Sunteți pe pagina 1din 18

Spectrofotometrie

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Ce este un spectru?

Definitie

Definitie generala = toate valorile pe care le poate lua o marime fizica
valori
Spectru
continuu

 Spectre continue / discrete



Spectru continuu – marimea fizica
poate lua orice valoare, intr-un
interval valori

Spectru discret – marimea fizica
poate lua doar anumite valori valori Spectru
discrete in interiorul unui interval discret

valori

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Spectrul EM

Spectrul electromagnetic


c= =⋅
T

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Spectrul EM

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Spectrofotometrie.
Spectre de absorbtie si de emisie


Spectrofotometria = masuratoare cantitativa a spectrelor
de absorbtie / emisie ale unei substante


Absorbtia radiatiei EM:

Apare la orice substanta

Este maxima la o anume lungime de unda (specifica substantei analizate)

Emisia radiatiei EM:

Emisia anumitor lungimi de unda, in functie de molecula, ca rezultat al excitarii
moleculei (transfer de energie)

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Spectrofotometrie.
Spectre de absorbtie si de emisie

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Spectre de absorbtie si emisie

Energia radiatiei incidente poate fi absorbita la:

Nivel atomic – electronii “sar” pe niveluri energetice superioare; energia
absorbita corespunde diferentei de energie intre nivelul fundamental si nivelul
excitat, de aceea spectrul de absorbtie va fi discret

Nivel molecular – energia va fi utilizata pentru he energy will be used to:

Cresterea vitezei de agitatie moleculara (energie cinetica) → efect termic, spectru de
absorbtie continuu

Cresterea energiei cinetice de rotatie a moleculelor

Cresterea energiei cinetice de vibratie a moleculelor

Moleculele care au absorbit energie intra intr-o stare
excitata, cu timp de viata scurt; revenirea la starea
fundamentala se face prin eliberare de energie:

Emisie radiativa:

Fotoluminescenta (lungimea de unda emisa va fi intotdeauna mai mare ca
cea absorbita – energia emisa ESTE INTOTDEAUNA sa fie mai mica decat
energia absorbita!)

Emisie neradiativa:

Emisie de caldura

Declansarea unor reactii fotochimice
UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie
Spectre de absorbtie. Cromofori

Cromoforii sunt anumite grupari din structura unei
molecule, responsabile pentru culoarea ei
Cromofor Varf de
absorbtie

Fiecare cromofor va
prezenta un maxim de
absorbtie specific

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Spectre de absorbtie. Cromofori

Cand intr-o molecula exista mai multi cromofori,
aceastia isi influenteaza reciproc maximele de
absorbtie:

Efect batocromic (max ) / efect hipsocromic (max )

Efect hipercromic (absorbtie crescuta) / efect hipocromic
(absorbtie scazuta)

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Aplicatiile spectrofotometriei

Analiza calitativa

Din spectrul de absorbtie pot fi deduse informatii
structurale, pe baza varfurilor de absorptie intalnite


Analiza cantitativa

Amplitudinea absorbtiei depinde de concentratia
substantei

Determinari de concentratii ADN/ARN

Determinarea densitatii bateriilor intr-o cultura

Screening toxicologic etc

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Legea Beer-Lambert

Exprima legatura intre intensitatea luminii care
traverseaza o solutie si concentratia solutiei respective

I0 = intensitatea luminii incidente


I = intensitatea luminii emergente
C = concentratia solutiei
d = grosimea cuvetei cu solutie
 = coeficient de absorbtie

− C d
I= I 0 10
N.B. - pentru gaze, legea se scrie
de obicei in forma exponentiala

Coeficientul de absorbtie  depinde de lungimea de unda a luminii

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Transmisia si extinctia

In spectrofotometrie se folosesc uzual doi
parametri pentru a cuantifica absorbtia:

Transmisia (T)

Extinctia (E)

I 1
T= = 10
− C d
E= log = −log T 
I0 T

T ∈[0, 1] E=  C d

E∈0, ∞

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Transmisia si extinctia

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Masurarea spectrului de absorbtie

Masurarea extinctiei pentru un interval de lungimi de
unda

Trasarea curbei E = f(λ)

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Masurarea spectrului de absorbtie

Spectrul de absorbtie este influentat de:

Concentratie → varfuri mai inalte la concentratii mai mari

Temperatura

pH → influenteaza echilibrul intre formele protonate / neprotonate ale
gruparilor moleculare, forme care pot avea varfuri de absorbtie diferite

Formele dimerice / trimerice ale moleculelor pot avea varfuri
de absorbtie suplimentare

Echilibrul intre formele mono / dimerice etc este influentat
de:

Temperatura → temperaturile crescute favorizeaza formele
monomerice

Concentratia → concentratiile mai mari cresc procentul de forme
dimerice

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Activitate experimentala

Masurarea spectrului de absorbtie al unor solutii de
colorant (acridin oranj) cu concentratiile de: 2‰, 4‰, 8‰,
si o concentratie necunoscuta x ‰

Pentru fiecare solutie, masuram extinctia intre 360 nm si 600
nm, cu pasi de 20 nm; datele vor fi trecute intr-un tabel ca cel de
mai jos;

Pe baza datelor din tabel, desenam curbele de absorbtie pentru
cele patru solutii
λ 2 4 8 x

UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie


Activitate experimentala

Calculam concentratia x ‰:
➔ Alegem setul de valori ale E care corespund varfului de
absorbtie (sunt suficiente valoarea pentru x ‰ si pentru una
din solutiile cunoscute)
E x = x d
E cunoscuta = C cunoscuta d
Ex xd
=
E cunoscuta  C cunoscuta d

E x C cunoscuta
x=
E cunoscuta
UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie
Activitate experimentala
Exemplu (Atentie! Nu corespunde cu datele ce se vor obtine la LP!)

Obtinem 3 varfuri de absorbtie, la 415 nm, 500 nm si 570 nm, dupa
cum se vede in figura

Alegem valorile corespunzatoare lungimii de unda de 570 nm (cel
mai mare varf de absorbtie)

λ 2 4 8 x
570 0.75 1.5 3 1.2


Concentratia solutiei
necunoscute va fi (‰):

Ex 8 1.2⋅8
x= ; x=
E8 3
x= 3.2
UMF Carol Davila – Catedra de Biofizica Spectrofotometrie