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FLUMINENSEINSTITUTO DE BIOLOGIADEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E MOLECULARGCM
ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS 1PRÁTICA No1 - FUNDAMENTOS DE FOTOMETRIA E
ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORÇÃO 1. Princípios geraisO termo espectro foi
utilizado inicialmente porNewton, quando este descobriu que a luz branca,
aoatravessar um prisma, é dividida em várias cores.Atualmente, sabe-se que o
espectro visível é apenasuma pequena parte do espectro eletromagnético. A luzé,
portanto, definida como uma forma de energiaeletromagnética, formada por ondas
que apresentamcomprimentos diferentes. O comprimento de onda (λ) émedido em n
m
onde 1,0 nm equivale a 10-9m. A tabelaabaixo mostra as regiões do espectro
em
relação aocomprimento de onda:REGIÃO:(λ) EM nm:Raios X 0,1-100Ultra
violeta
100-400Visível 400-800Infravermelho 800-5000Microonda 5000-30000 A cor dos
objetos é devida a duas causas:reflexão e absorção. Assim, um papel
transparente,vermelho, recebe todos osλda luz branca, mas reflete etransmit
e
somente o vermelho, sendo o restanteabsorvido. Quando um objeto é da cor
branca, todos osλsão refletidos, se é negro, é porque, praticamente,todos
osλsão
absorvidos. No entanto, existe uma cor(ouλ) que é mais absorvida, a qual
corresponde àchamada cor complementar. Se uma solução absorve nafaixa de
435-480
nm, que corresponde à radiação azul, asua cor (cor complementar) será o am
arelo;
a sensaçãovisual do amarelo será dada pelo conjunto de todos osoutros
componentes da luz branca, que não foramabsorvidos. A tabela abaixo mostra
as
cores de cadaintervalo de radiação da faixa do visível e as suasrespectivas
cores complementares: A capacidade que as diversas substânciasquímicas têm de
absorverem luz em determinadoscomprimentos de onda pode ser utilizada para a
suadeterminação quantitativa e qualitativa, uma vez que oespectro de absorç&#22
7;o é
característico para umadeterminada substância e a quantidade de
absorção(intensidade) é dependente da concentração docomposto.A intensidade
da
radiação transmitida por umasolução pode ser determinada em aparelho
(fotômetro),que deverá ser constituído de: uma fonte luminosa, umseletor
deλ(filtro ou prisma), um compartimento para aamostra, uma célula fotoelétrica
(ou fototubo) e umsistema para amplificação e medida do sinal (correnteelétrica
)
proveniente da célula fotoelétrica (medidor depotencial elétrico =
potenciômetro). Pode-se selecionaro comprimento de onda que incidirá sobre a
soluçãousando-se um monocromador (prisma ou retículo dedifração) ou um filtr
o
óptico (vidro colorido ou quartzo,que transmite uma determinada faixa deλna
região doultravioleta, UV). Se o aparelho dispõe de filtro óptico,é denom
inado
fotômetro ou fotocolorímetro e se dispõede prisma ou retículo é denominado
deespectrofotômetro. Este último é muito útil, pois podeselecionar faixas de
comprimentos de ondaINTERVALO(nm)CORABSORVIDACORCOMPLEMENTAR380-435 violeta
Verde-amarelada435-480 azul amarela480-490 azul esverdeada alaranjada490-500
verde azulada vermelha500-560 verde púrpura560-580 Verde- amarelada
violeta580-595 amarelada azul595-650 alaranjada Azul-esverdeada650-780 vermelha
verde-azulada 2extremamente estreitas, nas regiões do UV, visível
einfravermelho (IV).A fotometria de absorção, portanto, presta-setanto para a
medida da concentração de compostosnaturalmente corados, como daqueles
incolores, maspassíveis de adquirirem cor mediante o emprego decertos reativos,
bem como de compostos incolores queabsorvem UV ou IV. Esta metodologia,
porconseguinte, tem largo emprego na química analíticaquantitativa. Alguns
poucos exemplos: na determinaçãode atividade enzimática ou nas dosagens de
compostosorgânicos em fluidos biológicos, como glicose, uréia,proteínas, etc.,
em que se dosa um produto colorido,obtido por meio de uma reação química, ou um
produtoincolor que absorva na região do UV ou do IV. Ensaiosimunológicos
quantitativos (como o ELISA:Enzyme-LinkeImmunoadSorbentAssay) também usam
afotometria. 1.1. Leis da fotometria O princípio básico da fotometria é baseado
nofato de que: partículas dispersas ou dissolvidas em umasolução interferem
seletivamente com um raio de luzque passa através desta solução. Esta
interferênciadepende dos seguintes fatores:a) cor do composto ou do tipo de
ligação químicapresente;b) tamanho da partícula;c) transparência da soluç&#227
;o;d)
combinação dos fatores acima.Deste modo, as partículas podem absorver
etransmitir parte do espectro, dependendo da suaconcentração, da sua natureza
química e/ou da sua cor.Se pudermos medir o total de luz que incide (Io) sobre
asolução de uma determinada substância e o total da luztransmitida (It), podemo
s
avaliar o quanto a substânciaabsorveu (absorvância:A) O esquema abaixo
mostracomo funciona um fotômetro ou um espectrofotômetro:A seguinte formulação
pode ser feita:Transmissão = It/ Io(luz transmitida / luz incidente). Obser
ve
que o termo transmissão tem aplicaçãolimitada, uma vez que, aItéI0menos a
luz
que éabsorvida não só pela substância que se deseja medir,mas também pelo
solvente, pelo material da cubeta epor outras substâncias aí existentes.
Assim,Ité a luztransmitida após as absorções pela substância deinteresse mais os
interferentes. Para corrigir tal efeito,admite-seIt=1 (100%deTransmitância)a
luztransmitida apósI0atravessar a cubeta contendo umasolução denominadabranco.
Este branco contém todosos componentes do meio, exceto a substância a sermedida.
No escuro, bloqueada a passagem de luz para ofototubo (fotocélula),
aTransmitância = 0,ou seja,não há luz transmitida a ser medida.Na prática, a
transmitância (T), que é medidaem uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o
brancona passagem da luz), é pouco utilizada, pois ésubstituída pelo valor de
densidade óptica (D.O.) ouabsorvância (A),termo mais aceito atualmente,
quecorresponde ao logaritmo do inverso da transmitância: A = log 1/TA
absorvância é, desta forma, medida em umaescala de 0 (log 1/1) a infinito (log
1/0).A relação daA com a concentração da substância pode sercompreendida pel
as
Leis de Lambert-Beer: aabsorvância de uma solução é proporcional àconcentraç&#
227;o
da substância na solução e à distânciapercorrida pelo feixe luminoso que
atravessa a solução(caminho óptico):A =ε. l.c,onde:ε= coeficiente ext
inção
molar, que é constantepara cada substância, e definido como a absovância (A)de
uma solução l molar da substância em umdeterminado comprimento de onda (λ)
, numa
cubeta decaminho ópticol= l cm (largura da cubeta) ec= àconcentração da
solução. Apostila_bioq_praticaBaixar este documento
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