Sunteți pe pagina 1din 16

sfefdseczsczxsdfsafdaw

Detectarea și cuantificarea speciilor de


carne prin qPCR (adwcxzsdawin
timpzsc real) în alimente prelucrate
termic care conțin ADN fragmentat

Detectarea și cuantificarea speciilor de carne prin qPCR (in timp real) în alimente
prelucrate termic care conțin ADN fragmentat

INTRODUCERE

Controlul calităţii produselor alimentare de origine animală abordează aspecte legate de


calitatea cărnii/produselor din carne din punct de vedere al consumatorului, al societăţii şi
îmbunătăţirea calităţii şi siguranţei alimentelor.

O altă problemă socio-economică, cu impact major în bugetele familiale, în special în


condiţiile economice actuale, este garantarea unor produse sigure şi protecţie împotriva
practicilor comerciale neloiale, a fraudelor alimentare, care îmbracă o importanţă capitală pe
piaţa de retail.

Tehnicile de biologie moleculară vin în întâmpinarea acestor probleme, reprezentând o


metodă de control a calităţii produselor alimentare.

TEHNICILE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ

 Identificarea se realizează prin metode bazate pe ADN

 Mai sigure (ADN prezintă stabilitate la temperaturi ridicate, presiune şi tratament chimic)

 Real Time PCR (cea mai populară metodă)

 Reproductibilitate şi specificitate mari

TEHNICILE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ PERMIT IDENTIFICAREA FALSURILOR


CARE VIZEAZĂ:

 comercializarea altor specii decât cea declarată;

 substituirea, în conservele de carne, a unui tip de carne cu altul;

 substituirea cărnii cu derivatele de soia şi amidonuri peste limita legală;

 conţinutul de carne de bună calitate

Printre cele mai consumate produse alimentare, in intreaga lume, sunt cele compuse din
combinatii de carne de porc si vita. Pentru a eticheta conform un produs alimentar si a se elimina
frauda cu carne, sunt necesare metode analitice precise si robuste in laboratoarele de control.

OBIECTIVUL LUCRARII: Imbunătățirea proiectării unor metode concise pentru cantificarea


s peciilor în alimentele procesate.

SCOPUL LUCRARII: Adecvarea metodelor qPCR pentru cuantificarea speciilor, chiar și


pentru produsele alimentare puternic procesate.

Până în acest moment, atât metodele PCR în timp real, cât și metodele de imunodetecție
bazate pe proteine s-au dovedit a fi cele mai bune pentru detectarea de rutină și cuantificarea
speciilor de carne din produsele alimentare.

Totusi, pentru detectarea proteinelor animale se utilizeaza frecvent ELISA, care


reprezinta o metoda rapida si ieftina pentru detectarea acestora. De asemenea, ELISA reprezinta
o metoda specifica a determinarii ADN-ului din produsele alimentare. Utilizarea acestor metode
în alimentele foarte procesate este de obicei limitată din cauza denaturării proteinelor.
Prelucrarea alimentelor la temperaturi ridicate duce, de asemenea, la fragmentarea ADN-
ului, care poate împiedica detectarea și cuantificarea prin metode PCR. Pentru a evita acest lucru,
este de obicei preferată utilizarea ampliconelor scurte, deși s-a demonstrat că ampliconii în jur de
350 de perechi de baze sunt încă adecvate pentru probele de carne foarte procesate.

In aceasta lucrare va fi determinata, pe cale experimentala, modalitatea in care se pot


depasi punctele slabe asociate frecvent cu prezenta ADN-ului in componentele alimentare, cu
scopul de a obtine informatii cantitative cu privire la factorii care afecteaza productia qPCR.

Aceste cercetari sunt efectuate deoarece metodele analitice pentru detectarea și


cuantificarea speciilor din alimentele procesate nu sunt pe deplin stabilite datorită unor efecte
negative intalnite in timpul tratamentelor termice asupra proteinelor și ADN-ului din compozitie,
fapt care compromite metode de detectare bazate pe imuno- și PCR.

De cele mai multe ori, pentru o detectie corecta, in aceasta lucrare a fost propusa
utilizarea standardelor adaptate la matrice. Aceasta nevoie aparare deoarece măsurările exacte ale
proporțiilor de carne în probe sunt compromise de varietatea tipurilor de țesuturi utilizate în
fabricarea alimentelor. Fracțiunile ADN pot să nu se coreleze cu conținutul de carne din probă
dacă metoda este calibrată cu ADN obținut din țesuturi (slănină grasă, mușchi fără grăsime, țesut
conjunctiv) diferite de cele prezente în probă.

AVANTAJELE UTILIZARII ADN-ului

Se preconizează că în următorii 50 de ani populaţia Planetei va creşte de la aproximativ


6,5 miliarde, cât măsoară astăzi, la peste 9 miliarde. Extinderea suprafeţelor cultivate nu se va
putea face astfel încât să compenseze creşterea numărului de oameni. Soluţia principală pentru
asigurarea securităţii alimentare este astfel reprezentată de creşterea producţiei la unitatea de
suprafaţă.

Micşorarea cantităţilor de erbicide, pesticide sau fertilizanţi aplicate în agricultură, în


urma utilizării plantelor transgenice, va reduce poluarea mediului.

 mărirea capacităţii de producţie;

 creşterea perioadei de păstrare ce poate favoriza transportul pe distante mai mari;

 produse care să reziste mai bine la lovire, reducând pierderile înregistrate de la recoltare
până la desfacere sau procesare prin manipulare necorespunzătoare;

 obţinerea unor OMG-uri cu gusturi şi culori diferite, în vederea diversificării ofertei;


rezistenta la îngheţ sau alte condiţii extreme de mediu

DEZAVANTAJELE UTILIZARII ADN-ului


Potenţialul culturilor transgenice de a rezolva problema securităţii alimentare este
important cel puţin din considerentul că promovarea tehnologiilor transgenice are ca element
central posibilitatea acestora de a asigura hrana pentru populaţia în continuă creştere a Terrei.

Produsele alimentare MG îşi pot modifica foarte mult compoziţia şi valoarea nutritivă.
Astfel, unele produse derivate din OMG-uri pot conţine substanţe toxice sau alergenice pentru
consumatori.

Unele OMG-uri prezintă caracteristici pentru distrugerea dăunătorilor.

Biodiversitatea este esenţială deoarece reprezintă bazinul genetic care va permite


organismelor să se adapteze şi să facă faţă schimbărilor viitoare din ecosistem.

SOLUTII PROPUSE: Detectarea și cuantificarea speciilor de carne supuse procesarii si


sterilizarii termice prin detectoarele compuse dintr-o combinație de primeri oligonucleotidici
specifici speciei si prin metoda MGB, asemanator produselor neprocesate.

Detectoarele bazate pe sondă MGB care vizează carnea de vită și porc sunt testate în
această lucrare pe amestecuri standardizate de carne de vită și carne de porc, atât crude, cât și
fierte / sterilizate, pentru a-și stabili capacitatea de a obține rezultate cantitative precise. În plus,
efectele gătitului și sterilizării termice asupra fragmentării ADN din aceste probe au fost, de
asemenea, testate, permițând corelarea gradului de deteriorare a ADN-ului prin proceduri de gătit
și rezultatul PCR.

Clasificarea produselor care pot fi testate pentru prezenta OMG-urilor se poate face după:

 gradul de procesare;

 tipul ingredientelor;

 modul de prezentare;

 gradul de umiditate.

Aceste aspecte sunt importante deorece o cunoaştere cât mai bună a proprietătilor intrinseci
ale probelor ajută la alegerea celor mai potrivite metode de eşantionare, pregătire şi extractie.

OMG (Organisme modificate genetic) = organisme (respectiv plante) al caror material genetic a
fost “transformat “ prin aplicarea tehnicilor de recombinare ADN.

Procesul de eşantionare reprezintă întodeauna o sursă de eroare care apare atunci când din
lotul de dimensiuni mari se aleg obiecte pentru a constitui proba ce va fi utilizată direct în
laborator. O bună practică de eşantionare asigură reducerea erorilor, ceea ce înseamnă de fapt
creşterea gradului de reprezentativitate al probei pentru populatia din care provine.
ANALIZA PCR

PCR : Realizează copii multiple ale unei secvenţe ADN specifice prin replicări succesive având
la bază proprietate ADN polimerazelor de a sintetiza în direcţia 5’-3’ o secvenţă de nucleotide
complementară cu secvenţa ADN ţintă (matriţă) pornind de la un primer cu capăt 3’-OH liber.
Astfel, numărul de copii ale secvenţei ţintă este dublat la fiecare replicare (ciclu), acesta crescând
deci exponenţial odată cu fiecare ciclu de amplificare.

ETAPELE PCR

1. Denaturarea termică a macromoleculei dublucatenare ADN matriţă

2. Hibridizarea (anelarea) primerilor pe bază de complementaritate la matriţa ADN

3. Polimerizarea sau sinteza unei noi catene avănd drept matriţă catena veche ADN

COMPONENTELE REACŢIEI PCR

Rezultatul reacţiei PCR este dependent de determinarea experimentală a concentraţiei optime a


componentelor amestecului de reacţie.

 Matriţa ADN poate fi: ADN genomic, mitocondrial, viral, ADNc (caz particular ARN
total – RTPCR)

 Tamponul de reacţie: furnizează pH optim al polimerazei utilizate şi concentraţia optimă


a ionilor Mg2+, acivatorii ADN polimerazei (cantităţile insuficiente de Mg2+ duc la
amplificări slabe, iar cantităţile crescute conduc la cumularea de produşi de amplificare
nespecifici). Cel mai comun tampon (pH 8,3) folosit conţine: Tris-HCl KCl şi gelatină.

 dNTP: sunt livrate fie sub forma a patru soluţii stoc individuale, fie sub forma unui
amestec al celor patru nucleotide. Soluţiile sunt ajustate la o valoare optimă de pH.
Concentraţia optimă de dNTP depinde de: concentraţia de MgCl2, conc. primerilor,
lungimea fragmentului ce urmează să fie amplificat şi numărul de cicluri de reacţie.
 ADN polimeraza: iniţial s-a folosit fragmentul Klenow al ADN polimerazei din E. Coli.
Ulterior au fost descoperite şi utilizate ADN polimeraze termostabile ca:

 Taq/Amplitaq ADN polimeraza – izolată din Thermus aquaticus. Viteza optimă


de polimerizare este de 35-100 nucleotide/s la 70-80°C. Enzimele au o activitate
5’-3’ exonucleazică care permite înlăturarea nucleotidelor situate în faţa lanţului
de creştere.

 AmpliTaq polimeraza are aceleaşi proprietăţi cu Taq polimeraza dar este produsă
în E. Coli prin recombinare genetică. Reproductibilitatea şi puritatea acesteia este
mult mai mare decât a Taq polimerazei simple.

 Apa ultrapură: se utilizează exclusiv apă ultrapurificată, nuclease-free, livrată de firme


specializate

 Primerii: în desemnarea primerilor trebuie respectate câteva reguli generale:

 lungimea primerilor trebuie să fie cuprinsă între 20 şi 35 de nucleotide, acest lucru


permiţând selectarea unei temperaturi de hibridizare ridicate.

 primerii trebuie să conţină un număr aproximativ egal din cele patru baze azotate,
evitându-se pe cât posibil regiunile cu repetiţii de nucleotide (evitare structuri
hairpin).

 perechile de primeri trebuie alese astfel încât să nu prezinte complementaritate la


nivel intra- şi interindividual (evitarea dimerlor de primeri).

 distanţa dintre doi primeri la nivelul matriţei trebuie să fie mai mică de 5-10 kpb,
dar s-a observat o eficienţă foarte scăzută a reacţiei în cazul în care lungimea
produsului de amplificare depăşeşte 3 kpb.

 determinarea cu exactitate a temperaturii optime de hibridizare (annelare) prin


realizarea unei reacţii PCR în gradient de temperatură.

Pentru determinarea rezultatelor din articolul selectat, autorii au utlizat etapele


prezentate mai jos:

MATERIALE SI METODE UTILIZATE

Ca in orice experiment, pentru obtinerea unor rezultate corecte si pentru intocmirea unui
raport final calitativ este necesara atat alegerea metodei sau metodelor eficiente cat si a
materialelor sau probelor de material.

A. PREGATIREA PROBELOR DE CARNE


- Probele de carne proaspătă s-au obtinut din surse comerciale și depozitate congelate la
20°C pana in momentul experimentului.

- Amestecurile binare de carne de vită și porc au fost preparate prin combinarea cantităților
adecvate de carne tocată, slabă.

- S-au preparate două probe de carne din fiecare amestec:

 T (gătit și sterilizat): au fost prăjite în ulei vegetal la 65°C timp de 15 min,


conservate și sterilizate la 121°C timp de 30 min si au fost pastrate la temperatura
camerei pana la utilizare

 F (martor negătit): nu au fost nici fierte, nici sterilizate și au fost menținute


congelate la -20 ° C până la utilizare

EXTRACȚIA ADN-ULUI

Probele T și F au fost liofilizate și măcinate până la o pulbere fină într-un macerator


manual.

ADN-ul a fost purificat din 30 mg de carne folosindu-se o trusa de purificare a ADN-ului.


Conținutul de ADN a fost cuantificat după colorare cu reactiv de cuantificare a ADN-ului
Picogreen, utilizând un spectrofotometru de fluorescență Perkin-Elmer LS-50B și comparând
fluorescența cu cea din standardele ADN de concentrație cunoscută. ADN-ul pentru curbele
standard qPCR și digestiile ADN-ului a fost purificat din probe de carne autentificate anterior
prin secvențierea ADN a unei regiuni mitocondriale ND5-cytB.

Detectarea și cuantificarea ADN-ului a fost efectuată prin amplificare utilizând un sistem


de detectare a secvenței în timp real. Reacțiile au fost efectuate prin duplicat în plăci cu 96 de
godeuri.
Combinațiile sondei S1 cu FBOS3 / RBOS1, FBOS3 / RBOS2, FBOS3 / RBOS3 sau
FC1SUS / RSUS2 au fost utilizate pentru a formula detectoarele BOS1 (92 bp), BOS2 (204 bp),
BOS3 (319 bp) și SUS (100) bp), respectiv.

Amestecurile de reacție de 25 ll conțineau 12,5 lL de Taqman (care include enzima


AmpliTaq GoldTM activată termic), 300 nM din fiecare primer oligonucleotidic specific, 200
nM sondă MGB și 2 ll ADN.

 Reactia a fost creata in condițiile după cum urmează:

 10 min la 95 ° C pentru activarea enzimei

 apoi 50 de cicluri de denaturare la 95 ° C timp de 15

 recoacere la 55 ° C timp de 1 min.

Citirile au fost luate la fiecare ciclu, iar creșterea fluorescenței a fost reprezentată grafic
față de numărul ciclului. Pentru a testa amplificarea ADN-ului din specii încrucișate, toate testele
PCR au inclus cel puțin trei reacții independente de control ADN nețintă (NTD) pentru fiecare
detector, conținând 4 ng de carne de vită (sau porc), ADN de pui sau curcan. Pragul de
fluorescență a fost fixat la același nivel exponențial mediu pentru toate cursele.

CUANTIFICAREA SPECIILOR DE CARNE

Pentru a cuantifica proporția de carne de porc în carne de vită: carne de porc amestecurile
binare, curbele standard folosind diluții de ADN de carne de porc și carne de porc au fost
obținute în primul rând prin reprezentarea grafică a ADN-ului vs. pentru ambele specii.

Amplificările qPCR au fost apoi efectuate în duplicat folosind 2 ng lL-1 de ADN obținut
din amestecuri binare F și T și CT-ul mediu înregistrat de detector au fost interpolați în curba
standard corespunzătoare pentru a obține conținutul de ADN din carne de vită în eșantion.
CT înregistrat de detector nu a fost interpolat direct pe curba standard, în schimb, carnea
de vită 50:50: probele de porc au fost utilizate ca referință matricială pentru a calibra diferențele
de conținut de ADN pentru cantități egale de carne de vită și carne de porc. Această diferență, D,
a fost definită ca numărul de cicluri care trebuie adăugate la experimental și interpolate pe
curbele standard corespunzătoare pentru a obține aceeași cantitate de ADN detectat în eșantionul
50:50. Astfel, dacă curbele standard sunt definite de CT m log Nb. Pentru calcul s-au efectuat
formulele de mai jos:

- Unde, unde CTb50 și CTp50 sunt CT obținute cu detectoare și din referința matricei
50:50.

Folosind această abordare, valorile DF și DT au fost calculate pentru probele neprelucrate


și prelucrate pentru a obține proporția de carne de porc în probele F și respectiv T. Cantitatea
ajustată de ADN de porc din orice probă poate fi apoi dedusă din:

Și proporția de carne de porc din eșantion ca:

CONDIȚII DE DIGESTIE A ADN-ULUI

ADN timus de vițel a fost digerat cu 10—3–2 × 10—4U lL — 1 din DNază I, timp de 10
min la 37 ° C în 500 lL de tampon de digestie conținând 50 mM Tris – HCI (pH 7,5), 10 mM
MgCl2 și 50 lg mL — 1 BSA. Toate digestiile au fost efectuate prin duplicat.

Reacția a fost oprită prin adăugarea a 25 lL de 0,5 M EDTA pH=8 și incubare la 100 ° C
timp de 10 min, urmată de fenol / clor, extracția cloroformului și precipitarea ADN-ului prin
adăugarea unui volum de 1,2-propanol. Peleta a fost spălată cu etanol 70% și ADN-ul a fost
rehidratat prin adăugarea a 20 lL apă și incubarea peste noapte la 4 ° C. O probă fără enzimă a
fost preparată ca martor la normalitează rezultatele.

Gama de mărimi a fragmentelor de ADN rezultate a fost monitorizată prin electroforeză


în 1,5% agaroză la 20 V și colorare cu 1 lg ml-1 de soluție de bromură de etidiu în tampon TAE.
Pentru testele qPCR, 2 lL de a 20 ng lL — 1 diluție de ADN digerat au fost utilizate ca șablon.
IMUNODETECȚIA CĂRNII

Identificarea cărnii de vită și de porc a fost efectuată folosind truse ELISA pentru
alimentele crude sau conform instrucțiunilor producătorului.

Înainte de extracție, probele brute și cocsificate au fost tăiate și omogenizate într-un


blender. 5 g din fiecare probă omogenizată s-au plasat într-un tub de plastic steril conținând 50
ml de NaCl 0,9% și amestecul a fost puternic zăvorât timp de 30 s.

După 10 min la temperatura camerei, extractele au fost apoi condiționate prin diluarea
1/10 (v / v) în soluție salină tamponată cu fosfat (10 mM fosfat, 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, pH
7,4). 100 lL din fiecare extract reconstituit a fost verificat de ELISA. Etapele de spălare au fost
efectuate cu ajutorul unui inel microplate. Absorbanța a fost citită cu un cititor de microplacă
Spectra MAX340pc la 450 nm.

REZULTATE

LINIARITATEA ȘI SENSIBILITATEA DETECTOARELOR DE CARNE PE PROBELE


PRELUCRATE

Rezultatele obtinute in partea experimentale arătat că detectoarele bazate pe anumite


principii ale producatorilor, atunci când sunt utilizate pe ADN-uri cu o singură specie sau
amestecate purificate din carne proaspătă, au dat o corelație liniară a ADN-ulu, cu o eficiență
PCR aproape de o dublare pe ciclu.

Pentru a testa efectele posibile ale procedurilor de gătire a cărnii și de sterilizare la


căldură, precum și prezența ADN-ului nețintă în eșantion, asupra răspunsului liniar al
detectoarelor, s-au efectuat noi teste de linearitate prin triplicat folosind ADN obținut din non-
probe de carne amestecate sau amestecate (50:50), atât fierte cât și sterilizate (T) sau netratate
(F).

Eficiențele PCR măsurate atât pentru detectoarele utilizate pe amestecuri 50:50 (2,2 ± 0,2
și respectiv 2,0 ± 0,3, respectiv) nu au fost statistic diferite (p> 0,05) de cele observate la carnea
pură de vită sau de porc (2,0 ± 0,1) și respectiv 2,3 ± 0,3).

În mod similar, nu s-au observat diferențe în probele de T tratate termic. Astfel, s-ar putea
concluziona că procesele de gătit și sterilizare utilizate nu afectează în mod semnificativ
răspunsul qPCR la diferite concentrații de ADN și că prezența ADN nețintă în amestecul de
carne, nu afectează eficiența PCR.
Pentru exemplificarea acestor rezultate, se vor folosii urmatoarele grafice, execuate in
momentul experimetului:

FIGURA 1: Corelarea amplificării specifica specifica ADN-ului și a conținutului de carne de


vită și de porc în amestecurile binare vs. jurnalul procentului de carne de vită sau de porc a fost
obținut prin amplificare qPCR folosind detectoare BOS (A) sau SUS (B) și 4 ng de ADN total ca
șablon din amestecuri F (albe) sau T (negre) tratate termic.

Pentru a compara rezultatele obținute folosind qPCR cu performanța metodelor bazate pe


imunodetecție, aceleași probe au fost analizate folosind o metodă comercială ELISA pentru
carne de vită și porc. Așa cum se arată în Fig. 2, doar probele F au produs o recunoaștere
consistentă antigen în teste, cu o limită de detecție care se apropie de 1%, în timp ce amestecurile
de carne T nu au reușit în general să detecteze oricare dintre cele două specii, probabil din cauza
denaturării. a țintei antigenice în timpul tratamentului de sterilizare. Limita de detectare a fost
estimată la 1% (carne de vită, porc și păsări de curte) prin analiza a 5 seturi de 12 replici ale
standardelor zero. Valoarea medie a absorbanței minus SD de 3 ori a fost echivalentă cu 0,9 ori
semnalul în absența analitului, care corespunde unei limite estimate de detectare de 0,32 ng / ml
din speciile de carne
FIGURA 2 : Imunodetecția cărnii de vită și de porc în probele de carne F și T. Extractele din
probele F și T prelucrate neprelucrate cu compoziție cunoscută au fost testate folosind truse
ELISA pentru carne de vită și carne de porc. Tăierea a fost stabilită de trei ori abaterea
standard de la măsurarea medie a semifabricatului. Sunt prezentate absorbanța medie a
măsurătorilor triplicate (abaterea standard relativă <10%).

CUANTIFICAREA SPECIILOR DE CARNE UTILIZÂND MATRICEA DE REFERINȚĂ CU


PUNCT UNIC

Principalul dezavantaj al metodelor bazate pe ADN pentru cuantificarea proporțiilor


diferitelor specii din alimente derivă din variabilitatea concentrației ADN (numărul de copii ale
ADN-ului țintă per gram de material), care depinde atât de specie, cât și de tipul de țesut prezent
în probă. În cazul produselor din carne, cantități egale de carne de vită și mușchi slab de porc nu
pot conține același număr de copii ale ADN-ului țintă.

De asemenea, s-a arătat că utilizarea ADN extras din materialul de referință adaptat la
matrice conținând diferite proporții de specii de carne produce rezultate mai precise decât
utilizarea diluțiilor ADN pentru a construi curbe de calibrare. În consecință, curbele standard
prezentate în Fig. 1 pot fi utilizate direct pentru a interpola valorile qPCR obținute din ADN
extras din amestecuri de carne de vită și carne slabă de porc pentru a stabili proporțiile fiecărei
specii.

Cu toate acestea, producerea de materiale de referință adaptate la matrice pentru a


construi curbe de calibrare poate necesita mult timp și crește costul testului atunci când sunt
necesare multe tipuri diferite de amestecuri. Pentru a simplifica procedura experimentală,
combinația curbelor standard de diluare a ADN-ului cu datele qPCR dintr-un material de
referință cu o singură matrice ar putea fi utilizată pentru a obține date cantitative fiabile.
Diferențele în numărul de copii țintă între două specii sau țesuturi pot fi considerate ca diferențe
în CT și pot fi utilizate pentru a calcula raportul real de specii în amestecurile binare de carne.
In Fig. 3, s-a arătat o corelație bună a rezulatelor. Precizia, calculată ca deviație medie
relativă (în % din valoarea reală a cărnii de porc) pentru toate probele a fost de 17% și 13%
pentru probele F și T, respectiv. Aceste valori de precizie sunt similare cu cele raportate pentru
metodele care implică utilizarea standardelor adaptate la matrice pentru produsele slab procesate.

Datele prezentate în Fig. 3 sugerează că procesarea alimentelor utilizate în aceste teste,


care implică gătirea la 65 ° C urmată de sterilizarea termică la 121 ° C timp de 30 de minute nu
afectează semnificativ rezultatele cantitative obținute de qPCR. Există totuși dovezi puternice
care indică faptul că un astfel de tratament termic ar trebui să producă o fragmentare
semnificativă a ADN-ului.

FIGURA 3: Cantificarea cărnii de porc în carne de vită: amestecuri binare de carne de porc
utilizând standarde de matrice 50:50 pentru calibrare. Procentul de carne de porc din probele
din seria F și T a fost calculat folosind ecuația reprezentata anterior. Rezultatele prezentate
reprezintă media a 4 teste independente ± SD.

Diferența observată, de aproximativ două cicluri, în valorile D pentru probele tratate și


netratate reflectă o scădere de patru ori a ADN-ului de porc amplificabil în amestecurile tratate în
comparație cu ADN-ul de vită. Acest lucru sugerează că procesarea căldurii poate afecta diferit
față de amplificarea fiecărei specii prezente în amestec și întărește importanța utilizării
standardelor procesate prin matrice pentru a calibra orice teste calitative sau cantitative bazate pe
qPCR.

În comparație cu alte metode raportate, care necesită producția de materiale de referință


adaptate la matrice care să cuprindă întreaga gamă de proporții așteptate ale cărnii, clonarea
secvențelor țintă ADN sau contul mărimilor genomului, utilizarea matricei de referință cu un
singur punct în testele de alimente bazate pe qPCR, așa cum se exemplifică aici, poate simplifica
configurarea experimentală și prelucrarea datelor pentru cuantificarea speciilor.
Această abordare ar putea fi transferată cu ușurință la cuantificarea altor produse
alimentare, deoarece ar necesita doar un singur set de curbe standard qPCR folosind diluții ADN
din probe de referință ale fiecărei specii, care pot fi utilizate pentru a testa diferite matrice și o
reacție qPCR într-un singur punct folosind ADN dintr-o probă adaptată la trix de compoziție
cunoscută.

Pentru a obține o indicație a deteriorării ADN-ului produs de gătit și tratament termic, a


fost conceput un experiment controlat de DNază pentru a testa efectele fragmentării ADN asupra
rezultatelor qPCR.

Gradul de fragmentare a fost confirmat prin electroforeză prin geluri de agaroză și


colorare cu bromură de etidiu, iar pentru obtinerea unor rezultate cat mai precise s-au utilizat si
alte detectoare ale ADN-ului.

Rezultatele obținute pe ADN-ul digerat arată că detectoarele BOS pot fi utilizate pentru a
obține o estimare a degradării ADN-ului în produsele din carne procesate. Pentru a testa acest
lucru, probele de carne de vită au fost gătite și tratate termic în condiții diferite, iar valorile r care
țin cont de degradarea ADN-ului au fost obținute folosind detectoarele BOS.

In Fig. 4A, este aratat ca exista posibilitatea chiar și la cea mai mică concentrație de DNază
utilizată, ca si cantitatea de ADN amplificat de detector de 204 bp a fost de aproape o pătrime
din ADN-ul amplificat în ADN-ul nedigerat.

In Fig. 4B, se indica faptul că, în timp ce prăjiți în ulei vegetal la 65 ° C, chiar și pentru
perioade lungi de timp, nu afectează în mod semnificativ amplificarea detectorului, reduce
cantitatea detectată cu detectorul. Acest lucru sugerează că, în aceste condiții, majoritatea ADN-
ului este prezent în fragmente de 200 până la 300 bp. Sterilizarea la 126 ° C, chiar și pentru
perioade scurte de timp, reduce drastic semnalul recuperat de detectoare, ceea ce sugerează
apariția fragmentării ADN sub 200 bp în medie.

FIGURA 4: Amplificarea ADN-ului prin qPCR pe probe degradate de ADN. (A) Amplificarea
pe ADN timus de vițel digerat cu DNaseI. Raportul dintre amplificarea ADN-ului digerat și cel
digerat a fost obținut după incubare cu concentrații diferite de DNaseI. (B) Amplificarea pe
probe de carne de vită prăjite în ulei vegetal la 65 ° C timp de 30 de minute. urmată de
sterilizare la B2: 126 ° C timp de 10 minute; B3: 20 min și B4: 30 min. B1: martor nesterilizat.
Raporturile r1-2 (negru) și r1-3 (gri) au fost calculate.

CONCLUZII

Rezultatele acestui experiment sunt conforme asteptarilor autoriilor, astfel reusind sa


urmeze obiectivele stabilite si sa demonstreze scopul propus. Datele colectate în acest raport
susțin adecvarea metodelor qPCR pentru cantificarea speciilor, chiar și pentru produsele
alimentare prelucrate puternic. Utilizarea standardelor matriciale controlate pentru a obține
informații cantitative cu privire la factorii care afectează producția qPCR, așa cum este
exemplificat în această lucrare, permite depășirea punctelor slabe asociate de obicei cu utilizarea
metodelor ADN pentru cuantificarea componentelor alimentare, cum ar fi ținta variabilitatea
concentrației și fragmentarea derivată din tratamentele termice.

Această abordare poate contribui la îmbunătățirea proiectării unor metode robuste pentru
cantificarea speciilor în alimentele procesate.

Pentru determinarea acestor parametrii si pentru a reusi sa se demonstreze nevoia unei


metode mai avansate, autorii au utilizat teste suplimentare pentru a putea compara rezultatele
obtinute.

S-ar putea să vă placă și