst – înălţimea picului standardului
Sx – înălţimea picului substanţei de analizat.
C% – concentraţia substanţei de analizat.
Se calculează F pentru câteva concentraţii şi apoi – media:
c) Metoda etalonării absolute. Se prepară şi se cercetează o serie de
soluţii standard. Se determină experimental dependenţa înălţimii sau a
suprafeţei picului de concentraţia substanţei şi se trasează curba de eta­
lonare. Apoi, se determină aceeaşi parametri ai picurilor amestecului de
analizat şi, din curba de etalonare, se determină concentraţia substan­ţei
analizate. Această metodă simplă şi exactă este principala metodă de de­­
terminare a microimpurităţilor. Metoda nu necesită o separare a tu­tu­ror
componenţilor amestecului, dar se limitează la analiza componentului stu­
diat în amestecul concret.
S
X = Si × 100 (20)
st
La baza determinărilor cantitative stă relaţia de proporţionalitate între aria
de sub picul cromatografic şi cantitatea componentului eluat. Cheia acestor
metode constă în măsurarea ariei şi stabilirea acestei proporţionalităţi.
1) Calcularea ariei se poate face pe mai multe căi:
− Măsurarea ariilor este înlocuită uneori cu măsurarea integrală a
înălţimii picului (h).
− În cazul picurilor simetrice, aria se calculează prin metoda
produsului dintre baza picului şi înălţimea acestuia × ½:
h × y
A= (21)
2

− Ariile se mai pot determina automat, utilizând în acest scop un
integrator mecanic sau un computer.
2) Corelarea datelor obţinute cu compoziţia cantitativă a probei. Dintre
metodele care stabilesc relaţiile pentru transformarea şi corelarea corectă a
ariilor cu concentraţia componentelor, amintim:
a) Metoda standardului extern: se realizează într-un mod ase­mă­nă­
30
tor curbei de etalonare din spectroscopie. Cantităţi cunoscute de probă-
etalon se cromatografiază; se măsoară ariile corespun­ză­toare picurilor şi
se întocmeşte curba de etalonare, care are înregistrată în ordonată valoarea
ariilor (mm2) şi în abscisă – con­centraţia (µg).
b) Metoda standardului intern constă în introducerea unui stan­dard,
(substanţă de referinţă) în cantitate bine definită, supusă anali­zei. Drept
standard intern se poate utiliza o substanţă pură, care să se elueze cu o rezoluţie
bună, cu un timp de reţinere apropiat al componentelor de determinat şi care
să nu interacţioneze cu acestea. Cunoscând concentraţia standardului intern
din probă (Cs) şi măsurând ariile picurilor corespunzătoare componentei
de determinat (Ax) şi ale standardului (As), se poate calcula con­centraţia
necunoscută (Cx). În acest scop, se întocmeşte o curbă de etalonare sau se
calculează factorul de corecţie al ariilor pentru compusul de determinat (fx).
Curba de etalonare se realizează prin cromatografierea a trei so­lu­ţii
de concentraţii exacte din componenta de determinat (C1, C2, C3), prin
dizolvarea acesteia în soluţia standardului intern (Cs). Se determină, în
fiecare caz în parte, raportul ariilor: A1/As; A2/As; A3/As. Aceste valori se
înscriu în ordonată, iar concentraţiile C1, C2, C3 – în abscisa unui sistem de
coordonate şi se trasează curba de etalonare.
Factorul de corecţie al ariilor (fx) se poate calcula astfel:
Se face media aritmetică (Vx) a valorilor rapoartelor obţinute mai sus:
A1/As = V1; A2/As = V2; A3/As = V3; V + V2 + V 3
1 =V
3

Pentru fiecare concentraţie (C1, C2, C3) se calculează raportul: C1/
Vx; C2/Vx; C3/Vx; media aritmetică a valorilor obţinute pentru aceste trei
concentraţii reprezintă factorul de corecţie mediu (fx) care intervine în
formula de calcul.
Cx (mg/ml) = fx × Vx (22)
c) Metoda normării ariilor. Această metodă se bazează pe faptul că
raportul existent dintre aria corespunzătoare picului unui anu­mit component
SA şi suma ariilor tuturor componentelor pre­zente (∑S) este egală cu procentul
de component prezent în amestec.
SA

A% = S + S + S +... × 100 (23)
A B C

Identificarea alcoolului etilic prin metoda gaz-cromatografică

31
 a) În băuturile alcoolice şi soluţiile alcoolice. Metoda constă trans­
formarea alcooliilor în alchilnitriţi, care se separă în coloana cromato­gra­fică.
Pentru aceasta, într-un flacon vid de penicilină se introduce 0,5 ml
soluţie de acid tricloracetic de 50% şi 0,5 ml de soluţie de alcool etilic,
cu concentraţie exactă în limitele a 3-4% (soluţie standard). Flaconul se
închide cu dopul de gumă, care este fixat de un dispozitiv cu un orificiu. Cu
seringa, prin dop, în flacon se introduc 0,25 ml de soluţie de nitrit de sodiu
de 30%. Conţinutul flaconului se agită timp de un minut. Cu altă seringă
uscată se iau 3 ml din faza gazoasă ce conţine etilnitrit şi se in­jec­tează în
cromatograf. După obţinerea cromatogramei soluţiei standard, se determină
timpul de retenţie corectat.
Apoi, tot în aşa fel, se cromatografiază soluţia de analizat şi se compară
timpul de retenţie brut, corectat cu cel al soluţiei standard. Dacă timpii co­in­cid,
acestea confirmă identitatea soluției de analizat.
Metoda de identificare a etanolului din sânge și din urină este iden­tică cu
cea de identificare a acestuia în băuturile alcoolice și în soluțiile alcoo­lice. Mai
întâi se cromatografiază şi se determină timpul de retenţie a soluţiei etanolice
(standard). Apoi se determină etanolul în sânge şi urină. Într-un flacon vid de
penicilină se introduc 0,5 ml sânge ori urină şi 0,5 ml de soluţie de 50% de
acid tricloracetic; flaconul se închide cu dop şi se fixează cu fixatorul.
Apoi, prin dop, se introduce 0,25 ml de soluţie de nitrit de sodiu de 30%.
Conţinutul flaconului se agită bine timp de un minut. Apoi, cu o se­ringă
curată, din flacon se iau 3 ml de fază gazoasă, se introduc în cro­matograf şi
se cormatografiază. Dacă timpul de retenţie a soluţiei standard coincide cu cel
al substanţei ce se află în sânge ori în urină, atunci se confirmă identitatea lor
Îndeplinirea lucrului practic
Lucrul practic constă din 2 etape:
I. Determinarea timpului de reţinere relativ al substanţelor pure pe
coloane de polaritate diferită şi completarea tabelei generale.
II. Identificarea toxicilor „volatili” în amestecul-model.
1. Fiecare student primeşte o substanţă, o cromatografiază pe co­loane cu
polaritate diferită. Se cercetează cromatogramele obţinute.
2. Fiecare student primeşte amestecul model, care conţine 2 sub­stanţe
necunoscute şi le cromatografiază pe ambele coloane cu polaritate
diferită în aceleaşi condiţii. Cromatogramele se studiază, se calculează
timpul de reţinere corectat şi relativ. Apoi, identificarea se efectuază
după schema aplicată în cer­ce­tarea cromatogramelor model.
32
 3. Determinarea timpului de retenţie relativ al componentelor pure pe
coloana cu fază staţionară lichidă de polaritate diferită şi alcătuirea
tabelei generale (Lucrarea I).
4. Identificarea toxicilor volatili în amestecul model (Lucrarea II).
Reguli de folosire a microseringilor
1. La finele lucrului, seringa se spală cu alcool și/sau eter: fiecare
solvent se ia în seringă de 2-3 ori şi se descarcă pe hârtie de filtru.
2. Seringa se aranjează în penar.
3. Înainte ca proba să fie colectată, injectarea acului în coloană este
interzisă.
4. Nu se admite colectarea rapidă a probei.
Pregătirea către analiza cromatografică
1. Înainte de a începe lucrul, se verifică ermeticitatea camerei de eva­
porare. Pentru aceasta, cu ajutorul periei şi a soluţiei de săpun, se unge
deschizătura evaporatorului, unde se intro­duce, de obicei, acul siringei.
Ermeticitatea se constată prin lipsa vaporilor de gaz în această regiune
Controlul ermeticităţii se efectuază şi în timpul lucrării
2. Controlul eficacităţii siringii de 1m se face prin colectarea a 0,5 m de
acetonă şi dozarea acestuia pe hârtia de filtru. În timpul dozării apare
o micropicătură pe vârful acului, iar la atingerea ei de hârtia de filtru,
apare un spot umed. Dacă picătura lipseşte, atunci se verifică fixarea
acului de siringă.
În procesul lucrului, ermeticitatea microseringii se verifică după fiecare
7-10 probe.
Efectuarea analizei cromatografice
Analiza gaz-cromatografică începe cu aranjarea benzii de autoîn­scriere.
Apoi, în microseringă se colectează 0,5m de solvent organic, care se introduce
în camera de evaporare a cromatografului. Pe hârtia cro­­matografică, se notează
cu creionul momentul introducerii probei. După aceasta, se înregistrează
picul aerului, care se notează prin cu­vân­tul „Aer”. Analiza aerului şi toate
celelalte probe se interpretează con­se­cutiv nu mai puţin decât de 2 ori pe
aceeaşi coloa­nă. Astfel, se verifică suprapunerea cromatogramelor paralele
după tim­pul de reţinere, adică după intervalul de timp trecut de la momentul
in­tro­ducerii până la apa­riţia maximului şi după mărimea înălţimii acestuia.
Dacă rezultatele obţi­nute de pe ambele cromatograme nu se suprapun, se
repetă experienţa până la suprapunerea rezultatelor. În caz con­trar, calitatea
cromatogra­melor paralele se analizează cu profesorul.

33
 Analiza substanţelor lichide se efectuează cu ajutorul microseringii
de 1m ori 10ml. Mărimea probei – 1-0,5µl. Sensibilitatea pentru fiecare
substanţă se alege individual. După îndeplinirea analizelor paralele, se­ringa
se spală de câteva ori cu soluţia de analizat şi numai atunci este gata de colectat
proba pentru îndeplinirea experienţei următoare pentru aceeaşi probă.

Analiza cromatogramelor
Iniţial, se măsoară cu ajutorul riglei distanţa (mm) de la momentul
introducerii probei până la maximul picului de aer (fig. 1). Această dis­
tanţă corespunde timpului de găsire a componentului în interiorul cro­
matografului în stare mobilă.
C
Semnat

b
G H

a A B
E F
O tm t´R Timp
tR

Fig. 1. Determinarea distanţei de reţinere pe cromatogramă

a – momentul introducerii probei; b – maximumul picului de aer;
c – maximumul picului substanţei de cercetat;

Mărimea T este distanţa de reţinere a gazului neabsorbit. Se mă­soa­ră ea

cu ajutorul riglei în mm. Distanţa obţinută în mm raportată la viteza mişcării
corespunde timpului de reţinere a gazului neabsorbit în secunde ori minute.
Distanţa de la maximul picului aerului până la maximul picului
compuşilor de analizat, raportat la viteza benzii corespunde timpului de
retenţie corectatat al amestecului de analizat (T') Dacă nu se menţio­nea­
ză „ştrih” atunci acesta este timpul de reţinere a gazului neabsorbit, care
nu e adecvat pentru calcule. Pentru calculele de identificare se folo­seşte
nu­mai timpul corectat (T'), deoarece numai el determină timpul, în care
moleculele substanţei de analizat a „toxicului volatil” se găsesc în stare de
absorbţie (dizolvare) în fază staţionară.
Numai timpul staţionării este diferit pentru fiecare toxic „volatil”,
34
deoarece numai el caracterizează solubilitatea diferită a toxicilor în una şi
aceeaşi fază staţionară, ori absorbţia diferită în unul şi acelaşi absor­bent.
Datele valorilor L şi T ale fiecărui component se înscriu în tabelă:
Tabelul 1
Denumirea Coloana Coloana
compusului cu sorbent polar 1 cu sorbent polar 2
L : T'sec : Trel L : T'sec: Trel
− Cloroform
− Alcool propilic
− Etanol
L'x
T' =
C (viteza benzii)
Valoarea Trel se calculează cu exactitate până la 0,01. După efec­tua­rea
calculelor şi completarea tabelului din procesul verbal, studentul elaborează
o tabelă care va cuprinde o pagină și care va conţine date despre condiţiile
cromatografice ale tuturor substanţelor cercetate.
Obiectele de cercetare
Amestec model din 2 toxici volatili alcătuit din următoarele com­po­­
nente: cloroform, alcool – metilic, etilic, butilic, izobutilic, acetonă, eti­lace­tat,
toluen, dioxan, benzen, tetraclorură de carbon, dicloretan, hexan.

Indicaţii pentru efectuarea identităţii toxicelor „volatili”

Identificarea toxicilor „volatili” prin metoda cromatografiei gaz-li­chide
se reduce la Trel pe 2 coloane cu polaritate diferită. Dacă compo­nentul nu
se separă pe o coloană sub formă de pic, separarea are loc nea­părat pe a
II coloană. Deaceea, analiza amestecurilor se efectuează pe două coloane
cu sorbent de polaritate diferită. Pe cromatogramele ob­ţi­nute, se calculează
timpul de retenţie relativ pentru fiecare pic cromato­gra­fic. Parametrii
obţinuţi se notează în două tabele. În prima tabelă, se includ parametrii
de reţinere pe coloana cu sorbentul polar, în a doua – cei de pe coloana cu
sorbent nepolar. Aici se încheie I etapă de lucru.
La etapa a II-a, se folosesc datele individuale din tabelă, obţinute pentru
toxicii „volatili”. În tabelul 2 se includ parametrii de reţinere şi denumirile
corespunzătoare, la care timpul de retenţie relativ nu se deo­se­beşte decât
cu 0,05 min, determinat în mod experimental prin analiza amestecurilor de
toxici neconoscuţi.
35
 Exemplu de tabelă. Datele experimentale şi tabelare despre para­me­trii
de reţinere ai toxicilor „volatili” necunoscuţi pe coloana cu sor­bent polar.
Calculele timpului relativ de reţinere sunt efectuate în raport cu benzenul
(ori alt solvent).
Tabelul 2
Datele despre parametrii de reţinere
ai toxicilor „volatili” necunoscuţi pe coloana cu sorbentul polar
Nr. pic pe Datele Datele din
cromato- experimentale tabelă Determinarea substanţei
gramă L (mm) Trel Trel
0,79 Butilformiat
1 63 0,84 0,81 Propoxibutan
0,85 Metanol
1,00 Benzen
1,00 Butilizobutirat
2 125 0,99
1,01 Cloroform
1,03 Dibutoxibutan

Această tabelă se completează cu valorile timpului de reținere din

amestec din probele experimentale pe două coloane cu polaritate dife­ri­tă și
se compară cu timpul de reținere relav pentru aceiași toxici în stare pură.
Etapa următoare constă în compararea tabelelor completate și anu­
me a coloanelor cu polaritate diferită, care conţin date concrete cu privi­re la
timpul de reţinere a toxicilor „volatili” necunoscuţi din problema de con­trol şi
denumirile propuse. De aici rezultă, că componentele care au pic co­mun pe
o coloană sunt în aceeaşi măsură orientate şi pe altă coloană.
Există însă excepţii, când, chiar dacă polaritatea este diferită, ambele
coloane nu sunt selective pentru perechea dată de substanţe. În acest caz,
aceste substanţe urmează să fie excluse din ambele tabele şi iden­ti­fi­­carea
lor se efectuează separat, pentru că în amestecul de analizat, aces­tea ar putea
să se afle în mod separat sau împreună. În consecinţă, ambele com­ponente se
notează în răspunsul la problema „convenţional identificate”.
După excludere, se procedează la compararea tabelelor. Aceste de­
numiri corespund toxicilor, care persistă în obiectul de cercetare. Pentru
finalizarea acestei etape de lucru, se va completa tabela finală, care va avea
această formă:

36
 Tabelul 3
Denumirea toxicilor „volatili” determinaţi pe Denumirea
fiecare coloană cu polaritate diferită
Coloana polară Coloana nepolară toxicului identificat

Prima rubrică a tabelei se completează cu toate denumirile, găsite pe

coloana polară, a II-a – cu denumirile de pe coloana nepolară. De­nu­mirile
toxicilor subliniaţi se vor înscrie desfăşurat în rubrica III.
Aşa dar, în procesul identificării, efectuat pe coloane paralele, este
necesar ca denumirea toxicului, care se află în probă să fie determinată
după totalitatea parametrilor de repartiţie obţinuţi pe fiecare coloană. Dacă
denumirea toxicului este găsită numai după datele unei coloane, în proba de
cercetat acest toxic este absent. Unii şi aceeaşi toxici pe diferite co­loane
pot fi repartizaţi în ordine diferită.
Dacă pe cromatograme se înregistrează numai un pic şi nu este exclusă
prezenţa lui în probă în calitate de toxic „volatil”, apare necesi­tatea de a înlocui
benzenul cu un alt solvent, de exemplu: butilacetatul sau alcoolul propilic.

Bibliografie
1. Notițe de la prelegeri.
2. M. Bojiță, L. Roman, R. Sandulescu, R. Oprea. Analiza și controlul
medicamentelor. Vol.1, Ed. Inteleredo, Deva, 2003.
3. G. Cimpan, S. Cobzac. Metode analitice de separare. Manual de lucrări
practice de separare. Universitatea „Babeș Bolyai”. Cluj Napoca, 1995.
4. S. Cogan. Curs de Chimie analitică. Metode de separare. Manual de lucrări
practice. Universitatea „Babeș Bolyai”. Cluj Napoca, 1994.
5. L. Roman, R. Săndulescu, M. Bojiță. Validarea metodelor de analiză și
control. București, Ed. Medicală, 1998.
6. L. Roman, R. Săndulescu, M. Bojiță, D. Muntean. Validarea metodelor
analitice. București, Ed. Medicală, 2007.
7. L. Zadornîi. Metode cromatografice de separare și analiză. Îndrumar de
laborator. Chișinău, Ed. UTM, 1998.
8. Л. Симонов, В. Валика. Группа токсических веществ извлекаемых из
биоматериала перегонкой с водяным паром. Методические указания
для студентов IV курса фармацевтического факультета по токсико­
логической химии. Кишинэу, Изд. Полиграф. центр Medicina, 2007.
9. Л. Симонов. Курс лекций по токсикологической химии. Кишинёв,
2003.

37
 Lucrarea de laborator N 2
Tema: Metoda cromatografiei gaz-lichide în analiza chimico-
toxicologică. Determinarea cantitativă.
Scopul lucrării: Asimilarea metodelor de determinare cantitativă
a toxicilor „volatili” prin metoda CGL. Studierea teoretică şi asimilarea
practică și metodica de analiză a CGL a alcoolului etilic din sânge şi din
urină, analiza aplicată în laboratoarele Centrului de medicină legală şi
laboratoarele chimice.

Obiectivele:
1. Bazele teoretice ale CGL:
− eficacitatea coloanei cromatografice şi fazei staţionare lichide;
− selectivitatea fazei staţionare;
− detectorii cromatografului.
2. Determinarea cantitativă prin metoda cromatografiei gaz-lichide.
3. Metodele de calculare a suprafeţei picurilor:
− normarea ariilor;
− standardul intern;
− calibrarea absolută.
4. Reacţia care stă la bază identificării şi dozării alcoolului etilic în
lichidele biologice prin metoda CGL.
5. Condiţiile de identificare a alcoolului în lichidele biologice prin CGL.
6. Obiectele de cercetare pentru identificarea alcoolului etilic în analizele
chi­mico-judiciare şi chimice.
7. Detectorul care se foloseşte pentru determinarea alcoolului etilic din
sânge şi urină prin metoda CGL.
8. Determinarea alcoolului etilic în lichidele biologice prin meto­da CGL
poate fi blocată de prezența altor componente „volatile”.
9. Construirea curbei de calibrare pentru determinarea eta­nolului în
sânge şi urină.
10. Standardul intern pentru determinarea alcoolului etilic.
Scopurile calculării coeficienţilor de calibrare pentru deter­mi­na­rea
etanolului din sânge şi urină
Subiectele ce stau la baza pregatirii individuale
1. Care proprietăţi ale componentelor separate acţionează asupra timpului
de reţinere în baza staţionară?
2. Explicaţi: de ce compuşii organici nesaturaţi posedă un timp de reţinere

38
 mai mare în faza staţionară polară decât în cea nepolară?
3. Cum are loc cromatografierea în faza staţionară lichidă a ben­ze­nului şi
fenolului? (TR') ?
4. Care este avantajul metodei CGL faţă de celelalte metode?
5. De ce depinde eficacitatea repartiţiei componentelor în coloană?
6. Care parametrii ai picului se folosesc în determinarea cantitativă?
7. În ce constă importanța efectuării analizei cantitative prin meto­da
cromatografiei gaz-lichide?
8. Cum se construieşte graficul de calibrare prin metoda standar­dului
intern, a calibrării absolute?
9. De ce aplicarea metodei de dozare a standardului intern cere
introducerea în cromatograf a diferitor volume de probă?
10. Cum determinaţi conţinutul etanolului din urină, dacă, după ana­liza
cromatogramei, înălţimea picului de etilnitrat hx=10 mm, înălţi­mea
picului de propilnitrat este de 15 mm, R=1, Ku=1,03?
11. Determinaţi conţinutul etanolului din sânge, dacă înălţimea picului
etilnitrat este de 25 mm, propilnitrat – de 17 mm, R=1, Ks=1,90.

Indeplinirea lucrului practic

Studenţii primesc cromatograme pentru rezolvarea a 4 situaţii.
Cro­matogramele se notează în caiete. Pe una din ele se demonstrează care
parametri se determină pe cromatograme.
Studentul trebuie să cunoască diferite moduri de calcul ale suprafeţei
picurilor: B
S=h
2
unde: h – înălţimea picului
B – baza triunghiului sub pic.
h
S=h×µ
unde: h – înălţimea picului
µ – lăţimea picului la jumătatea B
înălţimii

Studenţii îndeplinesc 4 însărcinări relative la cromatogramele expuse.

Metoda normării ariilor
Fiecare student determină componenţa procentuală a amestecului (o
cromatogramă) prin metoda normării ariilor de dozare a cromatogra­melor.

39
Pentru aceasta, se calculează suprafeţele tuturor picurilor.
Formula de calcul:
SA
A= × 100
ΣS΄
Metoda standardului intern
Calculaţi conţinutul în % a unui component din amestecul medi­ca­men­tos
prin metoda standardului intern (calculele se efectuează con­form formulei):
S × Kx
A% = x × R × 100
Sst × Kst

În acest caz, Sst şi Kst = 1, iar

R = m standardului / m amestecului de analizat (fără standard)

Fiecare student calculează independent, ținând cont de datele cro­ma­to­­

gramei, formula fiind următoarea:
Sx
A% = R × 100
Sst

Cromatograma se interpretează, efectuându-se calculele necesare.
Toate datele se includ în tabelă.
Analiza cantitativă Analiza calitativă
Nr.
Compo­nenta % TR'
cromato­ Metoda Viteza
amestecului h S normei L
gramei standardului benzii Trel
interne

Calcularea vitezei optime a gazului vector pentru repartiţia com­po­

nentelor.
Fiecare student primeşte cromatogramele substanţei de analizat, cu
vector-heliu la diferite viteze.
a) pentru fiecare cromatogramă, calculaţi numărul talerelor teore­tice
cu ajutorul ecuaţiei: x

( YX )
2
N = 16 ×
y
40
Calculaţi ÎETT cu ajutorul următoarei formule:
L cm

ÎETT =
N
unde: ÎETT – înălţimea eficacităţii talerelor teoretice;
L – lungimea coloanei cromatografice (arătată pe cromatogramă);
N – numărul talerelor teoretice.

b) Construiţi graficul dependenţei ÎETT (axei ordinatelor) în raport

cu viteza gazului vector (axei absciselor). Determinaţi viteza maximă a
heliului după grafic, corespunzător ÎETT minime pe grafic.
Alcătuiţi tabela.
2
x x
VHe X Y   N ÎETT
Y Y

Calcularea reproductibilităţii metodei CGL.

Fiecare student primeşte 3 cromatograme ale unui component, no­tea­ză
condiţiile experimentului şi măsoară înălţimea picului în mm, calculează
înălţimea medie, greşeala determinării separate, abaterea re­la­ti­vă medie.
Abaterea determinării separate:
hmed – h1 = a1
hmed – h2 = a2
hmed – h3 = a3

Abaterea medie a1 + a 2 + a 3
=b
3

Abaterea relativă medie
b
× 100
hmediu
Abaterea medie relativă nu trebuie să depăşască 3-4%.

41
 Determinarea alcoolului etilic din sânge şi urină prin me­toda CGL.

Prelucrarea metodică.
Condiţiile de lucru: Aparat – Crom-4: coloană de oţel (sticlă) 2 m, fa­za
staţionară – PEG-1500, umplutura – cromaton cu argint N-AW-DMAS, Tº
coloanei – 680, Tº termostatului – 70º, T catarometrului – 100º, inten­­si­
tatea curentului în detector – 100 A, gazul vector – heliu 2,4 l/oră, sen­
si­bilitatea înregistrării 2, mărimea probei 2 ml. Cloralhidratul, formal­de­­
hida, acidul acetic, fenolul, dioxanul, acidul cianhidric, metilsalici­latul,
metilmercaptofosul picuri nu formează.
Mai întâi, se înregistrează picurile metilnitrilului, hexanului, penta­
nu­lui apoi cele ale etilnitrilului. Apoi se înregistrează etilnitrilul și după
el – cloroformul, tetraclorura de carbon, dicloretanul, acetona, eterul, ben­
zenul, toluenul, xilolul, octanul, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-, amil-,
izoamilnitriţii, această ordine de înregistrare nu împiedică identi­fi­carea.
Pentru a dovedi prezenţa alcoolului etilic, se vor utiliza atât valo­rile timpului
de reţinere corectat cât şi cele ale timpului de reţinere relativ.

Identificarea alcoolului etilic în amestecul model (descrieţi chi­mis­­mul

reacţiilor):
Într-un flacon de penicilină vid se introduc 0,5 ml de solușie de acid
tricloracetic 50%, 5 ml de solușie de n-alcool propilic (4%) şi 0,5 ml de
sânge sau urină (ori C2H5OH). Flaconul se închide cu un dop din cau­ciuc
şi se fixează în cilindrul metalic. Capacul cilindrului se închide ast­fel încât
dopul de cauciuc să închidă ermetic flaconul. Conţinutul flaco­nu­lui se agită
cu precauţie.
Cu o seringă de 1 ml, în flacon se introduc 0,25 ml de soluţie de ni­
trit de sodiu de 30%. Flaconul se agită şi peste 1 minut, cu o altă se­rin­gă,
se colectează 2 μl de probă gazoasă şi se introduc în injectorul cro­ma­
tografului. Cromatograma înregistrată permite să se determine timpul de
reţinere corectat şi relativ. Timpul de reţinere relativ se determină după
n-alcoolul propilic.
Determinarea cantitativă prin metoda standardului intern. Metoda
grafică. Construirea curbei de calibrare a soluţiei standard de alcool etilic
în lichidele biologice sau în soluţie apoasă de etanol.
Fiecare student primeşte 4 cromatograme ale etilnitritului, propor­țio­

42
nal cu conţinut de etanol din lichidele biologice (sânge sau urină). Fiecare
cromatogramă se interpretează după calculele de determinare calitativă
şi cantitativă a alcoolului etilic în lichidele biologice. Pentru aceasta, se
calculează timpul de retenţie relativ al etilnitrilului. Pentru de­terminarea
cantitativă, se determină înălţimea picurilor de etilnitrit (hx) şi standard
– n-propilnitrit (hst) şi se calculează raportul hx/hst × 100. Se construieşte
graficul: pe axa ordonatelor se înscrie raportul hx/hst × 100, pe axa absciselor
– concentraţia etanolului în lichidele biologice în pro­mile (‰).
Soluţiile standarde de etanol în sânge şi urină nu sunt stabile şi trebuie
regulat. Pentru construirea curbei de calibrare, mai adaptată ar fi fo­losirea
soluţiilor standarde apoase de alcoolul etilic. La utilizarea da­te­lor din
diagramă se folosesc neapărat coeficienţii de calibrare: pentru de­ter­minarea
etanolului în sânge, acesta este egal cu 0,95, iar în urină – cu 1,05.
Cs = C(C2H5(H2O))×0,95, Cur = C(C2H5(H2O))×1,05 (C(C2H5(H2O)) – valoarea
concentraţiei etanolului stabilită după curba de calibrare a soluţiei apoase
de etanol).
Metoda de calcul pentru determinarea cantitativă a etanolului în
cazul aplicării standardului intern
Analiza cantitativă a etanolului după metoda standardului intern se
efectuează şi prin metoda de calcul fără a construi graficul de calibrare, cu
ajutorul următoarei formule:
Sx
C‰ = × K' × R;
Sat
R = 1
K' – coeficientul de corecţie relativ al suprafeţelor picurilor (Sx, Sst),
determinat pentru fiecare component în raport cu standardul în condiţiile
date. (FLS, temperatura de evaporare. Temperatura de ter­mo­sta­tare, detectorul,
viteza gazului vector). Astfel, calculul coefi­cientului de corecţie se exprimă prin
formula:

S st
K′ = × C‰; ori suprafaţa acestuia se înlocueşte cu înalţimea picului.
SX

Pentru calcularea K', se iau soluţiile apoase de etanol (1‰, 2‰, 3‰,
4‰) al căror standard intern este alcoolul propilic. Componenții soluțiilor
apoase ale etanolului se dozează conform regulilor și se cromato­gra­fia­ză.

43
Pe cromatogramă, se măsoară înălţimea picului etilnitrit şi propilnitrit (în
soluţie apoasă de etanol) şi se calculează K' apoi se înmulţeşte la 0,95 sau la
1,05. Coeficientul final, care va fi folosit în formula de calcul pentru sânge
Ks va fi egal cu K'med înmulțit cu 0,95, iar pentru urină, coefi­ci­entul
Kur = K'med ×1,05.
h st
Exemplu de prelucrare a rezultatelor obţinute: K ′ = × Cx
hx

Conc. Înălţimea Înălţimea h

etanol picului picului
K' = st × Cx K'med Ks Kur
hx
Cx etilnitrit propilnitrit
1‰ 62 135 135/62 × 1 = 2,18
2‰ 80 99 99/80 × 2 = 2,48
3‰ 140 109 109/104 × 3 = 2,34 K'med × 0,95 K'med ×1,05
4‰ 192 106 108/192 × 4 = 2,20
5‰ 178 78 78/178 × 5 = 2,25
2,29 2,11 2,41

Exemplu de calcul:
Problema 1. Calculaţi cantitatea de etanol în sânge, dacă:

hС2H5ONO = 60 mm

hC3H7ONO = 130 mm
60
C‰c2h5oh = × 2,11 = 0,97%
130
Problema 2. Calculaţi conţinutul etanolului în urină, dacă:

hС2H5ONO = 175 mm

hC3H7ONO = 80 mm
175
C‰c2h5oh = × 2,41 = 5,27%
80
K – coeficientul de corecţie pentru fiecare concentraţie

K' – coeficientul mediu pentru determinarea conţinutului de alcool etilic în sânge

şi în urină.

44
Bibliografie

1. Notițe de la prelegeri.
2. Cotelea T. Simonov L.Grupa compuşilor toxici, care se izolează din
materialul biologic prin antrenare cu vapori de apă. Recomandări
metodice pentru studenţii anului IV Chisinău,Centrul Editorial-Poligrafic,
Medicina,2017
3. M. Bojiță, L. Roman, R. Sandulescu, R. Oprea. Analiza și controlul
medicamentelor. Vol.1. Deva, Ed. Inteleredo, 2003.
4. G. Cimpan, S. Cobzac. Metode analitice de separare. Manual de lucrări
practice de separare. Universitatea „Babeș Bolyai”. Cluj Napoca, 1995.
5. S. Cogan. Curs de Chimie analitică. Metode de separare. Manual de lucrări
practice. Universitatea „Babeș Bolyai”. Cluj Napoca, 1994.
6. L. Roman, R. Săndulescu, M. Bojiță. Validarea metodelor de analiză și
control. București, Ed. Medicală, 1998.
7. L. Roman, R. Săndulescu, M. Bojiță, D. Muntean. Validarea metodelor
analitice. București, Ed. Medicală, 2007.
8. L. Zadornîi. Metode cromatografice de separare și analiză. Îndrumar de
laborator. Chișinău, Ed. UTM, 1998.
9. Л. Симонов, В. Валика. Группа токсических веществ извлекаемых из
биоматериала перегонкой с водяным паром. Методические указания
для студентов IV курса фармацевтического факультета по токси­
кологической химии. Кишинэу, Изд. Полиграф. Центр Medicina, 2007.
10. Л. Симонов. Курс лекций по токсикологической химии. Кишинёв, 2003.

Lucrarea de laborator Nr. 3

Tema: Expertiza chimico-toxicologica a toxicilor „volatili” din

materialul biologic. Determinarea alcoolului etilic în lichidele biolo­
gice prin metoda cromatografiei gaz-lichide. Metoda cromatografiei
gaz-lichide în identificarea şi dozarea toxicilor „volatili”. Evaluare

Scopul temei: Consolidarea cunoştinţelor teoretice şi practice refe­

ri­tor la analiza chimico-toxicologică a toxicilor „volatili” din materialul
biologic. Studierea metodică de dozare a etanolului din sânge şi urină prin
aplicarea metodei cromatografiei de gaze.
Determinarea gradului de alcoolizare a organismului.

Obiectivele
1. Asimilarea practicii izolării toxicilor „volatili” din materialul
biologic, aplicându-se metoda antrenării cu vapori de apă.
2. Studierea metodelor de identificare a toxicilor „volatili” din
45
 distilatul obţinut.
3. Determinarea cantitativă a toxicilor „volatili”.
4. Studierea biotransformării toxicilor „volatili”.
5. Studierea modului de dozare a etanolului din sânge şi urină prin
aplicarea metodei cromatografiei de gaze.
6. Determinarea gradului de alcoolizare a organismului.
Echipamentul necesar pentru realizarea lucrării de laborator
Modele de solvenţi şi amestecuri de solvenţi organici: alcool etilic,
alcool metilic, alcool butilic, alcool izobutilic, alcool izoamilic, chloroform,
tetraclorură de carbon, etilacetat, acetonă, dioxin, soluţie standard intern de
alcool propilic.
Soluţii de etanol 1‰, 2‰, 3‰, 4‰, 5‰, soluţie de propanol 4‰,
soluţie acid tricloracetic 50%, soluţie de nitrit de sodiu 30%, probe de
sînge şi urină cu conţinut de alcool etilic 1‰, 2‰, 3‰, 4‰, 5‰.
Cromatograf, două coloane umplute cu faze lichide mobile de di­fe­rite
polarităţi, seringi pentru introducerea probelor în coloană, cu volu­mul de
1 μl şi 10 μl, flacoane pustii de penicilină cu dopuri de cauciuc, cilindre de
metal cu dop rodat pentru fixarea flacoanelor cu conținut de probă, pipete
chimice cu volumul de 1, 2, 5 ml.
Subiectele ce stau la baza pregătirii individuale
1. Care este principiul metodei de izolare a toxicilor „volatili”?
2. Explicaţi prepararea probelor preliminare în analiza chimico-
toxicologica a toxicilor „volatili”.
3. Cum se izolează etilenglicolul şi acidul acetic din materialul biologic?
4. Care sunt particularităţile izolării alcoolului izoamilic, etilic, me­tilic,
a fenolului, dicloretanului, aldehidei formice?
5. Cum se efectuează analiza chimico-toxicologică a acidului cian­hi­
dric şi a sărurilor acestuia în extrasele biologice.
6. Care este importanţa toxicologică, mecanismul acţiunii toxice şi a
metabolismul acidului cianhidric şi sărurilor acestuia.
7. Efectuaţi analiza chimico-toxicologică, identificarea şi dozarea
derivaţilor halogenaţi (cloroform, dicloretan, cloralhidrat, tetraclorura
de carbon) în materialul biologic.
8. Care este acţiunea toxicologică a derivaţilor halogenaţi ai hidro­carburilor?
9. Care este caracteristica alcoolului metilic, etilic, izoamilic şi a
etilenglicolului? Particularităţile izolării, identificării şi dozării
46
 alcooli­lor în funcţie de obiectul de cercetare?
10. Care sunt particularităţile acţiunii alcoolului etilic? Descrieţi coma
alcoolică.
11. Care sunt metodele chimice de confirmare a prezenţei formal­de­hidei
în organele cadaverice?
12. Care este acţiunea toxică şi biotransformarea formaldehidei în
organismul uman.
13. Descrieţi acetona şi acidul acetic; toxicocinetica şi toxicodinami­ca.
14. Efectuaţi analiza chimico-toxicologică a acidului acetic şi a ace­­to­nei.
15. Care sunt particularităţile cercetărilor chimico-toxicologice ale
fenolu­lui şi derivaţilor săi?
16. Caracterizaţi biotransformarea fenolului şi acţiunea toxică a aces­tuia.
17. Cum se efectuează expertiza intoxicaţiilor alcoolice în mate­rialul
cadaveric? Factorii ce influenţează asupra identificării etanolului.
18. Explicaţi mecanismul acţiunii toxice a tetraetilului de plumb.
19. Efectuaţi analiza chimico-toxicologică a nitrobenzenului şi a ani­linei.
20. Care este mecanismul acţiunii toxice a nitroderivaţilor?
21. Descrieți procesele de absorbţie, repartiţie şi eliminare a cia­nu­ri­lor
şi acidului cianhidric, cloroformului, cloralhidratului, tetraclorurii de
carbon, dicloretanului, formaldehidei, acetonei, acidului acetic, alcooli­
lor alifatici, etilenglicolului, fenolului, nitrobenzenului.
22. Cum are loc biotransformarea acidului cianhidric, a derivaţilor
halogenaţi, acidului acetic, formaldehidei, etilenglicolului, a hidrocar­
bu­rilor saturate?
23. Cum are loc absorbţia, distribuţia şi eliminarea alcoolului etilic în și
din organismul uman?
24. Cum are loc biotransformarea alcoolului etilic?
25. Care este simptomatologia intoxicaţiilor cu alcool etilic?
26. Cum se efectuează expertiza intoxicaţiilor cu alcool etilic? In­ter­
pretarea rezultatelor expertizei în funcţie de materialul bio­logic.
27. Care sunt caracteristicile cu intoxicaţii mixte cu alcool etilic?
28. Care este caracteristica metodei gaz-cromatografice în vederea
determinării toxicilor „volatili”? Descrieţi părţile componente ale
cro­ma­tografului.
29. Enumăraţi tipurile de detectori ţi principiile de lucru ale acestora.
30. Explicaţi eficacitatea coloanei.
31. De ce depinde selectivitatea fazei staţionare?
47
 32. Formulaţi definiţia timpului corectat şi timpului relativ în coloană.
33. Care este principiul de identificare a toxicilor „volatili” prin me­­toda
cromatografiei de gaze?
34. Cum se dozează toxicii „volatili” prin metoda cromatografiei de gaze?
Care sunt principiile de lucru şi metodele de calcul?
35. Cum se dozează etanolul în lichidele biologice: chimismul, me­todele,
calculele?
Realizarea lucrului practic

Condiţiile experimentului: aparatul „Crom-4”, coloana de sticlă – 2 m,

faza staţionară PEG-1500 10%, Tº colanei – 60ºC, Tº camerei de evapo­rare
70ºC, Tº catarometrului – 100ºC, intensitatea curentului – 100 A, ga­zul
purtător – Heliu, viteza 2,4 l/oră, mărimea probei – 2 ml.
Problema 1
Determinarea coeficientului de corecţie pentru analiza cromato­gra­fică
a lichidelor biologice și detectarea prezenţei alcoolului etilic prin metoda de
calcul.
Fiecare student primeşte soluţie în apă (cu concentraţia de 1-5‰) şi
prelucrează, apoi cromatografiază amestecul de gaze în cromatograf. Pe
cromatograma obţinută, se măsoară înălţimea picului etilnitrit şi propil­
nitrit. Cu ajutorul datelor obţinute, se efectuează calcu­lele coeficientului de
corecţie relativ conform formulei:
hst (înălțimea picului propilnitrit)
1) K' = × Cc2h5oh‰
hx (înălțimea picului etilnitrit)

2)  Se calculează K'med

3) Se calculează coeficientul de corecţie pentru determinarea eta­

no­lului în sânge în condiţiile cromatografice date, ținându-se cont de coefi­
cientul de calibrare.
K sânge = Kmed × 0,95

1) Se calculează coeficientul de corecţie pentru determinarea eta­

no­lului în urină în condiţiile experimentului, ținându-se cont de coefici­en­
tul de calibrare.
Kur = Kmed × 1,05

48
 Problema 2
Dozarea alcoolului etilic în sânge şi urină prin metoda de calcul
Grupuri a câte 2 studenţi primesc o problemă. Li se dau două fla­coane
cu lichid biologic: urină şi sânge cu conţinut de alcool etilic.
Probele se prelucrează pentru dozarea alcoolului etilic (Problema 1) şi
se cromatografiază produsele gazoase ale reacţiei în aparatul „Crom-4”.
Cromatograma obţinută se prelucrează calitativ (distanţa de reţinere L);
TR – corectat, Trel – timpul relativ. Se efectuează dozarea alcoolului etilic
prin metoda de calcul, pentru care se măsoară înălţimea etilnitritului şi
propilnitritului şi se efectuează calculele. Înălţimea picului propilnitrit
C etanol în sînge ‰ = înălțimea picului propilnitrit/ înălţimea picului etilnitrit ×Ksînge

C etanol în urină ‰ = înălțimea picului propilnitrit/ înălţimea picului etilnitrit ×Kurină

Problema 3
Determinarea etanolului prin metoda standardului intern după gra­fi­cul
de calibrare.
a) Pentru rezolvarea acestei probleme, studenţii folo­sesc date din
problema 1, completează tabela şi construiesc graficul de calibrare după
datele obţinute.

Concentrația Înălţimea Înălţimea picului

h -C2H5ONO
etanolului picului etilnitrit propilnitrit × 100
în ‰ h –C2H5ONO h –C3H7ONO h -C3H7ONO
1‰
2‰
3‰
4‰
b) Determinarea etanolului în lichidele biologice după graficul de
calibrare. Se prelucrează sângele şi urina după metoda soluţiei apoase
de etanol. Se măsoară pe cromatogramă h –C2H5ONO şi h –C3H7ONO
şi se găseşte pe grafic concentraţia corespunzătoare a etanolului (CH2O).
Deoarece graficul de calibrare este cunoscut după soluţia apoasă de eta­nol,
concentraţia adevărată a eta­nolului în sânge Csânge = CH2O × 0,95, iar în urină
Curina = CH2O × 1,05.
În sfârşit, se compară datele obţinute după graficul de calibrare şi
metoda de calcul.
Se deduce conţinutul etanolului în sânge şi urină şi gradul de alco­o­lizare.
49
Bibliografie
1. Notițele de la curs.
2. Cotelea T. Simonov L. Grupa compuşilor toxici, care se izolează din
materialul biologic prin antrenare cu vapori de apă. Recomandări metodice
pentru studenţii anului IV Chisinău, Centrul Editorial-Poligrafic, Medicina, 2017
3. T. Brodicico, V. Valica. Curs de Chimie toxicologică. Chişinău, 2003.
4. Крамаренко В. Г. Токсикологическая химия. Киев: Выща школа, 1989.
C. 135-143.
5. Лужников Е. А. Клиническая токсикология. М. «Медицина», 1994. C. 552.
6. Белова А. В. Руководство к практическим занятиям по токсиколо­ги­­
ческой химии. Москва: «Медицина», 1976. C. 37-44.
7. Л. Симонов, В. Валика. Группа токсических веществ извлекаемых из
биоматериала перегонкой с водяным паром. Методические указания
для студентов IV курса фармацевтического факультета по токси­
кологической химии. Кишинэу, Изд. Полиграф. Центр Medicina, 2007.
8. Л. Симонов. Курс лекций по токсикологической химии. Кишинёв, 2003.

Lucrul individual
Problema 1. Pentru separarea substanţelor, ca detector, în cate­ro­metru
se folosesc diferite gaze-vectori: azot, heliu, hidrogen, argon. Care gaz-vector
asigură o sensibilitate mai mare a catarometrului? Argu­men­taţi răspunsul
alcătuind următoarea tabelă:
Gaz Conductibilitate termică M. Mol

Problema 2. Secţia toxico-narcologică cere determinarea cantității de

metanol dintr-o cantitate de urină prin metoda cromatografiei gaz-lichide.
Care detector se va utiliza, pentru ca apa să nu blocheze deter­mi­narea
metanolului?
Problema 3. Secţia de cercetări chimico-judiciare cere efectuarea
ana­li­zei-express a materialului biologic şi anume a microcantităţilor de
cloroform din sânge. Care tip de detector se va folosi pentru efectuarea
aces­tei analize?
Problema 4. Cetăţeanul A fost internat la centrul pentru tratarea in­
toxicaţiilor acute cu presupunere de intoxicare cu fenol. A fost efec­tuată
analiza gaz-cromatografică a urinei acidulate a pacientului. Pe co­loa­na
polară, timpul relativ de reţinere corespundea etilenglicolului şi feno­
lului, iar pe cea nepolară – fenolului şi toluolului. Care vor fi concluziile
50
chimistului-expert?
Problema 5. Pentru identificarea picului cromatografic, de care
caracteristici se va ține cont?
a. Punctul iniţial al picului,
b. Maximul picului,
c. Lăţimea picului,
d. Înălţimea picului,
e. Suprafaţa picului.
Buletin de expertiză
Actul analizei chimico-toxicologice a corpurilor delicte, conform
dosarului cetăţeanului X, transmise anchetatorului_________________.
Analiza se efectuează în laboratorul toxicologic al Universităţii
de Stat de Medicină şi Farmacie „Nicolae Testemiţanu” de chimistul-
expert_____________________________.

Începutul_________­­____ Sfîrşitul_____________

Examenul exterior
Pentru cercetare, se ia un borcan de sticlă transparentă, cu volumul
de 500 ml, acoperit cu permanganat, cu inscripţia „Borcanul Nr.1 frag­
mente de ficat şi rinichi”. Conţinutul probei reprezintă fragmente de or­gane
indicate cu masa: ficat – 250 g, rinichi – 200 g. Reacţia conţi­nu­tului probei
(turnesol – neutră). Miros – neutru.
Cercetatrea chimică
100 g de material biologic din borcanul Nr. 1 se amestecă cu apă distilată
până la o consistenţă densă, se acidulează cu acid oxalic până la pH slab
acid (hârtia indicator turnesol) şi se supune antrenării cu vapori de apă:
prima fracţie a distilatului în volum de 3 ml s-a adunat într-un volum de
5 ml soluţie NaOH 1%. Fracţia a 2-a (25 ml) şi a 3-a (25 ml) se adună
separat, fără adaos de NaOH.
Cercetarea distilatului
1. La fracţia 1 de distilat se adaugă câteva picături de sulfat de Fe şi 1-2
picături de soluție de clorură de Fe, apoi lichidul se acidulează cu HCl
până la pH slab acid. Precipitat albastru nu a apărut nici imediat, nici
peste 48 de ore.
2. Fracţia 2 se supune probei cu soluție de rezorcină în NaOH, care se
încălzeşte, dar nu se observă coloraţie.
51
 3. Fracţia 2 se supune probei cu soluție de iod în NaOH. La încăl­zire pe
bain-marie, se depune precipitat galben cu miros de cloroform.
4. La o parte din fracţia 2, se adaugă volum egal de soluție de acid sulfuric
de 20% şi câteva cristale KMnO4. Peste un interval de timp, se simte
miros plăcut de fructe. Peste 20 min, lichidul se filtrează şi cu filtratul
incolor se efectuează reacţiile următoare:
a. La jumătate din filtrat se adaugă 1/5 volum de acid sulfuric
con­centrat, în care au fost solubilizate câteva cristale de
morfină. Culoarea albastră-violetă nu a apărut.
b. La a 2-a jumătate de volum a filtratului se adaugă acelaşi volum
de acid fuxin sulfuros şi 1 ml de acid sulfuric concentrat. Nu se
observă nici o coloraţie.
5. Câteva cristale de acetat de Na se dizolvă în 1 ml de soluție din distilatul
2, care se amestecă cu un volum dublu de acid sulfuric con­cen­trat. La o
uşoară încălzire, se simte miros de etilacetat.
6. O parte din distilatul 2 se amestecă cu acelaşi volum de soluție alcoolică
de 5% de NaOH şi se încălzeşte atent timp îndelungat. Când se răcește,
se adaugă acid azotic şi apoi – soluție de nitrat de Ag de 5%. Formarea
opalescenţei şi precipitatului nu se observă. Reziduurile disti­latului 2
se amestecă cu al 3-lea şi se cercetează.
7. La o parte din distilat se adaugă câteva picături de apă de Br, unde
imediat se formează opalescenţă gălbuie; o jumătate din distilat se
supune deflegmaţiei de 2 ori. După a 2-a deflegmaţie s-a colectat: în pri­
mul distilat – 5 ml de lichid, în al 2-lea – 10 ml lichid. Cu primul dis­ti­lat
s-au efectuat reacţiile descrise în punctele 3, 4, 5 cu acealaşi rezultate.
În urma reacţiei descrise în punctul 5, mirosul de etilacetat devine mai
pronunţat. În urma reacţiei cu apa de Br, opalescenţa nu se observă.
8. A 2-a parte a mestecului distilat se unesc, se alcalinizează cu carbonat de
Na şi se repetă extracţia cu eter. Extracţiile eterice se unesc, se filtrează,
iar eterul se înlătură la temperatura camerei. Reziduul a fost neînsemnat.
După solubilizarea acestuia în 2-3 picături de apă distilată, se adaugă 2
picături de clorură de Fe, proaspăt pregătită. Culoarea vio­letă nu apare.

Concluzie
Din analiza efectuată şi descrisă, rezultă că în materialul biologic
al cetăţeanului X s-a identificat alcool etilic. Nu s-au identificat: acid
cianhidric, alcool metilic, cloroform, te­tra­clorură de carbon, cloralhidrat,
formaldehidă, fenol, alcool izoamilic.

52
 Teste:
1. CS Construirea graficului de calibrare este necesar pentru metoda:
a) Standardului intern
b) Calibrării absolute
c) De normare a ariilor
d) De neutralizare
e) De calcul a timpului de retenţie relativ

2.CS Etilenglicolul în lichidele tehnice se determină prin reacţia:

a) De formare a rodanurii de fier
b) Cu sulfat de cupru
c) Cu formarea esterilor
d) Cu clorură de fer (III)
e) Cu rezorcină

3.CS Indicaţi proprietatea fizică ce caracterizează cloralhidratul:

a) Lichid cu gust dulce
b) Lichid care fierbe la o temperatură ridicată
c) Substanţă solidă ce se topeşte la o temperatură joasă
d) Lichid ce fierbe la o temperatură joasă
e) Lichid uleios cu gust dulce

4.CS Din materialul biologic prin metoda antrenării cu vapori de

apă în prezenţa acidului fosforic se extrage:
a) Etanolul
b) Cloroformul
c) Acidul cianhidric
d) Acidul acetic
e) Acetona

5.CS Biotransformarea alcoolului izoamilic are loc conform reacţiei:

a) Reducere
b) Oxidare
c) Hidroliza
d) O-dezalchilare
e) Transformarea în rodanuri

53
 6.CS Biotransformarea etilenglicolului are loc conform reacţiei:
a) Oxidare
b) Reducere
c) Acetilare
d) Hidroliză
e) O-dezalchilare

7.CS Pentru izolarea toxicilor din materialul biologic prin metoda

antrenării cu vapori de apă se adaugă soluţia de:
a) Acid sulfuric
b) Hidroxid de sodiu
c) Amoniac
d) Acid oxalic
e) Acid azotic

8.CS Precipitatul de culoare albă obţinut la interacţiunea apei de

brom cu distilatul confirmă intoxicaţia cu:
a) Etanol
b) Fenol
c) Acidul acetic
d) Barbital
e) Acidul cianhidric

9.CS Prin reacţia distilatului cu clorura de fier, apariţia culorii

albastră-violetă, care dispare la adăugarea etanolului se confirmă
prezenţa:
a) Acidului salicilic
b) Fenolului
c) Anilinei
d) Acidului acetic
e) Etilenglicolului

10.CS Indicaţi metoda de izolare a plumtetraetilului din materialul

cadaveric:
a) Mineralizarea uscată
b) Antrenarea cu vapori de apă
c) Macerare cu solvenţi polari
54
 d) Extragerea cu solvenţi nepolari
e) Distructivă a materialului biologic

11.CS Distilatul ce conţine acid cianhidric se colectează:

a) Într-un balon gol
b) În soluţie de hidroxid de sodiu
c) În soluţie de acid sufuric
d) În soluţie de carbonat de sodiu
e) În soluţie de acid oxalic

12. CS Dacă în urină în a cincea zi a fost determinat acidul formic

intoxicaţia a fost provocată de către:
a) Fenol
b) Etanol
c) Metanol
d) Cloroform
e) Acetonă

13.CS Metoda gaz-cromatografică se aplică în determinarea

cantitativă pentru:
a) Alcoolul metilic
b) Alcoolul etilic
c) Cloroform
d) Alcoolul izoamilic
e) Acidul acetic

14.CM Izolarea alcoolului etilic are loc cu ajutorul metodelor:

a) Mineralizarea umedă
b) Antrenarea cu vapori de apă
c) Antrenarea cu vapori de apă în prezenţa clorurii de sodiu
d) Macerarea cu solvenţi polari
e) Metoda distructivă

15.CM Timpul relativ de retenţie a substanţei în coloana

cromatografului de gaze depinde de:
a) Natura substanţei
b) Viteza gazului vector
55
 c) Natura fazei staţionare
d) Temperatura termostatului cu coloane
e) Temperatura injectorului

16.CM Coma profundă acută este confirmată de valorile în sînge (Cs)

şi urină (Cu) a alcoolului etilic:
a) Сu/Сs=1,22-1,34
b) Сu/Сs=0,97-1
c) Сu/Сs=1,54
d) Сu=3 %о
e) Сs=3,5 %о

17.CM Calcularea concentraţiei alcoolului etilic prin metoda gaz-

cromatografică se efectuează cu ajutorul parametrilor:
a) Timpul de retenţie
b) Aria picului
c) Înălţimea picului
d) Cu ajutorul standardului intern
e) Volumul de retenţie a gazului

18.CM Dozarea etanolului în materialul biologic se efectuează prin

metodele:
a) Fotocolorimetria
b) Gravimetria
c) Cromatografia gaz-lichidă
d) Colorimetria vizuală
e) Metoda enzimatică

19. CM Pentru diagnosticarea comei acute sau superficiale, alcoolului

etilic se dozează din probele biologice:
a) Salivă
b) Aer expirat
c) Sânge
d) Urină
e) Mase vomitive

56
20. CM Enzimele sub influenţa cărora viteza de biotransformare a
alcoolului etilic este constantă şi nu depinde de concentraţia totală din
organism sunt:
a) Alcooldehidrogenaza
b) Catalaza
c) Sistemul microsomial de oxidare
d) Aldehiddehidrogenaza
e) Reductaza

57
 Cuprins

Introducere...............................................................................................3
Tema: Cercetarea substanţelor toxice, care se izolează din materialul
biologic prin metoda antrenării cu vapori de apă, aplicând cromatogra-
fia gaz-lichidă. Lucrarea de laborator N1............................................... 4
Tema: Metoda cromatografiei gaz-lichide în analiza chimico-
toxicologică. Determinarea cantitativă. Lucrarea de laborator N2......... 38
Tema: Expertiza chimico-toxicologica a toxicilor „volatili” din
materialul biologic. Determinarea alcoolului etilic în lichidele biolo-
­gice prin metoda cromatografiei gaz-lichide. Metoda cromatografiei
gaz-lichide în identificarea şi dozarea toxicilor „volatili”. Lucrarea de
laborator N3. Evaluare........................................................................... 45
Lucrul individual. Completa­rea buletinului de expertiză......................50

Teste........................................................................................................ 53

58