HORMONUL DE CREŞTERE UMAN RECOMBINAT ŞI

SOMATOSTATINA RECOMBINATĂ
 
GENERALITĂŢI PRIVIND HORMONUL DE CREŞTERE
ENDOGEN UMAN 
(HGH)
         Hormonul de creştere al omului (hGH – human growth
hormone) este un hormon de
tip proteină, esenţial pentru creşterea normală şi pentrudezvoltarea
organismelor. Se mai numeşte hormonul somatotrop (STH)
sau somatotropină.
         hGH influenţează multe aspecte ale metabolismului uman
printre care: stimularea procesului de lipoliză, stimularea sintezei
proteinelor, inhibarea metabolismului glucozei.
         Acest hormon a fost izolat şi identificat în jurul anului 1950 din
extracte obţinute din glandele pituitare (hipofiza anterioară), glande care
la rândul lor au fost recoltate de la cadavre sau de la pacienţi care fuseseră
supuşi hipofizectomiei. Primele utilizări -1957-58 pentru stimularea
creşterii copiilor hipopituitari        Clonarea hormonului uman al
creşterii a avut loc pentru prima dată în 1979, iar prima utilizare la
oameni a hormonului de creştere recombinat (rhGH) a fost comunicată în
literatura de specialitate în 1982.
Creutzfeldt-Jakob, - hGH derivat din glanda pituitară. -
contaminarea posibilă a preparatelor de hGH obţinute din glanda pituitară,
cu “prion"-ul - scoaterea acestor produse de pe piaţa comercială din
S.U.A., în 1985 ca urmare rhGH.
         Preparate pe bază de rhGH au fost produse la început de
către bacterii (E. coli) şi spre deosebire de hGH endogen au conţinut o
grupare de metionină terminală şi a fost notat met- rhGH.
                Produsele care conţineau rhGH cu secvenţă naturală au

fost obţinute ulterior atât în celulele bacteriilor cât şi în

celulele mamiferelor.
STRUCTURA HORMONULUI DE CREŞTERE ENDOGEN
UMAN ŞI IZOHORMONII HGH
         Forma principală circulantă a hormonului de creştere uman (hGH)
este o proteină neglicozilată cu 22 kD compusă din 191 resturi de
aminoacizi care sunt legate prin punţi de disulfură, formându-se două
bucle peptidice.
Hipofiza anterioară secretă mai multe izoforme de hormoni de
creştere principale fiind: monomerul cu 22 kD şi monomerul cu  20 kD.
 La oameni există două gene hGH notate: gena hGH-N şi gena
hGH-V. Gena hGH-N este exprimată în glanda pituitară şi este direct
răspunzătoare de producerea formei cu 22 kD, “normale”, a hormonului
de creştere endogen uman.
         Gena hGH-V (gena variabilă) este exprimată în placentă şi este
direct răspunzătoare de producerea unor forme "variabile" de hGH
întâlnite în cantităţi mari la femeile însărcinate în cursul celui de al treilea
trimestru de sarcină.
 
SECREŢIA ŞI REGLAREA SECREŢIEI HORMONULUI DE
CREŞTERE UMAN
Hormonul de creştere hipofizar este stocat în hipofiza anterioară
sub formă legată de ioni de zinc fiind eliberat din această formă în
urma secreţiei acestuia în plasmă. Aproximativ 40% din hormonul de
creştere secretat se leagă în plasmă de proteine specifice numite GHBP
(growth hormone binding proteins), proteine care leagă hormonul de
creştere. Aceste proteine sunt de două feluri: cu afinitate mare pentru
hormon şi cu afinitate redusă.
         Cedarea hormonului de creştere din glanda pituitară e reglată
prin feedback scurt de două peptide hipotalamice cuplate şi anume o
peptidă stimulatoare, hormonul care stimulează eliberarea
hormonului de creştere (GH-RH – growth hormone releasing
hormone) numită şi somatoliberină şi o peptidă inhibitoare,
somatostatina notată cu GH-RIH – growth hormone releasing inhibitor
hormone.
Factorii care influenţează secreţia de hGH sunt:
-          factori hormonali dintre care unii sunt stimulatori (somatoliberina
hipotalamică, estrogenii, glucagonul, vasopresina), iar alţii
sunt inhibitori (somatostatina, hipotiroidismul);
-          factori metabolici dintre care unii sunt stimulatori (starea de foame,
aminoacizii plasmatici, uremia crescută) şi alţii
sunt inhibitori (hiperglicemia, nivel crescut de acizi graşi liberi în
sânge);
-          factori neurali dintre care unii sunt stimulatori (somnul, stresul de
tipul traumatismelor, emoţiilor, infecţiile diverse, agonişti α-
adrenergici, antagonişti β-adrenergici, L-DOPA, iar
alţii inhibitori (agoniştii β-adrenergici, agonişti α-adrenergici).
        
ACŢIUNILE BIOLOGICE ALE HORMONULUI DE CREŞTERE
         Hormonul de creştere are acţiuni metabolice şi de promovare a
creşterii care sunt bine definite. Astfel hGH stimulează creşterea
cartilajelor şi oaselor în mod direct, prin intermediul receptorilor săi
prezenţi în aceste ţesuturi şi indirect prin intermediul creşterilor locale
ale concentraţiei de IGF-I numit şi somatomedină.
 
OBŢINEREA HORMONULUI DE CREŞTERE UMAN
RECOMBINAT (RHGH)
         Producţia de hormon de creştere prin inginerie genetică are şi
un interes istoric, fiind rezultatul practic al primului contract care are la
bază "comercializarea genei", contract industrial realizat în 1978 între
firma farmaceutică Kabi Vetrum AB din Stokholm (Suedia) şi
firma Genentech (S.U.A.)specializată în construirea de microorganisme
modificate prin inginerie genetică.
         Interesul medical pentru acest hormon constă în faptul că absenţa lui
din organism determină apariţia nanismului, maladie care poate
fi vindecată prin administrare de hormon.
         În mod normal, hormonul de creştere uman (care este
un polipeptid conţinând 191 de aminoacizi) este elaborat de
către ţesuturile glandei pituitare. Întrucât are specificitate de specie,
sursa naturală de extragere a fost  glanda umană provenind de la cadavre,
sursă care este foarte limitată şi deci s-au obţinut cantităţi foarte mici.
Tratamentul cu hormon în cazul nanismului hipofizar implică două injecţii
săptămânale a câte 2 mg. fiecare, începând de la 4 - 5 ani, pe toată
perioada pubertăţii, costul pentru un an al tratamentului unui copil
ridicându-se la 10.000 dolari.
Din fericire, tehnologia ADN recombinat a oferit o posibilitate
avantajoasă pentru producerea hormonului de creştere uman, mărind şansa
de a trata numeroşi copii afectaţi de această maladie. În şapte ore, dintr-
un litru de cultură bacteriană, se obţine cantitatea de hormon care s-ar
putea extrage prin metodele anterioare pornind de la 60 de glande
hipofizare.
Procedeul industrial de sinteză al hormonului de creştere uman se
bazează pe utilizarea unei tulpini de E. coli modificată prin tehnologia
ADN recombinat.Gena HCU a fost obţinută prin combinarea metodei
chimice cu cea enzimatică de sinteză a ADN: prima parte a genei (care
codifică aminoacizii 1 - 24) a fost sintetizată chimic prin
metoda fosfotriesterilor, iar partea a doua (corespunzătoare
aminoacizilor 25-191) a fost sintetizată enzimatic, utilizând ARNm
specific genei HCU ca matriţă, iar reverstranscriptaza ca enzimă pentru
obţinerea ADNcomplementar.
Pentru a marca începutul genei, sinteza chimică a primei părţi a
genei a inclus şi ataşarea codonului ATG, care
specifică sinteza metioninei. În felul acesta s-a asigurat startul corect al
sintezei genei HCU şi etapa de desprindere de ß-galactozidază.
 Pe de altă parte, ADNc sintetizat pe modelul ARNm izolat din
glanda pituitară a fost la rândul său modificat în aşa fel încât să conţină
informaţia genetică doar pentru aminoacizii 25-191 ai genei HCU. În
acest scop, ADNc a fost hidrolizat cu enzima de restricţie Hae III, care
acţionează asuprasecvenţei GGCC situată în prima parte a ADNc, exact
în zona codonilor care specifică sinteza aminoacizilor 24-25.
În urma hidrolizei apar două fragmente de ADNc, unul mic care
se îndepărtează, iar al doilea - cel mare - corespunzător aminoacizilor 25
- 191, estecuplat, după purificare, cu prima parte a genei HCU sintetizată
chimic. Prin aceste operaţii se ajunge în final la obţinerea genei întregi
HCU.
În continuare, cu ajutorul AND-ligazei, gena este ataşată vectorului
pBR 322 prevăzut cu regiunea de control a operonului lac. ADN
recombinat astfel obţinut este utilizat apoi la transformarea celulelor de E.
coli. Celulele transformate produc gena HCU sunt izolate şi prelucrate
pentru a produce substanţa proteică.
 
PREPARATE FARMACEUTICE CU HORMON DE CREŞTERE
UMAN
 
Tipul de hormon de
Sursa, tehnologie Denumirea comercială Firma producătoare
creştere
Hormonul de creştere
Glande pituitare CRESCORMON Kabi Vetrum AB
derivat din glanda
de la cadavre NANORMON Novo Nordisk
pituitară (pit-GH)
Metionil-hormon de
Tehnologia ADN
creştere uman SOMATONORM Kabi Vetrum AB
recombinat prin
(met-rhGH) PROTROPIN Genentech, Inc.
bacteria  E. coli
(Somatrem)
GENOTROPIN Kabi Vetrum AB
Tehnologia ADN NORDITROPIN Novo Nordisk
recombinat prin NUTROPIN Genentech, Inc.
Somatotropina, bacteria  E. coli HUMATROPE Eli Lilly and Co.
secvenţa naturală BIO-TROPIN Bio-Tehnology General
proteică a hormonului Proteină
de creştere uman recombinată
(rhGH) produsă în celule SEROSTIM Ares
animale (linie de SAIZEN Serono
celule derivată de
la şoarece)
 
UTILIZAREA CLINICĂ A PREPARATELOR FARMACEUTICE CU
HORMON DE CREŞTERE UMAN RECOMBINAT
În continuare prezentăm unele informaţii privind principalele
indicaţii clinice ale hormonului de creştere uman recombinat.
         A. Deficienţă în hormon de creştere/statură idiopatică mică
B.    Sindromul Turner
         Sindromul Turner este o maladie întâlnită, mai ales, la femei şi
care este cauzat de pierderea parţială sau totală a unui cromozom
sexual şi caracterizată printr-o scădere a creşterii intrauterine şi
postnatale, înălţime finală mică a adultului, dezvoltarea incompletă a
ovarelor şi a caracterelor sexuale secundare precum şi prin alte
anomalii fizice.
C.   Insuficienţa renală cronică (IRC)
         Copii care prezintă această insuficienţă renală cronică cresc greu,
probabil datorită deficienţelor de metabolism.    
D.   Deficienţe de hormon de creştere la adulţi şi vârstnici
F.    Sindromul malnutriţiei şi sindromul pierderii în greutate
G.   Alte indicaţi clinice ale rhGH
terapii ale sterilităţii femeilor
vindecării rănilor şi arsurilor
 
EFECTE ADVERSE ALE ADMINISTRĂRII
HORMONULUI DE CREŞTERE UMAN RECOMBINAT
Fenomene adverse au fost observate doar în cazul unui număr mic
de copii şi au inclus: hipertensiunea craniană, intoleranţa faţă de
glucoză şiformarea de anticorpi anti-hGH. apariţia leucemiei, dar nu s-
a stabilit o corelaţie definită.
Hormonul de creştere a produs retenţia semnificativă a lichidelor la
pacienţii adulţi, ceea ce a condus la creşterea greutăţii corpului, umflarea
articulaţiilor, artralgii şi alte simptome. Aceste simptome au fost
trecătoare, dispărând odată cu reducerea dozelor de rhGH sau după
întreruperea tratamentului.
 
FORMULAREA PREPARATELOR FARMACEUTICE CU
HORMON DE CREŞTERE UMAN RECOMBINAT
         Activitatea produselor cu rhGH a fost exprimată în Unităţi
Internaţionale/mg (UI/mg). Etalonul sau standardul iniţial stabilit
în 1982 pentru preparatelepit-hGH a fost egal cu 2 UI/mg. Standardul
pentru produsele cu rhGH a fost de 2,6 UI/mg până în septembrie 1994.
Etalonul curent, stabilit în septembrie 1994este egal cu 3,0 UI/mg.
         Majoritatea formulărilor curente se prezintă sub formă de
preparate liofilizate care trebuie să fie reconstituite înainte de injectare.
Formulările liofilizate includ de obicei 5 sau 10 mg de proteină biologic
activă încorporată într-un excipient care este constituit dintr-un tampon
fosfat, glicocol şi/sau manitol.
         Preparatele sunt reconstituite de obicei cu apă sterilă pentru injecţii
în vederea unei singure utilizări sau cu apă sterilă sau soluţie salină
bacteriostaticăîn vederea mai multor administrări.
         Recent a fost aprobat în vederea utilizării în SUA un preparat lichid
cu rhGH (NUTROPIN AQ, Genentech Inc.) care conţine 10 mg de proteină
în tampon citrat conţinând şi polisorbat 20, fenol, clorură de sodiu.
 
OBŢINEREA SOMATOSTATINEI PRIN RECOMBINARE
GENETICĂ
GENERALITĂŢI. RĂSPÂNDIRE ÎN ORGANISMUL
UMAN.
Somatostatina a fost descrisă iniţial ca factor
hipotalamic care inhibă eliberarea somatotropinei hipofizare (GH-RIH
sau SRIH). Ulterior somatostatina a fost identificată şi în pancreas, unde
este produsă de celule de tip D insulare, la nivelul
tractului gastrointestinal precum şi în creier.
         La fel ca majoritatea hormonilor cu structura polipeptidică,
somatostatina este elaborată sub forma
unui precursor cu greutate molecularărelativ mare, care se transformă în
cele două forme active ale somatostatinei (cu 14 şi
respectiv 28 de aminoacizi).
 
STRUCTURA CHIMICĂ
Somatostatina este un hormon local care se prezintă sub două forme
active ciclice:
-         cu 14 aminoacizi (tetradecapeptid)
-         cu 28 aminoacizi
 
Somatostatina 14
 
                  S                                     
                                                    S
 

Ala- Gly- Cys- Lys- Asn- Phe- Phe- Trp- Lys- Thr- Phe- Thr- Ser- Cys
 
Somatostatina 28
 
Ser-Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys-Ala-Gly-

-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys
 
 
                S                                                 
                            S
 
Forme active ale somatostatinei (SRIH)
 
ACŢIUNI BIOLOGICE ŞI FARMACOLOGICE
Somatostatina hipotalamică prin acţiune paracrină modulează
secreţia unor hormoni sintetizaţi de către hipofiză. Astfel, somatostatina
din hipotalamusinhibă eliberarea hormonului de creştere
hipofizar (hormonul somatotrop hipofizar, STH, GH).
Tot prin acţiune paracrină somatostatina
pancreatică inhibă secreţia de glucagon si insulină precum si secreţiile
exocrine ale pancreasului.
La nivelul tractului gastrointestinal, somatostatina inhibă secreţia
de gastrină, de acid clorhidric, pepsină.
La nivelul creierului cele două neuropeptide active: somatostatina
14 şi somatostatina 28 au acţiuni biologic mai puţin cunoscute (probabil
caneurotransmiţători)
 
OBŢINEREA SOMATOSTATINEI PRIN
BIOTEHNOLOGIE
Izolarea somatostatinei din hipotalamus sau din alte ţesuturi este
deosebit de dificilă; Guillemin (descoperitorul acestui hormon) a trebuit să
prelucrezejumătate de milion de creiere de oaie pentru a obţine 1 mg de
somatostatină.
În urma cercetărilor efectuate de colectivul condus de  Guillemin,
care au stabilit structura primară a somatostatinei (cei 14
aminoacizi constitutivi), s-a dedus structura genei somatostatinei, în
baza echiva lenţelor stabilite de codul genetic.
Trebuie precizat că pentru o anumită secvenţă de aminoacizi se pot
formula mai multe structuri pentru gena corespunzătoare,
întrucât codul geneticeste degenerat, iar unul şi acelaşi aminoacid poate
fi codificat de mai mulţi codoni. În acest caz, alegerea codonilor s-a
făcut pe baza unor observaţii experimentale, care au precizat preferinţa
sistemului celular de E. coli de a exprima anumiţi codoni.
Itakura şi colaboratorii au sintetizat gena somatostatinei din 8
blocuri de oligodeoxinucleotide monocatenare obţinute prin metoda
fosfotriesterilor. Sinteza a inclus şi ataşarea nucleotidelor corespunză
toare pentru situsul enzimei de restricţie Eco RI şi nucleotidele codonului
de start (ATG), iar la capătul genei s-au adăugat nucleotidele pentru doi
codoni de stop, plus nucleotidele pentru situsul enzimei de restricţie
Bam HI.
 Gena asamblată a fost cuplată de vectorul de exprimare construit
din plasmida pBR 322 şi elementele de reglaj
ale operonului lac. Orientarea corectă a genei a fost asigurată de
existenţa în vector a două capete coizive, primul format din nucleotide ce
constituie jumătate din situsul enzimei Eco RI, iar al doilea din
nucleotidele specifice pentru jumătate din situsul enzimei Bam HI.
Cu ADN recombinat astfel obţinut s-a făcut transformarea celulelor
de E. coli. In celulele transformate se sintetizează somato
statina fuzionată cu -galactozidaza. Tratarea cu BrCN a acestui
complex izolat din celule, permite obţinerea somatostatinei pure, care s-a
dovedit a fi, din punct de vedere structural şi biologic, identică cu
hormonul produs de hipotalamusul uman.
Referitor la obţinerea somatostatinei umane cu ajutorul bacteriilor
modificate, este de menţionat că în acest caz s-a reuşit să se dovedească
pentru prima dată că o genă umană, proiectată şi sintetizată de om, se
poate exprima corect şi eficient într-un sistem bacterian.
 
PRODUSE FARMACEUTICE CU SOMATOSTATINĂ
Datorită faptului că somatostatina inhibă secreţia hormonului de
creştere, a insulinei şi a glucagonului, ea este din ce în ce mai uti lizată ca
un agent terapeutic eficace în tratamentul acromegaliei, pancreatitei
acute şi în special a diabetului insulino-dependent.
Medicamentul STILAMIN, comercializat de firma Serono,
conţine acetat de somatostatina 14, un tetradecapeptid
ciclic obţinut sintetic, identic ca structură şi acţiune cu somatostatina
endogenă.
Este indicat în tratament curativ în hemoragii severe cauzate
de ulcere gastrice şi duodenale sau varice esofagiene, hemoragii severe
care însoţescgastrita acută erozivă sau gastrita hemoragică şi în
tratament profilactic pentru prevenirea complicaţiilor post-operatorii di
n chirurgia pancreatică. Ca tratament adjuvant este folosit
în cetoacidoza diabetică.