Sunteți pe pagina 1din 100

PEPTIDE si PROTEINE

Curs 2+3+4 1
Cuprins
Formarea legaturii peptidice.
Peptide reprezentative.
Proteine.
Notiuni generale.
Clasificare
Metode de separare,purificare si analiza a proteinelor

Curs 2+3+4 2
Denumiri si clasificari ale substantelor
continand aminoacizi ca unitati structurale de
baza
Protide (protos = cel dintâi): biomolecule ce au ca unitate structurala de
baza aminoacizi si reprezinta constituenti universali şi indispensabili ai
tuturor formelor de viaţă, asigurând organizarea şi menţinerea
structurilor morfologice ale celulelor, precum şi manifestarea funcţiilor şi
activităţilor vitale ale acestora.
Protidele cu rol fiziologic important mai conţin şi atomi de S, P, iar unele
conţin în proporţie mai mică şi atomi de metale: Mg, Ca, Zn, Fe, Cu etc.

Curs 2+3+4 3
Formarea legaturii peptidice
• Prin eliminare unei molecule de apă între grupa α-COOH a unui aminoacid (cu
catena laterala R1) şi grupa α-NH2 a altuia (cu catena laterala R2), are loc o reactie
de condensare, prin care se formeaza o legatura covalenta -CO-NH-,
caracteristica amidelor substituite.
• Substanţă astfel formata se numeste (di)peptidă, iar legatura formata de numeste
legatura peptidica.
• Prin unirea mai multor aminoacizi în acelaşi mod se obţin di, tri, tetra.... polipeptide
• Se numesc oligopeptide polimerii aminoacizilor formaţi din 2-10 subunităţi, iar
polipeptide, polimerii formaţi din mai puţin de 100 resturi de aminoacizi şi cu
M<10.000.
• Lanturile polipeptidice cu
M>10.000 = proteine si au
peste100 de resturi de
aminoacizi.

• .
Curs 2+3+4 4
Formarea legaturii peptidice

• De fapt, la formarea legaturii peptidice, grupa amina actioneaza ca


un reactant nucleofil pentru a inlocui grupa OH a celuilalt aminoacid

• Desi grupele amino sunt reactanti nucleofili eficienti, grupa OH


poate fi cu greu indepartata, la pHul si temperatura fiziologica, fara
interventia unor enzime si au unor reactanti specifici, care activeaza
grupa carboxil, astfel incat eliminarea grupei OH sa fie favorizata.

Curs 2+3+4 5
Oligopeptide

Serilgliciltirozilalanilleucina = Ser-Cly-Tyr-Ala-Leu sau SCYAL.


Peptidele se denumesc incepand cu aminoacidul amino-terminal, care, prin
conventie se plaseaza la stanga.
Un aminoacid din compozitia unei peptide este denumit un rest de aminoacid
(partea ramasa dupa pierderea unui atom de hidrogen din grupa amina sau a
grupei OH din grupa carboxil).
Restul de aminoacid de la capatul lantului peptidic care are grupa amina libera
se numeste aminoacid aminoterminal sau N-terminal.
Restul de aminoacid de celalalt capat al lantului peptidic, care are grupa
carboxil libera, se numeste aminoacid carboxiterminal sau C-terminal.
Curs 2+3+4 6
Oligopeptide
• O dipeptida formata din doi aminoacizi se poate găsi sub forma a
doi izomeri în funcţie de rolul pe care îl îndeplineşte fiecare din cei
doi aminoacizi constituenţi: N-terminal sau C-terminal.
 Ex.: Gly-Tyr şi Tyr-Gly.
• Pe măsură ce creşte numărul aminoacizilor din constituţia unei
peptide, numărul izomerilor teoretici creşte foarte mult.
• Denumirea unei peptide derivă de la aminoacizii componenţi cărora
li se adaugă terminaţia “il”, cu esceptia aminoacidului carboxi-
terminal, la al cărui nume nu se mai adaugă această terminaţie.
• Dipeptida formata din două molecule de glicină = glicil-glicină;
tripeptida format dintr-o moleculă de glicină, una de alanină şi una
de leucină = glicil-alanil-leucină

Curs 2+3+4 7
Carnozina şi anserina
Sunt dipeptide prezente în ţesutul muscular: sub forma de esteri fosforici joacă
un rol important în procesele energetice ale organismului.

Curs 2+3+4 8
Glutationul (γ-glutamil-cistenil-glicocolul) = tripeptidă care poate fi găsită
în celulele tuturor fiinţelor vii. Are proprietatea de a funcţiona ca un sistem
biologic redox reversibil, când două molecule de glutation sunt reduse
transformându-se într-o disulfură:

Curs 2+3+4 9
Vasopresina - 9 aminoacizi - controleaza excretia de apă din
prganism, favorizand apsorbţia apei.
Oxitocina - 9 aminoacizi - regleaza contracţia muşchiului neted
al uterului şi a celulelor mioepiteliale ce înconjoară alveolele
mamare.
Aceste 2 oligopeptde se diferentaza doar prin 2 aminoacizi, in
pozitile 2 si respectv 7.

Hemoglobina A – fiziologica
Hemoglobina S – patologica: lanturile β sunt modificate fata
de HbA (Glu este inlocuit cu Val, in pozitia 6 a lantului (β6
Glu→Val) Anemia falciformă, sicklemia sau
drepanocitoza - maladie ereditară caracterizată printr-o formă
anormală a hematiilor, de seceră (sickle), în loc de formă de
disc biconcav.
Această formă scade flexibilitatea hematiilor risc crescut de
complicații. Curs 2+3+4 10
Curs 2+3+4 11
O serie de microorganisme formează substanţe active (antibiotice) care
frânează creşterea altor celulelor microbiene, care pot contamina
organismele vegetale sau animale.
Multe antibiotice sunt peptide atipice. Astfel sunt penicilina, actinomicina D
(care conţine două pentapeptide) şi gramicidina, care este o decapeptida
ciclica.

Acidul 6-aminopenicilanic, substanţa de bază din penicilină şi materia


primă pentru sinteza unui mare număr de peniciline poate fi considerat ca
o peptidă atipică a L-valinei şi L-cisteinei. Sinteza lui are loc în mucegaiul
Penicillium notatum sau chrysogenum din aceşti doi aminoacizi.
Din acidul 6-aminopenicilanic se pot fabrica, prin sinteza, cele mai diferite
peniciline.
În peniciline gruparea amino este acilată. Radicalul R al acestui acid poate
să fie de natură diferită. Benzil-penicilina, fabricată în cantitatea cea mai
mare, conţine radicalul benzil C6H5- CH2.

Curs 2+3+4 12
Proprietăţi fizico-chimice ale peptidelor
• Peptidele prezintă proprietăţile fizico-chimice, inclusiv
electrochimice ale aminoacizilor.
• Au o grupa α-amino terminala si o grupa α-carboxil terminala libere,
la cele doua capete opuse ale lantului polipeptidic, care ionizeaza la
fel ca in cazul aminoacizilor, dar constantele de ionizare sunt diferite
datorita distantei dintre cele doua grupe.
• Prezintă un pI caracteristic, la care nu migrează în câmp electric
putând fi astfel separate prin electroforeză.
• Electroforeza = deplasare spre electrozi a particulelor dintr-o soluţie
coloidală sub acţiunea câmpului electric.

Curs 2+3+4 13
PROTEINE

Curs 2+3+4 14
Caracteristici generale
• Proteinele sunt alcatuite din lanturi polipeptidice formate dintr-un
numar variabil de aminoacizi, in general peste 100.
• De exemplu, citocromul c uman are 104 resturi de aminoacizi,
chimotripsinogenul bovin are 245 resturi de aminoacizi, iar titina, o
componenta proteica a tesutului muscular al vertebratelor are
27.000 resturi de aminoacizi si o greutate moleculara de
3.000.000.
• Cea mai mare parte a proteinelor naturale contin mai putin de 2000
de resturi de aminoacizi.

Curs 2+3+4 15
Curs 2+3+4 16
Caracteristici generale
• Unele proteine sunt formate dintr-un singur lant polipeptidic; altele
contin doua sau mai multe astfel de lanturi asociate non-
covalent, care pot fi identice sau diferite.
• Proteinele formate din 2 sau mai multe astfel de lanturi polipetidice
se numesc oligomeri (di-, tri-, tetramer. etc.)
• 2 lanturi identice, legate non-covalent formeaza un protomer.
• De exemplu, hemoglobina, are patru subunitati polipeptidice: 2
lanturi α identice si 2 lanturi β identice, toate cele 4 subunitati fiind
asociate prin interactii necovalente
• Ambele lanturi (subunitati) α sunt asociate in acelasi mod cu
subunitatile β, astfel incat hemoglobiba poate fi considerata fie un
tetramer format din 4 subunitati polipeptidice, fie un dimer format din
2 protomeri αβ.

Curs 2+3+4 17
Vedere 3 D a hemoglobinei: cele 4
subunităţi roşu şi galben, iar unitatea
hemică verde.
Numele de hemoglobină denotă faptul că
hemoglobina are la baza proteine globulare
cuplate cu o grupare hem

Curs 2+3+4 18
Caracteristici generale
• Anumite proteine contin 2 sau mai multe lanturi polipeptidice legate
covalent, cum sunt cele doua lanturi polipeptidice A si B ale
insulinei, care sunt legate prin punti disulfurice S-S.

• Aceste lanturi nu sunt considerate subunitati ale proteinei.

• Compozitia in aminoacizi a proteinelor este foarte variabila: unii


aminoacizi pot aprea doar o data sau de loc intr-un lant polipeptidic,
altii pot aparea de mai multe ori in acelasi lant, in diverse pozitii.

• In general, numarul de aminoacizi din care este alcatuita o proteina


se poate calcula impartind greutatea moleculara a acesteia la 110.

Curs 2+3+4 19
Citocromul c si chimotripsinogenul bovin
sunt 2 proteine cu functii foarte diferite si
care se deosebesc semnificativ si prin
compozitia lor in aminoacizi (ca numar de
resturi ale aceluiasi aminoacid prezente).

Citocromul c este o proteina implicata in


procesele celulare redox.

Chimotripsinogenul este un precursor al


enzimei digestive chimotripsina.

Curs 2+3+4 20
Importanta proteinelor

• Constituie suportul chimic structural şi funcţional al materiei vii pe care se bazeaza


proprietatile acesteia de: diferenţiere, creştere, dezvoltare şi reproducere.
• Protidele îndeplinesc în organism, datorită înaltului grad de organizare şi
diversitate, roluri multiple:
1. rol structural (plastic), ca si constituenţi principali ai membranelor biologice,
tesuturilor si organelor. Reprezintă: 65-70% din materia uscată a organismului
animal, 2-35% din materia uscată a organismului vegetal, 80-90% din materia
uscată a microorganismelor;
2. rol biocatalitic: sub formă de enzime, catalizează selectiv reacţiile biochimice din
organismele vii;

Curs 2+3+4 21
Importanta proteinelor

3. rol fizico-chimic: caracter coloidal şi amfoter  participa la :


 reglarea presiunii osmotice
 reglarea permeabilităţii selective a membranelor
 reglarea echilibrului electrostatic şi acido-bazic
4. rol de aparare a organismlui (anticorpi-participa la procesele imunologice de apărare a
organismelor superioare; trombina si fibrinogenul -factorii de coagulare ai sângelui )
5. rol de transportori ai altor molecule sau ioni (hemoglobina, calmodulina), sau ai
impulsurilor nervoase
6. rol de represori: au capacitatea de a traduce din genomul celular numai mesajul necesar
într-un anumit moment din viaţa celulei sau organismului;
8. rol de reglare fină a proceselor biochimice, prin intermediul hormonilor.

Curs 2+3+4 22
Clasificarea proteinelor
1. După sursa de provenienţă:
a) proteine de origine microbiana
b) proteine de origine vegetală
c) proteine de origine animală
2. După solubilitatea în apă şi în soluţii de electoliţi:
a) insolubile (fibroase, fibrilare) - se găsesc în organismul animal în stare
solidă şi conferă ţesuturilor rezistenţă mecanică (proteine de schelet) sau
protecţie împotriva agenţilor externi.
b) solubile (globulare) - apar în celule în stare dizolvată sau sub formă de
geluri hidratate. Au forma sfericã sau ovalã. Au functii biologice specifice, spre
deosebire de proteinele fibrilare, care au funcţie structuralã şi mecanicã. Se
subîmpart în:
a) albumine, solubile în apă şi în soluţii diluate de electroliţi (acizi, baze, săruri)
b) globuline, solubile numai în soluţii de electroliţi

Curs 2+3+4 23
Clasificarea proteinelor

3. După produşii rezultaţi la hidroliza totală:


a) proteine simple (holoproteine ) – dau prin hidroliză
totală numai α- aminoacizi
b) proteine conjugate sau proteide (heteroproteine) -
dau prin hidroliză totală si alți compuși alături de α-
aminoacizi.
Molecula unei proteide include în structura sa o parte
proteică, numita apoproteina şi o parte neproteica,
numita grupa prostetica.

Curs 2+3+4 24
Holoproteine
Globulare Fibrilare
Albumine Colagenul

Globuline Keratinele

Histone Elastina

Protamine Fibrinogenul

Prolamine Fibroina

Gluteline Curs 2+3+4 Miozina si actina 25


Albumine
• Solubile in apa, precipita in prezenta sarurilor concentrate,
coaguleaza la temperaturi ridicate
Albumina serica
- proteina monomerica, M = 66 500 Kda
- transporta molecule anumite molecule insolubile: ac. grasi, bilirubina,
anumiti hormoni
- contribuie la mentinerea presiunii osmotice a sangelui
Lactalbumina (in lapte)
- M-13 500kDa
- sintetizata de glanda mamara, sub controlul prolactinei
Ovalbumina (in albusul de ou)
-
Curs 2+3+4 26
Globulinele

• Sunt insolubile sau greu solubile în apă şi solubile în


soluţii diluate de săruri.
• Precipită uşor cu soluţie de sulfat de amoniu 50%.
• Au caracter acid datorita prezenţei în structura lor a
acidului aspartic şi glutamic.
• In plante, se găsesc ca substanţe de rezervă, alături de
albumine, mai ales în seminţe.

27
Globuline
• Globulinele de origine animala se gasesc in serul sanguin
• In functie de mobilitatea electroforetica, se impart in:
α (1 si 2), β si γ
- Globulinele α si β se sintetizeaza in ficat.
- Globulinele γ sunt sintetizate de catre limfocite.
α 1-Globuline: antitripsina (70%), antichimotripsina, lipoproteine, glicoproteine
acide, proteina de legare a tiroxinei
α 2-Globuline: o macroglobulina (30%), haptoglobina, ceruloplasmina, alte
enzime
β-Globulinele: transferina, chemotripsina, fractiuni ale sistemului complement,
fibrinogenul, unele lipoproteine, transcobalamina, proteina C reactiva.
γ-Globulinele = imunoglobuline: A,G.M,D,E

Curs 2+3+4 28
Histonele

• Au un puternic caracter bazic, deoarece ≈ 25 - 30% din aminoacizii


constituenţi sunt bazici, purtători de sarcini pozitive (arginină, lizină
şi histidină).
• Nu contin triptofan, fenilalanină şi tirozină.
• Au M = 11 000 – 21 000KDa
• Pot fi extrase uşor cu acid clorhidric diluat sau cu acid sulfuric.
• Sunt alcătuite dintr-o singură catenă polipeptidică.
• Se gasesc in nucleele celulelor eucariote, unde contribuie la
impachetarea si organizarea ADN-ului in unitati structurale denumite
nucleozomi.
• Reprezinta proteinele de baza din structura cromatinei.

Protaminele
• Sunt proteine nucleare cu caracter bazic (bogate in Arg), implicate
in spermatogeneza. 29
Prolaminele (gliadinele)

• Se găsesc numai în regnul vegetal şi conţin cantităţi mari


de prolină şi acid glutamic, care le imprimă caracter acid.
• Au valoare alimentară redusă, deoarece sunt sărace în
triptofan şi lizină.
• Datorită conţinutului redus în triptofan şi lizină, folosirea
porumbului ca aliment unic, conduce în organism la
grave tulburări.

30
Glutelinele

• Sunt răspândite în seminţele cerealelor şi în părţile verzi


ale plantelor.
• Sunt insolubile în apă şi în alcool, dar se dizolvă în soluţii
diluate de baze sau de acizi.
• Conţin acid glutamic şi prezintă caracter acid.
• Au valoare alimentară deosebită, jucând un rol important
în procesul de panificaţie.
• Dintre gluteline sunt importante: glutenina (din
seminţele de grâu) care alături de gliadină este
componenta glutenului care conferă făinii proprietatea de
a putea fi prelucrata in panificatie (în lipsa glutenului
pâinea nu creşte) şi orizenina (din boabele de orez).
31
Proteine conjugate
• Sunt proteine care pe langa lanturile polipeptidice formate din
aminoacizi contin si alti compusi sau elemente chimice.
• Portiunea polipeptidica din structura unei proteine conjugate se
numeste apoproteina, iar portiunea non-aminoacid din structura unei
proteine conjugate poarta numele de grupa (componenta) prostetica.
• Proteinele conjugate se clasifica in functie de natura grupei prostetice;
de exemplu, lipoproteinele au o grupa prostetica cu structura lipidica,
glicoproteinele contin glucide ca grupe prostetice, metaloproteinele
contin un metal specific.
• Unele proteine conjugate sunt asociate permanent cu mai multe grupe
prostetice .
• De obicei, grupa prostetica joaca un rol important in functia
biologica a proteinelor.

Curs 2+3+4 32
Heteroproteide (heteroproteine)
• Clasificate in functie de natura chimica a grupei
prostetice in:
- Metaloproteine
- Fosfoproteine
- Glicoproteine
- Lipoproteine
- Cromoproteine

Curs 2+3+4 33
Clasificarea proteinelor conjugate

Curs 2+3+4 34
Metaloproteine
• Contin Ca2+, Mg2+, Fe2+/3+, Cu1+/2+, Zn2+, Mn2+
Cu rol de transport:
- Tranferina – transporta Fe
- Ceruloplasmina – transporta Cu
- Calmodulina – transporta Ca
- Hemoglobina – O2, CO2, Fe
Cu rol de rezerve:
- Feritina – depozit de Fe3+ ficat si splina
- Hemosiderina: ficat
- Ovotransferina – rezerva de Fe3+ in ou
- Lactotransferina - rezerva de Fe3+ in lapte

Curs 2+3+4 35
Fosfoproteine
• Componenta prostetica = resturi de acid fosforic legate
esteric de grupele OH ale Tyr sau Ser)
• Cazeinele
- 80% din proteinele din lapte
- nu coaguleaza la incalzire
- contin toti AA esentiali
- precipita in mediu acid
• Ovovitelinele
• Fosfovitelinele – galbenusul de ou

Curs 2+3+4 36
Glicoproteine
• Gruparea prostetiva consta intr-un rest glucidic, in
special oligoglucidic, legat O sau N – glicozidic
• Cu rol structural
- In matricea extracelulara a tesutului conjunctiv:
proteoglicani (mucoproteine, sialoproteine)
- In eritrocite – glicophorina
- In albusul de ou, legand biotina – avidina
• Cu rol de aparare (anticorpi)
- Imunoglobulinele: A,D,E,G,M

Curs 2+3+4 37
Lipoproteine
• Sunt asociatii complexe de proteine cu lipide simple,
complexe, colesterol liber si colesterol esterificat
• Lipoproteine de transport
- Chilomicroni (volum mare, densitate mica)
- vLDL (very low density lipoproteins)
- LDL
- HDL
• Lipoproteine de membrana

Curs 2+3+4 38
Cromoproteine

• Grupa prostetica este o grupa cromofora: care absoarbe


radiatiile electromagnetice (lumina) din domeniul vizibil, cu
anumite lungimi de unda, imprimand astfel culoarea substantei
respective.
• Carotenoproteide:
- crustacyanina
- astaxanthina
- rhodopsina (crupa prostetica = 11-cis-retinal)
• Hemoproteine:
- hemoglobina
- mioglobina

Curs 2+3+4 39
A. Proprietăţi fizice ale proteinelor

• A1. Aspect: substanţe solide, în general amorfe, care prin purificare


avansată pot fi obţinute în stare cristalină.
• A2. Solubilitatea în apă: foarte diferită, in functie de:
- natura, numărul şi aşezarea în catenă a aminoacizilor care compun
macromolecula;
- existenţa grupelor funcţionale hidrofile (carboxil, hidroxil);
- pH;
- concentraţia în săruri a soluţiei.
Prezenţa grupelor funcţionale polare (-OH, -NH 2, -COOH,-SH) favorizează
dizolvarea în apă: moleculele polare ale apei sunt atrase electrostatic de
grupele funcţionale polare ale proteinei  legarea moleculelor solvatului
de moleculele solventului, adică la fenomenul de solvatare (hidratare în
cazul apei) indispensabil dizolvării.
• Proteinele globulare sunt mai mult sau mai puţin solubile, pe când cele
fibrilare sunt insolubile.
Curs 2+3+4 40
A3. Masa moleculară a proteinelor

• Variază de la câteva mii la câteva milioane de Da, în funcţie


de numărul catenelor polipeptidice şi a aminoacizilor
componenţi.
• Determinarea masei moleculare a proteinelor este dificilă,
deoarece ele formează prin dizolvare soluţii coloidale, astfel
că nu pot fi aplicate metodele obişnuite de determinare a
masei moleculare, ci metode speciale.

Curs 2+3+4 41
A4. Starea coloidală a proteinelor în
soluţie

• Soluţiile de proteine formează sisteme moleculare disperse.


• Dimensiunile macromoleculelor proteice: 5-10 nm proteinele globulare 
40-50 nm proteinele fibrilare
• Soluţiile de proteine prezintă proprietăţile sistemelor coloidale:
presiune osmotică mică, putere de difuziune redusă, ultrafiltrare, efectul
Tyndall etc.
• Efectul Tyndall: in soluţii, proteinele dispersează lumina în toate direcţiile
spaţiului: privind lateral un fascicul de lumină ce străbate soluţia, se observă
traiectoria acestuia.
• În lumină difuză, din cauza dispersiei luminii, soluţiile proteice prezintă o
slabă tulbureală numită opalescenţă.

Curs 2+3+4 42
A4. Proprietatile coloidale ale proteinelor
(continuare)
• Din cauza dimensiunilor mari ale macromoleculelor, proteinele nu
difuzează prin membrane ale căror pori sunt de ordinul milimicronilor
(membrane de celofan, pergament, colodiu etc.), proprietate pe care
se bazează separarea lor de sărurile prezente în soluţie şi ai căror
ioni trec prin membranele de dializă.

Curs 2+3+4 43
A4. Proprietatile coloidale ale proteinelor
(continuare)
• Soluţiile proteice pot forma geluri: proteina şi solventul = masă
omogenă, cu particularităţi specifice substanţelor solide.
• Imbibiţia gelului, însoţită de creşterea considerabilă a volumului
este utilizată în industria alimentară (gelifierea alimentelor prin
adăugare de gelatină, imbibiţia proteinelor din făină la
prepararea aluatului etc.)

Curs 2+3+4 44
A5. Precipitarea reversibila a proteinelor

• Are loc în prezenţa:


1. soluţiilor concentrate de electroliţi tari (săruri ale metalelor alcaline,
alcalino-pământoase, ca de ex.: (NH4)2SO4
2. solvenţilor miscibili cu apa (alcool, acetonă).
Precipitarea reversibilă se explică prin fenomenul de salifiere, care
constă în deshidratarea parţială a proteinelor, datorită competiţiei
pentru moleculele de apă dintre ionii electroliţilor folosiţi la
precipitare şi grupele polare sau ionice ale proteinelor.
Macromoleculele proteice deshidratate parţial, se aglomerează şi
precipită.
La adăugarea unui exces de apă, precipitatul se dizolvă, ceea ce
dovedeşte că la precipitarea reversibilă, proteinele suferă unele
modificări fizico-chimice, dar nu se produce denaturarea
structurilor moleculare.

Curs 2+3+4 45
A6. Precipitarea ireversibila a proteinelor

• Se produce :
• în prezenţa sărurilor metalelor grele (Cu, Pb, Hg, Fe, Ni etc.),
• în prezenţa acizilor tari (HCl, HNO3, H2SO4),
• în prezenţa bazelor alcaline (NaOH, KOH)
• în prezenţa acidului picric
• în prezenţa unor acizi anorganici complecşi (de ex. acid fosfomolibdenic).
• la încălzire puternică (coagulare),
• sub acţiunea razelor X, UV, etc.
.

Curs 2+3+4 46
A6. Precipitarea ireversibila a proteinelor

• La încetarea acţiunii agenţilor precipitanţi, proteinele nu revin la forma


iniţială, deoarece structura spaţială a proteinelor (secundară, terţiară) suferă
o depliere, o dezorganizare, care însă nu afectează şi structura primară.
• Precipitarea ireversibilă a proteinelor este însoţită de transformări chimice
mai profunde ale proteinelor (denaturarea proteinelor).
• Un proces de precipitare este şi coacervarea, proces lent de separare a
coloizilor din soluţie, ca urmare a modificărilor lente ale condiţiilor soluţiei
coloidale proteice.

Curs 2+3+4 47
A7. Activitatea optica a proteinelor

• Se datoreaza atât aminoacizilor constituenţi care conţin


atomi de carbon asimetrici, cât şi asimetriei întregului
agregat macromolecular.
• Orice modificare a structurii proteinei este însoţită de
schimbarea rotaţiei specifice, care indică denaturarea
proteinei.

Curs 2+3+4 48
B. Proprietăţi chimice ale proteinelor

• Proprietăţile fizice şi chimice generale ale proteinelor


sunt determinate de:
 structura moleculară
 natura legăturilor intra- şi intermoleculare
 natura grupelor funcţionale.
• Proteinele prezintă (asemănător aminoacizilor) reacţii
chimice specifice grupelor funcţionale: -NH2 şi -COOH
libere, precum şi reacţii ale radicalilor -R pe care îi
conţin.
• Sunt caracteristice de asemenea o serie de reacţii de
culoare, care servesc la identificarea lor (reacţia
biuretului, reacţia xantoproteică, etc.)

Curs 2+3+4 49
B1. Caracterul amfoter al proteinelor

• Se datorează prezenţei în molecula lor a grupărilor acide


(-COOH) sau bazice (-NH2) libere ale resturilor
aminoacizilor dicarboxilici sau diaminici.
• Este influenţat şi de resturile unor aminoacizi cu grupări
ionizabile (-OH din tirozină, resturile bazice ale
histidinei, argininei).
• Datorită sarcinilor electrice, proteinele migrează în câmp
electric spre anod în soluţie bazică şi spre catod în
soluţie acidă. Fenomenul stă la baza separării şi
purificării proteinelor prin metoda numită electroforeză.

Curs 2+3+4 50
B2. Hidroliza proteinelor

• Are loc sub influenţa:


 acizilor
 bazelor
 enzimelor proteolitice
• Catena polipeptidică se scindează cu formarea unor
fragmente polipeptidice, care în final hidrolizează,
punând în libertate toţi aminoacizii constituenţi.

Curs 2+3+4 51
B3. Denaturarea proteinelor

• Reprezinta modificarea structurala a proteinelor sub acţiunea unor


agenţi fizici şi chimici, cu păstrarea masei moleculare.
• Denaturarea determină: scăderea solubilităţii şi a capacităţii
proteinelor de a absorbi apa, modifică viscozitatea, presiunea
osmotică, activitatea optică şi gradul de hidroliză, ca şi activitatea
fiziologică.

Curs 2+3+4 52
B3. Denaturarea proteinelor

• Clasificarea agenţiilor denaturanţi:


 agenţi fizici: temperaturile ridicate, radiaţii UV, razele X, ultrasunetele
etc.;
 agenţi chimici: soluţii concentrate de acizi şi baze tari, sărurile unor
metale grele (Hg, Pb, Cd etc.), compuşi ai arsenului, solvenţi organici
etc.
• Denaturarea proteinelor reprezintă un proces complex, care implică
modificări ale structurii secundare şi terţiare a proteinelor (desfacerea
sau modificarea legăturilor de hidrogen, a legăturilor disulfurice, ionice
etc.), însoţite de deplierea catenelor şi modificarea arhitecturii
moleculare.

Curs 2+3+4 53
Alte caracteristici ale proteinelor

• Specificitatea de organ: fiecare organ al unui organism conţine proteine


specifice, diferite de proteinele altor organe ale aceluiaşi individ.
• Specificitatea de specie: acelaşi organ de la diferite specii, animale sau
vegetale, conţine proteine specifice, diferite de ale aceluiaşi organ al unui
individ din altă specie.

Curs 2+3+4 54
Alte caracteristici ale proteinelor
• Proprietăţi imunologice: inocularea unor substante cu structura proteica,
poliglucidica sau a unor complexe glucido-lipido-proteice, în organismul unui
animal provoacă apariţia în serul acestuia a unei substanţe capabile să
recunoasca substanta inoculata.
• Substanta inoculata = antigen este străina organismului în care a pătruns şi
declanşează în consecinţă biosinteza unor proteine specifice de apărare,
denumite anticorpi.
• Antigenul reacţionează cu anticorpii formaţi, determinând reacţia antigen-
anticorp, prin care este anihilată acţiunea nocivă a antigenului.
• Formarea anticorpilor coincide cu instalarea în organism a unei
rezistenţe specifice (imunitate) faţă de agentul patogen.
• Reacţiile imunologice stau la baza preparării şi utilizării serurilor şi
vaccinurilor în vederea imunizării organismelor contra infecţiilor microbiene.

Curs 2+3+4 55
Metode de separare si purificare a
proteinelor
• Puritatea unui preparat proteic este esentiala pentru identificarea proteinei,
studiul proprietatilor si al functiei acesteia.
• Metodele clasice de separare a proteinelor se bazeaza pe diferentele
existente intre proprietatile acestora: solubilitate, marime, sarcina electrica,
stabilitate termica, capacitatea de legare de anumite suporturi.
• Sursele de proteina sunt fluidele biologice, tesuturile sau celulele
microbiene.
• Prima etapa a oricarui procedeu de purificare implica dezintegrarea
(spargerea) celulelor, care permite eliberarea proteinelor intr-o solutie
numita extract brut.
• Extractul proteic brut se prelucreaza apoi prin diferite procedee care conduc
la separarea proteinelor in mai multe fractiuni, pe baza proprietatilor sus-
mentionate.

Curs 2+3+4 56
Extractia proteinelor din materialul
biologic
• Eficienta extractiei depinde de:
- cantitatea de material biologic disponibil
- localizarea proteinelor
- cantitatea de proteine din materialul biologic
- solubilitatea proteinelor
- prezenta unor electroliti
- prezenta unor solventi organici

Curs 2+3+4 57
Extractia proteinelor intracelulare

Proteine localizate in citoplasma


• celulelor animale: suspendare intr-o solutie hipotonica
• celulelor vegetale sau microbiene: tratare cu lizozim, enzima
ce degradeaza memebranele celulare

Proteine localizate in alte formatiuni celulare (membrane sau


mitocondrii) se extrag prin centrifugare diferentiata: celulele
suspendate sunt centrifugate la viteze diferite, in functie de care
se separa componentele.

Curs 2+3+4 58
Separarea proteinelor intracelulare prin centrifugare
diferentiata

Curs 2+3+4 59
Solubilitatea proteinelor
• Este deteminată de:
1. prezenţa pe suprafaţa moleculei proteice a resturilor de
AA cu sarcini electrice (COO- ; NH3+) şi de grupări polare
(OH, SH) care interacţionează cu dipolul de apă.
2. particularităţile de organizare (proteinele globulare se
dizolvă mult mai bine faţă de cele fibrilare)
3. pH-ul mediului, care modifică sarcina electrică a proteinei
4. temperatură

Curs 2+3+4 60
5. proprietăţile solventului (ex:apa pură, soluţii saline slabe).
6. prezenţa sărurilor metalelor uşoare – NaCl, MgCl2, Na2SO4,
care:
- la concentraţii mici măresc solubilitatea proteinelor
- la concentraţii mari scad solubilitatea proteinelor şi ele
precipită. Acest proces se numeşte salifiere.

Curs 2+3+4 61
Metode se separare bazate de diferenţa de
solubilitate
Fiecare proteină are compoziţia sa proprie de aminoacizi, care îi
determină comportarea ca electrolit.

Deoarece proteinele se comporta ca electroliţi cu masa moleculara


mare, ele pot fi selectiv precipitate sau solubilizate prin modificarea pH-
ului, tariei ionice, constantei dielectrice sau temperaturii soluţiei in care
se afla..

Curs 2+3+4 62
Metode de separare bazate de diferenţa de
solubilitate
1. Salefierea proteinelor
Sărurile neutre au efecte puternice asupra solubilităţii proteinelor.
În concentraţii mici, sărurile cresc solubilitatea proteinelor, fenomen
cunoscut sub denumirea de salting-in. Săruri ca MgCl2 şi (NH4)2SO4
sunt mult mai eficiente în acest sens decât cele monovalente KCl, NaCl,
NH4Cl.
Capacitatea sărurilor neutre de a influenţa solubilitatea proteinelor este
în funcţie de taria ionică, mărime care măsoară atât concentraţia cât şi
numărul de sarcini electrice.

Curs 2+3+4 63
Metode bazate de diferenţa de solubilitate
1. Salefierea proteinelor
Pe măsură ce tăria ionică continuă să crească, solubilitata proteinelor
începe să scadă. La o tărie ionică suficient de mare, o proteină poate
fi precipitată aproape complet din soluţie, fenomen cunoscut sub
numele de salting-out.
Principiile fizico-chimice care stau la baza acestui proces sunt
complexe. Unul din factorii care intervin este îndepărtarea apei de
hidratare din molecula proteinei de către concentraţia mare de sare,
ceea ce duce la scăderea solubilităţii.
Fiecare proteină răspunde in mod diferit la concentraţia sărurilor neutre.

Curs 2+3+4 64
Metode bazate de diferenţa de solubilitate
2. Precipitarea izoelectrică
Solubilitatea celor mai multe proteine este puternic influenţată de pH-
ul sistemului.
pH-ul la care o proteină este cel mai puţin solubilă este pH-ul său
izoelectric (pI), definit ca pH-ul la care molecula nu are încărcare
electrică şi nu se deplasează în câmp electric.
În aceste condiţii nu există respingere electrostatică între molecule
proteice învecinate, care tind să se aglomereze şi să precipite.
La valori de pH deasupra sau sub pI toate moleculele de proteină au
încărcare electrică netă de acelaşi semn, deci ele se vor respinge,
evitandu-se astfel aglomerarea în agregate insolubile.

Curs 2+3+4 65
Metode bazate de diferenţa de solubilitate
2. Precipitarea izoelectrică

Datorită conţinutului lor diferit de aminoacizi cu grupări R ionizabile,


proteinele au valori diferite ale pH-ului izoelectric si pot fi separate prin
precipitare izoelectrică.

Proteină pH-izoelectric Proteină pH-izoelectric


Pepsină 1 γ1- globulină 6,6
Ovalbumină 4,6 Hemoglobină 6,8
Albumină serică 4,9 Mioglobină 7
β-lactoglobulină 5,2 Ribonuclează 9,6

Curs 2+3+4 66
Metode bazate de diferenţa de solubilitate
3. Fracţionarea cu solvenţi
Solubilitatea proteinelor depinde de constanta dielectrică a soluţiei, care alterează
amplitudinea interacţiunilor electrostatice dintre grupele cu sarcină electrica.
Pe măsură ce constanta dielectrică scade intensitatea interacţiunilor
electrostatice creşte. Aceasta duce la scăderea solubilităţii proteinelor în soluţie,
deoarece repulsiile electrostatice dintre ele nu sunt suficient de mari pentru a
preveni agregarea.

Curs 2+3+4 67
Metode bazate de diferenţa de solubilitate
3. Fracţionarea cu solvenţi
Constanta dielectrică a soluţiilor apoase poate fi scăzută prin adăugare de
solvenţi organici hidrofili, cum ar fi etanol şi acetonă.
Cantitatea de solvent organic necesară precipitării depinde de tipul proteinei şi,
prin urmare, aceasta poate fi separată de restul proteinelor, prin precipitare.
Cantiatea optimă de solvent organic necesară precipitării proteinei variază între 5-
60%.
Operaţia se realizează de obicei sub 0oC, pentru a preveni denaturarea
proteinelor prin creşterea temperaturii la amestecarea solvetului organic cu apa.

Curs 2+3+4 68
Metode de separare bazate pe
diferenţele de masă
I. Dializa
• Dializa este folosită pentru separarea moleculelor din soluţie.
• Se bazează pe utilizarea unor membrane semipermeabile care
permit trecerea moleculelor mai mici decât o anumită mărime dată.
• Soluţia proteică este introdusă în sacul de dializă confectionat din
materialul semipermeabil, care este închis şi amplasat într-un volum
mare de apă sau soluţie tampon care se agită uşor, continuu.
• Moleculele mici trec prin pereţii sacului de dializa, iar cele de
proteină vor fi reţinute în interiorul lui. Dializa este o metodă lentă,
necesitând până la 12 ore.
• Este utilizată frecvent în laborator pentru înlăturarea sărurilor după
separarea prin salefiere.

Curs 2+3+4 69
Separări bazate pe diferenţele de masă
II. Ultrafiltrarea
Soluţia proteică este plasată într-o celulă ce conţine o membrană
semipermeabilă şi apoi este aplicată o presiune sau este supusă
centrifugării.
Moleculele mici şi apa trec prin membrană, moleculele de proteină
fiind reţinute.
Principiul de separare este similar dializei, dar datorită aplicării
presiunii separarea este mult mai rapidă.

Curs 2+3+4 70
Separări bazate pe diferenţele de masă
III. Cromatografia prin excludere moleculară (gel-filtrare)
Separă proteinele pe baza mărimii lor.
Soluţia proteică este introdusă într-o coloană a cărei umplutură este formată dintr-un
polimer reticulat (dextrioza, agaroză).
Moleculele mai mari decât porii polimerului sunt excluse şi ies rapid din coloană.
Moleculele mai mici pot intra în pori, deci viteza lor de deplasare prin coloană va fi
mai mica.
Astfel, moleculele sunt eluate din coloană începand cu cele mai mari.
Există faze staţionare care prezintă mărimi diferite ale porilor astfel încât permit
separarea proteinelor cu diferite mase moleculare.
Fabricantii acestor faze staţionare dau informaţii asupra domeniului de greutăţi
moleculare pentru care acestea sunt cele mai potrivite.

Curs 2+3+4 71
Masa moleculară a
proteinelor necunoscute
poate fi determinată prin
compararea volumului de
eluţie cu cel al unor
molecule proteice cu
masa cunoscută:
reprezentare grafică a
volumului de eluţie
funcţie de logaritmul
masei moleculare trebuie
să fie o linie dreaptă.

Curs 2+3+4 72
Separări bazate pe diferenţele de masă
• IV. Electroforeza consta in deplasarea moleculelor incarcate electric
(proteine, acizi nucleici) de-a lungul unui gel, intr-un camp electric.
• Gelul este asemeni unei site moleculare, care permite moleculelor mai mici
sa se deplaseze mai rapid, iar celor mai mari sa inainteze mai lent.
• Amestecurile de proteine sunt separate prin intermediul SDS-poliacrilamid
electroforezei = SDS-PAGE (SDS = sodium dodecyl sulfate - dodecil sulfatul
de sodiu).
• Pentru a strabate mai usor aceste site moleculare moleculele de proteina
sunt denaturate (despachetate) cu ajutorul detergentilor (SDS) si a agentilor
reducatori (β-mercapto-etanol sau altii) care desfac puntile disulfurice.
• In stare denaturata, marimea proteinelor este aproximativ proportionala cu
masa lor moleculara.
• Aceasta corelatie face posibila estimarea masei moleculare a proteinelor
necunoscute cu ajutorul unor proteine martor a caror masa moleculara este
deja cunoscuta. Curs 2+3+4 73
Curs 2+3+4 74

Electroforeza SDS-PAGE
Electroforeza SDS-PAGE
a)
• Diferite probe se aplica in godeuri la capatul gelului de poliacrilamida.
• SDS (dodecil sulfatul de sodiu (lauril sulfatul) CH3(CH2)11OSO3-Na+)
interactioneaza cu partile hidrofobe ale proteinei (lanturile de proteina
despachetate leaga SDSul formand structuri elipsoidale), rezultand
micelii incarcate negativ care au o masa moleculara constanta (1,4 g
SDS/g proteina).
• Proteinele se misca in gel in momentul aplicarii campului electric.
• Micelele incarcate negativ se deplaseaza spre anod cu o distanta de
migrare proportionala cu logaritmul masei moleculare a proteinei.

Curs 2+3+4 75
Electroforegrama separarii si
purificarii unei proteine din E.coli
(b)
• Proteinele se pot vizualiza dupa electroforeza, prin tratarea gelului cu
un colorant (albastru Coomassie), care se leaga de proteine, dar nu
si de gel.
• Fiecare banda reprezinta o proteina sau o subunitate proteica
diferita.
• Proteinele mai mici se deplaseaza spre anod mai repede decat cele
mari, astfel ca ele apar aproape de capatul gelului.
 Prima banda este formata dintr-un set de proteine de masa
cunoscuta, care reprezinta markeri moleculari.
 Urmatoarele 2 benzi reprezinta proteinele din E.coli inainte si
dupa inducerea biosintezei proteinei de interes.

Curs 2+3+4 76
Electroforegrama separarii si
purificarii unei proteine din E.coli
(b)
 A patra banda prezinta proteinele din extractul proteic brut.
 Urmatoarele benzi (de la stanga la dreapta) arata proteinele
prezente dupa fiecare din mai multe etape succesive de
purificare (fractionarea cu sulfat de amoniu, cromatografia pe
cationit si pe anionit)
 Ultima banda este etalonul de proteina pura, formata dintr-un
singur lant polipeptidic ( M,= 38.000).

Curs 2+3+4 77
Focusarea (focalizarea,concentrarea)
izoelectrica
• Daca un amestec de proteine este supus electroforezei
intr-o matrice care are un gradient de pH si creste incet
pHul de la anod la catod, fiecare proteina va migra pana
la punctul in care pH-ul matricei este egal cu punctul sau
izoelectric.

Curs 2+3+4 78
Focusarea (focalizarea,concentrarea)
izoelectrica

Curs 2+3+4 79
Focusarea (focalizarea,concentrarea)
izoelectrica
• Se bazează pe diferenţele dintre punctele izoelectrice (pI, care
sunt determinate de continutul relativ de grupări bazice şi acide
ale proteinelor.
• Punctul izoelectric al unei proteine este egal cu pH la care
sarcina totală (implicit mobilitatea electroforetică) a proteinei
este zero.
• La pH < pI proteinele sunt încărcate pozitiv şi migrează într-un
mediu cu pH fixat spre catodul încărcat negativ.
• La pH > pI proteinele sunt deprotonate şi datorită încărcării
negative, acestea migrează spre anod.
• Punctul izoelectric al unei proteine poate fi estimat utilizând un
gel cu gradient (format din polielectroliţi) de pH.
Curs 2+3+4 80
Focusarea (concentrarea) izoelectrica
• În mod curent un acid (fosforic) este plasat la catod, iar o bază
(etanolamina) este plasată la anod.
• Domeniul de pH al soluţiei de electrolit poate fi larg (2-10) sau
îngust (7-8) în funcţie de numărul de proteine separate sau de
necesitatea preciziei determinării pI-ului.
• Dat fiind faptul că moleculele de proteină din amestecuri au
valori ale punctelor izoelectrice diferite, este posibilă separarea
acestora prin focusare izoelectrică.
• Mai mult, punctul izoelectric al proteinelor separate coincide cu
valoarea pH-ului la care proteina a fost focusată.

Curs 2+3+4 81
Focusarea (concentrarea) izoelectrica
• Este un procdeu folosit pentru determinarea punctului izoelectric al
proteinelor.
• Intr-o coloana de gel se incorporeaza un amestec de acizi si baze
organice (amfoliti). Se aplica un camp electric, care conduce la
stabilirea unui gradient de pH prin distribuirea amfolitilor de-a lungul
gelului cilindric.
• Se introduce solutia proteica in gel si se aplica din nou un camp
electric.
• Odata cu aplicarea campului electric, solutia proteica patrunde in gel
si.fiecare proteina din amestec va migra pana cand va atinge pHul
care corespunde punctului sau izoelectric.
• Astfel, proteinele cu pIuri diferite se distribuie in mod diferit in gel.

Curs 2+3+4 82
Focusarea izoelectrica

Curs 2+3+4 83
Electroforeza bidimensionala
• Este un procedeu care combina focusarea izoelectrica
(metoda în care separarea se face pe baza sarcinii) si
electroforeza SDS-PAGE (metoda în care proteinele sunt
separate pe baza masei mo leculare)..
• Permite separarea amestecurilor complexe de proteine, a
proteinelor cu greutate moleculara identica, dar cu puncte
izoelectrice diferite, sau a proteinelor cu puncte izoelectrice
similare, dar care au greutati moleculare diferite.
• Seapararea pe orizontala reflecta diferentele de pI ale
proteinelor din amestec.
• Separarea pe verticala reflecta diferentele de greutate
moleculara.

Curs 2+3+4 84
Electroforeza bidimensionala
• Combinarea celor două metode conduce la îmbunatăţirea rezoluţiei
separărilor amestecurilor de proteine complexe. Proteinele astfel
separate pot fi observate sub forma unor spoturi situate în geluri.
• Această tehnică este indispensabilă pentru cercetătorii care
lucrează în domeniul proteomică, a caror ţintă este studierea
structurii, interacţiunilor şi a funcţiilor biologice a proteinelor
rezultate în urma expresiei genomului (proteom ului) unui organism .

Curs 2+3+4 85
Electroforeza
bidimensionala

Curs 2+3+4 86
Separarea proteinelor prin cromatografie de
adsorbtie pe coloana
Cromatografia de adsorbţie (cromatografia de lichide pe coloana) implică
separarea compuşilor dintr-un amestec prin adsorbţia/desorbţia selectivă a
acestora pe suprafaţa unui adsorbant (faza staţionară) reţinut în interiorul unei
coloane prin care trece amestecul de proteine dizolvate (faza mobilă).
În funcţie de tipul fazei staţionare, există două tipuri de mecanisme care se
aplică în cazul separării proteinelor:
- cromatografia prin schimb ionic
- cromatografia de afinitate.
Separarea se poate realiza atat pe coloane deschise cat si inchise, de inalta
performanta.

Curs 2+3+4 87
Separarea proteinelor prin cromatografie de
adsorbtie pe coloana
a) Cromatografia prin schimb ionic
Cromatografia prin schimb ionic se bazează pe fenomenele reversibile de
adsorbţie/desorbţie, respectiv schimb ionic, între ionii din soluţie şi grupările
ionice ale unei matrici solide sau reţea polimerică.
Această tehnică este cea mai utilizată tehnică cromatografică pentru
separarea proteinelor.
Adsorbantul (sorbent), respectiv faza stationara, este o matrice de polimer
sintetic (răşină) sau natural, de care sunt legate grupe acide sau bazice,
ionizabile.
Adsorbantul ce conţine grupe anionice (incarcate negativ) se numeşte cationit
pentru ca schimba cationii care se pot lega de grupele anionice (deci este
schimbator de cationi).
Adsorbantul ce conţine grupe cationice (incarcate pozitiv) se numeşte anionit
pentru ca schimba anionii care se pot lega de grupele cationice (deci este
schimbator de cationi).
Curs 2+3+4 88
Separarea proteinelor prin cromatografie de
adsorbtie pe coloana
a) Cromatografia prin schimb ionic
Faza mobilă este formată dintr-un electrolit având o anumită tărie
ionică şi un anumit pH, astfel încât să favorizeze un număr maxim
de legături între faza staţionară şi proteina de interes.
Proteinele contaminante trebuie să se lege mai puţin puternic, astfel
încât să treacă mai repede prin coloană. Proteina de interes este
apoi eluată cu o altă soluţie tampon care să favorizeze desorbţia.
Cromatografia de schimb ionic valorifică diferenţele de semn şi
marime intre sarcinile electrice ale diferitelor proteine, la un anumit
pH.

.
Curs 2+3+4 89
Curs 2+3+4 90
Separarea proteinelor prin
cromatografie de adsorbtie pe coloana
a) Cromatografia prin schimb ionic (exemplu)
• Intr-o coloana cu cationit (schimbător de cationi) se introduce o solutie (fază
mobilă) ce conţine un amestec de 2 proteine A si B.
• Exemple de cationiti: polimeri cu grupe functionale, incarcate negativ, acide
(carboxilice)
• Exemple de anioniti: polimeri cu grupe functionale incarcate pozitiv, bazice
(saruri cuaternare de amoniu)
• La pHul fazei mobile, proteina A are sarcina electrica -3, datorita
preponderentei resturilor de Glu şi Asp comparativ cu Arg Lys si His, iar
proteina B are sarcina electrica netă + 1.
• Deoarece schimbatorul de cationi are grupe functionale incarcate negativ,
acestea vor atrage electrostatic moleculele incarcate pozitiv, întârziind
trecerea lor prin coloană. Peptida B, fiind încărcată pozitiv, va interacţiona
mai puternic cu schimbătorul de cationi decât peptida A, care va elua prima.
• Pe o raşină schimbătoare de anioni, peptida B va trece prima.
Curs 2+3+4 91
Separarea proteinelor prin
cromatografie de adsorbtie pe coloana
b) Cromatografia de afinitate
În cromatografia de afinitate fază staţionară este formata dintr-un
polimer solid, de care se leagă covalent un ligand.
Ligandul este o moleculă care prezintă afinitate specifică pentru o
proteină dată.
Amestecul de proteine este trecut prin coloană, iar proteina de
interes este reţinută pe suprafaţa adsorbantului, în timp ce alte
proteine trec nereţinute.
Proteina de interes este apoi eluată cu o soluţie de ligand sau cu o
solutie tampon care favorizează desorbţia.
Această tehnică este cea mai eficientă metodă de separare a
proteinelor individuale dintr-un amestec de proteine, dar este şi cea
mai scumpă metodă, deoarece necesită coloane cu faze staţionare
specifice.
Curs 2+3+4 92
Curs 2+3+4 93
Metode analitice de determinare a
concentratiei proteinelor
• Metode spectrofotometrice
- Determinarea absorbtiei la 280 nm
- Metoda biuretului
- Metoda Lowry
- Metoda Blue Coomassie
• Metode imunochimice

Curs 2+3+4 94
Determinarea absorbtiei la 280 nm
• Absorbtia la 280 nm se datoreaza prezentei resturilor de Trp, Tyr, Phe,
Cis.
• Avantajele metodei sunt:
- sensibilitate buna (50 – 100 micrograme)
- simplitate
- este o metoda nedistructiva
• Dezavanta major:
- interferenta acizilor nucleici (care absorb la 254 nm)
Metoda Warburg - Christian (1941): determinarea absorbtiei la 2 lungim
de unda diferite: 260 nm (pt. acizii nucleici) si 280 nm (pt. proteine)
mg. proteine/mL = 1,55 x A280 – 0,76 x A260

Curs 2+3+4 95
Metoda biuretului
• Se bazeaza pe reactivul numit biuret, o solutie alcalina
de sulfat de cupru de culoare albastra, care se schimba
in violet in urma contactului cu proteine.
• Avantaje:
- simplitate, rapiditate
- Sensibilitste medie (1-20 mg)
- mai putine interferente comparativ cu metoda Lowry

Curs 2+3+4 96
Curs 2+3+4 97
Metoda Lowry
• Se bazeaza pe proprietatea Tyr si a Trp de a reactiona
cu fosfomolibdatul sau fofowolframatul de sodiu, cu
formarea unui complex de culoare albastra.
• Dezavantaje
• Substante care interfera cu absorbtia proteinelor:
zaharoza, glicerol, derivati de mercaptan, EDTA,
detergenti

Curs 2+3+4 98
Metoda Bradfort

• Principiul metodei: colorantul Commassie Blue G 250, in forma


anionica, se leaga de gruparile bazice din structura proteinelor
(arginina, histdina, lizina) cu devierea absorbtei de la 465 nm
(culoarea rosie) la 595 nm (culoarea albastra).
• Se determina concentrata de proteina in functe de absorbanta
probei la 595 nm (A 595), comparatv cu o proteina standard de
concentrate cunoscuta.
• Avantaje
- sensibilitate buna (permite determinarea unor concentrati de
proteine cuprinse in domeniul 0,2-20 µg)
- simplitate
- absenta interferentelor uzuale
Curs 2+3+4 99
Metoda imunochimica

Curs 2+3+4 100