Imunosenzori

1· Introducere în imunosenzori
Un biosenzor este un dispozitiv care furnizează un semnal de ieșire legat de
concentrația unui analist țintă dintr-o probă. Semnalul generat este proporțional cu
cantitatea de analit țintă într-o reacție specifică. Un biosenzor este reprezentat grafic în
Figura 1.1 și este format din următorii constituenți:

1. Analit: O componentă care trebuie detectată. De exemplu, acidul uric

este un „analit” sau o țintă pentru un biosenzor special conceput pentru a detecta
acidul uric

2. Bioreceptor: Un bioreceptor este încorporat într-un biosenzor pentru a

recunoaște și lega în mod special analitul. Bioreceptorii pot fi sub formă de
enzime, celule și anticorpi. Odată ce bioreceptorii interacționează cu analitul, va fi
produs un semnal ca căldură, sarcină, schimbare de masă și pH etc., iar aceasta se
numește biorecunoaștere (sau receptor de recunoaștere).

3. Traductor: Funcția unui traductor este de a utiliza informațiile din

episodul de biorecunoaștere dintre bioreceptor și analit, care este apoi convertită
într-un semnal măsurabil. Semnalul poate fi apoi afișat în termeni de grafice,
numere sau imagini care sunt înțelese de utilizatori

Fig. 1.1 Reprezentarea schematică a unui biosenzor.

Biosenzorii sunt utili și au o serie de avantaje față de instrumentele analitice actuale pe

baza acestor două caracteristici: proximitatea receptorilor de recunoaștere, de ex. anticorpi,
ADN, aptameri cu traductorul; și dimensiunea sa practică potrivită pentru munca de teren. Este
necesară doar o cantitate mică de probă pentru detectare, deoarece partea sensibilă a unui
biosenzor este în mod normal mică.

2· Principiile de bază ale unui imunosenzor

Sistemul imunitar este un subiect atractiv în multe cercetări științifice datorită
capacității sale de a procesa informații. Funcția principală a unui sistem imunitar este de
a recunoaște și identifica toate celulele și moleculele din sistem și de a sorta aceste
entități biologice ca fiind dăunătoare sau nu, ca parte a mecanismului de apărare al
sistemului.În prezența unor substanțe străine (adică antigene), celulele specializate ale
sistemului imunitar produc imunoglobuline (adică anticorpi) care leagă în mod specific
acești antigeni. Acest fenomen are o serie de funcții, inclusiv dezvoltarea senzorilor.Un
senzor care se bazează pe conceptul de imunologie (cunoscut și ca imunosenzor)
utilizează un anticorp (ca bioreceptor) pentru recunoașterea moleculară specifică a
antigenelor și ulterior formează un imunocomplex stabil.Imunocomplexul este
determinat și măsurat prin cuplarea acestei reacții la suprafața unui traductor (de
exemplu, termistor). Traductorul detectează și transformă reacția într-un semnal electric
unde poate fi procesată, înregistrată și vizualizată.Traductorii pot fi clasificați în diferite
categorii în funcție de semnalul de ieșire (de exemplu, electric) sau de modificarea
proprietăților (de exemplu, schimbarea masei) la formarea complexelor antigen-
anticorp.

În mod ideal, un imunosenzor ar trebui proiectat cu următoarele specificații:

capacitatea de a identifica rapid antigenele țintă; capacitatea de a genera
imunocomplexuri fără a fi nevoie de adăugarea de reactivi suplimentari; capacitatea de a
da rezultate cu reproductibilitate ridicată; și capacitatea de a detecta cu ușurință ținta în
probe reale.În imunosenzori, detectarea analitului țintă poate fi directă prin observarea
formării imunocomplexelor sau indirectă prin utilizarea unei etichete, de exemplu,
enzime sau nanoparticule de aur pentru a observa un eveniment de legare.În ultimele
trei decenii, utilizarea conceptului imunologic în biosenzori a produs rezultate
importante și interesante.

3· Anticorpi și aplicarea lor la imunosenzori

Abia la sfârșitul anilor '50 și începutul anilor '60 anticorpii au fost utilizați în aplicații
de detectare. Anticorpii, cunoscuți și sub numele de imunoglobuline (Ig), sunt membri
de clasă ai glicoproteinelor și sunt produși ca răspuns la un agent chimic (antigen) ca
parte a un sistem defensiv (sistemul imunitar) la animalele multicelulare.Deși există în
general cinci clase de imunoglobuline, și anume IgG, IgM, IgA, IgD și IgE, IgG este clasa
predominantă și reprezintă aproximativ 70% din totalul imunoglobulinei din serul uman.

Cea mai de bază moleculă de imunoglobulină G este cea a unui „Y”, care este
compus din două lanțuri ușoare (~25 kDa) și două lanțuri grele (~50-70 kDa), atașate prin
interacțiuni necovalente și disulfurice. Lanțurile ușoare (25 kDa) sunt legate prin
disulfură de lanțurile grele din regiunile CL și, respectiv, CH1.Lanțurile grele sunt, la
rândul lor, ținute împreună prin legături disulfurice în regiunea balamalei.Într-o metodă
de imunotestare, cea mai importantă funcție a moleculelor de anticorpi este de a se
combina cu antigenul lor specific pentru a forma un complex anticorp-antigen. Siturile
de legare la antigen, sau epitopii, (adică, regiunile Fab) sunt responsabile pentru legarea
specifică a IgG la țintele lor. Forțele intermoleculare care contribuie la stabilizarea
complexului anticorp-antigen sunt legăturile de hidrogen, forțele electrostatice,
interacțiuni hidrofobe, forțe van der Waals și impulsuri repulsive stearice. Această
proprietate unică a moleculelor de anticorp de a se lega discret cu țintele lor biospecifice
este cea care oferă un reactiv de afinitate universal care poate interacționa selectiv cu o
singură moleculă într-un amestec foarte complex de alte biomolecule. Formarea unui
bioconjugat cu un anticorp şi o a doua moleculă având o altă proprietate de dorit oferă
un complex hibrid în care ambele proprietăţi pot fi exploatate pentru utilizare în
imunosenzori. Funcționalizarea IgG poate fi realizată prin trei grupuri importante: –NH2,
–COOH și –SH.

4· Format imunosenzor

Testele imunologice sunt tehnici bioanalitice care funcționează ca rezultat al unui

răspuns al unui antigen (adică analit) și al unui anticorp, care permite cuantificarea unui
analit.Un instrument analitic, care folosește anticorpi sau fragmente de anticorpi ca
componente de recunoaștere biomoleculară, este cunoscut ca imunosenzor și este
utilizat în mod obișnuit în diferite sectoare industriale (cum ar fi agricultură și industria
farmaceutică și alimentară), analize clinice și diagnosticare, analize criminalistice,
amenințare biologică programe de management și control și prevenire a bolilor
epidemice.Legarea unui antigen-anticorp este detectată prin cuantificarea semnalului
produs de eticheta atașată. În mod ideal, eticheta utilizată în procedurile de
imunotestare ar trebui să aibă următoarele proprietăți: să fie ieftină, sigură, stabilă, cu
tehnici simple de etichetare, să aibă un efect minim asupra performanței de legare și de
detectare cu instrumente ieftine. Cu toate acestea, în aplicarea biosenzorului, măsurarea
legării antigen-anticorp se poate face în continuare fără utilizarea unei etichete,
deoarece formarea unui imunocomplex provoacă o modificare a atributului fizic al
testului. În funcție de designul testului, anticorpul sau antigenul trebuie imobilizat pe
materiale suport solide, cum ar fi o placă de microtitrare din polistiren cu 96 de godeuri,
nitroceluloză și cipuri acoperite cu aur. În principiu, imunotestele pot fi clasificate în
imunotestele competitive, necompetitive, directe și indirecte și vor fi detaliate în
următoarele subsecțiuni.

5·Sistem de imunotest competitiv

Într-un format de imunotest competitiv, analiții care trebuie măsurați și etichetați

„analit” sunt amestecați simultan, unde ambii concurează unul cu celălalt pentru legarea
la numărul limitat de situsuri de legare a anticorpilor. Etichetele utilizate în mod obișnuit
în măsurătorile electrochimice sunt etichetele enzimelor (cum ar fi peroxidaza de hrean,
fosfatază alcalină și lactat oxidază și etichete electroactive (cum ar fi nanoparticule de
aur), nanoparticule de argint, și puncte cuantice). Prin determinarea cantității de analit
marcat care s-a format la locurile de legare, cantitatea de analit de probă poate fi
cuantificată. Intensitatea semnalului produs este invers proporțională cu concentrația
analitului de probă. Cu alte cuvinte, atunci când cantitatea de antigen de probă este
scăzută, se produce un semnal ridicat. Testele competitive sunt utilizate în mod obișnuit
pentru analiza moleculelor mici, deoarece dimensiunea lor mică limitează numărul de
anticorpi care pot lega analitul din cauza obstacolelor stearice.

6·Imunotestul direct

Un test care utilizează metoda directă este cel mai potrivit pentru cuantificarea
antigenelor cu greutate moleculară mare. Anticorpul sau antigenul este imobilizat direct
pe suprafața suportului de analiză după incubarea cu un anticorp sau antigen marcat cu
etichetă pentru detectare și măsurare. Un semnal este apoi produs prin adăugarea unui
substrat adecvat. Aceasta permite măsurarea concentrației de antigen sau anticorp într-
o probă de testare.Aceasta este reprezentată în Figura 1.2:

Fig. 1.2 Formate de imunotestare. (a) Test imunologic cu detecție directă folosind
antigen imobilizat pe suportul unui senzor; (b) imunotestare competitivă indirectă
folosind anticorpi secundar conjugați la o etichetă; (c) test indirect necompetitiv
(sandwich) folosind un anticorp secundar atașat.

7·Arhitecturile traductoarelor și aplicațiile lor potențiale

În afară de elementul de recunoaștere moleculară, mecanismul de transducție a

semnalului este o parte esențială a oricărei configurații imunosenzoare care
funcționează pentru a traduce orice evenimente biologice într-un semnal care poate fi
citit. Imunosenzorii pot fi clasificați în funcție de traductoarele utilizate: electrochimice,
optice și piezoelectrice.

În ultimele decenii, numeroase eforturi au demonstrat progrese remarcabile în

identificarea analiților importanți în diferite sectoare, cum ar fi poluanții de mediu,
medicamentele, microorganismele patogene, biomarkerii cancerului și contaminanții
alimentari. Pentru a răspunde acestor diferite situații de operare și analiți țintă,
imunosenzorii au fost proiectați, dezvoltați și testați pentru a funcționa în conformitate
cu criterii de lucru specifice, diferă astfel în ceea ce privește schema lor de detectare,
utilizarea etichetelor și potențialul lor de calibrare. Fiecare analiză este necesară pentru
a îndeplini anumiți parametri de lucru: sensibilitate, specificitate, interval de lucru
analitic, repetabilitate și reactivitate încrucișată a procedurilor de detecție. Secțiunile
ulterioare vor sublinia diferite tipuri de traductoare împreună cu aplicațiile lor și
performanța recentă pe baza analiților selectați.
 8·Imunosenzor electrochimic

Un imunosenzor electrochimic măsoară un semnal electric care afișează fie o

creștere, fie o scădere a semnalului electric atunci când se formează un complex
antigen-anticorp. Utilizarea electrochimiei în imunosenzori pentru detectarea analiților
are mai multe avantaje deoarece această tehnică este economică, ușor de utilizat,
portabilă și simplu de construit. Deoarece electrochimia este o metodă bazată pe
suprafață, volumul de reacție nu este important acolo unde probele minuscule sunt
necesare doar în scopuri de detectare.Prin utilizarea tehnologiei moderne și în evoluție,
această tehnică analitică este sensibilă, selectivă și capabilă să producă rezultate
instantanee, făcând astfel un imunosenzor electrochimic un candidat atractiv pentru
aplicații de detecție largi.În general, imunosenzorii electrochimici sunt clasificați în trei
moduri de măsurare: curent, potențial și impedanță pentru funcțiile analitice.

9·Tipuri de imunosenzori electrochimici

1. Imunosenzor amperometric

Interesul pentru biosenzorii amperometrici a început când s-a observat că

procedurile potențiostatice sunt capabile să detecteze modificări ale proprietăților
dielectrice ale suprafeței unui electrod.Amperometria măsoară fie mărimea, fie
densitatea curentului la o valoare potențială constantă într-o perioadă de timp stabilită
într-o celulă electrochimică. Când se aplică un potențial fix între electrodul de lucru și cel
de referință, oxidarea și reducerea vor avea loc, rezultând o ieșire de curent măsurabilă,
care este proporțională cu concentrația analitului de interes.Electrozii utilizați în tehnica
amperometrică prezintă adesea o stabilitate satisfăcătoare pe o perioadă lungă de timp,
cu interferențe reduse și prezintă un răspuns liniar care se întinde pe un interval
fiziologic. Deoarece mediatorii de transfer de electroni, cum ar fi ferocianura de potasiu,
sunt folosiți pentru a transfera eficient electronii între etichetă și suprafața electrodului,
electrozii nu sunt afectați de fluctuația oxigenului și acest lucru eradică interferența din
gazul dizolvat, producând astfel rezultate consistente și reproductibile.Un alt avantaj al
acestui tip de traductor este natura sa foarte selectivă, deoarece potențialul de oxidare
sau reducere care este caracteristic țintei este utilizat pentru a determina identitatea
acesteia.

2. Voltametrie

Voltametria implică măsurarea curentului și potențialului în care potențialul este

scanat într-un interval de potențial prestabilit. Curentul rezultat este convertit într-un
vârf sau platou, care reprezintă ținta de interes, iar înălțimea vârfului corespunde
cantității de analit dintr-o probă. Este plauzibil să se detecteze mai mulți analiți într-o
singură probă pe baza diferitelor poziții caracteristice ale vârfurilor analiților, făcând
astfel această metodă o tehnică de neprețuit în imunodetecție.Această metodă este
foarte sensibilă datorită zgomotului minim de fond, mai ales atunci când se utilizează o
pre-concentrare eficientă a probei (analiza de stripare electrochimică).
 3. Potențiometrie

Măsurarea potențiometrică înregistrează și afișează activitatea ionilor într-o reacție

electrochimică. Specifică potențialul de sarcină de masă la un electrod de lucru față de
un electrod de referință la care curentul este zero. Ecuația Nernst poate fi utilizată
pentru a stabili relația dintre potențial și concentrația de analit.Cel mai comun
instrument folosit în potențiometrie este electrodul de pH. Alți ioni precum electrozii
selectivi (F−, I−, CN−, Na+, K+, Ca2+, NH4+) sau gaz (CO2, NH3) pot fi, de asemenea,
utilizați pentru măsurarea potențiometrică.

4. Impedanta

Spectroscopia de impedanță electrochimică (EIS) măsoară impedanța electrică a

unei interfețe prin aplicarea unei mici tensiuni sinusoidale la o anumită frecvență și
curentul rezultat este înregistrat, iar această procedură poate fi efectuată la diferite
frecvențe. Raportul dintre curent și tensiune asigură impedanța.

10· Rezonanța plasmatică de suprafață (SPR)

Principalele funcții ale tehnologiei rezonanței plasmonilor de suprafață (SPR) sunt

de a stabili o relație de afinitate și cinetică între biomolecule, interacțiunile receptor-
liganzi și de a determina hibridizarea acidului nucleic. În această secțiune, va fi discutată
o versiune simplificată a unui sistem SPR. Un imunosenzor SPR constă din următoarele
părți: o sursă de lumină, o prismă, o suprafață de transducție (de obicei film de aur), o
biomoleculă (anticorp sau antigen), un sistem de flux și un detector. Un plasmon de
suprafață este o undă coerentă de densitate de sarcină care există cu două interfețe,
cum ar fi aurul în aer, unde constantele dielectrice ale acestor două medii sunt de semne
opuse. Unda plasmonului de suprafață este analogă proprietății electromagnetice a unui
metal, un vector de câmp evanescent care își atinge maximele la interfață și se
descompune exponențial în medii în vrac. Într-un imunosenzor SPR, anticorpii sunt
imobilizați pe o suprafață de film subțire de metal, de obicei aur, unde lumina polarizată
este radiată de la suprafața din spate printr-o prismă și este introdus un ligand țintă.
Filmul metalic va reflecta această lumină (acționând ca o oglindă) și puterea luminii
reflectate poate fi apoi evaluată și cuantificată. Când anticorpii imobilizați sunt legați de
ținta lor, se poate observa o schimbare a unghiului SPR (Figura 1.3) care depinde de
concentrația țintei.
 Fig. 1.3 Principiul general al SPR (indicele de refracție n2 al mediului cu indice de
refracție mai mic, amplitudinea câmpului evanescent E, vectorul de undă Ksp al
plasmonilor de suprafață, vectorul de undă Kx al fotonului).

Biosenzorii SPR au meritele evidente de a fi rapid și convenabil în comparație cu

alte metode, de exemplu, în detectarea antibioticelor, creșterea microbiană este oprită și
aceasta este utilizată pentru citiri biologice rapide. Deoarece semnalele de ieșire sunt în
termeni de unghi de rezonanță sau valoare a indicelui de refracție, etichetarea cu
etichete fluorescente sau radioactive este opțională atunci când această tehnologie face
detectarea moleculelor mici, cum ar fi alergenii alimentari și toxinele, foarte fezabilă.
Deși etichetele nu sunt necesare într-un imunosenzor SPR, utilizarea etichetelor poate,
totuși, amplifica semnalele și în cele din urmă duce la detectarea sensibilă, de ex.
marcarea anticorpilor cu nanoparticule de aur în imunotestele sandwich sau biotestele
hibride sandwich (între aptameri și anticorpi).

Principalul dezavantaj al biosenzorului optic este costul său scump de configurare a

instrumentației. Alte probleme întâlnite în fabricare includ (i) imobilizarea
biomoleculelor pe măsură ce se observă pierderi de material în timpul procesului de
imobilizare a biomoleculelor pe substrat solid; (ii) contaminarea datorată scurgerii de
biomolecule și substanțe chimice utilizate în biosenzori care se scurg din biosenzor; și (iii)
sterilizare deoarece biomoleculele pot fi denaturate dacă sunt utilizate sonde nesterile.
În prezent, SPR este o tehnologie lider de senzori pentru observarea interacțiunilor
biomoleculare în timp real, care a fost comercializată de mai multe companii.

Cu toate acestea, s-a raportat că există câteva probleme în ceea ce privește senzorii
SPR. Chimia suprafeței este limitată la o suprafață metalică nobilă, în special aur.
Semnalul produs ca indice de refracție este afectat semnificativ de mediul fizic. Acest
efect trebuie neutralizat prin calibrarea instrumentelor, de exemplu, făcând modificări în
tampon.
 11· Bibliografie:

1. Z. Zhao and H. Jiang , Enzyme-based Electrochemical Biosensors, Biosensors ,

P. A. SerraInTech, 2010

2. N. Bhalla , P. Jolly , N. Formisano and P. Estrela , Essays Biochem., 2016, 60 , 1

3. M. Rizwan , D. Koh , M. H. Booth and M. U. Ahmed , Sens. Actuators, B, 2017,

255 , 557

4. N. Bojorge Ramírez , A. M. Salgado and B. Valdman , Braz. J. Chem. Eng.,

2009, 26 , 227

5. S. Aydin Peptides, 2015, 72 , 4

6. S. A. Lim and M. U. Ahmed , RSC Adv., 2016, 6 , 24995

7. R. Ekins J. Clin. Ligand Assay, 1999, 22 , 61

8. M. Rizwan , N. F. M. Naim and M. U. Ahmed , Sensors, 2018, 18 , 166

9. C. Moina and G. Ybarra , Fundamentals and Applications of Immunosensors,

Advances in Immunoassay Technology , N. H. L. Chiu and T. K. Christopoulos,
InTech, 2012, pp. 65–68

10. E. Gizeli and C. Lowe , Immunosensors, Curr. Opin. Biotechnol., 1996, 7 , 66

11. T. R. Holford , F. Davis and S. P. Higson , Biosens. Bioelectron., 2012, 34 , 12