Cursul 5; Gripa aviară 3.

Metodologia de diagnostic

Metodologia de diagnostic în Gripa aviară

Diagnosticul de suspiciune, se formulează prin coroborarea anchetei epidemiologice,

simptomatologiei clinice, leziunilor morfopatologice.

Protocolul de diagnostic, include coroborarea următoarelor date:

1.Ancheta epidemiologică;
2.Examenul clinic;
3.Examenul morfopatologic;
4. Examene de laborator.

1.Reprezintă informații greu de obținut ce trebuie consemnate într-un Formular de date

anamnetice sau o Fișă de date epidemiologice, care intotdeauna trebuie să însoțească probele
prelevate dintr-un focar.

Fișă de date epidemiologice- a fost elaborată de specialiștii IDSA și adoptată prin

decizoa ANSVSA nr.6793/21.02.2006, cuprinde:

1. Profesia și ocupația proprietarului, membrilor familiei acestuia,

2. Data apariției primelor semne de boală și dacă în efectiv evoluează și alte boli:
3. Numărul de păsări moarte și specia.
4. Stabilirea exactă a locației de apariție a presupusului focar; se anexează și o
hartă a localității respective;
5. Date despre amplasarea geografică a localității și precizarea distanței față de
luciu de apă, bălți, lacuri unde există păsări sălbatice de apă și de uscat,
inclusiv păsări migratoare;
6. Numărul de păsări, posibil susceptibile la gripa aviară, pe categorii:
galinacee, palmipede ( cu precizarea faptului dacă acesta sunt libere pe timpul
zilei, pe un luciu de ape, stătătoare sau curgătoare);
7. Precizarea unui posibil contact cu păsările din gospodăriile invecinate sau de
pe suprafața unui luciu de apă;
8. Prezentarea celorlalte animale prezente în gospodăria suspicionată (dacă în
gospodărie există cai, porci, câini, pisici- care circulă liber ;
9. Precizarea faptului că oricare dintre membrii familiei au avut un contact
anterior cu alte persoane cărora le-au murit păsările, sau au avut păsări
bolnave în efectiv, din aceea și localitate sau din alte localități;
10. Existența unor populații de porumbeii în gospodăria suspicionată sau în
apropiere;
11. Consemnarea situației în care unul dintre membrii familiei sau mai mulți au
avut tangență cu un luciu de apă din vecinătate sau din alte zone (dacă
membrii familiei sunt pescari, ciobani, vânători sau fac un hobby din aceste
meserii) și dacă în curtea respectivă au fost aduse păsări de vânătoare moarte ,
vii sau împușcate;
12. Dacă înainte cu 10 zile din gospodăria cu probleme au fost comercializate
păsări, sau au fost introduse păsări cu 15 zile înainte și se precizează locația de
unde au fost procurate;
13. Precizarea numărului de păsări moarte; mortalitatea datorată rozătoarelor și
aprecierea dimensiunii populației de rozătoare din arealul respectiv;
14. Dacă cu cel puțin 10 zile înainte s-a observat survolarea gospodăriei sau a
localității de păsări sălbatice sau dacă acestea au staționat pentru a se hrăni sau
a bea apă în curtea respectivă sau în cele învecinate;
15. Precizarea speciilor de păsări observate în apropierea localității sau a locației
în toamna anului precedent și începutul anului în curs și estimarea
aproximativă a numărului acestora;
16. Precizarea numărului de păsări și a speciilor de păsări existentte în localitate;
17. Menționarea căilor de access care traversează localitatea și fac legătrura dintre
localitatea suspicionată și alte localități (drumuri județene, drumuri naționale
și căi de acces secundare- ulițe, poteci etc.);
18. Precizarea fapului că personalul sanitar-veterinar a fost cu 7 zile înainte de
izbucnirea focarului, în gospodăria respectivă și dacă în această perioadă au
 fost efectuate acțiuni de imunoprofilaxie și tratamente de combatere a unor
boli;
19. Precizarea numărului de păsări tăiate în gospodăria respectivă;
20. Dacă în localitatea respectivă apar focare concomitente la mai multe locațiiu;
21. Modul de manipulare și destinația finală a păsărilor moarte.

2. Examenul clinic

Se bazează pe inspecția păsărilor bolnave, :

-comportamentul;

-reacțiile acestora la diverși stimuli;

-se poate verifica și apetitul.

Forma supraacută

-perioada de incubație de 3-7 zile, în funcție de tulpina virală, specia și vârsta gazdei;

-se întâlneșete la prima apariție a bolii într-un areal

Un prim semn clinic constă în apariția unei mortalități bruște, fulgerătoare și

exagerate.

Moartea survine în 24-48 de ore.

Forma acută:

Semne clinice generale:

-scăderea ouatului;

-hipersecreție lacrimală;

-edemațierea capului;

-tumefierea crestei;
 -cianoza pielii și a mucoaselor aparente;

-indigestie ingluvială; diaree;

-tulburări respiratorii, raluri;

-tulburări locomotorii însoțite de deplasări groaie, păsările stau ghemuite, cu capul

sprijinit pe sol;

-uneori simptomatologie nervoasă etc.

Manifestări clinice la găină:

-incubație 3-7 zile;

Manifestări generale: depresie severă; inapetență; astenie generală; horiplimație;

polidipsie; adinamie etc.

Respirator: jetaj mucos abundent, tuse, strănut, raluri umrde traheale, dispnee gravă etc.

Digestiv:

-indigestie ingluvială (care constă din scurgerea din cavitatea bucală a unui lichid
filant);

- diaree- inițial apoasă, apoi verde și ulterior albicioasă.

Sistemul nervos: inccordonarii, ataxie, astazie, poziții anormale ale capului și gâtului,
torticolis, paralizie etc.

Piele și mucoasele aparente: edem al capului și gâtului, cianoza și tumefacția crestelor

și bărbițelor, tumefacție și congestie conjunctivală, hipersecreție conjunctivală, hemoragii
difuze la nivelul picioarelor și ghearelor etc.

Scăderea producțiilor: scăderea bruscă a producției de ouă și modificări ale calității

ouălor (ouă cu coaja moale sau lipsite de coajă).

3. Examenul necropsic
 Etapele examinării necropsice sunt:

-examenul exterior al cadavrului :

- se menționează în Fișa de examinare a cadavruluiu:

-modificările cadaverice;

-repartiția și extinderea leziunilor cutanate.

-deschiderea cadavrului:

-se realizează sub îndrumarea unei persoane competente și de o persoană

autorizartă;

-se face o apreciere calitativă și cantitativă a modificărilor.

-examinarea propriu-zisă a cadavrului: toate modificările se consemnează într-o Fișă

de observație necropsică......... Laboratorul județean.

Reguli de respectat la realizarea examenului necropsic:

-evitarea pe cât posibila a transportului cadavrelor sau a păsărilor cu semne clinice

în afara perimetrului exploatațiilor avicole sau chiar în incinta acestora dacă în spațiul respectiv,
există și alte efective de păsări;

-examenele necropsice pot fi executate în locația respectivă cu condiția alegerii unui

spațiu adecvat care să întrunrască cerințele necesare operațiunilor de contaminare;

-în unitățile avicole de tip industrial, în care există spații destinate efectuării necropsiei,
se va alege o suprafață ușor de decontaminat, dar situată la o distanță cât mai mare de
adăposturile de păsări;

-în cazul în care se decide efectuarea examenelor necropsice într-un Laborator autorizat,
ambalarea și transportul se vor face cu un mijloc de transport autorizat ala DSVSA județeană,
cu respectarea tuturor normelor de biosecuritate în vigoare;

-păsările cu semne clinice extrase din efectiv, vor fi eutanasiate prin mijloacele prevăzute
și cu aplicarea legislației în vigoare;
 -personalulul care se ocupă de aceste aspecte (medici veterinari, tehnicieni veterinari,
personalul suxiliar al unității, sau membrii gospodăriei unde a fost descoperită suspiciunea) vor fi
dotați cu echipament complet de protecție, instrumentar, recipiente, tampoane sterile, bandaje,
etichete, mijloace de refrigerare, necesare recoltării de probe în vederea executării examenelor de
laborator.

Tabloul morfopatologic al Gripei aviare:

1. Forma supraacută:
-leziunile sunt slab exprimate,
-cianoza crestei și bărbițelor;
-leziuni congestive în musculatură și viscere.

2. Forma acută:

-cianoza crestei și bărbițelor;

-edeme subcutanate la nivelul capului, gâtului și a musculaturii

pectorale;

-congestia mucoasei conjunctivale asociate cu prezența unor echimoze și

peteșii;

-exsudat mucos abundent în cavitatea bucală, în sacul conjunctival, la

nivel palpebral și în căile respiratorii anterioare;

- congestia musculaturii;

-în trahee se constată exsudat mucos, sau exsudat hemoragic;

-sacii aerieni încărcați cu exsudat mucos; aerosaculite;

-hemoragii la nivelul ghearelor;

-aspect hemoragic, în:

-seroasa cavității toraco-abdominale,

-masa musculaturii pectorale

 -în epicard,

-proventriculită hemoragică difuză;

-în peretele stomacului glandular;

-în musculatura intestinală,

-în mezenter

-stomacul glandular și papilele glandulare proventriculare sunt tumefiate;

-cuticula stomacului muscular se desprinde cu ușurință și sub ea se observă

hemoragii și eroziuni;

-enterită catarală sau hemoragică;

-rinichii congestionați și uneori se observă prezența depozitelor de urați;

-ovarele hemoragice sau degenerate cu eventuale necroze;

-splenomegalie;

-pancreasul tumefiat;

-în cavitatea peritoneală se pot observa pseudoconcremente de ouă, la păsările care

supraviețuiesc mai mult de 7-10 zile;

Histopatologic: modificări circulatorii care se manifestă prin edeme, hemoragii și

infiltrate perivasculare în miocard, splină, pulmon, creier, sistem nervos.

Curcan- aspectele morfopatologice sunt asemănătoare cu cele de la găină dar de

intensitate mai mică.

Palmipede- leziunile sunt discrete sau chiar pot lipsi.

Diagnosticul de certitudine:

Presupune:

- prelevarea de probe,

-transportul,
 -efectuarea examenelor virusologice care implică metode de izolare, cultivare, tipizare,
stabilirea virulenței.

1. Prelevarea și transportul probelor

-se realizează numai de către personalul sanitar-veterinar specializat;

-conform Legislației în vigoare privind protrcția împotriva Gripei aviare;

-recoltarea se face în funcție de analiza de laborator cerută;

-trebuie recoltate un număr apreciabil pentru relevanța examenului de laborator

(rezultatele finale trebuie să aibă o precizie de 95 % pentru o prevalențță de 30 % a probelor
pozitive din totalul probelor prelevate, Harder și col, 2006:

-la prelevarea probelor trebuie eliminată orice posibilitate de contaminare a

mediului; toate materialele și instrumentarul să fie de unică folosință; cele care au venit în
contact cu păsările bolnave trebuie distruse;

-Probele de sânge:

- se recoltează prin puncția venei brahiale;

-- recipientele cu sânge se agită ușor, după preluare;

- în recipiente sterile prevăzute cu substanțe anticuagulante ( (EDTA-

acid diaminotetra acetic; heparină) cand recoltarea se face pentru examene virusologice;

-când recoltarea se face pentru examene bacteriologice nu se folosesc

substanțele anticuagulante;

- probele pentru examenele serologice, se pun într-un stativ, la

temperatura camerei (1-2 ore), în vederea formării coagulului de sânge și pentru
exprimarea serului.

Probele de materii fecale, tampoanele cloacale (tampoane sterile cu care se raclează

suprafața mucoasei cloacale);

Tampoanele se introduc în recipiente speciale, care conțin medii de transport adecvate.

 Probele de secreții nazale- se introduc tampoane sterile în oro-farinxul păsărilor
suspecte.

Tampoanele sunt imersate pe timpul transportului în 1-3 ml, mediu de steril izotonic în
care au fost dizolvate antibiotice și substanțe proteice sterile (0,5 % albumină serică bovină, până
la 10 % ser bovin sau mediu BHI- brian heart infusion).

Probele de organe și țesuturi:

-se prelevează după realizarea examenului necropsic;

- prelevarea se face de personal specializat sanitar-veterinar;

-prelevarea se face cu instrumentar adecvat, în recipiente sterile pentru fiecare

probă în parte;

- recipientele se etichetează;

-imediat după prelevare probele se refrigerează;

-dacă nu pot fi trimise la Laborator în 48 de ore, probele se congelează.

-pe timpul transportului există o Foaie de transport unde este trecut numărul,
felul probelor, data și ora recoltării etc.

Diagnosticul de Laborator

Există 2 categorii de Metode de identificare:

1. Metode directe de identificare

1. Izolarea virusului
-presupune inocularea probelor;
-inocularea se face la ouă embrionate de găină, în vârstă de 9-11
zile;
-probele pot fi: secreții, raclate sau omogenizate tisulare;
-în funcție de virulența tulpinii:
 -embrionii pot să moară sau nu după 5 zile chiar fără apariția
unor leziuni caracteristice în cazul, în care virusurile sunt slab patogene
(formele LPAI);
-embrionii pot să moară după 48 de ore, când este vorba de
virusuri HPAI;

2.Evidențierea prezenței antigenului viral în lichidul alantoidian, al ouălor

inoculate embrionate și stabilirea virulenței se poate face prin:

- hemaglutinare (IH)

-inhibarea hemaglutinării (IHA);

-indicele de patogenitate intravenoasă (IVPI)

-reacția de polimerizare în lanț, prin transcripție inversă (RT- PCR)

-reacția de imunofluorescență (IF)

-metode imunoenzimatice (ELISA)

Primele 3 metoce reprezintă tehnici clasice de diagnostic și de stabilire a patogenității;

rezultatele se obțin în intervale lungi de timp.

Trebuie folosite Ouă SPF, adică libere de floră patogenă și seruri specifice
antihemaglutinine și antineuraminidază.; necesită personal specializat.

RT-PCR

-prezența ARN-ului specific virusurilor gripale se evidențiază prin aplicare unei

reacții de polimerizare în lanț, care se referă la anumite segmente ale genei M (reprezintă
segmentul genomic cel mai conservat pentru virusurile gripale ce aparțin diferitelor subtipuri)
sau gena care codifică proteinele nucleocapsidei; în cazul în care la acest test se obține un
rezultat pozitiv, se amplifică prin RT-PCR segmentele de hemaglutinină H5 și H7, în scopul
identificării unei eventuale evoluții a influenței aviare.

În cazul unui nou rezultat pozitiv se continuă cu secvențarea unui anumit fragment al
genei pentru HA în scopul diagnosticării patotipului viral, adică diferențierea dintre virusurile
LPAI și HPAI., pe baza analizei configurației situsului de clivare hemaglutinic.
 2. Identificarea tulpinilor de virus H5 N1, aparținând descendenței asiatice

RT-PCR-se aplică și pentru identificarea și altor subtipuri virale în afara celor H5 și H

7, prin analiza subunității HA-2.

Există primeri pentru fiecare tip de neuraminidază; o caracterizare complexă a unui izolt
viral se poate realiza în 3 zile.

Tehnica RT-PCR și tehnica de hibridare a ADN-ului sunt asociate cu un anumit grad de

incertitudine din cauza posibilității de apariție a unoe rezultate fals negative în situația în care
s-au produs anumite mutații la situsul de legare a primerilor.

Se recomandă ca procedeu optim de diagnostic al gripei aviare, o asociere a celor două

categorii de metode respectiv tehnicile moleculare și tehnicile clasice descrise anterior.

Tot ca metode de identificare directă, se poate folosi:

Testul de imunofluorescență:

Pentru detectarea antigenului antiviral, în amprente tisulare sau secțiuni criostatice

realizate din diferite organe.

Testul imunoenzimatic ELISA

Reprezintă o succesiune de reacții antigen-anticorp, ultima fiind relevată printr-o reacție

enzimatică cu schimbarea culorii unui cromogen; această metodă este folosită pentru
detecția/confirmarea unui agent patogen sau pentru detecția/evaluarea statusului imun umoral.

Metodologia ELISA

Combinația unică de sensibilitate, specificitate și aplicabilitate practică pentru detecția

unor antigene sau anticorpilor.

Conform Oficiului Internațional de Epizootii, tehnicile ELISA sunt recomandate ca teste

principale în cazul a mai multor boli (11) și ca teste alternative la alte 18 boli.

Există variante:
 -varianta directă, are ca scop identificarea/detecția antigenului sau a anticorpilor;

- varianta indirectă, identificarea/detecția anticorpilor, este cea mai utilizată;

-varianta Sandwich (captura de anticorpi)-servește la identificarea și detecția

antigenelor,

-varianta dublu Sandwich (captura de complex antigen-anticorp)- scop,

identificarea antigenelor.

Avantaje:

-test extrem de sensibil deoarece decelează valori sub pragul de detecție

caracteristic, altor teste de imunologice,

-este un test cantitativ, nivelele de hormoni sunt exprimate ca trituri, sau mai
simplu ca unități Elisa-UE, indicator care se aplică în supravegherea colectivelor de animale
pentru departajarea subpopulațiilor susceptibile de cele rezistente sau de cele recent expuse la
boală.

Identificarea directă a antigenului viral, în probele de țesut provenite de la păsări

infectate se pot face si prin tehnica de colorare imunohistochimică care utilizează anticorpi
monoclonali față de nucleoproteinele virusurilor gripale de tip A.

Tehnica imunohistoenzimatică- permite în același timp evaluarea eventualelor

modificări histologice.

Tehnicile de imunohistochimie au la bază reacţia antigen-anticorp, antigenul urmărit

aflându-se la nivelul țesutului care va fi analizat, iar anticorpii utilizaţi în scopul evidenţierii
acestuia sunt comercializaţi sub diverse forme – mono- sau policlonali, concentraţi sau diluaţi,
gata de a fi utilizaţi („ready-to-use”).

Situsul reacției antigen-anticorp se află la nivel celular (memebranar, citoplasmatic –

filamente intermediare /organite celulare sau la nivel nuclear),  iar evidențierea se realizează
printr-o metodă indirectă de legare – un lanţ de alte reacţii în mai multe faze succesive cu
anticorpi secundari marcaţi.
 Anticorpul primar este nemarcat, de acesta se leagă un anticorp secundar marcat cu
peroxidază, de care este legat un sistem de relevare. Această tehnică este mai sensibilă deoarece
permite vizualizarea antigenelor existente în concentraţii mici. Metoda folosită în Departamentul
de Anatomie patologică Personal Genetics foloseşte un substrat cromogen (DAB) la care este
ataşat anticorpul secundar.

Pentru reuşita reacţiilor imunohistochimice este esențială fixarea corectă a fragmentului

biopsic, astfel încât epitopii (situsurile antigenice) să nu fie inactivaţi ori denaturați. Optim,
fixarea în formol tamponat 10%  durează maxim 24 h, ce depăşeşte perioada de 48 h inactivează
majoritatea epitopilor, determinând reacţii fals negative.

Metode de identificare indirectă

-utilizarea testelor serologice în monitorizarea de rutină;

-presupune identificarea anticorpilor specifici antigripali în probele de ser

sanguin sau în gălbenuțul de ou prin folosirea următoarelor tehnici:

Reacția de inhibare a hemaglutinării (IH)- pentru decelarea anticorpilor

specifici în serul păsărilor suspecte și necesită utilizarea unor subtipuri antigenice de referință.

Imunodifuzia în gel de agar și tehnica imunoenzimatică ELISA- pentru

decelarea anticorpilor virali cu specificitate de grup, activi împotriva proteinelor nucleocapsidei.

La galinacee, anticorpii specifici împotriva virusului gripal, ating niveluri decelabile , în

decursul celei de a doua săptămâni de la infectare. Anticorpii din gălbenușul de ou, ating titruri
decelabile cu o întârziere de câteva zile.

Conduita de supraveghere și diagnostic în Gripa aviară

Conform deciziei ANSVSA nr. 9338/29,11. 2005- a fost aprobată conduita de efectuare
s examenelor de supraveghere și diagnostic a influenței aviare, în Laboratoarele sanitar-
veterinare de stat (LSVS) după cum urmează:

Supravegherea seologică
1. Probele de seruri prelevate de la galinacee se testează prin ELISA (Enzyme linked
immunosorbernt assay); serurile care prezintă reziultate pozitive la Elisa, se retestează
orin imunodifuzie în gel de agar și/sau reacția de inhibare a hemaglutinării pentru
antigen H5.
2. Probele de seruri prelevate de la palmipede, inclusiv palmipede sălbatice se testază
prin ID și/sai IHA.
3. Pentru probele de seruri cu rezultate negative la testele serologice LSVSJ va elibera
buletin de analiză.
4. În cazul efectivelor de păsări pozitive la testele serologice ID și/sai IHA se vor
preleva tampoane traheale și cloacale în vederea efectuării de examene virusologice.

Supravegherea virusologică

1. În caz de suspiciune clinică sau de rezultate pozitive la testele serologice se

prelevează tampoane traheale și cloacale, care se examinează prin teste rapide de
detecție a antigenului viral.
2. Probele pozitive la testele imunocromatografice rapide se expediază către
Laboratorul Națonal de Rfeerință pentru Influența aviară, din cadrul IDSA,
pentru izolarea virusului.
3. Probele negative, la testele imunocromatografice rapide se examinează la LSVSJ
prin RT-PCR.
4. Pentru probele cu rezultate negative la testul RT-PCR, LSVSJ va elibera Buletine
de analiza.
5. Probele negative la testele imunocromatografice rapide din celelate județe se
examinează la Laboratorul de referință pentru Influența aviară din cadrul IDSA.
6. Probele pozitive la testul RT-PCR vor fi expediate imediat de către Laboratoarele
de biologie moleculară menționate, către LNRD- IA din cadrul IDSA pentru
izolarea virusuului.

Remember: Ortomyxoviridae;
 -virusurile gripale aviare fac parte din Myxovirusuri (Myxa, în limba greacă
înseamnă mucus);
- Ortomyxovirusurile:
-particule de formă sferică sau ovoidă:
-diametrul 80-120 nm:

- virionii, au forma sferică, diametrul 200 nm și conțin spiculi de

Hemaglutinină și Neuraminidază;

- Genomul este de tip ARN (-), alcătuit din 8 segmente, dispuse în nucleu;
-ARN + nucleoproteina (RNP) = structură helicoidală + 3 polipeptide cu
activitate polimerazică asociată fiecărui segment;
-la virusul gripal de tip A, genomul codifică 11 proteine:
-hemaglutinina (HA);
-neuraminidaza (NA);
-proteinele matrice M1, M2;
-proteinele nonstructurale NS1, NS2;
-trei polimeraze PB1, PB2, PB3;
-nucleoproteina NP (proteinele nucleocapsidei).
-există 16 subtipuri de HA – hemaglutinină ( H1- H 16);
- HA:

- facilitează intrarea virusului în celula gazdă, prin atașarea la acidul sialic de pe

receptorii celulelor epiteliale,

-favorizează fuziunea membrane,

-este componenta esențială a vacccinurilor gripale.

-9 subtipuri de NA, recunoscute la păsările acvatice;

-are activitate enzimatică,
-scindează acidul sialic din proteinele virionului
- facilitează eliberarea particulelor virale din celulele infectate.
 Mutațiile apărute între antigenele de suprafață ale HA și NA se datorează unor presiuni
de selecție într-o populație imună care să conducă la o schimbare a direcției antigenice, de-a
lungul timpului- drift antigenic, ceea ce explică epidemiile repetate cu virus gripal A sau Virus
gripal B.

Genomul segmentat al virusurilor gripale permite ca rearanjarea genetică să apară

atunci când două virusuri gripale infectează aceeași celulă.

Acest lucru generează diversități genetice pentru transmiterea interspecies și permite

sustragerea gazdei de la răspunsul imun print-o schimbare majoră antigenică- Shift antigenic.

Subtipurile virusurilor gripale iau naștere prin drift și shift antigenic .