PCR

La reacción en cadena de la
polimerasa
La reacción en cadena de la polimerasa, cuyas iniciales en
inglés son PCR, es una técnica que fue desarrollada por Kary
Mullis a mediados de los años 80.

Con esta metodología se pueden producir en el laboratorio

múltiples copias de un fragmento de ADN específico,
incluso en presencia de millones de otras moléculas de ADN
La reacción en cadena de la
polimerasa
Como su nombre indica, se basa en la actividad de la
enzima ADN polimerasa que es capaz de fabricar una
cadena de ADN complementaria a otra ya existente.

Sus únicos requerimientos son que existan nucleótidos en

el medio que son la materia base para fabricar el ADN (los
nucleótidos de adenina, timina, citosina y guanina), y una
pequeña cadena de ADN que pueda unirse a la molécula
que queremos copiar para que sirva como cebadora (el
cebador, en inglés "primer").
Procedimientos de la PCR:
Etapas
Ciclo 1
Desnaturalización: La reacción se calienta a altas temperaturas
para reducir la doble hélice del ADN a cadenas simples. Estas
cadenas se tornan accesibles a los cebadores
Ciclo 1
Hibridación: Se enfría la mezcla de reacción. Los cebadores
hibridan con las regiones complementarias de las cadenas del
ADN patrón, y se forman nuevamente cadenas dobles entre los
cebadores y las secuencias complementarias.
Ciclo 1
Extensión: La Taq polimerasa sintetiza una cadena
complementaria. La enzima lee la secuencia de la cadena
opuesta y extiende los cebadores agregando nucleótidos en el
orden en que pueden emparejarse. El proceso entero se repite
una y otra vez
Ciclo 1
Ciclo 2
Cuando comienza el segundo ciclo, hay en realidad dos tipos de
patrón: (1) las cadenas del ADN original; y (2) las cadenas del
ADN recién sintetizadas, que constan de la región de interés y de
fragmentos de longitud variable de la región flanqueante, en el
extremo 3’. Cuando se usa este último patrón en este ciclo,
solamente se copia la región de interés.
Ciclo 2
Ciclo 3
En el tercer ciclo, la región de interés recién sintetizada (es decir,
sin regiones flanqueantes) actúa como patrón. La molécula de
ADN original está todavía presente y lo estará hasta el final de la
reacción. Sin embargo, después de unos pocos ciclos, el
fragmento de ADN recién sintetizado se establece rápidamente
como el patrón predominante.
Ciclo 3
Consideraciones los ciclos
• Desnaturalización completa del patrón de ADN
• Temperatura óptima para la hibridación
• Temperatura óptima para la extensión
• Número de ciclos de la PCR
• Etapa final de extensión
• En la etapa inicial de desnaturalización, es esencial que se
desnaturalice completamente el patrón de ADN. La desnaturalización
incompleta del ADN dará como resultado el uso ineficiente del
patrón en el primer ciclo de amplificación y, en consecuencia, en un
escaso rendimiento del producto de la PCR.
• La temperatura de hibridación se calcula en 5°C por debajo de la
temperatura de fusión del duplo cebador-patrón de ADN. Si se
obtienen productos de la PCR no específicos, además del producto
esperado, la temperatura de hibridación se puede optimizar
aumentándola por incrementos de 1 a 2°C.
• La etapa de extensión se realiza, generalmente, a 72°C y una
extensión de 1 min es suficiente para sintetizar fragmentos de PCR
de hasta 2 kb (kb = kilobase = 1000 pb). Cuando se amplifican
fragmentos de ADN más grandes, el tiempo generalmente se
extiende a razón de 1 min por cada 1000 pb.
• El número de ciclos de la PCR dependerá, básicamente, del
rendimiento esperado del producto de la PCR.
• Después del último ciclo, las muestras suelen incubarse a 72°C
durante 5 min para completar los extremos que sobresalen de los
productos de la PCR recién sintetizados.
Consideraciones de la mezcla
de reacción
Hay que evitar la contaminación del ADN con las siguientes
medidas:

• Separando las zonas de extracción del ADN y de la PCR

• Empleando equipo de laboratorio dedicado a un solo uso
• Esterilizando en autoclave y haciendo alícuotas
• Añadiendo una reacción testigo
Componentes de la PCR
• Agua desionizada estéril
• Solución tampón de PCR 10X
• Mezcla de dNTP
• Cebador
• Taq polimerasa
• MgCl2
• ADN patrón
Inconvenientes
La sensibilidad de la técnica de PCR es muy alta pero presenta
algunos inconvenientes, como son que no es una técnica
cuantitativa y una relativamente alta probabilidad de obtener
falsos positivos por contaminación. Para solventar este último
problema se ha de optimizar la secuencia de los cebadores, así
como la temperatura precisa para que estos se unan al ADN en
la localización correcta y realizar una adecuada manipulación de
los reactivos.
Inconvenientes
Por otra parte para solventar el problema de la cuantificación se
han generado unas variaciones sobre el esquema inicial de la
PCR, dando lugar a lo que se conoce como PCR cuantitativa o
PCR en tiempo real.
PCR en tiempo real
La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar en
tiempo real la amplificación de nuestro genoma de interés. Para
llevar a cabo esta detección existen varios métodos pero casi
todos basados en la utilización de otro fragmento de ADN
(sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que
queremos amplificar. Esta sonda lleva adherida una molécula
fluorescente y otra molécula que inhibe esta fluorescencia
("quencher"), de tal forma que sólo cuando la sonda es
desplazada de su sitio por acción de la ADN polimerasa la
molécula fluorescente se libera de la acción del "quencher" y
emite fluorescencia al ser iluminada con un láser.
PCR en tiempo real
La cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo
de la PCR será proporcional a la cantidad de ADN que se está
amplificando. En general para que sea válida esta técnica
requiere realizar en paralelo una curva patrón en las mismas
condiciones para conocer la cantidad total de ADN que se está
amplificando.
En resumen
• La PCR es una técnica sencilla para obtener múltiples
copias de fragmentos específicos de ADN

• La PCR comprende tres etapas: desnaturalización,

hibridación y extensión

• Para que el éxito sea seguro, hay que tener cuidado tanto
en preparar bien la mezcla de reacción como en
establecer las condiciones óptimas de los ciclos