Biosinteza ADN

Celulele vii pot fi considerate ca un mediu artificial creat de ADN în scopul

propriei replicări.
ADN este depozitarul informaţiei genetice din celule. Această informaţie este
transferată integral sub raport calitativ şi cantitativ, de la o generaţie de celule la alta,
prin procesul de replicare semiconservativă a ADN. În acelaşi timp viata celulei se
bazeaza permanent pe informaţia genetică din ADN , care se materializeaza in
sinteza ARN si a proteinelor, acestea constituind principalele componente în
realizarea structurilor şi funcţiilor celulare.
Principiul biosintezei sau replicării ADN îl constituie replicarea
semiconservativă.
Catena parentală se dedublează sub forma a 2 catene ADN fiice, fiecare fiind
formată dintr-o catena parentală A şi o catenă nou formată având ca matriţa catena
parentală complementara B .

Procesul replicării este deosebit de complex. Din acest motiv el a fost

descifrat mai intai la procariote (E. coli) şi ulterior la eucariote. În linii mari procesul
este acelaşi. Diferenţele la eucariote sunt date marimea şi complexitatea structurală
a ADN eucariot, precum şi de numărul mult mai mare de factori de control implicaţi
in proces .
Biosinteza ADN este realizată de un complex multienzimatic numit replizom.
Segmentul de ADN care va fi sintetizat, este o copie complementara a unui
segment, numit replicon, dintr-o catenă parentala matriţă.

REPLICON
ori

În cazul ADN procariot (de dimensiuni reduse) el însuşi în totalitate va

constitui un singur replicon .

În cazul ADN eucariot (cromozomi) există cca. 100 de repliconi. Fiecare

replicon are un punct de start şi un punct terminal .
 Complexul multienzimatic al replicarii sau replizomul este format din ADN
girază (topoizomeraza II), helicază, topoizomeraze, proteine de stabilizare şi ADN
polimeraze.

ADN giraze
ADN helicaze
ADN topoizomeraze Replizom
ADN polimeraze
Proteine de stabilizare

I.5.1. Etapele replicării

Principalele etape ale replicării sunt :
- Initierea.
- Elongarea.
- Etapa terminala.

1. INIŢIEREA – constă în despiralizarea celor 2 catene sub acţiunea

helicazei şi ruperea legaturilor de H dintre catene sub acţiunea topoizomerazei ,
constituindu-se un ochi sau furca de replicare. Catenele astfel desfăcute sunt
împiedicate să se respiralizeze prin acţiunea unor proteine de stabilizare, ce se
fixează pe exteriorul celor doua catene .
Topoizomerazele reglează formarea structurii suprahelicoidale. Ele
catalizează separarea şi refacerea catenelor ADN şi modifică numărul de legături de
hidrogen din structura ADN. Se clasifică în topoizomeraze I, care realizează o
ruptură tranzitorie la nivelul unei singure catene a ADN, cu modificarea numărului de
legături prin introducerea uneia în plus şi topoizomeraze II, care acţionează la
nivelul ambelor catene simultan.
Topoizomerazele II acţionează prin legarea la molecula ADN astfel încât
generează două bucle supraspiralate. Deoarece o buclă este negativă şi una
pozitivă şi nu există rupturi ale legăturilor fosfodiester, numărul de legături rămâne
neschimbat. Apoi, enzima realizează o crestare a ambelor catene, iar un fragment
ADN trece prin ruptura creată, rezultând astfel două supraspiralări negative şi
modificarea numărului de legături cu două.
Energia necesară este furnizată prin hidroliza ATP, utilizat pentru restaurarea
conformaţiei enzimei. O subcategorie a topoizomerazelor II, girazele, sunt singurele
enzime care introduc o supraspiralare negativă la nivelul ADN relaxat şi se găsesc
numai la bacterii. Inhibitori ai acestor topoizomeraze şi giraze acţionează ca şi agenţi
antibacterieni şi antitumorali.

Figura 16. Mecanismul de acţiune al topoizomerazei I.

Topoizomeraza I relaxează ADN prin (a) legarea la ea şi separarea locală a

catenelor complementare; apoi (b) are loc crestarea unei catene şi legarea la capătul
nou format; trecerea (c) catenei intacte prin golul generat de crestare, apoi
închiderea golului prin restabilirea legăturilor fosfodiesterice. Rezultă astfel o
structură relaxată (d).
 Figura 17. Mecanismul de acţiune al topoizomerazei II.

Topoizomerazele II şi girazele modifică numărul de legături (cu două) din

molecula ADN prin legarea la molecula ADN şi trecerea unui fragment de ADN prin
ruptura reversibilă creată într-un segment diferit al aceleaşi molecule ADN. Are loc
conversia ADN relaxat la o moleculă ce conţine două supraspiralări, pozitivă şi
negativă (1). Trecerea segmentului ADN prin ruptura creată va modifica numărul de
legături (2) şi se va obţine o moleculă ADN ce va conţine două supraspiralări
negative(3).
Fenomenul torsionării duplexului ADN datorită despiralizării, este combătut
de topoizomeraza II (ADN giraza) care realizează o torsiune negativă printr-o
contraspiralare.
Fiecare din segmentele desfăcute ale celor doua catene va constitui o matriţa
pentru sinteza unei catene noi, complementare si antiparalele . Orice noua catena
ADN se va sintetiza întotdeauna pe direcția 5’ → 3’ aceasta constituind o regula
obligatorie .
În cazul catenei parentale, cu sensul 3’ - 5’, aceasta va induce sinteza unei
catene noi al cărei sens 5’-3’ va coincide cu sensul de înaintare al despiralizării
(sensul de realizare al replicării). Aceasta catenă se numeşte catena conducătoare.
Cea de-a 2 catenă sintetizată, pentru a respecta sensul de sinteză 5’-3’, va
avansa în sens opus sensului de despiralizare, sinteza desfăşurându-se mai lent.
Aceasta catenă se numeşte catena în întârziere.
În timp ce sinteza catenei conducătoare se va desfăşura practic neîntrerupt
(având acelaşi sens cu cel al înaintării sintezei), catena în întârziere va fi sintetizată
discontinuu sub forma unui fragment pentru fiecare ochi de despiralizare. Aceste
fragmente se numesc fragmente OKAZAKI.
 În cazul ambelor tipuri de catene etapele sintezei sunt aceleaşi.
Sinteza noilor catene este realizată de enzime numite ADN polimeraze.
Acestea inseră deoxinucleotide în noua catenă sintetizată, într-o secvenţă
complementară cu cea a catenei parentale matriţă . ADN polimeraza are nevoie
pentru a insera prima nucleotidă de un capăt 3’-OH liber care sa funcţioneze ca o
amorsă (primer). Acest lucru poate fi obţinut in următoarele variante :
1. mecanismul cel mai răspândit este sinteza mai întâi a unui fragment de ARN
la al cărui capăt 3’-OH să se continue cu sinteza de ADN.
2. sub acţiunea unei proteine specifice se introduce forţat un nucleotid legat de
catena parentală care sa aibă un capăt 3’-OH liber .
Sinteza fragmentului ARN primer este efectuat de un complex numit
primozom (parte a replizomului) constituit din: primază (ARN polimerază ADN
dependentă), helicază, matrită ADN, ribonucleotide trifosfat .
După sinteza unui segment ARN primer (40-80 ribonucleotide) ADN
polimeraza III va începe să ataşeze complementar dezoxiribonucleotide monofosfat
la capătul 3’-OH liber al acestuia. Modul de introducere al acestora constă în atacul
nucleofil al grupării 3’-OH a segmentului primer asupra unui dezoxiribonucleotid
trifosfat corespunzător nucleotidului complementer din catena parentală.
În urma atacului, dezoxiribonucleotidul monofosfat este ataşat noii catene, iar
restul pirofosfat este detaşat şi hidrolizat sub acţiunea pirofosfatazei, reacţia
devenind astfel ireversibilă.

Figura 18. Introducerea dezoxiribonucleotidelor complementare

 Energia necesară desfăşurării procesului de sinteză provine din hidroliza a 2
legături fosfat macroergice din structura nucleotidelor trifosfat utilizate ca materie
prima in sinteză .
Prin ataşarea noilor nucleotide, la polinucleotidul în formare, catena
avansează, în cazul catenei conducătoare practic necontenit, iar în cazul catenei în
întârziere, cu fragmente OKAZAKI, până când întâlneşte marginea ochiului de
despiralizare,
La terminarea copierii segmentelor parentale din ochiul de despiralizare intră
în acţiune ADN polimeraza I. Acesta excizionează în totalitate ribonucleotidele din
fragmentul ARN primer şi le înlocuieşte cu dezoxiribonucleotide complementare
catenei parentale. În acest mod la sfârşitul sintezei nu vor exista decât catene ADN.
Ultima operaţie constă în lipirea fragmentelor OKAZAKI, din catena în
întârziere, prin acţiunea unei ADN ligaze. În urma acţiunii ADN ligazei şi catena în
întârziere se va prezenta sub forma unei catene unice. Procesul de sinteza se
desfășoară foarte rapid: in fata buclelor de replicare helicazele si topoizomerazele
despiralizeaza cele doua catene foarte rapid, iar in spatele buclei de replicare refac
spiralizarea celor doua ADN fiice rezultate in urma replicării.

Figura 19. Lipirea fragmentelor Okazaki

 S-a identificat un model în care sinteza celor 2 catene se face simultan, sub
acţiunea aceleași ADN polimeraze, cele 2 catene înaintând în aceeaşi direcţie.

Figura 20. Sinteza simultană a celor două catene de ADN

Figura 21. Reprezentarea ADN polimerazei III ce realizează sinteza în acelaşi

sens a celor două catene
 În cazul eucariotelor, unde lungimea ADN este de mii de ori mai mare decât
în cazul procariotelor, în cazul ochiurilor de replicare avansarea se face în ambele
sensuri, astfel că într-o singură buclă vom avea 2 catene conducătoare şi 2 catene
în întârziere.

I.5.2. Particularităţi ale sintezei ADN la procariote

La procariote avem un singur cromozom extranuclear şi circular. Mărimea
mică a cromozomului face să existe un singur centru de iniţiere a replicării numit Ori
C din care porneşte replicarea. Acest punct de iniţiere are o structură standard
conţinând 11 segmente metilate şi 3 segmente bogate în Adenină şi Timină.
Formarea replizomului începe cu recunoaşterea centrului de iniţiere de către
proteine specifice (ADN A,B,C,). Acestea constituie helicaze şi topoizomeraze.
Catenele despiralizate sunt stabilizate de către proteine de stabilizare după
care acţionează primozomul ce sintetizează fragmente ARN primer.
 Figura 22. Replicarea la eucariote
Urmează sinteza catenei ADN de ADN polimeraza, iar terminarea sintezei
are loc la nivelul unui fragment ADN numit T. Regiunea terminală, bogată în
guanină şi timină, leagă proteina de terminare care blochează continuarea sintezei.
Proteina de terminare este de fapt o contra helicază ce intervine doar în momentul
când replizomul a parcurs şi secvenţa T (terminală).
 Figura 23. Mecanismul replicării prin sinteza în acelasi sens al celor două tipuri de
catene nou sintetizate, catena în avans şi catena în întârziere. Prin acest mecanism
ambele catene sunt sintetizate simultan, diferenţele provenind din etapa
suplimentară de lipire a fragmentelor Okazaki sub acţiunea ADN ligazei în catena in
întârziere

I.5.3. Particularităţi ale replicării la eucariote

Deşi fundamental procesul este acelaşi există o complexitate mai mare
datorită multitudinii de factori implicaţi şi diferenţelor generale dintre procariote şi
eucariote :
1. La procariote cu creştere rapidă, după sinteza ADN are loc imediat diviziunea
celulară. La eucariote sinteza ADN şi a histonelor este doar o fază a ciclului
celular (faza S), diviziunea având loc în faza M.

2. Diferenţa de mărime a ADN.

3. Diferenţa de structură a ADN: la procariote există un cromozom dublu

 circular cu localizare citoplasmatică. La eucariote ADN are mai multe nivele
de condensare care încep cu nucleozomi şi se termină cu cromozomii. Din
acest motiv la eucariote avem o viteză de sinteză mult mai redusă (2500
nucleotide/sec faţă de 15 000 nucleotide/sec la procariote). Viteza redusă
este compensată la eucariote de următoarele procese:
a. Un număr mai mare de repliconi (cca 100 / cromozom faţă de 1 la
procariote).
b. Numărul de molecule de ADN polimerază este mult mai mare (20 000)
faţă de numai câteva zeci la procariote.
c. Numărul de tipuri de ADN polimerază.
Astfel, în timp ce la procariote avem un tip de ADN polimerază cu o structură
dimerică, la eucariote avem cel puţin 4 cu acţiune specializată şi anume:
• ADN polimeraza σ ce realizează sinteza catenei conducătoare.
• ADN polimeraza  care are rolul de reparare a erorilor în catena.
• ADN polimeraza  sintetizează catena în întârziere.
• ADN polimeraza  care este specifică pentru mitocondrie.

4. Centrul de origine (complex de recunoaştere a originii de replicare)

Dacă la procariote acest centru este fix (Ori C), în cazul eucariotelor poziţia
acestui centru este variabilă. In general, conţine secvenţe bogate în adenină şi
timină, secvenţe de care se ataşează un complex de proteine, denumit complex de
recunoaştere a originii de replicare. Recunoaşterea centrelor de iniţiere trebuie să se
facă coordonat pentru toţi cromozomii, astfel ca în faza S a ciclului celular să fie
replicate toate regiunile din cromozomi şi nici o regiune să nu se replice de mai
multe ori. În acest sens intervin ciclinele şi kinazele dependente de cicline (CDK)
care controlează ciclul celular. Degradarea acestora produce inhibiţia diviziunii
celulare.

5. Replicarea capetelor cromozomilor (la eucariote).

Capetele cromozomilor eucariotelor se numesc telomeri. Acestea sunt
regiuni de mărime variabilă (20 pb la protozoare şi 150 kb la şoarece). Sunt
constituite din secvenţe repetitive care la om sunt secvenţe de câte 6 nucleotide -
TTAGGG - repetate de mii de ori. Telomerii indeplinesc două roluri importante:
 a) Protejează cromozomii de atacul nucleazelor
b) Blochează fuzionarea cap la cap a cromozomilor
Telomerii prezintă la capăt o structură închisă în formă de laţ.
Sinteza telomerilor implică unele probleme generate de faptul că sinteza
catenelor complementare este incompletă, deoarece în faza terminală ARN primer
de la capete nu poate fi înlocuit cu un segment ADN. Ca urmare noile catene
sintetizate vor avea capete mai scurte. Se estimează ca fiecare telomer pierde 100
pb (cca. 16 repetiţii TTAGGG) la fiecare mitoza. Astfel după 125 de diviziuni mitotice,
telomerii vor dispărea complet . În general celulele umane se divid de aproximativ
100 de ori, dar frecvenţa de replicare scade cu vârsta .
Segment nereplicat

5' 3' 5' 3' 5' 3'

Originea replicarii Indepartarea

Sinteza ADN primerilor ADN

3' 5'
3' 5' 3' 5'
Cromozom care Primer ARN din
se va replica fragmentul Okazaki Segment nereplicat

Figura 24. Structura telomerilor în cursul replicării

Problema replicării telomerilor este rezolvată de o enzimă specifică –

telomeraza. Enzima conţine un segment matriţă ARN de aproximativ 150
nucleotide din care cca. 15-20 sunt complementare secvenţei telomerice TTAGGG.
În plus exercită o activitate enzimatică de tip reverstranscriptază (ADN polimerază
ARN dependentă). Reverstranscriptaza sintetizează ADN pe matriţă de ARN.
 TTAGGGn TTAGGGTTAGGGTTAGGG 3'
CCCAATCCC
AATCCC AATCCC 5'
n
3'

5'

Figura 25. Acţiunea telomerazei

Telomeraza se fixează la capetele 3’ ale catenelor parentale şi utilizand ca

matriţă propriul segment ARN alungeşte capătul 3’ al acestora cu secvenţe
TTAGGG. După fiecare alungire telomeraza se deplasează în sensul 5 ’-3’ sintetizând
un nou fragment TTAGGG la capătul 3’al catenei parentale.
În momentul în care segmentul nou sintetizat, de la capatul 3’, depăşeşte 100
nucleotide, la capătul lui se ataşează un complex de replicare, primozom, care
începe sinteza unei segment ADN complementar, pe direcţia 5’ → 3’, până când
ajunge la capătul 5’ al catenei nou sintetizate; legătura cu aceasta este realizată de o
ADN ligază. În acest mod se sintetizează capetele cromozomilor ale catenelor noi
sintetizate până ajung la aceeaşi lungime cu catenele parentale.
Activitatea telomerazică menţine lungimea constantă a secvenţelor telomerice
ale cromozomilor, având o activitate maximă la celulele embrionare; după naştere
activitatea scade, astfel că în stadiul adult activitatea telomerazică este 0. Din acest
motiv la fiecare replicare a celulelor somatice cromozomii devin tot mai scurţi. În
momentul în care această scurtare ajunge la nivelul secvenţelor codante ale
cromozomilor apare instabilitatea cromozomială, proces caracteristic îmbătrânirii
celulelor. Astfel lungimea telomerilor este considerată ca fiind ceasul biologic al
celulelor şi implicit al organismului.
În cazul celulelor canceroase telomeraza redevine activă şi din acest motiv
celulele tumorale se pot divide la infinit fără a-şi scurta cromozomii, astfel incât
celulele canceroase pot fi considerate nemuritoare . Din acest motiv telomeraza a
devenit una din ţintele terapiei anticanceroase.
 Sinteza ADN pe matriţă de ARN
Virusurile oncogene ce conţin numai ARN (retrovirusuri) conţin enzima
reverstranscriptază (ADN polimerizează ARN dependentă) . Aceste virusuri îşi
introduc ARN-ul în celula gazdă unde enzima reverstranscriptaza virală, utilizând
ARN-ul propriu ca matrice, va sintetiza o catenă ADN complementară. ADN-ul
complementar se autoreplică şi, sub formă dublucatenară, intră în nucleu unde se
inseră în ADN-ul celulei gazdă. Aici initiază transcriptia urmată de translaţie, procese
prin care se obţin ARN şi proteine virale, care prin asamblare vor produce copii virale
multiple .

5' 3' ARN viral matriţă

revers transcriptaza

3
3' ARN viral matriţă

5' ADN complementar

5'

ADN complementar monocatenar

5' 3' 3
5
ARN viral matriţă revers
transcriptaza

3'

5'
ADN complementar
dublu catenar

Figura 26. Acţiunea reverstranscriptazei virale

Primerul folosit de reverstranscriptaza virală este un ARN de transfer preluat
de particula virală din infecţii anterioare.
Spre deosebire de ADN polimerază, reverstranscriptaza nu posedă activitate
reparatorie (3’-5’ exonucleazică). Astfel, în procesul de sinteză se vor produce foarte
multe greşeli (erori de replicare) ce vor modifica genomul viral. Acest lucru explică
numărul enorm de tulpini virale şi modificarea rapidă a acestora în cursul proceselor
 de multiplicare. În cazul virusului HIV existenţa unui număr foarte mare de mutaţii
produse rapid, explică eficienţa redusă a tratamentelor de până acum. Un alt
exemplu de activitate reverstranscriptazică este acţiunea telomerazei.
Descoperirea reverstranscriptazei a dezvoltat tehnologiile de obţinere de gene
sintetice pornind de la ARNm citoplasmatic al genelor originale.

I.5.4. Modificări ale ADN în cursul procesului de replicare

O categorie specială de modificări ale ADN este dată de erorile de replicare.
Astfel în cursul sintezei noilor catene apare o nucleotidă eronată la fiecare 10 4-105
nucleotide inserate . Pentru a preveni aceasta, ADN polimerazele utilizate în procesul
de replicare ADN exercită şi o acţiune reparatorie de tip 3’-5’ exonuclează şi 5’-3’
polimerază. Astfel ele detectează nucleotidele încorporate greşit si le înlocuiesc cu
nucleotide corecte. Această activitate continuă şi în perioada dintre replicări, ADN
polimerazele fiind gardieni ai integrităţii ADN atât în timpul replicării cat şi al
funcţionalităţii ADN.
Ca urmare a activităţii reparatorii a ADN polimerazelor si a mecanismului
semiconservativ de sinteză a ADN se obtine o fidelitate deosebita a procesului
replicativ de 1 nucleotida gresita la 109 nucleotide corecte , acest lucru insemnand 3-
5 erori pe ADN –ul unei celule. Daca se porneste de la numarul de celule total din
organismul uman, 1013 - 1014 numărul de erori generate prin replicare devine uriaş.
În plus se mai adaugă modificările ADN induse de factori interni sau externi, ceea ce
ridică foarte mult riscul modificărilor patologice ale ADN – ului celular .
În cazul eucariotelor, pe lângă polimerazele  şi  care sintetizează şi repară
în acelaşi timp catena conducătoare respectiv catena în întârziere, există polimeraze
specializate în procesul de reparare cum este de exemplu polimeraza .