Imunosenzori

Un biosenzor este un dispozitiv care

furnizează un semnal de ieșire legat de
concentrația unui analist țintă dintr-o probă.
Semnalul generat este proporțional cu
cantitatea de analit țintă într-o reacție specifică.
Un biosenzor este reprezentat grafic în Figura
1.1 și este format din următorii constituenți:
Fig. 1.1 Reprezentarea schematică a unui biosenzor.
 Principiile de bază ale unui
imunosenzor

Sistemul imunitar este un subiect atractiv în

multe cercetări științifice datorită capacității
sale de a procesa informații. Funcția principală
a unui sistem imunitar este de a recunoaște și
identifica toate celulele și moleculele din
sistem și de a sorta aceste entități biologice ca
fiind dăunătoare sau nu, ca parte a
mecanismului de apărare al sistemului.
 În prezența unor substanțe străine (adică
antigene), celulele specializate ale sistemului
imunitar produc imunoglobuline (adică
anticorpi) care leagă în mod specific acești
antigeni. Acest fenomen are o serie de funcții,
inclusiv dezvoltarea senzorilor.Un senzor care
se bazează pe conceptul de imunologie
(cunoscut și ca imunosenzor) utilizează un
anticorp (ca bioreceptor) pentru
recunoașterea moleculară specifică a
antigenelor și ulterior formează un
imunocomplex stabil.
 În mod ideal, un imunosenzor ar trebui proiectat
cu următoarele specificații: capacitatea de a
identifica rapid antigenele țintă; capacitatea de a
genera imunocomplexuri fără a fi nevoie de
adăugarea de reactivi suplimentari; capacitatea de a
da rezultate cu reproductibilitate ridicată; și
capacitatea de a detecta cu ușurință ținta în probe
reale.În imunosenzori, detectarea analitului țintă
poate fi directă prin observarea formării
imunocomplexelor sau indirectă prin utilizarea unei
etichete, de exemplu, enzime sau nanoparticule de
aur pentru a observa un eveniment de legare.
 Anticorpi și aplicarea
lor la imunosenzori
Abia la sfârșitul anilor '50 și începutul anilor
'60 anticorpii au fost utilizați în aplicații de
detectare. Anticorpii, cunoscuți și sub numele
de imunoglobuline (Ig), sunt membri de clasă
ai glicoproteinelor și sunt produși ca răspuns la
un agent chimic (antigen) ca parte a un sistem
defensiv (sistemul imunitar) la animalele
multicelulare.
 Cea mai de bază moleculă de imunoglobulină G
este cea a unui „Y”, care este compus din două
lanțuri ușoare (~25 kDa) și două lanțuri grele (~50-70
kDa), atașate prin interacțiuni necovalente și
disulfurice. Lanțurile ușoare (25 kDa) sunt legate prin
disulfură de lanțurile grele din regiunile CL și,
respectiv, CH1.Lanțurile grele sunt, la rândul lor,
ținute împreună prin legături disulfurice în regiunea
balamalei.Într-o metodă de imunotestare, cea mai
importantă funcție a moleculelor de anticorpi este de
a se combina cu antigenul lor specific pentru a forma
un complex anticorp-antigen. Siturile de legare la
antigen, sau epitopii, (adică, regiunile Fab) sunt
responsabile pentru legarea specifică a IgG la țintele
lor.
 Forțele intermoleculare care contribuie la
stabilizarea complexului anticorp-antigen sunt
legăturile de hidrogen, forțele electrostatice,
interacțiuni hidrofobe, forțe van der Waals și
impulsuri repulsive stearice. Această proprietate
unică a moleculelor de anticorp de a se lega discret
cu țintele lor biospecifice este cea care oferă un
reactiv de afinitate universal care poate interacționa
selectiv cu o singură moleculă într-un amestec foarte
complex de alte biomolecule. Formarea unui
bioconjugat cu un anticorp şi o a doua moleculă
având o altă proprietate de dorit oferă un complex
hibrid în care ambele proprietăţi pot fi exploatate
pentru utilizare în imunosenzori. Funcționalizarea IgG
poate fi realizată prin trei grupuri importante: –NH2,
–COOH și –SH.hy
 Format imunosenzor
Testele imunologice sunt tehnici bioanalitice
care funcționează ca rezultat al unui răspuns al
unui antigen (adică analit) și al unui anticorp,
care permite cuantificarea unui analit.
 Un instrument analitic, care folosește
anticorpi sau fragmente de anticorpi ca
componente de recunoaștere biomoleculară,
este cunoscut ca imunosenzor și este utilizat în
mod obișnuit în diferite sectoare industriale
(cum ar fi agricultură și industria farmaceutică
și alimentară), analize clinice și diagnosticare,
analize criminalistice, amenințare biologică
programe de management și control și
prevenire a bolilor epidemice.Legarea unui
antigen-anticorp este detectată prin
cuantificarea semnalului produs de eticheta
atașată.
 În mod ideal, eticheta utilizată în
procedurile de imunotestare ar trebui să aibă
următoarele proprietăți: să fie ieftină, sigură,
stabilă, cu tehnici simple de etichetare, să aibă
un efect minim asupra performanței de legare
și de detectare cu instrumente ieftine. Cu
toate acestea, în aplicarea biosenzorului,
măsurarea legării antigen-anticorp se poate
face în continuare fără utilizarea unei etichete,
deoarece formarea unui imunocomplex
provoacă o modificare a atributului fizic al
testului.
 Sistem de imunotest
competitiv
Într-un format de imunotest competitiv, analiții care
trebuie măsurați și etichetați „analit” sunt amestecați
simultan, unde ambii concurează unul cu celălalt
pentru legarea la numărul limitat de situsuri de legare
a anticorpilor. Etichetele utilizate în mod obișnuit în
măsurătorile electrochimice sunt etichetele enzimelor
(cum ar fi peroxidaza de hrean, fosfatază alcalină și
lactat oxidază și etichete electroactive (cum ar fi
nanoparticule de aur), nanoparticule de argint, și
puncte cuantice)
 Imunotestul direct
Un test care utilizează metoda directă este cel mai
potrivit pentru cuantificarea antigenelor cu greutate
moleculară mare. Anticorpul sau antigenul este
imobilizat direct pe suprafața suportului de analiză
după incubarea cu un anticorp sau antigen marcat cu
etichetă pentru detectare și măsurare. Un semnal este
apoi produs prin adăugarea unui substrat adecvat.
Aceasta permite măsurarea concentrației de antigen
sau anticorp într-o probă de testare.Aceasta este
reprezentată în Figura 1.2:
 Fig. 1.2 Formate de imunotestare. (a) Test imunologic cu detecție
directă folosind antigen imobilizat pe suportul unui senzor; (b)
imunotestare competitivă indirectă folosind anticorpi secundar conjugați
la o etichetă; (c) test indirect necompetitiv (sandwich) folosind un
anticorp secundar atașat.
 Arhitecturile traductoarelor și
aplicațiile lor potențiale
În afară de elementul de recunoaștere
moleculară, mecanismul de transducție a
semnalului este o parte esențială a oricărei
configurații imunosenzoare care funcționează
pentru a traduce orice evenimente biologice
într-un semnal care poate fi citit.
Imunosenzorii pot fi clasificați în funcție de
traductoarele utilizate: electrochimice, optice
și piezoelectrice.
 Imunosenzor electrochimic
Un imunosenzor electrochimic măsoară un
semnal electric care afișează fie o creștere, fie
o scădere a semnalului electric atunci când se
formează un complex antigen-anticorp.
Utilizarea electrochimiei în imunosenzori
pentru detectarea analiților are mai multe
avantaje deoarece această tehnică este
economică, ușor de utilizat, portabilă și simplu
de construit.
 Deoarece electrochimia este o metodă bazată pe
suprafață, volumul de reacție nu este important
acolo unde probele minuscule sunt necesare doar
în scopuri de detectare.Prin utilizarea tehnologiei
moderne și în evoluție, această tehnică analitică
este sensibilă, selectivă și capabilă să producă
rezultate instantanee, făcând astfel un
imunosenzor electrochimic un candidat atractiv
pentru aplicații de detecție largi.În general,
imunosenzorii electrochimici sunt clasificați în trei
moduri de măsurare: curent, potențial și
impedanță pentru funcțiile analitice.
 Tipuri de imunosenzori
electrochimici
1)Imunosenzor amperometric
2)Voltametrie
3)Potențiometrie
4)Impedanta
 Rezonanța plasmatică
de suprafață (SPR)
Principalele funcții ale tehnologiei rezonanței
plasmonilor de suprafață (SPR) sunt de a stabili o
relație de afinitate și cinetică între biomolecule,
interacțiunile receptor-liganzi și de a determina
hibridizarea acidului nucleic. În această secțiune, va
fi discutată o versiune simplificată a unui sistem
SPR. Un imunosenzor SPR constă din următoarele
părți: o sursă de lumină, o prismă, o suprafață de
transducție (de obicei film de aur), o biomoleculă
(anticorp sau antigen), un sistem de flux și un
detector.
 Un imunosenzor SPR constă din următoarele
părți: o sursă de lumină, o prismă, o suprafață
de transducție (de obicei film de aur), o
biomoleculă (anticorp sau antigen), un sistem
de flux și un detector. Un plasmon de
suprafață este o undă coerentă de densitate
de sarcină care există cu două interfețe, cum
ar fi aurul în aer, unde constantele dielectrice
ale acestor două medii sunt de semne opuse.
Unda plasmonului de suprafață este analogă
proprietății electromagnetice a unui metal, un
vector de câmp evanescent care își atinge
maximele la interfață și se descompune
exponențial în medii în vrac.
 Într-un imunosenzor SPR, anticorpii sunt
imobilizați pe o suprafață de film subțire de
metal, de obicei aur, unde lumina polarizată
este radiată de la suprafața din spate printr-o
prismă și este introdus un ligand țintă. Filmul
metalic va reflecta această lumină (acționând
ca o oglindă) și puterea luminii reflectate
poate fi apoi evaluată și cuantificată. Când
anticorpii imobilizați sunt legați de ținta lor, se
poate observa o schimbare a unghiului SPR
(Figura 1.3) care depinde de concentrația
țintei.
 Fig. 1.3 Principiul general al SPR (indicele de refracție n2 al mediului cu
indice de refracție mai mic, amplitudinea câmpului evanescent E, vectorul
de undă Ksp al plasmonilor de suprafață, vectorul de undă Kx al fotonului).