Metoda Southern Blot

- principala metodă de analiză genomică este metoda Southern blot;

- este o tehnică pentru determinarea formelor specifice de ADN din diferite
celule;
- în prealabil, ADN-ul este extras din celule şi fragmentat cu ajutorul unor enzime
de restricţie;
- urmează separarea fragmentelor de ADN prin electroforeză şi transferarea
acestora pe un suport solid (hârtie);
- moleculele specifice sunt apoi identificate cu o sondă nucleotidică radiomarcată.

ETAPE:
• Extragerea ADN genomic dintr-o sursă accesibilă cum ar fi:
– limfocite din sânge periferic;
– fibroblaste din cultură;
– celule amniotice sau din vilozităţi choriale pentru diagnosticul prenatal;
– celule obţinute prin biopsii de organe;
• Fragmentarea ADN genomic prin clivare cu o enzimă de restricţie adecvată,
care să conducă la aproximativ un milion de fragmente mai mici de 20kD
• Separarea fragmentelor pe baza mărimii lor prin electroforeză pe gel de
agaroză

• Denaturarea fragmentelor bicatenare în mediu alcalin, pentru separarea

celor 2 catene complementare;
• Transferarea prin capilaritate (blotting) a moleculelor de ADN monocatenar
de pe gel pe un suport solid (filtru din nitrat de celuloză sau nylon) unde vor
fi imobilizate exact în poziţia rezultată prin migrarea pe gel;
• Hibridizarea fragmentelor de pe filtru cu o sondă monocatenară specifică şi
marcată radioactiv sau fluorescentă. Pe baza complementarităţii sonda
hibridizeaza exclusiv cu secvenţa omoloagă/complementară din unele
fragmente de ADN genomic;
• Duplexul format între fragmentele de ADN complementare şi sondă este
rezistent la spălare şi poate fi evidenţiat datorită emisiei radioactive
(marcaj izotopic) sau prin recunoaşterea specifică a ligandului fluorescent;

UTILIZARE:

• Utilizarea metodei Southern blot pentru analiza genotipică presupune

cunoaşterea prealabilă a hărţii situsurilor de restricţie pentru domeniul
genomic explorat de sondă ceea ce permite alegerea unui cuplu adecvat
enzima de restricţie-sondă;
• Rezultatele obţinute se compară cu profilul normal al domeniului genomic
explorat de sondă, fiind posibilă evidenţierea a două tipuri de mutaţii:
• Deleţii sau inserţii mai mari de 50-100 perechi de baze, care
modifică lungimea fragmentelor de restricţie; dacă deleţia este
 totală atunci secvenţa genică lipseşte, iar sonda nu dă niciun
semnal;
• Mutaţii punctiforme ce afectează o singură pereche de baze şi
creează sau distrug un situs de restricţie al enzimei folosite,
antrenând o modificare a lungimii fragmentelor.