Mutageneza

Mutageneza este un proces prin care informația genetică a unui organism este modificat prin
producerea unei mutații . Poate apărea spontan în natură sau ca urmare a expunerii la agenți mutageni .
De asemenea, poate fi realizat experimental folosind proceduri de laborator. Un mutagen este un agent
care cauzează mutații, fie el chimic sau fizic, care are ca rezultat o rată crescută de mutații în codul
genetic al unui organism. În natură, mutageneza poate duce la cancer și diferite boli ereditare, dar este și
o forță motrice a evoluției. Mutageneza ca știință a fost dezvoltată pe baza lucrărilor efectuate de
Hermann Muller , Charlotte Auerbach și JM Robson în prima jumătate a secolului al XX-lea.

ADN-ul poate fi modificat, fie natural, fie artificial, de către o serie de agenți fizici, chimici și
biologici, rezultând mutații . Hermann Muller a descoperit că „temperaturile ridicate” au capacitatea de a
muta gene la începutul anilor 1920, iar în 1927, a demonstrat o legătură cauzală cu mutația la
experimentarea cu un aparat cu raze X , observând modificări filogenetice la iradierea muștelor de fructe
cu doza mare de radiografii . Muller a observat o serie de rearanjamente cromozomiale în experimentele
sale și a sugerat mutația ca o cauză a cancerului. Asocierea dintre expunerea la radiații și cancer a fost
observată încă din 1902, la șase ani după descoperirea razelor X de către Wilhelm Röntgen și
descoperirea radioactivității de către Henri Becquerel . Lewis Stadler , contemporanul lui Muller, a arătat,
de asemenea, efectul razelor X asupra mutațiilor la orz în 1928 și al radiațiilor ultraviolete (UV) asupra
porumbului în 1936. În anii 1940, Charlotte Auerbach și JM Robson au descoperit că muștarul gazul
poate provoca, de asemenea, mutații la muștele fructelor.

În timp ce modificările cromozomului cauzate de raze X și gazul muștar au fost ușor de observat
pentru primii cercetători, alte modificări ale ADN-ului induse de alți mutageni nu au fost atât de ușor de
observat; mecanismul prin care apar poate fi complex și poate dura mai mult pentru a se dezlega. De
exemplu, s-a sugerat că funinginea este o cauză a cancerului încă din 1775 și s-a demonstrat că gudronul
de cărbune provoacă cancer în 1915. Substanțele chimice implicate în ambele s-au dovedit mai târziu a fi
hidrocarburi aromatice policiclice (PAH) . HAP în sine nu sunt cancerigeni și s-a propus în 1950 că formele
cancerigene ale HAP sunt oxizii produși ca metaboliți din procesele celulare. Procesul metabolic a fost
identificat în anii 1960 ca cataliză de către citocromul P450 , care produce specii reactive care pot
interacționa cu ADN-ul pentru a forma aducti , sau molecule produse rezultate din reacția ADN-ului și, în
acest caz, a citocromului P450, mecanismul prin care aductii PAH dau naștere la mutație, totuși, este încă
în curs de investigare.

Distincția dintre o mutație și deteriorarea ADN-ului

Deteriorarea ADN-ului este o alterare anormală a structurii ADN-ului care nu poate fi, ea însăși,
replicată atunci când ADN-ul se replic . În contrast, o mutație este o modificare a secvenței de acid
 nucleic care poate fi replicată, prin urmare, o mutație poate fi moștenită de la o generație la alta.
Deteriorarea poate apărea de la adăugarea chimică (aduct) sau perturbarea structurală a unei baze a
ADN-ului (creând o nucleotidă anormală sau un fragment de nucleotide) sau o rupere a uneia sau a
ambelor catene de ADN. O astfel de deteriorare a ADN-ului poate duce la mutații. Atunci când ADN-ul
care conține daune este replicat, o bază incorectă poate fi inserată în noua catenă complementară pe
măsură ce este sintetizată. Inserarea incorectă în noua catenă va avea loc vizavi de situsul deteriorat din
catena șablon și această inserție incorectă poate deveni o mutație (adică o pereche de baze modificată)
în următoarea rundă de replicare. Mai mult, rupturile dublu-catenar din ADN pot fi reparate printr-un
proces de reparare inexact, îmbinare la capăt neomolog , care produce mutații. Mutațiile pot fi de obicei
evitate dacă sistemele precise de reparare a ADN-ului recunosc deteriorarea ADN-ului și o repară înainte
de finalizarea următoarei runde de replicare. Cel puțin 169 de enzime sunt fie direct angajate în
repararea ADN-ului, fie influențează procesele de reparare a ADN-ului. Dintre aceștia, 83 sunt angajați
direct în cele 5 tipuri de procese de reparare a ADN-ului indicate în graficul prezentat în articolul
Repararea ADN-ului .

ADN-ul nuclear de mamifere poate suporta mai mult de 60.000 de episoade de daune pe celulă pe
zi, așa cum este listat cu referințe în daune ADN (care apar în mod natural) . Dacă nu sunt corectate,
acești aducti, după replicarea greșită dincolo de locurile deteriorate, pot da naștere la mutații. În natură,
mutațiile care apar pot fi benefice sau dăunătoare - aceasta este forța motrice a evoluției. Un organism
poate dobândi noi trăsături prin mutație genetică, dar mutația poate duce, de asemenea, la funcționarea
afectată a genelor și, în cazuri severe, provoacă moartea organismului. Mutația este, de asemenea, o
sursă majoră de dobândire a rezistenței la antibiotice în bacterii și la agenții antifungici din drojdii și
mucegaiuri. Într-un cadru de laborator, mutageneza este o tehnică utilă pentru generarea de mutații care
permite examinarea în detaliu a funcțiilor genelor și a produselor genetice, producând proteine cu
caracteristici îmbunătățite sau funcții noi, precum și tulpini mutante cu proprietăți utile. Inițial,
capacitatea radiațiilor și mutagenilor chimici de a provoca mutații a fost exploatată pentru a genera
mutații aleatorii, dar mai târziu au fost dezvoltate tehnici pentru a introduce mutații specifice.

La om, o medie de 60 de mutații noi sunt transmise de la părinte la urmași. Masculii umani, cu
toate acestea, tind să transmită mai multe mutații în funcție de vârsta lor, transmitând în medie două
mutații noi descendenților lor cu fiecare an suplimentar de vârstă.

Mecanisme

Mutageneza poate avea loc endogen (de exemplu, hidroliza spontană), prin procese celulare
normale care pot genera specii reactive de oxigen și aducti ADN, sau prin erori în replicarea și repararea
ADN-ului. Mutageneza poate apărea și ca urmare a prezenței mutagenilor din mediu care induc
modificări la ADN-ul unui organism. Mecanismul prin care apare mutația variază în funcție de mutagenul
sau agentul cauzal implicat. Majoritatea agenților mutageni acționează fie direct, fie indirect prin
metaboliți mutageni, asupra ADN-ului unui organism, producând leziuni. Unii mutageni, totuși, pot
afecta replicarea sau mecanismul de partiție cromozomială și alte procese celulare.

Mutageneza poate fi, de asemenea, autoindusă de organismele unicelulare atunci când condițiile
 de mediu sunt restrictive pentru creșterea organismului, cum ar fi bacteriile care cresc în prezența
antibioticelor, drojdiile care cresc în prezența unui agent antifungic sau alte organisme unicelulare care
cresc într-un mediu lipsit de un nutrient esențial.

Mulți mutageni chimici necesită activare biologică pentru a deveni mutageni. Un grup important
de enzime implicate în generarea metaboliților mutageni este citocromul P450 . Alte enzime care pot
produce și metaboliți mutageni includ glutation S-transferaza și epoxid hidrolaza microzomală .
Mutagenii care nu sunt mutageni în sine, dar necesită activare biologică se numesc promutageni.

În timp ce majoritatea mutagenilor produc efecte care în cele din urmă duc la erori în replicare, de
exemplu creând aducti care interferează cu replicarea, unii mutageni pot afecta direct procesul de
replicare sau pot reduce fidelitatea acestuia. Analog de bază, cum ar fi 5-bromoracil, poate înlocui timina
în replicare. Metalele precum cadmiul, cromul și nichelul pot crește mutageneza în mai multe moduri, în
plus față de deteriorarea directă a ADN-ului, de exemplu reducând capacitatea de a repara erorile,
precum și producând modificări epigenetice.

Mutațiile apar adesea ca urmare a problemelor cauzate de leziunile ADN-ului în timpul replicării,
ducând la erori în replicare. La bacterii, deteriorarea extinsă a ADN-ului din cauza mutagenilor are ca
rezultat goluri ADN monocatenar în timpul replicării. Acest lucru induce răspunsul SOS , un proces de
reparare de urgență care este, de asemenea, predispus la erori, generând astfel mutații. În celulele de
mamifere, blocarea replicării la locurile deteriorate induce o serie de mecanisme de salvare care ajută la
ocolirea leziunilor ADN, cu toate acestea, acest lucru poate duce și la erori. Familia Y de ADN polimeraze
este specializată în bypass-ul leziunilor ADN într-un proces numit sinteza translesion.(TLS) prin care
aceste polimeraze de bypass de leziune înlocuiesc ADN polimeraza replicativă de înaltă fidelitate blocată,
tranzitează leziunea și extind ADN-ul până când leziunea a fost trecută, astfel încât replicarea normală să
poată relua; aceste procese pot fi predispuse la erori sau fără erori.

Leziuni ADN și mutație spontană

Numărul de episoade de deteriorare a ADN-ului care apar într-o celulă de mamifer pe zi este mare
(mai mult de 60.000 pe zi). Apariția frecventă a leziunilor ADN este probabil o problemă pentru toate
organismele care conțin ADN, iar nevoia de a face față leziunilor ADN și de a minimiza efectele lor
dăunătoare este probabil o problemă fundamentală pentru viață.

Cele mai multe mutații spontane apar probabil din sinteza trans-leziunii predispuse la erori dincolo
de un loc de deteriorare a ADN-ului din catena matriță în timpul replicării ADN-ului. Acest proces poate
depăși blocajele potențial letale, dar cu prețul introducerii de inexactități în ADN-ul fiicei. Relația cauzală
a leziunii ADN-ului cu mutația spontană este ilustrată de bacteriile E. coli care cresc aerob , în care 89%
din mutațiile de substituție a bazelor care apar spontan sunt cauzate de deteriorarea ADN-ului indusă de
speciile reactive de oxigen (ROS). În drojdie, mai mult de 60% din substituțiile și delețiile spontane de
perechi de baze unice sunt cauzate probabil de sinteza trans-leziunii.

O sursă suplimentară semnificativă de mutații la eucariote este procesul inexact de reparare a

ADN-ului de îmbinare a capetelor neomolog , care este adesea folosit în repararea rupurilor duble
 catene.

În general, se pare că principala cauză subiacentă a mutației spontane este sinteza trans-leziunii
predispuse la erori în timpul replicării ADN-ului și că calea de reparare a îmbinării terminalelor
neomoloage predispusă la erori poate fi, de asemenea, un contributor important la eucariote.

Hidroliza spontană
ADN-ul nu este complet stabil în soluție apoasă și poate avea loc depurinarea ADN-ului. În condiții
fiziologice, legătura glicozidică poate fi hidrolizată spontan și se estimează că 10.000 de situsuri purinice
din ADN sunt depurinate în fiecare zi într-o celulă. Există numeroase căi de reparare a ADN-ului pentru
ADN; cu toate acestea, dacă situsul apurinic nu este reparat, în timpul replicării poate apărea
încorporarea greșită a nucleotidelor. Adenina este încorporată de preferință de ADN polimeraze într-un
situs apurinic .

Citidina poate deveni, de asemenea, dezaminată la uridină la o cinci sutimi din rata depurinării și
poate duce la tranziția G la A. Celulele eucariote conțin, de asemenea, 5-metilcitozină , despre care se
crede că este implicată în controlul transcripției genelor, care poate deveni dezaminată în timină.

Tautomerism
Tautomerizarea este procesul prin care compușii se rearanjează spontan pentru a-și asuma
formele izomerice structurale . De exemplu, formele ceto (C=O) ale guaninei și ale timinei se pot rearanja
în formele lor rare de enol (-OH), în timp ce formele amino (-NH 2 ) ale adeninei și citozinei pot avea ca
rezultat imino mai rare (=NH) forme. În replicarea ADN-ului, tautomerizarea modifică locurile de
împerechere a bazelor și poate provoca împerecherea necorespunzătoare a bazelor de acid nucleic.

Modificarea bazelor
Bazele pot fi modificate endogen de molecule celulare normale. De exemplu, ADN-ul poate fi
metilat de S-adenosilmetionină , modificând astfel expresia genei marcate fără a suferi o mutație a
secvenței de ADN în sine. Modificarea histonelor este un proces înrudit în care proteinele histonelor în
jurul cărora bobinele ADN pot fi modificate în mod similar prin metilare, fosforilare sau acetilare; aceste
modificări pot acționa pentru a modifica expresia genică a ADN-ului local și pot acționa, de asemenea,
pentru a indica locațiile ADN-ului deteriorat care au nevoie de reparație. ADN-ul poate fi, de asemenea,
glicozilat prin zaharuri reducătoare .

Mulți compuși, cum ar fi HAP, amine aromatice , aflatoxină și alcaloizi pirolizidină , pot forma specii
reactive de oxigen catalizate de citocromul P450. Acești metaboliți formează aducti cu ADN-ul, care pot
cauza erori în replicare, iar aductii aromatici voluminosi pot forma o intercalare stabilă între baze și
replicarea blocată. Aductii pot induce, de asemenea, modificări conformaționale în ADN. Unii aducti pot
duce, de asemenea, la depurinarea ADN-ului, este, totuși, incert cât de semnificativă este o astfel de
depurinare cauzată de aducti în generarea mutației.
 Radiațiile ionizante și speciile reactive de oxigen oxidează adesea guanina pentru a produce 8-
oxoguanină .

Deteriorarea coloanei vertebrale

Radiațiile ionizante pot produce radicali liberi foarte reactivi care pot rupe legăturile din ADN.
Ruperele dublu catenare sunt deosebit de dăunătoare și greu de reparat, producând translocarea și
ștergerea unei părți a unui cromozom. Agenții de alchilare precum gazul muștar pot provoca, de
asemenea, rupturi în coloana vertebrală ADN. Stresul oxidativ poate genera, de asemenea, specii de
oxigen foarte reactive care pot deteriora ADN-ul. Repararea incorectă a altor daune induse de speciile
foarte reactive poate duce, de asemenea, la mutații.

Dimerizare
Dimerizarea constă în legarea a doi monomeri pentru a forma un oligomer, cum ar fi formarea de
dimeri de pirimidină ca urmare a expunerii la radiații UV , care promovează formarea unui inel ciclobutil
între timinele adiacente din ADN. În celulele pielii umane, mii de dimeri se pot forma într-o zi datorită
expunerii normale la lumina soarelui. ADN polimeraza η poate ajuta la ocolirea acestor leziuni într-o
manieră fără erori, cu toate acestea, persoanele cu funcția de reparare a ADN-ului defectuoasă, cum ar fi
cei care suferă de xeroderma pigmentosum , sunt sensibile la lumina soarelui și pot fi predispuse la
cancer de piele.

Intercalarea între baze

Structura plană a substanțelor chimice precum bromura de etidio și proflavina le permite să se
introducă între baze în ADN. Această inserție face ca coloana vertebrală a ADN-ului să se întindă și face
mai probabil să apară alunecarea ADN-ului în timpul replicării, deoarece legătura dintre catenele este
făcută mai puțin stabilă prin întindere. Alunecarea înainte va duce la o mutație de ștergere , în timp ce
alunecarea inversă va duce la o mutație de inserție . De asemenea, intercalarea în ADN a antraciclinelor,
cum ar fi daunorubicina și doxorubicina, interferează cu funcționarea enzimei topoizomerazei de tip 2,
blocând replicarea precum și provocând recombinarea omoloagă mitotică.

Mutageneză inserțională
Transpozonii și virusurile pot introduce secvențe de ADN în regiuni de codificare sau elemente
funcționale ale unei gene și pot duce la inactivarea genei.

Mecanisme de mutageneză adaptivă

Mutageneza adaptivă a fost definită ca mecanisme de mutageneză care permit unui organism să
se adapteze la un stres de mediu. Întrucât varietatea tensiunilor de mediu este foarte largă, mecanismele
care o permit sunt, de asemenea, destul de largi, după cum au arătat cercetările în domeniu. De
exemplu, în bacterii, în timp ce modularea răspunsului SOS și sinteza ADN-ului profag endogen s-a
dovedit a crește rezistența Acinetobacter baumannii la ciprofloxacină. Se presupune că mecanismele de
rezistență sunt legate de mutațiile cromozomiale netransferabile prin transferul orizontal de gene la unii
membri ai familiei Enterobacteriaceae, cum ar fi E. coli, Salmonella , Klebsiella și Enterobacter.
Evenimentele cromozomiale, în special amplificarea genelor, par să fie, de asemenea, relevante pentru
această mutageneză adaptivă în bacterii.

Cercetările în celulele eucariote sunt mult mai rare, dar evenimentele cromozomiale par să fie, de
asemenea, destul de relevante, în timp ce s-a raportat că o recombinare intracromozomală ectopică este
implicată în dobândirea rezistenței la 5-fluorocitozină în Saccharomyces cerevisiae , s-a descoperit că
dublările genomului conferă rezistență S. cerevisiae la mediile sărace în nutrienți.

Aplicații de laborator
În laborator, mutageneza este o tehnică prin care mutațiile ADN sunt proiectate în mod deliberat
pentru a produce gene mutante, proteine sau tulpini de organisme. Diferiți constituenți ai unei gene,
cum ar fi elementele sale de control și produsul său genic, pot fi mutați astfel încât funcția unei gene sau
a unei proteine să poată fi examinată în detaliu. Mutația poate produce, de asemenea, proteine mutante
cu proprietăți modificate sau funcții îmbunătățite sau noi care se pot dovedi a fi utile comercial. Pot fi, de
asemenea, produse tulpini mutante de organisme care au aplicații practice sau care permit investigarea
bazei moleculare a unei anumite funcții celulare.

Metodele timpurii de mutageneză au produs mutații în întregime aleatorii, cu toate acestea,

metodele moderne de mutageneză sunt capabile să producă mutații specifice locului . Tehnicile moderne
de laborator utilizate pentru a genera aceste mutații includ:

1) Mutageneză dirijată

2) Mutageneză direcționată pe situs / Mutageneză PCR

3) Mutageneză inserțională

4) Semnătură marcată mutageneză

5) Mutageneză cu transpozon

6) Mutageneză de saturație a secvenței