Sunteți pe pagina 1din 77

Modificări ale ADN în cursul procesului de replicare

O categorie specială de modificări ale ADN este dată de erorile de replicare.


Astfel în cursul sintezei noilor catene apare o nucleotidă eronată la fiecare 10 4-105
nucleotide inserate . Pentru a preveni aceasta, ADN polimerazele utilizate în procesul
de replicare ADN exercită şi o acţiune reparatorie de tip 3’-5’ exonuclează şi 5’-3’
polimerază. Astfel ele detectează nucleotidele încorporate greşit si le înlocuiesc cu
nucleotide corecte. Această activitate continuă şi în perioada dintre replicări, ADN
polimerazele fiind gardieni ai integrităţii ADN atât în timpul replicării cat şi al
funcţionalităţii ADN.
Ca urmare a activităţii reparatorii a ADN polimerazelor si a mecanismului
semiconservativ de sinteză a ADN se obtine o fidelitate deosebita a procesului
replicativ de 1 nucleotida gresita la 109 nucleotide corecte , acest lucru insemnand 3-
5 erori pe ADN –ul unei celule. Daca se porneste de la numarul de celule total din
organismul uman, 1013 - 1014 numărul de erori generate prin replicare devine uriaş.
În plus se mai adaugă modificările ADN induse de factori interni sau externi, ceea ce
ridică foarte mult riscul modificărilor patologice ale ADN – ului celular .
În cazul eucariotelor, pe lângă polimerazele  şi  care sintetizează şi repară
în acelaşi timp catena conducătoare respectiv catena în întârziere, există polimeraze
specializate în procesul de reparare cum este de exemplu polimeraza .

I.5.5. Mutaţii ADN


Mutaţiile sunt definite ca fiind schimbările transmisibile ereditar ale
materialului genetic. Ele pot afecta atât celulele somatice cât şi celulele germinale.
Mutaţiile nereparate pot conduce la apariţia de diverse boli, cancer, senescenţă,
apoptoză celulară. De aceea, procesele de reparare sunt continue şi indispensabile .
Toate organismele vii posedă mecanisme de reparare ale modificărilor
intervenite în structura ADN. Unele leziuni sunt direct reparate, dar cele mai multe
sunt îndepărtate şi înlocuite cu secvenţe corecte. Cheia acestor procese de reparare
este natura dublu-catenară a ADN, ce conţine informaţia genetică în duplicat, ceea
ce permite restaurarea secvenţelor alterate folosind ca model informaţia de la nivelul
celeilalte catene. Acest avantaj, împreună cu cel al transmiterii semiconservative a
informaţiei genetice reprezintă suportul adoptării modelului dublu catenar al ADN.
Mutaţiile pot fi spontane sau consecutive unor modificări la nivelul bazelor azotate.
ADN poate fi afectat de procese în urma cărora se pierd, se adaugă sau se
modifică unele baze azotate. Aceste procese pot fi:
- izomerizarea bazelor azotate (forma ceto-enol, amino-imino)
- dimerizarea timinei sub acţiunea radiaţiilor UV
- dezaminarea unor baze (citozina→uracil, adenina→ hipoxantina, guanina →
xantina)
- disfuncţionalităţi ale procesului de replicare sau de reparare a ADN.
Din punct de vedere al amplitudinii se împart în două categorii:

a) Macroleziuni ale ADN


1. Deleţiile (amputări ale materialului genetic de dimensiuni variabile)
2. Duplicări şi amplificări ale materialului genetic
3. Fuziuni de gene
4. Inversiuni ce constau în inversarea sensului unui segment
5. Inserţii de secvenţe ADN de lungimi variabile.
Din punct de vedere terapeutic macroleziunile ADN sunt dificil de reparat, în
majoritatea cazurilor având loc moartea celulară.

b) Microleziunile ADN (mutaţii punctiforme)


Rezultă prin modificarea unei singure perechi de baze. În funcţie de tipul
modificării avem:
1. Tranziţionale (când o nucleotidă purinică este înlocuită tot cu o nucleotidă
purinică sau o nucleotidă pirimidinică este înlocuită tot cu o nucleotidă
pirimidinică)
2. Transversale (când o nucleotidă purinică este înlocuită cu o nucleotidă
pirimidinică sau invers)
3. Mutaţii non-sens ce au loc prin înlocuirea unei perechi de baze cu alta
proces în urma căruia rezultă un codon stop care va bloca sinteza
proteinei codificate.
4. Mutaţii missens în care o pereche de nucleotide este înlocuită cu alta,
proces în urma căruia rezultă un alt codon, codon ce va genera un alt
aminoacid în proteina codificată de genă, acest lucru modificând
structura primara si functia biologică a proteinei respective.
5. Mutaţii ale cadrului de citire in care se adauga sau se elimina o pereche
de nucleotide. În acest caz se modifică complet secvenţa nucleotidică
organizată în codoni, anulându-se sinteza ARN transcripţionat de gena
respectivă.
6. Mutaţii mute apar atunci când înlocuirea unei nucleotide cu alta nu
afectează secvenţa de aminoacizi a proteinei codificate.

În general efectele mutaţiilor sunt mai reduse decât cele ale macroleziunilor.
Cele mai comune mutaţii sunt produse prin substituţia unei perechi de baze cu alta.
Principala cauză internă este procesul spontan de tautomerizare al bazelor
azotate formele ceto  enol sau amino  imino. Deşi formele predominante sunt
amino şi ceto, totuşi circa 10-4 din baze adoptă tranzitoriu celelalte forme tautomere,
perioadă de timp în care aceste forme vor produce împerecheri greşite cum ar fi
imino adenina cu citozina în loc de uracil. Acest lucru va genera la replicare un ADN
filial cu o pereche de baze greşită C-G în loc de T-A .
Cauzele externe se datorează agenţilor chimici şi radiaţiilor ultraviolete. Ca
agent chimic, HNO2 acidul azotos, modifică prin dezaminare bazele azotate ce
conţin grupare amino. Ca urmare adenina va trece în hipoxantină, guanina în
xantină, iar citozina în uracil. Hipoxantina se va împerechea cu citozina, uracilul cu
adenina, producându-se astfel mutaţii de tip tranzitie A-T  C-G. Alţi agenţi chimici
periculoşi sunt compuşii aromatici policiclici, de exemplu acridinele, care se pot
insera intre cele două catene ale helixului ADN, producând mutaţii ale cadrului de
citire, prin inserţia sau deleţia uneia sau a mai multor perechi de baze.
Radiaţiile ultraviolete reprezintă cel mai comun agent de lezare al ADN. Ele
produc legarea covalentă a două baze pirimidinice adiacente in catena ADN,
formându-se un dimer de pirimidină. Acest dimer blochează la nivelul său procesele
de replicare sau transcripţie, procese ce pot avea loc doar după repararea leziunii.
Figura 27. Producerea de mutatii la nivelul ADN sub acţiunea diferiţilor agenţi
mutageni

NH2 O

HN
N Dezaminare

O N
O N H
H
Citozina Uracil

NH2 O
CH3 CH3
N HN
Dezaminare

O N O N
H H
5 - metil - citozina Timina
Figura 28. Mutaţii realizate prin dezaminare care implică îndepărtarea unui
grup amino. Dezaminarea poate modifica citozina în uracil, sau citozina
metilată în tiamină.

În ultimul timp a fost luată în considerare şi expansiunea (multiplicarea)


tripletelor. Tripletele sunt secvenţe repetitive simple numite microsateliţi ce apar cu o
frecvenţă mare la nivelul genomului. În cazul genelor fiecare triplet codifică un
aminoacid, astfel că expansiunea tripletelor va duce la formarea unui segment
poliaminoacidic in secventa proteinei codificate de genă, producăndu-se modificări
structurale ce vor afecta activitatea proteinei . Un exemplu il reprezintă expansiunea
tripletelor CAG în diferite forme de cancer .
Triplet expansiunea constituie o premutaţie care nu prezintă un fenotip
specific, dar conduce la o expansiune dramatică în generaţia următoare. Aceste
secvenţe repetitive mult mai lungi ca de obicei, pot produce boli prin inserarea unui
lanţ din reziduuri ale aceluiaşi aminoacid la nivelul lanţului polipeptidic codat, ca de
exemplu în boala Huntington, sau pot afecta reglarea unei gene, ca în sindromul
X fragil.

I.5.6. Repararea mutaţiilor ADN


Cu toată acurateţea replicării ADN, aceasta nu este de 100%. De asemenea
ADN suferă procese de alterare datorate agenţilor fizici (radiaţii) şi chimici (radicali
de oxigen liberi).
Mecanismele de reparare ale ADN cuprind:
1. Repararea directă
2. Repararea prin excizia bazelor azotate
3. Repararea prin excizia nucleotidelor modificate
4. Repararea in cursul proceselor de replicare sau transcripţie
A. Repararea directă
Este un mecanism în care modificările sunt înlăturate fără a întrerupe (a tăia)
catena ADN. Cel mai cunoscut exemplu este al fotoreactivării, realizat prin acţiunea
enzimelor de tip fotoliaze, ce acţionează asupra mutaţiilor produse de radiaţiile UV
făcând din acestea leziuni reversibile.
Este un mecanism specific de îndepărtare prin fotoliză a dimerilor de
ciclobutan pirimidină, leziunea majoră produsă de radiaţiile ultraviolete. Enzimele
folosesc cofactori: metilen FolH4, FADH2 şi energie luminoasă în scopul ruperii
legăturilor dintre dimerii de timină.
Un alt exemplu este cel al demetilării bazelor incorect alchilate, de obicei sub
actiunea unor agenţi carcinogeni . In acest caz există metilaze care recunosc bazele
metilate greşit, de exemplu O6 – metil guanina, şi îndepărtează direct gruparea metil,
lăsând catena ADN intactă .
B. Repararea prin excizie
Este un mecanism prin care se repară mai multe tipuri de leziuni şi constă în
îndepărtarea leziunii prin excizia unei părţi din catenă, lăsând un „gol” (gap), urmat
de resinteză (sub acţiunea ADN polimerazei), utilizând matriţa oferită de catena
ADN complementară şi ligaturare (sub acţiunea ADN ligazei), pentru restaurarea
continuităţii ADN. Există două tipuri majore ale exciziei: excizia bazelor şi excizia
nucleotidelor.
C. Repararea prin excizia bazelor
Baza afectată este înlăturată sub acţiunea unei glicozilaze, care desface
legăturile N-glicozil dintre monozaharid şi baza azotată. AP endonucleaza rupe
legăturile fosfodiester, întrerupând catena, iar AP liaza îndepărtează pentoza. În
continuare ADN polimeraza umple golul rămas, iar ADN ligaza reface continuitatea
catenei .

Figura 29. Mecanismul de reparare prin excizia bazelor

D. Repararea prin excizia nucleotidelor


Procesul debutează prin acţiunea unui complex multienzimatic ce conţine
proteine cu activitate catalitică codate de genele uvrABC. Acesta recunoaşte
distorsiunea la nivelul catenei ADN si realizează o dublă excizie, de ambele părţi ale
bazelor afectate, astfel că leziunea este îndepărtată sub forma unui oligonucleotid
(12-13 nucleotide la E.coli şi 27-29 la om). În continuare, acţionează ADN
polimeraza ce sintetizează un fragment nou corect şi ADN ligaza ce leagă acest
fragment de restul catenei asigurând o catenă continuă şi corectă .

Figura 30. Mecanismul de reparare a ADN prin excizia nucleotidelor

E. Repararea bazelor nepotrivite „mismatch” reprezintă o variantă


particulară de reparare prin excizia de nucleotide ce înlătură erori ale replicării în
care nu avem baze lezate sau modificate, ci doar o altă bază din cele patru în locul
celei potrivite. Astfel, este necesară recunoaşterea structurii distorsionate şi alegerea
unei baze care trebuie înlăturate, în condiţiile în care bazele au o structură normală.
Trebuie să fie recunoscută catena nou sintetizată şi îndepărtată baza
nepotrivită. Recunoaşterea se bazează pe faptul că metilarea catenei nou sintetizate
nu este realizată în primele momente ale replicării putând fi uşor deosebită de
catena parentală. Primele etape sunt realizate de un complex proteic codificat de
genele MutS, MutL, MutH la E.coli, respectiv MSH şi MLH la om. Acest complex
recunoaşte baza ataşată greşit şi o marchează printr-o incizie. Acţiunea este
continuată de exonucleaze ce excizionează un segment mai amplu, fapt ce permite
activitatea ADN polimerazei şi ADN ligazei .
Defectele care intervin în acest tip de reparare pot cauza cancerul de colon
non-polipozic ereditar, sau intervin în apariţia rezistenţei la agenţi de metilare
(nitrozoureea, cisplatin) utilizaţi în terapia cancerului.
Nucleotida împerecheată greşit

Figura 31. Repararea „mismatch”

F. Repararea in cursul proceselor de replicare sau transcripţie


O serie de mutaţii pot împiedica replicarea sau transcripţia.În acest caz
complexul de replicare sau transcripţie se opreşte la nivelul leziunii, replicarea fiind
întârziată datorită abilităţilor de corectare ale polimerazelor, care împiedică ataşarea
nucleotidelor în locul opus unei leziuni. Această problemă se rezolvă în următoarele
variante :
- complexul se retrage pentru a permite repararea
- complexul trece peste acesta lăsând un gol în noua catenă
În cazul golului lăsat în viitoarea catenă există un sistem de reparaţie specific ce
utilizează proteina REC (recombinare). Repararea golului apărut la nivelul catenei
fiice se bazează pe o recombinare postreplicativă, ce permite transferul unui
fragment din catena parentală la nivelul golului. Spre deosebire de catena în
întârziere, unde reiniţierea sintezei este realizată simplu prin sinteza unui nou
fragment Okazaki, în cazul catenei conducătoare aceasta se realizează mai dificil
datorită necesităţii existenţei unei origini de replicare.
Sinteza „ocolitoare”(bypass) se realizează cu ajutorul unor ADN polimeraze
ce prezintă un grad mai mic de acurateţă şi o procesivitate mai mică (la E.coli, ADN
polimeraza IV şi V, iar la om ADN polimeraza η).
Rupturile dublu-catenare, potenţial letale sunt reparate prin recombinare
omoloagă
Cuplarea reparării cu transcripţia este o formă de reparare prin excizie
declanşată de complexul ARN polimerazei blocat şi direcţionează repararea spre
catena matriţă a regiunii transcrise, astfel că aceste leziuni sunt mult mai repede
reparate.

G. ADN-ul mitocondrial este predispus la mutaţii


Majoritatea mutaţiilor apar la nivelul secvenţelor ADN nuclear datorită
dimensiunii mari a acestuia. Totuşi, genomul mitocondrial moştenit pe linie maternă
(ADNmt, 16.000 baze adică aproximativ 1/200.000 din cel nuclear) este un punct
fierbinte al mutaţiilor patogenice datorită a doi factori principali: i) 93% din ADNmt
este codant, ii) ADNmt are o rată mai mare a mutaţiilor faţă de ADN genomic datorită
faptului că nu este protejat de histone, prezintă multe cicluri de replicare şi nu este
reparat aşa de eficient ca genomul nuclear. Din aceste motive multe din bolile
genetice umane îşi au sediul la nivelul ADNmt. O caracteristică a bolilor
mitocondriale este faptul că se moştenesc pe linie maternă (mitocondria din
spermatozoid este pierdută imediat după fertilizare şi nu contribuie la mitocondria
zigotului), afectează ambele sexe şi poate fi transmisă numai de mamele afectate.
Zigotul îşi primeşte tot ADNmt (mai mult de 105 copii) din citoplasma oocitului. Dacă
o parte din aceste molecule de ADNmt conţin mutaţii atunci segregarea aleatorie a
formelor mutante şi wild type din timpul mitozei va conduce la celule fiice cu proporţii
diferite ale mutaţiilor mitocondriale (heteroplasmie). Numai un număr mic de boli
mitocondriale se caracterizează prin mutaţii ADNmt prezente în toate celulele
(homoplasmie).

I.5.7. Patologia reparării ADN


Cuprinde o serie de boli a căror cauză o constituie defecte ale enzimelor
implicate în repararea ADN.
1. Xeroderma pigmentosum – maladie cauzata de un defect in repararea prin
excizie a mutaţiilor datorate razelor ultraviolete. Astfel dacă în fibroblastele
umane normale, jumătate din dimerii de timină generaţi de UV sunt
excizionaţi în primele 24 de ore, la bolnavii cu xeroderma pigmentosum în
aceeaşi perioadă de timp nu este excizionat nici măcar 1% din dimeri. Boala
se manifestă prin fotosensibilitate, cancer de piele, tulburări neurologice .
2. Cockaine’s syndrome – maladie cauzata de defect în repararea noilor catene.
Se manifestă prin retardare mintală, degenerare neurologică.
3. Bloom syndrome, anemia Fanconi, ataxia - telangiectasia - maladii datorate
defectului in repararea rupturilor (ADN ligaza) la nivelul ADN
4. Cancerul de colon ereditar nonpolipozic (sindromul Lynch) datorat defectelor
în repararea postreplicativa a mutaţiilor de împerechere nepotrivită a bazelor.
Incidenţa bolii este de 1 : 200, iar defectele sunt localizate la nivelul genelor
enzimelor de reparare MSH şi MLH.

I.5.8. Evaluarea potenţialului carcinogen al substanţelor chimice


Multe substanţe chimice au potenţial carcinogen şi din acest motiv este
importantă identificarea lor în scopul evitării utilizării sau expunerii la aceşti compuşi.
În acest sens a fost dezvoltat testul Ames.
Acesta constă în cultivarea pe un mediu nutritiv fără histidină a unei tulpini de
Salmonella defectivă la sinteza de histidină. În condiţii normale aceasta nu va fi
capabilă să se dezvolte pe acest mediu. Adăugarea unui agent mutagen, poate
produce mutaţii, care să permită tulpinii să poată sintetiza histidină şi astfel să se
dezvolte pe mediul de cultură fără histidină . Testul Ames clasic a fost completat prin
adăugarea de extract de ficat de mamifer, concomitent cu potenţialul agent mutagen.
Acest lucru a fost necesar deoarece o substanţa poate dezvolta capacităţi
mutagene în urma transformării ei în organism în cursul procesului de detoxifiere la
nivelul ficatului. Acest sistem a permis identificarea potenţialului mutagen a
aflatoxinei B1 din mucegai, cereale, fasole. Astfel acesta este transformat de
citocromul P-450, component al sistemului de detoxifiere din ficat, într-un epoxid cu
un potenţial mutagen foarte puternic, ce induce transversii de tip G - C  A - T.

I.5.9. De ce timina ?
Cercetările legate de descifrarea procesele reparatorii la nivelul ADN au dat
răspunsul la o întrebare veche: de ce avem timină (5-metil-uracil) în ADN şi nu
uracil, ca în ARN ?
Explicaţia este următoarea: mutaţiile generate prin dezaminarea citozinei
produc uracil, care este recunoscut ca bază modificată de enzimele de reparare şi
îndepărtat. Timina, un uracil metilat, este recunoscută ca bază corectă. În absenţa
timinei, uracilul corect nu ar fi putut fi deosebit de uracilul rezultat prin modificarea
citozinei şi astfel procesele reparatorii nu ar mai fi fost eficiente. Reamintim că
transformarea citozinei în uracil produce mutatii de tipul G - C  A - T

I.5.10. Agenţi chemoterapeutici implicaţi în replicare


Cunoaşterea mecanismelor biochimice ale replicării ADN a deschis
perspective in tratamentul unor afecţiuni , tratament bazat pe intervenţia in procesele
de replicare .
În cazul infecţiilor bacteriene blocarea multiplicarii celulare a agentului
bacterian poate fi realizata prin utilizarea unor substante (antibiotice) ce inhibă
activitatea unor componente ale procesului de replicare.
1. Fluoroquinolonele (norfloxacin, lomefloxacin, fleroxacin, ciprofloxacin,
enoxacin, trovafloxacin novobiocina, acidul nalidixic) sunt inhibitori ai
topoizomerazelor legându-se la complexul enzimă-ADN.
2. Metronidazolul realizează rupturi la nivelul catenelor ADN microbiene .
O alta categorie o constituie agenţii anticancerigeni, substanţe care inhibă
replicarea ADN din celulele canceroase, blocând astfel dezvoltarea procesului
tumoral. În funcţie de tipul componentei afectate în cursul replicarii avem mai multe
categorii :
1. Agenţi de alchilare cum ar fi ciclofosfamida (Cytoxan, Neosar) fosfamida,
decarbazina, clorambucil (Leukeran), procarbazina (Matulane, Natulan). Majoritatea
acestor substanţe derivă din gazul muştar folosit ca gaz de luptă în primul război
mondial
2. Agenti ce blocheaza topoizomerazele cum ar fi antraciclinele
(Doxorubicina, Daunorubicina), camptotecinele (Irinotecan, Topotecan), etopozide
(Vepesid).
De exemplu, camptothecina şi derivaţii acesteia modifică funcţia
topoizomerazei I, iar anthraciclinele, ca adriamicina şi doxorubicina îşi exercită
efectele terapeutice asupra topoizomerazei II, fiind utilizate în tratamentul
neoplasmelor hematologice. Topoizomerazele reprezintă ţinte terapeutice importante
pentru agenţi antitumorali, care acţionează prin interferarea enzimelor ce catalizează
reasamblarea celor două catene, inhibând astfel una dintre treptele de acţiune a
topoizomerazelor. Spre deosebire de alţi agenţi terapeutici, care inhibă întreaga
activitate a unei enzime, inhibitorii topoizomerazelor acţionează prin inhibarea doar
parţială a actitivităţii enzimei.
3. Agenţi ce blocheaza formarea fusului mitotic (Vincristina, Vinblastina, etc).
4. Agenţi ce hiperstabilizeaza microtubulii, blocând astfel diviziunea celulară
cum ar fi paclitaxel (Taxol) sau docetaxel (Taxotere) .

I.6. Biosinteza ARN (transcripţia)

ADN conţine unităţi funcţionale numite gene. Gena poate fi definită ca fiind
segmentul ADN ce codifică un produs funcţional de tip ARN. În cazul în care ARN
produs este ARNm informaţia transferată prin aceasta va fi tradusă în sinteza unei
polipeptide sau proteine. În acest mod gena va codifica sinteza unei proteine.
Sinteza proteinei va trebui să parcurgă astfel 2 etape:
1. Transcripţia – procesul de copiere a informaţiei din genă sub forma ARNm.
2. Translaţie – procesul de traducere a informaţiei transferate de ARNm în
secvenţa de aminoacizi a proteinei codificate.
În esenţă transcripţia reprezintă copierea unui segment ADN (genă), sub
forma unei molecule ARN. Procesul de transcripţie urmează în linii mari procesul de
replicare a ADN, dar la o scală mult mai mică.
Astfel cele 2 catene ADN se desfac, iar una dintre ele constituie pe o porţiune
limitată, matrita pentru acţiunea unei polimeraze ce sintetizează un segment
polinucleotidic complementar utilizând ribonucleotidele. Procesul utilizează
ribonucleotide trifosfat (ATP; GTP;UTP; CTP), ioni de Mg2+ şi Mn2+.
Fiecare ribonucleotidă este ataşată noii catene printr-o legătură fosfo-
diesterică, iar energia necesară incorporării este cea obţinută prin hidroliza a 2
legături fosfat macroergice.

Figura 32. Transcripţia. Prezentare generală


Procesul de transcripţie prezintă diferenţe între procariote şi eucariote,
diferenţe date de complexitatea procesului de reglare a expresiei genelor la
eucariote.
ARNm este o copie poliribonucleotidică a unui fragment ADN în care
ribonucleotidele din segmentul copie ARN sunt complementare
dezoxiribonucleotidelor ADN. Complementaritatea se realizează la nivelul perechilor
de baze azotate A-U şi G-C.
Procesul de sinteză al ARN este realizat de ARN polimeraze –ADN
dependente care iniţiază transcripţia, sintetizează catena ARN prin ataşarea de
ribonucleotide şi termină transcripţia. Ele sunt polienzime formate din mai multe
subunităţi (2,1,1’,1σ) fiecare subunitate îndeplinind câte un rol distinct (ex. de
recunoaştere, catalitic, de identificare a situsurilor de terminare a transcripţiei).

I.6.1. Etapele transcripției


Transcripţia la eucariote este un proces complex ce se desfăşoară în
citoplasmă. Expresia genei la eucariote (expresia genei = sinteza de ARN şi proteine
specifice) depinde de foarte mulţi factori, atât externi cât şi interni. Acestea pot
influenţa transcripţia atât în cele 3 etape de desfăşurare, cât şi la nivelul produsului
final, ARN.

A. Iniţierea transcripţiei
ADN-ul eucariot se găseşte sub forma cromatinei, în care elementul de bază
este nucleozomul. Compactarea ADN în cromatină împiedică procesul de
transcripţie şi din acest motiv primul eveniment în iniţierea transcripţiei este
remodelarea cromatinei.
Aceasta constă în desprinderea ADN de corpul histonic al nucleozomilor,
pentru a putea fi expus acţiunii ARN polimerazei. Deoarece lungimea ADN dintr-un
nucleozom + ADN de legătură este de aproximativ  200 pb se consideră că trebuie
detaşat ADN de pe 3-4 nucleozomi pentru a realiza iniţierea transcripţiei. Procesul
se realizează prin acţiunea unor factori proteici de transcripţie ce fixează o moleculă
ce coactivator cu activitate histon acetil – transferazică si care acetilează histonele
din nucleozomi la nivelul resturilor de aminoacizi bazici din constituţia acestora.
Procesul de acetilare neutralizează grupările bazice ale histonelor (de exemplu NH 2
din lizină), eliminând asfel atracţia electrostatică histone – ADN, astfel că molecula
ADN se detaşează de histone.
Cromatina Nucleozomi

ADN TATA

Activator (factor
de transcriptie)

TATA

Coactivator cu activitate de
Coactivator acetiltransferaza a
Acetilarea histonelor
histonelor

TATA

Cromatina este
remodelata

Coactivator
Nucleozomi

Promotor
deblocat
TATA

Figura 33. Remodelarea cromatinei

Lanţ polipeptidic
histonic

Lanţ
cu lizină Histon-acetiltransferaza
(HAT)
+Acetil-CoA

NH3+ NH-COCH3
Subunitatea histonică Subunitatea de histonă
a nucleozomului acetilată

Figura 34. Acetilarea lizinei din histone.


Toate genele au înainte de secvenţa ce urmează a fi copiată un segment de
recunoaştere pentru fixarea ARN polimerazei, numit segment promotor. Regiunea
promotor fiind astfel eliberată, va lega, la nivelul cutiei TATA, complexul de
transcripţie, iar acesta la randul sau ARN polimeraza.
Locul de incepere
al transcriptiei

Regiune de
reglare Elemente de control In amonte In aval
-200 in amonte -50
CCAAT TATA
ADN

-25

Promotor

ARN polimeraza recunoaşte promotorul cu care formează un complex de


iniţiere al transcripţiei numit complex închis.
Formarea complexului inchis este posibila doar prin participarea unor factori
de transcriptie, situati in amonte de segmentul promotor. Se formează complexul de
transcripţie ARN polimerază fixându-se la nivelul poziţiei TATA. Genele eucariote
contin o regiune promotor foarte extinsă, uneori pe zeci de mii de pb, de câteva zeci
de ori mai mare decât sectorul codant al genei. În cadrul acestei regiuni (Figura 51)
distingem situsuri de legare pentru :
- elemente de control : cutii TATA, secvenţe GC, secvenţa CAAT

- elemente de reglare activatoare


inhibitoare

Elementele de reglare sunt locusuri de fixare specifică pentru diferiţi factori


cum ar fi ARE (element de răspuns hormonal) sub a căror acţiune are loc
amplificarea sau reducerea procesului de transcriptie al gene respective.
Sub acţiunea acestor factori se formează complexul de iniţiere ce leagă ARN
polimeraza la nivelul secvenţelor de start ale transcripţiei. În cadrul promotorului
avem elemente de control şi o regiune de de legare a factorilor de transcripţie
activatori sau inhibitori.
Elemente amplificatoare

Coactivator
Factori de
transcripţie ARN
TAF
polimeraza
TBP
TATA ADN
TFII B

Elemente de control

Figura 35. Complex inchis al transcripţiei

Factori de transcripţie TF se numesc activatori când se leagă de zone


amplificatoare. Fiecare factor are 2 regiuni : un domeniu de legare al ADN şi un
domeniu de legare a unui factor de activare. Ex. TBP( proteina de legare de cutia
TATA ) este proteina de legare a unui factor de transcripţie, element obligatoriu la
toate eucariotele. Activarea factorilor de transcripţie se face prin proteine specifice
de obicei produşi din a unei căi de semnalizare intracelulară.

Figura 36. Elemente de control din regiunea promotor


Formarea complexului de iniţiere a transcripţiei depinde şi de gradul de
metilare al resturilor de citozină din regiunea promotor, în special în zona cutiei GC.
Un grad ridicat de metilare, inhibă transcripţia. Procesul de metilare se realizează în
decursul existenţei, iar metilarea GC se poate transmite prin celule germinale,
fenomen epigenic numit imprimare genomică (genomic imprinting).

B. Factori cis şi trans reglatori ai transcripţiei


În structura regiunii reglatoare a genei se găsesc dispersate secvenţe
nucleotidice, formate din 6-8 nucleotide, numite elemente cis-reglatoare. Acestea vor
fixa factori proteici specifici de reglare numiţi trans-reglatori. Când un factor reglator
se fixează pe o secvenţă cis-reglatoare de ADN, cantitatea de ARNm sintetizat fie
scade brusc (factor trans inhibitor) fie creşte brusc (factor trans activator).
Fenomenul este cu atât mai interesant cu cât unele secvenţe cis se găsesc la mare
distanţă (zeci de mii de pb) faţă de locul de start al transcripţiei.
Secvenţa cis reglatoare Factor trans reglator
cutie TATA TF III D
cutie GC Sp 1
cutie CCAAT CTF

Factorii trans – reglatori sunt proteine produse de alte gene şi posedă


obligatoriu:
- un domeniu de fixare al ADN, domeniu ce conţine motive structurale de tip
deget de zinc, fermoar de leucină.
- domeniul de activare al transcripţiei
- domeniul de fixare al unui alt element, implicat in reglare, cum apare de
exemplu la receptorii nucleari pentru hormoni steroidici, tiroidieni etc.

Figura 37. Factori de reglare ai transcripţiei genei enzimei


fosfoenolpiruvatcarboxikinază
În genele de la eucariote care codează ARN mesager s-au descoperit 2 tipuri
de factori de reglare cis numiţi promotori şi amplificatori (enhancers).
- promotorii conţin aproximativ 100 – 200 perechi de baze şi sunt localizaţi
înaintea locusului de iniţiere a transcripţiei. Rolul acestora este în ataşarea ARN
polimerazei 2 şi în corecta iniţiere a transcripţiei.
- amplificatorii activează promotorii controlând eficacitatea şi rata de
transcripţie începând de la respectivii promotori. Fiind factori de reglare de tip cis
amplificatorii acţionează doar asupra promotorilor situaţi pe acelaşi cromozom,
uneori la distanţe mari (chiar de 50 kb de promotor). Dacă promotorii sunt
dependenţi de localizarea lor spaţială neputând fi localizaţi decât la capătul 5’,
segmentele amplificatoare pot fi localizate şi la capătul 3’ sau chiar în introni.
Există tipuri diferite de polimeraze specializate pe sinteza anumitor tipuri de
ARN:
• ARN polimeraza I (acţionează în nucleol) sintetizează ARN ribozomal
(70% din total);
• ARN polimeraza II (în nucleoplasmă) - este responsabilă de sinteza
ARNm şi ARNsn( ARN nuclear scurt – este singura inhibată de
AMANITINA);
• ARN polimeraza III (în nucleoplasmă) - este responsabilă de sinteza
ARNt şi ARNr cu masa 5S.
Figura 38. Tipurile şi rolul ARN polimerazelor

Pentru a recunoaşte un promotor, ARN polimeraza II are nevoie de anumiţi


factori de reglare din nucleu, în lipsa cărora ataşarea enzimei se face la întamplare.
Aceşti factori sunt reprezentaţi de 5 proteine nucleare care sunt necesare în
transcrierea corectă cu ajutorul ARN polimerazei II. Într-o primă etapă, TFIID în
asociere cu TFIIA recunosc şi se fixează la nivelul secvenţei TATA. În continuare la
acest complex se adaugă TFIIB, fiind o punte de legatură între TFIID şi ARN
polimeraza II. Energia necesară transcripţiei este asigurată de o ATP-ază ADN
dependentă numită TFIIF.

Figura 39. Conformaţia ARN polimerazei

Aceşti reglatori nucleari fac parte din categoria factorilor de reglare trans. Pe
langă aceştia, mai sunt şi alţi factori de reglare trans dar care trebuie să
interacţioneze direct sau indirect cu secvenţa de iniţiere a transcripţiei TATA.
Aceşti factori de reglare sunt prezenţi în toate celulele şi se pare că sunt
implicaţi în diversele tipuri de interacţiuni între promotori şi amplificatori care
determină diferenţe în transcripţia anumitor gene în celule diferite.
Complexul inchis de transcripţie acoperă cca 60pb din catena ADN matriţă,
din care 10-12 pb sunt situate in aval de punctul de start al transcripţiei. Complexul
se transformă în complex deschis în momentul în care enzima desface cele două
catene ADN pe o lungime de aproximativ 18 pb. În acest proces intervine
subunitatea σ care apoi se detaşează, marcând astfel limita dintre etapa de start şi
cea de alungire din cadrul transcripţiei.
După desfacerea ADN dublu catenar, catena ADN cu sensul 3’ → 5’ va
constitui matriţa pentru sinteza ARN. Aceasta se va sintetiza în sensul 5’ → 3’ prin
ataşarea de ribonucleotide. ARN polimeraza va înainta în sensul de copiere
desfăcând ADN-ul dublu catenar. În spatele ei ADN-ul va reforma dubla catenă.
Catena copiată se numeşte catenă matrice în timp ce cea de-a doua catenă se
numeşte catenă codantă. În acest fel prin copierea celor două catene se obţin ARN
diferite. Procesul continuă până când se ajunge la secvenţe complementare de tip
GC şi care se continuă cu o poli adenină. Copierea acestor secvenţe va produce o
secventă ARN cu fragmente complementare care vor putea hibridiza pe portiuni
limitate formand structri spatiale in formă de ac de păr .

G C
G C
G C Inel bogat in legaturi G-C
G C
G C
ARNm
G C
OH
UUUU
Figura 40. Structura terminală ARN în formă de ac de păr
Apariţia structurii în ac de păr detaşează ARN polimeraza. În acelaşi timp un
factor  recunoaşte segmentul poli U favorizând în plus procesul de disociere al
complexului ADN + ARN polimeraza, de desprindere al ARN polimerazei şi de
terminare a transcripţiei.
C. Terminarea transcripţiei
Terminarea procesului de transcripţie presupune implicarea mai multor factori
proteici de recunoaştere şi reglare a regiunilor terminale din gena transcripţionata.
Una din principale regiuni terminale este secvenţa 5’-AA-T-A-A-A-3’ în catena ADN
matriţă, numită semnal de poliadenilare.
Această secvenţă va genera modificare posttranscripţională de ataşare, la
nivelul moleculei ARN, a unei secvenţe terminale poli A.
O altă secvenţă terminală este o secvenţă complementară formata de un
segment poliuracil şi o regiune lungă bogată în GC, care, datorită numărului mare de
legături de hidrogen, este greu de desfăcut de ARN polimeraza. Acest segment
GGGGGCCCCC este recunoscut de un factor  ce favorizează detaşarea ARN
polimerazei şi terminarea transcripţiei.

I.6.2. Maturarea ARNm


ARNm rezultat în urma transcripţiei este o moleculă mare şi nefuncţională. Tot
în nucleu după terminarea transcripţiei este supus unor procese post-transcripţionale
în urma cărora devine o moleculă mică şi funcţională. Astfel, molecula ARNm nou
sintetizată are de parcurs mai multe etape înainte de a ajunge în citoplasmă şi a
participa la sinteza proteică. În cursul acestor etape ARNm suferă o serie de
transformări numite modificări posttranscripţionale sau maturarea ARNm.

Figura 41. Etapele maturării ARN mesager

Modificările posttranscripţionale se împart în 3 categorii:


1. Protejarea moleculei de ARNm faţă de acţiunea nucleazelor din citoplasmă
2. Selectarea informaţiei din ARNm prin procesul de splicing
3. Controlul cantităţii de ARNm care va trece în citoplasmă

1. Procesele de protecţie
ARNm trebuie protejat de acţiunea nucleazelor citoplasmatice. În citoplasmă
există nucleaze ce au rolul de a distruge ARN-ul străin sau ARN-ul propriu degradat.
Din acest motiv protejarea ARN-ului este de fapt un proces de marcare prin care să
fie recunoscut ca o moleculă proprie.
Protejarea moleculei ARNm se realizează printr-nu proces de adăugare la
cele două capete 3’ şi 5’, ale moleculei de ARNm a unor grupări chimice de
protecţie.
Protecţia la capătul 5’ după transcripţie începe cu o grupare trifosfat legată de
o riboză şi o bază purinică(A sau G) de exemplu 5’ pppA/GpNpNpNpN... unde p =
grupare fosfat şi N = baze azotate A, U, G sau C. Sub acţiunea unei
guaniltransferaze şi GP are loc reacţia :

Gppp +pppApNpNp... → GpppApNpNp...+ pp+p.

Se ataşează astfel un rest de guanozina legată printr-o legătură neobişnuită 5’


→ 5’ trifosfat cu următoarea nucleotida de la capătul 5’ al moleculei ARNm .
Restul GDP va fi apoi metilat la atomul de azot în poziţia 7 rezultand 7-
metilguanozină-difosfat. Această grupare 5’ terminală va fi o „cască de protecţie„
împotriva acţiunii propriilor nucleaze din citoplasmă.
Procesul de protecţie la capătul 5’ poate fi completat prin metilarea în poziţia
2’ a ribozelor următoarelor nucleotide (10-30 de resturi de nucleotide) de la capătul
5’.

Protecţia la capătul 3’ .
După sinteză, la capătul 3’, moleculele de ARNm sunt scindate la 20 de
nucleotide în aval de secvenţa specifică de poliadenilare AAUAAA. Apoi o enzimă de
tip poli(A) polimerază ataşează un număr variabil de resturi de adenozină
monofosfat constituind coada 3’ poliadenină [poli(A)].Numărul resturilor de
adenozină în poli A este variabil fiind în medie de 200-250. S-a constatat o relaţie
direct proporţională între mărimea poli A şi timpul de viaţă al ARNm.
Segmentul de poliadenină este considerat ca fiind ceasul biologic al ARNm ,
timpul de viaţă al acestuia depinzând de marimea segmentului de poliadenină. De
exemplu la ARNm pentru histone, ce nu are segment de poliadenină, timpul de viaţă
este de ordinul minutelor in timp ce în cazul unui segment poliadenilic cu lungime
maximă, timpul de viaţă creşte la 30 h. În timp segmentul poliadenilic se scurtează,
iar în momentul în care dispare în întregime ARNm va fi degradat de nucleaze.

Figura 42. Mecanismele de protecţie ale capetelor ARNm

Selectarea informaţiei codante din ARNm (splincing)


ARNm primar obţinut prin transcripţie are o lungime de peste zece ori mai
mare decât segmentul codant efectiv al ARNm ce va trece în citoplasmă. Spre
deosebire de procariote în care toată secvenţa de ARNm nou sintetizat se regăseşte
în secvenţa proteinei codate, la eucariote acest lucru se realizează doar parţial.
În secvenţa ARNm se găsesc atât porţiuni codante, numite exoni, cât şi
necodante, numite introni. În cursul unui proces complex numit matisare (splicing),
segmentele necodante, intronii, sunt scindate şi îndepărtate, iar cele codante, exonii,
sunt legate între ele formând molecula de ARNm matură, a cărei secvenţă se va
regăsi în secvenţa de aminoacizi a proteinei codate.
Figura 43. Mecanismul procesului de splicing
Procesul este catalizat de molecule ribonucleice mici (sn ARN) bogate în uracil ce
au 100-300 nucleotide şi denumite U1,U2,U3,U5 şi U6 . Fiecare sn ARN este asociat
cu factori proteici de control cu care constituie sn RNP (ribonucleoproteine nucleare
mici). Aceste complexe se fixează la nivelul intronilor din molecula ARNm imatură
constituind un agregat numit spliceozom care va cataliza procesul de excizie intron -
înnădire exoni.
Secvenţa unui intron începe cu 5’-GU şi se termină cu AG-3’. Legatura intron-
exon este unică; toţi introni încep cu GU şi se termină cu AG.
Procesul de splicing cuprinde etapele :
a) scindare 5’ a intronului. Extremitatea liberă 5’ formată se leagă
fosfodiesteric de situsul de ramificare formând un laţ.
b) scindare 3’ intronului, detaşarea intronului şi legarea automată a celor 2
exoni între ei printr-o legătură fosfodiesterică 3’(OH)→ 5’ (fosfat).
În unele cazuri procesul de splicing este realizat autocatalitic, chiar de ARNm
imatur, proprietate ce a permis atribuirea numelui de ribozime.

OH

Exonul 1 pGU A AGp Exonul2


5' 3'
intron
Transcriptul
primar ARN G p

AGp
OH U A

G p

Exonul 1 Exonul 2
AG
U A

ARNm Intron excizat


Figura 44. Eliminarea intronilor

În cadrul ARNm, mărimea intronilor depăşeşte cu mult pe cea a exonilor.


Astfel în timp ce un exon are o secvenţă medie de 1000 nucleotide, unii introni pot
depăşi 480.000 nucleotide. In general numărul de introni este de 2-500/genă cu o
mărime medie de 2000-10000 nucleotide.
În urma acestui proces ARNm va fi constituit numai din exoni, adică numai din
segmente codante.

Splincing tisular alternativ


Procesul de splicing este diferit în funcţie de tipul celular si de intervenţia
unor factori interni sau externi .
Astfel în ţesuturi diferite, aceeaşi genă produce acelaşi ARNm imatur, dar
procesarea acestuia generează diferite tipuri de ARNm matur, ce vor constitui
matriţe pentru proteine diferite.
În unele ţesuturi intronii sunt trataţi ca exoni şi invers. De asemenea modul de
asamblare al exonilor între ei poate să difere. Ambele variante de splicing alternativ
au ca rezultat formarea de ARNm respectiv de proteine diferite pornind de o singură
genă.
Acest lucru explică, printre altele, de ce, având acelaşi genom celular,
ţesuturile exprimă proteine diferite, element de bază în diferenţierea celulară. În plus,
acest fapt explică cum un număr de  30 000 de gene umane produc cel puţin de 10
ori mai multe tipuri de proteine. S-a constatat că peste 50% din genele umane
produc ARNm imatur ce este procesat alternativ.
Un exemplu de splicing alternativ este limfocitul B. În stadiile iniţiale de
diferenţiere celula utilizează un exon ce codifică un domeniu proteic transmembranar
ce permite reţinerea anticorpului la suprafaţa celulei. Ulterior limfocitul B foloseşte alt
exon ce codifică un alt domeniu proteic ce permite anticorpului să fi secretat în afara
celulei .
Un alt exemplu este al proteinei musculare tropomiozina pentru care au fost
identificate cel puţin 8 variante diferite. De exemplu, proteina musculară
tropomiozina din muşchiul striat este diferită de cea din muşchiul neted rezultat al
unui splincing tisular specific în urma căruia se obţin două tipuri de ARNm matur
pentru tropomiozina în cele două tipuri de muşchi: neted si striat .

situs de poliadenilare muşchi scheletic

situs de poliadenilare muşchi neted

5' 3'
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13
ARNm imatur

5' 3'
E1 E2 E4 E5 E6 E8 E9 E10 E11 E12
ARNm matur muşchi striat (10 exoni)

5' 3'
E1 E2 E4 E5 E6 E8 E9 E10 E13
ARNm matur muşchi neted (9 exoni)

Figura 45. Splicing alternativ pentru tropomiozină

Figura 46. Splicing alternativ al ARNm generat de gena pentru calcitonina


Un alt exemplu de splicing alternativ este in cazul ARNm al genei pentru
calcitonina. Calcitonina este un peptid (32 aminoacizi) cu rolul de hormon in reglarea
calcemiei, secretat de celulele parafoliculare de pe tiroida. Aceeasi gena pentru
calcitonina este maturata diferit in tesutul neural, rezultând alt ARNm care prin
translaţie generează peptidul CGRP (peptid înrudit cu calcitonina) de 37 de
aminoacizi, cu rol de agent cardiovascular.

Modificările bazelor azotate


La sfârşitul procesului de maturare au loc modificări ale bazelor azotate
componente prin reacţii de transfer de grupări metil, hidroximetil, acetil sau
obţinerea unor baze modificate noi ca de exemplu pseudouridină, acid ribotimidilic.

Rolul intronilor
La vertebrate intronii sunt precursorii moleculelor ARN mici din nucleol (sno
RNA). Acestea participă la maturarea ARN ribozomal sau servesc ca elemente
matriţă în sinteza telomerilor.
Tulburările procesului de splicing pot genera patologii diverse. Astfel în cazul
-talasemiei etiologia se poate datora unor mutaţii ale genelor ce codifică
ribonucleoproteine U ce recunosc intronii din gena -globinei. Pacienţii cu lupus
eritematos prezintă autoanticorpi ce recunosc snoRNA de tip U1.
În cazul rearanjării cromozomilor; segmentele codante (exonii) trebuie
transferate intacte, asfel că locurile de contact şi rupere dintre cromozomi trebuie să
fie în regiuni necodante (introni) care se află pe ambele laturi ale segmentelor
codante. Din acest motiv mărimea intronilor este mult mai mare decât cea a exonilor.
Se consideră că la origini fiecare exon a fost o genă ce codifica o proteină
mică, caracterizată printr-un singur domeniu proteic. Obţinerea unor proteine
complexe, formate din mai multe domenii s-a realizat prin sudarea mai multor gene
mici într-o genă mare. În cadrul acestora, exonii reprezintă segmentul codant al
genelor ce s-au unit, iar intronii secvenţele necodante de la capetele 3’ si 5’.

Maturarea ARNr
Genele pentru ARNr sunt localizate în nucleol existând sute de copii ale
fiecărui tip de ARNr organizate în tandemuri repetitive. Fiecare unitate repetitivă
conţine o copie din fiecare tip de ARNr şi anume 28 S; 18 S; 5,8 S despărţite între
ele de regiuni necodante. Fiecare unitate repetitivă este transcrisă unitar asigurându-
se astfel sinteza echimoleculară a tutror tipurilor de ARNr.
După transcripţie şi maturare, din unitatea repetitivă rezultă un singur ARN cu
masa 45s. Acesta se leagă de complexe mici nucleare ribonucleoproteice
(snoRNPs) care îl fragmentează în segmente de 28S,18S şi 5,8S. Acestea vor fi
transportate în citoplasmă unde, împreună cu proteinele ribozomale, vor constitui
cele 2 subunităţi ribozomale:
➢ ARNr 18S + 34 tipuri de proteine = subunitatea 40S (sau mică)
➢ ARNr 5,8S; 28S; 5S + 50 proteine = subunitate 60S (sau mare)

Figura 47. Maturarea ARNr

Maturarea ARNt
Prin transcripţia genelor pentru ARNt rezultă o moleculă mare nefuncţională
ce conţine extensii la ambele capete şi introni. Extensia 5’ este îndepărtată de o
ribonuclează. iar cea 3’ de o exonuclează. La capătul 3’ obţinut se adaugă tripeptidul
CCA. Intronii sunt îndepărtaţi prin acţiunea cuplată a unei endonucleaze şi ligaze. În
continuare urmează modificări chimice.
ARNt sunt cei mai modificaţi acizi nucleici, circa 1/3 din bazele azotate fiind
modificate si având peste 60 de tipuri de modificări, realizate de peste 100 de
enzime. Modificările (reduceri, izomerizări, ataşări de grupări funcţionale) se produc
la nivelul bazelor azotate din structura nucleotidelor. Exemple de baze modificate:
baze metilate, pseudouridină, quenosină, 4 sulf-tiouridină etc.

I.6.3. Activitatea de corectare a transcripţiei


Nu există sisteme de corectare ale erorilor produse la sinteza ARN, rata de
erori a transcriptiei fiind de 1 ribonucleotidă incorporată greşit: 104 ribonucleotide
incorporate în molecula ARN. Acest grad ridicat de eroare este tolerat, deoarece
molecula ARN are un timp de viaţă scurt iar mutaţiile produse la nivelul ARN nu sunt
transmisibile. Timpul de viaţă pentru ARNm este variabil, fiind de maxim 30 ore, în
timp ce pentru ARNt ajunge la 5 zile.
Produşii de transcripţie
Una din definiţiile genei este de segment ADN ce produce o moleculă
funcţională de tip ARN. Doar 3-5% din totalul ARN este reprezentat de ARNm ce va
codifica proteine, restul fiind format de ARNt, ARNr, sno-RNA, snRNA, microARN,
ARN antisens. Dintre acestea ARNt şi ARNr participă alături de ARNm la sinteza
proteică, în timp ce restul tipurilor de ARN sunt implicaţi în reglarea expresiei genelor
intervenind în special la nivelul proceselor posttranscripţionale ale ARNm, ARNt, şi
ARNr.

I.6.4. Blocarea transcriptiei


Cunoaşterea mecanismelor transcripţiei a făcut posibilă punerea la punct a
unor mijloace terapeutice. De exemplu o serie de agenţi chemoterapeutici, de tip
antibiotic, funcţionează pe baza inhibarii transcripţiei la microorganisme, blocându-le
procesele vitale si implicit dezvoltarea si multiplicarea . De exemplu:
1. Rifampicina - acţionează prin blocarea subunităţii  a ARN polimerazei
bacteriene, fără a afecta ARN polimeraza de la eucariote.
2. Actinomicina D - este o substanţă ce se intercalează între perechile G - C din
segmentul promotor al genelor, blocând astfel iniţierea transcripţiei.
I.7. Biosinteza proteinelor (translaţia)

Informaţia privind sinteza unei proteine se găseşte în fragmente din molecula


de ADN din nucleu numite gene. Acestea sunt copiate în procesul de transcripţie sub
formă de ARNm care în citoplasmă împreună cu ribozomii va dirija sinteza proteinei
folosind aminoacizii din citoplasmă într-o succesiune controlată de informaţia din
genă.

Figura 48. Translaţia

I.7.1. Elementele procesului de translaţie


ARNm transportă informaţia de la genă la ribozomi participând direct la
procesul de sinteză proteică. Informaţia transportată este codificată sub forma
codonilor (triplete de nucleotide succesive). Fiecare codon va dirija locul şi felul
fiecărui aminoacid din viitoare proteină.
ARNt recunoaşte, leagă, activează şi transportă aminoacizii din citoplasmă la
complexul de sinteză. Fiecare ARNt transportă un singur tip de aminoacid, dar un
singur aminoacid poate fi transportat de mai multe tipuri de ARNt. La om s-au
identificat 32 de tipuriARNt. Fiecare ARNt are în bucla a 2-a o tripletă caracteristică
numită anticodon. Acesta este complementară cu codonii din ARNm.
ARNr are rolul de constituire al ribozomilor, de orientare a moleculelor de
ARNt, de fixare şi derularea ARNm.

Ribozomii reprezintă sediul sintezei proteice. Sunt:


1) Independenţi – sintetizează proteine de structură:
2) Legaţi de reticulul endoplasmic cu care formează reticulul endoplasmic rugos –
sintetizează proteine de secreţie.
Fiecare ribozom este constituit din 2 subunităţi :
- subunitatea mică (30 S la procariote, 40 S la eucariote)
- subunitatea mare (50 S la procariote, 60 S la eucariote ).
Subunitatea mare prezintă 3 loci numiţi aminoacil (A), peptidil (P) şi de
eliminare (E) în care vor fi ataşaţi ARNt. Tot aici se găseşte ARNr 23S ce prezintă
activitatea catalitică numită peptidiltransferaza ce poate tranfera un ARNt dintr-un
locus în altul.
Subunitatea mică fixează ARNm; fixarea este laxă ca banda unei maşini de
scris, permiţând derularea acestuia şi incadrarea codonilor din secvenţa ARNm în
locii aminoacil, peptidil şi de eliminare din constituţia subunitaţii ribozomale mari.

Comparaţie între structura ribozomilor în procariote, eucariote şi


mitocondrie

Bacterie (70S) Eucariot (80S) Mitocondrie (55S)

Subunitate mare 50S 60S 39S

23S (2904 nts) 28S (4700 nts) 16S (1560 nts)


ARNr
5S (120 nts) 5S (120 nts)
(1 of each)
5.8S (160 nts)

Proteine 33 ~49 48

Subunitate mică 30S 40S 28S

ARNr 16S (1542 nts) 18S (1900 nts) 12S (950 nts)

Proteine 21 ~33
I.7.2. Etapele biosintezei
Principial, procesul de biosinteză proteică urmează aceleaşi etape atat la
procariote cât şi la eucariote.

Etapele sunt:
1. Activarea aminoacizilor din citoplasmă şi formarea complexelor aminoacil –
ARNt
2. Iniţierea sintezei proteice
3. Alungirea catenei polipeptidice
4. Terminare sintezei şi eliberare proteinei
Aminoacil -ARNt sintetaza

Aminoacid A=adenina

= D-riboza

ATP A

P-P-P
trifosfat

A
P-P- P
pirofosfat

P-P-
fosfat

ARNt

A
P

AMP

Aminoacil ARNt
(un aminoacid "activat")
Figura 49. Formarea complexului activat aminoacil - ARNt

I.7.2.1. Activarea aminoacizilor


Procesul are loc în citoplasmă şi este catalizat de enzima aminoacil-ARNt-
sintetază ce prezintă 3 situsuri active:
- pentru legarea ATP
- pentru legarea aminoacidului la secvenţa ACC de la capatul 3’ al ARNt
- pentru legarea ARNt
Formarea complexului aminoacil-ARNt este un proces consumator de
energie, energie furnizată de hidroliza a două legături macroergice dintr-o moleculă
de ATP. Legătura ARNt – aminoacid nou formată este o legătură macroergică
(7kcal/mol). Pentru fiecare aminoacid există un ARNt specific ce expune un
anticodon specific.

I.7.2.2. Iniţierea sintezei


Sinteza se desfăşoară de la capătul N terminal la capătul C terminal al
proteinei.
Aminoacidul ce iniţiază sinteza este în totdeauna formil – metionină la
procariote şi metionină - la eucariote. Acest aminoacid se leagă de un ARNt
special(ARNt de iniţiere). Acesta va fi recunoscut de un factor de iniţiere specific
numit IF2.
În afara procesului de biosinteză ribozomii se găsesc sub formă disociată a
celor două subunităţi, reasocierea lor fiind realizată de către ARNm.
În cadrul procesului de iniţiere are loc formarea complexului de preiniţiere la
care participă :
1. ARNm care se leagă de proteine ribozomale. Ribozomul începe translaţia la
codonul AUG care este localizat într-o secvenţă specifică numită secvenţă de
consens Kozak (CAAAAUG), conținînd codonul AUG de care se va fixa prin
complementaritate ARNt-Met.
2. Factorii de iniţiere, se numesc eiF şi sunt în număr de cel puţin 6. Aceștia
recunosc şi leagă subunitatea ribozomală de ARNt-Met.
Fixarea subunităţii ribozomale mari de subunitatea ribozomală mică se face în
aşa fel încât ARNt-Met să fie încadrată concomitent cu codonul AUG al ARNm în
locusul peptidil (P).
Locuri partiale
f Met
f Met
ARNm

E P A
IF 1 IF 2 IF 3
30 S

GTP ARNm

5' IF 2 3'
IF 1 IF 3 30 S

AUG NNN

Subunitatea 50 S Legarea
subunitatii mari

GDP+Pi
IF1,IF2,IF3
50 S
f Met

E P A

ARNm
AUG NNN

5' 30 S 3'

Figura 50. Formarea complexului de iniţiere a sintezei proteice

I.7.2.3. Elongarea
În locusul aminoacil (A) liber din complexul de iniţiere se va fixa prin
complementaritate complexul ARNt - aminoacid 2, al cărui anticodon este
complementar codonului ARNm încadrat de locul aminoacil.
Această fixare se face prin acţiunea unui factor de elogare (EF-Tu) şi prin
hidroliza unei molecule GTP. După această fixare enzima peptidil transferaza (o
riboenzimă din subunitatea 50S) hidrolizează aminoacidul din locusul peptidil (P) şi îl
leagă de aminoacidul 2 din locusul aminoacil (A) printr o legătură peptidică. Practi
are loc un atatc nucleofil al grupării alfa-amino a aminoacidului din situsul A asupra
grupării carboxil a aminoacidului din poziţia P. Astfel acum vom avea un ARNt liber
în poziţia P şi un dipeptid (H2N - Met – aminoacid 2) în poziţia A.
Legarea aminoacidului din poziţia P (Met) se face la nivelul grupării carboxil
astfel că primul aminoacid ataşat de ARNm, în cazul de faţă Met, va constitui
capătul N terminal al viitoare proteine.
În continuare sub acţiunea unui factor de elongare EF-G (translocază) şi cu
consumul unei noi molecule GTP are loc mişcarea ribozomului (translocarea) de-a
lungul ARNm pe direcţia 5’ → 3’, pe o distanţa de 3 nucleotide (un codon). În urma
acestui proces ARNt liber din poziţia P ajunge în poziţia E de unde va fi eliberat. În
acelaşi timp ARNt-dipeptid din poziţia A ajunge în poziţia P. În poziţia A devenită
liberă este încadrat acum următorul codon pe direcţia 5’ → 3’ din ARNm. În poziţia
A se va fixa ARNt-aminoacil 3, al cărui anticodon este complementar codonului
încadrat de locusul A. După această fixare peptidil transferaza detaşează
dipeptidul (H2N - Met – aminoacid 2) din poziţia P şi îl leagă printr-o legătură
peptidică de aminoacidul 3 formându-se tripeptidul H2N - Met – aminoacid 2 –
aminoacid 3 .
În continuare translocaza deplasează din nou ribozomul de-a lungul ARNm
pe direcţia 5’-3’ pe distanţa a încă 3 nucleotide. În urma acestei mişcări ARNt liber
din P trece în poziţia E şi va fi eliberat. ARNt- tripeptid trece din poziţia A în P, poziţia
A redevenind din nou liberă pentru a fi ocupată de ARNt-aminoacid 4 al cărui
anticodon este complementar noului codon încadrat în poziţia A a subunităţii mari a
ribozomului .
Procesul se repetă, urmând aceleaşi etape, fiecărui codon din sectorul
codant al ARNm fiindu-i ataşat câte un aminoacid transportat de ARNt cu anticodon
complementar.
Figura 51. Etapa de alungire a sintezei proteice

I.7.2.4. Terminarea sintezei şi eliberarea proteinei


Semnalul de terminare al sintezei îl constituie apariţia în secvenţa ARNm ce
ajunge la citire in locusul A a unor codoni non-sens (UAA, UAG, UGA).În terminare
sintezei intervin 3 factori de eliberare (RF1şi RF2 ce recunosc codonii stop, iar RF3+
o moleculă GTP eliberează proteina şi disociază complexul de iniţiere în elementele
componente). Viteza procesului de sinteză proteică este mare, un ribozom
sintetizând 400 de legături peptidice/minut.
În general de o moleculă ARNm se ataşează simultan mai mulţi ribozomi,
complexul numindu-se polizom. Ribozomii din acest complex sintetizează
concomitent acelaşi tip de proteină. În acest fel o moleculă de ARNm constituie
matriţa pentru sinteza unui mare număr de proteine identice.
Energetica procesului de translaţie
Legarea unui aminoacid printr-o legătură peptidică necesită consumul a 4
legături macroergice dintre care 2 pentru activarea aminoacidului şi formarea
complexului aminoacil-ARNt, iar alte 2 în procesul de elongare şi anume o
moleculă GTP hidrolizată pentru activarea factorului EF-TU şi o moleculă GTP
pentru acţiunea translocazei.

I.7.3. Efectul Wobble


Legarea complementară codon – ARNm - anticodon-ARNt nu este perfectă
constatându-se că este obligatorie complementaritatea doar a primelor două
nucleotide din codon, în timp ce pentru cea de-a 3-a există mai multe variante. De
exemplu 3 codoni pentru glicină (GGU; GGC; GGA) din ARNm pot fi recunoscuţi şi
legaţi de un singur tip de ARNt cu secvenţa anticodonului CCI.
Acest efect, descoperit de Crick, este cuplat cu degenerarea codului genetic,
ambele având ca scop limitarea efectului mutaţiilor. Datorită efectului Wobble dacă
mutaţia afectează doar a 3-a nucleotidă dintr-un codon ARNm, ea nu va avea
repercursiuni asupra structurii proteice.

I.7.4. Fidelitatea procesului de translație


Rata de eroare în sinteza proteică poate fi estimată prin măsurarea frecvenţei
de incorporare a unui aminoacid în structura unei proteine ce în mod normal nu
conţine acel aminoacid în secvenţă. Rata de eroare în acest caz este de un
aminoacid greşit încorporat la 104 aminoacizi încorporaţi corect, conform secvenţei
ARNm, ceea ce înseamnă că aproximativ 1 din 25 molecule proteice de mărime
medie (400 aminoacizi) poate să conţină o eroare de sinteză .
Fidelitatea sintezei proteice depinde de acurateţea celor două mecanisme de
adaptare: legarea fiecărui aminoacid de molecula de ARNt corespunzătoare şi
complementaritatea perechilor de baze din codonii ARNm cu anticodonii ARNt.
Celulele si-au dezvoltat mecanisme de reparare “proofreading” pentru a reduce
numărul de erori din aceste două etape cruciale ale sintezei proteice.
I.7.5. Realizarea conformaţiei finale a proteinelor (folding)
În cazul sintezei proteinelor mari ce conţin punţi S-S, deşi conformaţia este
controlată de structura primară, totuşi obţinerea conformaţiei nu se face în mod
spontan. Dacă se denaturează o proteină mare şi apoi se îndepărtează agentul
denaturant ea va adopta o conformaţie, dar lipsită de activitate biologică. Acest
lucru demonstrează că în sinteza proteinelor mari adoptarea conformaţiei este un
proces asistat. Astfel, s-a constatat că în cazul şocului termic asupra celulelor cresc
foarte mult un tip de proteine ce a fost denumit proteine de şoc termic (Hsp = Heat
shock proteins).
Ulterior, studiile au arătat ca aceste proteine sunt identice cu proteinele ce
asistă adoptarea conformaţiei corecte la sinteza proteinelor mari. Identitatea celor
două tipuri de proteine este dată de faptul că în renaturarea după şocul termic sau în
sinteza „de novo” a proteinelor trebuie obţinută aceeaşi conformaţie.
Datorită rolului lor, variantele proteice de tip Hsp70 şi Hsp60 au fost denumite
Chaperone (= proteine de asistenţă). Prima proteină din această categorie, GroEL şi
apoi GroES, a fost descrisă de Anfinsen intr-un model care i-a adus denumirea de
„cuşca lui Anfinsen”.
Proteina în curs de sinteză este în pericol ca începând cu capătul N-terminal,
să interacţioneze cu diverse proteine din citoplasmă. Chaperonele fixează capătul N-
terminal şi proteina în curs de sintetizare, ca într-o cuşcă de protecţie ferind proteina
de astfel de interacţiuni, astfel că proteina îşi dezvoltă conformaţia corectă dictată de
structura primară.

Proteină pliată
Proteină nepliată GroES

ATP ATP

Proteină pliată
Figura 52. Obţinerea asistată a conformaţiei corecte a proteinelor utilizând
chaperone – modelul cuştii lui Amfisen

La acest proces asistat de folding participă două tipuri importante de enzime:


1. Protein-disulfit –izomeraza(PDI)care rupe punţile S-S incorecte şi le reface
în locurile corecte. Concentraţia PDI este crescută în RE unde sunt
sintetizate proteinele de secreţie.
2. Peptidil-prolin-izomeraza(PPI) care aranjează resturile de prolină în poziţiile
cis şi trans.

I.7.6. Dirijarea şi secreţia proteică


Când lungimea polipeptidului în curs de sintetizare in complexul ribozom
ARNm ajunge la aproximativ 30 de aminoacizi, capătul său N-terminal poate urma
una din alternativele:
1. Importul cotranslaţional. Este caracteristic proteinelor de secreţie.
Polipeptidul se va asocia cu membrana reticulului endoplasmic şi va fi transferat prin
membrană în lumenul reticulului endoplasmic, acest proces desfăşurându-se în
paralel cu sinteza proteică.
La terminarea sintezei, polipeptidul fie rămâne în reticulul endoplasmic, fie va
fi transportat de către diverse vezicule, complex Golgi sau o altă destinaţie finală.
Proteinele membranare de structură sunt inserate după sinteză în membrana
reticulului endoplasmic (majoritatea lor), iar o mică parte sunt transportate în lumen.
2. Importul posttranslaţional. Este destinat proteinelor de membrană .Dacă
polipeptidul este destinat să funcţioneze în citosol , nucleu, mitocondrie sau
peroxizomi, sinteza sa se va desfăşura numai în citosol. Când sinteza polipeptidului
este completă, acesta este eliberat de către ribozom în citosol unde va rămâne sau
va fi transportat în organite apropiate prin import posttranslaţional. Trecerea
polipeptidului în nucleu se realizează prin porii nucleari, fiind implicat un mecanism
diferit faţă de cel întâlnit la alte organite celulare.
Figura 53. Desfăşurarea sintezei proteice în funcţie de destinaţia finală a
proteinei
Proteinele de secreţie sunt sintetizate în reticulul endoplasmic rugos (RER).
Procesul constă în cuplarea poliribozomilor de membrana externă a RE. Pentru
aceasta complexul de sinteză ARNm-ribozomi trebuie să ajungă din citoplasmă la
nivelul RE.
Acest lucru este posibil datorită faptului că proteinele de secreţie expun
imediat după sinteza primilor 30 de aminoacizi la capătul N terminal un semnal
peptidic hidrofob. Acest semnal este imediat recunoscut de o proteină citoplasmatică
SRP-este numit semnal de recunoaştere.
Secvenţa semnal pentru reticulul endoplasmic se va lega de particula de
recunoaştere a semnalului, care este un complex de ribonucleoproteine alcătuit din
6 peptide şi o moleculă de ARN cu 300 nucleotide.
Particula de recunoaştere a semnalului (SRP) se leagă de receptorul pentru
SRP pentru a fixa ribozomul de membrana reticulului endoplasmic. Când receptorul
pentru SRP leagă GTP, polipeptidul rezultat va traversa porii. SRP va fi eliberată prin
hidroliza GTP. Polipeptidul format va fi translocat printr-un por hidrofil creat de una
sau mai multe proteine membranare, numite translocon.
Proteina va intra în RE înaintând pe măsura sintezei. Când sinteza
polipeptidului s-a încheiat, o peptidază va cliva secvenţa semnal de la capătul N-
terminal, iar proteina va fi eliberată în lumenul reticulului endoplasmic. După
aceasta, ribozomul este eliberat, iar porii se închid complet. În RE, plierea
proteinelor nou-sintetizate, necesită noi mecanisme moleculare şi alte proteine
implicate în plierea proteinelor. Proteina de legare(BP) este un membru al familiei
Hsp 70 şi are rolul de a se lega şi stabiliza regiunile hidrofobe ale proteinelor (cele
bogate în Trp, Phe, Leu), permiţând plierea potrivită a proteinelor. Izomeraza
proteinelor cu grupări disulfat catalizează formarea şi desfacerea legăturilor
disulfidice dintre reziduurile de cisteină, ducând la o conformaţie stabilă.

Figura 54. Sinteza proteinelor de secreţie

De la nivelul RE proteina va migra spre ţesutul ţintă în funcţie de secvenţa


semnal de la capătul N terminal. Capetele semnal ale proteinei sunt cele care
hotărăsc legarea de situsurile de recunoaştere ale structurii ţinută: multe din aceste
capete sunt rezultatul unor:
1. Situsuri alternative de iniţiere a translaţiei
2. Splincing alternativ al ARNm
Rezultatul acestor procese: o genă =multiple proteine cu localizări şi cu
structuri diferite. De ex. în celula hepatică sunt sintetizate 2 fumaraze provenite din
aceeaşi genă, dar una este inclusă în mitocondrie, iar cealaltă rămâne în citoplasmă.

ARNm

Veziculă
de transfer

RE rugos

Golgi

Veziculă
secretoare

Membrană
plasmatică
Spaţiu extracelular

Figura 55. Dirijarea sintezei şi eliberării extracelulare a proteinelor de secreţie

Proteinele de membrană se sintetizează în mod analog, caz în care ribozomii


se ataşează de membrana plasmatică .
Importul posttranslaţional permite unor polipeptide să pătrundă în organite
după ce sinteza proteică s-a încheiat.Proteinele nucleare şi mitocondriile sunt
sintetizate iniţial de ribozomii citoplasmatici liberi. Proteinele nucleare sunt
direcţionate apoi spre nucleu ele având secvenţe de recunoaştere bogate în Liz şi
Arg. Proteinele mitocondriale sunt direcţionate de secvenţe bogate în Ser şi Thr.
La fel ca şi importul cotranslaţional către RE, importul posttranslaţional într-o
mitocondrie necesită o secvenţă semnal (secvenţă tranzit), un receptor membranar,
proteine membranare şi o peptidază.
Când polipeptidele sunt incluse în mitocondrie, se produce deschiderea
membranelor simultan. În mitocondrie, receptorul membranar recunoaşte direct
secvenţa semnal fără intervenţia unei particule de recunoaştere a semnalului
citosolic.

I.7.7. Modificări posttranslaţionale


Forma finală a unei proteine, fixarea şi funcţionarea acesteia sunt rezultatul
unor procese multiple şi complexe, în care catena polipeptidică nou sintetizată
suferă modificari chimice, de mărime şi conformaţie. Dintre aceste procese se pot
enumera:
1. Scindări ale catenei polipeptidice, în urma cărora se elimină fragmente ce
menţineau proteina în stare inactivă sau fragmente cu rol temporo-spţial ce au dirijat
transportul şi inserarea proteinei în structura celulară finală. Un exemplu este
hormonul proteic insulina sintetizată iniţial sub forma unei proteine mari,
nefuncţionale numită preproinsulină. Preproinsulina este scindată succesiv în două
etape trecand mai întâi în proinsulina, iar aceasta ulterior este transformată în
hormon activ prin înlăturarea enzimatică a unui al doilea segment polipeptidic . Cele
două catene polipeptidice rămase rămân legate covalent prin legături disulfidice
dintre reziduurile de cisteină din structura insulinei.
2. Recent descoperit, procesul de „splicing” proteic (analog cu splicing-ul
ARN), înlătură inteinele (analogi proteici ai intronilor din ARNm) şi ataşează
exteinele (analogi proteici ai exonilor din ARNm) pentru a realiza secvenţa proteinei
mature.
3. Modificări chimice ale aminoacizilor în procesul de translaţie
În cursul sau după sinteză proteinele suferă modificări chimice care sunt fie
indispensabile realizării activităţii lor biologice fie din contra predecesoare inactivării
şi distrugerii lor.
Modificările pot fi : - enzimatice/ neenzimatice
- reversibile /ireversibile
A. Modificări neenzimatice
a) Racemizarea aminoacizilor, ei trecând din forma L în D
b) Glicarea (glicozilarea) se referă la legarea neenzimatică printr-o legătură ceto-
amidică a glucozei de grupările amino ale proteinelor plasmatice.Ex.
glicolizarea hemoglobinei .
c) Carbamilarea- realizată de ureea din sânge asupra proteinelor plasmatice.
d) Oxidarea catenelor laterale ale aminoacizilor din proteine. Acest fenomen
afectează în proporţie de 30-40% proteinele parţial distruse şi nefuncţionale de
la persoanele în vârstă.
B. Modificări enzimatice
- ataşarea de resturi glucidice → glicoproteine
- acilarea proteinelor
- formarea de legaturi intra sau intercatenare
a. Ataşarea de resturi glucidice cu obţinerea de glicoproteine
La eucariote fixarea resturilor glucidice la catenele polipeptidice este una din
cele mai importante modificări afectând mai ales proteinele de secreţie şi proteinele
membranare .
Ataşarea de glucide asigură:
- realizarea structurilor necesare pentru funcţia biologică
- protecţie împotriva proteazelor
Rezultă 2 tipuri de glicozilări : a) N-glicolizarea – modificare cotranslaţională
b) O-glicolizarea – modificare posttranlaţională
N-glicozilarea
Catena glucidică este fixată în reticulul endoplstic print-o legătură N-
glicozidică cu gruparea amino din poziţia  a unui rest de asparagină.
O-glicozilarea
Are loc în aparatul Golgi . Şi în acest caz catena polipeptidică se construieşte
pas cu pas prin adăugarea una câte una a resturilor glucidice la catena laterală a
unui rest de Ser,Thr sau 5-OH-Liz. De obicei O - glicolizarea are loc concomitent la
nivelul mai multor resturi de Ser sau Thr concentrati într-o anumită regiune a
proteinei. Acest tip de glicozilare este important în matricea extracelulară ce face
legătura între celule .
b. Acilarea proteinelor
Se realizează prin acilarea grupărilor amino ale resturilor de aminoacizi bazici
cu acizi graşi (miristic, palmitic).
- N-miristoilarea – în care restul mirstoil se fixează la capătul N-terminal a
rproteinei; prin această legătură proteina se leagă de faţa externă a
membranei plasmatice.
- Glipiarea – la capătul C – terminal se fixează o moleculă complexă ce
conţine glicero-fosfo – inozitol.
- Palmitoilarea – în care restul palmitoil se leagă printr-o legătură ester sau
tioester de aminoacizi hidroxilaţi sau de Cis. Şi această legare permite
ancorarea de partea externă a membranei plasmatice .
- Izoprenilarea – legarea de resturi izoprenice de Cis de la capătul C-
terminal. Proteinele izoprenilate (Ras) se fixează de partea internă a
membranei plasmatice.
c. Formarea de legături intra sau inter – catenare
Formarea de punţi de S , punţi ditirozină, legături Gln-Liz, metilarea catenei
laterale la Arg ,His,Liz,  carboxilarea Glu, iodinarea Tir .

I.8. Expresia genică

Este procesul prin care o genă duce la sinteza unei proteine. O genă nu este
tradusă direct într-o proteină ci este exprimată prin formarea unui compus
intermediar numit ARN mesager.
Porţiunea din ARNm care corespunde secvenţei aminoacizilor din proteină se
numeşte regiune codantă. Dar pe langă aceasta, ARNm conţine secvenţe adiţionale
netranslatabile, la fiecare capăt 3’ si 5’, care nu codifică aminoacizi. Mutaţiile în
aceste regiuni terminale determină alterarea expresiei genice ceea ce demonstrează
rolul lor indirect în exprimarea genei.
Proteinele sunt considerate produsul final al expresiei genelor . Astfel
controlul sintezei proteice este de fapt controlul expresiei genelor .Teoretic acest
control poate avea loc la nivelul tuturor etapelor procesului genă → ARNm →
proteine. În general controlul are loc majoritar la nivelul transcripţiei, procesul
oferind economicitate şi rapiditate .
Figura 56. Expresia genică

I.8.1.Controlul expresiei genelor


Este un fenomen complex datorită cantităţii mari de ADN, organizării
superioare a acestuia, a localizării în nucleu a ADN şi a timpului de ½ al ARNm mult
mai lung la eucariote. La om doar 2-5% din ADN este transcris sub formă ARNm.
Într-un organism există diferite tipuri de celule diferenţa între acestea fiind
uneori frapantă: ex. o trombocită comparată cu o celulă neuronală. Experimentele au
confirmat că acestă diversitate nu este produsul pierderii unor gene în cursul
diferenţierii celulare ci al modificărilor expresiei genelor. Acest lucru se
demonstrează simplu injectînd într-o celulă ou anucleată de mamifer nucleul unei
celule diferenţiate de mamifer adult , oul astfel rezultat generând un animal sănătos,
identic cu cel de la care a provenit nucleul.
Proteinele reprezintă reflexia finală expresiei genelor ele putând fi clasificate
astfel:
a) proteine comune tuturor celulelor dintr-un organism cum ar fi: proteine structurale
din cromozomi ARN polimeraze, enzime de reparaţie ale ADN, proteinele
ribozomale, proteine din citoschelet,etc.
b) proteine caracteristice unor anumite ţesuturi.De exemplu.hemoglobina se găseşte
doar în seria eritrocitară.
Celulele umane produc în medie ARNm corespunzător a 10 - 20000 de gene
dintr-un total estimat de 30000 - 40000 gene. Modificările post transcripţionale şi
post translaţionale fac posibil ca 1 genă să genereze o întreagă familie de roteine.
Reglarea se face prin 2 tipuri de mecanisme:
1) Reglaj genetic pe termen scurt sau reversibil în urma cărora se modifică
activitatea unor gene fapt exprimat prin fluctuaţii în sinteza de ADN, ARN şi proteine.
2) Reglaj genetic pe termen lung (ireversibil) ce implică mecanisme legate de
diferenţierea celulară şi care au loc în cursul dezvoltării ontogenice. Acest tip de
reglaj este întipărit în secvenţa ADN.
Nivelele la care controlul expresiei genelor este realizat.
1. controlul transcripţional ce reglează unde, când şi cât este realizată
transcrierea genei.
2. controlul procesării ARN
3. controlul transportului şi localizării ARN
4. controlul translaţional.
5. controlul degradării ARNm.
6. controlul activităţii proteinelor.
Figura 57. Puncte de control al reglajului expresiei genelor

I.8.1.1. Controlul la nivelul transcriptional


Deşi în principiu fiecare pas în expresia genelor poate fi controlat, controlul
iniţierii transcripţiei genelor rămâne forma predominantă în reglare expresiei
majorităţii genelor.

1. Represia transcripţiei este un mecanism esential in controlul expresiei


genice. Procesul este realizat de proteine represoare care actioneaza asupra
genelor tinta direct, prin domeniile de legare a ADN, sau indirect prin interactia cu
proteinele legate de ADN .
Pentru a inhiba procesul transcriptional , o proteina represor realizează (1)
mascarea unui domeniu de activare a transcriptiei (2) blochează interacţia dintre un
activator si alte elemente ale complexului de transcripţie (3) îndepartează un
activator de ADN.
Figura 58. Controlul expresiei genice la nivel transcriptional

A. Metilarea ADN
Expresia genelor la eucariote poate fi reglată atât la nivel genetic prin
schimbări la nivelul secvenţei nucleotidice a ADN cât şi epigenetic, prin mecanisme
independente de modificări ale secvenţei nucleotidice a ADN.
Sunt două mecanisme importante de control epigenetic al expresiei genelor şi
anume metilarea ADN şi modificările post-translaţionale ale histonelor care produc
schimbări în structura cromatinei.
În general, o structură conformaţională relaxată a cromatinei denotă regiuni
genice potenţial active şi este asociată cu hipometilarea ADN şi histone acetilate, în
timp ce ADN-ul din cromatina compactă este inactiv din punct de vedere
transcripţional , hipermetilat şi legat de histone neacetilate.
Mecanismele epigenetice se manifestă în timpul diferenţierii şi dezvoltării
celulare şi sunt determinante pentru diferite procese care au loc la nivel celular. Spre
exemplu, metilarea ADN este implicată în reglarea unor procese precum dezvoltarea
embrionară, transcripţia, realizarea structurii cromatinei, inactivarea cromozomului X,
amprentarea genomică şi stabilitatea cromozomilor.
Procesul de metilare este un proces reversibil care are loc la C5 al resturilor
de citozină din secvenţele repetitive de dinucleotide CpG- insule CpG - din structura
ADN.
Metilarea ADN influenţează procesul de transcripţie în două moduri: inhibă
legarea factorilor de transcripţie la secvenţele ADN specifice, represând transcripţia
genei respective, sau duce la recrutarea unor proteine specifice care leagă
secvenţele CpG metilate, reprimând remodelarea cromatinei într-o structură
corespunzătoare desfăşurării procesului de transcripţie. Anumite tipare prestabilite
în care se încadrează structura ADN-ului metilat trebuie menţinute şi sunt esenţiale
pentru dezvoltarea şi funcţionarea normală a organismului adult. Aceste tipare ale
metilării ADN sunt moştenite mai mult sau mai puţin stabil şi sunt programate prin
mitoza celulelor adulte, dar anumite deviaţii de la pattern-ul normal de metilare a
ADN sunt asociate cu diferite boli.

B. Metilarea ADN şi cancerul


Numeroase dovezi experimentale au demonstrat că in cancer au loc simultan
două procese implicând procesul de metilare-demetilare a ADN. Genomul celulelor
canceroase este hipometilat comparativ cu celulele normale ca rezultat al demetilării
la nivelul secvenţelor repetitive din genom, ceea ce duce la instabilitate genomică
(caracteristica generală a celulelor tumorale) generată de rearanjări cromozomiale.
Această instabilitate creată de demetilare poate duce la reactivarea
promotorilor transpozonilor (numiţi şi „jumping genes” care contribuie la reglarea
aberantă a genelor în cancer prin interferenţă transcripţională sau generarea de
transcripţi antisens). De asemenea, apar efecte ale hipometilării specifice fiecărei
gene care duc la creşterea expresiei genei respective aşa cum s-a demonstrat
pentru mai multe gene printre care gena proteinei S100 A4 ce leagă calciul
cunoscută ca marker în cancerul de colon sau gena proteinei inhibitoare a serin
proteazei SERPINB5 în cancerul gastric. Demetilarea la nivelul genomului este un
eveniment care apare timpuriu şi poate fi utilizat ca un marker care se corelează cu
severitatea bolii şi potenţialul metastazic în multe tipuri de tumori. Această
demetilare globală apărută timpuriu în tumorigeneză poate predispune la instabilitate
genică şi schimbări genetice ulteriore, în timp ce demetilarea specifică unei anumite
gene poate fi un eveniment ulterior care permite celulelor tumorale să se adapteze
condiţiilor locale şi să inducă metastaza. În paralel cu această demetilare specifică
unei anumite gene se produce şi o hipermetilare aberantă a anumitor gene, de
regulă la nivelul insulelor CpG care în celulele somatice normale, în majoritatea
cazurilor, sunt nemetilate. Această hipermetilare are ca rezultat schimbări în
structura cromatinei care va inhiba transcripţia genei respective.
Gene implicate în reglarea ciclului celular, în invazia celulelor tumorale,
repararea ADN, remodelarea cromatinei, semnalizarea celulară, transcripţie şi
apoptoză devin aberant hipermetilate şi neexprimate în aproape fiecare tip de
tumoră. Acest lucru conferă celulelor canceroase un potenţial de creştere mai mare,
o creştere a instabilităţii genetice (care permite realizarea unor modificări genetice
avantajoase pentru proliferarea lor) şi le permite să metastazeze.

Figura 59. Influenţa metilării ADN în reglarea transcripţiei genelor tumor


supresoare
2. Controlul vitezei de iniţiere al transcripţiei este realizat prin factorii
amplificatori sau inhibitori ce cresc sau reduc viteza de transcripţie prin formare
complexului de iniţiere. Reglarea prin fosforilare- defosforilare a unor factori de
iniţiere a translaţiei de exemplu eIF-2 .Această reglare este o acţiune de răspuns
faţă de diferiţi factori de mediu (temperatură ,factori de creştere sau alimentari,infecţii
etc.)
3. Splicing alternativ. Cel puţin 1/3 gene umane produc proteine multiple
utilizând acest mecanism.Reglarea splicing-ului ARN generează diferite versiuni ale
aceleiaşi proteine în diferite ţesuturi.Reglarea se face pe baza competivităţii
situsurilor de splicing obţinută prin acţiunea proteinelor reglatoare.
4. Situsuri alternative de iniţiere sau de terminare a transcripţiei ARN
(puncte de start sau stop diferite). Unele gene sunt transcrise pornind de la puncte
de start diferite şi transcrierea se termină în segmente de poliadenilare diferite. Ca
urmare ARNm rezultat va avea capete 3’ sau 5’ diferite. De ex. glucokinaza din
hepatocite şi cea din celulele  pancreatice au dimensiuni diferite, deoarece între
ARNm corespunzător celor două forme enzimatice există diferenţe de 26 000
nucleotide.
5. Modificări de editare ale ARN. În general la eucariote există o
colinearitate între exonii din genă, ARNm, proteină. Există cazuri în care ARNm
după maturare este modificat enzimatic în nucleu. La mamifer acestea constau de
obicei în modificarea unei baze azotate din structura ARNm în timpul transcripţiei,
rezultatul fiind modificarea unui codon din structura ARNm. De exemplu enzima
ARN-adenozin dezaminază transformă un rest de adenină → hipoxantină, fapt ce
modifică Glu → Arg în viitoarea proteină ce reglează un canal ionic din creier,
proteina implicată în dezvoltarea creierului.
În cazul proteinei apolipoproteină B o modificare de editare C → U
generează un codon stop ce produce o proteină mai scurtă în intestin apo B48,
comparativ cu cea din ficat apo B100 .
Asfel în nucleele celulelor intestinale, ARNm pentru apolipoproteina B este
supus acţiunii enzimei citidindezaminză care modifică citidina din codonul CAA care
se transformă în UAA (codon stop) ceea ce va bloca sinteza proteinei la acest nivel.
Din acest motiv spre deosebire de apolipoproteina B din ficat(4536 AA) numită ApoB
100, în intestin vom avea ApoB 48 ce conţine 2152 AA.
6. Reglarea transportului ARN din nucleu în citoplasmă. Se consideră că
doar 1/20 din totalul ARN sintetizat în nucleu trece în citoplasmă. Majoritatea ARN
este degradată în nucleu de un complex proteic numit exozom: principalul criteriu
fiind un proces incomplet de splicing.
7. Localizare ARNm în diferite regiuni ale citoplasmei în funcţie de diferite
secvente semnal ce se găsesc în segmentul terminal 3’ al ARNm între codonul stop
şi secvenţa terminala 3’ poli A. De exemplu ARNm pentru actină este localizat în
fibroblaste la nivelul unei zone bogate în filamente de actină.

I.8.1.2. Controlul la nivel translational


În ceea ce priveşte etapele unde se realizează controlul:
1. Blocarea situsului de start al translaţiei de către proteine supresoare,
reglate de efectul fiziologic al proteinei translatate. Astfel o fero-proteină, blochează
translaţia ARNm al feripinei atunci când concentraţia celulară a Fe2+ creşte.
2. Centre interne multiple ale ARNm pentru iniţierea sintezei proteice.
Aceste centre iniţiază sinteza sărind peste iniţierea prin codon AUG + factor de
iniţiere a translaţiei. Acest mecanism este utilizat de virusuri ce blocheză sinteza
proteică a gazdei şi orientează sinteza pe proteine virale ce posedă centre interne
diferite pentru iniţierea sintezei proteice.
3. Controlul stabilităţii ARNm. Principala cale utilizată in degradarea ARN
este scurtarea cozii de poliadenină (pe direcţia 3’ → 5’), iar când mai rămân
aproximativ 30 resturi adenină, este îndepărtată şi protecţia de la capătul 5’ şi ARNm
este degradat rapid. Fiecare ARN are in segmentul terminal loci pentru legarea de
proteine ce cresc sau scad viteza de scurtare a regiunii poliadenină.
O cale de prelungire a vietii ARNm este lungirea poliadeninei cu noi unităţi.
De exemplu estradiolul creşte durata de viaţă a ARNm a vitelogeninei de la 30 h la
200 h; mecanismul se desfăşoară printr-o poliadelinare la nivelul citoplasmatic;
prolactina favorizează lactaţia prelungind durata de viaţă a ARNm pentru cazeină.
4. Controlul factorilor ce intervin în translaţie (factori de iniţiere, elongare
si terminare). Factorii de translaţie pot fi blocaţi sau activaţi prin acţiunea unor
inhibitori sau a unor procese de fosforilare/defosforilare.

I.8.1.3. Controlul expresiei genelor prin molecule ARN


S-a constatat că doar 2% din ADN-ul uman codifică proteine restul de 98%
considerându-se că este implicat în reglarea genelor din cei 2%. În sprijinul teoriei
stă faptul că 98% din ARN obţinut prin transcripţie provine din zona necodantă
pentru proteine.
Funcţiile acestor tipuri de ARN sunt de :
- legare şi blocare a ARNm (inhibitori translaţie).
- legare şi blocare a ADN (control transcripţie)
- legare şi blocare proteine (blocare transcripţie)
Aceste procese sunt incluse în termenul genetic de interferenţă ARN. Până
acum sau identificat 2 tipuri de ARN:
- micro ARN
- ARN scurt de interferenţă sau neutralizare a ARN(SiRNA)
Micro ARN, sunt produşi de gene din ADN. Gena microARN este mult
mai lungă decât micro ARN deoarece include şi o secvenţă complementară
(secvenţă inversă). Prin transcripţia acestei gene se obţine o singură moleculă ARN
care, ca urmare a complementarităţii, va forma o structură ARN dublu catenară cu o
buclă la capăt (ac de păr). În continuare o enzimă specială Drosha - taie baza buclei
formând un pre-micro ARN. Aceasta este o structură activă fiind transportata de o
proteină specifică la nivelul unei enzime speciale Dicer care il transforma in micro
ARN matur. Acesta are o secventa complementara cu segmente apartinand unuia
sau mai multor tipuri de ARNm. La nivelul porţiunii respective hibridizează cu
acestea blocând legarea ARNm de ribozomi. Se blocheaza translaţia si implicit
expresia genei ce a generat tipurile respective de ARNm.
O genă ce produce un micro ARN poate astfel controla expresia mai multor
gene producătoare de ARNm .
Acţiunea ARN interferent. Este îndreptată împotriva elementelor
transpozabile şi a virusurilor ce posedă segmente ARN dublu catenar. Acesta atrage
ARNi şi o nuclează ce scindează ARN dublu catenar în fragmente mai mici, ce
rămân asociate la enzimă şi o direcţioneză spre distrugerea altor molecule ARN cu
care sunt complementare. Trecerea fragmentelor ARN de la celulă la celulă permite
transferul rezistenţei la ARN viral.

I.8.2. Inhibitori naturali si chemoterapeutici ai expresiei genelor


A. Inhibitori ai transcripţiei
Sunt în general inhibitori ai ARN polimerazei. De exemplu ARN polimeraza
de la procariote este inhibată de rifampicină, care datorită acestei propietăţi este
utilizată ca antibiotic selectiv. Un exempul de utilizare a rifampicinei este în
tratamentul TBC blocând dezvoltarea Mycobacterium tuberculosis. Avantajul
tratamentului este toxicitatea redusă.
-amanitina este o toxină din ciuperca Amantina phaloides, care blochează
selectiv ARN polimeraza II (ce sintetizează ARNm) de la eucariote. Din acest motiv
produce intoxicaţii grave la om.

B. Inhibitori ai translaţiei
În natură inhibitori ai sintezei proteice la nivel ribozomal (substanţe antibiotice)
sunt utilizate de multe microorganisme ca arme chimice împotriva competitorilor sau
paraziţilor. De exemplu mucegaiul Penicilium produce inhibitori antibacterieni.
Datorită diferenţelor structurale între ribozomii de la procariote şi eucariote, aceste
antibiotice sunt selective fie pentru procariote (streptomicina, tetraciclină,
eritomicină), fie pentru eucariote (cicloheximidă, puromicină). Multe antibiotice
afectează funcţionarea ribozomilor la bacterii:
1. Aminoglicozidele (streptomicină, neomicină, tobramicină, gentamicină,
amikacină) se leagă ireversibil de subunitatea 30 S a ribozomilor bacterieni,
blocând activitatea peptidil transferazei.
2. Tetraciclinele (tetraciclină, doxiciclină, demeclociclină) se leagă reversibil la
subunitatea 30 S, inducând modificări conformaţionale ce împiedică alinierea
codonilor ARNm cu anticodonii ARNt.
3. Macrolidele (eritromicină, azitromicină, claritromicină) se leagă reversibil de
subunitatea 50 S şi inhibă activitatea peptidil transferazei.
4. Streptograminele (quimpristină, dalfopristină) împiedică legarea ARNt de
subunitatea 50 S.
În cazul bacteriilor cu creştere rapidă blocarea sintezei proteice va bloca
dezvoltare microorganismelor.
O acţiune mai deosebită o are toxina difterică- o proteină produsă de
microorganismul Corynebacterium difterie. Toxina blochează factorul de elongare
EF-2 (translocază) de la eucariote, blocând astfel regenerare celulară.
I.9. Biotehnologia ADN recombinant

În ultimi 30 ani s-a acumulat o mare cantitate de informaţii referitoare la


genomul uman, în 2001 fiind finalizată secvenţializarea acestuia, cunoscându-se
astfel ordinea celor 3,5 miliarde de nucleotide. S-au identificat circa 15% din genele
din constituţia genomului uman, precum şi elementele de control ale acestora.
Aceste demersuri au necesitat dezvoltarea tehnicilor de biologie moleculară de
manipulare a materialului genetic ce cuprind separarea şi caracterizarea acizilor
nucleici, secvenţializarea acestora, obţinerea de acizi nucleici de diferite mărimi şi
diferite cantităţi, introducerea de material genetic în diferite genomuri, utilizarea
tehnologiei ADN în prognosticare, diagnosticare, monitorizare şi terapie.

I.9.1. Secvenţializarea ADN


Secvenţializarea ADN reprezintă identificarea tipului, felului şi
succesiunii nucleotidelor dintr-un fragment de ADN analizat.
La ora actuală s-au dezvoltat tehnici de secvenţiere automatizată. Aceasta se
poate realiza fie chimic prin metoda Maxam-Gilbert, fie enzimatic prin metoda
Sanger. În prezent marea majoritate a tehnicilor de secvenţializare a ADN se
realizează prin metoda Sanger care este mai facilă şi superioară calitativ.
Metoda enzimatică Sanger constă din replicarea ADN-ului monocatenar
începând de la un punct precis de iniţiere, replicarea fiind apoi întreruptă în funcţie
de baza existentă în secvenţa analizată de către dideoxinucleotide. Componentele
reacţiei enzimatice Sanger sunt:
1. Catena de ADN ce trebuie secvenţializată: provine dintr-un fragment clonat sau
din denaturarea simplă a moleculei de ADN sau fragmentului de ADN prin căldură.
2. Un primer (amorsă oligonucleotidică) scurt specific care asigură iniţierea reacţiilor
de secvenţializare din acelaşi punct. Primerul este marcat radioactiv sau fluorescent.
3. ADN polimeraza
4. Substratul reprezentat de dNTP – dezoxinucleotide (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)
5. Terminatori ai elongării specifici pentru fiecare bază. Pentru fiecare din cele patru
baze este nevoie de un dideoxinucleozid trifosfat (ddNTP). Aceste molecule
stopează sinteza catenei de ADN, deoarece nu dispun de un grup 3’-hidroxil, care
este necesar pentru elongarea cateneii.

Figura 60. Principiul metodei enzimatice Sanger de secvenţializare a ADN


Pentru secvenţializarea catenei de ADN este nevoie de patru reacţii
simultane, dar separate, iniţiate însă de acelaşi primer. Fiecare amestec de reacţie
conţine un singur ddNTP pentru una din cele patru baze şi un amestec din cele 4
nucleotide necesare sintezei(dNTP).
Proporţia ddNTP este astfel stabilită încât o moleculă ddNTP este incorporată
în fiecare catenă sintetizat. În cazul fiecărei reacţii se sintetizează o populaţie de
catene de ADN care se termină la fiecare bază complementară cu respectivul
ddNTP utilizat. Fragmentele ADN formate sunt separate prin electroforeză de înaltă
rezoluţie în gel de poliacrilamidă în condiţii denaturante.
Produşii obţinuţi în cele patru reacţii sunt amplasaţi în gel în patru godeuri
adiacente. Gelul este analizat prin autografie, şi se observă benzile pentru fiecare
fragment de ADN sintetizat. Secvenţa se citeşte de sus în jos, fragmentele mai mari
migrând cel mai puţin iar cele mai mici parcurgând distanţa cea mai mare.
Reacţiile de secvenţializare în cadrul metodei automatizate se realizează prin
metoda enzimatică, ansamblul operaţiilor descrise anterior fiind automatizat. Se
poate utiliza un primer marcat cu un fluorofor diferit pentru fiecare din reacţii.
Aceasta permite reunirea tuturor fragmentelor obţinute şi migrarea lor într-o singură
linie electroforetică. Benzile sunt detectate în timpul migrării lor de către un sistem
care permite detectarea şi diferenţierea diverselor spectre emise de fluoroforii
excitaţi de către un laser cu argon. Fragmentele ADN care se termină cu o adenină,
o citozină, o guanină şi o timidină, vor emite 4 coloraţii diferite, specifice fiecărui tip
de nucleotidă, care se înregistrează şi apoi se interpretează.

I.9.2. Amplificarea ADN


Majoritatea metodelor de manipulare a ADN in vitro necesită cantităţi relativ
crescute de ADN de puritate mare. Acest deziderat a fost realizat cu succes odată
cu dezvoltarea în anii ’80 a tehnicii PCR (Polymerase Chain Reaction). Obiectivul
acestei tehnici îl constituie realizarea unui număr foarte mare de copii a unei porţiuni
dintr-o moleculă de ADN, în condiţiile cunoaşterii secvenţelor nucleotidice, vecine
porţiunii de amplificat.
Prima etapă o constituiie denaturarea ADN prin încălzire, rezultând două cate-
ne polinucleotidice libere, care se pun în contact cu un exces de două
oligonucleotide (primeri), fiecare complementară unei porţiuni ADN de la capetele 3'
ale celor două catene. Cele două oligonucleotide, ataşate la cele două extremităţi 3'
ale fragmentului ADN de copiat, vor constitui primeri de la care o ADN polimerază va
copia segmentul, de la primer spre capătul catenei. În acest fel, de la perechea de
catene iniţială, se obţin două perechi de catene. Acestea vor fi supuse din nou
ciclului denaturare, ataşare primeri, polimerizare, obţinându-se patru perechi de
catene şi aşa mai departe în mod exponenţial, astfel că la 20 de cicluri se obţin cca.
106 copii. Este de remarcat că deja de la al doilea ciclu, două perechi de catene
conţin strict numai fragmentul urmărit, încadrat de secvenţele celor două nucleotide
primeri.

Figura 61. Reprezentare schematică a reacţiei PCR

Figura 62. Amplificarea exponenţială în cursul reacţiei PCR

Tehnica PCR a fost complet automatizată, un ciclu complet de denaturare,


ataşare oligonucleotide primeri şi sinteză desfăşurându-se în aproximativ 4 minute.
La ora actuală, pe baza tehnologiei PCR s-au dezvoltat o serie de alte tehnici
de analiză exhaustivă a acizilor nucleici, utilizate atât în cercetarea fundamentală,
cât şi în cercetarea clinică. Una dintre cele mai utilizate metode în acest sens este
reprezentată de tehnica microarray. Tehnica microarray presupune hibridizarea
acizilor nucleici extraşi din probele biologice pe un suport inert, reprezentat de obicei
de o lamă de sticlă, de care sunt legate fragmente de ADN complementare cu
aceştia. Acestă tehnologie permite analiza concomitentă a unui număr impresionant
de gene, în funcţie de numărul fragmentelor ADN legate pe lamă, complementare cu
genele de investigat. In funcţie de scopul urmărit, această tehnică poate fi utilizată la
studierea expresiei genice, genotiparea polimorfismelor ADN, şi chiar secvenţierea
ADN. Prezentăm în continuare un exemplu de analiză comparativă a expresiei
genice a unui ţesut normal faţă de un ţesut canceros cu ajutorul tehnicii microarray.
Pentru aceasta, într-o primă etapă are loc extracţia ARNm din cele două
tipuri de ţesuturi, urmată de revers transcripţia (RT-PCR) pentru construirea ADN
complementar (ADNc) tuturor speciilor de ARNm specific tuturor genelor exprimate
în respectivele ţesuturi. În aceeaşi etapă are loc şi marcarea fluorescentă a ADNc
prin încorporarea unei nucleotide fluorescente în cursul reacţiei RT-PCR. În acest fel
se marchează cu fluorocromi difeiţi ADNc provenit din cele două ţesuturi, după care
acestea se amestecă şi se hibridizează pe lama de microarray. Pe lamă se află
depozitate în anumite godeuri (spoturi) fragmente oligoncleotidice de ADN
complementare cu secvenţele din genele umane ce se doresc a fi analizate. Fiecare
spot conţine câteva zeci, chiar sute de astfel de fragmente complementare cu
aceeaşi genă, prin urmare numărul de spoturi este egal cu numărul de gene de
analizat, existând în plus şi un număr de spoturi de control. La ora actuală există
lame de microarray care conţin fragmente complementare cu totalitatea genelor
umane cunoscute, astfel încât se poate analiza expresia genică a întregului genom
uman. În cursul reacţiei de hibridizare, se vor lega competitiv de fragmentele
complementare din spoturi speciile de ADNc specific fiecărei gene, în funcţie de
nivelul de expresie. Astfel, ADNc genelor care sunt supraexprimate într-un tip de
ţesut se va lega cu predilecţie pe spotul complementar, marcându-l cu culoarea
flruorocromului cu acesta este marcat. În urma excitării lamei cu ajutorul unei raze
laser şi prin vizualizarea la microscop, se vor identifica, în funcţie de culorea
emisă de fiecare spot în parte, genele supraexprimate, respectiv cele supresate în
ţesutul canceros faţă de ţesutul normal.
Figura 63. Reprezentarea schematică a tehnicii microarray

I.9.3. Fragmentarea şi ligarea ADN


Actul de naştere al tehnologiei ADN recombinant l-a constituit descoperirea
enzimelor de restricţie şi modificare, care a permis excizarea şi izolarea genelor,
determinarea structurii lor, construcţia in vitro de gene active prin recombinare sau
sinteză chimică. Datorită manipulării cu uşurinţă, dar şi a specificităţii lor pentru
anumite secvenţe nucleotidice, endonucleazele (numite şi enzime de restricţie) sunt
elemente deosebit de importante folosite în studiul structurii primare a ADN, în
tehnologia de obţinere a ADN recombinant, dar şi în alte domenii ale geneticii
moleculare şi ale biologiei celulare.
Aceste enzime clivează ADN dublu-catenar la nivelul unei secvenţe specifice,
realizând două „tăieturi”, câte una la nivelul fiecărei catene a ADN. Bacteriile prezintă
enzime de restricţie ca şi mijloc de apărare împotriva infectării cu fagi. Clivajul
expune ADN viral la eventuala degradare de către exonucleazele bacteriene
nespecifice. ADN bacterian poate fi protejat împotriva clivării prin metilare specifică.
Situsurile de recunoaştere pentru metilazele de restricţie sunt corespunzătoare cu
cele ale endonucleazelor. De remarcat că şi la organismele superioare metilarea
bazelor intervine în reglarea genică.

bacteriofag

Figura 64. Acţiunea enzimelor de restricţie în bacterii

Au fost descoperite mai multe sute de endonucleaze de restricţie şi numărul


lor este în creştere. Descoperirea unui număr foarte mare de enzime de resctricţie a
necesitat crearea unei nomenclaturi uniforme propuse iniţial de Smith şi Nathans.
Numele speciei bacteriei de la care a fost izolată este identificat după prima literă a
genului din care face parte bacteria şi primele două litere ale speciei, formând
împreună o abreviere de trei litere scrise italic, cum ar fi Eco (Escherichia Coli).
Aceasta este urmată de iniţiala tulpinii sau tipului celular, de exemplu EcoR. Când o
anumită tulpină bacteriană are mai multe enzime de restricţie, acestea sunt
deosebite între ele prin adăugarea de cifre romane, de exemplu EcoR I şi EcoR II.
Cele mai multe recunosc secvenţe scurte, constituite din 4-8 nucleotide,
numite situsuri de restricţie. Endonucleazele de restricţie recunosc secvenţele
specifice ce apar în moleculele de ADN de mari dimensiuni cu o frecvenţă mică şi
fragmentează ADN-ul foarte selectiv. Semnificaţia practică este că o anumită enzimă
de restricţie generează fragmente specifice pentru orice moleculă de ADN dată.
Acest model fragmentare este denumit digestie. Disponibilitatea acestor enzime
pentru fragmentarea ADN şi dezvoltarea tehnicilor de electroforeză pentru separarea
fragmentelor ADN, rezultate în urma digestiei, au făcut ca determinarea secvenţelor
să fie o chestiune simplă.
Situs de restricţie

Figura 65. Acţiunea enzimelor de restricţie asupra ADN uman


Numărul şi dimensiunea fragmentelor obţinute prin tăiere enzimatică depind
de frecvenţa secvenţelor specifice enzimelor respective în lanţul ADN. Tăind cu
enzime de restricţie care au secvenţa de recunoaştere de 4 nucleotide se vor obţine
multe fragmente de dimensiuni mici, iar dacă tăiem ce enzime cu secvenţe de
recunoaştere de 8 nucleotide vom obţine un număr mic de fragmente de dimensiuni
mari.
Astfel, prin acţiunea specifică a unei enzime de restricţie, are loc o
fragmentare specifică a moleculei ADN aparţinând unui fag, plasmide sau
cromozom. Fragmentele obţinute sunt la rândul lor scindate în fragmente mai mici
sub acţiunea altor enzime de restricţie. Se poate alcătui astfel o hartă a ADN
respectiv, în funcţie de situsurile de scindare ale diverselor enzime de restricţie.
Fragmentele obţinute sunt separate prin electroforeză, după care, utilizând una din
tehnicile rapide de determinare a secvenţei, li se determină secvenţa nucleotidică.
În urma acţiunii enzimelor de restricţie asupra catenei ADN, pot rezulta
fragmente cu capete de tip bont (blunt ends), sau capete lipicioase (sticky ends).
Acestea din urmă sunt preferate în majoritatea tehnicilor ce utilizează apoi
fragmentele obţinute pentru a le lega de alte fragmente ADN tăiate cu aceeaşi
enzimă de restricţie, pentru a forma fragmente de ADN hibrid, recombinant.

EcoRI

Figura 66. Obţinerea capetelor lipicioase în urma acţiunii enzimei EcoRI

Legarea fragmentelor ADN de origini diferite se poate realiza cu ajutorul unei


enzime numită ligaza. Aceasta poate asocia chiar si fragmente ADN cu capete de tip
bont (ambele catene au aceleaşi dimensiuni), dar mai ales fragmente cu capete
lipicioase, ce prezintă o catenă mai lungă cu câteva nucleotide, acestea fiind
complementare cu nucleotidele fragmentului de care se leagă. În acest mod se pot
asocia foarte uşor fragmente de ADN de origini diferite, această proprietate fiind
utilizată de obicei pentru introducerea genelor în vectori pentru clonare.

I.9.4. Construcţia unei gene pentru clonare


În sens larg, noţiunea de ADN recombinant cuprinde tehnicile de izolare a
unor anumite gene dintr-un organism sau de sinteză a unor gene noi, urmată de
includerea acestui material genetic în genomul altei specii, astfel încât se obţine o
celulă sau un organism cu proprietăţi ereditare noi.
Includerea materialului genetic străin în celula gazdă este utilizată fie pentru
exprimarea de către aceasta a unui caracter nou, util experimentatorilor, fie pentru
înlocuirea unui segment defectuos al materialului genetic cum ar fi o genă anormală.
Prin aceste tehnici s-a reuşit transferul de material genetic de la procariote →
procariote, de la eucariote → procariote şi de la eucariote → eucariote.
Principalele etape urmate în tehnologia ADN recombinant sunt:
- Obţinerea fragmentelor de ADN (gene) ce urmează a fi transferate şi
clonate în altă celulă sau organism. Aceste gene codifică caracterul celular
pe care dorim să-l transmitem celulelor sau organismelor.
- Selectarea unui vector capabil să transporte fragmentul ADN la noua celulă
gazdă.
- Inserţia genelor străine în structura moleculei vector, obţinându-se un
vector de clonare ce conţine un ADN hibrid (vector + genă).
- Introducerea vectorului de clonare în ADN-ul celulei gazdă (de obicei E.
Coli), astfel încât ADN hibrid introdus să fie apt de replicare odată cu ADN
celulei gazdă.
- Selectarea clonei celulare ce deţine acelaşi ADN hibrid în genomul propriu
modificat şi evidenţierea caracterelor noi rezultate.

În sens biologic, o clonă reprezintă o populaţie de molecule, bacterii sau


celule identice, care provin din aceeaşi moleculă, bacterie sau celulă iniţială, printr-
un proces de amplificare (clonare).
Figura 67. Reprezentarea schematică a clonării unei gene (proteine)

Secvenţele ADN ce urmează a fi transferate, trebuie să fie suficient de mari


pentru a conţine gena urmărită. Din acest motiv, iniţial s-au ales doar acele
fragmente ADN care produc în celula gazdă efectele codificate de gena ce se
doreşte a fi transferată. Principalele metode de obţinere a fragmentelor ADN sunt:
- Scindarea ADN genomic cu enzime de restricţie, rezultând fragmente ce sunt
identificate, izolate şi inserate în plasmide şi fagi cu care vor constitui vectorii de
clonare. Sunt utilizate în acest scop, în special enzime de restricţie care clivează
două legături fosfodiester, câte una în fiecare catenă, producând capete de catenă
complementare (lipicioase) care se vor putea lega, pe bază de complementaritate,
cu orice moleculă de ADN, indiferent de specie.
- Sinteza de ADN complementar (ADNc). În această tehnică se izolează ARNm
specific genei urmărite, apoi utilizând ARNm drept matriţă, se sintetizează sub
acţiunea revers transcriptazei ADN complementar cu ARNm. ADN obţinut nu mai
conţine în moleculă introni sau porţiuni reglatoare, urmând astfel, de exemplu,
integrarea genelor de la eucariote la procariote.
- Sinteza chimică a genei. Există astăzi tehnici automatizate, ce permit sinteza de
polinucleotide pe baza fie a unui şablon al unei gene naturale, a cărei secvenţă a
fost identificată, fie pe baza secvenţei de aminoacizi a proteinei codificate de gena
urmărită. De referinţă rămâne în acest sens sinteza chimică a genei insulinei.
Metoda nu este încă aplicabilă sintezei genelor mari, dar prezintă avantajul că se pot
utiliza codoni specifici celulei gazdă, iar structura genei poate fi modificată.
Modificările în structura genei se pot urmări corelativ cu modificările în structura
proteinei codificate.
Pentru clonarea unui fragment specific de ADN, acesta trebuie introdus într-o
celulă gazdă adecvată, unde fragmentul se va replica şi divide odată cu ADN-ul
celulei gazdă. Replicarea va avea loc dacă fragmentul de ADN conţine un segment
de iniţiere al replicării, specific celulei gazdă. Multe fragmente ADN nu conţin astfel
de segmente, fiind necesar să fie ataşate la un vector ADN ce conţine astfel de
segmente.
Vectorul reprezintă un intermediar cu sistem de replicare propriu, capabil să
integreze un fragment de ADN străin, să-l transporte din exterior în celulă, la adăpost
de acţiunea nucleazelor, asigurând apoi replicarea acestuia odată cu genele proprii.
În această categorie intră plasmidele, bacteriofagii, virusurile din plante şi animale,
precum şi vectori creaţi artifical, de tipul cosmidelor sau cromozomilor artificiali.
Această varietate de vectori a fost impusă de necesităţile creşterii cantitative
ale materialului genetic ce trebuie transportat. Astfel, plasmidele pot transfera ADN
cu lungimea de 5 - 10 kbaze, bacteriofagii 15 - 25 kbaze, cosmidele 45 kbaze, iar
cromozomii artificali din drojdie cca. 200 - 500 kbaze. În acelaşi timp, materialul
genetic transportat a devenit tot mai complex, de la gene simple la complexe de
gene, împreună cu regiuni învecinate.
Molecula ADN a vectorului trebuie să fie capabilă de replicare autonomă în
celula gazdă, să conţină în structura sa un singur situs de recunoaştere pentru
enzimele de restricţie utilizate curent şi să conţină o genă marker, a cărei exprimare
fenotipică în celula gazdă să permită separarea celulelor transformate de cele
normale.
Situs de recunoaştere pentru
enzimele de restricţie

Vector de
expresie
mamaliană
Figura 68. Reprezentare schematică a unui vector de expresie.
Se observă existenţa promotorului viral pCVM-citomegalovirus, precum şi a genei ce
conferă rezistenţa la ampicilină (amp), alături de celelalte elemente reglatoare ale
expresiei.

Inserţia fragmentului de ADN în molecula vectorului (de exemplu vectorul este


plasmidă), se realizează prin scindarea cu aceeaşi enzimă de restricţie atât a
fragmentului de ADN de clonat, cât şi a plasmidei, urmată de hibridizarea (lipirea)
capetelor complementare rezultate şi sudarea fragmentului ADN sub acţiunea unei
ligaze în molecula plasmidei.
Introducerea vectorului în celula gazdă se realizează prin permeabilizarea
învelişurilor celulare, care, în cazul microorganismului E. coli (cel mai utilizat în
ingineria genetică), are loc prin tratare cu CaCl2 ce suprimă bariera normală faţă de
pătrunderea ADN. Acest procedeu se desfăşoară mult mai puţin eficient decât
procesul natural, apreciindu-se că doar una din 10.000 de molecule himere va
traversa învelişurile celulare. Odată ajuns în celula gazdă, vehiculul de clonare se va
replica autonom în cazul vectorilor plasmidiali sau odată cu genomul celulei în cazul
vectorilor fagici sau virali. În urma replicării, are loc o amplificare sau clonare a
moleculei de ADN introdus în celula gazdă, clona moleculară obţinută reprezentând
populaţia omogenă de plasmide sau fagi ce propagă un segment de ADN determi-
nant.
Unul din principalele obiective ale ingineriei genetice este exprimarea
informaţiei genei străine într-o celulă gazdă, de exemplu sinteza unei proteine
specifice. Condiţia exprimării este ca vectorul de clonare să conţină elementele
necesare iniţierii transcripţiei genei transferate, aceştia purtând numele de vectori de
expresie.

I.9.5. Vectorii de expresie la procariote


În cazul transferului unor gene de tip eucariot la E. coli, acestea vor putea fi
exprimate sub forma sintezei de proteine specifice numai dacă vectorul conţine,
înaintea genei, o secvenţă reglatoare a transcripţiei compusă dintr-un promotor şi o
secvenţă Shine - Dalgarno. Deoarece la procariote nu există posibilitatea maturării
ARNm prin excizarea intronilor, gena utilizată trebuie să fie obţinută prin tehnica
ADN complementar ce nu conţine introni în moleculă.
Viteza ridicată de diviziune a procariotelor permite obţinerea unor clone
moleculare numeroase, în care sinteza proteică se desfăşoară foarte rapid.

I.9.6. Vectorii de expresie la eucariote


Aceşti vectori au origine virală, fiind capabili să infecteze şi să se replice în
celula gazdă, în urma unui proces de transfecţie. Cea mai folosită metodă de
transfecţie implică formarea unui complex ADN viral - fosfat de calciu sau ADN viral -
dietilaminoetil - dextran, care este introdus în celulă prin endocitoză. Complexul
traversează citoplasma, intră în nucleu, unde se inserează în genomul celular prin
intermediul căruia este replicat şi transcripţionat.
ADN transferat trebuie să conţină obligatoriu elementele de control ale
transcripţiei, ca: promotori, segmente reglatoare, segmente de maturare, ceea ce
face ca ADN obţinut prin tehnica ADN complementar să nu corespundă acestor
criterii.
Aplicaţiile vectorilor de expresie la eucariote constituie aşa-numita terapie
genică. Astfel, în cazul unei celule ce prezintă o anomalie genică, introducerea în
genom a unei gene cu secvenţă corectă ar restabili normalitatea caracterului afectat
de anomalia genei respective.

I.9.7. Editare genica prin tehnica CRISPR/Cas9


Apariţia in anii ’70 a tehnicilor de ADN recombinat a marcat apariţia unei noi
ere in ştiinţele bio-medicale, cea a manipulării prin inserții, deleții sau alterări ale
secvenţei a ADN genomic si/sau a produşilor de transcriptie. Tehnicile de
inginerizare genomică au evoluat de la targetarea genica prin recombinare
omoloaga (laborioasa, de durata, cu eficiente foarte mici a proceselor de
recombinare) la tehnici de recombinare (omoloagă si non-omoloagă) induse de
meganuclease ZN-finger (mult mai simplu de aplicat, nu suficient de precise) si
tehnici de editare genomică folosind endonucleaze Cas9 (parte a sistemului imun de
apărare adaptativă microbiana, CRISPR) ghidate de molecule de ARN (foarte
rapida, foarte precisă).
Istoria CRISPR începe in 1987 odată cu descoperirea unui set de repetiţii de
29 de nucleotide (separate de secvenete non-repetitive de 32 de nucleotide)
adiacente genei yap din E. Coli , ulterior identificate ca făcând parte dintr-un sistem
CRISPR in peste 40% dintre bacterii si care in mod invariabil asociaza gene asociate
(CRISPR associated, CAS). Secvențele CRISPR (Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeats) reprezintă bazele unui mecanism de protecție utilizat de
bacterii împotriva infecțiilor virale, și sunt de fapt bucăți de secvențe de origine virală
integrate în genomul bacterian ce sunt utilizate de sistemul imun bacterian contra
infectării cu aceiași viruși. Din cele trei tipuri de loci CRIPSR, doar I si III conţin un
număr considerabil de gene asociate CAS si reprezintă unul din principalele
mecanisme de memorie imuna si defensa bacteriana la invazia bacteriofagică la
bacterii. A devenit ulterior evident ca acţiunea nucleazei Cas9 (Streptococcus
pyogenes Cas9, SpCas9) la nivelul CRISPR necesita prezența motivelor proto-
spacer PAM (secvente adiacente in 3’ regiunii ţintă) si a hibridului ARN
tracrRNA/crRNA (sgRNA). La scurt timp apare prima comunicare despre utilizarea
CRISPR/Cas9 pentru editarea genomului la mamifere, revoluţionând practic tehnicile
de inginerie genomică. Specificitatea Cas9 este data in principal de nivelul
complementarităţii sgRNA cu regiunea ţintă de ADN; important de reţinut ca
nucleaza Cas9 tolerează un anumit număr de nepotriviri de complementaritate, ceea
ce explică în bună măsură si apariţia (deşi redusă) a fenomenelor de tăiere
nespecifice.
Utilizarea sistemului CRISPR/Cas9 permite in prezent editarea de fineţe
(până la nivel de 1 nucleotida) a ADN genomic in scop de cercetare fundamentală
(inclusiv generarea de modele animale) sau clinică (repararea mutaţiilor, inclusiv
punctiforme). Astfel, screeningul funcţional al diferitelor regiuni genomice (codante
sau non-codante) a devenit mult mai rapid si mai facil.
Prin introducerea într-o celulă a unei nucleaze Cas9 complexată cu o
secvență de ghidare RNA, se poate cliva molecula de ADN la un anumit locus,
putându-se astfel scoate gene existente sau introduce noi gene în acel loc, cu
potențiale aplicații biomedicale din cele mai diverse. Secvența RNA complementară
cu secvența din genom ghidează proteina Cas care recunoaște si clivează secvența
respectivă. Se pot utiliza vectori virali sau non-virali pentru a introduce sistemul în
celulă. Acest sistem a fost utilizat cu succes pentru scoaterea din genom a până la
62 de gene simultan.
Acest sistem revoluționar de editare genică este utilizat în prezent în trialuri
clinice pentru a încerca repararea genelor mutate care cauzează cancer, printre
altele. În general, aceste studii presupun izolarea unor celule imune de la persoane
cu cancer, editarea genomului acestora urmată de reintroducerea lor în organismul
acelorași persoane.

I.9.8. Aplicaţii biomedicale ale tehnologiei ADN recombinant


Tehnologia ADN recombinant este utilizată de mai bine de trei decenii în
ştiinţele biomedicale, în special în scop de cercetare. Cu toate acestea, în ultima
perioadă, odată cu dezvoltarea, perfecţionarea şi automatizarea tehnicilor de
manipulare a ADN, au apărut tot mai multe aplicaţii directe în medicina clinică a
tehnologiei ADN recombinant.
În cercetarea fundamentală, descifrarea genomului uman a fost realizată cu
ajutorul tehnicilor automatizate de secvenţiere. De asemenea, în scopul determinării
funcţiilor genelor, al rolului acestora în procesul de dezvoltare embrionară s-au
realizat animale transgenice, respectiv animale knock-out.
Animalele transgenice reprezintă organismele dezvoltate dintr-o celulă ou
fertilizată în genomul căreia s-a inserat material genetic (gene) străin, ce este
transmis tuturor celulelor ce derivă din celula ou. Genele introduse sunt molecule de
ADN recombinant, care includ şi promotorii de transcripţie ai genei. Prin introducerea
în celula ou, genele străine se leagă aleator de ADN cromozomal, existând
posibilitatea apariţiei de mutaţii letale sau neletale. Diferenţierea celulară şi ulterior
expresia fenotipică permit evaluarea impactului materialului genic străin asupra
genomului celular. Animalele transgenice sunt utilizate în special pentru studiul
diverselor aspecte legate de gena introdusă cum ar fi: studiul elementelor de reglare
a expresiei genice, expresia unor proteine în cursul diferenţierii celulare,
specificitatea tisulară, rolul potenţial al oncogenelor în creştere, diferenţiere şi
inducerea carcinogenezei.
Animalele knock-out reprezintă organisme în care este suprimată expresia
unei anumite gene. Se urmăreşte apoi dezvoltarea în stadiul embrionar şi adult al
animalului knock-out, monitorizându-se modificările faţă de un animal normal. În
cazul în care lipsa expresiei genei respective este compatibilă cu supravieţuirea, se
pot trage concluzii privind rolul biologic al acesteia.
În cazul cercetării aplicative, tehnicile de clonare se utilizează pentru
producerea de anticorpi monoclonali utilizaţi în diagnostic, inginerie medicală, terapie
anticanceroasă, obţinerea de vaccinuri prin antigene monoclonale prin clonarea
antigenelor de la suprafaţa virusurilor obţinuându-se un singur tip de antigen ce v-a
constitui vaccinul propriu-zis. Vaccinul cu antigen monoclonal va avea două
avantaje majore, şi anume: se sintetizează un singur tip de anticorpi evitându-se
epuizare sistemului imunitar şi nu se introduce material genetic viral, evitându-se
riscul infecţios. De asemenea, prin clonarea vectorilor de expresie s-a reuşit
obţinerea prin inginerie genetică a somatostatinei, insulinei, hormonului de creştere,
a interferonului uman, factorului de necroză tumorală, factorului VIII de coagulare,
etc., folosindu-se ca celule gazdă producătoare microorganismele E. coli sau S.
cerevisiae. Avantajele acestei tehnici sunt în primul rând de ordin calitativ, deoarece
proteinele sunt produşi ai genei umane, astfel că se elimină fenomenele de
antigenitate în utilizarea lor; şi de ordin cantitativ, astfel că, în sinteza somatostatinei,
100 g de E. coli produc într-un fermentator de 8 l o cantitate de hormon echivalentă
cu cea rezultată din prelucrarea a 100 t de creier recoltat de la 500.000 de ovine.
Ca aplicaţii clinice, amintim detecţia de mutaţii necunoscute prin
secvenţiere, sau detecţia de mutaţii cunoscute prin tehnici bazate pe PCR. S-au
dezvoltat tehnici de detecţie a mutaţiilor la nivel prenatal şi chiar preimplantaţional,
ducând astfel la diagnosticarea precoce a unor maladii, respectiv la evaluarea
riscului de a avea copii ce vor suferi de aceste boli. De asemenea, prin genotiparea
polimorfismelor genice sau a mutaţiilor se determină profile genice specifice unei
anumite boli, cu aplicaţii în prognostic, diagnostic sau orientarea terapiei. Studiul
răspunsului diferit la o anumită terapie, în funcţie de profilul genic individual, face
obiectul farmacogeneticii , a cărei aplicaţie directă o constituie administrarea unei
terapii individualizate.
Pe lângă aplicaţia directă în descifrarea hărţii genetice a genomului, tehnica
PCR a devenit indispensabilă în ingineria genetică, cu numeroase aplicaţii în
practica medicală. Astfel, în domeniul medico - legal, regiunile hipervariabile din
ADN mitocondrial, specifice fiecărui individ, pot fi obţinute în cantităţi suficiente şi
identificate, pornind de la un singur fir de păr sau de la o celulă, provenind de la
victimă sau suspect.
O altă aplicaţie medicală este detectarea infecţiei virale, în special cea dată
de virusuri latente, înaintea reacţiei imune a organismului. De exemplu, infecţia cu
HIV poate fi detectată în stadiu latent, prin amplificarea PCR şi ulterior identificarea
secvenţei ADN a HIV din ADN leucocitar. Tehnicile PCR de diagnostic prezintă
avantaje evidente faţă de metodele clasice de detecţie a infecţiei virale, aceste
metode fiind bazate pe identificarea prezenţei proteinelor virale în organismul
pacientului. Proteinele virale persistă timp îndelungat şi după eliminarea virusului,
ceea ce duce la interpretarea eronată infecţiei virale. În schimb, tehnica PCR
detectează specific, chiar şi cantitativ, existenţa acizilor nucleici virali, fapt ce
certifică prezenţa activă a virusului în organism, fiind un important indiciu în ce
priveşte administrarea unei terapii adecvate.
Tehnica PCR se aplică curent şi în stabilirea compatibilităţii ţesuturilor pentru
transplant. În domeniul cercetării fundamentale, tehnica PCR este utilizată în studiul
evoluţiei, în încercările de utilizare al ADN din probele arheologice, etc.
O altă aplicaţie clinică directă a tehnologiei ADN recombinant este
reprezentată de terapia genică, ce constă în introducerea în organismul uman a
genei corecte care să o înlocuiască pe cea defectă. La ora actuală, administrarea de
material genetic unui anume tip de ţesut din organismul adult ce prezintă anomalii
genice, întâmpină numeroase obstacole, cum ar fi lipsa unor vectori care să
acţioneze strict asupra ţesuturilor ţintă şi imposibilitatea de a acţiona asupra unei
proporţii semnificative din celulele ţesutului ţintă. Elementele principale ale unui
vector sunt reprezentate de componenta de acid nucleic sau caseta de expresie ce
cuprinde atât gena ce trebuie livrată, cât şi elementele de control ale expresiei
acesteia, precum şi un sistem de protecţie a ADN-ului faţă de acţiunea nucleazelor
intracelulare. În funcţie de aceste elemente, se diferenţiază vectorii nonvirali de
vectorii virali.
Vectorii nonvirali sunt reprezentaţi de plasmide. Plasmidele sunt molecule de
ADN circular ce conţin o genă marker de rezistenţă la antibiotice şi un fragment de
origine al replicaţiei ce-i conferă posibilitatea replicării în E. Coli spre exemplu. De
asemenea, plasmidul utilizat în terapia genică umană trebuie să conţină o casetă de
expresie mamaliană ce conţine atât gena de interes, cât şi elementele reglatorii ale
expresiei acesteia.
Deşi susceptibil de a fi rapid degradat de endonucleaze, s-a observat că
plasmidul injectat intramuscular pătrunde rapid în nucleii miocitelor după care
asigură expresia genei terapeutice conţinute de acesta. De asemenea, plasmidul în
soluţie apoasă injectat în cantităţi mari în fluxul sanguin produce acelaşi efect.
Pentru a eficientiza transportul genelor terapeutice în celulele ţintă, se utilizează
diverse metode fizice, de tipul electroporării, ultrasonoporării, tehnica genelor-
proiectil (molecule de ADN plasmidial ce înfăşoară microparticule de aur sau
tungsten ce vor si proiectate cu viteză în celulele ţintă) sau metode chimice ca în
cazul liposomilor (ADN-ul plasmidial este protejat de membrane de poliamine, lipide
policationice, polimeri neutri sau combinaţii între acestea), precum şi combinarea
celor două tipuri de metode (de exemplu liposomi ce sunt supuşi electroporării).
Principalele avantaje ale vectorilor nonvirali sunt reprezentate de posibilitatea
înglobării de fragmente ADN de până la 40 kb, lipsa activării răspundului imun şi risc
scăzut de a produce efecte adverse. Dezavantajul major este reprezentat de
eficienţa relativ scăzută a trasnducţiei şi expresia tranzitorie.
Vectorii virali sunt reprezentaţi de o multitudine de tipuri de viruşi şi au ca şi
caracteristică comună lipsa genelor ce codifică proteinele specifice virale, acestea
fiind înlocuite de gena terapeutică. Principala caracteristică ce conferă viruşilor
statutul de vectori este proprietatea lor nativă de a se interga în genomul gazdă şi de
a utiliza sistemul de expresie al acestuia.
Cel mai frecvent utilizaţi vectori virali pentru terapia genică sunt vectorii
derivaţi din retroviruşi, lentiviruşi, adenovirusi, viruşi adeno-asociaţi şi virusul herpes
simplex, fiecare având anumite avantaje şi dezavataje unii în raport cu ceilalţi.
Principalul avantaj al vectorilor virali este reprezentat de capacitatea lor de integrare
in genomul gazdă şi de expresia susţinută. În schimb, vectorii virali prezintă marele
dezavantaj de a produce un răspuns imun susţinut, precum şi alte efecte adverse ce
nu au reuşit încă a fi contracarate.
Cu toate aceste probleme întâmpinate în utilizarea pe scară largă a terapiei
genice, în ultimul deceniu, avînd la dispoziţie informaţiile oferite pe parcursul
desfăşurării Proiectului Genomul Uman ce a dus la cunoaşterea în prezent a
structurii majoritatii genelor umane, terapia genică a cunoscut o dezvoltare extrem
de rapidă. De la primele experimente disparate în cazul unor boli monogenice cum
este sindromul imunodeficient sever (bubble boy), sau chiar a unor boli
multifactoriale cum este cancerul, s-a ajuns astăzi la utilizarea curenta in practica
medicala a terapiei genice în unele tari cum este SUA.
În funcţie de procedeul utilizat, se diferenţiază terapia genică in vivo, în care
genele sunt modificate in celulele corpului uman, de terapia genică ex vivo, în care
celulele ţintă sunt prelevate şi modificate genetic după care sunt reintroduse in
acelaşi organism. Teoretic, toate bolile umane sunt potenţiali candidaţi la terapie
genică, bolile fiind considerate la ora actuală maladii poligenice.
Figura 69. Reprezentare schematică a terapiei genice in vivo şi ex vivo

În concluzie, tehnologia ADN recombinant a cunoscut o dezvoltare expansivă


în ultimii ani, cu aplicaţii în cele mai diverse domenii ale medicinii, atât în cercetarea
fundamentală ce oferă date noi despre rolul şi funcţiile genelor în organism, cât şi în
cercetarea aplicativă ce oferă noi soluţii terapeutice, noi biomarkeri de diagnostic şi
prognostic.