Aplicațiile metodelor

cromatografice în controlul
medicamentelor

Pregătire rezidenţiat
Obiective

• Cromatografia planara
• Cromatografia pe strat subtire
• Cromatografia pe hartie

• Cromatografia pe coloana
• Cromatografia in faza gazoasa
• Cromatografia de lichide
• Teoria cromatografiei
• Clasificarea metodelor cromatografice
• Generalitati
Teoria cromatografiei

• Cromatografia-istoric:
• 1906-M. Tvet - Separarea pigmenţilor foliari:
• Extract de frunze în eter de petrol
• Coloană de carbonat de calciu precipitat
• Spălarea coloanei cu solvent
• Separarea pigmenţilor clorofilieni, a xantofilelor şi a carotenoidelor
Teoria cromatografiei

• Cromatografia-principiu FRX:
• Este o metoda fizico-chimica de separare a unor substante dintr-un amestec, intr-un
sistem constituit
• dintr-o faza stationara
• si o faza mobile care se deplaseaza intr-o directie data
• Se bazeaza pe un proces de migrare dinamica diferentiata a substantelor din
amestecul respectiv ca urmare a unor diferente de:
• adsorbtie
• repartitie
• solubilitate
• presiune de vapori
• marimea molecule, etc.
Teoria cromatografiei

• Cromatografia-principiu PhE 10:

• Tehnicile de separare cromatografică sunt metode de separare în mai multe etape în
care componentele unei probe sunt distribuite între 2 faze, dintre care una este
staționară, în timp ce cealaltă este mobilă
• Faza staționară
• poate fi un solid sau un lichid adsorbit pe un solid sau un gel
• poate fi ambalată într-o coloană, distribuita sub forma unui strat sau film
• Faza mobilă poate fi gazoasă sau lichidă sau fluid supercritic
• Separarea se poate baza pe adsorbție, distribuție de masă (partiție), schimb de ioni etc. sau se
poate baza pe diferențe în proprietățile fizico-chimice ale moleculelor, cum ar fi dimensiunea,
masa, volumul etc.
Clasificarea metodelor cromatografice
Faza mobilă Gaz Lichid
Forma suportului Coloană Coloană Suprafaţă plană
cromatografic Deschisă tubulară Închisă Deschisă Închisă Hârtie Strat subţire
tubulară
Faza staţionară Lichid Solid Solid Lichid Solid

Metoda Cromatografia Cromatografia Cromatografia de Cromatografia pe Cromatografia pe

gaz- lichid gaz- solid lichide pe hârtie strat subţire
(CG, CGS) coloană (CH) (CSS, CFSS)
(CG, CGL)
(CL, CLIP)

Procesul Repartiţie Adsorbţie, Adsorbţie, Repartiţie Adsorbţie,

cromatografic Excluziune Schimb ionic Repartiţie,
moleculară, Afinitate, Schimb ionic
Excluziune
moleculară
Clasificarea metodelor cromatografice

• Cromatografia: preparativa si analitica

• Preparativă
• separarea componentelor unui amestec în vederea utilizării lor ulterioare

Principiul cromatografiei preparative

Clasificarea metodelor cromatografice

• Cromatografia: preparativa si analitica

• Analitică
• măsoară cantitatea relativă în care se găseşte fiecare component într-un amestec

Principiul cromatografiei analitice

Cromatograma

Schema unei cromatograme de eluţie Schema unei cromatograme planare

• Cromatografia pe strat subţire (CSS)

• Cromatografia pe hârtie (CH)

Cromatografia
pe strat subţire
(CSS)
Cromatografia pe strat subţire (CSS)

• Principii
• Definitii
• Faze stationare / Faze mobile
• Aparatura
• Etapele tehnicii CSS

• Aplicaţii în analiza medicamentelor

Cromatografia pe strat subţire (CSS)

• CSS/TLC - PhE 10
• Este o tehnică de separare în care o fază staționară constând dintr-un material
adecvat este dispusă într-un strat subțire uniform pe un suport (placă) din sticlă,
metal sau plastic
• Soluțiile de analiți sunt depuse pe placă înainte de developare
• Separarea
• se bazează pe adsorbție, partiție, schimb de ioni sau pe combinații ale acestor mecanisme și
• se realizează prin migrarea (developarea) substanțelor dizolvate (soluții de analiți) într-un
solvent sau un amestec adecvat de solvenți (faza mobilă) prin stratul subtire (faza staționară)
Faze stationare in CSS
• Stratul subtire de fază stationară este depus pe plăci sau foi subtiri de sticlă,
plastic sau metalic
• Plăcile CSS
• Turnate în laborator (FRX)
• Produse comerciale pre-acoperite (calitate superioara) (PhE 10)
• Se pot adăuga:
• Lianţi (CaSO4, amidon, CMC)- ex. silicagel G
• Agenţi fluorescenţi ex. silicagel GF24

• In functie de dimensiunea particulelor fazei stationare sunt disponibile 2

variante:
• Placi normale CSS
• Placi de înaltă performantă (HPTLC ) – diametru mai redus
• Dimensiunea particulelor de silicagel este indicată in monografie
• Ph.E
• Libera alegere pentru identificarea produselor vegetale
• Din 2010 – substantele inrudite din SM → HPLC
Faze stationare in CSS
• Cele mai utilizate FS (CSS si HPTLC) in analiza majoritatii medicamentelor continua sa
fie: silicagelul 60 (F254), urmat de RP-18 (C-18)
• De interes pot fi si alte faze stationare
• Aplicatii speciale

• Tipuri
• Silicagel
• Faze staţionare cu silicagel grefat cu diferite grupări funcţionale
• Faze grefate cu grupări hidrofobe (RP-silicagel)
• Faze grefate cu grupări hidrofobe pentru separări chirale
• Faze grefate cu grupări hidrofile
• Polaritatea variaza
• Silicagel > diol > amino > ciano > RP
• Faze staţionare non-silicagel
• Alte faze stationare: poliamida, rasini schimbatoare de ioni, Kieselguhr
Faze stationare in CSS
• Silicagelul
• Cea mai utilizata FS
• Matrice amorfa, poroasa obtinuta prin adaugarea unui acid la o solutie de silicat de
sodiu
• Prin controlul procesului de hidratare se va forma o retea cu structura de hidrogel, care este
ulterior spalat si uscat
• Se obtine un produs cu pori de aprox. 60Å (silicagel 60) si o suprafata de aprox. 500 m2/g
• Alte dimensiuni a porilor/suprafata pot fi obtinute prin modificarea conditiilor de hidratare
• Partea activa a silicagelului este reprezentata de catre gruparile silanol (Si-O-H)
• Ele se leaga puternic de gruparile polare ale oricarei substante prin legaturi de hidrogen, interactiuni dipol-
dipol si interactiuni electrostatice → separare
• Apa se leaga puternic de gruparile silanol
• Este important controlul umiditatii si continutul de apa a solventilor fazei mobile → obtinerea unor rezultate reproductibile
• pH-ul silicagelului este neutru (pH 7.0) permitand separarea compusilor neutri, acizi si bazici
Faze stationare in CSS

• Faze staţionare cu silicagel grefat cu diferite grupări funcţionale

• Faze grefate cu grupări hidrofobe (RP-silicagel)
• Un numar crescut de faze grefate cu alchil-siloxani
• Dimetil (RP-2 sau C-2), octil (RP-8 sau C-8) si octadecil (RP-18 sau C-18)
• Mecanism complex: adsorbtie/repartitie
Faze stationare in CSS
• Faze staţionare cu silicagel grefat cu diferite grupări funcţionale
• Faze grefate cu grupări hidrofobe (RP-silicagel) pentru separări chirale
• Numar limitat: ex. Chiralplate (Macherey-Nagel, Düren, Germany)
• Separarea enantiomerilor aminoacizilor si amino-alcoolilor prin mecanism de schimbare a ligandului
• FS: C18 impregnata cu un selector chiral

• Faze grefate cu grupări hidrofile

• Mai putin utilizate decat silicagelul sau fazele grefate cu grupari hidrofobe
• Contin grupari hidrofile: ciano, amino sau diol legate la silicagel prin lanturi scurte apolare:
• [-(CH2)3-] pentru fazele NH2 si CN sau
• derivate dintr-o catena glicerol silan pentru fazele diol
• Mecanism de retentie complex
Faze stationare in CSS

• Faze staţionare non-silicagel

• Alumina (oxidul de aluminiu, Al2O3)
• Faza stationara polara
• Prin procesul de fabricare i se poate imprima la suprafata un caracter bazic (pH 9–10), neutru
(pH 7–8) sau acid (pH 4–4.5)
• Mecanismul de separare: adsorbtie
• Permite diferite tipuri de adsorbtie, bazate pe pH
• Are o mare densitate de grupari hidroxil – umiditatea atmosferica!
• Activarea la 120°C timp de 10 min inainte de utilizare
Faze stationare in CSS

• Faze staţionare non-silicagel

• Celuloza
• Derivata din surse naturale (fibroasa, polimerizarea beta-glucopiranozei, 400-500unitati glucoza)
• Fibrele pot fi fragmentate (sau hidrolizate) in particule mai mici potrivite pentru CSS
• Celuloza microcristalina (40-200unitati gulcoza)
• Mecanismul de separare: repartitie NP
• Intre apa absorbita pe suprafata celulozei si FM
• Migrare lenta, difuzie laterala
• Selectivitate unica pentru multi compusi: poate separa clase foarte diferite de SM sau produsi naturali
• Celuloza nativa – proprietati chirale (impregnare cu reactivi chirali)
• Separarea izomerilor budesonidului (cefuroxim axetil)
• FS: celuloza impregnata cu 1% β-ciclodextrina, FM: solutie apoasa de β-ciclodextrina 1% / metanol (15:1)
Faze stationare in CSS

• Alegerea fazei staţionare în CSS. Criterii:

• Natura substanţelor de separat
• Structură
• Polaritate similara
• Proprietăţi chimice
• Solubilitate
• Natura procesului de separare
Faze mobile in CSS
• Solvenţi organici/anorganici de puritate avansată, cu capacitate de eluţie diferită faţă de
acelaşi adsorbant
• Proprietati
• Sa dizolve amestecul de substante
• Sa transporte substantele separate de-a lungul FS
• Sa dea valori Rf medii (de evitat valorile extreme)
• Sa ofere o selectivitate adecvata pentru amestecul de separat
• Alte cerinte: puritate, stabilitate, vascozitate, presiune de vapori, izoterma de partitie, toxicitate

• Capacitatea de eluţie a fazei mobile depinde de:

• Forta de elutie
• Selectivitate
• Polaritate
• Constanta dielectrică
• Capacitatea de a forma legături de hidrogen
• Variaţia pH-ului mediului de adsorbţie
Faze mobile in CSS
• Forta de elutie • Serie eluotropa – FS: silicagel 60
• Faza normala
• Creste in ordinea:
• perfluoroalcan, hexan, pentan,
tetraclorură de carbon, benzen / toluen,
diclorometan, eter dietilic, acetat de etil,
acetonitril, acetonă, 2-propanol / n-
butanol, apă, metanol, trietilamină, acid
acetic, acid formic

• Faza inversa C-18

• Ordine inversa
Faze mobile in CSS

• Alegerea fazei mobile în CSS

• Structura, proprietăţile substanţelor de separat

• Se utilizează amestecuri de doi sau mai mulţi solvenţi

• Polaritate opusă fazei staţionare

Aparatura în CSS
• Plăci cromatografice din sticlă sau din alte materiale
• (L= 20 cm, l variabilă)

• Vase de sticlă – închidere etanşă, dimensiuni

convenabile

• Micropipete, microseringi sau alte dispozitive (FR X,

PhE 10)

• Echipament pentru detectia fluorescentei

• Reactivi si echipament pentru derivatizare

• Dispozitiv pentru livrarea datelor obtinute (fisier,

foto) (PhE 10)
Etapele unei tehnici CSS
• Pregatirea bacului cromatografic

• Pregatirea placilor
cromatografice

• Aplicarea probelor

• Developarea

• Uscarea

• Revelarea

• Interpretarea
Faurie B. Thin layer chromatography procedure (TLC procedure), 2
Etapele unei tehnici CSS
• Pregatirea bacului cromatografic – FRX
• Vase cromatografice din sticla, cu posibilitatea de inchidere etansa, de
dimensiuni convenabile, pentru a asigura mentinerea placilor in pozitie verticala
• Daca nu se prevede altfel, inaintea determinarii cromatografice respective, vasul cromatografic se
satureaza cu vaporii developantului prin urmatorul procedeu: se captusesc cu hartie de filtru trei
pereti ai vasului si se introduce developantul, astfel incat acesta sa formeze, de obicei, un strat cu
grosimea de 10 mm, se acopera vasul si se lasa, daca nu se prevede altfel, timp de 30 min pentru
saturare
• Saturarea vasului cromatografic si determinarea cromatografica se efectueaza la o temperatura
cuprinsa intre 20oC si 25oC.
• O diferenta de temperatura intre peretii vasului cromatografic conduce la perturbari ale procesului de
migrare in stratul adsorbant
Etapele unei tehnici CSS
• Pregatirea bacului cromatografic – PhE 10
• Pentru developarea verticala bacurile pot fi:
• cu fund plat sau jgheab dublu,
• din material inert, transparent,
• de o dimensiune adecvată pentru plăcile utilizate
• prevăzute cu un capac bine fixat

• Pregatire
• Se captusesc pereții rezervorului cromatografic cu hârtie de filtru
• Se toarnă în rezervorul cromatografic o cantitate suficientă din faza mobilă pentru dimensiunea
rezervorului pentru a da după impregnarea hârtiei de filtru un strat de adâncime adecvat în raport cu
dimensiunea plăcii care urmează să fie utilizată
• Pentru saturarea rezervorului cromatografic, se inchide bacul cu capacul și se lasa să stea la 20-25 ° C
timp de 1 oră. Cu excepția cazului în care se indică altfel în monografie, separarea cromatografică se
realizează într-un rezervor saturat
Etapele unei tehnici CSS

• Pregatirea bacului cromatografic – PhE 10

• Pentru developarea orizontală rezervorul este prevăzut cu un jgheab pentru faza
mobilă și conține în plus un dispozitiv pentru direcționarea fazei mobile către faza
staționară (HPTLC)
Etapele unei tehnici CSS
• Pregatirea placilor cromatografice – FRX
• Placi cromatografice din sticla sau din alte materiale, de dimensiuni diferite, cu lungimea, de obicei, de
20 cm si latimea variabila, pe care se aplica un strat subtire de adsorbant de puritate cromatografica
(silicagel, kieselgur, celuloza microcristalina, oxid de aluminiu etc), la care se pot adauga lianti (sulfat
de calciu, amidon, CMC, etc) sau agenti fluorescent

• FRX reglementeaza si modul de preparare a placilor

cromatografice
• Rar utilizata aceasta tehnica in industria farmaceutica
• Sunt preferate placile pre-turnate (pre-
acoperite) industrial
Etapele unei tehnici CSS

• Pregatirea placilor cromatografice – PhE 10

• Reglementeaza utilizarea placilor preacoperite industrial
• Pre-tratarea plăcilor
• Poate fi necesară spălarea plăcile înainte de separare
• Acest lucru se poate face prin migrarea unui solvent adecvat
• Plăcile pot fi, de asemenea, impregnate prin proceduri precum developarea, imersia sau
pulverizarea
• În momentul utilizării, plăcile pot fi activate, dacă este necesar, prin încălzirea într-un cuptor
la 120 ° C timp de 20 de minute
Etapele unei tehnici CSS

• Aplicarea probelor – FRX

• solvenţi volatili
• pipete Pasteur, microseringi, capilare
• volumul de probă aplicat: µL
• modul de aplicare
• in punct (a)
• in banda (b)
Etapele unei tehnici CSS

• Aplicarea probelor – PhE 10

• Volumul precizat de soluții la o distanță adecvată de marginea inferioară și de
laturile plăcii și pe o linie paralelă cu marginea inferioară
• Un interval de cel puțin 10 mm (5 mm pe plăcile performante) între centrele
punctelor circulare și 5 mm (2 mm pe plăcile performante) între marginile benzilor
• Aplicați soluțiile în porțiuni suficient de mici pentru a obține pete circulare cu
diametrul de 2-5 mm (1-2 mm pe plăcile performante) sau benzi 10-20 mm (5-10
mm pe plăcile performante) cu 1-2 mm
Etapele unei tehnici CSS

• Developarea placilor cromatografice – FRX

• bacuri verticale sau orizontale
• pe o distanţă de 10-15 cm
• în sistemul de solvenţi aleşi, folosind tehnicile cromatografice de developare
• în cazul substantelor fotosensibile, developarea trebuie efectuata ferit de lumina
Etapele unei tehnici CSS

• Developarea placilor cromatografice –PhE 10

• bacuri verticale sau orizontale
• Când solventul din soluțiile aplicate s-a evaporat, se aseaza placa în bacul cromatografic, cât mai
vertical posibil, petele sau benzile trebuind sa fie deasupra suprafeței fazei mobile

• Se inchide bacul cromatografic, se mentine 20-25°C și protejat de lumina soarelui

• Dupa developarea pe distanta precizata se scoate placa cromatografica si se masoara distanta de

migrare a fazei mobile de la punctele de aplicare la frontal solventului

• Pentru bacurile orizontale, migrarea se poate face simultan la ambele capete ale placii
cromatografice
Etapele unei tehnici CSS

• Tehnici cromatografice de developare verticala

• În funcţie de sensul de migrare al solventului pe placa cromatografică:
• Tehnica ascendentă (a)
• migrarea fazei mobile se realizează datorită forţei de capilaritate
• Tehnica descendentă (b)
• migrarea fazei mobile se realizează în sensul forţei de gravitaţie
Etapele unei tehnici CSS

• Tehnici cromatografice de developare verticala

• Dupa numărul de developări şi direcţia de migrare a fazei mobile
• Tehnica unidimensională
• O singura elutie intr-o singura directie
Etapele unei tehnici CSS

• Tehnici cromatografice de developare verticala

• Tehnica bidimensională (multidimensionala)
• 2 elutii succesive in 2 directii
• Se pot realiza
• in acelasi sistem de elutie
• in sisteme diferite
• Se prefera folosirea a 2 sisteme
de solvenți cu selectivitate
complementară
Etapele unei tehnici CSS

• Uscarea
• în scopul îndepărtării solvenţilor
• la temperatura camerei (în nişă)
• cu sisteme de ventilare cu aer cald
Etapele unei tehnici CSS

• Revelarea cromatogramei
• FRX
• Punerea in evidenta a petelor de pe cromatograma se efectueaza
prin examinarea acestora ca atare sau dupa tratare cu reactivi
potriviti, in lumina vizibila sau in lumina ultravioleta la 254nm sau la
366 nm

• PhE 10
• Sunt utilizate dispozitive adecvate pentru derivatizare pentru a
transfera reactivii pe plăci prin pulverizare, imersie sau expunere la
vapori și, după caz, pentru a facilita încălzirea pentru vizualizarea
componentelor separate
Etapele unei tehnici CSS
• Revelarea cromatogramei
• Metode fizice:
• iradierea cu radiaţii UV
• cand substanţele separate prezintă fluorescenţă
• faze staţionare cu indicatori fluorescenţi
• substanţele separate apar ca pete întunecate
pe fond fluorescent
• Metode chimice:
• Reactivi de revelare:
• Generali: ex. KMnO4, I2, AgNO3
• Specifici pentru anumite clase de substanţe:
• reactivul Dragendorff – alcaloizi
• iodoplatinat de potasiu – alcaloizi, compusi organici cu N
• NaNO2 – sulfamide
• ninhidrina – aminoacizi
• reactivi corozivi (H2SO4 conc., 100C, H2SO4/K2Cr2O7)
• Metode biologice:
• Formarea unor compuşi coloraţi sau fluorescenţi sub acţiunea unor enzime cu care faza staţionară a fost
impregnată în prealabil
Etapele unei tehnici CSS

• Interpretarea cromatogramei:
• Stabilirea identitatii

• Evaluarea puritatii

• Analiza cantitativă
Etapele unei tehnici CSS

• Interpretarea cromatogramei:
• Stabilirea identitatii – FRX
• Pentru identificarea substantelor, se compara pe aceeasi cromatograma valoarea Rf si culoarea sau
fluorescenta petei obtinute cu solutia proba, cu valoarea Rf si culoarea sau fluorescenta petei
obtinute cu solutia-etalon; cele doua pete trebuie sa fie asemanatoare
• Valoarea Rf a unei substante este

Rf = a/b
in care
a= distanta parcursa de substanta de la punctul
de aplicare al solutiei pana in centrul petei (cm)
b= distanta parcursa de developant de la punctul
de aplicare al solutiei pana la frontul developantului,
trecand prin centrul petei (cm)
Etapele unei tehnici CSS

• Interpretarea cromatogramei:
• Stabilirea identitatii – FRX
• Identificarea unei substante se efectueaza, in anumite cazuri, fata de o substanta de referinta, cu
ajutorul valorii Rr
• Valoarea Rr a unei substante este

Rr = a/c
in care
a= distanta parcursa de substanta de la punctul de aplicare al solutiei pana in centrul petei (cm)
c= distanta parcursa de substanta de referinta de la punctul de aplicare al solutiei pana in centrul petei
(cm)
Etapele unei tehnici CSS

• Interpretarea cromatogramei:
• Stabilirea identitatii – PhE 10
• Pata principală din cromatograma obținută cu soluția testată este comparată vizual cu pata
corespunzătoare din cromatograma obținută cu soluția de referință
• culoare, dimensiune, factorului de retardare (Rf) pentru ambele pete
• tehnica standardelor externe = aplicarea in acelasi timp pe placa a probelor si a standardelor de identitate
cunoscuta

• Verificarea puterii de separare este descrisa în monografie

Etapele unei tehnici CSS

• Interpretarea cromatogramei:
• Evaluarea puritatii
• FRX:
• Compararea vizuala a dimensiunii petelor si intensitatii coloratiei sau fluorescentei se foloseste pentru
evaluarea semicantitativa a impuritatilor
• PhE 10:
• Punctul (punctele) secundar (e) din cromatograma obținut cu soluția de testare este (sunt) comparat
vizual fie cu spotul (punctele) corespunzător (e) din cromatograma obținut cu soluția de referință care
conține impuritatea (e), fie cu punctul din cromatograma obținut cu soluția de referință preparată dintr-o
diluare a soluției de testat.
• Verificarea puterii de separare. Cerințele pentru verificarea puterii de separare sunt prevăzute în
monografiile în cauză.
• Verificarea puterii de detectare. Puterea de detectare este satisfăcătoare dacă un punct sau o bandă este
clar vizibilă în cromatograma obținută cu soluția de referință cea mai diluată
Etapele unei tehnici CSS

• Interpretarea cromatogramei:
• Evaluarea puritatii
• Tehnica CSS se poate utiliza pentru evaluarea purităţii unei substante medicamentoase
• Aparitia de spoturi cromatografice suplimentare
• Uneori natura impurităţilor se cunoaşte, alteori se presupune
• În cazul în care substanţa de analizat şi impuritatilor prezintă aceaşi modalitate de revelare, testul
de puritate în CSS se poate aborda în una din următoarele situaţii:
• Nu este permisa prezenta impuritatilor
• Este permisa prezenta impuritatilor
• Exista standarde de impuritati
• Nu exista standarde de impuritati
Etapele unei tehnici CSS

• Interpretarea cromatogramei:
• Evaluarea puritatii
• FRX:
• Compararea vizuala a dimensiunii petelor si intensitatii coloratiei sau fluorescentei se foloseste pentru
evaluarea semicantitativa a impuritatilor
• PhE 10:
• Punctul (punctele) secundar (e) din cromatograma obținut cu soluția de testare este (sunt) comparat
vizual fie cu spotul (punctele) corespunzător (e) din cromatograma obținut cu soluția de referință care
conține impuritatea (e), fie cu punctul din cromatograma obținut cu soluția de referință preparată dintr-o
diluare a soluției de testat.
• Verificarea puterii de separare. Cerințele pentru verificarea puterii de separare sunt prevăzute în
monografiile în cauză.
• Verificarea puterii de detectare. Puterea de detectare este satisfăcătoare dacă un punct sau o bandă este
clar vizibilă în cromatograma obținută cu soluția de referință cea mai diluată
Etapele unei tehnici CSS

• Interpretarea cromatogramei:
• Evaluarea limitei de impurităţi pentru „Chloramphenicol palmitate” - PhE 10 :
• Faza staţionară: silica gel GF254;
• Faza mobilă: metanol – cloroform - ciclohexan (10:40:50) (v:v);
• Soluţii:
• Soluţia probă: se dizolvă o cantitate de 0.1g pulbere de probă în acetonă și se diluează până la un volum de 10mL cu același
solvent.
• Soluţia de referinţă a: se prepară o soluție
de cloramfenicol palmitat izomer (s.r.) prin dizolvarea a 20mg cloramfenicol palmitat izomer (s.r.) în acetonă R și se diluează
până la un volum de 10mL cu acelaşi solvent. 1mL din această soluție se diluează la 10mL cu acetonă;
• Soluţia de referinţă b: se prepară o soluție de cloramfenicol dipalmitat (s.r.) prin dizolvarea
a 20mg cloramfenicol dipalmitat în acetonă R și se diluează până la un volum de 10mL cu acelaşi solvent. 1mL din această
soluție se diluează la 10mL cu acetonă;
• Soluţia de referinţă c: se prepară o soluție de cloramfenicol (s.r.) prin dizolvarea a 5mg cloramfenicol (s.r.) în acetonă R și se
diluează până la un volum de 10mL cu acelaşi solvent; 1mL din această soluție se diluează la 10mL cu acetonă;
• Pe placa cromatografică se aplică 10µL din fiecare soluție. Placa cromatografică se introduce în vasul
cromatografic și se menţine până când faza mobilă migrează pe o distanţă de aproximativ 15cm de la linia de start.
Placa se lasă la uscat și apoi se examinează la lumină UV λ=254nm.
Etapele unei tehnici CSS

• Interpretarea cromatogramei:
• Evaluarea limitei de impurităţi pentru „Chloramphenicol palmitate” - PhE 10 :
• Evaluarea purității:
• Spoturile din soluţia probă corespunzătoare cloramfenicolului palmitat izomer și cloramfenicol dipalmitat nu sunt mai intense decât spoturile
corespunzătoare obținute din soluţiile de referinţă a și b (2 %). Și, orice spot în afară de spotul principal și spoturile corespunzătoare
cloramfenicolului palmitat izomer și cloramfenicolului dipalmitat, nu sunt mai intense decât spotul obținut din soluția de referință c (0.5%).
• Precizați dacă proba analizată corespunde din punct de vedere al evaluării purităţii.

Cloramfenicol
Cloramfenicol
palmitat

Cloramfenicol
Cloramfenicol dipalmitat
palmitat - izomer
Etapele unei tehnici CSS

• Interpretarea cromatogramei:
• Evaluarea limitei de impuritati pentru
„Chloramphenicol palmitate” - PhE 10 : Proba a b c
• Evaluarea purității:
• Spoturile din soluţia probă corespunzătoare
cloramfenicolului palmitat izomer și
cloramfenicol dipalmitat nu sunt mai intense
decât spoturile corespunzătoare
obținute din soluţiile de referinţă a
și b (2 %). Și, orice spot în afară de spotul
principal și spoturile corespunzătoare
cloramfenicolului palmitat izomer și
cloramfenicolului dipalmitat, nu sunt mai
intense decât spotul obținut din soluția de
referință c (0.5%).
• Precizați dacă proba analizată corespunde din
punct de vedere al evaluării purităţii.
Etapele unei tehnici CSS

https://forms.office.com/Pages/ResponsePage.aspx?id=Ja-
p_IQ7bEyXNp1c3OIQxU5CSCOUuO9HjH_UwsCFQ2RUMVk1NE81NVJLSVI2V
EpFQzVUVE9ITEcyTC4u
Etapele unei tehnici CSS
• Interpretarea cromatogramei:
• Determinarea cantitativa
• FRX
• Dozarea substantelor separate pe cromatograma se efectueaza, dupa razuirea petelor respective si
eluarea substantelor de pe adsorbant cu un solvent potrivit, prin spectrofotometrie sau direct pe placa,
de obicei, prin densitometrie
• Adsorbantii, liantii si solventii folositi trebuie sa fie de puritate cromatografica
• PhE 10
• Substanțele separate prin CSS și care răspund la iradiere UV-Vis pot fi determinate direct pe placă,
folosind instrumentele adecvate
• Se masoara reflectanta luminii incidente sau fluorescenta
• Substanțele care conțin radionuclizi pot fi cuantificate în 3 moduri:
• direct pe placa folosind un contor adecvat
• prin tăierea plăcilor în benzi și măsurarea radioactivității pe fiecare bandă individuală utilizând
un contor adecvat
• prin răzuirea fazei staționare, dizolvarea ei într-un cocktail de scintilație adecvat și măsurarea
radioactivității folosind un contor de scintilație lichidă
Etapele unei tehnici CSS

• Interpretarea cromatogramei:
• Determinarea cantitativa
• Elutia spoturilor si evaluarea cantitativa prin alte metode analitica
• Razuirea
• zonei care conţine spotul corespunzător substanţei de analizat
• zonei care conţine spotul corespunzător substanţei etalon
• unei zone fără substanţă de la acelaşi Rf (blanc)
• Se eluează în solvenţi potriviţi pentru determinarea în UV
• Se citeşte absorbanţa probei (Ap) şi a etalonului (Ae) faţă de blanc
Etapele unei tehnici CSS

• Interpretarea cromatogramei:
• Determinarea cantitativa
• Densitometrie
• Moduri de masurare:
• prin reflexie – dispersia luminii incidente de catre
analit
• prin transmisie – dezavantajos
• prin emisie fluorescenta
• prin stingerea fluorescentei
• Densitometrul traseaza in functie de aria picurilor o
pseudo-cromatograma
• Permite masurarea ariei spoturilor
• Sunt suficiente cateva ng pentru a avea un spot
cromatografic
Etapele unei tehnici CSS

• Interpretarea cromatogramei:
• Determinarea cantitativa
• Densitometrie
• Curba de calibrare: Cuba de calibrare, A=f(c)
• Calculul concentratiei folosind curba de calibrare
Aplicatiile tehnicii CSS (HPTLC)
• Analiza medicamentelor si substantelor medicamentoase
• Identificarea, testarea puritatii si determinarea concentratiei substantelor active si auxiliare din forme farmaceutice
precum si in procesul de fabricatie
• Identificarea si determinarea concentratiei substantelor active si metabolitilor lor
• Antidepresive si neuroleptice
• Sedative si anxiolitice
• Analogi de morfina
• Analgezice, antiinflamatoare
• Derivati de ergot
• Anestezice
• Antiepileptice
• Antidiabetice
• Antihistaminice
• Diuretice
• Antiulceroase
• Spasmolitice
• Antihipertensive
• Antibiotice, antivirale, antitumorale, antiseptic, sulfonamide, quinolone, tuberculostatice, antifungice, antiprotozoarice, etc
Aplicatiile tehnicii CSS (HPTLC)
• Analiza plantelor si medicamentelor din plante
• Medicina de laborator, toxicologie si biochimie
• Determinarea substantelor active si a metabolitilor lor din matrici biologice, diagnosticul bolilor metabolice
(fenilcetonuria, cistinuria, boala siropului de artar)
• Cosmetologie
• Coloranti materii prime si produse finite, conservanti, agenti tensioactivi, acizi grasi, parfumuri
• Analiza alimentelor
• Determinarea de pesticide si fungicide în apa potabila, reziduurile din legume, salate si carne, vitamine din băuturi
răcoritoare si margarina, aditivi interzisi, conformitatea cu valorile limită (compusi policiclici în apa potabila, aflatoxine
în lapte si produse lactate)
• Analiza mediului
• Analiza apelor subterane, determinarea de poluantilor din sol si apele de suprafată, produsele de descompunere din
colorantilor azoici utilizati în industria textile

• Diferenta CSS/HPTLC consta in sensibilitate (polaritatea FS/FM fiind aceeasi)

Concluzii
• Metodele CSS sunt foarte eficiente in cazul
• necesitatii unor analize ieftine si pentru un numar mare de probe (screening in fluide biologice si tesuturi,
produse vegetale)
• unor probe care necesita o prelucrari minima
• unor probe pentru care CSS reduce un numar de etape de prelucrare (componente care raman absorbite pe
faza stationara)
• unor substante cu caracteristici de detectare slabe si care necesită tratament chimic post-cromatografic
• Metodele HPLC sunt preferate, în special dacă pentru separare sunt necesare un număr mare de talere
teoretice, pentru separări prin excluziune moleculara sau cu schimbatori de ioni și pentru analiza urmelor
folosind detectoare selective indisponibile pentru CSS
Cromatografia
pe hârtie (CH)
Cromatografia pe hartie (CH)

• Principii
• Definitii
• Faze stationare / Faze mobile
• Aparatura
• Etapele tehnicii CH

• Aplicaţii în analiza medicamentelor

Cromatografia pe hârtie (CH)

• Principiul cromatografiei pe hârtie

• Majoritatea aplicaţiilor au la bază fenomenul de partiție în
care substanțele sunt distribuite între două lichide
• lichidul din porii hârtiei de filtru (de obicei apă) = faza staționară
• solvenţii din faza mobilă
• Separarea componentelor amestecului reprezintă rezultatul
diferenţelor de afinitate faţă de cele 2 faze în timpul migrării
fazei mobile de-a lungul hârtiei de celuloză sub acţiunea
forţei capilare (sau alte tipuri de forte)
• * Poate avea uneori la bază şi fenomene de adsorbţie în cazul în care faza
staționară este suprafața solidă a hârtiei impregnata cu diversi adsorbanti și faza
mobilă este faza lichidă
Cromatografia pe hârtie (CH)
• Faze stationare in CH
• Hartia cromatografica este formata din lanturi celulozice
• Alcatuite la randul lor din β-glucoza
• Caracter hidrofil
• In majoritatea cazurilor faza stationara este apa care este retinuta de
hartie prin legaturi de hidrogen
• pot fi utilizati si alti solvent organici polari si hidrofili: metanol,
formaldehida, glicoli, glicerina, etc
• Prin impregnarea cu alumina, kieselgur, silicagel sau schimbatori de
ioni care loc schimbarea comportamentului cromatografic
• Cromatografia in faza inversa
• Prin acilarea grupelor hidroxil (triacetatul de celuloza)
• Siliconarea hartiei
Cromatografia pe hârtie (CH)

• Faze mobile in CH
• Se utilizeaza amestecuri de doi sau mai multi solvent, sau amestecuri de solvent cu
solutii de saruri sau solutii tampon
• Polaritatea fazei mobile este diferita in functie de tipul de analiti separate
• În general, cu cât este mai mare solubilitatea unui solut într-un solvent, cu atât este
mai mare mobilitatea solutului în acel solvent
Nr Sistem de solventi Nr Sistem de solventi
1 izopropanol – amoniac – apa 6 formamida – benzen
2 n-butanol – acid acetic – apa 7 formamida – benzene – ciclohexan
3 apa – fenol 8 dimetilformamida – ciclohexan
4 formamida – cloroform 9 kerosen – izopropanol 70%
5 formamida – cloroform – benzen 10 ulei de parafina – DMF – metanol - apa
Cromatografia pe hârtie (CH)

• Tipuri de tehnici cromatografice pe hartie

• Tehnica unidimensionala
• ascendenta
• descendenta
• radiala

• Tehnica bidimensionala
Cromatografia pe hârtie (CH)

• Prevederi FRX, PhE 10

Cromatografia pe hârtie (CH)

• Prevederi FRX, PhE 10

Cromatografia pe hârtie (CH)

• Prevederi FRX, PhE 10

Cromatografia pe hârtie (CH)

• Prevederi FRX, PhE 10

Cromatografia pe hârtie (CH)
• Etape
• Pregătirea probelor:
• Amestecul (de exemplu un amestec de aminoacizi) de analizat este dizolvat într-un solvent adecvat (0,5-3%)
• Solventul selectat trebuie să fie volatil pentru evaporarea rapidă a solventului
• Selectarea si pregatirea hârtiei:
• Hârtia cromatografică pentru CH analitică / CH preparativa
• Marcarea liniei de start
• Hartie de diferite dimensiuni
• Pregatirea bacului si developarea cromatogramelor:
• Saturarea bacului
• Aplicarea probelor cu micropipete
• Compușii de referință sunt preparați în mod similar și aplicați pe hârtie odata cu probele
• Developarea:
• Nivelul fazei nu trebuie sa depaseasca linia de aplicare, developarea se face pe o distanta prestabilita
• Vizualizarea:
• Reactivi generali sau specifici
Cromatografia pe hârtie (CH)

• Aplicații ale cromatografiei pe hârtie

• Analiza calitativa:
• Implică identificarea compușilor prezenți în amestec. Identificarea implică compararea valorii Rf a
compusilor separati cu cea a valorii Rf a compusului etalon
• Analiza cantitativa
• Se face pe hârtie sau după îndepărtarea componentei de pe hârtie (componenta este tăiată de pe hârtie,
extrasă cu un solvent adecvat, măsurată prin colorimetru sau spectrofotometru UV-Vis)
• Cromatografie preparativă pe hârtie (izolare si purificare)
• Aplicatii diferite
• Separarea a numerosi compusi organici și biochimici, monitorizarea reactiilor chimice, analiza alimentelor,
toxicologie, analiza medicamentelor
• determinarea indolului din urina,
• studiul barbituricelor, antibioticelor, hormonilor și aminoacizilor,
• analiza colorantilor alimentari
Cromatografia pe hârtie (CH)

• Concluzii
• Nu are nevoie de echipamente scumpe
• Singurul echipament necesar este bacul cromatografic
• Există două variante mai importante pentru developarea hârtiei
• metoda ascendenta și descendenta
• Numeroase aplicatii
• Cromatografia de gaze (GC)

• Cromatografia de lichide
(LC, HPLC)
Cromatografia
de gaze (CG)
Cromatografia de gaze, cromatografia in faza gazoasa (GC)

• Principii
• Definitii
• Aparatura
• Faze stationare / Faze mobile
• Etapele tehnicii GC

• Aplicaţii în analiza medicamentelor

Cromatografia de gaze, cromatografia in faza gazoasa (GC)

• Cromatografia in faza gazoasă (GC) este o tehnică de separare cromatografică

bazată pe diferența de distribuție a compusilor între 2 faze nemiscibile în care
faza mobilă este un gaz purtător care se mișcă sau trece prin faza staționară
conținută într-o coloană
• Se aplică substanțelor sau derivaților acestora care sunt volatilizați la temperaturile
utilizate
• GC se bazează în principal pe mecanisme de adsorbție sau distribuție de masă
Cromatografia de gaze

• Echipamentul constă de obicei din:

• Un injector
• O coloană cromatografică conținută într-un
cuptor
• Unul sau mai mulți detectori
• Un sistem de achiziție de date
• Gazul purtător curge prin coloană și apoi
prin detector la un debit sau presiune
controlată
• Cromatografia se efectuează fie la o
temperatură constantă, fie în conformitate
cu un program de temperatură dat
Cromatografia de gaze
Faza mobilă în GC

• Gazul vector, sau faza mobilă reprezintă partea dinamică a cromatografiei

de gaze
• Cel mai frecvent se utilizează:
• Heliu
• Azot
• Hidrogen

• Butelii/Generatoare
Faza mobilă în GC
• Timpul de retentie (tR) si eficienta de separare depind de debitul fazei mobile
• tR si rezolutia sunt direct proportionale cu lungimea coloanei

• Debitul fazei mobile este masurat in mL si este strict controlat cu ajutorul reglatoarelor de presiune
• Viteza liniară a gazului purtător printr-o coloană este invers proporțională cu diametrului intern al
coloanei pentru un debit dat
Faza mobilă în GC
• Cum se alege gazul vector?
• În funcţie de:
• Detector
• Catarometrul - limitează alegerea la He
• Detectorul cu captură de electroni - gaz vector lipsit de O2 (Ar)
• Eficienţa separării
• Depinde de:
• Vâscozitatea gazului vector (masa moleculară)
• Natura gazului vector
• Cost
Cromatografia de gaze
Cromatografia de gaze

• Injectarea
• Injectarea de probe lichide poate fi efectuată
• într-o cameră de vaporizare echipată cu un
spliter de flux (split/splitless),
• direct în capul coloanei folosind o seringă sau o
supapă de injecție.

• Injectarea de probe in faza gazoasa se realizeaza

cu sisteme headspace statice sau dinamice
• Headspace dinamic – adsorbtia substantelor
volatile la temperature scazuta si desorbirea lor
in faza mobila
• Headspace static – incalzirea probelor,
echilibrare, prelevare din faza gazoasa
Cromatografia de gaze
 Faza staţionară în GC
86

• Faza staţionară este depusă în interiorul coloanei cromatografice: capilare sau umplute
• Conform FRX faza staţionară este:
• un solid,
• sau un lichid cu care este impregnat un suport solid inert,
• sau un lichid repartizat uniform pe pereţii unei coloane capilare (poate fi legat chimic de peretii coloanei
cromatografice)
 Faza staţionară în GC
87

• Coloane cromatografice
• Umplute
• Capilare

• Coloane umplute
• Caracteristici
• Diametru interior 2-4mm
• Lungime 1-4 m
• Coloana: cupru, oţel inox, sticlă, teflon, etc

• Factori care influenţează separarea

• Lungimea
• Diametrul
 Faza staţionară în GC
88

• Coloane capilare
• Caracteristici
• Diametru interior < 2mm (0.35mm)
• Lungime > 100m (15-175m)
• Coloana: silice fuzibilă

• Sunt formate din 3 părți distincte

• Strat exterior protector
• Strat de silice fuzibilă
• Strat interior de film polimeric = Faza staționară (FS)
• Interacțiunea compușilor cu FS este responsabilă de separare și este dependentă de proprietățile FS

• Avantaje:
• Separare superioară (viteza gazului vector este aprope aceeaşi pe tot parcursul coloanei)
• Rapide (timp scăzut de analiză şi condiţionare)
Faza staţionară în GC
• Clasificarea FS
• În funcţie de natura fazei staţionare CG:
• FS lichidă = Cromatografie de repartiţie gaz-lichid CGL (90%)
• Mecanismul de separare: REPARTIŢIA

• FS solidă = Cromatografie de adsorbţie gaz-solid CGS(10%)

• Mecanismul de separare: ADSORBŢIA
Faza staţionară în GC

• FS lichidă (suport + lichid)

• Suport:
• Sorturi de pământ diatomitic, sau kieselgur
• Polimeri fluorcarbon
• FS lichidă
• Depusă sub formă de peliculă; ex. polietilenglicol, fenilmetil-siloxan, squalan
• Legată chimic de suport (legături esterice între silicagel şi alcooli) ex. Porasil

• Aplicaţii:
• Marea majoritate a compuşilor volatili
Faza staţionară în GC
• Nepolare
• Polisiloxani sau siliconi
• Rezistente (325-350oC)
• Durată de viață lungă
• DB5, DB1?

• Polare
• Polietilenglicoli
• Diferă prin greutatea moleculară a lanțului polimeric
• Sensibile la acțiunea O2 la temperaturi crescute
• Durată de viață mai redusă
Faza staţionară în GC
• FS solidă
• Adsorbanţi anorganici – familii
• Adsorbanţi pe bază de carbon
• Cărbune activ, cărbune grafitat, site moleculare de carbon
• Silicagel
• Silicagel, silicagel grefat cu grupări nepolare, sticle poroase
• Alumine
• Zeoliţi = site moleculare
• Polimeri organici poroşi
• Aplicaţii:
• Separarea hidrocarburilor cu masă moleculară mică
• Separarea compuşilor polari
Sistem GC
Detectori în GC

• Trebuie să deosebească o proprietate fizico-chimică a componentului de

detectat faţă de eluent
• Transformă proprietatea detectată într-un semnal proporţional cu
concentraţia
• Semnalul generat de detector este:
• preluat,
• intensificat şi
• transformat de către înregistrator în cromatogramă
Detectori in GC

• Categorii:
• În funcţie de compuşii detectaţi

• Universali, sau semiuniversali– sensibili la un număr mare de componenţi

• Detector de ionizare in flacara (FID), spectrometrul de masa (MS), spectrofotometru infrarosu (IR)

• Specifici – sensibili numai la anumiţi componenţi

• Detector cu captura de electroni (ECD), detector pentru N si P (NPD)
Cromatografia de gaze
• FRX
• Gazul purtator se deplaseaza cu o viteza constanta prin camera de evaporare,
preia proba de analizat si o introduce in coloana cromatografica, unde
se realizeaza separarea componentelor
• La iesirea din coloana cromatografica, gazul purtator trece impreuna cu
componentele separate prin detector, care emite un semnal electric
proportional cu concentratia componentei din faza gazoasa
• Detectorul este conectat la sistemul de inregistrare
• Rezultatele se prezinta sub forma unui sistem grafic semnal-timp
• Deoarece probele de analizat dizolvate intr-un solvent trebuie sa fie aduse in stare de vapori, camera de evaporare este incalzita
la o temperatura suficient de ridicata pentru a asigura o evaporare rapida, fara a produce o degradare termica a probelor
• In timpul determinarii, temperatura coloanei trebuie sa ramana constanta, sau daca este necesar, trebuie sa creasca dupa un
anumit program (gradient)
Cromatografia de gaze
• PhE 10 – conditii pentru tehnica GC cu headspace static
• Este o tehnică adecvată în special pentru separarea și determinarea compușilor volatili prezenți în
probe solide sau lichide
Cromatografia de gaze
• PhE 10 – conditii pentru tehnica GC cu headspace static
• Metoda se bazează pe analiza fazei de vapori în echilibru cu faza solidă sau lichidă
• Proba de analizat este introdusă într-un recipient prevăzut cu un dop adecvat și un sistem de
supape care permite trecerea gazului purtător
• Recipientul este plasat într-o cameră termostatata la o temperatură stabilită în funcție de
substanța care urmează să fie examinată
• Proba este păstrată la această temperatură suficient de mult timp pentru a permite echilibrarea
între faza solidă sau lichidă și faza de vapori
• Gazul purtător este introdus în recipient și, după timpul prevazut, se deschide o supapă adecvată
astfel încât are loc expansiunea fazei gazoase către coloana cromatografică purtand compușii
volatilizați
• Evaluarea cantitativa
• Calibrare directa
• Metoda adaosului de standard
Cromatografia de gaze
• Analiza calitativă
• Identificarea unui compus pe baza parametrilor de retenţie
• Comparare tR etalon cu tR compus de analizat
• Identificarea prin spectrometrie de masa

• Analiza cantitativă
• Apreciere a relatiei de proportionalitate între aria, sau
înaltimea picului cromatografic şi cantitatea în care se
găseşte acest compus
• Metoda standardului extern
• Cuba de calibrare, A=f(c)

• Metoda standardului intern

• Cuba de calibrare, Ap/Asi=f(cp/csi)
• Rezolutia picurilor analizate trebuie sa fie > 1
Aplicatiile metodei GC
• Aplicații clinice și farmaceutice – compusi cu potential toxic
• Amfetamine
• Anestezice inhalatorii
• Antidepresive triciclice
• Antiepileptice
• Alcool din sange
• Droguri
• Prostaglandine
• Steroizi

• Analize de mediu
• Analize toxicologice
• Aplicatii fitochimice
 Concluzii
101

• GC – metoda de electie pentru analiza compusilor volatili

• Caracteristici importante
• Eficiența ridicată
• Stabilitatea coloanelor capilare modern
• Ușurința programării temperaturii și reproductibilitatea
• Dezavantajele GC
• Instrumente dedicate, operatori experimentați și infrastructură de laborator
adecvată
Cromatografia
de lichide (LC)
Cromatografia de lichide, cromatografia de lichide sub presiune,
cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
• Principii
• Definitii
• Aparatura
• Faze stationare / Faze mobile
• Etapele tehnicii HPLC

• Aplicaţii în analiza medicamentelor

Cromatografia de lichide, cromatografia de lichide sub presiune,
cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
• PhE 10
• Cromatografia de lichide (LC) este o metodă de separare cromatografică bazată pe diferența de
distribuție a speciilor între 2 faze nemiscibile, în care faza mobilă este un lichid care percolează printr-o
fază staționară conținută într-o coloană

• FRX
• Cromatografia de lichide sub presiune este o metoda fizico-chimica de separare cromatografica in care
faza mobila este un lichid, iar faza stationara, continuta intr-o coloana, este constituita dintr-un sold cu
granulatie fina sau un solid impregnat cu un lichid sau un solid pe care sunt grefate grupari organice

• LC se bazează în principal pe mecanisme de adsorbție, distribuție de masă, schimburi ioni,

excluziune moleculara sau interacțiune stereochimică
• Variante: standard (HPLC) si de ultrapresiune (UPLC)
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
• Echipamentul constă de obicei din:
• un sistem de pompare
• un injector
• o coloană cromatografică (se poate utiliza un regulator de temperatură a coloanei)
• 1 sau mai multi detector
• un sistem de achiziție de date

• Faza mobilă este alimentată de la unul sau mai multe rezervoare și este pompată către
injector, apoi prin coloană (de obicei la un debit constant), apoi prin detector (e)
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)

• Sistemele de pompare furnizează faza mobilă la un debit controlat

• Fluctuațiile de presiune trebuie minimizate
• Tuburile și conexiunile sunt capabile să reziste presiunilor dezvoltate de sistemul de
pompare
• Sunt capabile să furnizeze cu precizie o fază mobilă fie de compoziție constantă
(eluție izocratică), fie variabilă (eluare în gradient), conform unui program definit
• În cazul eluției în gradient, sunt disponibile sisteme de pompare care furnizează solvent (i) din
mai multe rezervoare, iar amestecarea solventului poate fi realizată fie la presiune scăzută, sau
la presiune înaltă
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)

• Injectorul
• Soluția probă este introdusă în faza mobilă care se deplaseaza spre coloana utilizând
un sistem de injecție care poate funcționa la presiune ridicată
• Se utilizează dispozitive cu buclă fixă și cu volum variabil acționate manual sau de un
autosampler
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
• Faze staționare utilizate :
• Silicagel sau alumină
• utilizate în mod obișnuit în LC în fază normală (fază staționară polară și fază mobilă nepolară),
unde separarea se bazează pe diferențe de adsorbție pe faza staționară și / sau distribuția masei
între faza mobilă și faza staționară (cromatografie de partiție)
• Suporturi modificate chimic preparate din polimeri, silice sau grafit poros,
• utilizate în fază normală și fază inversă LC (fază staționară nepolară și fază mobilă polară), unde
separarea se bazează în principal pe partiția moleculelor
• C18>C8>C3>C1
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
• Faze staționare utilizate :
• Rasini sau polimeri cu grupe acide sau bazice
• utilizate în cromatografie cu schimbatori de ioni, în care separarea se bazează pe concurența
dintre ionii care trebuie separați și cei din faza mobilă
• Silicagel sau polimeri porosi
• utilizate în cromatografia de excluziune moleculara, unde separarea se bazează pe diferențe
între dimensiunile moleculelor
• Faze staționare modificate special, de ex. derivați de celuloză sau amiloză,
proteine ​sau peptide, ciclodextrine etc.
• pentru separarea enantiomerilor (cromatografie chirală)
• Fazele stationare sunt depuse in coloane cromatografice de otel, de diametru variabil
• Coloanele cu diametre interne mai mici de 2 mm - coloane microbore
• Temperatura fazei mobile și a coloanei trebuie menținută constantă în timpul analizei
• Cele mai multe separări se efectuează la 20-25°C, dar poate fi specificată în monografie si o alta valoare
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
• Majoritatea separărilor au la baza tehnica in fază inversă
• Utilizează ca fază staționară silice modificată chimic
• Suprafața suportului (grupările silanol din silicage) reacționează cu diverși reactivi silanici producand
derivați de silil legați covalent care acoperă un număr variabil de situri active pe suprafața suportului
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
• Proprietatile fazelor stationare
• Natura fazei stationare este un parametru important pentru determinarea proprietăților de
separare ale sistemului cromatografic
• În cazul fazelor inverse, gradul de legare, tehnologia end-capped (o parte a grupelor silanol reziduale sunt sililate)
sunt factori determinanți suplimentari
• Stabilitatea fazei stationare
• Cu excepția cazului în care producătorul specifică altfel, coloanele cu fază inversă sunt considerate stabile în fazele
mobile cu un pH aparent în intervalul 2,0 - 8,0
• Coloanele care conțin grafit poros sau particule de materiale polimerice, cum ar fi copolimerul stiren-divinilbenzen,
sunt stabile într-un interval mai larg de pH
• Dimensiunea particulelor
• Dimensiunea particulelor celor mai frecvent utilizate faze staționare variază între 2 și 10 µm
• Particulele pot fi sferice sau neregulate și cu porozitate variabilă și suprafață specifică
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
• Faze mobile
• Pentru LC în fază normală, sunt folosiți în general solvenți organici cu polaritate redusă
• Conținutul de apă reziduală al solvenților utilizați în faza mobilă trebuie controlat strict pentru a obține rezultate
reproductibile
• În LC cu fază inversă, sunt utilizate faze mobile apoase, de obicei cu solvenți organici și / sau modificatori de pH.
• Componentele fazei mobile sunt de obicei filtrate pentru a îndepărta particulele cu dimensiuni mai mari de 0,45 µm (sau mai
mari de 0,2 µm atunci când faza staționară este formată din particule sub 2,0 µm și când se utilizează detectoare speciale, de
exemplu detectoare de împrăștiere a luminii)
• Fazele mobile multicomponente sunt pregătite prin măsurarea volumelor necesare (cu excepția cazului în care sunt specificate
mase) ale componentelor individuale, urmate de amestecare
• Alternativ, solvenții pot fi furnizați prin pompe individuale controlate prin supape de proporționare, prin care amestecarea
se efectuează în funcție de proporția dorită
• Solvenții sunt degazați în mod normal înainte de pompare prin pulverizare cu heliu, sonicare și / sau folosind module de
membrană / vid în linie pentru a evita formarea de bule de gaz în celula detectorului
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
• Faze mobile
• Solvenții pentru prepararea fazei mobile sunt în mod normal lipsiți de stabilizatori și, dacă se folosește un
detector ultraviolet, sunt transparenți la lungimea de undă a detecției.
• Solvenții și alte componente utilizate trebuie să fie de o calitate adecvată
• În special, apa pentru cromatografie R este utilizată pentru prepararea fazelor mobile atunci când apa, sau o soluție
apoasă, este una dintre componente

• Orice ajustări necesare ale pH-ului se fac la componenta apoasă a fazei mobile și nu la amestec
• Dacă se utilizează soluții tampon sau soluții saline, se efectuează o clătire adecvată a sistemului cu un amestec de
apă și o mică parte din partea organică a fazei mobile (5% V / V) pentru a preveni cristalizarea sărurilor după
finalizarea analiza
• Fazele mobile pot conține alte componente, de exemplu un contra-ion pentru cromatografia pe perechi de ioni
sau un selector chiral pentru cromatografia chirală utilizând o fază staționară achirală
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
• Detectori
• Sistemul de detectare folosit trebuie sa permita detectarea cantitatilor de componente prezente in
eluent (FRX)
• Au la baza
• Spectrofotometrele ultraviolete / vizibile (UV / Vis) (inclusiv detectoarele cu diode) sunt detectoarele cel mai
frecvent utilizate
• Spectrofotometre de fluorescență, refractometre diferențiale (RI), detectori electrochimici (ECD),
spectrometre de masă (MS), detectori de radioactivitate și alți detectori
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)
• Analiza calitativă
• Identificarea unui compus prin metoda HPLC se poate face:
• Pe baza parametrilor de retenţie

• Analiza cantitativă
• Apreciere a relatiei de proportionalitate între aria, sau înaltimea picului cromatografic şi cantitatea în
care se găseşte acest compus
• Metoda standardului extern
• Cuba de calibrare, A=f(c)

• Metoda standardului intern

• Cuba de calibrare, Ap/Asi=f(cp/csi)
• Rezolutia picurilor analizate trebuie sa fie > 1
Cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC)

• Aplicatii
• Standardizarea și controlul materiilor prime și formelor farmaceutice (puritate,
stabilitate, dozare, stabiliți perioada de valabilitate)

• Izolarea și purificarea ingredientelor active din produsele vegetale

• Estimarea concentrațiilor mici (ng) de studii „in vitro” sau „in vivo” efectuate în
domeniul biofarmaciei, farmacocineticii și farmacologiei
Concluzii

• Tehnica analitica cu putere separativa mare

• Utilizata in diferite domenii

• Cuplarea cu spectrometrul de masa

• Personal specializat, oportunitatea utilizarii

Bibliografie

• Farmacopeea Romana, Ed. X-a, Ed. Medicală, București, 1993

• Farmacopeea Europeana ed 10 online

• Bojita M., Roman L., Săndulescu R., Oprean R. Analiza și controlul

medicamentelor, vol. 2, Ed. Intelcredo, Cluj-Napoca, 2003