Disciplina Fiziologie I

Departamentul Clinic 2

HEMOLIZA
REZISTENȚA GLOBULARĂ
- protocol de lucru -

Prin hemoliză se înțelege eliberarea hemoglobinei din eritrocite și trecerea ei în mediul

ambiant. În afară de organism (in vitro), hemoliza poate fi ușor obținută prin diferiți agenți numiți
agenți hemolizanți. După natura lor ei pot fi clasificați în: agenți fizici, chimici și biologici.

Hemoliza prin agenți fizici se poate produce prin agitarea mecanică a sângelui, contact
prelungit cu sticla, iradiere cu raze solare ultraviolete, sau Rontgen, prin modificări bruște de
temperatură, înghețare, dezghețare, încălzire peste 50 grade etc.

Hemoliza prin agenți chimici se obține ori de câte ori eritrocitele vin în contact cu solvenții
lipidelor ca de exemplu: cloroform, alcool, benzen, etc., cu substanțe chimice care precipită
proteinele ca : acizi, alcalii, sărurile metalelor grele. Sărurile biliare și saponinele au o intensă
acțiune hemolizantă.

Agenții hemolizanți biologici la rândul lor pot fi clasificați în:

a) toxine animale și bacteriene ca : veninul de cobră, de anumiți păianjeni, veninul de albine și

al larvelor de muscă de cal, extractul de botriocefal, toxine microbiene, streptococ,
hematozoarul palustru care sunt de cele mai multe ori cauza anemiilor hemolitice.
b) Hemolizine specifice : care apar în sângele speciilor animale cu un proces de apărare a
organismului împotriva eritrocitelor străine sau în cadrul aceleași specii ca o consecință a
incompatibilității de grup sanguin. Acest tip de hemolizină mai complex poartă numele de
hemoliza serologică.

Studiile cu microscopul electronic au stabilit două forme de hemoliză:

1. Hemoliza fără modificări vizibile ale membranei , dar cu modificări în starea coloidelor din
interiorul celulelor care va permite ieșirea hemoglobinei în mediul ambiant este așa numita
hemoliză coloid-osmotică, ca de exemplu hemoliza prin congelare, expunere la ultra-
violete sau în mediu hipoton.
2. Hemoliza neosmotică în care stroma și membranele sunt lezate sau distruse, fenomen
cunoscut ca stromatoliză. Acest gen de hemoliză este produs de agenți chimici,
ultrasunete, unii agenți biologici. Față de agenții hemolizanți eritrocitele prezintă grade de
rezistență diferită în funcție de natura agentului hemolizant. În general hematiile tinere
sunt mai robuste, mai rezistente decât cele uzate, îmbătrânite.

1
 Eritrocitele normale într-un mediu cu aceeași presiune osmotică dată de NaCl – ca a
plasmei, mediu izotonic, pot fi menținute ore. Într-un mediu hipotonic cu o concentrație
scăzută de clorură de sodiu, presiunea osmotică exercitată de substanțele din interiorul celulei,
va determina intrarea apei în hematii, cu creșterea de volum și eliberarea hemoglobinei în
mediul ambiant. Practic hemoliza se produce numai când presiunea osmotică a mediului este
mult mai mică decât cea normală plasmatică, deci nu reprezintă un factor fiziologic de
hemoliză dar reprezintă o metodă de apreciere a rezistenței globulare ușor de realizat. A
determina rezistența, înseamnă a găsi care este concentrația exprimată în grame la 100, a unei
soluții de NaCl în care hemoglobina începe să părăsească hematiile mai puțin rezistente
rezistența minimă și concentrația soluției în care hemoliza este completă, toate hematiile sunt
lizate rezistența maximă. În mod practic, rezistența globulară se determină prin metoda
Mosso-Hamburger.

Principiul metodei: Se introduc hematiile în soluții de diferite concentrații de NaCl

cuprinse între 0,05 - 0,9 g%, determinându-se concentrația soluției la care începe hemoliza și la
care hemoliza este totală.

Material necesar: eprubete de hemoliză, sânge recoltat pe un anticoagulant,soluție de

NaCl 0,9% (ser fiziologic), apă distilată.

Tehnica de lucru: Se utilizează 18 eprubete de hemoliză și se pun: în prima eprubetă 1,8 ml

ser fiziologic, în a doua 1,7 ml, și tot așa descrescând cu 0,1 ml până la ultima eprubetă. Se
completează în fiecare eprubetă cu apă distilată în așa fel, ca volumul final în fiecare eprubetă
să fie de 1,8 ml. În prima eprubetă nu se pune apă, în a doua se adaugă 0,1 ml, în a treia 0,2 ml
apă și așa mai departe. În felul acesta se obțin o serie de eprubete în care concentrațiile NaCl
merg descrescând tot cu câte 0,05%, începând de la 0,9%.

În fiecare eprubetă se adaugă o picătură de sânge și se omogenizează ușor, prin

răsturnarea eprubetei și nu prin agitarea ei pentru a evita hemoliza mecanică. Se lasă
eprubetele în repaus timp de o oră, după care se citesc rezultatele. În primele eprubete
hematiile se sedimentează integral și supernatantul este incolor. Hemoliza parțială este
indicată de prima eprubetă în care culoarea lichidului supernatant este ușor roz, dar există încă
sediment globular (rezistență minimă). Hemoliza totală este indicată de prima eprubetă în care
lichidul este intens colorat, transportat și nu se mai observă sediment (rezistența maximă). Se
calculează concentrația NaCl din cele două eprubete și se exprimă rezistența osmotică a
eritrocitelor în grame NaCl%.

2
 REACTIVI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Apă distilată 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7

Ser fiziologic NaCl 0,9% 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

Conc.finală NaCl% 0,90 0,85 0,80 0,75 0,70 0,65 0,60 0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05

Interpretarea rezultatelor: Hemoliza începe în mod normal la concentrația de 0,45 g NaCl%, în

care hematiile cele mai puțin rezistente de obicei cele mai bătrâne, pierd hemoglobina
(hemoliza parțială, rezistența globulară minimă) și se termină la 0,33 g %NaCl, concentrație în
care hemoliza este totală (rezistența globulară minimă) și se termină la 0,33 g %NaCl,
concentratie în care hemoliza este totală (rezistența globulară maximă). Diferența între
concentrația soluției în care se începe hemoliza și concentrația în care hemoliza este totală,
reprezintă scara rezistenței.

Este un test specific în investigarea anemiilor hemolitice.

În condițiile în care rezistența globulară scade mult (sferocitoză erditară, intoxicații cu

benzen, hemofilie) hemoliza începe mult mai repede, la concentrații mari ale soluției de NaCl
(0,50 – 0,70 g NaCl%) și devine totală la concentrații mai crescute.

Creșterea rezistenței osmotice în care hemoliza totală apare la 0,30 – 0,28 g NaCl% este
întîlnită după hemoragii acute (crește numărul de eritrocite tinere), în anemia megaloblastică
feriprivă și talasemie, icter mecanic după splenectomie.