Carmen SOLCAN Cristian Radu SISEA

Universitatea de Științe Agricole și Universitatea de Științe Agricole și

Medicină Veterinară "Ion Ionescu de Medicină Veterinară Cluj Napoca
la Brad" Iași

BIOLOGIE MOLECULARÃ

Editura "Ion Ionescu de la Brad"

IAŞI - 2012

1
Referenți științifici:
Prof. Dr. Șteofil CREANGĂ
Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară "Ion
Ionescu de la Brad" Iași
Conf. Dr. Mariana IONIȚĂ
Universitatea de Științe Agonomice și Medicină Veterinară
București

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României

SOLCAN, CARMEN
Biologie moleculară / Carmen Solcan, Cristian Radu Sisea. –
Iași
Editura Ion Ionescu de la Brad, 2012

Biblogr.
ISBN 978-973-147-115-0

I. Sisea, Cristian Radu

577.2

ISBN 978-973-147-115-0

© Editura "Ion Ionescu de la Brad" Iași

2
 CUPRINS

INTRODUCERE 7
1 CELULELE PROCARIOTE ŞI EUCARIOTE (Carmen 9
SOLCAN)
1.1 Evoluţia celulelor 9
1.2 Caracteristicile procariotelor 11
1.3 Caracteristicile celulelor eucariote 12
1.3.1 Structura nucleului 13
1.3.2 Structura cromatinei 16
1.3.3 Structura nucleolului 17
2. ACIDUL DEZOXIRIBONUCLEIC (Carmen SOLCAN) 19
2.1 Structura acizilor nucleici 19
2.1.1 Structura primară a ADN 26
2.1.2 Structura secundară a ADN 27
2.1.3 Tipuri de ADN 30
2.2 Cromatina 32
2.3 Proprietăţile fizice ale ADN 37
3 REPLICAREA ADN (Carmen SOLCAN) 40
3.1 Ciclul celular 40
3.2 Apoptoza (moartea celulară programata) 46
3.3 Replicarea ADN – generalităţi 47
3.3.1 Caracteristicile replicării 48
3.3.2 Mecanismul molecular al replicării la procariote 50
3.3.3 Mecanismul molecular al replicării la eucariote 55
3.3.4 Reparaţiile ADN 61
4 TRANSCRIPŢIA ADN (Carmen SOLCAN) 66
4.1 Tipuri de ADN nuclear 66
4.2 Genomul mitocondrial 69
4.3 Structura şi clasificarea genelor 70
4.4 Transcripţia 73
4.4.1 Iniţierea transcripţiei 75
4.4.2 Factorii reglatori ai transcripţiei 78
4.4.3 Discontinuitatea genelor 80
4.4.4 Tipuri de ARN 80
4.4.4.1 Maturarea ARN-ului mesager 82
4.4.4.2 ARN de transfer (ARNt) 88
4.4.5 ARN Polimerazele 90
5 TRANSLAŢIA (Carmen SOLCAN) 92
5.1 Structura proteinelor 92
5.2 Codul genetic 95
5.3 Sinteza proteinelor 97
3
5.3.1 Iniţierea lanţului polipeptidic 99
5.3.2 Cadrul de citire al ARNm 103
5.3.3. Poliribozomii şi peptidele semnal 105
5.3.4. Denaturarea şi renaturarea proteinelor 111
6 MUTATIILE (Carmen SOLCAN) 114
6.1 Scurt istoric 114
6.2 Mutaţiile genice 116
6.2.1 Originea mutaţiilor genice 125
6.2.2 Activitatea unui situs criptic de excizie 128
6.2.3 Transpoziţia 129
6.2.4 Reverstranscripţia la virusuri 131
6.2.5 Duplicarea genei 133
6.2.6 Pseudogena 134
6.3. Mutaţiile cromozomiale 135
6.4 Mutaţii genomice 137
6.5 Mutaţii extranucleare 138
6.6 Nomenclatura mutaţiilor genice 138
7 TEHNICI DE EXTRACŢIE A ACIZILOR NUCLEICI 143
(Carmen SOLCAN)
7.1 Extracţia ADN 143
7.2 Extracţia ARN 147
7.3 Spectrofotometria pentru cuantificarea ADN 150
8 AMPLIFICAREA ACIZILOR NUCLEICI (Cristian Radu 153
SISEA)
8.1 Reacţia în lanţ a polimerazei PCR (polimerase chain 153
reaction)
8.1.1 Principiul reacţiei PCR 153
8.1.2 Reacţii PCR specializate 161
8.2 Real-time PCR 170
8.2.1 Principiul real-time PCR 171
8.2.2 Eficienţa amplificării în analizele real-time PCR 173
8.2.3 Materiale de referinţă certificate 182
8.2.4 Instrumentele real-time PCR 182
8.2.5 Sisteme de detecţie 185
8.3 Secvenţierea ADN (Carmen SOLCAN) 194
8.3.1 Secvenţierea ADN cu T7 ADN polimeraza 195
8.3.2 Secvenţierea fluorescentă automată 198
8.3.3 Electroforeza şi interpretarea secvenţei 201
9 METODE DE DETECŢIE A ACIZILOR NUCLEICI ŞI 203
PROTEINELOR (Carmen SOLCAN)
9.1 Electroforeza 203
9.2 Sisteme de detecţie 209
4
9.2.1 Electroforeza pe gel în câmp pulsat 211
9.2.2 Electroforeza capilară 213
10 TEHNICI DE HIBRIDARE (Carmen SOLCAN) 215
10.1 Enzimele de restricţie 215
10.1.1 Harta de restricţie 217
10.1.2 Polimorfismul lungimii fragmentelor de restrictie (RFLP) 220
10.2 Tehnici de hibridare. Generalităţi 224
10.2.1 Sondele de acizi nucleici 225
10.2.1.1 Marcarea sondelor 228
10.2.2 Hibridarea ADN-ADN sau tehnica Southern blot 235
10.2.3 Hibridarea ADN-ARN sau transferul Northern 240
10.2.4 Transferul proteinelor pe membrane (Western) 241
10.3 Condiţii de hibridare, stringenţa 244
10.4 Tehnica ADN microarray 248
10.5 Cariotiparea 252
10.5.1 Fluorescenţa în hibridarea in situ 253
10.6 Metode de diagnostic bazate pe hibridare 256
10.6.1 Electroforeza în gel cu gradient de denaturare (DGGE) 257
10.6.2 Hibridarea oligomerilor specifici alelelor 259
11 CLONAJUL MOLECULAR (Carmen SOLCAN) 260
11.1 Caracteristicile vectorilor de clonare 261
11.2 Plasmidele 262
11.2.1 Clonajul molecular la plasmide 263
11.3 Fagii sau bacteriofagii 266
11.4 Cosmidele 269
11.5 Cromozomul artificial de drojdie - Yac 272
11.6 Vectori de expresie 274
11.7 Construcţia unei bănci de ADN genomic 277
11.8 Construcţia unei bănci de ADN complementar 278
12. APLICAŢII PRACTICE ALE BIOLOGIEI MOLECULARE 284
BIBLIOGRAFIE 289

5
6
 INTRODUCERE

Biologia moleculară a evoluat în ultimii ani datorită progreselor

realizate în cercetările de biochimie, genetică, microscopie electronică,
tehnologia ADN recombinat şi a informaticii. James Watson a inventat
termenul "biologie moleculară", referindu-se la biologia acidului
dezoxiribonucleic. În natura există numeroase biomolecule, cu toate acestea
termenul este încă folosit pentru a descrie studiul acizilor nucleici.
În 1869 Friedrich Meicher a descoperit în nucleul celulelor (din sperma
de peşte şi din puroiul unor răni deschise) molecule de nucleoproteine (pe care
le-a numit nucleine) fără însă nici măcar să bănuiască importanţa acestora în
organismele vii. Structura acestor molecule a fost stabilită de abia în 1920 de
chimistul Levene.
În urma unor laborioase experienţe cu două tulpini de bacterii
(Streptococus pneumoniae) începute în 1920, în 1928 Griffith a demonstrat că
se pot modifica proprietăţile ereditare acţionând asupra unor „misterioase”
molecule chimice din structura organismelor vii, fără să poată preciza care însă
sunt acestea. Nimeni nu se gândea atunci la acizii nucleici, căci toată
comunitatea ştiinţifică era fascinată de proteine. Doar la Institul Rokefeler din
New York, Oswald Averry şi col. începând din 1944 pe baza unor cercetări
considerate însă de unii drept neconcludente susţineau rolul acizilor nucleici în
ereditate.
Profesorul Litarcek în anul 1949 – după un stagiu la Institutul Rokefeler
din SUA, - susţinea pentru prima oară la noi în ţară în prelegerile sale de la
spitalul Colentina din Bucureşti că nucleoproteinele trebuie să fie suportul
eredităţii.
Abia în 1952 în urma unor experienţe pe bacteriofag (virus care
agresează Escheria coli) făcute de A.Hershey şi Marta Chase aceştia au
demonstrat că suportul biochimic al eredităţii este dat de acizii nucleici. Cu
această descoperire genetica a intrat într-o eră nouă.
Odată făcută această precizare, oamenii de ştiinţă au fost curioşi să afle
prin ce secret aceste molecule sunt capabile să asigure ereditatea. Mingea a fost
aruncată în curtea fizicienilor şi cristalografilor care au început să cerceteze cu
metodele lor (mai ales prin difracţia razelor X), forma şi organizarea internă a
moleculelor de acid dezoxiribonucleic (ADN). O serie de fizicieni ca
M.Willkins, J.Randall, R.Gossling, L. Pauling ş.a s-au angajat în cercetări
laborioase.
Una din contribuţiile cele mai importante le-a adus Rosalind Franklin
(1920-1958) de la Kings College din Londra care printre altele a obţinut şi
imaginile de difracţie ce au fundamentat modelul helicoidal al moleculei de
ADN. Din motive obscure a fost marginalizată, şi cum a murit foarte tânără de
7
cancer, în vârstă de numai 37 de ani, probabil din cauza prea intensei iradieri, a
fost foarte nedreptăţită de „colegii”ei. I s-a spus „The Dark Lady of
DNA”(Doamna din întuneric a ADN-ului). Fotografiile pe care le-a făcut cu
privire la difracţia razelor X prin moleculele de ADN şi care i-au fost luate fără
permisiune au îngăduit lui Watson şi Crick să realizeze modelul helicoidal al
ADN-ului. Watson, Crick și Wilkins după minuţioase cercetări realizate între
anii 1950-1953 au descifrat structura ADN-ului, valabilă pentru nucleii tuturor
celulelor, pentru care au luat împreună premiul Nobel în 1962.
Manipularea ADN şi ARN în laborator este deja aplicată în producţia de
vaccinuri, diagnostic, pentru detectarea purtătorilor de gene dăunătoare şi în
terapia genică. Medicina umană și veterinară, producţia agricolă,
biotehnologiile etc. sunt beneficiare ale acestei noi ramuri a științei.
Una dintre cele mai importante realizări ale biologiei moleculare a fost
dezvoltarea metodelor pentru secvenţierea rapidă a fragmentelor de ADN.
Această separare a fost folosită în scop diagnostic şi s-a realizat prin două
metode: Sanger, sau dideoxy (chain-terminating) şi Maxam-Gilbert, sau
chimică. Prima metodă este folosită mai des în practică. Pe această cale se
alcătuieşte genomul unei specii. S-a ajuns la stabilirea genomului indivizilor şi
al agenţilor patogeni.
Secvenţierea genomului uman a avut un rol important în biologia
moleculară prin care, lumea ştiinţifică de azi speră să înţeleagă modul în care
acesta este organizat, cum funcţionează, ceea ce va permite tratarea unor boli.
Primul genom secvenţiat aparţinând unei specii de fermă a fost cel de
găină (Hillier şi col., 2004; Wong şi col., 2004), urmat de cel al taurinelor şi
suinelor. Existenţa acestor informaţii va permite localizarea genelor cu efect
major asupra caracterelor economico-productive, va asigura informaţiile din
domeniul molecular în managementul şi ameliorarea animalelor.
Numărul de markeri moleculari descoperiţi a crescut, iar o parte dintre
aceştia vor fi folosiţi în programele de ameliorare, acolo unde se va considera
că pot îmbunătăţi progresul genetic. Informaţiile provenite de la aceşti markeri
vor fi completate cu performanţele rezultate în urma testării, ambele fiind luate
în considerare la estimarea valorii de ameliorare a unui anumit caracter,
îmbunătăţindu-se acurateţea estimării sale şi creând astfel o generaţie mai
valoroasă din punct de vedere productiv sau al rezistenţei la îmbolnăviri.
În domeniul diagnosticului şi profilaxiei unor boli majore la animale
(gripa aviară, pesta porcină etc.) s-au făcut progrese remarcabile. Testele bazate
pe manipularea ADN sunt implicate în:
- depistarea speciilor, suşelor, serogrupelor și varietăţilor de agenți
patogeni: virusuri, bacterii, fungi, paraziţi;
- compararea speciilor din acelaşi gen sau suşelor din aceeaşi specie;
- cuantificarea citokinelor şi a interferonului gama;
- facilitarea supravegherii epidemiologice a efectivelor;
8
 - precizarea unui diagnostic de certitudine;
- identificarea şi diferenţierea cărnii diferitelor specii animale.
- Identificarea organismelor modificate genetic (OMG) etc.

1. CELULELE PROCARIOTE ŞI EUCARIOTE

1.1 Evoluţia celulelor

Lehninger (96), consideră celula ca o combinaţie complexă de molecule

organice capabile de autoorganizare, autoreplicare, schimb de energie şi materie
cu mediul, prin intermediul unor reacţii organice consecutive şi catalizate
enzimatic.
Primii polimeri biologici sunt consideraţi acizii nucleici, deoarece sunt
singurele molecule capabile de autoreplicare (care ar fi putut servi drept matrice
pentru propria lor replicare).
În orice proces de copiere se produc inevitabil erori, care vor genera
copii imperfecte. Prin replicări repetate, secvenţa de nucleotide din
polinucleotidul original va suferi modificări importante. În acest mod va apărea
o varietate de molecule cu informaţie diferită. În cazul ARN aceste molecule
diferite, pot explica proprietăţile fundamentale, forma şi comportamentul
acestuia. Molecula de ADN posedă două caracteristici speciale:
 conţine în secvenţa nucleotidelor informaţia pe care o poate
transmite în procesul de sinteză a proteinelor prin ARN mesager;
 molecula are o structură unică de înfăşurare care-i permite să
interacţioneze cu alte molecule și să răspundă la condiţiile de mediu
(ARN ribozomal şi ARN de transfer).
Cele două caracteristici, una informaţională şi alta funcţională reprezintă
două proprietăţi esenţiale pentru evoluţie. Secvenţa nucleotidică din ADN
reprezintă genotipul, adică informaţia transmisibilă a unui organism, în timp ce
forma structurală reprezintă fenotipul, adică expresia informaţiei genetice
asupra căreia operează selecţia naturală .
Dintre acizii nucleici ARN a apărut primul.
Cercetările de biologie moleculară au arătat că intronul, o secvenţă care
se găseşte în molecula de ARN premesager, dar care este eliminată din ARN
mesager matur, poate să se autoexcizeze din molecula precursor, fără
intervenţie enzimatică. Apare prima dovadă că ARN poate funcţiona ca o
enzimă şi că secvenţa intronică poate reprezenta enzima care ar cataliza
propria replicare.
În 1983 s-a descoperit a doua specie de ARN catalitic, ARN replicaza,
care poate fi considerată primul sistem viu sau molecula primordială a vieţii.
Aceasta se presupune că a apărut ca o condensare prebiotică aleatorie care a
9
condus la formarea de polimeri cu o creştere progresivă în lungime a catenelor.
La început, aceşti polimeri nu aveau nici o funcţie dar o moleculă dintre acestea
a putut să dobândească funcţia de ARN polimerază-replicază, capabilă de a
introduce erori din când în când. ARN replicaza ipotetică a evoluat spre
variante capabile de a asigura replicări mai rapide şi cu o precizie mai mare de
copiere a moleculelor parentale.
ARN este considerată molecula primordială a vieţii şi nu ADN,
deoarece:
 riboza (glucidul conţinut de ARN) se sintetizează mult mai uşor
decât dezoxiriboza (glucidul conţinut de ADN);
 structura ciclică a dezoxiribozei (din ADN) nu posedă gruparea
2´hidroxil. Grupările 2´ şi 3´ joacă rol structural în ARN şi sunt
implicate în formarea structurii terţiare a ARN de transport (forma
de treflă), prin legături de H; ADN neavând gruparea 2´hidroxil nu
se poate replica pentru a lua forme tridimensionale complexe,
impuse de activitatea catalitică;
- gruparea 2´hidroxil a ribozei joacă ea însăşi un rol catalitic direct.
Exemplu capacitatea de autoexcizie (matisare) a intronilor din ARN
mitocondrial;
- celulele cunoscute azi, toate au în genom ADN, dar precursorii
ADN sunt întotdeauna sintetizaţi prin reducerea precursorilor
difosfaţi nucleotidici ai ARN cu ajutorul unei enzime conservate de-
a lungul evoluţiei: ribonucleoziddifosfat reductaza.
S-a demonstrat astfel că molecula de ARN posedă cele două proprietăţi
indispensabile vieții: de replicare a informaţiei genetice şi de catalizator
enzimatic (ribozomii).
Este foarte greu de stabilit momentul în care molecula de ADN a preluat
funcţia exercitată de ARN. Ambele tipuri de molecule se găsesc în celulele
actuale, îndeplinind funcţii diferite, fiind în strânsă colaborare. Funcţiile
distincte se datoresc diferenţelor chimice mici (ADN conţine timină şi
dezoxiriboză, iar ARN conţine în loc de timină, uracil iar în locul dezoxiribozei,
riboza.
ADN ca depozit al informaţiei genetice, este mult mai stabil din punct
de vedere chimic (genetic) decât ARN. Stabilitatea moleculei de ADN este dată
de:
- structura dublu catenară, care permite moleculei să se repare rapid,
în cazul în care apare o modificare în secvenţa ei în timpul
replicării;
- dezoxiriboza nu are gruparea 2´ hidroxil, ceea ce o face mai
rezistentă la hidroliză comparativ cu riboza din ARN.
ADN conţine întreg setul de gene şi sisteme de control, care permit
transcripţia sub forma moleculelor de ARNm specifice proteinelor celulare şi
10
celorlalte tipuri de ARN (de transport şi ribozomal).

1.2 Caracteristicile procariotelor

Celula procariotă (pro - înainte, karyion – sâmbure sau nucleu). Din

categoria procariotelor fac parte toate bacteriile şi algele verzi-albastre. Celula
procariotă este învelită de un perete rigid, lipoproteic. Acesta conţine sacul
mureinic, inexistent la eucariote. Plasmalema este cel de al doilea înveliş al
celulei, de natură lipoproteică. Aceasta are rol în respiraţie, nu se poate invagina
pentru a forma vezicule, prin care să încorporeze soluţii nutritive de la exterior
sau particule solide prin pinocitoză şi fagocitoză. Membrana celulară formează
un singur compartiment citoplasmatic, fără o structură internă bine organizată.
Se remarcă lipsa nucleului şi a majoritaţii organitelor celulare. Singurele
organite prezente în citoplasma celulelor procariote sunt ribozomii (sau
,,granulele lui Palade"), al căror număr este de 10 ori mai mare decât la
eucariote. ADN-ul procariot este de obicei reprezentat printr-o singură
moleculă, circulară şi puternic spiralizată numită nucleoid (fig.1.1). Pe lânga
ADN, procariotele mai conţin ARN. Acesta se gaseşte liber în citoplasmă sau în
ribozomi. Mai conțin proteine de tipul histonelor. Neexistând compartimente
intracelulare transcripţia ADN şi transducţia ARNm (sinteză proteică) au loc
concomitent. Un singur tip de ARN polimerizează, transcrie cele trei tipuri de
ARNm, ARNr, ARNt.
Cercetările recente arată că în citoplasma procariotelor se gaseşte o
proteină contractilă, prin polimerizarea căreia rezultă o reţea contractilă, ca o
formă rudimentară de citoschelet întâlnită la eucariote.

Fig.1. 1. Celula procariotă. ADN circular, specific procariotelor.

(Prokaryotic+.png, microscopesblog.com).

11
 Bacteriile sunt de tip procariot şi conțin un singur cromozom, de formă
circulară, aflat de regulă în nucleoid. Mai conțin plasmide, formațiuni circulare
cu ADN dublucatenar. Acestea au rol de codare a proteinelor bacteriene, dar
sunt implicate și în rezistența bacteriană față de antibiotice (factorul R).
De obicei îmulțirea organismelor procariote este de tip asexuat. Aceasta
se realizează prin fisiune binară, prin care cromozomul este duplicat, se
ataşează de peretele celular, apoi are loc diviziunea celulei. Transferul
materialului genetic (ADN) are loc și prin alte procese de tipul transformării sau
a transducției (8, 19, 30).

1.3 Caracteristicile celulelor eucariote

Protozoarele, ciupercile, plantele și animalele sunt organisme eucariote,

încadrate în sistemele de clasificare în cinci regnuri: Monera, Fungi, Protista,
Plantae, Animalia. Dintre eucariote, organisme unicelulare sunt unele ciuperci
și protozoarele, iar pluricelulare sunt în totalitate animalele și plantele (30, 194).
Celulele eucariote au nucleu bine individualizat, cu o morfologie
caracteristică, înconjurat de o membrană proprie. Eucariotele au în citoplasmă
organite celulare (mitocondrii, lizozomi, peroxizomi, aparat Golgi, reticul
endoplasmatic) delimitate prin membrane de restul citoplasmei, care formează
matricea citoplasmatică sau citoscheletul (fig.1.2). Celula eucariotă are o
compartimentare structurală şi funcţională a citoplasmei. În citosol au un
citoschelet care determină forma şi mişcările celulei, din care fac parte curentul
citoplamatic şi mişcarea ameboidală (3, 35, 99 ).

Fig. 1.2. Compartimentarea celulei eucariote.

(eukaryotic.jpg, heathyomegardening.com)

12
 Nucleul este prezent în toate celulele eucariote şi îndeplineşte două
roluri principale: depozitarea informaţiei genetice în ADN-ul din cromozomi şi
reglarea sau controlul tuturor proceselor celulare, fiind ,,centrala cibernetică” a
celulei. Cercetările de biologie moleculară au demonstrat că 90-99% din
informaţia genetică existentă în genomul unei celule eucariote este represată,
deci este netranscriptibilă şi nu se exprimă fenotipic. Există gene funcţionale
comune aproape tuturor tipurilor celulare ale organismului respectiv care sunt
în mod selectiv activate sau represate în funcţie de tipul şi stadiul de
diferenţiere al celulei respective. Dacă toate genele din organism ar fi
transcrise, toate celulele constitutive ar produce acelaşi tip de proteine şi în
consecinţă ar fi identice. Realitatea nu este aceasta, pentru că deşi toate celulele
conţin întreg patrimoniul genetic, provenit de la oul fecundat, există un sistem
de control care decide şi menţine expresia anumitor gene şi represia altora, în
funcţie de necesităţile celulei respective (4, 19,36).
Factorii de control sunt proteinele reglatoare, codificate de gene
reglatoare, mai mult sau sau mai puţin active în funcţie de tipul celular, funcţiile
şi vârsta celulei. Proteinele reglatoare au capacitatea de a se lega de ADN, la
nivelul unor secvenţe (regiuni) care controlează activitatea unei anumite gene
structurale şi pot bloca, represa sau activa expresia acestei gene (transcripţia
ARNm necesar sintezei unei proteine specifice), în funcţie de cerinţele
fiziologice ale celulei (37, 102).

1.3.1 Structura nucleului

Nucleul, component fundamental prezent la toate celulele eucariote,

conţine aproape întreaga cantitate de ADN care formează genomul celular.
Ocupă aproximativ 10% din volumul total al celulei, dar acesta variază în
funcţie de ţesut, vârsta celulei, activitatea metabolică, gradul de diferenţiere,
patologia celulei (35).
În structura nucleului s-au pus în evidenţă patru componente distincte:
cromatina nucleară, nucleolul şi matrixul nucleolar care formează
nucleoplasma (sau carioplasma) şi membrana nucleară care închide acest
compartiment (29, 76).
Membrana nucleară
Nucleul este înconjurat de o membrană dublă trilaminată:
- membrana nucleară internă, prin proteinele specifice se leagă de
lamina nucleară. Este în contact cu ADN şi ARN-urile transcrise în
nucleu;
- membrana nucleară externă, care se continuă cu membrana
reticulului endoplasmatic (76, 102).
Între cele două membrane nucleare există un spaţiu perinuclear care are
diametrul de 20 - 40 nm. Proteinele sintetizate de ribozomii legaţi de membrana
13
nucleară externă, sunt transportate în spaţiul perinuclear, care se continuă cu
lumenul reticulului endoplasmatic (fig.1.3).

Fig.1.3. Structura nucleului (189).

Nucleul reprezintă centrul metabolic activ care realizează funcţii

primordiale pentru celulă: replicarea ADN, transcripţia informaţiei în ARN,
realizarea diviziunii celulare, repararea ADN (81). În desfăşurarea acestor
funcţii proteinele joacă un rol important. ARN-urile sintetizate şi procesate în
nucleu, sunt urmate de sinteza proteică desfăşurată în citoplasmă (fig. 1.4).
ARN-urile şi alte componente, precum proteinele din nucleu trebuie
exportate în citoplasmă, şi invers. Toate aceste componente traversează
membrana nucleară prin porii membranari, transportul fiind un proces selectiv,
nepermiţând decât anumitor proteine pătrunderea în nucleu (102, 129).
Porii membranei nucleare apar ca nişte canale de legătură între
conţinutul nucleoplasmatic şi cel citoplasmatic (fig. 1.5). Numărul porilor
variază cu specia şi tipul celular.
În centrul fiecărui complex al porului nuclear apare un „canal” prin care
moleculele solubile în apă pot circula din nucleu în citoplasma şi invers. Acest
canal conţine adesea şi un complex proteic granular, situat în zona centrală, care
apare ca o diafragmă în mijlocul canalului (149).

14
 Fig.1.4. Transcripţia şi transducţia la celula eucariotă (186).

Fig. 1.5. Porii membranei nucleare la ME.

(Nuc-por2b.JPG, course1.winona.edu)

Diametrul porului (tunelul cilindric) este de 9 nm şi lungimea de 15 nm.

S-a observat că moleculele mici (până la 1500 daltoni) difuzează rapid, iar cele
mari, mai greu. Porul nuclear conține 100 proteine diferite. Unele au rol de
receptori specifici pentru proteinele selectate şi un mecanism deosebit de
utilizare a energiei pentru trecerea lor în interiorul nucleului sau spre
citoplasmă. Astfel de proteine conţin o peptidă caracteristică, numită secvenţă

15
de localizare nucleară (NLS), care este esenţială pentru traversare. Transportul
nuclear este selectiv. Necesită un semnal nuclear de import care este prezent
numai în proteinele nucleare (enzime, histone, factori de transcripţie). Acest
semnal este reprezentat de o secvenţă scurtă de aminoacizi (4 - 8) care are
sarcina electrică pozitivă (conferită de obicei de lizină şi arginină) şi este
recunoscut de receptorii specifici din complexul por (35, 135, 170).
Moleculele mai mari decât diametrul porului (de exemplu, ARNm) sunt
complexate cu diferite proteine (nucleoproteine), şi interacţionează cu receptorii
specifici conţinuţi de proteinele globulare ale porului. Receptorii activează
tranzitul acestor particule în sau în afara nucleului, prin lărgirea canalelor
porilor (149).

1.3.2 Structura cromatinei

Asocierea obligatorie dintre ADN nuclear şi proteine se numeşte cromatină.

În diferite stadii ale ciclului celular cromatina prezintă diferite grade de condensare şi
se prezintă sub două tipuri morfo-funcţionale distincte: eucromatina şi
heterocromatina. Caracteristicile eucromatinei şi heterocromatinei sunt redate în
tabelul 1.1.

Tabel 1.1
Caracteristicile cromatinei
CARACTERISTICI EUCROMATINA HETEROCROMATINA
Condensare Fin dispersată Puternic condensată
(cromocentri)
Colorare Slabă Intensă
Replicare în faza S Precoce Tardivă
Activitate genetică Activă Inactivă
Compoziţie chimică Predomină perechi Predomină perechi de baze
de baze C-G; ADN A-T; ADN repetitiv;
nerepetitiv; proteine proteine histonice
nehistonice

Eucromatina are mai mult ADN nerepetitiv, în care predomină

perechile de baze G-C, şi proteine nehistonice; este puţin condensată şi
reprezintă partea activă genetic (transcripţională) a cromatinei. Se replică
precoce, la începutul fazei S. Alcătuieşte benzile R pozitive din cromozomii cu
marcaj în benzi (36, 112).
Heterocromatina are mai mult ADN repetitiv (în care predomină
perechile de baze A-T) şi histone, este foarte compactată (condensată sub formă
de cromocentri), inactivă genetic, cu replicare tardivă. Deşi inactivă genetic
(transcripţional), heterocromatina îndeplineşte cu siguranţă anumite funcţii
16
celulare. Se presupune că ea stabilizează centromerul şi telomerele
cromozomului, intervine în desfăşurarea meiozei (în sinapsa cromozomilor
omologi) şi, probabil, în diferenţierea celulară. Heterocromatina este de două
feluri: constitutivă şi facultativă (202).
Heterocromatină constitutivă se găseşte constant sub formă condensată.
Ea nu conţine gene funcţionale şi este formată din ADN înalt repetitiv (ADN
satelit). În structura cromozomului, heterocromatina constitutivă se află în
regiunea centromerului, pe braţul lung al cromozomului Y, pe braţele scurte ale
acrocentricilor şi în constricţiile secundare. Ea poate fi evidenţiată în
cromozomii metafazici, printr-un tratament specific, sub forma unor benzi
numite benzi C (35, 36).
Heterocromatina facultativă diferă la celule şi chiar la organisme
diferite. În unele celule anumite gene sau părţi din cromozomi pot fi active, în
altele aceleaşi structuri pot să nu funcţioneze, fiind prezente sub formă de
heterocromatină. Astfel, heterocromatina ar interveni în reglajul genic.
Exemplul cel mai tipic îl constituie cromatina sexuală: unul dintre cei doi
cromozomi X la organismele de sex feminin este inactivat, formând cromatina
X. Procesul se produce la întâmplare şi independent în fiecare celulă (35, 36,
37)
1.3.2. Structura nucleolului

Nucleolul (fig. 1.6) este situat în nucleu la celulele aflate în interfază, la

celulele embrionare care nu au început sinteza proteinelor proprii.

Fig.1.6 . Nucleolul la MO (a) şi la ME (b).

(10976.jpg; confluence.crbs.ucsd.edu)

La microscopul electronic, nucleolul este format din:

- centru fibrilar, de ADN netranscriptibil;
- o regiune fibrilară densă, de ARN în curs de sinteză;
- o componentă granulară care conţine particulele de preribozomi (4,
17
 35).
În 1960 s-a descoperit că nucleolul joacă rol în sinteza ARN ribozomal
(ARNr) şi în asamblarea componentelor ribozomale. Sinteza ARNr în nucleol a
fost pusă în evidenţă prin folosirea uridinei marcate (3H uridină). Astfel a fost
relevată sinteza unui singur tip de transcript primar, reprezentat de molecule
precursoare de ARNr 45S. Din ARNr 45S, prin clivarea parţială rezultă cele 3
tipuri de ARN ribozomal: ARNr 18S (încorporat în subunitatea mică a
ribozomilor), ARNr 5,8S şi ARN 28S (încorporate în subunitatea mare a
ribozomilor). Aceste molecule de ARN, înainte de a fi exportate în citoplasmă,
formează complexe ribonucleoproteice cu diverse tipuri de proteine. Proteinele
necesare sunt sintetizate în citoplasmă şi importate de nucleu. Complexele
obţinute stau la baza formării ribozomilor (129, 164).
Transcripţia ADN, deci sinteza ARNr, are loc numai în interfază. Pe
măsură ce se apropie faza mitotică, cromozomii se condensează, nucleolul se
micşorează iar în metafază el dispare complet. În telofază sinteza ARNr este
reluată şi mininucleolii se reformează în apropierea genelor ARNr localizate în
regiuni bine delimitate a 10 cromozomi (197).
La sfârşitul mitozei mininucleolii fuzionează rapid şi formează un
nucleol mare, care obişnuit se observă în interfază. În mod normal nucleolul
ocupă 30% din volumul nucleului. În celulele tumorale nucleolii apar
hipertrofiaţi având o formă neregulată. Gradul lor de hipertrofie este
proporţional cu gradul de malignitate (30).

Matricea nucleară
Este structurată dintr-o reţea de filamente insolubile, care ar fi
echivalentă citoscheletului citoplasmei. Se consideră că fiecare tip celular ar
avea un set distinct de proteine, pe acestea fiind structurate loops-urile din
structura cromozomilor. Acestea ajută la organizarea cromozomilor, reglarea
replicării şi a transcripţiei ADN (136).
S-a observat de asemenea, că şi ARNm şi de transport este conţinut în
cadrul unor compartimente specifice din nucleu. S-a pus în evidenţă că sinteza
acestor molecule de ARN are loc în zone numite „domenii de transcripţie”. În
aceste domenii are loc şi îndepărtarea intronilor din transcriptul primar, înainte
ca ARNm să fie exportat în citoplasmă (129).

18
 ACIDUL DEZOXIRIBONUCLEIC

2.1.Structura acidului dezoxiribonucleic

Moleculele biologice care conţin informaţia genetică sunt acizii

nucleici. Aceştia sunt polinucleotide (produşi de policondensare a unor unităţi
denumite nucleotide). Acest lucru este esenţial deoarece secvenţa (ordinea)
nucleotidelor în lungul catenei de ADN reprezintă informaţia genetică
codificată, pe baza căreia se stabileşte ordinea aminoacizilor în proteine.
Sensul de "citire" a informaţiei genetice este determinat de polaritatea 5'  3'
a catenei de ADN. Ea este dată de faptul că poziţiile 5'-fosfat a primului
nucleotid şi 3'-hidroxil a ultimului nucleotid al catenei sunt libere, neangajate
într-o legătură chimică. Orice secvenţă de nucleotide se "citeşte" în direcţia 5'
 3' şi se scrie cu capătul 5' la stânga, de ex. 5'-ATGCCTAGATCA-3'. Fiecare
catenă a ADN este deci o secvenţă orientată, definită prin înlănţuirea
nucleotidelor (4, 8, 201).
Există două tipuri de acizi nucleici: acidul dezoxiribonucleic (ADN) şi
acidul ribonucleic (ARN).
Sediul principal al localizării ADN-ului este nucleul celulelor.
Localizări secundare sunt: mitocondriile şi cloroplastele (în celula vegetală).
Diferitele tipuri de ARN sunt localizate în nucleu, citoplasmă,
mitocondrii, ribozomi.
Nucleotidele reprezintă unitatea monomerică a acizilor nucleici şi sunt
compuse din:
 radical fosfat;
 pentoză:
• dezoxiriboza (în ADN);
• riboza (în ARN).
 bază azotată heterociclică:
• purine: adenină (A) şi guanină (G);
• pirimidine: citozină (C) şi timină (T) pentru ADN;
citozină (C) şi uracil (U) pentru ARN.

Fosfaţii
Fosfatul anorganic este un complex stabil, format pornind de la acidul
fosforic H3PO4 (notat Pi). Esterii fosfat se pot forma prin reacția dintre un
fosfat şi o grupare hidroxil liberă a unui alcool, enol sau fenol.
Condensarea unui fosfat şi a unui acid de exemplu, sau a unui fosfat cu
un alt fosfat dă o anhidridă. Pirofosfatul este o anhidridă a acidului fosforic
(Fig.2.1).

19
 Fig. 2.1. Fosfaţii.

Ozele: riboza şi dezoxiriboza

Glucidul specific ARN-ului este riboza iar al ADN-ului este
dezoxiriboza.
Riboza este o pentoză din seria D în care toţi hidroxilii sunt orientaţi la
dreapta.
Dezoxiriboza derivă din riboză printr-o reducerea funcţiei alcool a
C2´-hidroxil. Gruparea 2´-hidroxil prezentă în ARN îl face susceptibil la
hidroliză alcalină, în timp ce ADN este rezistent. În schimb, atât ADN cât şi
ARN sunt hidrolizaţi în mediu acid. Atomii de carbon ai pentozelor sunt
numerotaţi de la 1’ la 5’ (fig.2.2).

Fig. 2.2. Riboza şi dezoxiriboza.

Bazele azotate
Bazele azotate sunt împărţite în două grupe: purinice - adenină, guanină
şi pirimidinice - citozină, uracil, timină.
Principala diferenţă între ele acizii nucleici este că ADN conţine timină
20
(T) în timp ce ARN conţine uracil (U). În ARNt, este prezentă şi inozina (I).
Inozina este nucleozidul hipoxantinei, derivată din adenina dezaminată. ARNt
conţine, de asemenea, alte nucleozide neuzuale precum: pseudouridina,
ribotimidina şi dihidrouridina.
Bazele azotate ale acizilor nucleici aparţin celor două molecule în
funcţie de nucleul aromatic de bază care constituie scheletul. Nucleul
pirimidinic este format din 6 atomi din care 4 de C şi 2 de N (fig.2.3). Cei doi
atomi de N se află în poziţia meta (numărul 1 şi 3).
O bază purinică este constituită din doi nuclei heterociclici alipiţi, unul
de 6 atomi şi altul de 5 atomi, având 2 atomi de C în comun (situaţi la mijloc).
În raport cu carbonii comuni, atomii de N ocupă poziţii simetrice 1 şi 3 la
stânga, 7 şi 9 la dreapta (fig.2.3).

Fig.2.3. Nucleu purinic şi pirimidinic.

Diferite baze întâlnite în compoziţia acizilor nucleici se deosebesc prin

substituienţii purtaţi de aceştia.

Bazele purinice
Adenina este constiuită dintr-un nucleu purinic în care atomul de C6
este substituit cu gruparea amină. Ea este singura bază azotată nucleotidică a
cărei formulă nu conţine atomi de oxigen (fig.2.4).
Guanina este constituită dintr-un nucleu purinic la care atomul carbon 2
este substituit cu o grupare amină şi carbonul 6 printr-o legătură cetonică (3,
34, 61).

Fig. 2.4. Baze purinice.

21
 Atomii heterociclului purinic sunt numerotaţi de la 1 la 9, astfel încât
atomii de N din ciclu să primească indicele minim.

Bazele pirimidinice
Sunt reprezentate de citozină, uracil şi timină.
Citozina este formată dintr-un nucleu pirimidinic în care C4 este
substituit de gruparea amină şi C2 cetonă.
Uracilul este constituit din nucleu pirimidinic în care carbonii 2, 4
poartă gruparea cetonă (fig. 2.5).

Fig.2.5. Baze pirimidinice.

Timina este constiuită din nucleu pirimidinic în care C2 şi C4 posedă

gruparea cetonă, iar C5 are legat un metil şi se mai numeşte metil-uracil (4,
62).
Bazele azotate prezintă fenomenul de tautomerie, o formă de izomerie
care se caracterizează prin uşurinţa cu care izomerii trec unul în celălalt,
datorită deplasării unei duble legături şi a unui atom de hidrogen.

Fig.2.6 Fenomenul de tautomerie.

22
  Formele mai stabile:
• Forma lactam este mai stabilă decât forma lactim;
• Forma amino este mai stabilă decât forma imino;
 În acizii nucleici există formele lactam şi amino (61, 96, 97).

Nucleozide şi nucleotide
Glucidele, riboza sau dezoxiriboza se leagă de bazele azotate prin
legături care implică unii din atomii de N ai bazei (N1 la bazele pirimidinice sau
N9 la purinice). Legătura dintre o bază azotată şi un zahar (oză) dă un
nucleozid; acestea sunt legături N-ozidice. Într-o nucleozidă atomii bazei se
numerotează prin cifre 1 ...n, iar pentru a se distinge carbonii ozei sunt
numerotaţi 1 - 2 (96, 97, 102, 197).
Legătura unei ozide cu un fosfat se face prin esterificare la funcţia
alcool primară (C5) a ozei cu una din cele 3 grupări acide ale fosfatului. Esterul
obţinut este o nucleotidă formată dintr-o bază azotată legată printr-o legătură
N-ozidică cu o oză, aceasta fiind la rândul ei legată esteric de un fosfat (fig.
2.7).

Fig. 2.7. 2' dezoxitimidina

Denumirea nucleotidelor
Bazele azotate sunt notate convenţional printr-o iniţială şi o culoare.
Adenina cu A şi verde; guanina (G) cu galben. Fiecare bază poate intra în
structura a două nucleozide în funcţie de oză, riboză sau dezoxiriboză. Fiecare
nucleozidă poate fi legată de una, două sau trei grupări fosfat (3, 19).
Nomenclaura ribonucleotidelor şi a dezoxiribonucleotidelor este redată
în tabelul 2.1.

23
 Tabel 2.1
Nomenclatura ribonucleotidelor şi a dezoxiribonucleotidelor
RIBONUCLEOTIDE DEZOXIRIBONUCLEOTIDE
Adenozin monofosfat Dezoxiadenozin monofosfat
(AMP) sau adenilat (dAMP) sau dezoxiadenilat
Adenozin difosfat Dezoxiadenozin difosfat
(ADP) (dADP)
Adenozin trifosfat Dezoxiadenozin trifosfat
(ATP) (dATP)

Denumirea nucleotidelor este dată de nucleozidă şi numărul radicalilor

fosfat; exemplu adenozin monofosfat sau AMP, difosfat ADP sau trifosfat ATP,
ultimele două fiind mai bogate în energie.
Adenozina
Este o nucleozidă formată dintr-o pentoză, riboza, legată printr-o
legătură N ozidică la o bază azotată adenina (fig 2.8). Alte ribonucleozide sunt
guanozina, citidina şi uridina. Nomenclatura nucleozidelor este redată în tabelul
2.2.

Fig. 2.8. Adenozina.

24
 Tabel 2.2
Nomenclatura nucleotidelor
BAZA NUCLEOZIDUL NUCLEOTIDUL
Adenina (A) Dezoxiadenozina (A) Dezoxiadenozin monofosfat (dAMP)
Dezoxiadenozin difosfat (dADP)
Dezoxiadenozin trifosfat (dATP)
Guanina (G) Dezoxiguanozina (G) Dezoxiguanozin monofosfat (dGMP)
Dezoxiguanozin difosfat (dGDP)
Dezoxiguanozin trifosfat (dGTP)
Citozina (C) Dezoxicitidina (C) Dezoxicitidin monofosfat (dCMP)
Dezoxicitidin difosfat (dCDP)
Dezoxicitidin trifosfat (dCTP)
Uracil (U) Dezoxiuridina (U) Dezoxiuridin monofosfat (dUMP)
Dezoxiuridin difosfat (dUDP)
Dezoxiuridin trifosfat (dUTP)
Timina (T) Dezoxitimidina (T) Dezoxitimidin monofosfat (dTMP)
Dezoxitimidin difosfat (dTDP)
Dezoxitimidin trifosfat (dTTP)

Dezoxiguanozina este o moleculă formată din pentoză-dezoxiriboză

legată de o bază azotată-guanina (fig.2.9).
Alte dezoxiribonucleozide sunt dezoxiguanozina, dezoxitimina.
Uridinmonofosfat sau acidul uridinic, UMP, este o moleculă rezultată
prin legătură esterică a fosfatului cu riboza şi N ozidică cu uracilul (fig. 2.10).

Fig. 2.9. Deoxiguanozina. Fig. 2.10. Uridina monofosfat sau

uridilat.

Dezoxitimidinmonofosfat sau acidul timidilic este o nucleotidă formată

din timina legată de dezoxiriboză. Se neglijează adesea precizarea denumirii de
dezoxitimidin monofosfat dTMP. Dezoxiriboza se leagă numai de timină şi
riboza de uracil (fig. 2.11).

25
 Adenozin Tri Fosfat –ATP. Un nucleotid în care trei grupări fosfat
sunt ataşate la un nucleozid la poziţia C5 a glucidului se numeşte nucleozid
trifosfat (fig.2.12). Asfel se denumeşte adenozin trifosfatul- ATP (P-P-P- C5-
riboză-adenină). ATP este molecula macroergică principală, care prin hidroliza
succesivă a grupărilor fosfat furnizează energie pentru procesele biochimice.

Fig. 2.11. Dezoxitimidina Mono Fig 2.12. Adenozin Tri Fosfat –ATP.
Fosfat.

Nucleotide naturale libere: AMPc

3’,5’adenozin monofosfatul ciclic (AMPc) este mesager secund implicat
în transmiterea mesajului hormonal din mediul extracelular în interiorul celulei
(fig.2.13).

Fig. 2.13. 3’,5’adenozin monofosfatul ciclic (AMPc)

2.1.1 Structura primară a ADN

Structura primară a ADN este reprezentată de lanțuri liniare de

nucleotide sau ADN monocatenar.
Legătura dintre două nucleotide se realizează cu ajutorul grupului fosfat,
care uneşte moleculele de pentoză a două nucleotide alăturate în poziţiile C5’-

26
C3’ sau C3’-C5’ (fig.2.14).

Fig. 2.14 Structura primară a ADN-ului

(http://ro.wikipedia.org/wiki/Nucleotid%C4%83).

Astfel dacă radicalul fosfat este legat de propria pentoză în poziţia C5’,
se leagă de atomul C3’ al nucleotidului vecin, iar dacă este legat la atomul C3’
al pentozei proprii, se leagă la atomul C5’ al pentozei alăturate, cu eliminarea
unei molecule de apă (4, 34, 62). Se obţin astfel catene macromoleculare.

2.1.2.Structura secundară a ADN

Structura secundară a ADN a fost stabilită în anul 1953 de către Watson,

Crick şi Wilkins şi corespunde tipului B de ADN, prezent în regiunile de
eucromatină, cu gene active metabolic. Cele două catene ale ADN se înfăşoară
(se împletesc) plectonemic (una în jurul alteia, ca "o frânghie", şi amândouă în
jurul unui ax central (imaginar) al moleculei, formând o dublă spirală
elicoidală coaxială (o elice dublă), orientată spre dreapta (dextrogir) având
forma unei scări în spirală.
Cele două balustrade ale scării sunt reprezentate printr-un schelet
glucido-fosforic, treptele scării fiind perpendiculare pe schelet, reprezentate
prin bazele azotate între care se stabilesc punţi de hidrogen de tipul A=T,
respectiv G≡C.
Prin aşezarea în interior a bazelor azotate, acestea sunt protejate de
acţiunea diferiţilor factori de mediu, asigurându-se stabilitatea moleculei şi
27
implicit a informaţiei genetice, conferită de ordinea nucleotidelor din catene
(fig. 2.15).
Datorită faptului că pot exista numai patru tipuri de legături de hidrogen,
A=T, G≡C, respectiv T=A, C≡G, se asigură reproducerea cu mare fidelitate a
informaţiei genetice în urma procesului de replicare (3, 19, 34, 36).

Fig. 2.15. Structura secundară a ADN-ului. Complementaritatea purină-

pirimidină sau pirimidină-purină

Structura ADN este, în ansamblul ei, perfect regulată, ordonată:

diametrul moleculei 2 nm; o tură completă are 3600; pasul elicei 3,4 nm permite
dispunerea a 10 perechi de baze. În configuraţia ei spaţială, molecula de ADN
prezintă două şanţuri laterale: unul mai mic şi altul mai mare. Ele sunt
importante în recunoaşterea stereochimică şi fixarea pe ADN a histonelor (la
nivelul şanţului mic) sau a unor molecule proteice reglatoare (la nivelul
şanţului mare), singurul loc în care bazele sunt accesibile acestor proteine care
vor influenţa (regla) realizarea funcţiilor ADN (29, 30).
În condiţii fiziologice, molecula de ADN are o mare stabilitate
metabolică, datorită legăturilor fizico-chimice dintre elementele unei catene
(legături fosfodiesterice intracatenare) precum şi dintre cele două catene
(legăturile de H). Ele sunt strâns legate una de alta şi de obicei nu se pot separa.
Această stabilitate este o condiţie obligatorie pe care trebuie să o îndeplinească
substratul material al eredităţii. Totuşi, sub acţiunea unor enzime cele două
catene ale ADN se pot desface parţial, pe segmente limitate, şi funcţionează ca
"matriţă" pentru sinteza unor molecule noi, complementare (ARNm în procesul
de transcripţie, sau o altă catenă ADN, în cursul replicării) (34, 61, 62).

Legăturile de hidrogen
28
 O legătură de hidrogen este o legătură săracă în energie între doi atomi
care se atrag electrostatic primul fiind bogat în electroni- nucleofil şi celălalt
bogat în protoni deci electrofil (atrage electroni).
Astfel, atomul de H cu electron unic necesită pentru completarea
orbitalului un alt electron deci nu poate fi decât electrofil fiind atras de atomi
care au dublete electronice libere (fig. 2.16).

Fig. 2.16. Legături de H.

Atomii de N şi O au 2 şi respectiv 4e- pe stratul periferic care nu

participă la orbitalii legăturilor covalente ai moleculei, (O2 are 2e-
neparticipanţi) şi N are 4 e-. Aceasta le conferă caracter nucleofil care le
permite atracţia atomilor electrofili, în special a atomilor de H această atracţie
constituie o legătură de H (102).

Hibridarea bazelor azotate

Hibridarea AT
Un acid nucleic prezent în soluţie moleculară formează legături de H
asociind nucleotidele două câte două, astfel că o nucleotidă cu A să se lege cu T
sau cu U în ARN şi o nucleotidă G cu C (fig.2.17). Această legătură se numeşte
hibridare.
Legătura AT este mai puţin stabilă decât GC, deoarece între adenină şi
timină se formează două legături de H iar între citozină şi gunină 3 (fig. 2.18)
.

29
Fig. 2.17 Hibridarea Adenina- Timina. Fig. 2.18. Hibridarea Guanină-
Citozină.

2.1.3 Tipuri de ADN

Structura secundară a ADN-ului poate fi de tipul B (structura descrisă de

Watson și Crick, cu un pas de zece nucleotide), de tipul A (cu un pas de
unsprezece nucleotide) sau de tipul Z (sau ADN senestra), a cărui elice este
înfășurata spre stânga, cu un pas de douăsprezece nucleotide.
La ADN se cunosc două conformaţii dublu helicoidale orientate spre
dreapta: ADN-A şi ADN-B.
ADN-B este caracterizat printr-o repetiţie regulată a şanţurilor sau
ferestrelor de tip mici şi mari (36, 61) (fig. 2.19).

Fig. 2.19 Tipuri de ADN

(labspaces.net).

În 1979, Rich şi Dickerson descoperă un tip particular de ADN-Z sau

ADN-senestra. El are o moleculă dublu elicală, orientată spre stânga, care îşi
pierde simetria caracteristică formei B, deoarece axul fosfo-glucidic ia o formă
neregulată în zig-zag, producând deformarea şi alungirea moleculei de ADN
(fig. 2.19). Conformaţia ADN-Z este normală, există "in vivo" şi apare, în
anumite condiţii fizico-chimice, în regiunile bogate în perechi de baze G-C, prin

30
tranziţia/conversia formei B (sub acţiunea unei topoizomeraze, prin rotirea
bazelor cu 180). Tranziţia B  Z este reversibilă (4, 30).
Caracteristicile moleculare ale diferitelor tipuri de ADN sunt redate în
tabelul 2.3.

Tabel 2.3
Caracteristicile moleculare ale diferitelor tipuri de ADN
TIPUL PERECHI DE ROTATIA PE CRESTEREA DIAMETRUL
DE ADN BAZE/ PAS PERECHI BAZE VERTICALA PE MOLECULEI
ELICE PERECHI BAZE (Å) (Å)
A 11 + 34,7 2,56 23
B 10 + 34,0 3,38 19
Z 12 - 30,0 5,71 18

ADN-Z intervine foarte probabil în inactivarea unor gene şi, deci, în

controlul expresiei informaţiei genetice. Conversia locală B  Z (mai ales în
situsurile de reglare a transcripţiei) poate fi realizată prin fixarea mai intensă a
histonelor sau a altor molecule ce produc represia genelor sau prin metilarea
citozinei din situsurile GC. Astfel, un "viraj la stânga" la începutul unei gene
determină stoparea activităţii ei (4, 25, 76).
Tranziţia B  Z ar determina însă şi evidenţierea unor situsuri din ADN
în care se fixează mai facil agenţi mutageni sau cancerigeni. Pentru aceasta
pledează faptul că mutaţiile apar mai frecvent la nivelul secvenţelor G-C care
iau conformaţia Z (76).
Un aspect important de subliniat este faptul că tranziţia ADN BZ ca şi
modificările conformaţionale A  B  C care apar în anumite regiuni ale
ADN (cu o secvenţă specială a nucleotidelor), demonstrează elocvent faptul că
molecula de ADN nu are o structură fixă, rigidă. În funcţie de condiţiile de
mediu, moleculele ADN sînt flexibile, într-o permanentă stare dinamică,
deformându-se neîncetat (3, 4, 34, 36).
Complementaritatea purină-pirimidină sau pirimidină-purină
conferă structurii helicoidale bicatenare a ADN o formă filiformă regulată cu un
diametru constant de-a lungul întregului traiect. Nucleotidelele sunt hibridate
două câte două pe bază de complementaritate pe toată lungimea, prin legături
de H, AT, GC. Pentru ca toate nucleotidele să se poată hibrida trebuie ca ordinea
în care se leagă să fie complementară catenei opuse. Se formează o secvenţă
complementară secvenţei originale (8, 149).
De exemplu
5'-ATGCCAG-3'
3'-TACGGTC-5'.
O împerechere purină-purină sau pirimidină-pirimidină ar face ca dublul
helix ADN să prezinte de-a lungul său neuniformităţi, regiuni cu diametru mai
31
mare (purina-purină) sau mai mic (pirimidină-pirimidină). Ar apărea astfel
distorsiuni neregulate, care ar împiedica funcţionarea normală, ceea ce nu se
întâmplă în condiţii normale (186).
Legea complementarităţii bazelor stă la baza mecanismelor prin care
se realizează funcţiile genetice ale ADN: transcripţia, replicarea, repararea
leziunilor, recombinarea (4, 22, 76).

Condensarea şi hidroliza nucleotidelor

Creşterea lanţului de acizi nucleici se face totdeauna prin extremitatea
3OH terminală a acidului nucleic. Condensarea se face pornind de la un
substrat activat – o nucleotidă trifosfat. Hidroliza ultimilor doi fosfaţi va furniza
energia necesară condensării. Nucleotida monofosfat rămasă va fi esterificată
printr-o funcţie acidă a fosfatului cu funcţia alcool eliberată de la carbonul 3 al
ribozei.Va fi eliberată o moleculă de apă (34, 96, 102).
Invers adăugarea unei molecule de apă pe această legătură ester va
produce o reacţie de hidroliză care va detaşa ultima nucloetidă şi va elibera C3
a nucleotidei precendente (fig. 2.20).

Fig. 2.20 Condensarea şi hidroliza nucleotidelor.

2.2 Cromatina

Nucleul interfazic este delimitat la exterior de o membrană dublă, cu

pori (prin care se realizează schimburile nucleo-citoplasmatice). În interiorul
nucleului se află: un nucleoschelet sau matrice nucleară (formată din ARN şi
proteine, în special actină), cromatină, nucleoplasmă şi nucleoli (35).
În nucleu, fiecare moleculă de ADN se asociază cu proteine histonice, si
32
nehistonice, formând un complex nucleo-proteic numit cromatină.
Interacţiunile dintre ADN şi proteine are un rol structural fundamental în
organizarea supramoleculară a ADN, precum şi un rol funcţional în
mecanismele complexe care reglează expresia şi replicarea genelor (22, 36).
Relaţiile complexe dintre ADN şi proteine nu sunt încă complet elucidate.

Organizarea cromatinei
Se cunosc 4 nivele de organizare a cromatinei:
În prima etapă fibrele subţiri de cromatină sau nucleofilamente (fibre
primare de 10 nm) sunt formate din nucleozomi şi porţiunile internucleozomale
sau ADN linker (fig.2.21);
Nucleozomul este alcătuit dintr-un complex de ADN şi histone. O
secvenţă de ADN (de 146 p.b.) se înfăşoară (1 tur şi 3/4) în jurul unui "miez"
histonic, cilindric, format din 8 molecule de histone (câte 2 molecule din H2A,
H2B, H3 şi H4). Nucleozomii sunt legaţi între ei printr-un segment de ADN
linker (60 p.b.), formând filamentul cu nucleozomi, asemănător unui "şirag de
perle". Această structură, menţinută strâns prin histona H1, ce leagă doi
nucleozomi vecini, realizează o rată de "împachetare" a ADN nativ (dublu helix
de 2nm) de circa 10:1 (4, 74).

Fig 2.21. Nucleozomul (http://mutagenetix.utsouthwestern.edu/

phenotypic/pfile.cfm/657/ nucleosome1.png)

Mecanismul prin care se formează nucleozomii este încă puţin cunoscut.

Nucleozomii sunt structuri dinamice, deoarece funcţiile ADN (transcripţia,
replicarea, recombinarea) necesită separarea celor două catene ale ADN şi
implicit modificarea structurii nucleozomului. Asamblarea nucleozomilor este
mediată de o proteină anionică nucleoplasmina. Rata de împachetare este de
10:1. Porţiunile internucleozomale intervin în controlul expresiei genice: factori
reglatori difuzibili şi conformaţia Z (36, 61).

33
 A doua etapă de condensare a ADN
Formarea fibrelor groase de cromatină de 30nm, cromonemă.
Spiralizarea în solenoide cu 6 nucleozomi/spiră este stabilizată de histona H1
(fig.2.22). Rata de compactare este de 5:1. Aceste fibre reprezintă unitatea de
organizare a cromatinei în interfază. Favorizează interacţiunile genice (35, 62).

Fig. 2.22. Fibre de 30nm, al 2-lea nivel de condensare al cromatinei

(U1CP1-5_ProkvsEukCell_ksm.jpg nature.com nature.com).
Fibra de cromatină are însă şi un rol important pentru funcţionarea
genomului, deoarece prin spiralizare apropie mult diferite regiuni ale ADN care,
liniar, se află la distanţe mari unele de altele. În felul acesta, favorizează
interacţiunile genice necesare pentru expresia adecvată a informaţiei ereditare.
Mai mult, solenoidul nu are o structură omogenă; zonele spiralizate alternează
neregulat cu zone nespiralizate, unde se pot fixa o serie de proteine specifice,
care produc o configuraţie cromatiniană ce permite accesul ARN polimerazei şi
deci transcripţia (96, 97).
Al treilea nivel de condensare a cromatinei rezultă prin plierea fibrei
de cromatină de 30 nm în bucle laterale, numite şi domenii, de lungimi diferite
(20-100 kb); se formează fibra pliată în bucle laterale cu un diametru de 300
nm (grad de compactare 10:1). Buclele sunt ataşate, prin anumite situsuri de
ancorare din structura fibrei de ADN (topoizomeraza II), la un "schelet" sau
matrice proteică (nonhistonică), care are o formă identică cu cea a
cromozomului metafazic (fig.2.23). Se consideră că fiecare buclă sau domeniu
(ce conţine câteva gene) ar putea fi o unitate funcţională de transcripţie şi
replicare. Buclele au deci atât o semnificaţie structurală cât şi un rol funcţional
important (22, 96, 97).
Fibra pliată în bucle laterale formează la începutul profazei, printr-o
34
puternică spiralizare şi condensare (grad compactare 20), cromatida unui
cromozom (figura 2.14). Ea atinge în metafază o grosime de 700 nm, fiind cel
mai înalt grad de compactare a fibrei de bază a cromatinei (30 nm). Fiecare
cromatidă a unui cromozom conţine deci o singură moleculă de ADN,
organizată în mai multe structuri succesive şi ierarhizate de "împachetare". La
sfârşitul diviziunii, în telofază, se produce despiralizarea/decondensarea
cromozomilor (35, 36, 76).

Fig. 2.23 Fibra pliată în bucle laterale

(mun.ca).

Cromozomii. Compactarea suplimentară (20X) dă naştere cromatidei

unui cromozom. Începe în profază, iar în metafază atinge cel mai înalt grad.
Grosimea este iniţial de 700 nm iar cromozomul metafazic are 1400nm. Cel mai
mic cromozom are 4,6x107pb, în interfază are 1,4cm, iar în metafază are 2μm.
Compactarea de 10 000X a moleculei de ADN este necesară în diviziunea
materialului genetic ocupând spaţiul mic, de câţiva micrometri, al nucleului (30,
96, 97) (fig. 2.24).

35
 Fig. 2.24 Treptele de compactare ale cromatinei: nucleozom, solenoid, fibre
pliate lateral, cromatidă, cromozom
(http://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/fig6_10.jpg).
Acest fenomen favorizează distribuţia corectă a materialului genetic în
diviziune şi asigură funcţionarea ADN.
Buclele fibrei de 300 nm se fixează neregulat de scheletul proteic. Din
loc în loc (în regiuni de ADN în care predomină secvenţe cu perechi de baze A-
T ele formează mici aglomerări de bucle, numite cromomere, separate prin
zone mai laxe. Pe măsură ce cromozomul profazic se condesează cromomerele
mici, vecine, se unesc într-o structură mai mare. Aceste cromomere mari se
adună în grămezi şi formează benzi intens condensate şi colorate (benzi G). Ele
vor fi separate prin benzi mai puţin condensate şi mai clare (benzi R) (29, 36,
62 ).
ADN care formează benzile G conţine mai multe puncte de ataşare,
strâns apropiate, iar buclele sunt mai dense, mai compactate. Coloranţii care au
afinitate pentru regiunile SAR bogate în A-T (Giemsa, Quinacrină) vor da benzi
G (sau Q). În benzile R densitatea punctelor de ataşare este mai mică, buclele
sunt mai laxe.
Benzile cromozomice reflectă structura internă heterogenă a
cromozomului şi definesc regiuni din genom care au proprietăţi şi funcţii
diferite ( 34, 36, 62).

36
 2.3 Proprietăţile fizice ale ADN

Denaturarea ADN poate fi termică şi chimică.

Denaturarea termică. Peste anumite limite de temperatură (63-100ºC)
stabilitatea legăturilor de H cedează, astfel se desface dublul helix în cele 2
catene polinucleotidice complementare, fenomen numit denaturare termică;
ADN trece de la condiţia de dublu catenar la cea monocatenară, însoţită de
reducerea vâscozităţii soluţiei.
Denaturarea este de obicei efectuată experimental prin încălzire.
Temperatura la care 50% dintre catene sunt separate se numeşte temperatură
de topire (Tm).
Aspectul curbei de denaturare a ADN ne permite să concluzionăm
conţinutul în perechi de baze azotate având în vedere că perechile A-T cu 2
punţi de H denaturează mai uşor decât perechile G-C între care sunt 3 legături
de H. Timpul de topire creşte odată cu creşterea conţinutului G-C, fapt
evidenţiat pe ADN al diferitelor specii de bacterii, al căror conţinut G-C variază
între 20-80% (96, 97, 102).
Denaturarea chimică. Pentru denaturare se pot utiliza şi baze. La pH
mare încărcătura multor gene angajate în formarea legăturilor de H se schimbă.
Astfel nucleotidele pierd capacitatea de a forma legături de hidrogen. La pH
mai mare de 11,3-12 toate legăturile de hidrogen sunt rupte şi ADN este
complet denaturat.
În tehnicile de bandare cromozomială se utilizează denaturarea cu
soluții alcaline, ADN fiind destul de rezistent la hidroliza alcalină.
Dacă amestecul se răceşte brusc, monocatenele rămân permanent
separate şi ADN se numeşte denaturat. Când o soluţie de ADN este supusă unor
temperaturi mai mari de 100ºC are loc ruperea legăturilor fosfodiesterice, cu
destrămarea coloanei glucido-fosforice. Denaturarea ADN este însoţită de
efectul hipercromatic, adică de creşterea intensităţii absorbţiei razelor UV de
către bazele azotate expuse la exterior. Bazele azotate sunt cromofile şi
hidrofile (62, 96, 97, 102).
Pentru a preveni reasocierea monocatenelor (după o denaturare
completă la 90º) prin împerecheri de baze se păstrează ADN denaturat la
concentraţii saline mari, la temperatura camerei (fig.2.25).

37
 Fig.2.25 Denaturarea şi renaturarea ADN (image024.jpg scrigroum)

Renaturarea
Renaturarea reprezintă refacerea structurii native, dublu catenară a
ADN, pornind de la monocatene separate prin denaturare.
Pentru renaturare sunt necesare două condiţii:
- concentraţia salină trebuie să fie suficient de mare pentru a înlătura
repulsia electrostatică dintre fosfaţii celor două catene
polinucleotidice (se utilizează 0,15-0,5 M NaCl);
- temperatura trebuie să fie cu 20-25ºC sub valoarea temperaturii de
topire, şi are rolul de a elimina legăturile de hidrogen intracatenare
apărute la întâmplare (randomizat).
In urma filtrării o soluţie de ADN renaturat are şi monocatene rămase
nesociate. Prin utilizarea filtrelor de nitroceluloză, ADN renaturat trece, pe când
monocatenele sunt reţinute de filtru putând fi măsurată astfel fracţia de ADN
care a renaturat (4, 112).
Renaturarea ADN este însoţită de efectul hipocromatic deoarece prin
refacerea structurii dublu catenare, bazele azotate se află spre interiorul
structurii bicatenare. Dacă denaturarea începe de la nivelul unor sectoare ale
dublului helix ADN bogate în A-T, renaturarea este iniţiată în sectoarele bogate
în G-C mai stabile. Aceste sectoare la nivelul cărora se iniţiază renaturarea se
numesc centre de nucleaţie sau de renaturare.
Denaturarea şi renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice folosite
pentru studiul relaţiilor filogenetice dintre specii şi in tehnologia ADN
recombinat. Speciile înrudite filogenetic au secvenţe de baze azotate cu un grad
mare de similitudine şi prezintă temperaturi apropiate de denaturare a ADN,
realizând o renaturare mai rapidă a monocatenelor amestecate.
Renaturarea este un proces mult mai lent decât denaturarea, în urma
căruia ia naştere o structură bicatenară hibridă (4, 22, 30). Procentul de
renaturare între monocatene de ADN de la om si cimpanzeu este de aproximativ
90% pe când cel dintre ADN uman şi de şoarece este de 25%.
În tehnologia ADN recombinat, hibridarea moleculară ajută la stabilirea
38
exactă şi rapidă a transferului unei gene eucariote în celula bacteriană prin
folosirea sondei moleculare (102).

Respiraţia şi absorbţia ADN

ADN este o structură dinamică în care regiunile bicatenare se deschid
frecvent spre a forma ochiuri sau bucle monocatenare. Acest fenomen se
numeşte respiraţia ADN şi-i permite acestuia interacţiunea cu diferite proteine
spre a-i fi citită informaţia codificată. Respiraţia apare mai frecvent în regiunile
bogate în perechi A-T decât în cele cu G-C, deoarece perechile A-T sunt mai
uşor de denaturat fiziologic. Nu întâmplător la nivelul originii replicării
perechile A-T sunt foarte frecvente.
Absorbţia reprezintă capacitatea unei soluţii ADN de a absorbi lumina
UV. Bazele acizilor nucleici absorb lumina UV de 260 nm (30, 37, 38).

ADN mitocondrial
Mitocondriile furnizează energie prin fosforilare oxidativă. Conţin
propriul lor ADN, extracromozomial, diferit de ADN nuclear. ADN
mitocondrial este dublu catenar de 16,5 kb circular, codant pentru 13 subunităţi
proteice, constituind 4 complexe biochimice şi 24 molecule de ARN structural
(2 ARNr şi 22 ARNz) indispensabil pentru transducţia mitocondrială a
proteinelor. ARNm este independent de ADN nuclear. Replicarea, transcripţia
şi transducţia este independentă de cea a ADN nuclear. El codifică proteinele
care participă la fosforilarea oxidativă, necesară funcţionării şi structurii
mitocondriale. Aceste proteine (codificate de gene nucleare) sunt produse în
citoplasmă înainte de a ajunge în mitocondrie. Există o interelaţie ADN nuclear
– ADN mitocondrial (62, 129).

39
 3. REPLICAREA ADN

3.1 Ciclul celular

Toate celulele vii urmează fie un un program de diviziune, fie o moarte

programată, numită apoptoză.
Celulele ce nu se mai divid pot fi permanent scoase din ciclul celular
prin diferenţiere terminală, sau pot fi oprite într-o stare intermediară, G0.
Evenimentele ce presupun desfăşurarea unui ciclu celular intervin într-un mod
organizat, astfel încât anumite evenimente se termină înainte ca altele să
înceapă. Această ordine este controlată de o serie de mecanisme intracelulare
incomplet elucidate şi este influenţată de factori extracelulari: factori de
creştere, mitogeni şi antimitogeni, inductori de diferenţiere, contact celulă-
celulă sau factori de ancorare, nutrienţi etc. Celula prezintă la suprafaţă
receptori specifici care recunosc factorii de creştere. Aceștia dau startul
sistemelor semnal intracelulare. Legarea factorilor de creştere provoacă o
mişcare în cascadă a semnalelor intracelulare, determinând fosforilarea
proteinelor care activează proteinele reglatoare nucleare şi se declanşează
diviziunea celulară (3, 4, 30).
La celulele eucariote se pot distinge două faze în timpul diviziunii,
interfaza, perioadă în care celulele cresc şi mitoza, perioada în care nucleul şi
restul celulei se divide. În cursul mitozei (M), cromozomii replicaţi se separă şi
se adună în doi nuclei noi, iar citoplasma se împarte la cele două celule fiice
prin citokineza.
Interfaza are trei faze:
 Gl (gap 1), o perioadă de creştere, în cursul căreia celula işi
intensifică pregătirea pentru sinteza ADN;
 S (sinteza ADN), în cursul căreia este replicat materialul genetic,
nefiind permisă repetarea replicării;
 G2 (gap 2), în care se determină fidelitatea replicării ADN şi se
corectează erorile (35, 102).
Etapele de tranziţie între G1 şi S şi între G2 si M sunt strict reglate
pentru a reduce la minimum erorile din procesul de replicare. Punctele de
restricţie din G1 şi G2, care determină dacă se poate trece la fazele S şi
respectiv, M, sunt reglate de protein-kinaze sau kinaze ciclin-dependente sau
cdk şi de proteine asociate cu kinazele, denumite cicline. Activitatea enzimatică
a cdk este determinată de asocierea lor cu o ciclină şi de starea de fosforilare.
Există cel puţin şapte membri ai familiei cdk, fiecare dintre aceştia fiind asociat
cu o moleculă distinctă de ciclină. Complexele au specificităţi de substrat
caracteristice şi sunt exprimate în diferite faze ale ciclului (36, 62). Exprimarea
ciclinei variază cu ciclul celular şi sinteza acestor complexe este reglată prin
transcripţie, degradarea lor fiind mediată prin ubiquitin-conjugare şi distrugere
40
în proteazomi (tab. 3.1).

Tabel 3.1
Exprimarea ciclinelor în fazele ciclului celular.
FAZA KINAZA CICLIN- CICLINA SUBSTRATUL
DEPENDENTA KINAZELOR

G1 cdk2, cdk4, cdk6 Ciclina D Rb-1

G1/S cdk2 Ciclina E Rb-1
S cdk2 Ciclina A ?
G2/M cdk2, cdk1,xdk1 Ciclina B/A ?

 Tranzitia G1 – S
In faza G1 a ciclului celular există un punct de control cunoscut drept
punct de restricţie, R. El marchează fosforilarea proteinei Rb (a
retinoblastomului) prin intervenţia complexului holoenzimatic format de cdk 4
şi cdk 6 cu ciclina D. Consecinţa este anularea acţiunii inhibitorii pe care o are
proteina Rb în forma hipofosforilată şi legarea acesteia la nivelul unor secvenţe
specifice ale ADN-ului prin intermediul unor factori de transcripţie de tipul
proteinei myc.

Fig. 3.1 Exprimarea ciclinelor în timpul ciclului celular.

(nrn2097-i1.jpg nature.com)

Acţiunea inhibitorie a proteinei Rb înainte de fosforilare se manifestă

prin legarea de un alt factor de transcriptie, E2F. Complexul astfel format este

41
capabil să lege ADN-ul, dar nu poate iniţia transcripţia. E2F devine capabil să-
şi îndeplinească rolul de factor de transcripţie doar după fosforilarea proteinei
Rb, când redevine liber. Astfel se activează transcripţia genelor ale căror
produşi sunt necesari pentru trecerea la faza S a ciclului celular şi pentru
desfăşurarea corespunzătoare a copierii ADN-ului. Se consideră că proteina Rb
este factorul-cheie pentru trecerea în faza S a ciclului celular (fig. 3.1).
Alterarea ADN-ului celulei aflate în faza G1 induce sinteza în cantităţi
mai mari a proteinei oligodimerice p53. Aceasta induce transcripţia genei p21,
sintetiza în cantităţi crescute de proteina p21, un inhibitor multipotent al
kinazelor ciclin-dependente. Consecinţa finală este inhibarea fosforilării
proteinei Rb şi, deci, blocarea evoluţiei ciclului celular. Se consideră că
proteina p53 induce şi transcripţia unor compuşi implicaţi în procesele de
reparaţie a ADN-ului. In condiţiile în care defectul este mult prea grav pentru a
fi reparat, p53 contribuie la declanşarea apoptozei (36, 62, 102).

 Faza S
Mecanismele de reglare a parcurgerii fazei S nu sunt suficient
cunoscute. Se ştie că, imediat dupa iniţierea replicării ADN-ului, se formează
complexul activator, cdk-2 ciclina A. Consecinţa este fosforilarea, deci,
activarea proteinelor care se leagă la nivelul situsurilor de replicare autonomă
unde debutează acest proces. Odată ce ADN-ul a fost copiat în întregime, celula
intră în faza G2.

 Tranzitia G2-M
Primul factor reglator descris ca fiind implicat în tranziţia de la faza G2
la faza M a fost factorul de promovare a mitozei, MPF.
MPF este de fapt complexul cdk2-ciclina B care acţionează pe un
substrat-cheie necunoscut, determină trecerea la faza M. El este activat de o
kinază activatoare cdk (CAK) şi de o fosfatază (cdc25) care îndepărtează
fosfaţii inhibitori (30, 36, 62).
Unele dintre substraturile complexului ciclina B/cdc2 sunt definite şi
determină:
 fosforilarea histonei HI, a lamininelor nucleare şi a proteinelor
asociate microtubulilor;
 faciliteaza condensarea cromozomilor;
 fragmentarea membranei nucleare şi, respectiv,
 formarea fusului nuclear (3, 29, 102).

 Faza M
Debutează dupa activarea complexului cdk2-ciclina B. Ieşirea din
mitoză şi intrarea în stadiul G1 este marcată de distrucţia proteolitică a ciclinei
B şi de inactivarea cdk2 (fig. 3.2).
42
 Fiecare cromozom replicat este format din două cromatide surori legate
prin cohesine. Complexul MCDK se formează în timpul fazei S şi G2 dar
activitatea acestuia este inhibată până când sinteza ADN este completă.
Activitatea MCDK începe în faza M şi este implicată în fosforilarea unor
substraturi multiple (Sic1). Primul este activat complexul promotor al anfazei
APC. Acesta are ca ţintă cohesinele reglatoare, care degradate permit
segregarea cromatidelor surori. APC degradează complezul MCDK rezultat în
finalul mitozei (30, 102).

Fig. 3.2 Activitatea ciclinelor exprimate în faza M a ciclului celular

(Figure_46_1.jpg; roche-applied-science.com)

Controlul activităţii cdk

1. Fiecare ciclină este sintetizată într-un anumit stadiu al ciclului celular.
Ciclinele D și E sunt sintetizate în faza G1, ciclina A în fazele S si G2, ciclina B
în fazele G2 si M.
2. Degradarea ciclinelor este reglată în mod riguros.
3. Ciclina poate forma un complex cu o cdk (kinaza ciclin-dependenta).
4. Acest complex devine activ prin acţiunea unei kinaze activatoare de
cdk (CAK).
5. Cdk sunt inactivate prin fosforilare în poziţia Thr14 si Tyr15 şi pot fi
reactivate prin acţiunea unei fosfataze în aceleaşi poziţii.
6. Proteine inhibitoare de cdk pot fie preveni asamblarea complexelor
cdk-ciclină, fie inactiva cdk din complexele formate.
Complexul cdk-ciclină activat fosforilează substraturile necesare
tranziţiei celulei la următoarea fază a ciclului.

Inhibitorii cdk
Activitatea cdk este reglată de inhibitorii cdk (cdki). Aceste proteine cu
greutate moleculară mică, fie inhibă larg activitatea cdk (p21), fie inhibă
selectiv complexele ciclina D/cdk4, sau -6 (pl6, pl8). Primul membru al acestei
familii care a fost identificat a fost p21, care inhibă atât cdk, cât şi antigenul
nuclear din celula proliferată, o subunitate a ADN-polimerazei δ. Proteina p21
este indusă prin deteriorarea ADN, ca urmare a activării transcripţiei genei p53
43
şi inhibă progresul ciclului celular în mai multe puncte, inclusiv fazele Gl şi
S şi permit repararea ADN. Dacă deteriorarea ADN este prea mare, este
indusă o cale de sinucidere a celulei, pentru a permite eliminarea celulelor
potenţial disfuncţionale (30, 62) (fig. 3.3; tabel 3.2).

Tabel 3.2
Complexele cdk-ciclină şi inhibitorii acestora în funcţie de etapele ciclului
celular
COMPLEXUL KIP INK FAZA
CDK-CICLINA (inhibitori ai (proteine
cdk) inhibitoare ale
kinazelor)
cdk 4-Ciclina D p21 p15, p16 G1
p27 p18, p19
cdk 2-Ciclina E p21, p27 - G1/S
cdk 2-Ciclina A p 21 - S
cdk 2-Ciclina B p21 - G2/M

Cdki poate fi indus prin inhibitorii de creştere, cum este factorul de

transformare a creşterii β (TGFβ), şi poate fi inhibat de factorii de creştere
pozitivi, cum este interleukina-2 (IL-2). Alterarea genetică a cdki, în special a
pl6 şi pl5 este foarte frecventă în unele tumori. Alterări la locusul pl6 de pe
cromozomul 9p21 au fost detectate în 75% din cancerele pancreatice, în 40-
70% din glioblastome, în 50% din cancerele esofagiene şi în aproximativ 20%
din cancerele pulmonare, precum şi în sarcoamele de tesuturi moi. Mutaţii ale
cdki însotesc adesea hiperexprimarea ciclinei Dl, cu translocaţie t (ll;14), din
limfomul cu celule în manta (10, 14, 82) .
Unele tumori nu exprimă cdki, deoarece genele sunt supresate printr-un
mecanism epigenetic de blocare a transcripției. Modificările ce apar în structura
factorilor de reglare ai ciclului celular au fost detectate în cancerele umane. Rb,
ciclina D, cdk4 şi pl6 sunt alterate în mod obişnuit în cancer. Studii
suplimentare ar putea releva motivele pentru care unele componente ale
sistemului sunt susceptibile la alterare, în timp ce alte componente nu (30, 129).

44
 Fig. 3.3 Inhibitori ai ciclului celular
(1-s2.0-S1050173801001335-gr2.jpg sciencedirect.com)

Proteina p53 este cunoscută ca "paznicul genomului" şi "paznic al

punctului de control Gl". În mod obişnuit nu este solicitată să acţioneze în
cursul unei replicări normale. Cu toate acestea, odată cu deteriorarea ADN, p53
influenţează transcripţia acţionând pentru a opri progresul ciclului celular prin
inducerea exprimării p21, pentru a inhiba activitatea cdk-kinazei, în vederea
efectuării reparaţiilor ADN. Dacă deteriorarea este prea mare acţionează pentru
a iniţia apoptoza. p53 este ţinta multor virusuri care determină cancer: proteina
papilomavirusului uman E6 scurtează secvenţa p53, iar proteinele
adenovirusului E1B afectează de asemenea funcţiile p53 (4, 37, 38, 62, 76).
Mutaţiile la nivelul p53 sunt cele mai comune alterări genetice observate
în cancerele umane (peste 50%). În mod obişnuit, o alelă p53 de pe
cromozomul 17 este ştearsă, iar cealaltă suferă o mutaţie. Mutaţiile afectează
frecvent regiunea dintre codonii 120 şi 290, porţiune a genei care specifică site-
ul p53 implicat în transcripţie. Unii agenţi din mediu determină mutaţii în locuri
specifice. In 81% din cazurile de hepatom observate în ţările în curs de
dezvoltare, codonul 249 suferă mutaţii din cauza expunerii la un agent
cancerigen, aflatoxina B1. Mutaţiile codonului 249 sunt observate în doar 11%
din hepatoamele persoanelor din ţările industrializate, unde expunerea la
aflatoxina este redusă (hrana mai salubră). Indiferent de patogenia tumorii,
majoritatea au unul sau mai multe mecanisme care le permit să ocolească
punctul de control Gl, să evite activarea căilor de apoptoză şi să provoace
multiplicarea celulelor cu ADN deteriorat (30, 19).

45
 Evenimente intracelulare sau extracelulare care pot determina oprirea
ciclului celular:
 denutriţia;
 schimbări drastice de temperatură;
 factori de stress;
 alterarea ADN-ului etc.
Afectarea ADN-ului celular este cel mai studiat semnal de iniţiere a
sistemelor de control ale ciclului. Detectarea de erori de copiere a genomului
celular determină sechestrarea celulelor în faza G1 sau, dacă aceasta a fost
depăşită, în faza S, va fi inhibată atât iniţierea replicării, cît şi elongaţia.
Blocarea ciclului celular se face prin intermediul inhibitorilor kinazelor ciclin-
dependente (fig.3.4).

Fig. 3.4 Rolul factorilor de crestere in desfasurarea ciclului celular.

Reglarea extracelulara a ciclului celular. Celula integrează continuu

semnale extracelulare cu rol în controlul mecanismelor de diviziune celulară.
Statusul nutriţional, contactul celulă-celulă şi peptidele extracelulare
influenţeaza evenimentele intracelulare.

3.2 Apoptoza (moartea celulară programată)

Este o manieră particulară de cenzurare a anormalităţilor de desfăşurare

a ciclului celular. Pentru producerea apoptozei se consumă energie sub formă
de ATP. In celulele supuse apoptozei, cromatina nucleară se condensează,
nucleul se fragmentează, iar membrana celulară se menţine integră până în
stadiul final, când celulele apoptotice se rup, formează corpii apoptotici ce sunt
fagocitaţi de macrofage (fig.3.5).

46
 Fig. 3.5 Apoptoza
(image004.jpgscritube.com; 240px-Apoptosis_multi_mouseliver.jpg
sl.wikipedia.org).

În inducerea apoptozei sunt implicaţi produşi care controlează ciclul

celular: p53, Rb etc. Există mai multe situaţii care pot induce declanşarea
apoptozei. S-a presupus că acest fenomen survine fie când celula recepţionează
semnale contradictorii, fie când celula nu primeşte semnale de supravieţuire
(factori de creştere, hormoni) din mediul extracelular, fie ca răspuns la
modificările marcante apărute la nivelul ADN-ului (4, 19, 30).
S-au descris molecule anti-apoptotice care inhibă proteina bax
(inductoare a apoptozei). Este vorba de proteina bcl-2 (localizată în
mitocondrii, membrana nucleară şi reticulul endoplasmatic) şi de proteina bcl-
X1. Se presupune că aceste proteine induc intrarea celulei într-o stare puţin
activă din punct de vedere metabolic, protejând-o astfel de apoptoză, proces
consumator de ATP (30).

3.3 Replicarea ADN – generalităţi

In faza S, sinteza ADN începe cu desfacerea ADN din cromatină prin

intermediul helicazei şi a proteinelor de legare a catenelor, care ajută la
derularea dublului helix. Punctele de origine a replicării sunt spaţiate la o
distanţă de aproximativ 100.000 de perechi de nucleotide în lungul genomului
(fig. 3.6).
ADN-polimeraza şi ADN-primaza se ataşează de aceste puncte şi
catalizează polimerizarea ADN. Topoizomerazele rup şi resigilează filamentele
de ADN, pentru a preveni încurcarea lor. Deşi sistemul de replicare este eficient
şi precis, se produc uneori erori, iar acestea sunt reparate în secvenţele replicate
printr-o varietate de mecanisme. În unele cancere, mecanismele de reparare a
erorilor sunt defecte şi erorile sunt transferate celulelor-fiice, determinând
dezvoltarea de noi mutaţii.
47
 Fig. 3.6 Multiple origini de replicare.
(u4fg27b.jpg, student.ccbcmd.edu; fragmentos+de+okazaki+en+horquilla.jpg
elmodernoprometeo.blogspot.com)

ADN-polimeraza nu este capabilă să asigure replicarea completă a

porţiunii finale a lanţului de ADN. Această problemă a fost rezolvată prin
adăugarea unui ADN format din secvenţe repetate la capătul fiecărui cromozom
numite telomere şi sunt replicate cu ajutorul unei ADN-polimeraze dependentă
de ARN, numită telomerază. Celulele somatice normale nu exprimă telomeraza,
probabil datorită faptului că nu se replică sau au o capacitate finită de replicare.
Celulele bacteriene, de asemenea, nu exprimă telomeraza. Exprimarea
telomerazei în celulele tumorale este considerată a fi o componentă importantă
a procesului neoplazic, asigurând capacitatea celulei de a se multiplica, fără a
pierde informaţia codificată în apropierea porţiunilor finale ale cromozomilor.
Inhibarea activităţii telomerazei din celulele tumorale ar putea avea un efect
antitumoral (36, 61, 62).

3.3.1 Caracteristicile replicării

Replicarea ADN este un proces fundamental care are loc în celulele

organismelor vii. Molecula de ADN se separă în cele două catene
complementare (asemenea deschiderii unui fermoar), formând o structură în
formă de Y numită “furcă de replicare”. Fiecare catenă serveşte apoi ca matriţă
pentru ataşarea complementară a nucleotidelor (A-T, G-C) şi secvenţială (în
direcţia 5’→3’) a dezoxiribonucleotidelor activate, care vor fi polimerizate sub
acţiunea ADN polimerazei. Astfel, o moleculă bicatenară de ADN va forma
48
două molecule noi, identice între ele. Fiecare moleculă este formată dintr-o
catenă “parentală”, sau catenă "veche" şi una "nou sintetizată".
Replicarea ADN este:
1. semi-conservativă - fiecare moleculă este formată dintr-o catenă
“parentală sau "veche" şi una "nou sintetizată".
2. completă- replicarea ADN antrenează întregul cromozom,
rezultând doi cromozomi identici;
3. bi-direcţională, deşi are loc întotdeauna în direcţia 5’ 3’.
Replicarea începe într-un punct bine determinat numit origine de replicare
(ori) şi pornind din acest punct se derulează simultan în ambele direcţii;
4. semi-discontinuă. Apare întrebarea cum poate fi copiată una
dintre secvenţele duplexului în aceeaşi direcţie ca şi secvenţa complementară
pozitionată antiparalel celeilalte. Această problemă a fost soluţionată în 1968 de
către Okazaki care a studiat replicarea ADN-ului la Escherichia coli. El a arătat
că secvenţe de ADN, cu lungimea a 1000 de baze, au putut fi observate prin
centrifugare într-un gradientul de densitate. Fragmentele s-au unit cu timpul în
bucăţi mai mari, arătând că acestea erau legate covalent la scurt timp după
sinteză. Aceste fragmente mici, numite şi fragmentele Okazaki, au reprezentat
cheia pentru a explica cum ambele secvenţe sunt copiate pe măsură ce se
derulează ADN la nivelul furcii de replicare. Cele două secvenţe ale helixului
parental nu sunt copiate în acelaşi fel.

Fig. 3.7 Replicarea ADN la eucariote (19).

Aparatul de replicare sare înainte o distanţă mica (~ 1000 de baze) pe

secvenţa de la 5’ la 3’ şi apoi copiaza înapoi spre furca de replicare, în timp ce
pe secvenţa conducătoare replicarea are loc într-un mod continuu (36, 37, 38,
96, 97).
Okazaki a propus şi demonstrat că în timp ce sinteza catenei 5’ la 3’
49
(numită conducătoare leading) este continuă, sinteza celei de-a doua (întârziată-
lagging ) este discontinuă (în runde de 150-250 nucleotide).

Elementele esenţiale necesare replicării sunt:

 ADN parental- matriţă (fiecare catenă de ADN serveşte ca matriţă);
 cei 4 dezoxiribonucleozid trifosfaţi dNTP (dATP, dGTP, dTTP,
dCTP);
 cei 4 ribonucleozid trifosfaţi NTP (ATP, GTP, UTP, CTP; aceasta
sugerează necesitatea sintezei de ARN în cursul sintezei de ADN;
 Proteine specifice, majoritatea enzime;
 Mg2+.

3.3.2 Mecanismul molecular al replicării la procariote

Proteinele implicate în replicarea ADN sunt redate în fig. 3.8.

ADN polimerazele
Clase ADN polimeraze -ADN dependente:
 la procariote: ADN pol I, II, III, IV, V
 la eucariote: ADN pol α, β, γ, ε, δ
ADN polimerazele au următoarele funcţii:
a. Sintetizează catena nouă în direcţia 5’—> 3’: formează legături
fosfodiesterice între două dNTP vecine dictate de matriţă, prin atacul nucleofil
realizat de către gruparea 3’-OH al primului nucleotid asupra grupării α fosfat
din dNTP următor (fig. 3.8). Necesită un primer deoarece nu poate iniţia
sinteza unei catene noi (ARN-ul sintetizat de primază serveşte drept primer).
b. Auto-control: au activitate 3' —>5' exonucleazică, care stă la baza
capacităţii de autocontrol sau de proof-reading: desface nucleotidele greşit
împerecheate de la capătul 3’ al catenei în creştere.
c. Procesivitate- capacitatea polimerazei de a se menţine legată de
matriţă; este o expresie a numărului de nucleotide adăugate la lanţul ADN în
creştere înainte ca polimeraza să se disocieze de matirţă (36, 62) .

50
 Fig. 3.8 Enzimele implicate in replicarea ADN la procariote.
(tumblr_mbs7jp80441qc0hbao1_1280.jpg, tumblr.com)

ADN polimeraza I catalizează încorporarea dNTP cu o viteză maximă

de 20 nt/sec. Enzima este prea lentă. Ar avea nevoie de 53 zile pentru a replica
integral cromozomul E.coli, care în realitate se divide la fiecare 20 min.
Enzima nu este suficient de procesivă.
Totodată este prea abundentă. Există aproxiamtiv 400 molecule de ADN
polimeraza I per celulă E.coli şi doar 2 bifurcaţii de replicare per celulă.
Rolul ADN pol I:
 îndepărtează primerul de la capătul 5’ al lanţului în creştere;
 sintetizează catena lagging, înlocuieşte primerul ADN cu ARN şi
repară leziunile ADN (ex. leagă dNTP pe locul liber apărut după
îndepărtarea bazelor greşit împerecheate).
ADN polimeraza III este polimeraza replicativă
Proprietăţile ADN pol III sunt potrivite pentru o enzimă care deţine un
rol central în replicarea ADN: are o procesivitate foarte mare şi catalizează
polimerizarea la o viteză foarte înaltă (250-1000 nt/sec) (102, 109). Sintetizează
catena conducătoare.
ADN pol II este implicată în reparea leziunilor ADN (are activitate 3'
 5‘ exonucleazică)
ADN pol IV este predispusă la erori de împerechere (nu are activitate de
autocorectare ca pol III, pol II şi pol I). Pol IV este responsibilă de 50% din
51
mutaţiile adaptative.
ADN pol V:
- este sintetizată cînd celula este expusă la doze mari de radiaţii sau
agenţi mutageni;
- aparţine unei căi speciale de reparare (un fel de “ultima barieră“)
denumită calea SOS de reparare a ADN în leziuni majore ale
ADN.
Helicaza. Proteina ADN B, hexamer, catalizează un fel de denaturare in
vivo a ADN (catenele dezrăsucite pot fi citite de către enzimele replicării), cu
consum de energie (2 molecule de ATP per 2 legături de hidrogen desfăcute).
ADN helicazele desfac dublu helixul de ADN şi “eliberează” monocatenele ce
vor funcţiona ca matriţe pentru replicare. Ele acţionează în puncte specifice,
precis localizate, numite şi origini ale replicării şi apoi asigură înaintarea furcii
de replicare, prin ruperea legăturilor de hidrogen, debobinarea şi deschiderea
moleculei de ADN, care devine accesibilă proteinelor care iniţiază replicarea
(62, 129) (fig. 3.9).

Fig. 3.9 Helicaza şi topoizomeraza.

(rep2.19.jpg biosiva.50webs.org, tumblr_mbs7jp80441qc0hbao1_1280.jpg
tumblr.com)

ADN topoisomerazele I şi II despiralizează helixul ADN şi eliberează

tensiunea din molecula de ADN, acumulată prin debobinarea sa de către
helicaze (care produc o suprarulare a ADN în aval de locul de acţiune).
Topoizomerazele secţionează una sau ambele catene ale ADN (la nivelul
legăturilor fosfodiesterice), le derulează (relaxând molecula de ADN, prea
strâns înfăşurată) şi apoi resudează breşa din fiecare catenă (fig.3.10).
Există două tipuri de asemenea enzime: topoizomerazele I, care
52
determină secţionarea unei singure catene ADN şi topoizomeraza II, care
determină rupturi ale ADN simultan la nivelul celor două catene. In plus,
topoizomeraza II pare a interveni şi în alte procese celulare precum condensarea
cromozomilor în cursul mitozei şi separarea anafazică a cromatidelor surori (36,
62).

Fig. 3.10 Topoizomerazele (image008.jpg scrigroup.com).

Tabel 3.3
Caracteristicile replicării la procarite şi eucariote.
PROCARIOTE EUCARIOTE
1 origine Multiple origini
2 bifurcaţii de replicare per 100 bifurcaţii de replicare per
cromozom cromozom

Viteza replicării Viteza replicării

1.000 perechi baze/sec 100 perechi baze/sec

Lungime fragmente Okazaki Lungime fragmente Okazaki

1000 - 2000 nucleotide 150 - 200 nucleotide

1 eroare la 1mil - 10mil 1 eroare la 1000 mil

Proteinele de replicare A (RPA) numite şi proteine SSB (de la single-

strand binding proteins) menţin separate cele două catene desfăcute de helicaze,
prin fixare la monocatene şi “mascarea” perechilor de baze, care au tendinţa
naturală de a se reuni, prin refacerea punţilor de hidrogen; deci RPA împiedică
53
reîmperecherea bazelor (126).
Complexul ADN-primază–ADN polimerază α este implicat în sinteza
amorselor şi replicarea catenei “întârziate” a ADN. Sub acţiunea ADN primazei
se sintetizează amorse scurte (3 - 16 nucleotide) de ARN la care ADN
polimeraza α adaugă, la capătul 3' terminal, circa 30 de dezoxiribonucleotide.
Apoi complexul ADN primază-ADN polimeraza α este îndepărtat şi ADN
polimeraza δ “preia ştafeta” continuând sinteza lanţului de deoxiribonucleotide
început. Amorsele ARN vor fi distruse prin hidroliză enzimatică şi înlocuite cu
ADN (4, 36, 62).

ADN ligazele
ADN ligazele sunt enzime capabile de reconstituirea legăturilor
fosfodiester între 3'OH şi fosfatul 5' a două nucleotide vecine dintr-un lanţ de
ADN (fig. 3.11). Ele intervin în replicare pentru a lega ansamblul lanţului ADN
sau fragmentelor Okazaki sintetizate de ADN polimeraze.
Intervin de asemenea în numeroase procese de reparare a ADN genomic
(3, 105).

Fig. 3.11 Ligaza.

Proteinele de replicare C (RPC) recunosc specific şi se leagă la

joncţiunea dintre primer şi matriţă, fiind responsabile de medierea şi stabilizarea
interacţiunii ADN polimerazei cu matriţa ADN.
Antigenul nuclear de proliferare celulară (Proliferating Cell Nuclear
Antigen) PCNA se leagă în imediata vecinătate a proteinelor RPC şi împreună
sunt principalele proteine asociate ADN polimerazei (fig. 3.12). PCNA se
organizează sub forma unor dimeri care au configuraţia spaţială a unui inel ce
alunecă de-a lungul matriţei ADN şi permit încorporarea neîntreruptă a mii de
54
nucleotide în catena ADN nou sintetizată. Blocarea PCNA (de exemplu, prin
proteina p21) opreşte replicarea ADN (30).

Fig. 3.12 PCNA si Pol δ

Ribonucleaza H1 (ARNaza H1) îndepărtează amorsele ARN folosite de

ADN polimeraze pentru iniţierea replicării. Lacuna rezultată este completată,
refăcută, de ADN polimerază δ iar refacerea continuităţii catenei este realizată
prin sudarea capetelor, de către o ADN ligază (112).

3.3.3 Mecanismul molecular al replicării ADN la eucariote

Procesul de replicare începe în “puncte” definite ale genomului numite

origini de replicare (“ori”) şi de aici progresează în ambele direcţii, până ce
ADN este complet duplicat. La acest nivel se fixează pe ADN proteinele de
iniţiere a replicării – care formează compexele prereplicative (pre-RC) - de care
se leagă apoi celelalte enzime ale “aparatului de replicare”: topoizomerazele,
helicazele, primazele, ADN polimerazele (36, 62).
Formarea complexelor prereplicative (pre-RC) în cursul fazei G1 a
ciclului celular, are loc prin asamblarea secvenţială a unor proteine (ORC,
Cdc6, Cdt1 si Mcm2-7). Odată format, complexul va fi activat prin intervenţia
unor kinaze ciclin-dependente, care declanşează tranziţia către replicarea ADN.
Această tranziţie implică asamblarea succesivă a unor factori de replicare
adiţionali, precum Mcm10, CDK, DDK, Cdc45, Sld3 şi a proteinelor de
replicare A, care facilitează despiralizarea ADN la nivelul originilor replicării şi
culminează cu asocierea ADN polimerazelor la ADN-ul despiralizat (30, 141).
Dublul helix este apoi despiralizat sub acţiunea topoizomerazelor iar
catenele sunt separate temporar de către ADN helicaze, într-o regiune
localizată, formând o structură în formă de Y – furcă de replicare. Pentru a
menţine catenele desfăcute, pe fiecare catenă “eliberată” se fixează proteinele
RPA (sau SSB), care împiedică re-împerecherea bazelor complementare şi
55
refacerea spontană a dublului-helix.
Pe cele două catene “matriţă” are loc, în prezenţa ADN polimerazei δ,
aranjarea secvenţială şi complementară a dezoxiribonucleotidelor activate în
prealabil (deci sub formă de nucleozid trifostaţi), pentru a aduce energia
necesară reacţiei de polimerizare.
ADN polimeraza nu poate iniţia sinteza de novo a unui lanţ
polinucleotidic. Ea este capabilă doar sa inducă adiţia unui nucleotid la capatul
3'OH al unui lanţ polinucleotidic preexistent. De aceea, declanşarea replicării
ADN necesită utilizarea unor amorse de tip ARN (“primer”) - sintetizate sub
acţiunea primazei. Sinteza se face aşadar numai în direcţia 5'—> 3' iar ADN
polimeraza “ştie” numai să alungească acea catena în curs de sinteză (36, 204).
Aceste două caracteristici determină “o asimetrie” în procesul de
replicare: pe catena matriţă 5’-3’ sinteza catenei noi este continuă şi rapidă
(“leading strand” sau catenă avansată), pe măsura desfacerii celor două catene,
iar pe catena 3’-5' sinteza ADN este discontinuă, sub forma unor secvenţe
scurte (100-1000 nucleotide) de ADN numite şi ”piese Okazaki”, fiind mult mai
lentă (“lagging strand” sau catenă întârziată). Ulterior amorsa este distrusă prin
hidroliză şi înlocuită cu secvenţe de tip ADN, sub acţiunea ADN polimerazei α
iar fragmentele sunt unite de către o ligază. Pentru catena avansată amorsa este
necesară numai la începutul replicării; în schimb pentru catena întârziată sinteza
fiecare fragment Okazaki necesită o amorsă (129).
Complexul de replicare al ADN-ului (replizom) conţine toate proteinele
necesare pentru câteva activităţi implicate în replicarea sigură a ADN-ului cu
secvenţă dublă. Activitatea helicazei în replizom, desface şi descurcă ADN-ul
pentru replicare. Primaza, fie ca proteină separată, fie ca o poliproteină primază
(helicaza din replizom), sintetizează secvenţe scurte de ARN (11± 1 baze)
pentru a facilita sinteza ADN-ului. Activitatea pimazei este necesară pe
parcursul procesului de replicare pentru a facilita sinteza discontinuă a unor
secvenţe de înfăşurare a ADN-ului. Primaza din E. coli, ADNG, transcrie 2000-
3000 de primeri (151)

Particularităţile replicării ADN la eucariote

Mecanismele de replicare a ADN la eucariote sunt în general
asemănătoare celor de la procariote. Apar totuşi anumite particularităţi
determinate de: mărimea enormă a genomului, asocierea ADN cu proteinele
(nucleozomi) în fibrele de cromatină şi replicarea în faza S a ciclului celular.
Datorită acestor proprietăți, viteza de replicare la eucariote este redusă (circa 50
nucleotide pe secundă comparativ cu 500 nucleotide pe secundă la procariote,
unde ADN este neasociat cu proteine). ADN trebuie însă să fie replicat integral
în circa 8 ore. Pentru a echilibra această situaţie, replicarea ADN la eucariote
debuteză în mai multe puncte de origine, ce corespund unor mici unităţi de
replicare numite repliconi. Replicarea progresează bidirecţional pentru fiecare
56
replicon şi după ce se termină, repliconii fuzionează treptat până ce întreagul
cromozom este duplicat. Fiecare cromozom are puncte de origine multiple,
situate la 150 - 200 kb iar întregul genom posedă circa 30.000 de puncte de
origine (36).
La eucariote există o “maşină” de replicare ce conţine toate elementele
menţionate anterior. De subliniat că ADN polimeraza α acţionează pe catena
întârziată (“lagging”) iar ADN polimeraza δ atât pe catena avansată (“leading”)
cât şi pe cea întârziată. În reglarea activităţii ADN polimerazelor sunt implicate:
PCNA sau antigenul nuclear de proliferare celulară şi factorul de replicare C
(RF-C), ambii cu roluri importante în controlul pornirii sau opririi replicării
(fig. 3.13).

Fig. 3.13 Modelul ipotetic de comportare a nucleozomilor în timpul replicării.

Enzimele implicate în replicare (19).

ADN-ul eucariotelor este asociat cu proteine histonice formând

57
nucleozomii. Se presupune că atunci când furca de replicare ajunge în dreptul
nucleozomului, ADN se derulează şi miezul histonic se desface în două
jumătăţi care rămân ataşate la una din cele două molecule de ADN formate prin
replicare. Ele vor reface ulterior nucleosomul original. Pe cealaltă moleculă de
ADN se vor constitui însă noi nucleosomi. Acest model este ipotetic dar s-a
demonstrat cu certitudine că o dată cu sinteza ADN are loc în nucleu o sinteză
importantă de histone necesare constituirii de nucleozomi noi (fig. 3.13) (19).
Factorii de transcripţie: RLF (inclus în complexul de pre-replicare) -
activează punctele de origine ale replicării şi împiedică re-replicarea în cursul
aceluiaşi ciclu iar E2F stimulează expresia genelor necesare intrării în faza S.
Inhibitorii kinazelor dependente de cicline sau CKI (proteinele p21,
p27 ş.a.) formează al doilea nivel de reglare al intrării şi progresiei celulelor
prin faza S. Ei blochează aceste procese (inhibând complexele Cdk-cicline şi
PCNA), fie atunci când apar leziuni în ADN, fie în cursul diferenţierii terminale
a unui ţesut (însoţită de pierderea capacităţii de replicare şi diviziune).
Cromatina puternic condensată (heterocromatina) este replicată tardiv,
la sfârşitul fazei S, în timp ce eucromatina, mai decondensată, se replică
precoce, la începutul fazei S. Deci regiunile din genom în care cromatina este
mai puţin condensată şi deci mai accesibilă maşinăriei de replicare sunt
replicate mai precoce. Acestea sunt de regulă benzile R (bogate în G-C), regiuni
de ADN care conţin în special genele "domestice" (active în toate celulele).
Regiunile din cromozomi care sunt replicate tardiv coincid cu benzile G, bogate
în A-T (30).
In mod normal, în faza S întregul genom este replicat o singură dată.
Deoarece replicarea ADN este asincronă există riscul teoretic ca unele regiuni
să fie replicate repetat. Acest lucru nu se întâmplă deoarece o serie de factori
inhibitori se fixează pe cromatina replicată şi nu permit replicarea ei repetată,
până ce celula nu trece prin mitoză. Aceşti factori sunt îndepărtaţi prin diviziune
şi celulele rezultate pot începe un nou ciclu, cu faza S, în care se produce o
nouă replicare (19).

Replicarea telomerelor
Telomerele sunt structuri cromatiniene specializate, situate la capetele
cromozomilor eucariotelor, care asigură stabilitatea cromozomilor şi împiedică
unirea lor prin capete.
Telomerele, alcãtuite din ADN şi proteine, au o structurã identicã la
specii diferite şi puternic conservatã în cursul evoluţiei, acest fapt atestând
importanţa lor funcţionalã deosebitã. Sunt formate din elemente repetitive
hexanucleotidice (la om TTAGGG) dispuse în tandem, care se extind pe o
lungime variabilă de 5-20 kb, în funcţie de ţesut şi de vârsta individului.
Datoritã particularitãţilor de replicare ale capetelor ADN liniar din cromozomi
(ce implică folosirea unor amorse degradabile, pentru iniţierea replicării), la
58
fiecare capãt 5' al catenelor nou sintetizate rămâne o mică regiune
(corespunzătoare ultimei amorse) care nu este replicată. Extremitatea
moleculelor de ADN ramâne cu o prelungire monocatenară 3', protuberantă şi
instabilă. Aceasta se pliazã spre înapoi şi formeazã o structurã "în ac de pãr",
care stabilizeazã ADN. Efectul stabilizant este favorizat şi prin asocierea, la
acest nivel, a unor proteine speciale (TRF1 şi TRF2) (151).
Pierderea secvenţelor telomerice poate fi compensatã prin adiţia
secvenţelor TTAGGG la capătul 3’ al unei catene de ADN, de cãtre
telomerazã, care stabilizeazã telomerele şi previne scurtarea lor. Telomeraza
este o ribo-nucleoproteinã ce conţine o scurtã secvenţã de ARN, complementarã
repetiţiilor telomerice (la om aceastã secvenţã este: 3'-CCCAAUCCC-5') ce
funcţionează ca matriţă internă. Ea este un tip neobişnuit de revers transcriptazã
(ADN polimerazã ARN dependentã) care adaugã la capãtul 3' (bogat în G) noi
secvenţe de nucleotide telomerice, fãrã sã necesite o matriţã exogenã. Sinteza
celeilalte catene complementare a telomerului, bogată în C, implică o
amorsă+ADN polimeraza α, ce foloseşte ca matriţă catena telomerică bogată în
C, care a fost deja sintetizată de telomerază (30, 102) (fig. 3.14).

Fig. 3.14. Telomerazele

Telomeraza este exprimatã în celulele germinale tinere (din gonade), în

blastocist şi cele mai multe ţesuturi embrio-fetale în sãptãmânile 16 - 20 ale
dezvoltãrii. Activitatea telomerazei scade progresiv în viaţa fetalã şi dispare
postnatal, în aproape toate celulele somatice normale. Excepţie fac celulele
stem din mãduva osoasă hematogenă. Dispariţia activitãţii telomerazice în
celulele somatice dupã naştere determinã scurtarea progresivã a lor, dupã
fiecare divizune odatã cu vârsta. Când se atinge o lungime criticã minimã (la
vârstã înaintatã) diviziunea celularã se opreşte şi începe senescenţa. Se fac
59
cercetări intense cu scopul de a preveni îmbătrânirea prematură a unor țesuturi,
întâlnită în diverse boli degenerative cu substrat genetic.
Pierderea telomerelor genereazã de asemenea instabilitatea genomicã şi
creşterea frecvenţei rearanjamentelor cromozomice (36).
Telomeraza poate fi reactivatã în procesele inflamatorii dar mai ales în
celulele canceroase. Acest lucru opreşte scurtarea telomerelor, creşte stabilitatea
lor (prin adãugarea secvenţelor repetitive hexanucleotidice la capetele
cromozomilor) şi astfel stimuleazã proliferarea celularã (62).

Fidelitatea replicării ADN

Acurateţea replicării ADN este critică pentru transmiterea informaţiei
ereditare în succesiunea celulelor şi organismelor. De aceea, organismul posedă
numeroase mecanisme care determină ca rata erorilor de împerechere
(“mismatch”) apărute în cursul procesului de replicare să fie extrem de redusă,
de circa o încorporare greşită la 109 – 1010 nucleotide.
În momentul în care cele două catene ADN sunt separate, nucleotidele
activate se aranjează "spontan" pe bază de complementaritate pe întreaga
porţiune a matriţei de ADN. Împerecherile greşite, în special unele precum G-T,
apar cu o probabilitate de 1 la 10.000. Gradul crescut de fidelitate al replicării
este rezultatul unor activităţi specifice ale ADN polimerazelor (62).
Un prim mecanism prin care ADN polimerazele ajută la creşterea
fidelităţii replicării este inserţia corectă a bazelor în catena ADN nou sintetizată.
ADN polimerazele nu catalizează încorporarea pasivă a oricărui nucleotid care
este deja legat prin punţi de hidrogen la catena matriţă, ci discriminează activ
împotriva unor împerecheri greşite probabil pe baza de conformaţie
tridimensională. Recunoaşterea erorii se face pe seama distorsiunii pe care o
produce în diametrul constant de 2nm al moleculei de ADN împerecherea
greşită a două nucleotide cu purină (molecule mari) sau două nucleotide cu
pirimidină (molecule mici). Această distorsiune acţionează ca semnal pentru
îndepărtarea noii baze inserate greşit. Mecansimul creşte acurateţea replicării de
aproximativ 100 de ori, reducând rata aşteptată a erorilor de la 10-4 la
aproximativ 10-6 .
Un alt mecanism major responsabil pentru acurateţea replicării ADN
este activitatea de autocorecţie (sau editare, proofreading) a ADN
polimerazelor. Aceasta este rezultatul capacităţii exonucleazice 3' –> 5' care
acţionează în sensul opus sintezei ADN şi înlătură nucleotidele încorporate
greşit în catena nouă. Asemenea activitate exonucleazică 3' –> 5' a fost
demonstrată pentru ADN polimerazele δ şi ε (delta si epsilon) şi permite
creşterea acurateţei replicării ADN de circa 100-1000 ori (102).
Puţinele erori de împerechere care apar totuşi, în ciuda intervenţiei
mecanismelor amintite, vor fi ţinta unor mecanisme de reparare a ADN (în
principal sistemul de reparare al erorilor de împerechere). Lipsa corectării lor va
60
conduce la apariţia mutaţiilor, prin replicări ulterioare. De exemplu, dacă în
locul A de pe matriţă se va plasa eronat C, în loc de T, la următoarea replicare
se va produce substituţia perechii de baze A-T cu C-G (36).
Integritatea structurală a ADN este foarte importantă pentru
supravieţuire şi toate celulele vii au mecanisme evoluate de reparare a
leziunilor. Această paradigmă a fost confirmată prin descoperirea unor
sindroame de predispoziţie la cancer care se produc prin mutaţii ale genelor ce
codifică proteinele implicate în reparare. Acestea determină o creştere de peste
100 de ori a ratei mutaţiilor şi produc o predispoziţie individuală la cancer, în
special de colon (160).

3.3.4 Reparaţiile ADN

Corectarea unei împerecheri greşite, sau a lipsei de complementaritate

între nucleotidele celor două catene, ale unui fragment de ADN, sunt denumite
reparaţii ADN.
Replicarea sau conservarea structurii primare ADN poate să nu fie
perfectă. Dacă ADN este lezat, sau replicat incorect rezultă că nuclotidele
situate pe cele 2 catene nu mai sunt complementare (AT sau CG). Are loc o
împerechere greşită între nucleotide.
Repararea vizează înlocuirea unei baze azotate, a unei nucleotide, sau
a unui fragment de acid nucleic, de către nucleotide complementare secvenţei
celeilalte catene.
Replicarea fiind semiconservativă una din cele două catene este
independentă ca matrice şi cealaltă catenă va fi reparată. (30).
Bazele greşite, lezate
Natura chimică a bazelor azotate este esenţială pentru mesajul genetic.
Numeroase modificări ale acestor baze pot antrena mutaţii.
Modificările chimice sunt reprezentate de:
 dezaminarea adeninei cu formarea hipoxantinei, în care aceasta este
preferenţial complementară cu C mai mult decât cu timina;
 metilarea citozinei, în 5' metil citozină, o face mai complementară
cu A decât G.
Mutaţia, rezultă din legături anormale între baze nucleotidice vecine
precum dimerii timinei. Căldura angajată în reacţia de hidroliză a bazelor
adesea a purinelor, conduce la situsuri apurinice (fără purine). Agenţii chimici
din mediu pot fi mutageni. Astfel, există analogi ai structurii bazelor, care dau
nucleotide anormale, precum 5-bromuracilul care se hibridează preferenţial cu
guanina, sau două aminopurine care se leagă de citozină. Unii agenţi mutageni
(2 metilnitrozamină) reacţionează între baze, sau în interiorul dublului helix ca
bromura de etidiu. Unii analogi ai purinelor sunt folosiţi în chimioterapia
cancerului (blochează replicarea) (91).
61
 Excizia bazelor lezate
În cazul unei baze deteriorate reparaţia se poate face prin simpla excizie
a acesteia, urmată de înlocuirea cu o bază a nucleotidei normale. Excizia se face
printr-o ADN glicozilază care deschide dublul helix, apoi hidrolizează legătura
N glicozidică a bazei lezate şi lasă o nucleotidă apurinică
Reparaţia se va face printr-o ADN polimerază de reparare, sau ADN
polimeraza β, γ, care hidrolizează nucleotida apurinică, apoi înlocuieşte
nucleotida ataşată la extremitatea 3'OH liberă şi breşa va fi închisă de ADN
ligaza. Aceasta reconstituie legătura fosfodiester în poziţia 3' a nucleotidei
adăugate (30) (fig. 3.15).

Fig. 3.15 Excizia bazelor azotate lezate.

Corectarea împerecherilor greşite

Unele baze azotate din ADN, existent sub mai multe forme tautomere,
rezultă prin deplasarea inconstantă a hidrolizei şi trecerea fracţiunii amino în
enol. Aceste forme sunt mai rare într-un ADN matriţă în curs de replicare.
Unele baze pot fi pentru scurt timp sub formă tautomeră.
Forma tautomeră a adeninei este imino-adenina, care nu se hibridează cu
timina ci cu citozina. La fel enol timina se hibridează mai bine cu guanina, decît
cu adenina şi enol guanina se leagă cu timina mai bine decât cu citozina (62).
Astfel ADN polimeraza, va fixa pe ADN-ul pe care-l construieşte, baze
azotate diferite faţă de cele normale (aşteptate). Dacă bazele azotate ale catenei
model vor lua forma obişnuită, ele nu se vor putea hibrida cu bazele catenei noi
şi vor rezulta împerecheri greşite (Fig. 3.16 ).

62
 Fig.3.16 Imperecheri greşite.

Transmiterea împerecherilor greşite

O împerechere greşită face să apară 2 nucleotide necomplementare în
aceeaşi poziţie a catenelor de ADN. Fiecare din cele 2 catene în cursul mitozei
următoare se vor replica producând o nucleotidă complementară. Nucleotida
anormală, va angaja o tranziţie permanentă într-una din cele 2 celule fiice. În
fig. 3.17, pe lanţurile parentale se află o pereche de nucleotide A=T. La
generaţia următoare, lanţul care posedă A, în urma unei iminizări, produce o
catenă complementară cu citozina, în loc de timina aşteptată (C=A). În altă
celulă secvenţa este normală T=A. Începând de aici toate celulele în care ADN
a fost replicat de la catena purtătoare de substituţie, vor avea la acest nivel o
pereche G=C. Substituţia a devenit permanentă (4, 141). Dacă ea este situată
într-o genă poate determina o mutaţie (Fig. 3.17 ).

Fig 3.17.Transmiterea împerecherilor greşite

63
 Excizia unui fragment lung de ADN
Dacă un fragment de ADN este lezat, simpla excizie a unei baze nu este
suficientă pentru reparaţie. O endonuclează secţionează catena purtătoare a
leziunii, la o distanţă de 5 nucleotide. Apoi sub efectul unei topoizomeraze şi a
unei helicaze (sau factorul TFIIH), catena lezată este separată de cele normale.
Începând de la extremitatea 3'OH a breşei astfel create, o ADN polimerază
reconstituie fragmentul complementar şi ultima legătură va fi inclusă prin ADN
ligaza (112). (fig. 3.18).

Fig. 3.18 Excizia unui fragment lung.

Modelul Holliday
Deschiderea unei breşe într-o catenă ADN şi derularea dublului helix,
permit unor fragmente de ADN monocatenar să se hibrideze cu secvenţele
complementare ale cromozomului omolog. În cazul unor greşeli, capetele celor
două catene schimbate vor putea fi reînchise prin ADN ligază. O asemenea
structură cu intercreşterea celor două catene ADN omoloage se numeşte
structură Holliday (1964). Această structură este mobilă şi schimbul se poate
propaga prin glisarea ei de-a lungul celor două helixuri, mergând în acelaşi sens
(Fig 3.19).

64
 Fig.3.19 Model Holliday.

Se poate reprezenta structura Holliday separând helixurile în formă de

cruce. Aceasta permite să se observe că există două moduri de separare a celor
două helixuri, fie secţionând orizontal şi obţinând o schimbare a fragmentelor
de ADN între 2 cromozomi, fie secţionând vertical şi ajungând la un schimb
complet de ADN între cei doi cromozomi, deasupra punctului de încrucişare
(30).

65
 4. TRANSCRIPŢIA ADN

4.1 Tipuri de ADN nuclear

Sunt descrise mai multe clase de ADN, diferite prin repetiţia secvenţelor
nucleotidice:
ADN nerepetitiv reprezintă circa 60% din genomul uman şi este
alcătuit din secvenţe unice per genom sau în număr foarte mic de
exemplare (familii multigenice). Este dispus printre secvenţele repetitive, în
regiunile eucromatice.
Sub 10% (circa 2%) din secvenţele nerepetitive reprezintă regiunile
codante ale genelor care codifică proteine (exonii). Aceste gene sunt transcrise
de ARN-polimeraza II (gene de clasă II).
Restul ADN-ului nerepetitiv (peste 90%) este necodant, prezent în
interiorul genelor (introni) şi în regiunile dintre gene, iar funcţia sa este încă
necunoscută (unii autori consideră că aceste secvenţe reprezintă gene represate).
ADN moderat repetitiv (ADN repetitiv dispersat) reprezintă circa
30% din genomul uman şi este alcătuit din secvenţe scurte, de 300-1000
pb, repetate de zeci şi sute de mii de ori şi dispersate în genom (36, 62).
Majoritatea acestor secvenţe sunt transcrise în ARN şi cuprind: genele repetate
în tandem care codifică ARNr şi ARNt, secvenţele LINEs şi SINEs.
Genele pentru ARNr sunt secvenţe repetate în tandem (150-200 copii),
localizate pe braţele scurte ale cromozomilor acrocentrici în regiunile
organizatorilor nucleolari (NOR-nucleolar organizer regions), care
formează nucleolii în nucleul interfazic (genele pentru ARNr 28S,
18S şi 5,8S). Genele pentru ARNr 5S sunt situate în vecinătatea
telomerului, pe braţul lung al cromozomului 1. Genele ribozomale sunt
transcrise de ARN-polimeraza I (gene de clasă I) (62).
Genele pentru ARNt (şi alte molecule mici de ARN) sunt repetate în
tandem, localizate mai ales la nivelul cromozomilor 1 şi 6. Aceste gene sunt
transcrise de ARN-polimeraza III (gene de clasă III).
Secvenţele LINEs (long interspersed nuclear elements) au lungimea de
1-6 Kb şi sunt dispersate în întregul genom, numărul de copii fiind de circa
500.000 (3-5% din genom). Până acum, sunt cunoscute două familii: L1 şi The
1 (fig. 4.1).
Rolul probabil al acestor secvenţe este de aasigura împerecherea corectă
a cromozomilor omologi în meioză, esenţială pentru schimbul reciproc de
segmente cromozomiale (30).

66
 Fig .4.1. Secvenţele LINEs (long interspersed nuclear elements)

Secvenţele SINEs (short interspersed nuclear elements) sunt secvenţe

scurte de 150-300 pb, dispersate în cromozomi în circa 100.000 de copii. Sunt
reprezentate de familia Alu. Funcţiile acestei familii sunt necunoscute, dar se
presupune că ar avea rol în iniţierea replicării în diferite puncte ale ADN.
Secvenţele Alu pot fi transpozate. Cele mai multe secvenţe repetitive sunt
rezultatul transpoziţiei, majoritatea având originea într-un ARN viral care, sub
acţiunea unei revers-transcriptaze, va forma o copie ADN ce va fi integrată în
alt loc din genom (37, 38).

ADN înalt repetitiv

Reprezintă 10% din genom şi este alcătuit din secvenţe foarte
scurte (2-200 pb), repetate în tandem de milioane de ori. Secvenţele înalt
repetitive, care nu sunt transcrise, sunt reprezentate de:
- sateliţi (ADN satelit), prezenţi în heterocromatina constitutivă din
anumite regiuni cromozomiale - centromer (banda C), telomere
(secvenţa TTAGGG), constricţii secundare, benzi G, precum şi din
cromozomul Y (corpusculul fluorescent); ADN satelit are deci rol
structural ;
- minisateliţii sunt secvenţe foarte scurte, de circa 15 pb, repetate în
tandem şi dispersate în toţi cromozomii (cu excepţia cromozomilor
X şi Y), unde ocupă situsuri specifice.
Minisateliţii sunt alcătuiţi dintr-o regiune centrală, cu o secvenţă
identică, şi regiuni periferice variabile. Numărul de copii ale secvenţei unui
minisatelit, precum şi variantele secvenţelor acestuia diferă de la o persoană la
alta. Sunt denumiţi şi regiuni hipervariabile (VNTR variable number of tandem
repeats) şi reprezintă markeri genetici ai individului: amprenta ADN sau
profilul ADN; probabilitatea de a întâlni doi indivizi neînrudiţi identici este mai
mică de 10-20 microsateliţi (secvenţe de 1-13 pb, cel mai frecvent
dinucleotidice) (62) (fig. 4.2).

67
 Fig. 4.2 Microsateliţii şi relevarea lor prin electroforeză.

- secvenţe scurte repetate (STR short tandem repeats) sunt grupări

de 2, 3, 4 şi 5 nucleotide ex.[AC]n’ = 5’AC AC AC repetare de n
ori; numărul lor este estimat între 50000 şi 100000 copii în genom
(fig.4.3);

Fig. 4.3 Polimorfismul unei singure nucleotide şi a polimorfismul unei

secvenţe lungi repetate în tandem.

- secvenţe repetate în tandem în număr variabil sau VNDR –

(variable number of dinucleotides repeats), distribuite neuniform la
nivelul genomului.
Mini- şi microsateliţii sunt localizaţi în regiunile de eucromatină şi
anume în ADN extragenic şi introni (37, 38). Aceste secvenţe repetitive sunt,
cel mai probabil, rezultatul unor defecte ale împerecherii (Slippage =
alunecare) în timpul procesului de replicare a AND (fig.4.4).

68
 Fig. 4.4 Tipuri de repetiţii în tandem in număr variabil (VNTR)
(bio3400.nicerweb.com)

4.2 Genomul mitocondrial

Genomul mitocondrial are o lungime de 16,6 Kb. Conţine un singur tip

de ADN circular, dublu catenar.
Cele două catene ale ADN mitocondrial (ADNmt) se deosebesc prin
conţinutul lor în baze azotate: una este bogată în guanină (catena grea - H), iar
catena complementară bogată în citozină (catena uşoară - L). Există o regiune
mică, numită bucla D, în care ADN este format din trei catene. În fiecare celulă
umană există câteva mii de copii ale ADN mitocondrial (ADNmt). Genomul
mitocondrial al zigotului provine exclusiv de la ovul, deci este moştenit numai
de la mamă (36, 62) (fig. 4.5).

Fig. 4.5 ADN mitocondrial

(http://www.carolguze.com/ima
ges/mito/mitgenome.jpg)

69
 ADNmt diferă de cel nuclear şi prin următoarele:
1. nu formează complexe cu proteine;
2. procentul de ADN codant este mare – circa 97%;
3. conţine foarte puţin ADN repetitiv;
4. este lipsit de introni;
5. replicarea este unidirecţională şi începe în puncte de origine diferite
pentru cele două catene;
6. transcripţia este continuă, fără întrerupere, în direcţii diferite pe cele
două catene, rezultând un transcript multigenic de dimensiune mare;
7. lipsesc unele mecanisme de reparare a leziunilor ADN, astfel că
mutaţiile se acumulează rapid;
8. conţine 37 de gene, care codifică ARNr de dimensiuni reduse,
ARNt şi polipeptide;
9. are 4 codoni stop, din care doi sunt codoni sens în ADN nuclear, iar
codonul stop UGA din ADN nuclear este codon sens în ADNmt.

4.3 Structura şi clasificarea genelor

Gena este unitatea de informaţie ereditară definită ca o secvenţă

ordonată de nucleotide dintr-un cromozom ce codifică un produs funcţional
specific respectiv proteină (fig.4.6). Ansamblul mecanismelor care stau la baza
secvenţelor genei şi conduc la producerea unui acid ribonucleic şi în final a
unei proteine sunt desemnate prin termenul de expresia genei (76).

Fig. 4.6 Localizarea genelor

(http://www.bing.com/images/search).

Gene ce codifică proteine reprezintă circa 1,5 % din genom.

Genele pentru ARN necodant (ncARNs) sunt împărţite în mai multe

70
clase majore pentru:
- ARN de transfer (ARNt) (4);
- ARN ribosomal (rARN);
- ARN nucleolar mic (snoARN) necesar procesării rARN;
- ARN nuclear mic (snARN) ce intervin în procesarea intronilor. Mai
există şi alte tipuri: ARN telomeraza.
Informaţia genetică codificată de ADN este mai întâi copiată -
transcripţie - într-o moleculă de ARNm, folosind acelaşi cod şi mecanismul
complementarităţii (A-U; C-G). Urmează apoi translaţia sau decodificarea
informaţiei genetice din ARNm într-o secvenţă specifică de aminoacizi a
proteinei, pe baza corespondenţei dintre fiecare codon şi un anumit aminoacid.
Gena este formată din secvenţe structurale ce codifică o succesiune de
aminoacizi (AA) şi o secvenţă reglatoare importantă pentru expresia genei.
Secvenţa structurală este formată din:
- regiune 5' netraductibilă (5'UTRs formată din 170 baze); care
debutează cu prima nucleotidă modificată (7 metil guanilat
trifosfat);
- regiunea centrală „cadru de lectură”, care este fragmentată în
secvenţe codante (exoni) separate de secvenţe necodante, intercalare
(introni);
- regiune 3' netraductibilă (3'UTRs formată din 700 baze).
La procariote secvenţa structurală se numeşte cadru deschis de lectură
sau ORF („open reading frame”) şi este lipsit de introni.
Secvenţa reglatoare sau promotorul este urmată de un situs de iniţiere
al transcripţiei, sau „start point” notat cu +1, locul unde este încorporat
primul nucleotid, de unde începe transcripţia (74) (fig. 4.7).

Fig 4.7. Structura genei. Regiune reglatoare şi transcriptibilă (236).

71
 Promotorului i se disting următoarele secvenţe:
- caseta TATA (sau domeniu), care este recunoscută specific prin
proteinele TPB ca subunităţi ale TFIID, cofactor al ARN polimeraza
II;
- caseta CAAT şi GG box, pe care vin să se fixeze alte proteine de
transcripţie CTF şi SP1.
Promotorul este situat în amonte de unitatea transcriptibilă, în poziţia 5',
are între 800 şi 1000 pb. El nu este transcris şi tradus. Intervine în iniţierea
transcripţiei şi orientarea direcţiei în care aceasta se va derula, prin secvenţe
consens pentru situl de fixare a ARN polimerazei II şi un capişon pe ARNm
indispensabil pentru transducţia sa ulterioară (30).
Activităţile multor promotori sunt amplificate de către secvenţe de ADN
numite potenţatori sau enhanceri situaţi la distanţă, până la câteva sute de
perechi de baze de promotor. Legarea poate fi la capătul 5' în amonte, sau 3'(în
aval) şi chiar în interiorul genei, într-un exon sau intron. Funcţia lor este
independentă de poziţie şi orientare. Asemenea potenţatori sunt recunoscuţi de
proteine specifice denumite factori de transcripţie sau activatori care
stimulează legarea ARN polimerazei de un promotor vecin (fig.4.8). Fiecare
potenţator conţine cel puţin un sit de fixare pentru un factor de transcripţie.
În general sunt mai multe situsuri pentru factorii de transcripţie care acţionează
sinergic (4, 36).

Fig. 4.8 Activatori , mediatori şi inhibitori ai transcripţiei

(U2CP3-2_GenePromoter_ksm.jpgnature.com).

72
 Potenţatorii (enhancerii) sunt secvenţe care stimulează expresia genei.
Faptul că sunt aşezaţi la distanţă (considerând ADN liniar) faţă de promotorii pe
care îi controlează este explicat pe baza împachetării sau plierii ADN. Ia naştere
o structură terţiară care aduce cele 2 elemente în poziţii apropiate (168 , 170).
Inhibitorii (silancerii) diminuă sau inhibă expresia genei. Sunt
localizaţi adesea între promotori şi potenţatori.
Factori care acţionează în transcripţie. Sunt proteine care acţionează
asupra ADN prin inhibarea parţială sau totală a receptorilor transcripţiei.

4.4 Transcripţia

Copierea informaţiei în ARNm se face numai de pe una din catenele

ADN, catena 3'5', numită catenă copiată, antisens sau matriţă. Ea este
totdeauna aceeaşi pentru o anumită genă dar la gene diferite poate fi una sau
alta din catenele ADN.
Catena ADN complementară catenei transcrise este similară cu ARNm
ca secvenţă (exceptând înlocuirea timinei cu uracilul) şi direcţie (5' 3') şi se
numeşte catenă de referinţă ("sens"). După desfacerea enzimatică, temporară, a
legăturilor de hidrogen dintre cele două catene ale ADN, copierea se face în
direcţia 3' 5', sintetizându-se o moleculă complementară şi antiparalelă (5'
 3') de ARNm. Ea va avea aceeaşi secvenţă şi orientare ca şi catena sens sau
de referinţă. De aceea, notarea şi descrierea unei gene se face, convenţional,
referindu-se la catena 5'  3' sens sau de referinţă a ADN (fig. 4.9).

Fig. 4.9 Transcriptia catenei

antisens·
(gifwww.biology.arizona.edu;
http://library.thinkquest.org/C00
4535/dna_transcription.html)

Mult timp s-a considerat că transferul informaţiei se face într-o singură

direcţie: ADN  ARNm  Proteină
şi a fost considerată dogma fundamentală a geneticii" (fig. 4.10).
73
 Această dogmă a fost reevaluată prin identificarea "transcripţiei
inverse -ADN. Prin acest mecanism retrovirusurile, care au
genomul format din ARN, îl pot integra în genomul celulei-gazdă,
confecţionându-şi o copie complementară de "tip ADN". Fenomenul este larg
folosit astăzi şi în ingineria genetică pentru obţinerea unor molecule de ADN
complementar din ARNm extras din celule. În fond acest ADNc reprezintă
gena (mai exact partea codantă) pe baza căreia se va sintetiza ARNm şi apoi
proteina corespunzătoare (3, 4).

Fig 4.10 Dogma centrală a geneticii

(news.softpedia.com).

Studiile recente (91) sugerează că transcripţia se desfaşoară în locaţii

retrase ale nucleilor, unde molecula de ADN se deplasează.
Una dintre aceste locaţii, nucleolul, este destinată sintezei ARN-ului
ribozomal. Polimerizarea ribonucleotidelor cu formarea ARN-ului pe modelul
ADN este catalizată de ARN-polimeraza şi este precedată de legarea acesteia de
promotor.
ARN polimeraza I formează complexe cu factori de transcripţie (TFIID)
care se leagă în amonte (deci înaintea punctului de iniţiere) pe când majoritatea
factorilor de transcripţie pentru ARN polimeraza II se leagă în aval (chiar la
mijlocul unităţii de transcripţie).
Dacă ARN polimerazele sunt universale, identice pentru toate celulele
şi ţesuturile, factorii de transcripţie sunt specifici pentru anumite ţesuturi.
74
Ei joacă un rol important în diferenţierea celulară şi menţinerea tipurilor de
celule.
Pe lângă aceşti factori implicaţi direct în sinteza ARNm, există şi
proteine care reglează desfăşurarea procesului, în sensul că îl intensifică,
atenuează dar nu-l blochează (4, 36, 62).
Etapele transcripţiei sunt:
- iniţierea;
- elongarea;
- terminarea.

4.4.1 Iniţierea transcripţiei

Transcripţia reprezintă procesul prin care este obţinut ARN pe baza unei
matriţe de ADN printr-un proces similar cu replicarea ADN-ului. Situsurile de
iniţiere ale replicării ADN-ului sunt mai puţine, comparativ cu cele pentru
transcripţie (sinteza ARN) atât la procariote cât şi la eucariote. In celulă sunt de
asemenea mult mai multe molecule de ARN polimeraze decât ADN polimeraze.
ARN polimerazele lucrează mult mai încet (50 - 100 ribonucleotide/sec) şi cu
fidelitate mai redusă, decât ADN polimerazele (1000 dezoxiribonucleotide/sec
pentru replicarea ADN).
Câţiva factori esenţiali sunt parte integrantă a acestui proces:
- ADN-ul matriţă;
- factorii de transcripţie: TFIID, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH (fig.
4.11);
- ARN polimeraza;
- ATP-ul şi
- ribonucleotidele trifosfat ca substrat.

Fig. 4.11. Complexul de

iniţiere altranscripţiei
(tumblr_mbjpfzVcSp1rivyp
9o1_1280.jpgtumblr.com).

Complexul de iniţiere a transcripţiei recunoaşte o secvenţă de

aproximativ 100 nucleotide ale lanţului antisens de ADN. TFIIH provoacă
deschiderea şi derularea parţială a dublului helix la acest nivel.
Transcripţia începe la a-35-a nucleotidă de pe TATA box. Fixarea
factorului TFIID se realizează printr-o componentă a acestui factor, TBP
(protein binding TATA box), care se ataşează de molecula de ADN folosind

75
caseta TATA pentru a poziţiona TFIID aproape de locul iniţierii transcripţiei
(30, 129). Acest ansamblu va servi ca punct de ancoraj pentru alţi factori de
iniţiere ai transcripţiei, după cum urmează:
-TFIIB care leagându-se va stabiliza complexul. Acest factor are acţiune
ATP-azică, eliberând energia necesară desfacerii catenelor de ADN,
pentru formarea complexului deschis;
-TFIIE şi TFIIH;
-ARN polimeraza II, care în urma unui proces ATP-dependent începe
transcripţia, odată cu formarea complexul de iniţiere, la nivelul
promotorului genei ţintă;
- TFIIF, factorul de elongaţie care împiedică terminarea prematură a
sintezei ARN.
Spre deosebire de sinteza ADN, cea a ARN nu necesită un primer. După
iniţierea sintezei ARN, prima ribonucleozidă trifosfat reţine toate grupările
fosfat deoarece ARN-ul este polimerizat în direcţia 5’-3’. Ribonucleozidele
trifosfat ulterioare reţin doar alfa fosfatul cel mai aproape de riboză (102).
Celelalte două grupări fosfat sunt eliberate sub formă de pirofosfat în timpul
reacţiei de sinteză (fig.4.12).

Fig. 4.12 Iniţierea transcripţiei (237).

Fiecare nucleotidă trifosfat este aleasă specific, pentru a fi

complementară cu baza corespunzătoare din lanţul antisens (A-U; C-G).
Fosfatul rămas se leagă printr-o legătură ester la carbonul 3 al ultimei
nucleotide a transcrisului în curs de sinteză. ARN polimeraza construieşte un
ARN hibrid cu lanţul de ADN antisens, a cărei secvenţă primară este o copie a
lanţului sens dar compusă din ribonucleotide în locul dezoxiribonucleotidelor şi
uracil în locul timinei. În cursul acestei elongări ARN polimeraza II este însoţită

76
de o serie de factori de elongaţie care modifică cromatina pentru a permite
avansarea enzimei, care împiedică formarea de obstacole, ca o agrafă de păr şi
facilitează avansarea policondensării. Transcriptul primar rămâne hibridat pe
câteva nucleotide cu lanţul antisens apoi se detaşează pentru a permite dublului
helix să se reformeze după trecerea polimerazei. Polimeraza se aşează pe catena
antisens şi merge în sensul 3  5 Ea lecturează sinteza transcrisului primar
prin condensarea ribonucleotidelor (96, 97, 99).

Fig. 4.13 Elongarea transcripţiei

(image009.jpg, referatele)

Nu există nici o secvenţă pe catena antisens a ADN care să codifice

încetarea transcripţiei. Acest fapt poate fi explicat prin cercetările recente care
arată că stoparea transcripţiei este realizată de exonucleaze specifice (113).
Deoarece ARNpolimeraza trece peste coada polyA, ARNm format este eliberat
de o endonuclează asociată polimerazei. ARN-ul nou sintetizat, iese din ARN
polimeraza şi este legat de către o altă exonuclează care începe să degradeze
ARN-ul’ spre ARN polimeraza (19). Când exonucleaza intră în contact cu
polimeraza, transcripţia se opreşte. Transcripţia trebuie făcută cu acurateţe
pentru că la nivelul ARN nu există sisteme de corectare a erorilor. ARN având
un timp de înjumătăţire biologic (T½) relativ scurt, nu se pot produce perturbări
genetice (transmisibile) ca în cazul ADN (fig.4.14).

77
 Fig. 4.14 Terminarea transcripţiei (238).

4.4.2 Factorii reglatori ai transcripţiei

Reglarea ARN polimerazei

Activatorii sau inhibitorii transcripţiei (factori trans-reglatori) sunt
proteine produse de ARN polimeraza II şi ca urmare induc sau reprimă expresia
genelor transcrise.
Aceşti factori transreglatori se leagă de ADN (ADN proteine de
legătură) în regiunea genei situate în amonte de partea transcrisă. Situsul de
fixare a acestor factori transreglatori pe ADN este constituit din secvenţe
specifice numite elemente cis reglatoare.
Cuplul elemente cis reglatoare cu factorii transreglatori legaţi, intră în
contact cu complexul de iniţiere a ARN polimerazei prin intermediul unui
ansamblu de proteine numite mediatori (102).
ARN polimeraza poate deci demara transcripţia, dacă este activată prin
factorii de transcripţie, unii fiind legaţi de aceste elemente ca TATA box sau
CAAT şi dacă prin intermediul mediatorilor ele au primit un semnal de
activare sau inhibare. Acest semnal depinde de prezenţa unui factor
transreglator legat la elemente din promotor. Legarea de reglatori ai
mediatorilor necesită o repliere a ADN din promotor pentru a permite legarea
de aceste proteine (fig. 4.15).

78
 Fig.4.15 Reglarea transcripţiei.
(data.jpgbiocadmin.otago.ac.nz)

Factorii de transcripţie pot folosi unul din cele două mecanisme pentru
reglarea expresiei genice. Aceste mecanisme sunt:
- activarea sau blocarea legării ARN polimerazei de ADN;
- acetilarea sau deacetilarea histonelor.
Activarea Histone-Acetil Transferazei (HAT) determină slăbirea,
ruperea legăturilor dintre ADN şi histone ceea ce-l fac pe ADN accesibil
transcripţiei. Activarea Histone Deacetilazei (HDAC) stimulează ataşarea
ADN la histone, ceea ce-l face pe ADN mai puţin accesibil ARN polimerazei.
În terapia cancerului se intenţionează folosirea unor substanţe care să inactiveze
HDACs ce determină activarea genelor supresoare tumorale (112) (fig. 4.16).

Fig. 4. 16 Activatorii şi inhibitorii transcripţiei (238)

79
 4.4.3 Discontinuitatea genelor

Moleculele de ADN ale fiecărui cromozom sunt foarte lungi până la sute
de milioane de perechi de nucleotide şi conţin mai multe mii de gene.
Fiecare genă conţine regiuni care prezintă secvenţe codate care vor fi
exoni, dar şi regiuni reglatoare ca promotori şi regiuni netraduse numite introni
care separă exonii. O genă poate să nu conţină decât un singur exon şi să nu
conţină intron, dar există gene cu peste o sută de exoni. După transcripţia ARN
produsă de ARN polimeraza transcrisul primar conţine de asemenena introni şi
exoni dar nu şi promotor.
După excizia intronilor şi matisarea sau înnădirea exonilor, mesagerul
nu conţine decât exoni reuniţi într-o singură secvenţă codantă.

Exonul
Reprezintă partea secvenţei unei gene transcrise în structura ARNm
până la transducţie. Exonii sunt fragmente ale secvenţei primare ale unor gene
care vor fi recopiate în structura primară a ARNm după matisare. Există exoni
de lungimi variabile: fragmente scurte (34 nucleotide pentru exonul 1 al
apolipoproteinei AII), sau lungi (7572 nucleotide pentru exonul 26 al
apolipoproteinei B) (102).
Un exon codifică cel mai adesea un domeniu funcţional al proteinei sau
o parte a acestuia. Astfel că poteinele eucariotelor sunt formate din mai multe
domenii codificate de gene care posedă cel puţin atâtea exoni (câte domenii
funcţionale are proteina). În cursul evoluţiei, gena poate fi modificată prin
substituţia, inserţia sau deleţia unui exon întreg (conversia genei) ceea ce
modifică proteina (aduce sau retrage proteinei un domeniu funcţional în
întregime).

4.4.4 Tipuri de ARN

Pentru a forma ARN nucleotidele GMP, AMP, UMP, CMP sunt

condensate prin legături fosfodiesterice între C3 a primei nucleotide şi 5 a
nucleoditei următoare.
După funcţie se disting mai multe tipuri de ARN:
- ribozomal - ARNr– (82 %);
- de transfer - ARNt- (16 %) transportă aminoaiczii activaţi pentru
transducţie;
- mesager - ARNm -(2%);
- ribonucleoproteine mici nucleare ARN - snARN (< 1 %)
structurează particula de recunoaştere a proteinei- semnal (96, 97).
ARN-ul ribozomal este o importantă componentă structurală şi
80
funcţională a ribozomilor (responsabili de sinteza proteinelor). Se cunosc două
tipuri de ribozomi: de tip procariot cu constanta de sedimentare 70S
(subunitatea mică 30S, subunitatea mare 50S) şi eucariot de 80S (subunitatea
mică 40S, subunitatea mare 60S). Tipurile variate de ARNr sunt denumite după
coeficientul de sedimentare (S) stabilit după centrifugare în gradientul de
densitate (170).
Se distig următarele fracţiuni de ARNr:
- la procariote: ARNr 23S şi ARNr 5S în subunitatea mare şi ARNr
16S în subunitatea mică;
- la eucariote, ARNr 18S care intră în structura subunităţii mici a
ribozomilor şi
- ARNr 28 S, ARNr 5,8 S şi ARNr 5S care structurează alături de
proteine subunitatea mare a ribozomilor. ARNr este sintetizat din
zonele genelor repetitive, singurul precursor fiind ARNr 45S (ARN
preribozomal) care este procesat subsecvent în tipul 18S 5.8S si
28S. ARNr 5S în subunităţile mari ribozomale este sintetizat separat
(fig. 4.17).
La procariote sunt trei specii de ARNr: 16S în subunităţile mici ale
ribozomilor 23S şi 5S, în subunitatea mare, toate sintetizate din aceleaşi gene.

Fig. 4.17 Tipuri de ARN ribozomal la procariote si eucariote (239).

ARN-ul mesager (ARNm) realizează transcripţia genelor purtătoare de

informaţie, care va fi tradusă în proteine (reprezintă o copie a genei). Prin
intermediul ARNm ribozomii primesc informaţia pentru sinteza proteinelor.
La procariote, ARNm este sintetizat şi în acelaşi timp tradus în proteine.
ARNm-ul procariotic poate fi uneori policistronic, însemnând că acesta
codifică mai multe proteine (3, 4, 36).
ARNm-de la eucariote, în contrast, este monocistronic, codificând
81
doar o proteină per ARNm. Totuşi, eucariotele pot produce proteine diferite din
aceeaşi secvenţă de ADN, începând sinteza ARN în diferite locaţii sau prin
procesarea diferită a ARNm. La eucariote, copierea ADN şi sinteza proteinelor
din ARNm rezultat sunt separate de membrana nucleară. ARNm de la eucariote
suferă o serie de modificări de procesare post-transcriptională înainte de a fi
tradus în proteine.
Cantitatea de ARNm particular dintr-o celulă este legată de necesitatea
acelei celule. Unele molecule de ARNm sunt transcrise constant şi sunt relativ
abundente în celula (transcripţia constitutivă), pe când altele sunt doar transcrise
la anumite intervale în timpul ciclului celular sau sub influenţa unor condiţii
particulare (transcripţia inductibilă sau regulatorie). Chiar şi cele mai
abundente molecule de ARNm sunt mai puţine în celulă decât ARNr.
ARNm cuprinde mai multe secvenţe:
- o secvenţă 5 necodantă care nu va fi tradusă, care corespunde
exonului 1 şi unei părţi a exonului 2;
- primul codon AUG, fixează ARNt la metionina iniţială;
- secvenţe de codoni pentru a încorpora aminoacizi, ca peptide
semnal şi polipeptide;
- secvenţa codonilor a căror aminoacizi vor forma structura primară a
proteinelor;
- secvenţa 3 netradusă care se va termina prin coada polyA.
Pe secvenţa 5 netradusă se va constitui complexul de iniţiere a
transducţiei unde ribozomii se vor asambla succesiv, pentru continuarea
transducţiei (4, 110).

4.4.4.1 Maturarea ARN-ului mesager

Poliadenilarea
Studierea ARNm la eucariote a fost facilitată de descoperirea faptului că
cei mai mulţi mesageri poartă o secvenţă de acid poliadenilic la terminaţia 3’
sau coada poli A. Prezenţa adeninelor a fost descoperită iniţial prin hibridarea
ARNm-ului la polidezoxitimină (poli dT) pe celuloză (47). Poliuridina sau
politimina ce apare legată covalent la substraturi de celuloză sau sefaroză este
folosită în izolarea specifică a ARNm în laborator. Coada poli A nu este
codificată în ADN-ul genomic. Este adaugată la ARN dupa sinteza unui
ARNpre-mesager. Un complex de proteine recunoaşte secvenţa de ARN,
AAUAAA şi desparte bazele 11-30 ale lanţului ARN în direcţia 3’ a acelei
locaţii. Enzima care taie ARNm-ul premesager înaintea poliadenilarii nu a fost
identificată (117, 172). Enzima poliadenilat polimeraza este responsabilă de
adăugarea de adenine la finalul transcriptului. Un grup de pâna la 500-2000 de
nucleotide poli A formează coada poli A a ARNm în celulele mamiferelor (fig.
4.18).
82
 Această coadă polyA este o etapă de maturare indispensabilă activităţii
ARNm pe care-l poartă. Ea va fi digerată lent de o exonuclează din citoplasmă
dacă mesagerul va fi activ. Dacă va fi redusă la câteva sute de nucleotide
mesagerul va fi distrus total pentru a fi înlocuit de un mesager nou.

Fig. 4.18 Formarea cozii poli A (239).

Capişonul
Structura capişon are rol protector şi serveşte ca semnal de recunoaştere
pentru aparatul translaţional.
Elongarea transcrisului primar începe de la extremitatea COOH
terminală a polimerazei complexului de iniţiere. Pentru adăugarea coifului un
complex multienzimatic excercită trei activităţi:
- hidroliza fosfatului printr-o fosfatază la nucleotidul 5 a
transcriptului primar;
- transferul pe fosfatul rămas a unui guanilat de la GTP, de către o
guanililtransferază;
- metilarea acestui guanilat pe N7 realizată de o metilază (fig. 4.19).

Fig. 4.19. Enzime de bonetare.

83
 GMP se fixează şi pe al II-lea fosfat din nucleotida trifosfat care se
găseşte la extremitatea 5 din transcris. Acest GMP este metilat pe azotul 7.
Dacă nucleotida iniţială conţine o adenină această poate fi metilată pe
azotul 6.
7-metil
G5’ppp5’ G or A 2’O-metil pNpNpNp

unde p reprezintă o grupare fosfat, N - orice nucleotidă (fig. 4.20).

Fig.4.20 Capişon sau boneta ARNm.

Excizia intronilor şi legarea exonilor cap la cap

Genele structurale la procariote conţin lungimi neîntrerupte sau cadre
de citire deschise ORF, secvenţe ce codifică aminoacizi. In contrast, regiunile
codificante de la eucariote sunt întrerupte de secvenţe lungi, necodificate de
ADN denumite introni. ARN premesager sau ARN heteronuclear (hnARN),
este mult mai întins decât ARNm matur deoarece conţine şi aceste secvenţe
84
reglatoare. Intronii sunt eliminaţi din hnARN prin splicing sau excizie.
Secvenţele rămase ce codifică proteinele se numesc exoni.
După excizia intronilor şi legarea exonilor, mesagerul nu conţine decât
exoni.
Excizia şi legarea se realizează prin acţiunea unor enzime şi a
ribozomilor care catalizează secţionarea ARN (endoribonucleaze mici nucleare)
şi închiderea breşelor prin ARN ligaze. Legarea poate fi alternativă adică poate
conduce la mai multe structuri ale ARNm. ARNm alternativ are anumiţi exoni
proprii şi unii exoni comuni (186).

Formarea lasoului
Excizia intronilor şi legarea exonilor este o etapă foarte importantă a
maturării transcrisului în nucleul celular. Se face apel la factori specifici:
ribonucleoproteine conţinând mici subunităţi de ARN nuclear (snRNP), ARN
având proprietăţi catalitice.
Structura secundară a transcrisului pune în contact secvenţa 3'OH a
intronului;
- secvenţa de debut a intronului (extremitatea 5 sau situsul donor),
- secvenţa de sfârşit a intronului (extremitatea 3 sau sistus acceptor)
şi
- un situs situat între 20-50 nucleotide în amonte de situsul de tăiere
3 numit situs de ramificare, folosit pentru formarea unui lasou
(laţ).
Procesul are loc prin două reacţii de transesterificare. Situsul donor
începe obişnuit printr-o guanină a cărui fosfat este detaşat de exonul precedent
pentru a fi transferat pe C2 a situsului A de ramificare. Se formează un grup 2´,
5 fosfodiesteric, cu detaşarea concomitentă a exonului în poziţia 5. Ultima
nucleotidă a situsului acceptor este de asemenea o guanină, care este detaşată de
exonul următor al primei nucleotide şi este legată prin fosfatul 5 la C3 a
ultimei nucleotide a exonului precedent.
Apoi gruparea 3-hidroxil a exonului 5 formează o legătură
fosfodiesterică cu capătul 5 terminal al exonului 3, rezultând produsul înnădit.
Intronul eliberat sub formă de lasou este distrus de nucleaze. Transcrisul
pierde succesiv toţi intronii săi şi exonii se leagă constituind secvenţa codantă a
ARNm (30, 102).
Joncţiunile de înnădire sunt recunoscute şi cei doi exoni care trebuiesc
uniţi sunt aduşi împreună prin intermediul unor molecule mici de ARN nuclear
(snARNs) care formează complexe proteice mici, numite ribonucleoproteine
mici nucleare (snRNPs). Complexul este cunoscut ca spliceosome o structură
foarte mare de 50-60S. Anticorpii de la pacienţii cu lupus eritematos sistemic
diseminat au avut un rol crucial în descoperirea snRNPs. În această boală
autoimună, pacienţii au o gamă largă de anticorpi faţă de componentele
85
nucleare. S-a demonstrat că anticorpii specifici anti- snRNPs blochează
procesul de excizie a intronilor (fig. 4.21).

Fig. 4.21 Formarea lasoului.

Excizia alternativă a intronilor şi legarea exonilor

Aproximativ 35% dintre genele umane suferă legare alternativă, generând,
prin selecţia exonilor mai mulţi produşi diferiţi structural şi funcţional ( cele circa
35000 de gene produc un număr triplu de proteine). Excizia alternativă poate
modifica produsele genelor prin inserarea alternativă a diferiţilor exoni şi duce
la formarea unor proteine diferite. Spre exemplu, sinteza calcitoninei
(hormonul care menţine homeostazia calciului în sânge) în tiroida depinde de
exonii incluşi în ARNm matur (4). Excizia alternativă a fost identificat în
aproape 40 de gene diferite.
Disfuncţiile din procesul de splicing sunt responsabile de apariţia unor
boli. Unele β-talasemii (boli ale sângelui) rezultă din mutaţii în secvenţele de
recunoaştere a zonelor pentru excizie ale genelor β-globinei. Unele boli
autoimune rezultă din producerea anticorpilor sub acţiunea complexelor de
proteine ARN.
Auto-anticorpii impotriva U1 ARN. Unul dintre ARN-urile
micronucleare necesare pentru realizarea exciziei este asociat cu lupusul
eritematos, boală autoimună întâlnită la om şi diverse specii de animale.
Un alt exemplu de excizie alternativă este al troponinei din muşchi.
Datorită prezenţei proteinelor reglatoare pe transcrisul primar legarea
poate fi de mai multe feluri, se face diferenţiat de la o celulă la alta. Este posibil
să se lege alternativ fie la exonul 3 fie la exonul 4 din gena troponina T. Dacă
exonul 3 este păstrat se obţine α-troponina, iar dacă exonul 4 este păstrat se
obţine -troponina T. Această matisare alternativă stă la originea numeroaselor
proteine izomorfe (Fig.4. 22).
Este de asemenea posibil să se determine dependenţa expresiei genei a
doi promotori diferiţi, responsabili de reglarea diferenţiată. Fiecare din aceşti
86
promotori este legat de un exon 1 sau 1bis care vor fi legaţi alternativ cu
secvenţa transcrisului (151).
Se poate întâmpla să existe mai mulţi exoni la sfârşitul genei care conţin
codoni STOP. În acest caz legarea alternativă va da proteine cu lungimi diferite.

Fig. 4.22. Legarea alternativă.

carling_no41_fig1.jpg

ARN catalitic (ribozime)

Unele molecule de ARN (numite şi ribozime, prin contracţia cuvintelor

ribonucleotid şi enzime) au capacitatea de a cataliza reacţii chimice de clivare
sau de transesterificare în absenţa proteinelor enzimatice. Un exemplu îl
reprezintă siturile active (peptidil şi aminoacil) ale ribozomilor care sunt
formate exclusiv din segmente de ARN ribozomal. Ribozimele pot cataliza şi
reacţii de modificare a acizilor nucleici, spre exemplu spliceozomii, complexe
ribonucleoproteice implicate în procesul de legare al ARN-ului premesager.
Pentru identificarea ribozimelor Thomas Cech şi Sidney Altman au primit
premiul Nobel pentru Chimie în 1989 (36).
Micro ARN-ul de interferenţă (Small interfering ARN) (ARNi)
reprezintă o formă de apărare a celulelor eucariote împotriva invaziei virale
(32). ARN antisens sau ARN de interferenţă, conţine regiuni complementare
ARN-ului mesager şi prin hibridare, poate determina formarea de regiuni dublu
catenare ARN-ARN, care pot fie impiedica ARNm să fie translatat (fig. 4.23),
fie pot duce la degradarea moleculei de ARNm. Acest proces de degradare este
numit interferenţă ARN (ARNi) şi a fost descoperit de Fire şi Mello (premiul
Nobel pentru Fiziologie şi Medicină în 2006). Ribonucleaza III, este
responsabilă de generarea siARN şi a înca unui mini ARN din precursori ai
dsARN (168).

87
 Fig. 4. 23 ARN de interferenţă.

Prima demonstraţie a iARN dirijat a avut loc în experimentele lui Fire et

al. cu C. elegans (54, 92, 93). Aceşti cercetatori au injectat dsARN la viermi şi
au observat inhibiţia dramatică a unor gene ce genereaza ARN. De atunci,
siARN-urile au fost introduse în plante şi animale, inclusiv în culturi de celule
umane. Injectarea de dsARN omoară celulele umane. Inhibarea genelor poate
fi realizată prin introducerea de siARN în plasmide codificate pentru dsARN.
Aceste instrumente genetice au potenţial aplicativ nu numai în identificarea
genelor implicate în boala dar şi în tratamentul unor boli, în mod particular
cancerul unde expresia anormală al unor gene specifice tumorilor poate fi
inhibată (89).

4.4.4.2 ARN de transfer (ARNt)

ARN-urile de transfer sunt polinucleotide monocatenare relativ scurte cu

lungime de 73-93 baze. Există cel puţin un ARNt pentru fiecare aminoacid.
Nucleotidele din structura ARNt sunt modificate, de obicei metilate.
Cele mai multe ARNt-uri au un rest guanilic la terminaţia 5’ iar secvenţa C-C-A
la capătul 3’. Prin hibridare intracatenară maximă, ARNt-ul are aspect
cruciform. Secvenţa C-C-A este regăsită la capătul acceptor 3’. Aici este locul
unde AA va fi ataşat covalent la ARNt.
- Două secvenţe, a câte 7 baze structurează bucla TψC (ψ
pseudouridină) şi bucla inferioară sau anticodon, ce conţine 3
perechi de baze, complementare codonului ARNm;
- O altă spirală de 8-12 baze (D loop) este relativ bogată în
dihidrouridină.

88
 Micro ARN-urile (miARN) realizează diverse funcţii în celulele
eucariote care influenţează expresia genelor, dezvoltarea şi apărarea celulelor.
Deoarece producţia de miARN este strict legată de stadiul dezvoltării celulare,
multe dintre aceste tipuri sunt prezente doar în celulele infectate viral sau după
introducerea de acid nucleic străin în timpul transformării (5).

Alte miARN-uri
Încă din anii 1990 o varietate crescândă de micro ARN-uri (sARN) au
fost descrise la procariote şi eucariote inclusiv ARN-uri mici necodificante
(tncARN, 20-22b) (5), micro ARN-uri modulatorii (sARNm, 21-23b) (89),
ARN-uri micro nucleare (snoARN) (49, 50), tARNm (144) şi altele. Sinteza
şi procesarea ARN-ului prin intermediul acestor molecule influenţează
numeroasele procese celulare, inclusiv replicarea plasmidelor, dezvoltarea
bacteriofagilor, structura cromozomilor şi dezvoltarea. Aceste molecule de
ARN mici netraduse, au fost denumite sARN la bacterii şi ARN-uri
necodificante (ncARN) la eucariote.

Diferenţele dintre ARN şi ADN sunt:

- ARN este mai scurt, are 70-100 000 nucleotide;
- ARN conţine riboză, ADN dezoxiriboză (ADN);
- ARN prezintă în structură uracil, ADN timina.
- ADN este bicatenar, ARN este monocatenar.
Totuşi în unele regiuni, pe distanţă scurtă, monocatenele sunt unite prin
legături de H pe bază de complementaritate, deci ARN devine bicatenar şi
formează structura secundară. Un exemplu tipic este structura în formă de
frunză de trifoi a ARNt (fig.4.24 ).

Fig. 4.24 Structura secundară a ARN (240).

89
 Structura secundară a ARN este prezentată în fig. 4.25. Lanţul
monocatenar formează următoarele structuri: agrafă de păr, buclă multiplă,
pseudonod, buclă interioară, tulpină.

Fig. 4.25 Structura secundară a ARN (241).

4.4.5 ARN polimerazele

Sinteza ARN este catalizată de ARN polimeraze de trei tipuri la

eucariote şi doar una la procariote. La eucariote ARN polimerazele sunt:
 Polimeraze ARN dependente de ADN, care necesită o matriţă de
ADN;
 Polimerazele ARN dependente de ARN, necesită o matriţă ARN.
- ARN polimeraza I este localizată în nucleoli, unde se găsesc
genele ribozomale şi catalizează sinteza precursorilor majorităţii
moleculelor de ARNr 18S, 5, 8S, 28S;
- ARN polimeraza II este localizată în nucleoplasmă şi catalizează
sinteza precursorilor ARNm şi a unor snARN (ribonucleoproteine
mici). Ea este inhibată specific de un α amanitină, toxic extras din
Amanita phalloides(o ciupercă otrăvitoare înrudită cu muscariţa),.
- ARN polimeraza III este localizată în nucleoplasmă şi catalizează
sinteza precursorilor moleculelor ARNr, 5S şi o varietate de mici
fragmente de ARN nucleari şi citoplasmatici (ARNt, , snARN, 7SL-
ARN) (14, 28, 29, 42, 51, 53).
La procariote ARN polimeraza bacteriană are cinci subunităţi, două α
şi câte una β, β’ şi σ (158).
Burgess şi col. (20) au demonstrat că factorul sigma este eliberat la
iniţierea ARN-ului şi are rol de a ghida complexul enzimatic spre locul potrivit
al iniţierii transcripţiei ADN-ului.
La eucariote, polimerazele sunt formate din multisubunităţi.
90
 - ARN Polimeraza I (ARN pol I) realizează transcripţia în nucleol,
sintetizează rARN (cu excepţia 5S ARNr).
- ARN Polimeraza II (ARN pol II) se găseşte în nucleu şi
sintetizează ARNm şi snARN. Pol II (denumită şi polimeraza
bARN [Rpb]) este enzima centrală de transcripţie a ARNm la
eucariote.
- ARN Polimeraza III (ARN pol III), se găseşte în nucleu (şi uneori
în citoplasma) şi sintetizează ARNt 5S, ARNr şi câteva snARN.
Virusurile ARN transportă polimerazele proprii dependente de ARN.
Virusul hepatitei C transportă acest tip de polimeraza pentru a-şi replica
genomul format din ARN. Activitatea polimerazelor ARN dependente de ARN
a fost de asemenea găsită şi la eucariotele mai mici (39). Scopul acestor enzime
în celule poate fi asociat cu ARNi şi inhibarea genelor.
Polimeraza PoliA, independentă de polimeraza ARN, adaugă
nucleotide de adenina capătului 3’ al ARNm (43). Coada PoliA rezultată este
importantă pentru stabilitatea ARNm-ului si pentru translaţia în proteine.

Alte enzime implicate în metabolismul ARN

Ribonucleazele degradează ARN-ul (într-un mod similar ADN-ului de
către dezoxirobonucleaze). Endoribonucleaza, un factor specific de
poliadenilare (CPSF), subunităţile polimerazei II ARN şi alte proteine vor
contribui la stoparea sintezei ARN, tăierea ARN premesager urmată de creearea
cozii PoliA de către polimeraza poliA (Ryan K,şi col., Dantonel J,şi col. şi cit
de 19).
Helicazele ARN catalizează desfacerea ARN-ului dublu catenar.
Sinteza ARNrn-ului şi procesarea necesită activitatea helicazelor. Aceste
enzime au fost caracterizate la organismele procariote şi eucariote. Câteva
helicaze ARN acţionează exclusiv pe ARN. Altele pot acţiona pe heteroduplex
ADN:ARN şi pe substraturi ADN. Altă activitate a acestor enzime este
inlăturarea proteinelor din complexele proteina-ARN (fig. 4.27).

Fig. 4.26 Helicazele şi topoizomerazele implicate în transcripţia ADN.

(nfgz004.gif, els.net).

91
 5. TRANSLAŢIA

Translaţia constă în traducerea de către ribozomi a mesajului genetic al

ARNm pe care-l transformă în proteine. Aceasta în două etape:
 transcripţia sau copierea ADN cu formarea ARNm;
 translaţia, citirea ARNm de către ribozomi cu formarea proteinelor
(fig. 5.1).

Fig. 5.1 Transcripţia şi transducţia.

Translaţia se realizeaza în:

- citoplasma celulelor, urmată de eliberarea proteinelor în citoplasma;
- organitele celulei în reticulul endoplasmic (RE), apoi proteinele sunt
transferate la aparatul Golgi (AG) cu destinaţii diferite: membrana
celulară, lizozomală, mitocondrială, nucleară sau sunt exocitate.

5.1 Structura proteinelor

Proteinele sunt polimeri ai aminoacizilor.

Fiecare aminoacid care intra în structura proteinelor (exceptie face
prolina) prezinta aceeaşi formula generală, fiind alcătuiţi dintr-o grupare
carboxil (- COOH), o grupare funcţională amino (-NH 2), un atom de hidrogen
şi un radical R, ataşate atomului de carbon α. Radicalul R este diferit de la un
aminoacid la altul.
Proprietăţile acido-bazice ale aminoacizilor. Gruparea carboxil (-
COOH) şi amino (-NH2) sunt capabile de ionizare, adică pot ceda sau accepta
92
protoni în funcţie de pH, comportându-se ca acizi sau ca baze (fig. 5.2). La pH
fiziologic (aprox. 7,4) gruparea carboxil este încărcată negativ iar cea amino
este încărcată pozitiv,astfel încât întreaga moleculă este neutră. La pH acid,
gruparea carboxil primeşte protoni, astfel ca sarcina întregii molecule devine
pozitivă, iar la pH alcalin gruparea amino cedează protoni întreaga moleculă
devenind încărcată negativ. Datorită prezenţei grupărilor acide şi bazice,
aminoacizii sunt consideraţi molecule amfotere, adică se comportă în mediul
acid ca baze şi în mediul bazic ca acizi (53, 96, 97).

Fig. 5.2 Structura unui aminoacid.

Proprietăţile aminoacizilor ce alcătuiesc o proteină determină forma şi

natura biochimică a acesteia. Ea poate fi puternic încărcată, hidrofilă sau
hidrofobă. O singură proteină poate avea domenii separate cu proprietăţi
diferite. De exemplu, proteinele transmembranare pot avea câteva prelungiri de
aminoacizi hidrofobi care vor ocupa loc în stratul bimolecular de lipide al
plasmalemei; ar putea avea de asemenea domenii hidrofile.
Grupările terminale carboxil şi amino ale aminoacizilor sunt unite de o
legatură peptidică pentru a forma scheletul sau structura primară a proteinei
(Fig. 5.3). Această secvenţă (structura primară) este citită prin convenţie de la
capătul amino la capătul carboxil. Doi aminoacizi uniţi de o legătură peptidică
alcătuiesc o dipeptidă. Peptidele cu unităţi în plus sunt tri-, tetra-, pentapeptide,
depinzând de numărul aminoacizilor ataşaţi (30).
Datorită numărului relativ mic de aminoacizi (20) care intră în structura
proteinelor, teoretic ar trebui să se formeze proteine cu masă moleculară în jur
de 4200. Însă în realitate masele moleculare ale proteinelor au valori de peste
10 000 ceea ce a dus la concluzia că cel puţin o parte de aminoacizi se repetă de
mai multe ori în cadrul unei molecule.
A fost descoperit al 21-lea aminoacid neconventional, selenocisteina, un
component al selenoproteinelor. La mamifere sunt cunoscute 25 de
selenoproteine. Selenocisteina derivă din cisteina, atomul de sulf fiind înlocuit
de seleniu. Este codata de UGA (Schomburg L, şi col. Cit de 19).
Secvenţa aminoacizilor într-o proteină determină natura şi activitatea
aceştia. Schimbări minore în structura primară pot altera serios activitatea acelei
proteine. De exemplu un singur aminoacid substituit în secvenţa globinei

93
determină producerea hemoglobinei S (în anemia falciforma- caracterizată prin
hematii în formă de seceră).
Modificări minore în structura primară pot avea efecte drastice pentru
organism, deoarece aminoacizii trebuie să coopereze unul cu celălalt pentru a
determina funcţia şi structura proteinei.
Peptidele pot avea şi ele activitate biologică. Hormoni cum ar fi
insulina, glucagonul, corticotropina, oxitocina, bradikinina, şi tireotropina sunt
exemple de peptide (lungi de 9-40 aminoacizi) cu o activitate biologică intensă.
Câteva antibiotice cum ar fi penicilina şi streptomicina sunt de asemenea
peptide (19).
Structura secundară se referă la forma şi la lungimea lanţurilor
polipeptidice, proprietăţi induse de legăturile de hidrogen. Cele mai întâlnite
tipuri de structură secundară sunt alpha helixul şi lanţurile beta.
Structurile proteice helix alfa şi lanţurile beta (Fig. 5.3) au fost prima
dată descrise de către Pauling si Corey in 1951 (116). Unele proteine, în special
cele structurale, sunt alcătuite aproape în întregime din helixuri alfa şi lanţuri
beta. Proteinele globulare au cantităţi variate de helixuri alfa sau lanţuri beta.

Fig. 5.3 Structura primară, secundară terţiară şi cuaternară a proteinelor.

Hemoglobina cu cele 4 subunităţi proteice şi hemul (217).

94
 Structura terţiară a proteinelor. Prin intermediul cristalografiei cu
raze X s-a dovedit faptul că macromoleculele proteice au o conformaţie
tridrimensională, realizată de obicei prin intermediul cuplării mai multor lanţuri
polipeptidice scurte între ele, cuplare care duce la formarea fibrelor proteice
(fig. 5.3). Legăturile intercatenare pot fi principale sau secundare.
Structura cuaternară se referă la modul în care se unesc subunităţile
proteice. Enzimele care catalizează asamblarea acestor subunităţi poartă
denumirea de holoenzime, în care o parte sunt subunităţi reglatoare şi catalitice
(75).
Exemple de proteine care au structura cuaternară sunt: hemoglobina,
ADN polimeraza, canalele ionice, nucleozomii şi nanotubulii, care sunt
complexe multiproteice. Fragmentele proteice pot suferi transformări în
structura cuaternară, care se reflectă, fie în structurile individuale, fie în
reorientările fiecărei subunităţi proteice (116).
Celulele consumă multă energie în coordonarea sintezei proteinelor în
aşa fel încât proteinele corecte sunt disponibile la momente specifice şi în
cantităţi bine stabilite. Pierderea acestei expresii controlate va determina
fenotipuri anormale.
Totalitatea proteinelor produse de un genom formează un proteom.
Proteomul uman este de 10 ori mai mare decât genomul acestuia (53). Motivul
este că o singură genă poate da naştere mai multor proteine, datorită lipirii
alternative şi a altor modificări posttranscripţionale sau posttranslaţionale.
Tipuri de proteine
În funcţie de compoziţia lor chimică ele pot fi clasificate în:
 Holoproteine cu următoarele clase;
o Proteine globulare (sferoproteine), substanţe solubile în apă
sau în soluţii saline: protaminele, histonele, prolaminele,
gluteinele, globulinele, albuminele;
o Proteine fibrilare (scleroproteinele), caracteristice regnului
animal, cu rol de susţinere, protecţie şi rezistenţă mecanică:
colagenul, cheratina şi elastina.
 Heteroproteinele sunt proteine complexe, constituite dintr-o parte
proteică şi o parte prostetică care nu este compusă din aminoacizi; în
funcţie de această grupare se pot clasifica astfel:
o glicoproteine;
o lipoproteine;
o nucleoproteine.

5.2 Codul genetic

Natura unei gene şi descifrarea codului genetic a fost clarificată de către

Crick, Nirenberg, Lender, Khorana si Brenner (37, 38). Codul genetic nu este în
95
sine o informaţie ci un dicţionar pentru traducerea secvenţei realizată prin
combinarea celor 4-nucleotide ale ADN, corespunzatoare celor 20-aminoacizi
ce structurează proteinele. Relaţia triplet/aminoacid poartă numele de cod
genetic.
Limbajul nucleic se scrie cu 4 litere (A,G,C,T). Dacă o literă nucleică s-
ar traduce printr-un aminoacid ar rezulta 4 aminoacizi. Grupând literele
nucleice în cuvinte de cîte 2 litere se vor forma 16 cuvinte ce codifica 16
aminoacizi. Grupând literele câte 3 în cuvinte vor rezulta 64 cuvinte, codoni,
ceea ce permite exprimarea celor 20 de aminoacizi şi a semnelor de punctuaţie.
Pana in 1965, toţi cei 64 de tripleţi sau codoni au fost repartizaţi aminoacizilor
(Fig. 5.4).
Principala caracteristică a codului genetic este redundanţa (mai mulţi
codoni codifică un aminoacid). Excepţie fac metionina şi triptofanul care sunt
codificaţi de câte un singur codon. Există mai mulţi codoni în codul genetic
decât aminoacizi şi semne de punctuaţie.
Tripleţii ce codifică acelaşi AA au primele două baze similare, diferenţa
o face cea de/a treia. Codonul AUG codifică metionina şi dă startul
translaţiei.
Toţi codonii în care a II-a literă este U corespund aminoacizilor
hidrofili, deci au proprietăţi fizice apropiate (76).
Trei codoni, UAG, UAA si UGA ce termină sinteza proteinelor sunt
denumiţi codoni nonsens sau STOP. Cel mai apropiat codon STOP este cel al
triptofanului. O schimbare a oricăruia sau a celor 2 guanine determină formarea
codonului STOP şi deci se opreşte translaţia. Dar acest codon corespunde unui
aminoacid foarte rar întâlnit în structura proteinelor obişnuite.
Mutaţiile în secvenţa ADN-ului vor avea efecte diferite asupra
fenotipului în funcţie de modificările rezultate în secvenţa AA. În consecinţă,
mutaţiile variază de la nesemnificative la drastice în privinţa efectelor asupra
fenotipului.

Figura 5.4 Codul genetic.

96
 Codonii sunt citiţi ca nucleotidele în coloana stângă, apoi rândul de sus,
apoi coloana din dreapta. De notat că pot fi până la 6 codoni pentru un singur
AA (leucina şi arginina). Doar metionina şi triptofanul au un singur codon.
Codonul UGA (STOP) poate codifica selenocisteina. Selenoproteinele
au codoni UGA în mijlocul regiunilor lor de codificare. În absenţa seleniului,
sinteza proteinelor se opreşte prematur (codonul devine STOP). Carenţa în
seleniu determină îmbolnăviri.
Codul genetic este acelaşi pentru toate vieţuitoarele biosferei
(universal). Există câteva excepţii la codonii responsabili de biosinteza
proteinelor din mitocondrii.
Cu mici excepţii repertoriul AA este limitat la 20 în toate organismele,
indiferent de mediul de creştere. Organisnele termofile şi criofile sunt adaptate
pentru creşterea la 100 °C şi respectiv temperaturi sub 0 °C, nu prin folosirea
AA structural diferiţi ci prin varietatea de combinaţii de AA. Studiile recente au
arătat că este posibilă manipularea codului genetic pentru introducerea de AA
modificaţi (44, 169).

5.3 Sinteza proteinelor

Sinteza proteinelor începe cu activarea aminoacizilor (AA).

Aminoacizii liberi din citoplasmă sunt substraturi pentru sinteza
proteinelor. Pentru sinteza unui polipeptid cu o secvenţă definită sunt necesare
2 condiţii biochimice:
- grupul carboxil al fiecărui aminoacid trebuie să fie activat pentru a facilita
formarea legăturii peptidice;
- trebuie stabilită o legătură între fiecare nou AA şi informaţia din
ARNm-ul care îl codează. Ambele necesităţi sunt îndeplinite de ataşarea
unui AA la un ARNt specific în prima etapă a sintezei proteice. Ataşarea
corectă a AA este esenţială. Această reacţie are loc în citoplasmă şi nu în
ribozom.

Fig. 5.5 Activarea aminoacizilor (239).

97
 Fiecare din cei 20 de aminoacizi este cuplat covalent la ARNt specific
prin energia furnizată de hidroliza ATP, în prezenţa unor enzime de activare
dependente de Mg, numite ARS (amioacil ARNt-sintetaze). Odată ce AA este
ataşat la ARNt, se formează un aminoacil-ARNt (AA-ARNt) iar AA este numit
„activat” (4, 37, 38) (fig. 5.5).
Aminoacil-ARNt-sintetazele sunt împărţite în doua clase, I si II. Ele
interacţionează prin fereastra mare cu aminoacidul şi prin fereastra mică cu
braţul ARNt acceptor. Ambele clase recunosc ARNt-urile prin secvenţa
anticodon, iar AA datorită lanţurilor laterale. Doar ARNt-urile potrivite şi AA
se vor integra în aminoacil ARNt sintetază cu aceeaşi origine. Un AA legat
întâmplător la o aminoacil-ARNt-sintetază va disocia rapid înaintea schimbării
conformaţiei şi înainte ca încărcarea să se producă. La un alt nivel de editare,
ARNt-urile aminoacilate încărcate sunt hidrolizate la punctul de eliberare din
enzime (Szymansk M, cit de 19).
Odata ce AA este esterificat în ARNt, nu se face nici o diferenţă în
specificitatea adăugării la proteină. Fidelitatea translaţiei este determinată de
anticodonul (trei baze complementare codonului specific AA) ARNt cu rol de
adaptor între ARNm şi proteina în dezvoltare.

Sinteza proteinelor
Translaţia are loc în ribozomi, ribonucleoproteine mici observate iniţial
cu ajutorul microscopiei electronice în celulele animale. In anii ’50, Zamecnick
a demonstrat că aceste particule sunt locaţia sintezei proteinelor la bacterii
(153). Sunt aproximativ 20.000 de ribozomi în de E.coli, însumând aproximativ
25% din greutatea umedă a celulei. Structura ribozomală este similară la
procariote şi eucariote (Fig. 5.6). La procariote, ribozomii 70S sunt asamblaţi
dintr-o subunitate mică 30S şi o subunitatea mare 50S, în asociere cu ARNm-ul
şi factorii de iniţiere. Subunitatea 30S (1 milion daltoni) este compusă din 16S
ARN ribozomal si 21 de proteine ribozomale. Subunitatea 50S (1.8 milioane
daltoni) este compusă din 5S ARNr, 23S ARNr si 34 de proteine ribozomale.
Ribozomii eucariotelor sunt puţin mai mari (80S) cu structură mai
complexă cu o subunitate mica (40s – 1.3 mil. daltoni) şi o subunitate 60S (2.7
mil. daltoni). Subunitatea 40S este alcatuită dintr-un ARNr 18S şi aproximativ
30 de proteine ribozomale. Unitatea 60S conţine un ARNr-5S, un ARNr 5.8S,
unul 28S si aproximativ 40 de proteine ribozomale.
Sinteza proteinelor la eucariote, implică activitatea a 70 proteine
ribozomale diferite, a peste 20 de enzime necesare activării aminoacizilor
precursori, a zeci de proteine auxiliare alături de factori de iniţiere, elongare şi
terminalizare, a aproximativ 100 enzime adiţionale pentru procesare finală a
diferitelor proteine, a peste 40 de tipuri de ARNt. Circa 300 de macromolecule
sunt implicate în cooperarea necesară sintezei proteinelor.
98
 Iniţierea sintezei. ARNm care transportă codul pentru polipetidul de
sintetizat se cuplează la subunitatea ribozomală mică şi la AA-ARNt. Apoi are
loc cuplarea subunităţii mari pentru a forma complexul de iniţiere.
Sinteza proteinelor în ribozom începe aproape întotdeauna cu AA
metionina la eucariote şi N-formilmetionina la bacterii, mitocondrii şi
cloroplaste.

Fig. 5.6 Sinteza proteinelor la procariote şi eucariote (239)

5.3.1 Iniţierea lanţului polipeptidic

Primul tip, desemnat sub sigla ARNtiMet, poate iniţia sinteza proteică în
timp ce al doilea poate încorpora Met dar nu participă la creşterea lanţului
polipeptidic. Aceeaşi enzimă, metionil-ARNt-sintetaza poate ataşa Met la
ambele tipuri de ARNt dar numai complexul metionil-ARNt iMet poate cupla
subunitatea ribosomală mică în vederea iniţierii sintezei proteice. De obicei,
după recunoaşterea capului 5’, are loc o glisare a subunităţii mici de-a lungul
moleculei de ARNm în vederea localizării AUG.
Formarea complexului de iniţiere a translaţiei cuprinde câteva subetape:
- eIF2 care aduce cuplată o moleculă de GTP (eIF2-GTP), se va lega de Met-
ARNt iMet;
- eIF2+ Met-ARNt iMet leagă eIF3 şi complexul eIF4 alături de ARNm şi
subunitatea ribozomală mică, formând complexul de iniţiere de 40S.
Are loc poziţionarea corectă a Met-ARNt iMet la AUG, cu consum
energetic (ATP şi GTP). Este eliberat eIF3.
99
 Este cuplată subunitatea ribozomală mare (60S), prin intervenţia eIF1 şi
eIF5. Se consumă o moleculă de GTP. Se formează R80, deci ribozomul
funcţional, gata de sinteză şi care va cuprinde locurile E şi P (spre capătul 5’) şi
locul A (spre capătul 3’). Sunt eliberaţi factorii de iniţiere care-şi reiau funcţia
In acest complex, ARNtMET sau ARNt fMET sunt situate în locaţia peptidil
(P site) a ribozomului funcţional. ARNtMET sau ARNt fMET se pot lega doar la
locaţia P a ribozomului, formată din ambele subunităţi funcţionale (fig. 5.7). In
contrast, toate celelalte ARNt-uri se leagă la o locaţie adiacentă, locaţia
aminoacil (locaţia A) a ribozomului (60).

Fig. 5.7 Citirea ARNm de către ribozomii procariotelor (209).

Inserţia
Elongarea lanţului polipeptidic. Presupune intervenţia unor factori de
elongare (EFTu, EFTs şi EF-G la eucariote). În acest moment, Met-ARNt iMet
ocupă locul P în ribozom.
In etapa de elongare unde ARNt-ul ce poartă următorul AA se leagă
la locaţia A a ribozomului sub influenţa unui complex EFTu-GTP (fig. 5.8).
Datorită acestuia are loc poziţionarea corectă a AA-ARNt în locul A al
ribozomului (prin recunoaşterea perechilor de baze codon-anticodon). GTP este
hidrolizat iar EFTu-GDP rezultat este regenerat sub influenţa EFTs fiind
retransformat în EFTu-GTP (19).

100
 Fig. Fig. 5.8 Mecanismul sintezei proteinelor la eucariote (242).

Transferul
Prima legatură peptidică este formată între AA în locaţiile A şi P, prin
transferul grupării N-metionil la gruparea amino a AA secundar, lasând un
ARNt-dipeptidil în locaţia A. Acest pas este catalizat de activitatea enzimatică
din subunitatea mare a peptidil transferazei.
Locul P va fi ocupat de un ARNt deacilat iar locul A de un dipeptidil
ARNt 1-2 (fig.5.9).

Fig. 5.9. Elongarea traslaţiei. Formarea legăturilor peptidice.

101
 Translocarea
După formarea legăturii peptidice ribozomul se deplasează către
capătul 3’ cu un codon, utilizând energia rezultată prin hidroliza unei molecule
de GTP. Astfel, ARNt fără aminoacid de pe fostul loc P ajunge în locţia E a
ribozomului de unde este eliberat în citoplasmă. Locul P devine acum A şi va fi
ocupat de acelaşi dipeptidil ARNt. Locul A este acum liber şi gata de a primi un
nou AA-ARNt. Această mişcare (translocaţie) ARNt pe o distanţă de 20 Å de la
locaţia A la P şi 28 Å de la P la E, necesită 2 molecule de GTP cu adăugarea
fiecărui AA. Acest proces este mediat de EF-G, proteină care aduce cuplată
molecula de GTP necesară translocării. Prin acelaşi mecanism se adaugă, pas cu
pas câte un nou aminoacid, conform codonilor respectivi, la lanţul polipeptidic
în creştere 1-2-3 (166).
Deşi aceste interacţiuni asigură împerecherea precisă a poziţiilor
primelor două nucleotide, împerecherea la poziţia a treia nu este aşa strictă,
reprezentând zigzagul din codul genetic (114).
Legarea ARNt-urilor încărcate şi formarea legăturii peptidice produc
polipeptida crescătoare (elongare). Câţiva ribozomi pot citi simultan un singur
ARNm (complex poliribozomal). Când complexul întâlneşte un codon nonsens
(STOP), sinteza proteinelor se opreşte, iar componentele sunt reciclate.
Această activitate poate fi mediată în întregime prin intermediul ARN,
deoarece nu există nici o proteină în vecinatatea locaţiei active a ribozomului
unde apare formaţiunea de legare a peptidelor (140).
In timpul translaţiei, polipeptidele crescânde încep să se plieze în forma
matură. Acest proces este asistat de complexe proteice protectoare
(chaperones) (75), proteine specializate care se leagă la subunitatea ribozomală
mare, formând un buzunar hidrofobic ce reţine polipeptidele emergente (Fig.
5.10).

a b c

Figura 5.10 Protectori moleculari prind peptidele în creştere odată ce acestea

emerg din locaţia activă. Peptidele trec prin stadiile reţinere (a), pliere (b),
eliberare (c). Când proteina este sintetizată şi eliberată complet din ribozom,
ar trebui să fie în starea de pliere (19).
102
 Aceste molecule supraveghetoare protejează aparent regiunile hidrofobe
ale peptidelor neterminate până când pot fi asociate în cadrul proteinei. In
absenţa acestei activităţi, proteinele neterminate se pot lega între ele şi forma
agregate nonfuncţionale. Totodată moleculele supraveghetoare stabilizează
lanţurile de polipeptide în timpul transportului în interiorul celulei mai exact în
organite.
Proteina ADNK a E. coli poate deasemenea să se comporte ca o
protectoare prin legarea la regiunile hidrofobe ale polipeptidelor emergente
(42).
Partea terminală a lanţului AA este semnalizată de unul dintre aceşti trei
codoni non sens sau terminali, UAA, UAG sau UGA care nu sunt încărcaţi cu
AA. Când ribozomul întâlneşte un codon terminal sau factorul de eliberare (R1,
R2 si S in E.coli), provoacă: hidroliza polipeptidelor terminale din ARNt-ul
final, cu eliberarea ARNt-ului respectiv din ribozom şi disocierea subunităţilor
mari si mici.
La eucariote, codonul STOP se leagă cu factorii de eliberare din
lanţul polipeptidic (eRF1 si eRF3) care declanşează hidroliza ARNt-peptidil
printr-o peptidiltransferază situată în centrul ribozomului (178, 60).
E coli poate sintetiza o proteină cu greutate de 300-400Da în 10-20
secunde. Deoarece proteina ia forma secundară după ce este sintetizată, aceasta
are deja conformaţia finală atunci când este eliberată din ribozom. La bacterii,
translaţia şi transcripţia intervin simultan.
In celulele nucleate, majoritatea translaţiilor apar în citoplasmă.
Cercetări recente sugerează că translaţia s-ar putea desfaşura şi în
nucleu.
S-a constatat că nucleii conţin factori necesari pentru translaţie (74, 15).
Nucleii izolaţi pot aminoacila ARNt-urile şi încorpora AA în proteine. Un alt
argument pentru translaţia nucleară este acela că degradarea ARNm este
mediată de codonii nonsens. Degradarea ARNm prin codoni de terminare
prematură a fost evidenţiată şi în nucleii mamiferelor. Mai multe investigaţii, au
arătat ca NMD pot sa nu apară în nucleii eucariotelor inferioare (88). Ca şi la
procariote, translaţia nucleară poate necesita transcripţie concurentă (80, 135).

5.3.2 Cadrul de citire al ARNm

Poziţionarea mesagerului în raport cu ARNt de la metionina iniţială

determină cadrul de citire a translaţiei. ARNt (a metioninei ocupă unul din cele
două situsuri de fixare a ARNt pe ribozom: situsul P (el conţine peptide în curs
de sinteză).
Codonul AUG al mesagerului se hibridează în sistusul P cu anticodonul
complementar din ARNt al metioninei plasând mesagerului codonii următori
103
(N1, N2, N3) care vor servi la fixarea noilor aminoacizi încorporaţi.
Nucleotidul N1 va fi tot timpul primul al fiecărui codon (Fig. 5.11).

Fig. 5.11 Cadru de citire (217).

Peptide semnal
Peptidele semnal sunt lanţuri formate din câţiva aminoacizi (15 - 20)
situaţi la extremitatea NH2 terminală a proteinelor traduse, semnalând locul
unde trebuie să fie excretată proteina din celulă. Atunci când o proteină este
sintetizată, structura sa secundară sau terţiară se construieşte din nou şi pe
măsura translaţiei este eliberată în citoplasmă (fig. 5.12).

Fig. 5.12 Sinteza peptidei semnal (243).

Dacă această proteină este destinată membranei sau organitelor celulare,

partea codantă a ARNm începe printr-o secvenţă de câţiva aminoacizi ca adresă
pentru încorporarea ei. Aceste peptide orientează destinaţia proteinelor:
încorporarea în membrană (RE, AG, plasmalemă, lizozomi) în mitocondrii sau
în vezicule condensate pentru exocitoza. Pentru că funcţia acestora este de a

104
penetra prin membrana RE, structura lor este bogată în aminoacizi hidrofobi
(Phe, Leu, Ile, Met, Val).
Fiecare organit prezintă un mecanism de recunoaştere şi încorporare
numai a proteinelor necesare şi specifice lui. Recunoaşterea se realizează
datorită unei secvenţe de aminoacizi pe care o conţine proteina respectivă,
secvenţa semnal şi unui receptor specific care recunoaşte proteina şi o
internalizează. După ce proteina a ajuns la destinaţie, secvenţa semnal este
eliminată prin digestie proteolitică, iar receptorul este eliberat şi reciclat (129).

5.3.3 Poliribozomii şi peptidele semnal

Poliribozomii care se formează pe un mesager conţinând o peptidă

semnal, au o evoluţie uşor diferită. Transducţia se opreşte cu puţin după sinteza
peptidei semnal. Aceasta interacţionează direct cu membrana reticulului
endoplasmatic. Acest lucru este posibil datorită particulei de recunoaştere a
semnalului SRP.
SRP este constituit din diferite proteine şi un ARN 7S (fig. 5.13).

Fig. 5.13 Structura particulei de recunoaştere a semnalului (243).

Dacă interacţiunea peptidei semnal cu SRP are loc în afara structurii

ribozomilor, acesta inhibă elongaţia.
Traducerea se opreşte când SRP este recunoscut de un receptor al
membranei RE. Imediat ce această legătură este stabilită ribozomul este legat de
ribozomii din membrana RE, lângă un complex proteic. Acesta contribuie la
formarea unui canal apos de transport al proteinelor cunoscut sub numele de
translocon, prin care proteina nou formată trece în lumenul, apoi în cisternele
RE. Deci canalul se deschide şi elongaţia se reia (30).
La faţa internă a membranei RE o endopeptidază specifică sau peptidază
semnal va secţiona peptida semnal şi sinteza se va desfăşura până la terminare.
105
SRP se eliberează în citosol şi traducerea este încheiată.
Proteina în final poate fi încorporată într-o membrană datorită secvenţei
semnal de ancorare (fig. 5.14 ) sau exportată pentru traversarea AG către
exteriorul celulei.

Fig. 5.14 Proteine sintetizate şi încorporate în membrane datorită secvenţei

semnal de ancorare (30).

Adresarea proteinelor către mitocondrii face apel la un tip de peptidă de

adresare care conduce peptidele prin traversul membranei mitocondriale în
matrice sau în endomembrane.
Produşii primari de traducere conţinând peptide semnal sunt denumiţi
preproteine, de exemplu preproinsulina, hormonul preproparotidian, etc.

Modificări posttransducţionale
Numeroase modificări chimice se produc după încorporarea
aminoacizilor în structura primară a proteinei (transducţia). Ele se numesc
modificări posttransducţionale. Se disting şi modificări cotransducţionale, care
se produc atunci când transducţia se desfăşoară şi când peptidele formate sunt
încă ataşate la ribozom în celulă, în organite sau în afara celulei. Astfel de
modificări sunt:
a) Proteoliza: fragmentarea peptidei semnal. Proteoliza este o etapă
importantă în maturarea multor proteine. Este implicată în clivarea
lanţului polipeptidic al secvenţei semnal. Secvenţa semnal sau ţinta este
secretată şi va fi recunoscută de receptori din plasmalema membranei
bacteriiilor sau a reticulului celulelor eucariote, în timp ce translaţia se
desfaşoară. Peptidaza semnal este o protează membranară specifică, ce
clivează secvenţa semnal dupa ce lanţul de polipetide trece prin canalul
membranar în timpul translaţiei (141).
Enzimele active sau hormonii, ex. insulina se formează prin clivarea -
106
dintr-un precursor mai mare (fig. 5.15).

Fig. 5.15 Proteoliza

b) Glicozilarea este un proces prin care mai multe proteine în special din
celule eucariote sunt modificate prin adiţia de carbohidraţi;
Glicoproteinele sunt proteine la care aderă lanţuri de carbohidraţi. Sunt
clasificate ca N-likate sau O-likate în funcţie de situsul de ataşare a lanţului de
carbohidraţi, ex. SerO, AsnN (fig. 5.16).

Fig. 5.16. Glicozilarea

peptidelor.

c) Ataşarea lipidelor sau acilarea duce la formarea lipoproteinelor.

N miristoilarea este un proces prin care acidul miristic este ataşat la un
rest glicină amino terminal (fig.5.17). Prin acelaşi mechanism se pot ataşa alţi
acizi graşi palmitic)

107
 Fig. 5.17. Ataşarea lipidelor sau
acilarea

Unele tipuri specifice de lipide sunt ataşate la atomii de sulf din cisteina
localizată lânga C terminal al lanţului polipeptidic (fig. 5.18).

Fig. 5.18 Ataşarea atomilor de

sulf.

Palmitoilarea constă în ataşarea acidul palmitic la atomii de sulf din

cisteinaă (fig.5.19).

Fig 5.19 Ataşarea atomilor de

sulf

Unele proteine din celule eucariote sunt modificate prin ataşarea

glucidelor şi lipidelor la lanţurile de polipeptide. Glicolipidele sunt lipide legate
de oligozaharide care apoi se adaugă grupului C carboxi terminal al unor
108
proteine la partea externă a membranei celulare formând glicoproteine (fig.
5.20).

Fig 5.20 Formarea glicoproteinelor

membranare.

Fosforilarea proteinelor. Protein kinazele catalizează fosforilarea

proteinelor prin transferul grupului fosfat de la ATP la grupul hidroxil al
resturilor de serină, treonină sau tirozină din lanţul polipeptidic (fig. 5.21).

Fig. 5. 21 Fosforilarea proteinelor.

Serin/threonin kinazele sunt protein kinaze care fosforilează resturi de

serină şi treonină.
Tirozin kinazele sunt proteikinaze care fosforilează resturile de
tirozină.
Fosfatazele acţionează ca reversprotein-fosforilaze şi catalizează
hidroliza sau fosforilarea resturilor de aminoacizi (151).
Plierea proteinelor. Protein disulfid isomeraza sau PDI, catalizează
formarea legăturilor disulfhidrice şi joacă un rol important în structura

109
secundară (fig. 5.22).

Fig. 5.22 Plierea proteinelor

prin Protein disulfid
isomeraza sau PDI.

Se numeşte proteină matură, forma chimică definitivă pe care proteina

o are în momentul în care îşi îndeplineşte funcţia în organism.

Organizarea structurală a proteinelor

Lanţurile polipeptidice ale proteinelor se pliază în diferite moduri atât în
cadrul propriului lanţ cât şi între lanţurile vecine adică intracatenar şi
intercatenar. În funcţie de plierea lanţurilor se disting proteine cu structură
secundară, terţiară şi cuaternară (fig. 5.23).

Fig. 5.23 Plierea proteinelor.

110
 Modul de pliere este esenţial pentru activitatea biologică a proteinelor şi
această organizare complicată trebuie conservată pe parcursul procedurilor
implicate în purificarea proteinelor. Mult timp s-a considerat că modurile de
pliere ale lanţurilor polipeptidice sunt determinate numai de secvenţa
aminoacizilor din lanţ. Astăzi s-a stabilit că proteinele având aceeaşi secvenţă a
aminoacizilor pot exista în forme diferite de împachetare şi că astfel de plieri
pot fi influenţate de prezenţa altor proteine cunoscute sub numele de molecule
supraveghetoare (chaperon) (fig5.24).

Fig. 5.24 Proteine supraveghetoare (chaperon).

5.3.4 Denaturarea şi renaturarea proteinelor

O proteină care posedă o proprietate biologică proprie, unică, se

numeşte proteină nativă şi ea se deosebeşte de proteina ce şi-a pierdut această
proprietate şi pe care o numim de aceea denaturată. O proteină denaturată şi-a
pierdut structura tridimensională sau în alţi termeni conformaţia sa (fig. 5.25).

111
Fig. 5.25 Denaturarea reversibilă a proteinelor.

Denaturarea poate fi reversibilă sau ireversibilă. Un exemplu de

denaturare ireversibilă este cea termică aplicată la fierberea unui ou; albuşul
oului (albumina) se coagulează astfel ireversibil. De fapt acesta este un
eveniment obişnuit în timpul gătitului care face ca proteinele să fie mult mai
uşor atacabile de către enzimele proteolitice după ingestia alimentelor.
Denaturarea reversibilă se poate realiza prin folosirea atentă a unor
reactivi ca ureea şi mercaptoetalonul. Ureea desface structura apei şi limitează
interacţiunile hidrofobe ale catenelor laterale R şi ale resturilor de aminoacizi,
ceea ce duce la deplierea şi la disocierea moleculelor proteice.
Mercaptoetanolul reduce legăturile S-S (32). De aceea la îndepărtarea ureei şi a
mercatoetanolului, proteina s-ar putea renatura (fig. 5.26).

Fig. 5.26 Denaturarea

reversibilă sub acţiunea
mercatoetanolului
reduce legăturile S-S.

Renaturarea este interpretată ca o dovadă în sprijinul ipotezei că o

proteină având o structură primară corectă se va plia în mod spontan conducând
112
la structura unică responsabilă pentru activitatea sa biologică. Acest fenomen
este denumit autoansamblarea proteinei.
Renaturarea proteinelor poate fi produsă pe două căi. Una implică
proteina disulfid izomeraza o enzimă care are rolul de a corecta legăturile S-S
greşit formate. A doua cale implică structurile tip molecule supraveghetoare
(chaperone). Ele sunt o familie de proteine din clase neînrudite care mediază
asamblarea corectă a altor polipeptide dar care nu sunt componente ale
structurilor funcţionale asamblate.

Degradarea proteinelor
Degradarea intracelulară a proteinelor se realizează prin două sisteme
generale: lizozomal şi al ubiquitinei.
Sistemul ubiquitinei. Ubiquitina este o polipeptidă acidă de 76
aminoacizi care este prezentă efectiv în toate tipurile celulare, de unde şi
numele său (102).
Ubiquitina este activată prin interacţiunea ATP cu 2 enzime. Complexul
rezultat se ataşează de proteina ţintă ce urmează a fi degradată. Nu se ştie în
totalitate modul cum sunt selectate proteinele-ţintă pentru degradare, dar s-a
constatat o corelaţie strânsă între natura aminoacidului N-terminal şi a acelora
care îl urmează, cu timpul de supravieţuire a unei proteine în celulă.
Figura 5.27 arată distrugerea programată a proteinelor citosolice prin
sistemul de reperare al ubiquitinei. Aceste evenimente au loc într-un complex
multiproteic numit proteazom, a cărui structură este cunoscută.

Fig. 5.27 Degradarea proteinelor de către

ubiquitină.
113
 6. MUTAŢIILE

6.1 Scurt istoric

Jean-Baptiste Lamarck (1744-1829) a propus în 1801 teoria moştenirii

caracterelor dobândite” induse de către mediul înconjurător, cunoscute ca
transformare sau transmutaţie. Ideia a fost ignorată sau criticată dur în timpul
vieţii sale. Niciodată nu a fost acceptat şi stimat de colegii săi şi a murit în
sărăcie şi obscuritate. Astăzi, Lamarck este asociat cu teoria eredităţii.
Charles Darwin (1809-1882) a arătat ca adevăratele variaţii adaptative
rezultă prin mutaţii întâmplătoare şi selecţie naturală (1859, Originea speciilor).
Contrar lui Lamarck, moştenirea trăsăturilor dobândite nu rezultă prin influenţa
mediului înconjurător. De-a lungul vieţii Darwin a redescoperit rezultatele
controversate ale lui Mendel privind importanţa relativă a mutaţiei şi selecţiei.
Noţiunea de mutaţie a fost elaborată în anul 1901 de către Hugo de
Vries care este autorul binecunoscutei teorii mutaţioniste. Mutaţia poate fi
definită ca fenomenul prin care se produc modificări în materialul genetic ce nu
sunt provocate de recombinarea genetică sau de segregare. Ele pot apărea în
mod spontan şi atunci sunt denumite mutaţii naturale, sau pot fi induse
experimental, fiind deci vorba de mutaţii artificiale. Între aceste două tipuri de
mutaţii nu sunt deosebiri de ordin calitativ.
Salvador Luria şi Max Delbrück (1943) a concluzionat că o populaţie de
E. coli care porneşte de la o singură bacterie ar trebui să exprime modele
diferite privind rezistenţa la fagul T1.
Conform teoriei adaptării, acestor bacterii le este indusă rezistenţa
când este adăugat fagul T1; proporţia celulelor rezistente ar trebui să fie aceeaşi
pentru toate culturile cu acelaşi fond genetic.
Conform teoriei mutaţiilor, aceste evenimente întâmplătoare conferă
rezistenţă la T1. Culturile duplicate cu acelaşi fond genetic trebuie să exprime
rezistente la T1 în proporţie diferită.
Fagii T1 sunt deficienţi la End A ceeea ce favorizează obţinerea
plasmidelor de înaltă calitate pentru clonare.
Mutaţiile pot fi definite (Mayr-1963) şi ca "modificări discontinue cu
efect genetic". Ele pot afecta diferite unităţi ale materialului genetic.
Variabilitatea genetică este determinată, pe de o parte, prin
recombinare şi pe de altă parte, prin mutaţii.
Tipuri de variabilitate şl rolul lor în evoluţie. Din punctul de vedere
al semnificaţiei lor în relaţiile organismului cu mediul, ca şi în procesul
evoluţiei (deci ca fenomen individual), variaţiile se pot împărţi în două mari
categorii:
a) variabilitate care afectează structura genotipului şi, din această
cauză, se poate transmite la descendenţi;
114
 b) variabilitate care afectează doar caracterele fenotipice,
genotipul rămâmând neschimbat; asemenea variaţii nu se pot
transmite la descendenţi. Din prima categorie fac parte mutaţiile, în
sensul cel mai larg al acestei noţiuni, şi recombinările genetice.
Variabilitatea genetică determinată prin recombinare constă în
realizareaa unor combinaţii genetice noi prin rearanjarea sau redistribuţia
materialului genetic care provine de la genitori. In procesul recombinării pot
fi implicate unităţi genetice diferite, adică genomul, cromozomul sau gena,
astfel încât recombinarea poate fi genomică, cromozomială şi genică.
Recombinarea genomică se produce în momentul fecundării.
Variabilitatea genetică se realizează prin recombinarea genomică, dar
numai cu condiţia esenţială ca genomurile care se încrucişează să fie cât mai
diferite. In cursul formării gameţilor, se produc fenomene genetice specifice
diviziunii meiotice. Pot avea loc 2 tipuri de recombinare: intercromozomială,
în care sunt implicaţi cromozomi omologi întregi şi intracromozomiala, la
care participă segmente de cromozomi omologi. La baza variabilitaţii pot sta
configuraţii genetice nou-realizate prin schimburi reciproce de segmente din
cromatide între cromozomii omologi şi are loc în profaza meiozei primare.
Recombinările între cromozomii omologi pot duce la schimbul de
fragmente, sau de catene întregi de ADN. În meioză, aceste schimburi se produc
frecvent între cromozomul de origine maternă şi paternă, astfel încât genele
cromozomilor din celulele fiice, sunt recombinări heterogene ale fragmentelor
cromatidice.
Rezultatul implică un amestec de caractere ereditare ale celor doi părinţi
şi constituie patrimoniul noului individ. Schimburile garantează menţinerea
fiecărei gene, a fiecărui locus sub formă de alelă homozigotă, sau heterozigotă.
Prin mutaţie se înţelege o modificare nenaturală adică anormală şi
ereditară a materialului genetic, deci schimbarea mesajului genetic.
Mutaţia poate produce o schimbare detectabila a fenotipului unei celule
sau individ. Mutaţiile care apar într-o celulă somatică se pot transmite prin
mitoză celulelor fiice, deci pot constitui punctul de pornire pentru formarea unei
linii celulare anormale, care are posibilitatea de a modifica structura şi funcţia
unor ţesuturi sau organe.
Mutaţiile apărute în celulele somatice nu se transmit prin gameţi
generaţiilor următoare. In funcţie de mărimea materialului genetic interesat –
genă, cromozom, genom – se pot descrie 3 tipuri de mutaţii, corespunzătoare
fiecărei unităţi genetice de interes:
- mutaţii genice ce pot interesa întreaga genă, mai multe nucleotide
sau unul singur - perechea de nucleotide este cea mai mică unitate
de mutaţie- ;

115
 - mutaţii cromozomiale sunt modificări structurale ale
cromozomilor ce constau în pierderea, câştigul sau rearanjarea unor
segmente cromatidice;
- mutaţii gemomice sunt modificări ale numărului diploid 46 de
cromozomi întregi, afectând fie 1-2 perechi cromozomi –
aneuploidie, fie toţi cromozomii, prin adăugarea a 1-2-3 seturi
haploide –poliploidie (37, 38).

6.2 Mutaţiile genice

Unitatea elementară a eredităţii este gena. Ea reprezintă o particulă

materială diferenţiată în materialul genetic care controlează sau condiţionează
manifestarea uneia sua mai multor caracteristici ereditare ale unui organism.
Poziţia ocupată de genă în cromozom se numeşte locus. Ca urmare a
mutaţiei, o genă poate prezenta mai multe variante, denumite alele din care
numai câte una singura există în fiecare cromozom (fig. 6.1). Rezultă că în
organismele diploide pentru fiecare caracteristică există două gene alele, în timp
ce în organismele haploide există o singură genă. Alelele se unesc prin
fecundare (în zigot, cu structura 2n) şi se separă prin diviziune reducţionala (în
gameti n).
Mutaţiile genice reprezintă modificări ale structurii şi funcţiei genei.
Ele constau într-o modificare survenită în secvenţa normală a nucleotidelor care
intră în structura genei. Gena poate fi definită modern ca fiind un segment
polinucleotidic al moleculei de ADN care deţine, sub formă codificată,
informaţia genetică necesară sintezei unei proteine cu structură şi funcţie
specifică.
Genele sunt redate prin simboluri din 1 - 5 litere, care desemnează
succint caracterul afectat în limbile latină sau engleză. Tipul normal (sălbatic) al
caracterului respectiv se notează cu semnul „+”. Genele apărute prin
modificarea genelor normale sunt numite gene mutante. De regulă, genele
sălbatice sunt dominante (predomină în prima generaţie). Ca rezultat al
procesului de mutaţie, una şi aceeaşi genă poate apărea sub mai multe forme
discrete, cunoscute sub denumirea de alele. Alelele sunt expresii diferenţiate ale
unui caracter. În cazul în care gena a suferit mai multe procese mutaţionale în
aceşti loci se pot găsi gene polialele. În funcţie de plasarea lor în autozomi sau
heterozomi, genele pot fi autozomale sau heterozomale.
În cazul plasării lor în heterozomi, genele manifestă fenomenul de sex-
linkage, transmiţându-se cu frecvenţă mai mare la unul dintre sexe (29, 30).
După funcţia lor, genele sunt divizate în: structurale, reglatoare şi
operatoare.
Genele structurale codifică diferite proteine cu rol structural sau
enzimatic.
116
 Genele operatoare declanşează sau nu activitatea celor structurale.
Genele reglatoare controlează şi dirijează activitatea genei operatoare şi
a celei structurale.
Genele sunt localizate în cromozomi, aranjate liniar fiecare ocupând un
loc bine definit, care se numeste „locus”. Pornind de la această idee, a fost
elaborată concepţia clasică, conform căreia gena are trei caracteristici de bază:
- unitate funcţională determină caracteristicile ereditare;
- unitate mutaţională structura chimică a genei se schimbă prin
mutaţie, ceea ce duce la apariţia caracterului nou;
- unitate de recombinare în cadrul procesului de crossing-over are
loc un schimb de gene corespunzătoare între cromatidele
cromozomilor omologi.

Fig 6.1 Clasificarea mutaţiilor

(http://www.imgt.org/IMGTeducation/IMGTlexique/M/mutation.png).

117
 În funcţie de modul cum se produce această modificare, mutaţiile genice
se produc prin:
- substituţie, înlocuirea unei perechi de nucleotide prin alta,
- adiţie sau adăugarea uneia sau a mai multor perechi de nucleotide şi
- deleţii (pierderi) ale unei perechi de nucleotide (30).
Mutatiile prin substituţie
Substituirile se pot produce în două moduri diferite — prin tranziţie
şi prin transversie.
În cadrul tranziţiilor, o bază azotată este înlocuită cu o altă bază din
aceeaşi categorie. De pildă, o bază purinică este înlocuită printr-o altă bază
purinică, adică A↔G. Se înţelege că deoarece o bază purinică dintr-un lanţ
nucleotidic al ADN este legată de o anumită bază pirimidinică (complementară)
din celălalt lanţ, această înlocuire va atrage şi înlocuirea bazei pirimidinice
corespunzătoare din lanţul complementar. Deci, în exemplul dat, se va produce
înlocuirea: A-T↔G-C (tabel 6.1).
În cazul transversiei, o bază purinică este înlocuită cu alta pirimidinică
(sau invers). Se pot produce următoarele substituiri prin transversii A-T↔C-G;
A-T↔T-A; G-C↔C-G; G-C↔T-A. Prin urmare, în ambele cazuri, în ultimă
instanţă o pereche de baze este înlocuită prin altă pereche ceea ce determină
transformarea unui codon (a unui triplet) în altul, fapt care duce la modificări în
sinteza lanţurilor polipeptidice.
In urma unei substituiri rezultă două feluri de codoni:
- unii sunt similari celor trei codoni non-sens şi mutaţiile se numesc
non-sens;
- alţii codifică alt aminoacid, mutaţiile având sens fals. Mutaţiile prin
substituţie sunt relativ frecvente.
Substituţia duce la modificarea unui singur codon (sens sau non sens).
Schimbarea unui codon sens va determina unul din următoarele efecte:
- A. schimbarea aminoacidului codificat de codonul iniţial, normal
prin alt aminoacid, codificat de codonul substituit;
- B. Mutaţia neutră diferită: determină substituirea bazei pereche
substituirea unui aminoacid cu altul cu proprietăţi chimice similare,
funcţia proteinei nu este alterată;
- C. Mutaţie non-sens, oprirea sintezei proteinei, în cazul în care noul
codon format prin substituţie este un codon non sens sau stop;
- D. Mutaţie asemănătoare/mutaţii discrete. În urma substituţiei bazei
pereche are loc păstrarea structurii iniţiale, normale a proteinei
deoarece codonul rezultat prin substituţie este ,sinonim, cu cel
modificat (codifică acelaşi aminoacid);
- E. Mutaţii prin schimbarea scheletului. Deleţia sau inserţia
(nedivizibile cu 3) determină translaţia unui aminoacid incorect, a

118
 codonilor stop (polipeptide scurte) sau citirea incorectă a codonilor
stop (polipeptide lungi).

Tabel 6.1
Tipuri de mutaţii
SECVENŢA UNEI PĂRŢI DINTR-O GENĂ SECVENTA GENEI MUTANTE
NORMALĂ
MUTAŢIE TIP TRANZIŢIE AT ÎN GC ÎN ACEST EXEMPLU
5TCTCAAAA*ATTTACG 5 TCTCAAAG*ATTTACG 3
3AGAGTTTT*TAAATGC 3 AGAGTTTC*TAAATGC 5
MUTAŢIE TIP TRANSVERSIE CG ÎN GC ÎN ACEST EXEMPLU
5TCTC*AAAATTTACG 5 TCTG*AAAAATTTACG 3
3AGAG*TTTTTAAATGC 3 AGAC*TTTTTAAATGC 5
ERORI MUTAŢIONALE (ÎNLOCUIREA UNUI AMINOACID CU ALTUL ÎN ACEST EXEMPLU,
TRANZIŢIA AT ÎN GC SCHIMBĂ CODONUL PENTRU LIZINĂ ÎN CEL PENTRU ACID
GLUTAMIC)
5 TCTCAA*AAT*TTACG 5 TCTCAA*GAT*TTACG 3
3 AGAGTT*TTT*AAATGC 3 AGAGTT*CTT*AAATGC 5
Ser Gln *Lys Phe Thr Ser Gln * Glu Phe Thr
MUTAŢIE NONSENS (ÎNLOCUIREA UNUI AMINOACID ÎN CODONUL STOP; ÎN ACEST
EXEMPLU, TRANSVERSIA DIN AT ÎN TA, SCHIMBĂ CODONUL PENTRU LIZINĂ ÎN UAA STOP
CODON)
5 TCTCAA*AAT*TTACG 3 5 TCTCAA*TAT*TTACG 3
3 AGAGTT*TTT*AAATGC 5 3 AGAGTT*ATT*AAATGC 5
Ser Gln *Lys *Phe Thr Ser Gln *Stop*
MUTAŢII NEUTRE (ÎNLOCUIREA UNUI AMINOACID CU UN ALT AMINOACID CU
PROPRIETĂŢI SIMILARE; ÎN ACEST EX., TRANZIŢIA AT ÎN CG SCHIMBĂ CODONUL PENTRU
LIZINĂ ÎN CODON PENTRU ARGININĂ)
5 TCTCAA*AAT*TTACG 5TCTCAA*GAT*TTACG
3AGAGTT*TTT*AAATGC 3AGAGTT*CTT*AAATGC
Ser Gln *Lys * Phe Thr Ser Gln *Glu* Ile Tyr
MUTAŢII DISCRETE (ÎNLOCUIREA CODONULUI ASTFEL ÎNCÂT RĂMÂNE ACELAŞI
AMINOACID SPECIFIC; ÎN ACEST EX, TRANZIŢIA AT ÎN GC ÎN POZIŢIA A 3-A DIN CODON, DĂ
UN CODON CARE CODIFICĂ TOT LIZINA)
5TCTCAA*AAT*TTACG 3 5 TCTCAAAAGTTACG 3
3AGAGTT*TTT*AAATGC 3 AGAGTTTTCAAATGC 5
Ser Gln * Lys* Phe Thr Ser Gln Lys Phe Thr
MUTAŢII PRIN SCHIMBAREA SCHELETULUI (ADIŢIA ORI DELEŢIA UNEIA SAU A UNOR
PUŢINE BAZE PERECHI CONDUCE LA SCHIMBAREA CITIRII SCHELETULUI; ÎN ACEST EX,
INSERŢIA UNEI BAZE PERECHI GC, SCHIMBĂ MESAJUL DUPĂ GLUTAMINĂ)
5 TCTCAA*AAT*TTACG 3 5 TCTCAA*GAT*TTACG 3
3 AGAGTT*TTT*AAATGC 5 3 AGAGTT*CTT*AAATGC 5
Ser Gln *Lys * Phe Thr Ser Gln * Glu* Ilee Tyr

Mutaţii punctuale
Mutaţiile punctuale constau în substituţie, supresie (lipsă) sau adiţia de
baze (fig. 6.2). Se realizează prin:
- depurinare (pierderea purinelor) ;
- dezaminare (citozina metilată trece în timină pe catena sens şi G-A
pe catena antisens);
- erori de replicare sau de reparaţie.
119
 Fig. 6.2 Mutaţie punctiformă prin substituţie (244).

Inversia unui nucleotid prin altul va duce la modificarea unui codon şi

lectura sa în sens invers. Consecinţele inversiei sunt aceleaşi ca şi la substituţie.
Prin deleţie se înţelege lipsa, pierderea uneia sau mai multor perechi de
nucleotide din molecula de ADN. Natura anomaliei produse va depinde de
numărul de perechi de nucleotide implicat în deleţie.
Deleţiile, ca şi adiţiile unor perechi de baze, schimbă complet secvenţa
aminoacizilor, deci structura proteinei, deoarece modifică citirea codonilor
pornind de la punctul în care s-a produs mutaţia (37, 38).
Deleţia are importanţă variabilă în funcţie de lungimea segmentului
afectat:
- de la 1 la 2 nucleotide ele decalează cadrul lecturii (fig. 6.3), se
poate forma un codon STOP prematur (fig 6.4);

120
Fig. 6.3 Mutaţie prin deleţia unei nucleotide determină modificarea cadrului
de lectura; dincolo de mutaţie apar aminoacizi diferiţi (245).

- la 3 nucletotide, duce la absenţa unui codon şi deci supresia (lipsa)

aminoacidului corespunzător în proteinele exprimate;
- mai mari, pot suprima expresia unuia sau a mai multor exoni sau a
genei în întregime (213, 214).

Fig.6.4 Mutaţie prin apariţia unui codon STOP prin decalarea cadrului de
lectură (245).

121
 De pildă, o succesiune iniţială a codonilor poate fi: ATG, ACG, AGT,
GCC, ATC... Dacă din primul codon se pierde T, atunci secvenţa devine AGA,
CGA, GTG, CCA, TC,. .. deci modificată complet. Deoarece substanţele
proteice pot avea rol enzimatic sau structural, o asemenea mutaţie va putea
afecta fie activitatea enzimatică, deci desfăşurarea unor căi metabolice cu
consecinţele ce decurg din ele, fie direct structurile. Experiente pe Drosophila,
de pildă, au arătat că mutaţiile genice pot afecta cele mai diferite caractere
morfologice (dimensiuni, culori, chemotaxia, forma organelor etc), fiziologice,
de dezvoltare, de rezistenţă la diferiţi factori etc. Mutaţiile genice reprezintă cea
mai importantă sursă de noi caractere. Efectul lor genetic constă, de fapt, în
adăugarea de noi alele (noi expresii) ale unui locus şi, deci, îmbogăţirea
patrimoniului ereditar al indivizilor şi populaţiilor (210, 212).
Mutaţia odată apărută se transmite generaţiilor următoare.

Mutaţii prin inserţie

Inserţia sau adiţia înseamnă introducerea unui nucleotid în mesajul unei
gene. Din punctul de inserţie lectura codonilor se va face decalat, fals,
realizându-se o proteină cu secvenţă anormală. Inserţiile sunt de importanţă
variabilă în funcţie de lungimea lor:
- de la 1-2 nucleotide, decalează cadrul de lectură (fig.6.5);
- inserţia a 3 nucleotide, conduce la introducerea unui aminoacid în
proteina exprimată (fig. 6.6);
- cele de lungime mare pot modifica complet transducţia exonilor.
În intronii sau în exonii netraduşi se întâlnesc adesea inserţii lungi, de
structură variabilă, care sunt fără efect aparent asupra expresiei genei (7, 8).

Fig.6.5 Mutaţie prin inserţie (245).

122
 Fig. 6.6 Mutaţie prin duplicaţie, adiția a sase nucleotide (245).

Reversia sau mutaţia supresivă, este o mutaţie care interesează o altă

mutantă, determinând revenirea la fenotipul normal-sălbatic. Reversia adevarată
transformă codonul mutant în normal iar reversia numită supresivă produce o a
doua mutaţie, diferită ca poziţie de prima dar care corijează efectul ei.
Duplicaţii şi hiperduplicaţii au avut ca rezultat de ex. catenele
polipeptidice alfa, beta, gama, delta, care se găsesc în hemoglobinele normale
(52).

Mutaţii în genele de reglare

Sinteza proteinelor codificate de genele structurale este reglată prin
intervenţia unor gene operatoare şi reglatoare. Mutaţiile în gena operatoare
pot determina fie blocarea, fie activarea continuă a transcripţiei. Acestea
determină, prin oprirea transcripţiei, deficienţa concomitemtă a mai multor
enzime, controlate de genele incluse în acelaşi operon.
Mutaţiile în genele reglatoare duc la schimbarea tipului sau
ritmului de sinteză proteică.

Mutaţii care controlează expresia unei gene

Sunt situate în zona reglatoare a genei, de exemplu:
- în promotor la nivelul codonului de iniţiere a transcripţiei sau la
nivelul situsului de poliadenilare. Pot fi situate pe gene codante
pentru proteine care intervin în reglarea expresiei, exemplu pentru
factori de transcripţie.

123
 Mutaţii de replicare sau dinamice
Sunt erori ale replicării mitotice sau premeiotice care determină o
alunecare a unor zone presupuse instabile ale genomului. Ele determină o
amplificare (mutaţie dinamică) sau o reducere a zonelor repetate. Persistă mai
multe generaţii şi cresc în cursul generaţiilor. Se regăsesc în anumite maladii
genetice pentru care s-a observat fenomenul de anticipare şi rezultatul
instabilităţii repetiţiei di sau trinucleotidice. Numărul de repetiţii de
trinucleotide este foarte variabil în genom de la un subiect la altul (polimorfism
multialelic). Acestea sunt utilizate ca markeri genetici. Când se depăşeşte un
anumit număr de repetiţii pe locus au efect patologic.
Mutaţiile genetice sunt responsabile de expansiunea secvenţelor scurte
(CGG) în boala X fragil (cu număr de repetiţii peste 50). Într-o primă generaţie
se observă o premutaţie care conţine un număr de repetiţii peste normal. În
generaţia următoare creşte numărul, premutaţia devine mutaţie şi apare boala la
o vârstă precoce. Aceste expansiuni îşi schimbă mărimea în timpul transmiterii
bolii de la părinţi la copii (cromozomul X) (61, 62).
Aceste mutaţii sunt dinamice şi explică variabilitatea fenotipului,
penetranţa şi bolilor genetice în care apar.

Fig. 6.7 Transmiterea mutaţiilor la progenitori (243).

124
 6.2.1 Originea mutaţiilor genice

Mutaţiile genice pot fi spontane sau induse. Cele spontane sunt

determinate de factori necunoscuţi, imposibil de definit. Cele induse sunt
determinate prin acţiunea unor factori cunoscuţi fizici, chimici sau
biologici.
Mutaţiile spontane- ar putea fi determinate de radioactivitatea
naturală terestră şi iradierea internă. Există variaţii regionale- geografice
determinate de soluri cu radioactivitate sporită sau de altitudine înaltă, deci
cantitate mai mare de raze cosmice. Frecvenţa unor afecţiuni ereditare diferă de
la o localitate la alta, în corelaţie cu valoarea iradierii locale.
Razele UV (260 nm) şi radiaţiile solare cu lungime de undă mică
determină formarea de dimeri de pirimidină prin legături C=C; T=T. ADN pol
citeşte greşit rezultând mutaţii (expunerea prelungită la soare favorizează
cancerul de piele).
O problemă în studiu rămâne creşterea radioactivităţii ambiante,
determinată eventual de activităţi umane din centralele nucleare, extracţia de
minereu radioactiv, explozii nucleare. Deşi are loc cu doze mici generează o
creştere slabă dar reală a frecvenţei bolilor dominante (8). Accidentele nucleare
(Cernobîl, 1986, Fukushima, 2011) constituie surse îngrijorătoare de creştere a
radioactivităţii naturale şi a riscului de cancer sau alte boli produse prin mutaţii.
Mutaţiile induse sunt determinate de agenţi care au capacitatea de a
produce mutaţii cu o frecvenţă superioară celor spontane. Factorii mutageni
sunt fizici (radiaţii UV, ionizante), chimici (agenţii alchilanţi), biologici
(virusuri, unele toxine) (fig 6.8).

Fig. 6.8 Efectul razelor ultraviolet (246).

125
 Ei determină citirea greşită a ADN în timpul replicării determinând -
mutaţie- principiul care stă la baza acţiunii unor citostatice - baze analoage.
Radiaţiile Ionizante (α, β, γ), se caracterizează prin: energie mare,
fragmentează ADN, având efect mutagen puternic, uneori chiar letal (fig. 6.9).

Fig. 6.9. Efectul razelor ionizate. 5brom-uracilul complementar adeninei

devine sub efectul radiaţiilor ionizate preferat de guanină (246).

Agenţii Alkilanţi introduc grupări alkil (metil, etil) în bazele

componente ale ADN şi perturbă citirea (fig. 6.10).

Fig. 6.10. Prezenţa grupărilor metal, etil perturbă citirea (246).

126
 UV (254-260 nm) determină formarea de dimeri anormali de purine şi
pirimidine pe care le încorporează în catene de ADN (fig. 6.11).

Fig. 6.11. Razele UV determină formarea dimerilor de timină (239).

Efectul mutagen al iradierii experimentale a fost demonstrat în 1927 de

H.J.Muller de la Drosophila (premiul Nobel). El a ajuns la următoarele
concluzii:
- numărul mutaţiilor induse este direct proporţional cu doza de
iradiere aplicată;
- radiaţiile ionizante produc mutaţii chiar în doze mici, nu există un
prag al acţiunii lor mutagene;
- efectul radiaţiilor este cumulativ, indiferent de distribuţia lor în
timp, ceea ce contează este doza totală primită, totuşi s-a observat
că iradierea cronică are efect de 2- 3 ori mai mic decât iradierea
acută (109).

Efectul mutagen al substanţelor chimice a fost descoperit în timpul

celui de-al doilea război mondial, de o echipă de geneticieni englezi care au
demonstrat acţiunea mutagenă a iperitei, substanţă toxică, folosită ca armă
chimică în primul război mondial în oraşul Ypres.
De atunci numărul cercetărilor ca şi al substanţelor chimice mutagene
cunoscute a crescut enorm. In fiecare an se sintetizează 30 000 de substanţe noi,
din care cel puţin 15 sunt sigur mutagene. Din acest motiv toate substanţele
chimice nou sintetizate care vin în contact cu omul sau cu mediul său de viaţă
(medicamente, aditivi alimentari, pesticide etc.) sunt testate pentru potenţialul
mutagen şi cancerigen. Este cunoscut potenţialul mutagen al gudroanelor din
fumul de tutun.
Substanţele chimice mutagene pot fi grupate în două categorii:
- substanţe ce interferează sinteza ADN;
- substanţe ce alterează structura ADN.
Producerea de chimioterapice cu efect antitumoral se bazează pe
substanţe chimice mutagene, care opresc dezvoltarea celulelor tumorale. Din
127
această categorie fac parte agenţii alchilanţi care introduc grupări alkil în
structura bazelor azotate şi perturbă citirea. Din păcate activitatea
chimioterapicelor antitumorale nu este strict specifică. Este inhibată şi
dezvoltarea altor celule /ţesuturi cu ritm mare de autoreînoire (leucocite, celule
epiteliale etc.), ceea ce explică efectele secundare, nedorite ale acestor
medicamente. Unele micotoxine (tricotecenii, aflatoxina etc.) au de asemena
potenţial mutagen şi cancerigen.

Mutaţiile genice reprezintă cea mai importantă sursă de noi caractere.

Efectul lor genetic constă, de fapt, în adăugarea de noi alele (noi expresii) ale
unui locus şi, deci, îmbogăţirea patrimoniului ereditar al indivizilor şi
populaţiilor.

Consecinţele mutaţiilor genice

Efectul primar al mutaţiilor genice îl reprezintă modificarea secvenţei
aminoacizilor în moleculele polipeptidice sintetizate pe baza informaţiei acestor
gene. Efectul biologic depinde de tipul de aminoacid substituit şi de locul său
particular în molecula polipeptidică.

Efectul mutaţiilor genice depinde şi de tipul de celulă afectată,

germinală sau somatică. Mutaţiile germinale se transmit prin gameţi la
descendenţi. Cele somatice nu se transmit la urmaşi dar determină apariţia unor
clone anormale. În cazul în care aceste clone persistă, nu sunt eliminate de
organism şi evoluează, vor modifica structura şi funcţia unui ţesut sau organ.
Prin mutaţii somatice se înţeleg toate modificările transmisibile care
apar în genomul celulelor somatice. Ele pot fi genice sau cromozomale (36).

6.2.2 Activitatea unui situs criptic de excizie

În afara zonelor de excizie normală există situsuri criptice care pot fi

activate. Pot fi situate în exon producându-se episaj anormal al exonului sau în
intron, o porţiune din intron regăsindu-se în paralel, în produsul transcris matur.
Cel mai adesea apare un codon STOP în aval.
O substituţie, poate altera un situs de legare. Astfel, situsul donator al
intronului 3 a apoAII este transformat din GT în AT într-o familie de bolnavi,
ceea ce-l face inactiv pentru excizia acestui intron.
Există în mijlocul exonului 3, o secvenţă care poate servi ca situs
donator alternativ dar, care este normal inactiv (situs donor criptic). În absenţa
situsului donator normal, acest situs criptic va servi la excizia intronului 3. Dar
cum acest situs criptic este situat la 65 nucleotide în amonte de situsul normal,
vor exista 22 aminoacizi ai exonului 3 care nu vor fi traduşi. Pe de altă parte
numărul de nucleotide pierdute nefiind un nultimplu de 3, va avea loc un
128
decalaj al cadrului de citire, care antrenează o traducere falsă a primilor 10
aminoacizi ai exonului 4 şi întâlnirea unui codon STOP prematur (30, 102)
(Fig. 6.12).
Proteinele întrerupte nu se exprimă şi apolipoproteina AII este absentă
din plasma acestor bolnavi.

Fig. 6.12 Mutaţia unui situs de excizie.

6.2.3 Transpoziţia

Transpoziţia reprezintă încorporarea unei secvenţe de ADN nou într-o

regiuune de ADN genomic al unei celule (fig. 6.13).

Fig. 6.13 Elemente transpozabile inserate. (238)

129
 În cursul evoluţiei speciilor, genomul creşte continuu, printr-o suită de
duplicaţii de gene şi transpoziţii (fig. 6.14).

Fig. 6.14 Transpoziţii la nivelul genelor (243).

Duplicările se produc în tandem; o secvenţă se găseşte repetată de 2-3

ori într-un genom, în urma duplicării.
Această duplicaţie permite fiecarei copii de secvenţe să evolueze pe cont
propriu ceea ce creşte şansa de producere a unor caractere noi.
Transpoziţiile rezultă prin încorporarea acizilor nucleici sintetizaţi din
afara genomului, prin:
- încorporarea unui virus;
- transcripţia inversă a unui ARN celular, sau a unui virus prin
intermediul unei reverstrancriptaze, care produce un ADN
complementar (ADNc) şi o transpozază care-l va încorpora în
genomul celulei (fig. 6.15).
Transpozazele sunt grupuri de enzime codificate de elemente genetice
mobile, cum ar fi transpozonii sau secvenţele de inserţie, care excizează şi
inseră aceste elemente mobile. Sunt proteine formate din 340-380 aminoacizi,
fiind implicate în recombinarea ADN în locuri specifice bacteriilor şi altor
organisme (112).

130
 Fig. 6.15 Transpozonul (239)

6.2.4 Reverstranscripţia la virusuri

ARN din HIV (virusul imunodeficienţei umane) atunci când pătrunde în

sânge este recunoscut de receptorul CD4 al limfocitului T4. Formarea
complexului receptor-virus antrenează fuziunea anvelopei virusului şi a
membranei limfocitului şi prin urmare virusul pătrunde în citoplasmă. Virusul
conţine o enzimă reverstranscriptază şi un ARN purtător al informaţiei genetice.
Enzima catalizează retrotranscripţia ARN viral în ADN şi încorporează acest
ADN (provirus) în ADN-ul limfocitului.
Provirusurile produc noi particule virale prin transcripţie şi se traduc
prin moartea celulei şi distrugerea ADN-ului său.
Particulele virale noi sunt eliberate pentru a transmite semnalul altor
LT4. Numărul LT4 diminuează până când răspunsul imun al subiecţilor devine
insuficient (SIDA), ceea ce antrenează infecţii oportuniste şi se termină cu
moartea indivizilor afectaţi (4).
131
 Ciclul unui retrovirus
Particula de retrovius este compusă dintr-un înveliş proteic înconjurând
o capsulă proteică care conţine patrimoniul genetic al retrovirusului sub formă
de ARN monocatenar. Acesta este structurat din genele:
- transcripţiei reverstranscriptazei şi
- ale proteinelor de înveliş (anvelopa) (fig. 6.16).

Fig. 6.16. Ciclu unui retrovirus (242).

Când infectează o celulă numai ARN penetrează şi traversează

membrana în citoplasma, el se exprimă ca un mesager. Reverstranscriptaza
sintetizată este o enzimă capabilă de:
- transcripţie inversă a ARN viral în ADN complementar (hibrid
ARN, ADN);
- distrugerea ARN pentru a-l înlocui cu o a II-a catenă ADN.
ADN dublu catenar se transpune în ADN nuclear al celulei gazdă, de
unde el poate fi transcris în multiple copii de ARN viral (fig. 6.17).

132
 Fig. 6.17 Ciclul unor virusuri (ARN, ADN) în celula eucariotă (239).

Transducţia acestui ARN conduce la sinteza de proteine, care se

asamblează în jurul ARN, pentru a constitui noi particule virale în număr foarte
mare (amplificarea virusului).
În final celula gazdă moare şi pune în libertate particule virale infectante
şi ciclu reîncepe (164).

6.2.5 Duplicarea genei

Numeroase situaţii pot conduce la duplicarea fragmentelor de ADN.

Aceste duplicări sunt facilitate de existenţa unei secvenţe repetitive directe
(secvenţa identică în acelaşi sens, la mică distanţă pe aceeaşi catenă ADN).
Într-o buclă de replicare, secvenţele repetitive directe pot conduce la
apariţia a două lanţuri inegale de ADN replicate şi după schimburile dintre cele
două catene, la o repetiţie a fragmentelor de ADN (fig. 6.18).
Atunci când schimburile dintre catene se fac în aceeaşi cromatidă după
replicare, fragmentul se regăseşte pe acea cromatidă.

133
 Fig. 6.18 Duplicarea unei gene.

În cursul meiozei, schimburile se pot produce între cromatide ca într-un

„crossing-over” normal, dar cu repartizare inegală pe catene a secvenţelor
repetitive. În acest caz secvenţa de origine paternă şi maternă se regăseşte la o
serie pe acelaşi lanţ ADN, conducând la două gene identice (numite paraloage).
În aceste cazuri ADN purtător de repetiţii beneficiază adesea de două
gene identice, codante pentru aceeaşi proteină. Această dispoziţie conferă
indivizilor care primesc acest patrimoniu genetic o mai bună rezistenţă la
mutaţii care pot surveni pe o genă, deci un avantaj selectiv în favoarea genelor
duplicate (3).

6.2.6 Pseudogena

Pseudogenele sunt:
- gene care în urma modificării structurii nu pot fi transcrise şi sau
traduse în proteine şi se numesc gene neexprimate;
- gene care apar prin multiplicare în cursul evoluţiei şi au suferit
evenimente genetice (substituţie, inserţie, deleţie) care, împiedică
transcripţia sau transducţia.
La o duplicare a genei apolipotroteine CI s-a format o genă apoCI, care
are 40 miloane de ani în genomul primatelor. Prin mutaţie recentă, se
transformă ultimul aminoacid din peptida semnal în codon STOP. Transcripţia
conduce la un ARNm dar acesta nu poate fi tradus decât printr-o peptidă semnal
fără a fi urmată de proteine în serie.

134
 Conversia genelor
Transcripţia unei secvenţe de ADN dintr-o copie a genei vechi,
duplicate (copie homoloagă) are ca rezultat reducerea sintezei apolipoproteinei.
Secvenţele genelor pot fi transformate prin schimbarea exonilor
compleţi printr-o transpoziţie pornind de la alte gene.
Transpoziţia unui exon poate adăuga un domeniu nou în structura unei
proteine sau restaura un domeniu, devenind multifuncţional în cursul evoluţiei.

6.3 Mutaţiile cromozomiale

Mutaţii cromozomiale nu afectează, în mod obişnuit, structura

genelor ci mai ales legăturile dintre ele. Sunt restructurări ale cromozomilor în
urma cărora grupuri întregi, mai mari sau mai mici de gene, sunt mutate de pe
un cromozom pe altul. Deci ceea ce se modifică este mai ales poziţia reciprocă
şi interacţiunea genelor. Primele mutaţii cromozomale au fost vizualizate în anii
1960 în celulele leucemice. Nowell şi Hungerford au observat un cromozom 22
anormal de mic în celulele leucemice, pe care l-au denumit cromozomul
‚Philadelphia’. Câţiva ani mai târziu, Rowley, folosind expunerea în bandă a
cromozomilor, a notat că celulele tumorale nu numai că au pierdut material
genetic dar că l-au şi schimbat. In 1972 primele translocaţii au fost descrise
între cromozomii 8 si 21, t (8; 21) la pacienţii cu leucemie mieloblatică acută.
In acelaşi an, a demonstrat că, cromozomul Philadelphia a fost rezultatul unui
schimb reciproc între cromozomii 9 şi 22. A continuat să identifice translocaţii
reciproce adiţionale în cazul altor boli, t (14; 18) în limfomul folicular şi t (15;
17) în leucemia promielocitică acută. Aceasta a fost prima dovadă că bolile
tumorale au o baza genetică.
După mecanismul lor de producere, mutaţiile cromozomiale pot fi de
mai multe categorii.
Deleţiile constau în pierderea unui locus sau a mai multora de pe un
cromozom. Duplicaţiile şi deleţiile pot fi create printr-un crossing-over anormal
în timpul meiozei. Marile deleţii acoperind milioane de perechi de baze pot fi
detectate utilizând cariotiparea. Microdeleţiile nu sunt întotdeauna văzute uşor
cu ajutorul acestei tehnici. De cele mai multe ori rezultatul unui asemenea
fenomen este letal pentru organism. Uneori însă funcţiile respective pot fi
compensate de alte gene sau pot să nu aibă efecte letale, în cazul când au
devenit inutile ca urmare a schimbării unor condiţii de mediu. De pildă trecerea
la modul de hrană saprofit sau parazit înlătură necesitatea unei serii întregi de
enzime.
Inversiunile constau în inversarea prin rotaţie, cu 180° a unui segment
de cromozom. Se poate produce prin ruperea cromozomului în două locuri,
după care segmentul dintre rupturi se realipeşte, dar în poziţie inversată. În
135
acest fel se inversează, pe segmentul respectiv, ordinea genelor. Acest fenomen
se produce mai ales în profaza fie a mitozei, fie a meiozei, când cromozomii
lungi şi subţiri se mişcă activ în nucleu. În mod normal, când se produce
împerecherea cromozomilor, genele omoloage se alătură exact. La
împerecherea cromozomului cu inversiune cu un cromozom normal, se
formează o buclă, pentru a permite alăturarea genelor omoloage. In cazul unui
organism heterozigot pentru o inversiune, genele segmentului inversat apar atât
de strâns legate între ele încât nu sunt afectate de crossing over şi se transmit în
bloc şi nu mai pot produce recombinări genetice. În felul acesta, inversiunea
poate deveni un mijloc bun de păstrare a unei anumite combinaţii a genelor,
care se dovedeşte deosebit de avantajoasă selectiv (fig. 5.19).

Fig. 6.19. Mutaţii cromozomiale (225)

In inversie nu se schimbă cantitatea de material genetic din cromozom.

Inversia nu alterează expresia genelor numai capătul inversiei se află în
interiorul genei.

136
 Duplicaţiile sunt restructurări care afectează o pereche de cromozomi
omologi: între ei se produce un schimb de segmente inegale, astfel că în timp ce
pe un cromozom apare o deficienţă a unuia sau a mai multor loci, pe celălalt
cromozom aceşti loci apar dublaţi. Uneori asemenea schimbări nu dau efecte
fenotipice vizibile, alteori determină modificări de natură diferită (213).

Translocaţiile constau în schimbări de segmente între doi cromozomi

neomologi. Translocaţia poate fi reciprocă (schimb reciproc de segmente
între cromozomi) sau simplă (un segment de pe un cromozom se transferă
pe alt cromozom). Ca şi în cazul inversiunilor, la organismele heterozigote,
meioza este alterată din cauza dificultăţilor în împerecherea cromozomilor
omologi. Aceasta poate produce anomalii. La om unele cazuri de mongolism se
datoresc translocaţiei (fig. 6.20).

Fig. 6.20 Translocaţiile cromozomiale (239).

6.4 Mutaţii genomice

Acestea constau în modificarea numărului cromozomilor poliploidie şi

aneuploidie. Diferite forme de poliploidie rezultă din anomalii în diviziunile
celulelor germinale sau somatice şi se pot datora celor mai diverse cauze
traumatisme, parazitism, substanţe chimice, înţepături ale unor insecte etc.
Fenomenul este larg răspândit la plante, dar mult mai rar la animale. În mod
obişnuit, majoritatea plantelor şi animalelor sunt diploide, adică au o garnitură
dublă de cromozomi în fiecare celulă. În unele cazuri, de pildă la unele insecte
ce se înmulţesc partenogenetic (deci prin ovule nefecundate), celulele primesc
numai o garnitură simplă de cromozomi. Acestea sunt organisme haploide iar

137
garnitura lor cromozomică este monoploidă. Monoploidia o întâlnim, de pildă,
la trântorii (masculii) din familiile de albine.

6.5 Mutaţii extranucleare

În prezent este demonstrată prezenţa ADN şi ARN şi în alţi constituenţi

celulari în afara cromozomilor. Astfel, plastidele din celula vegetală
(cloroplaste — când conţin clorofilă, leucoplaste — când sunt lipsite de acest
pigment), mitocondriile, kinetozomii conţin atât ARN cât şi ADN. Organitele
amintite au capacitatea de autoreproducere prin diviziune. Este, deci, firesc ca
ele să fie capabile să se şi modifice prin mutaţii ale acizilor nucleici proprii. La
drojdia de bere, Neurospora şi la alte microorganisme au fost descrise mutaţii
care apar, la nivelul mitocondriilor. Astfel, la drojdia de bere, a fost obţinută (pe
agar) o mutantă cu insuficienţe respiratorii, caracterizată prin dimensiuni foarte
reduse în comparaţie cu coloniile normale. Din această cauză, mutanta a fost
denumită „petite". O serie întreagă de enzime necesare metabolismului
energetic, printre care citocromoxidaza si succindehidrogenaza, sunt inactivate
la această mutantă. Încrucişarea mutantei „petite" cu drojdia normală nu duce la
transmiterea ereditară a dimensiunilor reduse (caracter fenotipic). Aceasta arată
că aparatul nuclear este normal. Mutaţia respectivă este legată de mitocrondrii.
Studiul acestor organite la mutanta „petite" nu a evidenţiat vreo deosebire
morfologică fată de drojdia normală. Deoarece se ştie că o parte din enzimele
mitocondriale sunt controlate de sistemul genetic nuclear, se poate conchide că
aparatul enzimatic al mitocondriilor este supus atât controlului genelor din
cromozomi cât şi unor gene extracromozomiale.
Kinetozomii sau corpusculii bazali, situaţi câte unul la baza fiecărui
flagel şi care sunt răspunzători de mişcările flagelilor, conţin, de asemenea atât
ARN cât şi ADN. Numeroase date pledează în favoarea ideii că aceste organite
sunt omologate cu centriolii (sau centrosomii). Kinetosomii sunt capabili de
autoreproducere iar diferitele caractere ale lor par a fi independente de sistemul
genetic nuclear. S-a constatat astfel că diferitele modificări ale kinetosomilor se
transmit prin înmulţirea agamă a celulelor iar procesul sexual al infuzorilor, la
care s-au făcut observaţiile, nu determină modificări ale kinetomului (totalitatea
kinetosomilor). Mai mult, înlocuirea macronucleului indivizilor cu kinetosomi
modificaţi, prin macronucleul indivizilor normali, nu are consecinţe asupra
kinetomului.

6.6 Nomenclatura mutaţiilor

Se vor folosi numai simbolurile oficiale acceptate de HGCN

Detaliile modificării trebuie precedate de simbolul nivelului descris:
– "c." – pentru secvenţa de ADN codant (de ex.: c.76A>T) ;
138
 – "g.“ – pentru secvenţa genomică (de ex.: g.476A>T) ;
– "m." – pentru secvenţe mitocondriale (de ex.: m.8993T>C);
– "r." – pentru secvenţa de ARN (de ex.: r.76a>u) ;
– "p." – pentru secvenţe proteice (de ex.: p. Lys76Asn).
Pentru a evita confuziile, descrierile variantelor la nivel de ADN, ARN
şi proteine sunt unice:
– ADN: notarea nucleotidelor cu majuscule
Numărul primului nucleotid modificat
Simbolul mutaţiei
De ex. c.76A>T or g.476A>T
– ARN: notarea nucleotidelor cu litere mici
Numărul primului nucleotid modificat
Simbolul mutaţiei
De ex. r.76a>u
– Proteină: notarea aminoacizilor cu simboluri de trei litere
începând cu o majusculă
Numărul poziţiei aminoacidului modificat
Simbolul mutaţiei
Aminoacidul modificat
De ex. Pro12Ala
– Numerotarea nucleotidelor este arbitrară;
– Se începe cu 1 la nivelul primului nucleotid din secvenţa din baza
de date de referinţă, care trebuie să includă toate nucelotidele din
secvenţa genică inclusiv promotorul la capătul 5';
– Nu se folosesc semnele + sau -.
Intervalul de nucleotide afectate este separat de semnul „ _ “ (între
primul şi ultimul nucleotid modificat)
– De ex.: c.76_78delACT
Dacă nu se cunoaşte poziţia exactă a modificării, intervalul presupus
este citat în paranteze
– De ex.: c.(67_70)insG

Substituţii:
Se foloseşte semnul “ > “
Ordinea descrierii modificării:
– “c.” sau “g.” pentru nivelul de ADN la care se referă descrierea
– poziţia nucleotidului susbtituit
– simbolul nucelotidului substituit
– semnul “>”
– simbolul nucleotidului nou
Ex.
– c.76A>C

139
 – c.-14G>C
– c.88+1G>T
– c.89-2A>C
– c.*46T>A

Deleţii
Se foloseşte prescurtarea "del"
Ordinea descrierii modificării:
 “c.” sau “g.” pentru nivelul de ADN la care se referă descrierea
Primul nucleotid pierdut
Semnul” _ “ pentru notarea intervalului
Ultimul nucleotid pierdut
Prescurtarea “del”
Eventual se poate adăuga secvenţa nucleotidică pierdută
Exemple:
 c.76_78del (c.76_78delACT)
 c.88-?_923+?
 c.(?_-30)_(*220_?)del

Duplicaţii
Se foloseşte prescurtarea "dup"
Ordinea descrierii modificării:
 “c.” sau “g.” pentru nivelul de ADN la care se referă descrierea
Primul nucleotid duplicat
Semnul ” _ “ pentru notarea intervalului
Ultimul nucleotid duplicat
Prescurtarea “dup”
Eventual se poate descrie secvenţa nucleotidică duplicată sau numărul
nucleotidelor duplicate
Exemple:
 c.77_79dup (sau c.77_79dupCTG sau c.77_79dup3)
 c.5dupT (sau c.5dup)
 c.(?_-30)_(*220_?)dup

Inserţii
Se foloseşte prescurtarea “ins"
Ordinea descrierii modificării:
– “c.” sau “g.” pentru nivelul de ADN la care se referă descrierea
– Primul nucleotid inserat
– Semnul” _ “ pentru notarea intervalului
– Ultimul nucleotid inserat
– Prescurtarea “ins”
140
– Eventual se poate adăuga şi secvenţa nucleotidică inserată sau
numărul nucleotidelor inserate
Exemple:
– c.76_77insT

Deleţii + Inserţii
(indels)
Se foloseşte prescurtările “delins"
Ordinea descrierii modificării:
– “c.” sau “g.” pentru nivelul de ADN la care se referă descrierea
– Poziţia primului nucleotid înlocuit prin deleţie respectiv inserţie
– Semnul” _ “ pentru notarea intervalului deleţiei
– Poziţia ultimului nucleotid înlocuit prin deleţie respectiv
inserţie
– Prescurtarea “delins”
– Nucleotidele inserate
Exemple:
– c.112_117delinsTG (c.112_117delAGGTCAinsTG)

Inversii
Se foloseşte prescurtarea “inv"
Ordinea descrierii modificării:
 “c.” sau “g.” pentru nivelul de ADN la care se referă descrierea
 Poziţia primului nucleotid din secvenţa inversată
 Semnul” _ “ pentru notarea intervalului
 Poziţia ultimului nucleotid din secvenţa inversată
 Prescurtarea “inv”
 Eventual se poate adăuga lungimea secvenţei inversate
Exemplu:
 c.203_506inv (sau 203_506inv304)

Variabilitatea secvenţelor repetitive:

Ordinea descrierii modificării:
 “c.” sau “g.” pentru nivelul de ADN la care se referă descrierea
 Poziţia primului nucleotid din secvenţa repetitivă
 Unitatea secvenţei nucleotidice repetate
 În paranteză rotundă intervalul valorii repetiţiilor cu cele două
valori limită separate de semnul “_”
 De exemplu:
 c.123+74TG(3_6)

Alte variante:
141
 Conversii: “ con”
Descrierea translocaţiilor la nivel molecular
 descrierea citogenetică urmată de menţionarea poziţiei punctelor de
ruptură conform unei secvenţe de referinţă (Genbank, EMBL,
DDJB)
 De exemplu:
 t(X;4)(p21.2;q35)(c.857+101_857+102)

Mai multe variante la aceeaşi persoană:

Două secvenţe modificate în alele diferite – enumerare în paranteze
drepte diferite separate de semnul “ + “
 De ex.: c.[76A>C]+[87delG]
Două secvenţe modificate în aceeaşi alelă – enumerare într-o singură
paranteză şi separare cu semnul “ ; “
– De ex: c.[76A>C; 83G>C]
Mozaicism – enumerare într-o singură paranteză şi separare cu semnul
“, “
– c.[=, 83G>C]

Descrierea mutaţiilor la nivel de proteină

(secvenţă de aminoacizi)
Se foloseşte prescurtarea "p." pentru indicarea nivelului descris (p-
proteină)
Se preferă utilizarea simbolurilor cu trei litere, prima literă fiind notată
cu majuscule
“X” se foloseşte pentru notarea codonilor STOP
Numerotarea aminoacizilor – indicarea poziţiei variaţiei:
– Primul aminoacid (Met) se numerotează cu +1
– Secvenţa proteică se referă la produsul primar al translaţiei
– Aminoacizii apăruţi în urma unor modificări care determină
traducerea unor secvenţe suplimentare în amonte se indică cu
semnul “ – ” (de ex. Gln-2, Thr-1)
– Aminoacizii rezultaţi din traducerea unor secvenţe intronice se
indică cu semnul “ + ” sau “ - ” în funcţie de poziţia exonului
apropiat (de ex. Val4+1, Phe5-2)
– Aminoacizii apăruţi în urma unor modificări care determină
traducerea unor secvenţe suplimentare în aval prin pierderea
codonului STOP se indică cu semnul “ * ” (de ex. Gln*1, Ser*2
(110).

142
 7 TEHNICI DE EXTRACŢIE A ACIZILOR NUCLEICI

7.1 Extracţia ADN

Scopul extracţiei este eliberarea acizilor nucleici din celulă şi folosirea

în diverse tehnici. Ideal, acidul nucleic ţintă ar trebui să fie necontaminat cu
proteine, carbohidraţi, lipide sau alţi acizi nucleici (ADN fără ARN sau ARN
fără ADN). Cantitatea iniţială de material celular este obţinută prin distrugerea
celulei şi membranelor celulare (liza celulară). Liza trebuie să se relizeze în
condiţii ce nu vor dauna acidului nucleic. După liza celulară materialul ţintă
este purificat, ca apoi concentraţia şi puritatea mostrei să poata fi determinată.
Etape ale izolarii şi purificarii AND-ului genomic:
1. Obţinerea sedimentului celular.
2. Distrugerea peretelui celular prin tratament cu lizozim.
3. Liza peretelui nuclear.
4. Deproteinizare enzimatică.
5. Precipitarea proteinelor cu soluţie salină KCl.
6. Precipitarea acizilor nucleici: cu alcool izopropilic.
7. Indepărtarea moleculelor de ARN din extract. In marea majoritate a
experimentelor, în acest scop se efectuează şi tratament cu RNază
H.
8. Este necesară şi parcurgerea unei etape de spălare a sedimentului
ADN cu etanol 70% rece.
9. Resuspendarea sedimentului ADN în TE.
Extractele ADN sunt scanate în UV în registrul de lungimi de undă
cuprins între 200 nm şi 350 nm. Acest registru a fost ales având în vedere
următoarele:
- faptul că moleculele de ADN (atât dublu catenare, cât şi
monocatenare) prezintă absorbanţă maximă la lungimi de undă ce
variază între 257 şi 260 nm. Cel mai frecvent, ADN de origine
bacteriană prezintă peak-ul specific la λ = 258 nm;
- absorbanţa maximă pentru proteinele rămase eventual în extract este
la λ=280 nm;
- unele polizaharide absorb radiaţiile luminoase cu λ = 230 nm;
- absorbanţa la 220 nm este dată de oligonucleotide ce reprezintă de
obicei molecule de ADN fragmentat artificial în timpul tehnicilor de
extracţie şi purificare.
Gradul de contaminare proteică a probelor a fost determinat cu ajutorul
raportului A260/A280; valoarea optimă a acestui raport este cuprinsă între 1.7
şi 2.0. Valori mai mici de 1,7 indică o contaminare proteică semnificativă.
Valori mai mari de 2.0 sunt, de obicei, corelate cu contaminarea probelor de
143
ADN cu ARN (125).
Determinarea concentraţiei ADN-ului din probe se face prin analize
spectrofotometrice, folosind relaţia:
A260 = 1 corespunde la o concentraţie de 50 μg ADN d.c. / ml

Obţinerea sedimentului celular

Acidul nucleic este în mod normal, izolat din celule nucleate în
suspensie, surse fungice, bacteriene şi virale. Etapele iniţiale în izolarea acidului
nucleic depind de natura materialului recoltat.

Celulele nucleate în suspensie

Leucocitele pot fi izolate din sânge sau măduvă hematogenă. Acest
lucru este posibil fie prin centrifugarea în gradient de densitate sau prin liză
diferenţiată. Pentru centrifugarea diferenţiată, sânge complet sau măduvă
osoasă se mixează cu soluţie izotonică salină şi Ficoll. Acesta este un polimer
de sucroză extrem de ramificat ce nu penetrează membranele biologice. Odată
centrifugate, leucocitele mononucleare (celulele dorite pentru izolarea acidului
nucleic) se concentrează într-un strat în gradientul Ficoll situate sub
componentele plasmatice mai puţin dense şi deasupra celulelor
polimorfonucleate şi a celulelor roşii (RBCs). Stratul conţinând celulele
mononucleare este eliminat din flacon şi spălat cel puţin de două ori şi
resuspensia se centrifughează în soluţie salină înainte de a începe procedura
de izolare a acidului nucleic.
O altă metodă folosită în izolarea celulelor nucleate profită de
diferenţele în fragilitatea osmotică a hematiilor şi leucocitelor. Incubarea
sângelui sau a maduvei în soluţie tampon hipotonică sau apă va duce la liza
hematiilor înaintea leucocitelor. Leucocitele sunt separate prin centrigugare,
lăsând membranele hematiilor goale şi hemoglobină în suspensia din soluţie
(211).

Probele de ţesuturi
Ţesuturile proaspete sau congelate trebuie disociate înaintea începerii
procedurii de izolare a ADN-ului. Marunţirea ţesutului congelat în azot lichid şi
omogenizarea acestuia sau simpla mărunţire poate distruge probele de ţesut.
Ţesuturile fixate incluse în parafină trebuie deparafinate prin introducerea în
xilen. Sunt adesea folosiţi în acest sens substituienţii mai puţin toxici ca
Histosolve, Anatech Pro-Par sau ParaClear. După tratarea cu xilen, ţesutul este
rehidratat în concentraţii descrescătoare de etanol (33, 149).
Deproteinizare enzimatică
Microorganismele
Unele bacterii şi fungi au pereţii celulari rezistenţi care trebuiesc
dizolvaţi pentru a permite eliberarea acidului nucleic. In comerţ sunt disponibile
144
câteva enzime ca lizozimul sau zimolaza, ce digeră polimerii peretelui celular.
Alternativ, pereţii celulari pot fi distruşi mecanic prin măcinare sau prin
mixarea puternică cu cioburi de sticlă. Metode enzimatice mai fine sunt puţin
eficiente. Peretele celular al bacteriilor poate fi distrus prin tratamentul cu
detergent (1% dodecil sulfat de sodiu) şi o baza tare (0.2 M NaOH) în prezenţa
bazei Tris, acidului etilendiamintetracetic (EDTA) şi glucozei. Fierberea în 8%
sucroză, 8% detergent Triton X-100, tampon Tris şi EDTA după tratarea cu
lizozim, eliberează ADN ce poate fi imediat precipitat în alcool. ADN-ul extras
cu NaOH sau utilizând procedurile de fierbere, este denaturat (devine
monocatenar) şi este posibil să nu fie potrivit pentru metode ca analiza
enzimelor de restricţie ce necesită ADN bicatenar. Avantajul acestor tipuri de
extracţie este viteza şi simplitatea metodei. Metodele de amplificare vor
funcţiona folosind acest tip de izolare a ADN-ului (149, 192).

Precipitarea proteinelor cu soluţie salină

După eliberarea ADN-ului din celulă, purificările ulterioare necesită
eliminarea proteinelor, lipidelor, carbohidraţilor şi resturilor celulare. Acest
lucru este realizat folosind o combinaţie de salinitate mare, pH scăzut şi o
mixtură organică de fenol şi cloroform. Combinaţia dizolvă uşor
contaminanţii hidrofobi ca lipidele şi lipoproteinele, colectează resturile
celulare şi elimină cele mai multe proteine associate cu ADN.
Izolarea cantităţilor mici de ADN din probele cu fungi poate fi facilitată
prin pretratamentul cu bromură de cetiltrimetilamonium, un detergent cationic
ce separă eficient ADN-ul de contaminarea cu polizaharide. Pentru a evita
contaminarea cu ARN pot fi adăugate ARNazele. Alternativ, ARNazele pot fi
adăugate de asemenea în ADN-ul resuspendat la sfârşitul procedurii.
Când se adăugă fenol şi cloroform la lizatul celular hidrofilic se
formează o emulsie bifazică. Centrifugarea va stratifica soluţia în strat hidrofob
la bază şi hidrofil deasupra. Lipidele şi alte componente hidrofobe vor structura
stratul bazal, decantat, iar ADN-ul va fi dispus în faza apoasă superioară.
Componentele amfifilice (ce au proprietăţi hidrofobe şi hidrofile) ca şi resturile
celulare, se vor aduna formând un precipitat alb la interfaţa dintre cele două
straturi (192) (fig. 7.1).

145
 Fig. 7.1 Protocol pentru extracţia acizilor nucleic (226)

Precipitarea acizilor nucleici

Faza superioară, conţine ADN colectat care este precipitat folosind
etanol sau izopropanol într-o concentraţie mare de sare (acetat de sodiu,
amoniu, potasiu, litiu sau clorura de sodiu). Etanolul sau alcoolul izopropilic
este adăugat în soluţia în raport 2:1 sau 1:1 iar ADN-ul formează un precipitat
solid care este colectat prin centrifugare (fig.7.2). Sarea în exces este
îndepărtată prin clătirea peletelor în etanol 70%, centrifugare şi aruncarea
supernatantului de etanol, apoi dizolvarea peletelor de ADN în soluţie tampon
de rehidratare, de obicei 10 mM Tris, 1 mM EDTA (TE).

146
 Fig. 7.2 Schema generală a izolării organice a ADN-ului (221).

Metode de izolare anorganică

Din motive de siguranţă folosirea reactivilor caustici în laborator este de
nedorit. Au fost prin urmare dezvoltate metode de izolare a ADN-ului care nu
necesită extracţia cu fenol.
Alegerea tipului de alcool folosit depinde de materialul de start,
mărimea şi cantitatea de ADN de izolat şi metoda în sine. Izopropanolul este
mai puţin volatil decât etanolul şi precipită ADN-ul la temperatura camerei.
Această metodă reduce coprecipitarea sării. Comparativ cu etanolul,
izopropanolul este adăugat în cantităţi mai mici; prin urmare poate fi mai
practic.
Iniţial, aceste metode nu au dat rezultat în recuperarea eficientă a ADN-
ului pur. Metodele mai noi, anorganice au dovedit că produc preparate de ADN
de calitate superioară. Extracţia anorganică a ADN-ului mai este numită salting
out. Foloseşte pH redus şi condiţii de salinitate mare pentru a precipita selectiv
proteinele, lăsând ADN-ul în soluţie. ADN-ul poate fi precipitat apoi aşa cum a
fost descris anterior prin folosirea izopropanolului şi resuspendarea în TE
tampon (204).

7.2 Extracţia ARN

Lucrul cu ARN în laboratoare necesită precauţii stricte pentru a evita

degradarea. ARN-ul este labil din cauza prezenţei ubicvitare a ARNazelor.
Aceste enzime sunt proteine mici ce pot renatura, chiar şi după autoclavare
devenind active. Spre deosebire de ADNaze, ARNazele trebuiesc eliminate sau
inactivate înaintea izolării ARN-ului. Ele rămân active la o paletă largă de
temperaturi (ex. sub 20 ºC) şi pot renatura chiar şi după încălzire. Este utilă
147
alocarea unei zone ARNaze-free (RNF) a laboratorului pentru stocarea
materialelor şi manipulări ale specimenelor. Consumabilele (eprubete, tipsuri)
ce vin în contact cu ARN ar trebui păstrate doar în zone delimitate şi să nu fie
atinse niciodată de mâini fără mănuşi. Articolele destinate folosirii în zona RNF
trebuie utilizate direct din ambalaj. Sticlăria reutilizabilă poate fi folosită dar
trebuie autoclavată la 40°C pentru inactivarea ARNazelor (203).

ARN total
Există câteva tipuri de ARN natural atât la procariote cât şi eucariote.
Cel mai abundent ARN din celule (80-90%) este ARN-ul ribozomal (rARN). In
funcţie de tipul celulei şi condiţii, următorul ca abundenţă (2,5 – 5%) este
ARN-ul mesager (ARNm). Acesta poate fi detectat ca un fundal şters ce stă la
baza ARNr-ului detectat de electroforeza pe gel de agaroză. ARN-ul de transfer
şi micro nuclear sunt prezente deasemenea în proba de ARN total (149).

Extractia ARN-ului total

Pregătirea materialului de studiu pentru extracţia ARN-ului diferă în
unele aspecte faţă de extracţia ADN-ului. Reticulocitele din sânge şi măduva
sunt lizate prin osmoză sau separate de celulele nucleate prin centrifugare. Când
ţesutul este disociat, proba ar trebui să fie păstrată în azot lichid sau scufundată
în soluţie tampon ce va inactiva ARNazele intracelulare.
Acest lucru este valabil în mod special pentru ţesuturi ca pancreasul, ce
conţine cantităţi mari de ARNaze. ARN-ul bacterian şi cel fungic sunt de
asemenea izolate prin liză chimică sau prin mărunţirea în azot lichid.
ARN-ul viral poate fi izolat direct din ser sau alte fluide fără celule prin
intermediul unor coloane speciale. Ca majoritatea metodelor de izolare a ADN-
ului, nu se poate face diferenţa între ARNul microorganismelor şi cel al celulei
gazdă, prin urmare folosirea unui preparat fără celule este cea mai potrivită.
Etapa de liză celulară pentru izolarea ARN-ului este realizată în
detergent sau fenol în prezenţa unei soluţii puternic saline (0.2 – 0.5 M NaCl)
sau a inhibitorilor de ARNaze. Tiocianatul de guanidina este un puternic agent
denaturant al ARNazelor şi poate fi folosit în locul soluţiilor puternic saline.
Agenţii puternic reducători ca 2-mercaptoetanolul pot fi adăugaţi de asemenea
în timpul acestui pas. Odată ce celulele au fost lizate, proteinele pot fi extrase
cu fenol (Fig. 7.3). Soluţiile fenol: cloroform: alcool izoamilic (25:2:1)
extrag eficient ARN-ul.
Cloroformul îmbunatăţeşte extracţia acidului nucleic prin denaturarea
proteinelor şi promovarea fazei de separare. Alcoolul izoamilic previne
spumarea. Pentru ARN, faza organică trebuie să fie acidă (4 - 5). Aciditatea
fazei organice poate fi reglată prin suprapunerea cu soluţia tampon de pH-ul
corect (pH 4 - 5). În unele proceduri de izolare, ADNazele sunt adăugate în
etapa de liză pentru a elimina ADN-ul contaminant. Alternativ, ADNazele fără
148
ARNaze pot fi adăugate de asemenea în ARN-ul izolat spre finalul procedurii.
După separare, faza superioară apoasă cu un conţinut de ARN, este îndepărtată
şi pusă într-un tub curat, apoi ARN-ul este precipitat prin adăugarea a doua
volume de etanol sau un volum de izopopanol. Precipitatul de ARN este spălat
apoi şi 70% etanol şi resuspendat în soluţie tampon RNF sau apă (19).

Figura 7.3 Extractia organica a ARN-ului total (221).

Izolarea ARN-ului polyA (mesager)

Majoritatea ARNm-ului provine din genele puternic exprimante
corespunzătoare. Prin urmare, exemplarele rare sau unice de ARNm reprezintă
o mică parte din ARN-ul total. Pentru creşterea productivităţii de ARNm, în
special în transcrierile rare, protocoale folosite includ oligomeri ai timinei şi
uracilului imobilizaţi în coloanele sau sferele matricii de răşina (167).
După spălarea ARN-ului rezidual, ARN-ul polyA este developat prin
spălarea coloanei cu soluţie tampon călduţă, slab salină ce conţine detergent. Se
poate obţine astfel aproximativ 30 - 40 ng de ARNm dintr-un microgram de
ARN total.
Există limite ale izolării ARN-ului polyA folosind oligo dT sau dU (19,
149).
Eficienţa legăturii polyA sau polyU este variabilă. De asemenea,
ARNm-urile cu cozi polyA scurte este posibil să nu se lege eficient sau deloc.
Este posibil ca fragmentele bogate în AT să se lege la coloană şi nu numai să
concureze cu ARNm ţintă, ci şi să contamineze produsul final. Digestia
potenţială a matricilor oligo-conjugate, împiedică folosirea ADNazelor înaintea
legării la coloană. Se recomandă tratarea eluantului cu DNaze fără RNaze (28).

149
 Fig. 7.4. Oligomerii polyT sau polyU se vor lega de coada polyA regăsită
exclusiv în ARNm (227).

7.3 Spectrofotometria pentru cuantificarea ADN

Acizii nucleici absorb lumina de 260 nm prin resturile de adenină.

Folosind legea Beer-Lambert, concentraţia poate fi determinată din constantele
de absorbţie (50 pentru ADN, 40 pentru ARN). Relaţia concentraţiei cu
150
absorbţia este exprimată astfel:
A = εbc
Unde A= absorbţia, ε= absorbţia molară (L/mol-cm), bc= mărimea căii,
(mg/L). Absorbţia la această lungime de undă este deci direct proporţională cu
concentraţia acidului nucleic din probă. Folosind absorbanţa ca un factor de
conversie din densitatea optică în concentraţie, o unitate de densitate optică (sau
unitate de absorbţie) la 260 nm este echivalentă cu 50 mg/L (sau 50 microg/mL)
de ADN şi 40 microg/mL de ARN. Pentru a determina concentraţia, se
înmulţesc unităţile citite la spectrofotometrul de absorbţie, cu factorul de
conversie adecvat.
Fenolul absoarbe lumina ultravioletă la 270-275 nm, aproape de
lungimea de undă a absorbţiei maxime a acizilor nucleici. Asta înseamnă că
trebuie evitată contaminarea cu fenol când se măsoară concentraţia la 260 nm.
Cele mai multe preparate de ADN şi ARN sunt într-o concentraţie
suficientă pentru a solicita diluarea înainte de spectrofotometrie (0.05 – 0.800
unităţi de absorbţie, în funcţie de instrument). Dacă proba a fost diluată înaintea
citirii, factorul de diluţie trebuie inclus în calcularea cantităţii. Se multiplică
rezultatele citirii absorbţiei, cu factorul de conversie şi factorul de diluţie pentru
a găsi concentraţia acidului nucleic (99).

Exemplu
Un preparat de ADN diluat 1:100 produce o citire a absorbţiei de
0.200 la 260nm. Pentru a obţine concentraţia în micrograme/mL, se
multiplică:

0.2000 unităţi de absorbţie x 50μg/mL per unitate de absorbţie x 100 =

1000μg/mL

Productivitatea probei este calculată folosind volumul acesteia. Dacă în

cazul de mai sus, ADN-ul a fost resuspendat într-un volum de 0.5 mL,
productivitatea ar fi:

1000 μg/mL x 0.5 mL = 500μg

Un preparat cu ARN diluat 1:10 produce o citire a absorbţiei de 0.500 la

260nm. Concentraţia este:

0.500 unităţi de absorbţie x 40μg/mL per unitate de absorbţie x 10 = 200μg/mL

Productivitatea probei este calculată folosind volumul acesteia. Dacă în

cazul de mai sus, ADN-ul a fost resuspendat în 0.2 mL, productivitatea ar fi:

151
 200 μg/mL x 0.2 mL = 40 μg

Măsurătorile spectrofotometrice indică de asemenea calitatea acidului

nucleic. Proteinele absorb lumina la 280 nm prin reziduurile de triptofan.
Absorbţia acidului nucleic la 260 nm ar trebui să fie de 1.6 – 2.00 ori mai mare
decât absorbţia la 280 nm. Dacă raportul 260 nm/280 nm este mai mic de 1.6,
preparatul de acid nucleic poate fi contaminat cu cantităţi inacceptabile de
proteine, nefiind suficient de pur pentru utilizare. O astfel de probă poate fi
îmbunatăţită prin reprecipitarea acidului nucleic sau prin repetarea pasului de
eliminare a proteinelor din procesul de izolare. Ar trebui luat în considerare ca
pH-ul scăzut poate afecta raportul 260 nm/280 nm. Unele soluţii tampon (pH
7.5) sunt recomandate pentru determinarea cu acurateţe a purităţii. ARN-ul
permite o raţie 260 nm / 280 nm oarecum mai mare, 2.0 – 2.3.
Un preparat ADN cu o raport mai mare de 2.0 poate fi contaminat cu
ARN. Unele proceduri pentru analizarea ADN-ului nu sunt afectate de ARN-ul
contaminat. În aceste condiţii ADN-ul fiind propice pentru folosire. Dacă totuşi
ARN-ul interferează sau reacţionează cu componentele de detecţie ale ADN-
ului ar trebui folosite RNazele pentru îndepărtarea ARN-ului contaminant.
Intrucât este dificil să detectezi ADN-ul contaminat în preparatele de ARN,
ARN-ul ar trebui să fie tratat cu ADNaze fără RNaze.
Analiza şi detectarea acizilor nucleici este realizată în câteva moduri.
Electroforeza pe gel şi cea capilară sunt cele mai practicate. ADN-ul poate fi
detectat folosind sonde specifice de hibridare (66, 149).

152
 8. AMPLIFICAREA ACIZILOR NUCLEICI

8.1 Reacţia în lanţ a polimerazei PCR (polimerase chain reaction)

Metodele de amplificare genică in vitro permit îmbunătăţirea şi

reproducerea accelerată a unui număr mare de copii a unei secvenţe de ADN
identice.
Descoperirea şi crearea reacţiei în lanţ a polimerazei, de către Mullis şi
colaboratorii săi în 1983, a revoluţionat ramurile moleculare ale biologiei şi
medicinei (Saiki et al. 1988, citat de 134), înainte de apariţia acestei tehnici
putând fi obţinute doar cantităţi infime dintr-un fragment de ADN ţintă. Reacţia
PCR permite amplificarea enzimatică in vitro a unei regiuni specifice de ADN,
localizată între două secvenţe ADN cunoscute, făcând astfel posibilă
multiplicarea unei singure copii a fragmentului de interes în peste un milion de
copii, în doar câteva ore. Tehnica PCR este esenţială pentru multe procedee de
analiză moleculară:
- clonarea unor fragmente specifice de ADN;
- detecţia şi identificarea genelor în vederea diagnosticării sau
investigării criminalistice;
- analiza modelelor de expresie genică.
În ultimii ani, reacţia PCR a făcut posibilă iniţierea cercetărilor în
domenii noi precum controlul autenticităţii produselor alimentare, prezenţei
ADN-ului modificat genetic (MG) şi a comtaminării microbiologice.
Reacţia de polimerizare în lanţ PCR (polimerase chain reaction) are la
bază o tehnologie in vitro care imită capacitatea naturală de replicare a ADN şi
care constă în generarea rapidă a unor copii multiple a unei secvenţe
nucleotidice ţinta (ADN sau ARN) dintr-o genă de interes sau un patogen
specific; produsul amplificat PCR este apoi detectat prin diverse metode.

8.1.1 Principiul reacţiei PCR

Reacţia PCR are la bază mecanismul de replicare in vivo a ADN-ului şi

este utilizată pentru amplificarea unei secvenţe ţintă de ADN într-un număr
mare de copii (87), fiind considerată un „fotocopiator molecular” (38) sau o
metodologie de „xeroxare a ADN-ului” (218).
Reacţia se desfăşoară în cadrul unui ciclu repetitiv de temperaturi (Fig.
8.1).
1. Denaturarea: în urma încălzirii amestecului de reacţie la 95 ºC, ADN-ul
ţintă este separat (denaturat) în două catene;
2. Hibridarea primerilor: ca urmare a scăderii temperaturii la 45-68ºC,
primerii se vor ataşa complementar la capetele 3’ ale celor două catene;

153
 3. Elongatia: la temperatura de 72ºC, ADN polimeraza termostabilă în
prezenta Mg2+ şi a excesului de dezoxinucleozid-trifosfaţi
(dezoxiadenozina, dezoxiguanozina, dezoxicitidina şi dezoxiuridina) va
extinde primerii ataşaţi în lungul matriţei ţintă şi va produce ampliconi
ADN. Analizorul va repeta automat acest proces pentru un număr stabilit
de cicluri (de obicei 30-35), la fiecare ciclu dublându-se cantitatea de
ampliconi ADN.

În prima etapă a amplificării PCR, temperatura înaltă are rolul de a

separa catenele dublului helix de ADN. Temperatura este apoi coborâtă pentru a
facilita alipirea (hibridarea) primerilor oligonucleotidici la secvenţa ţintă.
În ultima etapă temperatura are o valoare optimă pentru activitatea
polimerazei care extinde primerii prin alipirea unor noi nucleotide, în prezenţa
ionilor de Mg. În contextul amplificării PCR, cele trei etape constituie un ciclu
individual denumit, de obicei, ciclu/pas PCR. După fiecare ciclu, catenele de
ADN nou sintetizate servesc ca matriţe în ciclul următor. Principalul produs al
acestei reacţii exponenţiale este un segment dublu-catenar de ADN ale cărui
terminaţii corespund capetelor 5’ ale primerilor oligonucleotidici.

Fig. 8.1 Etapele tehnicii PCR.

Numărul de copii ale secvenţei ţintă creşte exponenţial cu fiecare ciclu

de amplificare, deoarece fiecare secvenţă nucleotidică nou sintetizată constituie
o matriţă pentru o nouă copie. Produsul PCR care reprezintă o copie a
ADN/ARN ţintă original este denumit amplicon. Această metodă permite
detectarea cu specificitate foarte mare a unor concentraţii foarte scăzute ale
secvenţei ţintă. La rândul său, procesul global de amplificare desfăşurat de-a
lungul unui număr definit de cicluri poate fi divizat in 3 faze:

154
 - Exponentială: la fiecare ciclu se dublează cantitatea de amplicon ADN
(se admite o eficienta de 100% a reacţiei);
- Lineară: pe masură ce componentele reacţiei sunt consumate, se produce
o încetinire a reacţiei iar produşii PCR încep să se degradeze;
- Platou (end-point): reacţia este stopată, nu se mai formează alţi produşi
de amplificare, iar dacă faza se prelungeşte mult produşii PCR vor suferi o
degradare important (Fig. 8.2).

Fig.8.2 Fazele procesului global de amplificare.

Amplificarea se realizeaza într-un analizor special (thermal cycler), iar

amestecul de reactie trebuie să conţină următoarele elemente:
- ADN sau ARN ţintă, extras din probă în cursul etapei de prelucrare;
- enzima care facilitează sinteza lanţului complementar de acid
nucleic:
- ADN polimeraza Taq (izolată din Thermophilus aquaticus) pentru
o ţintă ADN sau
- RTth ADN polimeraza – pentru o ţintă ARN - care are activitate
atât de revers-transcriptază, cât şi de ADN polimerază, permiţând
realizarea în acelaşi amestec de reacţie, atât a transcrierii inverse a
ARN ţintă în ADNc- cât şi amplificarea ADNc;
- cofactori enzimatici: Mg2+ şi/sau Mn2+;
- primeri (P1 si P2): secvenţe scurte, monocatenare, cu lungimea
maximă 20-30 nucleotide, care se leagă de o matriţă monocatenară
prin împerecherea complementară a bazelor. Servesc ca punct de
plecare pentru sinteza lanţului complementar cu ajutorul ADN
polimerazei, marcând începutul şi sfârşitul regiunii care trebuie să
fie amplificată;

155
 - deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP si dUTP) folosite pentru
sinteza noii catene ADN prin ataşarea lor la capătul primerilor,
complementar cu matriţa.
Observaţie: ampliconul va conţine deoxiuridina în loc de o
deoxitimidina, deosebindu-l de ADN nativ.

Lungimea produsului de amplificare (amplicon) este dată de distanţa

dintre cei doi primeri. Produşii ciclului iniţial de amplificare sunt însă
reprezentaţi de molecule de ADN de mărimi diferite, a căror lungimi pot depăşi
pe cea determinată de siturile de alipire ale celor doi primeri. În ciclul doi,
aceste molecule (produşii primului ciclu de amplificare) generează catene de
ADN de lungime definită, care se vor acumula exponenţial în continuare,
formând produşii de reacţie dominanţi.
În prima etapă, catena dublă este denaturată dând naştere ADN-ului
monocatenar. Procesul trebuie să fie complet deoarece catenele separate doar
parţial se vor hibrida (realipi) odată cu scăderea temperaturii, iar primerii nu vor
putea acţiona (87). Separarea catenelor complementare se face odată cu
creşterea temperaturii, prin ruperea legăturilor de hidrogen. Pragul de
temperatură maxim este de 92 - 96 °C, nivel la care se consideră că reacţia este
completă şi întreg ADN-ul dublu-catenar s-a denaturat. Temperatura la care
jumătate din ADN-ul dublu-catenar se găseşte sub formă monocatenară se
numeşte temperatură de denaturare şi este un parametru utilizat la designul
primerilor şi al protocoalelor de amplificare. Tipul de solvent, concentraţia
sărurilor şi pH-ul influenţează procesul de denaturare. De exemplu, în mediu de
reacţie cu conţinut redus de săruri, pH ridicat şi în prezenţa solvenţilor organici
(ex. formaldehidă), Tm are valoare mai redusă. Proporţia C/G şi T/A este un alt
factor important care influenţează Tm, această valoare fiind mai mare în cazul
structurilor de ADN cu conţinut mai mare de C/G comparativ cu conţinutul de
T/A.
Temperatura ridicată corespunzătoare etapei de denaturare asigură de
asemenea stoparea reacţiilor enzimatice (iniţiate în ciclul anterior).
Hibridarea catenelor de ADN are loc odată cu scăderea treptată a
temperaturii. Acest principiu stă şi la baza hibridării primerilor la siturile
complementare care flanchează secvenţa ţintă. În această etapă, între primerii
prezenţi în mediul de reacţie şi ADN-ul matriţă monocatenar legăturile se
formează şi se rup în mod constant. Cu cât aceste legături sunt mai stabile (ex.
primerii care se potrivesc perfect pe secvenţa matriţă de ADN), cu atât vor
rezista mai mult, permiţând ADN polimerazei să îşi desfăşoare mai uşor
activitatea. După ataşarea câtorva nucleotide, legăturile devin foarte puternice.
Temperatura necesară pentru hibridarea primerilor depinde în principal
de caracteristicile acestora. Teoretic, aceasta este cu câteva grade mai mică

156
decât Tm, ceea ce asigură formarea unor structuri stabile doar între primeri şi
fragmentele ţintă complementare (87).
Ultima etapă presupune extinderea primerilor de-a lungul secvenţei
ţintă prin adăugarea unor nucleotide libere de către ADN polimerază (frecvent
Taq ADN polimeraza), în prezenţa Mg2+. Bazele complementare secvenţei ţintă
sunt ataşate în continuarea primerului, la capătul 3’ al acestuia. Temperatura
optimă de funcţionare a Taq ADN polimerazei este de aproximativ 72 °C, acest
nivel fiind utilizat în majoritatea protocoalelor PCR (87). De asemenea pentru
majoritatea experimentelor PCR, durata de 30-45 secunde a acestei etape
asigură extensia completă a fragmentului de interes, fiind necesar un interval de
timp mai lung în cazul în care lungimea secvenţei ţintă depăşeşte 1000 pb.

Instrumentele şi componentele necesare reacţiilor PCR

Două mari inovaţii au permis automatizarea procesului de amplificare
PCR (133):
 introducerea ADN polimerazelor termostabile, care nu sunt
inactivate la temperaturi ridicate; astfel, cantitatea de ADN
polimerază repartizată iniţial poate acţiona de-a lungul mai multor
cicluri PCR;
 crearea unor blocuri de temperatură a căror nivel termic poate fi
crescut sau coborât rapid, în mod automatizat; un astfel de
instrument poartă denumirea de termociclor sau maşină PCR (Fig.
8.3 ).

(a) (b)

Fig. 8.3. Thermal cycler-ul. (a) Sistemul de băi marine utilizate

pentru experimentele PCR iniţiale. (b) Thermal cycler modern (Veriti
384-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems) care permite
desfăşurarea automatizată a amplificării. Surse: 191.

Parametri ciclurilor de temperatură şi reactivii utilizaţi sunt factori critici

pentru succesul reacţiei PCR, cele mai importante elemente care trebuie avute
în vedere în acest context fiind secvenţa ţintă de ADN, primerii, polimeraza,

157
soluţia tampon, ionii de Mg, nucleotidele libere şi numărul ciclurilor de
amplificare.

Secvenţa ţintă
Teoretic, amplificarea PCR se poate desfăşura dacă există cel puţin o
copie intactă a secvenţei ţintă (87), fiind însă necesar un număr mai mare de
copii pentru ca detecţia produsului de amplificare să fie posibilă. Mărimea
acestei secvenţe poate fi cuprinsă între 0,1 (sau chiar mai puţin, pentru real-time
PCR) şi până la câteva kilobaze. Cantitatea totală de ADN utilizată în mod
obişnuit pentru PCR este de 0,05 - 10 μg. Deşi o probă nu trebuie să fie înalt
purificată, cum se impune în cazul altor aplicaţii (ex. secvenţiere), eliminarea
unor contaminanţi ca polizaharide, polifenoli, lipide, heparină, agenţi de
chelatare ai Mg2+, formalină sau detergenţi este esenţială pentru desfăşurarea
procesului de amplificare.

Primerii
O componentă foarte importantă a reacţiei PCR este reprezentată de
primeri. Secvenţa acestora influenţează poziţia şi lungimea produsului de
amplificare, temperatura de alipire şi cantitatea de produs obţinut (Innis şi
Gelfand, 1994, cit.134). Proiectarea necorespunzătoare a primerilor determină
obţinerea unor cantităţi reduse de produs sau chiar lipsa produsului de
amplificare dorit. Elementele importante pentru construirea primerilor sunt:
lungimea, temperatura de alipire, gradul de omologie cu alte secvenţe decât cea
pe care dorim să o amplificăm, gradul de complementaritate dintre secvenţele
primerilor, conţinutul G/C, secvenţele polipirimidinice (T, C) sau polipurinice
(A, G), secvenţa de la capătul 3’ (134).
Lungimea primerilor este cuprinsă de obicei între 16 şi 30 nucleotide.
Cu cât aceasta este mai mare, alipirea (hibridarea) se realizează mai greu
(temperatura de alipire este mai ridicată). Specificitatea reacţiei creşte dar se
reduce cantitatea de produs acumulat.
Temperatura de alipire. O reacţie PCR necesită utilizarea unor primeri
cu temperaturi de hibridare similare. Dacă cele două temperaturi sunt foarte
diferite, amplificarea nu se va desfăşura corespunzător deoarece primerul cu
temperatură de hibridare mai ridicată se poate alipi nespecific dacă nivelul de
temperatură este optim pentru celălalt primer, iar acesta din urmă nu va rămâne
alipit la temperatura specifică primului primer. În practică temperatura de
alipire se determină cu ajutorul temperaturii de denaturare (Tm) menţionate
anterior. Aceasta se poate calcula utilizând diferite formule, cea mai simplă
fiind cea concepută de Wallace:

158
 Tm  2 A  T   4G  C  (3)

unde: A, T, G, C reprezintă numărul de baze ale primerului. Această

formulă oferă o valoare aproximativă, dar destul de precisă în cazul primerilor
de 18-24 baze. Relaţia între temperatura de alipire şi cea de denaturare
reprezintă una dintre aşa-numitele cutii negre ale reacţiei PCR. De cele mai
multe ori această valoare nu este însă optimă, fiind necesară determinarea ei
empirică.
Secvenţa primerilor. Primerii trebuie astfel aleşi încât să aibă o
secvenţă complementară unică, cel puţin pentru taxonul analizat, ceea ce
conferă specificitate reacţiei. Specificitatea primerilor este influenţată şi de
lungime, numărul siturilor de alipire fiind mult mai mic pentru un primer de 24
baze comparativ cu unul de 15 baze.
Fiecare primer trebuie astfel proiectat încât să nu conţină secveţe
omoloage mai lungi de trei baze, aceastea putând cauza apariţia unor structuri
dublu-catenare de tip „ac-de-păr” ce împiedică alipirea corectă. O altă eroare de
proiectare este prezenţa regiunilor omoloage în cadrul primerilor utilizaţi în
aceeaşi reacţie, rezultatul fiind sporirea primer-dimerilor.
Alipirea capătului 3’ al primerilor este esenţială deoarece aceasta este
partea în care polimeraza va adăuga nucleotide libere pentru sinteza noii catene.
Este recomandată includerea cât mai multor baze G şi C în această regiune,
prezenţa lor favorizând o hibridare mai stabilă.
Regiunile poli-G sau poli-C cresc probabilitatea alipirii nespecifice, iar
regiunile poli-T sau poli-A sunt instabile din punct de vedere al legăturilor
complexului primer-secvenţă ţintă. Cu toate acestea, trebuie evitată înlănţuirea
mai multor baze de acelaşi fel. Ideal, succesiunea nucleotidelor în cadul
secvenţei primerilor trebuie să fie întâmplătoare, G/C să reprezinte 50%, iar
totalul bazelor să fie de aproximativ 20. În această situaţie, Tm va fi cuprinsă
între 56 şi 62 °C.
Designul primerilor se realizează cu software-uri speciale, ca Primer
Express v1.5, distribuit de Applied Biosystems, sau Primer3 care poate fi
accesat liber (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/). Acestea sunt astfel concepute
încăt să ia în considerare toate principiile amintite anterior, referitoare la
caracteristicile intrinseci ale primerului. Specificitatea poate fi apoi evaluată
teoretic prin determinarea omologiei secvenţelor primerilor cu secvenţe
genomice din diverse baze de date (ex. GenBank,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html), utilizând software-uri de tip
BLAST (basic local alignment search tool) (ex.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi).
Concentraţia primerilor. Oligonucleotidele sunt utilizate de obicei în
concentraţii de 1 μM, suficiente pentru 30 cicluri de amplificare. Prezenţa unor
concentraţii mai mari poate cauza amplificarea unor secvenţe nedorite. Dacă
159
însă concentraţia primerilor în mediul de reacţie este redusă, eficienţa reacţiei
PCR va scădea.

ADN polimeraza
Metoda concepută de Mullis utiliza o ADN polimerază termosensibilă,
fiind necesară adăugarea enzimei în mediul de reacţie înaintea fiecărei etape de
extensie. Introducerea ADN polimerazelor stabile la temperaturi ridicate a
uşurat mult metodologia de lucru, adăugarea enzimei după fiecare etapă de
denaturare nemaifiind necesară. Prima ADN polimerază termostabilă utilizată a
fost Taq ADN polimeraza, provenită de la bacteria Thermus aquaticus care
trăieşte în izvoare termale.
Datorită mediului din care provine, Taq ADN polimeraza funcţionează
optim la o temperatură de 70-80 °C şi este, probabil, cea mai utilizată
polimerază în aplicaţiile PCR. Există şi alte tipuri disponibile (ex. Pfu ADN
polimeraza, provenită de la Pyrococcus furiosus). Diverse companii
producătoare pun la dispoziţie o multitudine de versiuni ale aceleiaşi enzime
(ex. în cazul Taq ADN polimerazei: Taq DNA Polymerase şi HotStar Taq DNA
Polymerase, Maxima Hot, Start Taq DNA Polymerase, TaqDNA Polymerase
nativă şi recombinantă, Platinum TaqDNA Polymerase, AmpliTaq DNA
Polymerase şi AmpliTaq Gold DNA Polymerase, GoTaq Flexi DNA
Polymerase, modificate şi optimizate pentru diferite aplicaţii.

Nucleotidele libere
Nucleotidele libere reprezintă elementele de bază pentru sinteza ADN-
ului. Concentraţia acestora trebuie să fie cuprinsă între 20 şi 200 μM pentru
fiecare din cele patru tipuri, în proporţii echivalente, pentru a reduce erorile de
încorporare în moleculele nou sintetizate (Innis et al., 1988, cit. De 134).
Nucelotide înalt purificate sunt furnizate şi utilizate ca stocuri, de obicei în
amestec.

Soluţia tampon şi ionii de Mg

Deşi nu participă direct la desfăşurarea reacţiei de polimerizare, prezenţa
unei soluţii tampon în mediul de amplificare este indispensabilă, aceasta având
rolul de a asigura un mediu optim, din punct de vedere chimic, pentru
activitatea şi stabilitatea ADN polimerazei. Compoziţia soluţiei tampon este
optimizată pentru enzima căreia îi este destinată, cei doi reactivi fiind
comercializaţi sub formă de pachet. Cele mai utilizate soluţii tampon conţin 10
mM Tris, pH 8,3; 50 mM KCl; 1,5 - 2,5 mM MgCl2. Acestor componente li se
mai pot adăuga şi alte substanţe, ca PVP, BSA sau glicerol, adjuvanţi ce au
rolul de a îmbunătăţi modul în care decurge amplificarea.
Prezenţa cationilor divalenţi de Mg este de asemenea esenţială pentru
desfăşuarea amplificării, concentraţia optimă determinându-se empiric pentru
160
fiecare protocol în parte. Aceştia se regăsesc sub formă de săruri (de obicei
MgCl2) concentraţia finală fiind cuprinsă, în general, între 0,5 şi 5,0 mM. Ionii
de Mg îndeplinesc următoarele roluri:
- formează un complex solubil cu nucleotidele, esenţial pentru
încorporarea acestora în catena de ADN;
- stimulează activitatea polimerazei;
- ridică temperatura de denaturare a complexului primer-secvenţă
ţintă, conferindu-i stabilitate.
În general, o concentraţie redusă de Mg2+ are ca rezultat acumularea în
cantităţi reduse a produsului de reacţie, în timp ce concentraţia ridicată de Mg2+
favorizează acumularea produşilor nespecifici. Pentru ca ionii de Mg să fie
activi în timpul reacţiei, trebuie evitată prezenţa în soluţia ADN a unor cantităţi
ridicate de agenţi de chelatare (ex. EDTA) sau gupări ionice încărcate negativ
(ex. fosfaţi).

Numărul ciclurilor de amplificare

Numărul ciclurilor necesare pentru producerea unei cantităţi detectabile
de amplicon depinde în principal de concentraţia iniţială a secvenţei de ADN
ţintă. Pentru amplificarea a 50 copii Innis şi Gelfand (72) recomandă 40-45
cicluri PCR, în timp ce doar 25-30 cicluri sunt suficiente pentru amplificarea a
3x105 molecule (134). Această disproporţionalitate se datorează efectului de
plafonare (platou), care implică modificarea ratei de acumulare a produsului
PCR în ultimele faze ale amplificării. Plafonarea este cauzată de degradarea
reactivilor (ex. enzime, nucleotide), consumarea acestora (ex. primeri în cazul
produşilor scurţi, nucleotide în cazul produşilor lungi) sau concurenţa
produşilor nespecifici pentru reactivi. Datorită acestui fenomen, mărirea
numărului de cicluri peste anumie valori nu reprezintă o soluţie. De aceea în
cazul în care produsul de interes nu este obţinut după 30-40 cicluri PCR se
recomandă efectuarea unei reamplificări, utilizând o parte (1 μl) din produsul de
amplificare şi un nou amestec de reacţie.

8.1.2 Reacţii PCR specializate

Pe lângă reacţia PCR tipică, descrisă anterior, au fost create variante

destinate unor aplicaţii specifice: nested PCR, touch-down PCR, real-time PCR
(rt-PCR), reverse transcription PCR (RT-PCR), consensus PCR, PCR
multiplex, colony PCR, hot-start PCR, inverse PCR etc. Real-time PCR este
tehnica cea mai utilizată pentru cuantificarea acizilor nucleici. Reacţiile
multiplex pot fi utilizate atât în etapa de analiză calitativă, cât şi în cea de
cuantificare.

161
 Nested PCR
Un experiment de tip „nested PCR” presupune utilizarea unui set de
primeri localizat între alţi doi primeri pereche, de-a lungul aceluiaşi fragment de
ADN (Fig. 8.4). Într-o primă reacţie se realizează amplificarea cu primerii
externi, urmată de amplificarea cu ceilalţi doi primeri (134). Deoarece
fragmentul mai lung, amplificat în prima etapă, este utilizat ca matriţă în cadrul
celei de-a doua reacţii, metoda se caracterizează printr-o mare sensibilitate şi
specificitate (Zimmermann et al., 1998, citat de 6; 134). Sensibilitatea creşte
datorită reamplificării regiunii de interes, iar sporirea specificităţii se bazează pe
probabilitatea extrem de redusă ca eventualele fragmente amplificate nespecific
în prima etapă să fie amplificate nespecific şi în cea de-a doua reacţie. A doua
reacţie poate fi considerată o strategie de confirmare a identităţii produsului
PCR.

Fig. 8.4 Detecţia genei lectinei de la soia utilizând un protocol nested PCR
. Amplificarea fragmentului ţintă se desfăşoară în două faze utilizând primerii
externi şi apoi primerii interni. (106).

Sensibilitatea mărită a acestei tehnici este însă susceptibilă potenţialelor

contaminări care pot apare în timpul executării protoculului. Trebuie deci
acordată o atenţie deosebită acestui aspect, mai ales în cazul laboratoarelor de
testare.

PCR multiplex
PCR-ul clasic presupune utilizarea unei singure perechi de primeri în
cadrul unei reacţii, având ca rezultat obţinerea unui singur amplicon specific.
Sunt utilizate mai multe perechi de primeri, fiind amplificate simultan mai
multe secveţe ţintă. Acest tip de aplicaţie s-a dezvoltat în ultimii ani, mai ales
după introducerea unor noi tipuri de polimeraze (65). Prezenţa mai multor
perechi de primeri în acelaşi mediu de reacţie determină sporirea numărulului
de hibridări nespecifice şi construcţii primer-dimer, amplificarea preferenţială a
fragmentelor de ADN mai scurte (Atlas şi Bey, 1994, cit de 134), precum şi
162
reducerea limitelor de detecţie (65), făcând destul de dificilă optimizarea
protocoalelor de acest tip. Cu toate aceastea, metoda generează mult mai multă
informaţie, într-un timp mai scurt şi cu costuri mai reduse decât amplificările
PCR clasice (singleplex) (65).
Perechile de primeri trebuie să aibă temperaturi de alipire cât mai
apropiate. De asemenea este necesar ca lungimea fragmentelor amplificate să
fie similară, cele mai scurte fiind amplificate preferenţial. În ceea ce priveşte
validarea teoretică a secvenţelor primerilor, aceasta poate fi făcută cu ajutorul
unor software-uri ca Oligos (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/bare-
1_html/oligos.htm), iar efectele eficienţelor diferite de amplificare pot fi
compensate prin ajustarea empirică a concentraţiilor primerilor. Utilizarea
soluţiilor tampon cu aditivi speciali reduc de asemenea problemele generate de
prezenţa unui număr mare de primeri.

Identificarea contaminării, validarea şi interpretarea rezultatelor

Reacţia PCR are o largă aplicabilitate în practica ştiinţifică, fiind

utilizată ca tehnică analitică sau pregătitoare. Datorită sensibilităţii metodei,
contaminarea cu ADN, chiar şi în cantităţi foarte reduse, poate duce la obţinerea
unor rezultate incorecte. Acest aspect trebuie să constituie îngrijorarea
principală în cadrul laboratoarelor de testare (134). Este de aceea necesar ca
setarea reacţiei să se desfăşoare într-un mediu lipsit de ampliconi proveniţi din
alte reacţii PCR, ADN rezultat din pregătirea probelor anterioare sau substanţe
rezultate în urma proceselor de decontaminare (134). Primele două tipuri de
agenţi produc contaminare de tip „carry-over”, determinând apariţia rezultatelor
fals pozitive, iar a treia categorie constituie substanţe inhibitoare ce favorizează
obţinerea rezultatelor fals negative. Un alt tip de erori care trebuie evitat este
contaminarea între probe analizate în paralel (contaminare încrucişată
contamination), care determină de asemenea apariţia unor rezultate fals
pozitive.
Existenţa spaţiilor de lucru separate fizic, dotate cu echipament dedicat,
reduce riscul contaminării, iar respectarea strictă a normelor de decontaminare
este o condiţie esenţială pentru reducerea ratei de apariţie a rezultatelor fals
pozitive. Roth et al. (130), recomandă de asemenea îndeplinirea anumitor
cerinţe de rutină referitoare la organizarea şi desfăşurarea activităţilor, menite să
asigure menţinerea unui mediu adecvat de lucru pentru orice sistem de analiză
care are la bază reacţia PCR, indiferent de numărul probelor procesate.
Sursele potenţiale de contaminare pot fi uşor întâlnite în laborator (ex.
probele analizate, personalul, instalaţia de aer condiţionat, echipamentele şi
reactivii), motiv pentru care este necesară utilizarea probelor de control,
pozitive şi negative. Acestea sunt necesare pentru a evidenţia prezenţa
contaminanţilor, şi pentru a valida corectitudinea rezultatelor obţinute. Probele
163
de control pentru analize OMG (organisme modificate genetic), specifice încă
din etapa de pregătirea a probelor şi până la cea de cuantificare, sunt prezentate
în continuare conform 219:
 probă de control pentru mediul de lucru (E). Utilizarea ei este
recomandată începând cu etapa de pregătire (omogenizare) a probei
şi are rolul de a identifica prezenţa contaminanţilor în mediul de
lucru (ex. aerul din labortor). Proba constă dintr-un tub conţinând
apă liberă de acizi nucleici, care este lăsat deschis în mediul de
lucru pe tot parcusul analizei.
 probă neutră de control a extracţiei. Controlul are caracter
obligatoriu, începând cu etapa de extracţie a ADN-ului. În acest tip
de probă, materialul biologic este înlocuit cu apă liberă de acizi
nucleici, urmărindu-se evaluarea prezenţei/absenţei contaminării
încrucişate în timpul etapei de extracţie. În fiecare serie de extracţii
trebuie inclusă cel puţin o astfel de probă de control.
 probă pozitivă de control a extracţiei (P) este de asemenea
obligatorie începând cu etapa de extracţie. Indică dacă reactivii
utilizaţi pentru extracţie funcţionează corespunzător şi dacă
extracţia a fost executată în mod corect. În acest scop se utilizează o
probă care conţine în mod sigur fragmentul de interes. Această
probă trebuie utilizată periodic şi la schimbarea stocului de soluţii
de lucru.
 probă pozitivă de control pentru ADN-ul ţintă (C+). Controlul
este obligatoriu, începând cu etapa PCR, pentru a verifica eficienţa
procedurii de amplificare a secvenţei ţintă. Proba este constituită din
ADN extras din MRC sau probă cunoscută pozitivă, reprezentative
pentru secvenţa analizată. Acest tip de probă poate fi înlocuită sau
poate înlocui proba pozitivă de control a extracţiei (P).
 probă negativă de control pentru ADN-ul ţintă (C-). Acest tip de
control are caracter obligatoriu începând cu etapa de amplificare a
ADN-ului. Demonstrează capacitatea procedurii de a nu produce
rezultate fals pozitive în lipsa secvenţei ţintă, utilizarea fiind însă
justificată doar în etapa de validare a metodei. Proba se obţine din
MRC sau probă cunoscută negativă, care nu conţin secvenţa de
interes.
 probă de control a reactivilor (amplification reagent
control/NTC). Utilizarea acestei probe de control este necesară din
etapa PCR. Are rolul de a verifica contaminarea cu acizi nucleici a
reactivilor utilizaţi pentru PCR. Poate fi înlocuită de proba neutră de
control a extracţiei. Proba de control include toţi reactivii necesari,
mai puţin extractul de ADN care este înlocuit de un volum
corespunzător de apă liberă de acizi nucleici.
164
  probă de control a inhibiţiei reacţiei PCR (I). Se utilizează
începând cu etapa de amplificare, având rolul de a confirma
absenţa/prezenţa inhibitorilor ce pot afecta eficienţa amplificării.
Controlul inhibiţiei poate fi făcut prin analiza real-time PCR a unei
diluţii seriate a extractului. O altă strategie o reprezintă utilizarea
unui control extern, întânlnit în literatura de specialitate sub
denumirea „spike”. În această situaţie, extractul analizat este
amestecat cu o soluţie pozitivă pentru secvenţa de interes, care
reprezintă practic controlul pozitiv extern. Uneori, controlul pozitiv
extern poate fi adăugat înaninte de extracţie, caz în care este
reprezentat de o matrice (ex. făină).
Interpretarea rezultatelor testării OMG calitative se face pe baza
profilului obţinut prin separarea electroforetică a produşilor PCR. Mărimea
ampliconilor separaţi este estimată cu ajutorul unei soluţii de ADN
standard (DNA marker) care conţine fragmente de mărimi cunoscute
(Fig.8.5). În cazul în care profilul electroforetic al probei prezintă o bandă a
cărei mărime este aproximativ cea aşteptată, se poate concluziona că banda este
cea căutată, iar proba este pozitivă.
Validarea rezultatelor presupune îndeplinirea următoarelor
condiţii:
 proba de control pentru mediul de lucru (E), proba neutră de control
a extracţiei (B), proba negativă de control pentru ADN-ul ţintă (C-)
şi proba de control a reactivilor (NTC) nu trebuie să prezinte banda
specifică, corespunzătoare ampliconului pe care dorim să-l
detectăm. Pot fi prezente benzi scurte corespunzătoare structurilor
primeri-dimer;
 proba pozitivă de control a extracţiei (P), proba pozitivă de control
pentru ADN-ul ţintă (C+) şi proba de control a inhibiţiei reacţiei
PCR (I) trebuie să prezinte banda corespunzătoare secvenţei ţintă pe
care dorim să o detectăm;
 repetiţiile corespunzătoare aceleiaşi probe trebuie să prezinte
rezultate identice.
În cazul în care există neconcordanţe între probele de control, analiza
trebuie considerată neconcludentă (219).

165
 (a) (b) (c) (d)

Fig. 8.5. Standarde ADN utilizate pentru estimarea mărimii

produşilor PCR. (a) Benchtop 100bp DNA Ladder
(Promega). (b) 100bp DNA Step Ladder (Promega). (c)
Benchtop PCR Markers (Promega). (d) O’GeneRuler 100 bp
(Fermentas). Surse:220.

Un aspect important care trebuie menţionat este faptul că o parte din

probele de control, în special cele pozitive, pot fi reprezentate de materiale de
referinţă certificate (MRC). Utilizarea materialelor de referinţă constituie o
parte esenţială a procedurilor de control al calităţii (fig. 8.6). Trebuie reţinut că
în scopul validării rezultatelor înregistrate, utilizarea probelor de control şi a
materialelor de referinţă este indispensabilă (180, 121).
În cazul în care specificul experimentelor impune o confirmare foarte
precisă a rezultatelor obţinute prin electroforeză, se pot aplica diferite metode,
ca: analiza de restricţie a produşilor PCR; Southern blotting-ul; secvenţierea
produşilor PCR care este cea mai sigură cale de confirmare a autenticităţii
acestora.
Principiul PCR prin metoda Hot Start. Hot Start Taq ADN
polimeraza este unul din compuşii amestecului reactiv care nu este adăugat în
timpul etapei de preparare PCR. Tubul reactiv este încălzit la temperatura
optimă de acţiune a Taq polimerazei, la 80˚C, când se adaugă compusul Hot
Start Taq ADN polimeraza şi PCR demarează la cald.
- există şi o altă variantă cu parafină, în care Taq polimeraza este
încorporată într-o bilă de parafină şi enzima se eliberează la
temepraturi crescute.
- Taq polimeraza este activă la 72˚C şi inactivă la temperatură mai
mică.
- O altă enzimă ampli Taq Gold polimeraza pentru a fi activată,
amestecul se încălzeşte 10 minute la 94˚C.

166
167
Fig.8.6 Designul experimental pentru testarea OMG calitativă. E - probă de control pentru mediul de lucru; B
- probă neutră de control a extracţiei; P - probă pozitivă de control a extracţiei; C+ - probă pozitivă de control pentru
ADN-ul ţintă; C- - probă negativă de control pentru ADN-ul ţintă; NTC - probă de control a reactivilor; I - probă de
control a inhibiţiei reacţiei PCR.
Fig.
 Utilizarea Taq Start Taq polimerazei în prezenţa anticorpilor. Anticorpii
blochează Taq Start polimeraza la temperaturi ambiante şi permit intrarea ei în
acţiune la peste 70˚C.
Realizarea unui PCR la temperaturi mai joase se poate face prin
scăderea progresivă după un număr de cicluri ajungând sub Tm a amorsei.
Metoda este utilă atunci când ADN ţintă este puţin cunoscut.

RT-PCR sau studiul ARN prin PCR

RT-PCR. Pentru studiul ARN prin PCR este necesară transcripţia
inversă care transformă ARNm în ADNc şi apoi se utilizează PCR.
Principiu: o enzimă, trancriptaza inversă, transformă ARNm în ADNc
care va fi amplificat prin PCR. Tehnica PCR are nevoie de ADN polimeraza şi
amorsă.
Se utilizează trei tipuri de amorse pentru sinteza ADNc:
- Oligo dezoxitimine (oligo dT), compuşi ai dezoxitimidinei trifosfat
12-18 dTTP care sunt utilizaţi pentru RT- PCR al ARNm. ARNm,
fiind poliadenilat în 3' (coada poliA) oligonucleotidul dTTP se va
hibrida în 3' a ARNm şi permite reverstrancripţia şi apoi
amplificarea.
- Amorsele randomizate sunt hexanucleotide, sub forma unui
amestec de mai multe amorse foarte scurte de 6 perechi de baze
conţinând toate secvenţele perechi de baze ale celor 6 nucleotide (3
purinice şi 3 pirimidinice în ADN, ARN, 46). Această mare
diversitate permite unor oligonucleotide să se hibrideze cu ARNm
pentru a servi ca amorse. Când ARN este bogat în GC, adică are
structură puternică, unii autori recomandată acest tip de amorsă (fig.
8.7).
- Amorsă specifică, cu secvenţă complementară ARN-ului de
studiat.

Fig. 8.7 Primerii utilizaţi în RT-PCR

168
 Amorsele funcţionează similar. Metoda cu hexanucletide dă
randamentul cel mai bun.
Transcriptaza inversă sau reverstranscriptaza este o ADN polimerază,
ARN dependentă, capabilă de o transformare ARN în ADNc.
Se utilizează des două RT:
- AMV-RT, extrasă din celule infectate cu virusul mieloblastozei aviare. Are
în plus o activitate importantă de RNază H.
- MMLV, extrasă din virusul leucemiei şoarecelui transformat de Molony.
Activitatea de RNază H este mult mai slabă decât la tipul AMV. Ambele
enzime au activitate ADN polimerazică 5'- 3'. ADN obţinut ajunge la 10
kb. Există o variantă AMLV mai eficace numită Superscript RNază H- care
nu are activitate de RNază H. Matricea ARN nefiind distrusă enzima va
acţiona cu randament mai bun.
ARN. Pentru a obţine o reacţie RT optimă este necesară obţinerea unui
ADNc de calitate care să fie nedegradat de ARN ază. Pentru aceasta, în reacţie
se adaugă sistematic un inhibitor de RNază numit Reneazin. Există mai multe
tehnici de extracţie a ARN. Se recomandă extracţie într-o singură etapă. Uneori
este necesară obţinerea ARNm pentru determinarea extremităţii 5' sau 3' a
ADNc. Atunci se recomandă să se elimine ARN care nu este poliadenilat, pe
care oligo dT nu se poate fixa.
În timpul extracţiei ARN se poate produce contaminarea cu ADN. Se
tratează ARN cu DNază înaintea transcripţiei inverse pentru a distruge resturile
de ADN. Distrugerea ADN este necesară pentru că acesta conţine pseudogene
(149).
Bogăţia în GC a ARNm
Structurile secundare sunt mai greu denaturate şi împiedică acţiunea RT.
Pentru a limita acest risc şi a nu se obţine ADNc incomplet este indispensabilă
denaturarea ARN înaintea începerii transcripţiei inverse. Se mai recomandă
creşterea temperaturii de reacţie la 42˚C în loc de 37˚C. Transcriptazele inverse
acţionează până la 50˚C.
O altă posibilitate este utilizarea unei ADN polimeraze termostabilă care
are activitate de transcriptază inversă. Exemplu, ADN pol Tth.
ADN pol Tth are două activităţi:
- activitate ADN polimerazică ca şi Taq polimeraza (nucleazică 5'-3');
-nu are activitate exonucleazică 3'-5'.
Temperatura optimă de acţiune este de 70˚C .
Activitatea ADN polimerazică ARN dependentă, deci de transcriptază
inversă, necesită Mg sub formă de sulfat; poate demara la 60˚C înainte de a
începe acţiunea ADN polimerazei în faza PCR. Este necesară optimizarea
reacţiei RT PCR făcând o gamă de soluţii MgSO4 în care concentraţia MgCl

169
este de două ori mai mare decât a sulfatului, (în general se începe cu 1,5 mM
MgCl şi 0,75 mM MgSO4).
Riscul de contaminare este mic. Poate utiliza un decontaminant.
Inconveniente: are activitate optimă la 70˚C şi dacă există contaminare
cu ADN se amplifică preferenţial acesta. Pentru a-l elimina se adaugă ADNază.
RT clasică durează 60 minute. Dacă se foloseşte Tth ADNpol nu trebuie depăşit
15-30 minute deoarece poate determina ADNc trunchiat (149).

8.2 Real-time PCR

Caracterul cantitativ al metodei real-time PCR este conferit de

posibilitatea stabilirii unei corelaţii directe între cantitatea produsului de
amplificare acumulat şi numărul iniţial de copii ale moleculei ţintă (171).
Particularităţile reacţiei PCR convenţionale nu permit realizarea unei astfel de
corelaţii, principala cauză fiind eficienţa defectuoasă a amplificării, care nu este
constantă între diferitele reacţii, dar mai ales între ciclurile aceleiaşi reacţii (87;
171). Această limită a fost depăşită în 1992 de către Higuchi şi colaboratorii săi,
care au iniţiat analiza cineticii reacţiei de amplificare prin crearea metodei real-
time PCR capabilă să detecteze produşii de amplificare odată cu formarea şi
acumularea acestora (87; 171). Sistemul de analiză în timp real folosea EtBr
pentru detecţia ADN-ului şi un thermal cycler adaptat să trateze mediul de
reacţie cu lumină UV şi să înregistreze fluorescenţa emisă de fluorocrom.
Excitaţia moleculelor de EtBr şi înregistrarea fluorescenţei se realizau la
sfârşitul fiecărui ciclu de amplificare, după etapa de extensie. Valoarea
intensităţii fluorescente înregistrate şi numărul ciclurilor PCR au fost introduse
într-un grafic care a oferit o imagine a procesului de amplificare, prezentând
acumularea produsului de amplificare în funcţie de timp.
Metodologia real-time PCR utilizată astăzi este o îmbunătăţire a
tehnicii iniţiale create de Higuchi et al. şi reprezintă cea mai performantă
strategie de cuantificare a acizilor nucleici (26; Miraglia et al., 2004, şi
Anklam et al., 2002, citat de 50;87;171;2). Pe lângă precizia cuantificării, a
crescut şi capacitatea de analiză, iar incidenţa erorilor şi a rezultatelor fals
pozitive este mult redusă (26; 2). Deoarece amplificarea şi detecţia sunt
combinate într-o singură analiză (sistem închis), riscul de contaminare este
de asemenea redus. Tehnica este utilizată în special pentru detecţia agenţilor
patogeni, analiza expresiei genice, a polimorfismului determinat de o singură
nucleotidă (single nucleotide polymorphism/SNP), analiza aberaţiilor
cromozomiale etc. Real-time PCR este de asemenea cea mai utilizată şi mai
precisă metodă de cuantificare a conţinutului modificat genetic al diferitelor
materii prime sau procesate de origine vegetală destinate consumului alimentar
al oamenilor sau animalelor (26; 219, 87; 41).

170
 8.2.1 Principiul real-time PCR

Tehnica real-time PCR utilizează primeri specifici pentru amplificarea

secvenţei ţintă, iar în tandem cu aceştia, construcţii oligonucleotidice speciale
(sonde marcate fluorescent) sau alte tipuri de molecule incluse în mediul de
reacţie indică acumularea produsului PCR (24). Astfel, de-a lungul mai
multor cicluri de amplificare, construcţiile oligonucleotidice care sunt de
asemena specifice secvenţei ţintă vor determina modificarea semnificativă a
semnalului fluorescent (24).
Teoretic, în cadrul amplificării, acumularea produşilor PCR se
desfăşoară exponenţial. În practică însă, reacţia nu atinge niciodată eficienţă
maximă. Mai mult, după 30-40 cicluri de amplificare intervine fenomenul de
plafonare (1) care afectează reacţiile în mod independent şi diferit (Fig.8.8).

Fig.8.8 . Cinetica reacţiilor de amplificare. În cazul

amplificării paralele a mai multor repetiţii ale aceleiaşi
sonde, curbele de răspuns sunt foarte asemănătoare în
faza exponenţială. Spre sfârşitul reacţiei profilurile
sunt însă extrem de diferite (curbele colorate mai
intens).

În cadrul reacţiei PCR convenţionale, determinarea este făcută într-un

singur punct, la sfarşitul amplificării (determinare end-point). De aceea
proporţionalitatea între cantitatea finală de ampliconi şi cea iniţială de copii
ale secvenţei ţintă este redusă, nefiind posibilă cuantificarea. S-a demonstrat
totuşi empiric, că această proporţionalitate există în timpul fazei exponenţiale a
amplificării, înainte să intervină plafonarea. Astfel, dacă se cunoaşte numărul de
cicluri necesare pentru atingerea unei anumite concentraţii a moleculei ţintă,
numărul iniţial de copii ale acesteia poate fi determinat cu precizie. Pentru
171
calcularea concentraţiei moleculei de interes într-o probă necunoscută este
necesară utilizarea unei curbe de calibrare (denumită şi curbă standard) (6)
obţinută prin analiza unui set de calibratori (probe standard) (152, 153, 154,
155) reprezentat de probe al căror număr iniţial de copii ale secvenţei ţintă este
cunoscut (Fig.8.9).

Produşi PCR
Produşi PCR

Conţinut
iniţial

Numărul de cicluri PCR Conţinutul iniţial

Conţinut

Cicluri PCR
iniţial
Produşi PCR

Numărul de cicluri PCR Conţinutul iniţial

Fig. 8.9. Diferenţele dintre analiza PCR convenţională (a, b) şi analiza real-
time PCR (c, d). Graficele (b, d) reprezintă concentraţia produşilor PCR (axa
OY) în funcţie de conţinutul OMG procentual al probei iniţiale (axa OX), în
punctul A. (a) Punctul A în care sunt colectate datele pentru analiză reprezintă
un anumit număr de cicluri de amplificare. (b) Se observă că probele B şi C, în
cazul cărora a intervenit fenomenul de plafonare, conţin cantităţi de ampliconi
similare, cu toate că numerele iniţiale de copii ţintă diferă de zece ori. Situaţia
este asemănătoare în cazul probelor C şi D. Este astfel ilustrată lipsa
proporţionalităţii dintre concentraţia ADN-ului şi porduşii PCR. (c) Punctul A
în care sunt colectate datele pentru analiză reprezintă o anumită valoare a
concentraţiei ampliconilor. (d) Se observă existenţa unei relaţii de liniaritate
directă între produşii PCR şi concentraţia ADN-ului în faza exponenţială a
amplificării, corelarea celor două valori fiind posibilă. (După Fagan cit de 1
modificat).

Atât în cazul probelor standard, cât şi al celor necunoscute,

monitorizarea acumulării produşilor de reacţie odată cu desfăşurarea

172
 amplificării se face prin înregistrarea emisiei fluorescente a unor substanţe
speciale aflate în mediul de reacţie.
Este evident că între semnalul fluorescent şi cantitatea de ampliconi
formaţi există o relaţie de proporţionalitate directă, ambele crescând odată cu
numărul de cicluri de amplificare (87; Grove, 1999, cit de 24). Concentraţiile
iniţiale ale moleculei ţintă şi numerele ciclurilor PCR sunt apoi utilizate pentru
construirea curbei standard, care reprezintă de fapt o regresie liniară.
Concentraţia moleculei ţintă reprezintă variabila independentă, iar valoarea
numărul ciclurilor PCR este variabila dependentă. Trebuie remarcat că în
ciclurile iniţiale semnalul generat este slab şi nu poate fi deosebit de semnalul
de fond. Odată cu acumularea unei cantitaţi mai mari de produs semnalul creşte
semnificativ, ridicându-se deasupra celui de fond (Fig. 8.10). Din acest moment
acumularea produsului de amplificare este evidentă, putându-se face colectarea
datelor pentru analiza cantitativă.
Fluorescenţă

Etapa de plafonare

Pragul limită
Faza Curbe de
liniară amplificare

Număr de cicluri
Semnal de fond

Fig. 8.10. Graficul unei amplificări real-time PCR construit pe o scară

(semi)logaritmică. Sunt evidenţiate cele trei faze tipice tuturor reacţiilor de
amplificare: faza iniţială, în care semnalul generat de acumularea ampliconilor nu
poate fi deosebit de semnalul de fond; faza exponenţială, în care semnalul generat de
acumularea ampliconilor depăşeşte semnalul de fond; faza în care intervine
plafonarea, eficienţa amplificării reducându-se semnificativ. (171 modificat)

8.2.2 Eficienţa amplificării în analizele real-time PCR

Eficienţa reacţiei PCR este exprimată ca rată de amplificare a cărei

valoare teoretică este 2, ceea ce înseamnă că numărul de copii ale unui
amplicon este dublat în fiecare ciclu PCR (111). În cazul unei eficienţe de
173
100%, raportul dintre numărul iniţial al copiilor secvenţei ţintă în două probe
diferite este dat de formula:

N0A
 2 CTB CTA  (4)
N 0B

unde N0A şi N0B reprezintă numerele iniţiale de molecule ţintă din

probele A, respectiv B, iar CTA şi CTB sunt valorile CT (cycle threshold- prag)
corespunzătoare acestora. Valoarea CT trebuie înţeleasă ca un interval de timp
ce reprezintă un număr de cicluri de amplificare. După cum s-a menţionat
anterior, semnalul fluorescent al unei probe este determinat de produsul de
amplificare, fiind direct proporţional cu cantitatea acestuia. Astfel, presupunând
că proba A atinge acelaşi nivel al fluorescenţei, respectiv pragul limită
(threshold), cu patru cicluri mai târziu decât proba B, adică are nevoie de patru
cicluri de amplificare adiţionale, putem conchide că proba A conţinea iniţial de
16 ori (2 x 2 x 2 x 2) mai puţine molecule ţintă decât proba B. Trebuie subliniat
faptul că semnalul probei cu mai puţine molecule va atinge mai târziu
valoarea pragului, după parcurgerea mai multor cicluri de amplificare.

Analiza grafică a datelor experimentale

Odată cu desfăşurarea amplificării în cadrul unui sistem real-time PCR,
semnalul fluorescent din mediul de reacţie este măsurat, iar pe baza acestor date
se va realiza o reprezentare grafică a acumulării produşilor PCR în funcţie de
numărul ciclurilor de amplificare. Scala pentru fluorescenţă poate fi normală
sau logaritmică, cea de-a doua facilitând distingerea celor trei faze ale
amplificării, menţionate şi în Fig.:
 faza iniţială, în care intensitatea fluorescenţei variză foarte puţin,
corespunzând semnalului de fond;
 faza liniară, în care reacţia se desfăşoară exponenţial iar acumularea
ampliconilor este evidentă;
 stadiul de platou (plafonare), în care rata amplificării se reduce
considerabil.
Pragul limită reprezintă punctul de echivalenţă pentru toate reacţiile
incluse într-o analiză.
În practică, alegerea pragului limită este făcută de către operator,
reprezentând unul dintre elementele subiective al analizei real-time PCR.
Punctul în care acesta este plasat trebuie ales foarte atent (Fig.8.11). În primul
rând trebuie să fie situat în cadrul fazei exponenţiale şi deasupra semnalului de
fond. Pe scală logaritmică, faza de creştere exponenţială apare sub forma unei
drepte, în timp ce pe o scală normală corelaţia între rata de acumulare a
ampliconilor şi alura curbei este mai greu de făcut. Nivelul de poziţionare al

174
 pragului trebuie ales astfel încât, în acel punct, graficele probelor să fie liniare şi
paralele, iar cele ale repetiţiilor să coincidă cât mai mult.
Fluorescenţă

Curbe de amplificare

(a) Pragul limită

Număr de cicluri

Etapa de plafonare
Fluorescenţă

Pragul limită

(
Faza
(b) liniară
CT

Număr de cicluri
Semnal de fond

Puncte de calibrare
Valori CT

(
(c) Curba standard

Log(conc. iniţială)

Fig.8.11 . Analiza grafică a datelor experimentale. (a) Poziţionarea pragului limită pe

o scală normlă. Curba de amplificare are o alură sinuoasă. (b) Pe scală logaritmică, în
faza exponenţială, curba de răspuns apare sub forma unei drepte. (c) Curba standard (de
calibrare) este construită într-un grafic în care axa OY corespunde valorilor CT iar axa
OX logaritmului numărului iniţial de copii ale fragmentului ţintă.

După poziţionarea pragului limită, software-ul calculează automat

valorile CT. Practic, CT reprezintă o valoare zecimală, ce exprimă numărul de
cicluri PCR la care curba de amplificare generată de modificarea intensităţii
semnalului fluorescent intersectează pragul limită (192; 163). Corelaţia dintre
175
numărul iniţial de copii ale secvenţei ţintă şi valoarea CT este următoarea: cu
cât cantitatea iniţială de ADN ţintă este mai mare, cu atât produsul PCR se
acumulează şi este detectat mai repede, iar valoarea CT este mai mică.
În continuare este generată curba standard, în funcţie de datele atribuite
probelor cunoscute (standarde/calibratori) incluse în experiment şi de valorile
CT determinate experimental (Fig.8.12). Limitele curbei trebuie să corespundă
unui interval cât mai larg. Una dintre condiţiile de validare a rezultatelor este ca
valorile CT ale probelor necunoscute să se încadreze în intervalul dat de valorile
CT ale probelor standard.
După construirea curbei standard sunt calculaţi anumiţi parametri ai
acesteia (ex. valoarea R2, panta curbei standard, eficienţa amplificării) care
oferă informaţii despre experiment şi permit validarea rezultatelor obţinute. În
cazul în care parametri curbei standard sau celelalte elemente de validare nu se
încadrează în limitele optime, rezultatele analizei nu trebuie valorificate.
Datele brute sunt exportate într-un fişier Excel, iar apoi, pentru
determinarea procentului OMG, se aplică formulele de calcul specifice metodei
alese (metoda curbei standard sau metoda ΔCT).

Metode de calcul
Cuantificarea relativă a conţinutului OMG este bazată întotdeauna pe
analiza a două secvenţe ţintă, una corespunzătoare transgenei, iar cealaltă
specifică unei gene de referinţă. Amplificarea celor două secvenţe ţintă
trebuie făcută în paralel, fie în reacţii diferite (reacţii simplex) fie în acelaşi
mediu de reacţie (reacţie duplex).
Ca şi în cazul altor metode de măsurare a concentraţiei analitului dintr-o
probă, în cadrul testărilor OMG este necesară utilizarea unor materiale cu
proprietăţi cunoscute, denumite standarde, materiale de referinţă sau calibratori,
în vederea construirii curbelor standard (de calibrare) cu ajutorul cărora va fi
apoi determinat conţinutul probelor necunoscute (Fig.7.17). Probele standard
sunt analizate în paralel cu probele necunoscute şi cu cele de control, pentru
fiecare fiind determinate valori CT sau ΔCT, în funcţie de metoda de calcul
utilizată.
Amplificarea probelor necunoscute şi a calibratorilor trebuie să se
desfăşoare în paralel, în cadrul aceluiaşi experiment. În acest context este
importantă evaluarea eficienţei de amplificare a fiecărei probe necunoscute,
comparativ cu cea a standardelor, aspect care este adesea ignorat sau considerat
neglijabil (130).
În ceea ce priveşte cuantificarea acizilor nucleici, în general, modele
matematice utlizate pentru prelucrarea datelor sunt numeroase şi variate, în
cazul testării OMG fiind aplicate însă doar două metode de calcul (26; 41;
191):

176
 (a)

(b)

Fig.8.12 . Mod de prezentare a datelor obţinute în urma unui

experiment real-time PCR. (a) Ferestre de analiză a software-ului
Rotor-Gene 6.1 (192). (b) Fereastra principală a software-ului
LightCycler 480 1.2 (221).
 metoda ΔCT, bazată pe compararea valorilor CT în vederea
detrminării conţinutului OMG (%);
 metoda curbei standard (standard curve method/approach), care
presupune măsurarea cantităţilor absolute ale moleculelor ţintă, la
nivel de echivalenţi genomici haploizi.
Această strategie de calcul implică desfăşurarea reacţiilor de amplificare
în sistem duplex. Presupunerea inerentă acestei strategii este că eficienţele celor
două sisteme de amplificare (de referinţă, respectiv transgenic) sunt aceleaşi
atât în cazul unei probe date, cât şi între diferitele tipuri de probe (ex. MRC-uri
şi matrici compozite sau intens procesate). Deoarece există diferenţe cel puţin
între tipurile de probe analizate, această supoziţie este considerată nepotrivită în
majoritatea situaţiilor (26). Totuşi, o astfel de strategie este mai eficientă din
punct de vedere economic şi de asemenea nu este influenţată de erorile de
pipetare (2) (Fig. 8.13).

177
178
Fig. 8.13 Utilizarea curbei standard pentru determinarea concentraţiei probelor necunoscute în cadrul unei
analize de cuantificare absolută. (După Roche (2006 a), modificat.)
 (a) (b)

(
c)

Fig. 8.14. Metoda ΔCT. (a) Pentru fiecare punct al curbei standard este utilizată
câte o probă standard diferită, iar amplificarea se celor două secvenţe de interes
se face în sistem duplex. (b) Designul experimental al unei analize. (c)
Determinarea valorilor ΔCT, construirea curbei standard şi determinarea
concentraţiei în OMG-uri. (Sursă:122.)

În Fig. 8.14c este reprezentat unul dintre modele de prelucrare a datelor

care utilizează valoarea ΔCT, panta M şi intersecţia B (24).

Metoda curbelor standard

În cazul acestei metode (Fig.8.15a) exprimarea conţinutului procentual
de material modificate genetic se face cu ajutorul unor valori absolute obţinute
în urma experimentului real-time PCR. Cele două molecule de interes vor fi
amplificate în sisteme simplex (122) (Fig.8.15b), fiecare probă fiind deci
prezentă în două reacţii separate, una specifică (primeri şi sondă) transgenei, iar
cealaltă genei de referinţă (130). Este astfel necesară construirea a două curbe
standard, câte una pentru fiecare secvenţă ţintă.
Spre deosebire de strategia anterioară, în acest caz se utilizează un
singur calibrator (soluţie cu concentraţie cunoscută a moleculei de interes),
punctele curbei standard reprezentând diluţii seriale ale acestuia (26). În
acest fel diferenţa dintre eficienţele celor două reacţii (sistemul transgenic,
respectiv cel de referinţă) este luată în considerare, cu alte cuvinte nu se mai

179
face presupunerea că acestea sunt egale. Sunt considerate egale doar eficienţele
de amplificare ale standardului şi probelor necunoscute amplificate în paralel.
Având însă în vedere că de cele mai multe ori între cele două tipuri de matrici
există diferenţe, şi această presupunere poate duce la supra- sau subestimarea
conţinutului OMG (26). În majoritatea protocoalelor studiate standardul utilizat
a fost reprezentat de un MRC cu 2% sau 5% material transgenic.
Pe baza rezultatelor amplificării seriei de diluţii obţinute din proba
standard, sunt construite cele două curbe de calibrare, care redau relaţia dintre
valorile CT şi logaritmul numărului de copii al moleculei ţintă. Curbele standard
sunt utilizate apoi pentru determinarea numărului iniţial de copii ale genei de
interes din proba necunoscută, prin extrapolare, introducând valorile CT
obţinute în ecuaţiile asociate regresiei liniare a acestora (150; 192; 130; 171)
(Fig.8.15c). Valorile probelor analizate trebuie să se încadreze între limitele
curbei standard, cele care ies în afara acestor valori fiind eliminate datorită
erorilor pe care le pot genera (221; 171).
Procentul de material modificate genetic este determinat prin
raportarea numărului de copii ale transgenei la numărul de copii ale
endogenei (130). Această raportare permite normalizarea datelor, depăşindu-se
eventulale neajunsuri determinate de calitatea diferită a extractelor. Valoarea
obţinută este relativă şi reprezintă conţinutul OMG al probei necuoscute
exprimat ca număr al copiilor de ADN MG raportat la numărul copiilor de
ADN specific taxonului ţintă, la nivelul genomului haploid (Fig. 8.15d).
Un alt element menţionat în literatura de specialitate (94; 78) ca fiind
necesar pentru calcularea conţinutului de ADN modificat genetic este factorul
de corecţie. Acesta exprimă raportul dintre numărul copiilor secvenţei
transgenice şi cel al endogenei, la nivelul genomului haploid al liniei
transgenice analizate.

180
Fig. 8.15.Metoda curbelor standard

181
 8.2.3 Materiale de referinţă certificate

Materialele de referinţă certificate (MRC) reprezintă o categorie de

probe foarte importante în cadrul testării OMG, fiind utilizate pentru controlul
calităţii sau validarea metodelor (184; 157; 122). În ceea ce priveşte testările
cantitative, MRC-urile joacă un rol crucial, cel de calibratori ADN (122; 152;
26) necesari construirii curbelor standard. În această situaţie, variabila
independentă necesară construirii acestor curbe cu ajutorul regresiei liniare, este
reprezentată de valoarea pentru care MRC-urile sunt certificate.
Conform SR EN ISO 24 şi Regulamentului 641/2004 (218, 222), MR-ul
este un material sau o substanţă ale cărei proprietăţi sunt suficient de omogene
şi bine stabilite pentru a fi folosite la calibrarea unui aparat, evaluarea unei
metode sau atribuirea de valori altui material. MRC-urile reprezintă o clasă
aparte de MR-uri, iar ca definiţie, MRC-ul este un material de referinţă însoţit
de un certificat oficial care îi atestă proprietăţile.
Utilizarea acestor materiale în cadrul analizelor reprezintă deci un
element cheie pentru asigurarea calităţii şi validarea rezultatelor (1).
Soluţiile de calibrare utilizate conţin fie ADN genomic (ADNg) fie
secvenţe de ADN plasmidial (ADNp), ambele tipuri prezentând avantaje şi
limite. Un al treilea tip de calibratori este bazat pe ampliconi hibrizi, ce includ
ambele secvenţe ţintă. Utilizarea acestora în cadrul testărilor OMG a fost
descrisă de Pardigol et al. (115) (40; 50).
Reticenţa faţă de utilizarea moleculelor plasmidiale ca materiale de
referinţă a avut ca principal argument lipsa comutabilităţii. Această proprietate
se referă la concordanţa dintre rezultatele obţinute pentru acelaşi produs
măsurand în condiţii diferite (i.e. secvenţa ţintă în MRC-uri bazate pe ADNg,
MRC-uri bazate pe ADNp, respectiv probe obişnuite) (223, 155). Cu alte
cuvinte s-a luat în calcul posibilitatea existenţei unor diferenţe de amplificare
între calibratorii pe bază de ADNg şi cei pe bază de ADNp, pe de o parte,
precum şi între calibratori şi probele obişnuite (necunoscute), pe de altă parte.
Diverşi autori (Charels et al., 2007 şi Mattarucchi et al., 2005, cit de 180;
Terry et al., 2002, cit de 26; 98;111; 155) au demonstrat că între cele două
tipuri de calibratori nu există diferenţe semnificative, în unele cazuri rezultatele
obţinute utilizând MRC-urile pe bază de ADNp fiind chiar superioare (26).
Lucrările enumerate prezintă de asemenea o serie de informaţii referitoare la
alte caracteristici şi avantaje ale calibratorilor plasmidiali.

8.2.4 Instrumentele Real-Time PCR

Un instrument real-time PCR are ca părţi componente de bază blocul

termic ce asigură desfăşurarea ciclurilor de amplificare, dispozitivul pentru
excitarea fluorocromilor şi sistemul optic destinat detectării şi înregistrării
182
semnalului fluorescent. Funcţionarea acestui instrument este controlată de un
software specific instalat pe un PC conectat la instrument (fig. 8.16).

(a) (b)

Fig. 8.16 Rotor-Gene 3000 (Corbett Research). (a) Thermal cycler-ul

Rotor-Gene 3000. (b) Camera de încălzire/răcire şi sistemul optic. Sursa de
excitare luminoasă este plasată în partea laterală a camerei în care sunt
aşezate probele, iar fotomultiplicatorul care detectează emisia fluorescentă
este aşezat sub această cameră. Instrumentul are patru canale de detecţie
care pot fi utilizate simultan în analizele multiplex: FAM (470/510
excitare/detecţie), JOE (530/555 excitare/detecţie), ROX (585/610
excitare/detecţie) şi Cy5 (625/665 excitare/detecţie). Rotorul pe care se
aşează tuburile cu probe este interschimbabil permiţând amplifiarea
simultană a 36 sau 72 probe. (192).

În momentul de faţă este disponibil un număr considerabil de aparate

destinate analizelor real-time PCR (fig. 8.17). Principalele diferenţe de ordin
tehnic dintre acestea sunt date de numărul canalelor pe care se poate realiza
detecţia, viteza de analiză, numărul de reacţii care se pot desfăşura în paralel şi
opţiunile de analiză ale software-ului. Cele mai utilizate instrumente real-time
PCR sunt (182; 87; 122):

183
 (a) (b)

(c)

(d)

Fig. 8.17. Instrumentul real-time PCR LightCycler 480 (Roche). (a)

Sistemul de cuantificare LightCycler 480 şi staţia de lucru. (b) Modul special
de aranjare a componentelor sistemului optic. (c) Vedere interioară a
instrumentului şi a părţilor sale componente. (d) Blocul termic şi modul de
integrare al elementului Therma-Base. (221)

 7900HT (până la 384 probe), 7700, 7500, 7500 şi StepOnePlus,

sisteme produse de Applied Biosystems;
 LightCycler 480 (până la 384 probe), LightCycler 2.0 şi
LightCycler 1.5 produse de Roche;
 Rotor-Gene 6000 (6 canale de detecţie) şi Rotor-Gene 3000 (4
canale de detecţie) produse de Corbett Research; ambele utilizează

184
 o platformă rotativă pentru asigurarea unei uniformităţi de
temperatură crescute;
 Chromo4, DNAEngine Opticon, iCycler, iQ, MyiQ şi iQ5 produse
de BioRad;
 Mastercycler şi RealPlex (Eppendorf);
 Mx3000p, Mx3005p şi Mx4000 (Startagene);
 SmartrCycler şi GeneXpert (Cepheid);
 InSyte (Biogene), care are şapte canale de detecţie şi este foarte
rapid;
 SuperConvector (AlphaHelix), realizează programe de amplificare
foarte rapide;
 DT-322 (DNA Technology), se remarcă prin dimensiuni foarte
reduse;
 Exicycler (Bioneer);
 OpenArray NT Cycler (BioTrove);
 Quantica (Techne).
Pe lângă software-urile de control specifice instrumentelor, există şi
pachete software create pentru analiza datelor real-time PCR (ex. BestKeeper,
Normfinder, Q-Gene, GenEx, qBasePlus, RDML etc.), fără însă a avea o mare
aplicabilitate în domeniul testărilor OMG (182).
Platformele Rotor-Gene 3000 şi LightCycler 480 sunt prezentate în
Fig.7.20.

8.2.5 Sisteme de detecţie

Există două categorii de sisteme ce pot fi utilizate pentru monitorizarea

amplificării:
 care utilizează substanţe de intercalare (ex. EtBr, SYBR Green I,
LC Green, BOXTO)
 care utilizează sonde/primeri marcaţi cu fluorocromi (ex. TaqMan,
FRET, Molecular Beacons, Scorpions, TaqMan MGB).
În cazul optimizării corespunzătoare a reacţiei de amplificare, sistemul
de detecţie utilizat nu este important decât sub aspect economic, substanţele de
intercalare fiind mult mai ieftine. De cealaltă parte, sondele/primerii marcaţi
asigură optimizarea uşoară a protocolului de amplificare, din perspectiva
specificităţii, aceste sisteme fiind îndeosebi recomandate în cazul reacţiilor
multiplex.

Substanţe de intercalare
Prima aplicaţie a tehnicii real-time PCR s-a desprins direct din
experimentele lui Higuchi et al., EtBr fiind însă înlocuită cu SYBR Green I,

185
substanţă fluorescentă de intercalare caracterizată printr-o toxicitate mult mai
redusă şi o specificitate mult mai mare (68). SYBR Green I se intercalează în
ADN-ul dublu-catenar, dar nu se poate lega şi la ADN-ul monocatenar.
O consecinţă a intercalării este intensificarea fluorescenţei, de 800-1000
ori, substanţa fiind practic nefluorescentă când se găseşte liberă în soluţie.
Apariţia emisiei fluorescente se datorează unor modificări ale structurii interne
după intercalarea între catenele moleculei de ADN (87). Excitarea este produsă
de lumina albastră (λmax = 488 nm), iar energia acumulată este disipată sub
formă de lumină verde (λmax = 422 nm) (184) (fig. 8. 18).

(a) (b) (c)

Fig.8.18 . Etapele de bază ale detecţiei ADN-ului cu SYBR Green I în real-

time PCR. (a) În stare liberă moleculele de SYBR Green I au o emisie
fluorescentă redusă. Odată cu alipirea primerilor se formează mici regiuni
dublu-catenare la care intercalează SYBR Green I, iar semnalul fluorescent al
acestora se intensifică. (b) În faza de elongaţie mai mult ADN dublu-catenar
este disponibil pentru intercalarea moleculelor fluorescente. (c) La sfărşitul
elongaţiei cantitatea de ADN dublu-catenar este maximă, moment în care se
măsoară intensitata fluorescenţei. (221).

Principiul detecţiei şi cuantificării este următorul: odată cu începerea

reacţiei PCR, cantitatea în creştere de ADN nou sintetizat leagă o cantitate tot
mai mare de SYBR Green I, rezultatul fiind intensificarea semnalului
fluorescent (Fig.8.18).
O limită a acestei strategii este reprezentată de recunoaşterea
nespecificică a ADN-ului dublu-catenar. Toate moleculele de acest tip prezente
în mediul de reacţie, inclusiv produşii PCR nedoriţi şi primer-dimerii, sunt
intercalate de SYBR Green I şi participă la formarea semnalului total. Pentru
depăşirea acestei probleme, după încheierea amplificării, se face analiza curbei
de denaturare a produşilor de reacţie (Fig. 8.19). În cadrul acestei analize
produşii rezultaţi (ADN dublu-catenar ţintă, ADN dublu-catenar nespecific,
primer-dimeri) sunt denaturaţi treptat prin creşterea graduală a temperaturii, în
paralel fiind înregistrată modificarea semnalului fluorescent. Această
modificare este redată în funcţie de variaţia temperaturii, sub forma unei curbe,
într-un grafic cu două axe (Fig. 8.19, drepta). Fluorescenţa se reduce treptat
datorită efectelor pe care creşterea temperaturii le are asupra proprietăţilor

186
interne ale fluorocromilor legaţi la ADN-ul dublu-catenar (Nygren et al., 1998,
87.)

Fig. 8.19. Analiza curbei de denaturare. Intensitatea semnalului fluorescet

se reduce brusc odată cu denaturarea unei cantităţi mai mari de ADN dublu-
catenar. Punctul de denaturare corespunde punctului de inflexiune al curbei
de topire, care se determină ca maxim al primei derivate negative a curbei de
denaturare. Ampliconul generat prin amplificarea secvenţei ţintă este mai
lung decât primer-dimerii şi astfel necesită pentru denaturare o temperatură
mai mare. (87)

În momentul în care temperatura de denaturare a ADN-ului dublu-

catenar este atinsă, moleculele sunt puse în libertate şi fluorescenţa scade brusc.
Acest nivel de temperatură este apoi calculat ca maxim al primei derivate
negative a curbei de denaturare. Deoarece fiecare tip de moleculă dublu-
catenară are o temperatură specifică de denaturare este posibilă discriminarea
diferiţilor produşi PCR (specifici sau nespecifici).
Analiza curbei de disociere reprezintă de asemenea o alternativă simplă,
ieftină, rapidă şi sigură pentru metodele de identificare a OMG-urilor bazate pe
PCR-ul convenţional (154). Identificarea şi discriminarea ampliconilor se face
pe baza temperaturilor de denaturare, determinate de conţinutul GC, lungimea
şi secvenţa acestora, precum şi de concentraţia substanţei de intercalare, a
sărurilor şi a produsului ţintă din mediul de reacţie (Shepherd et al., 1998, şi
Ririe et al., 1997, cit de 155). Este astfel posibilă efectuarea în bune condiţii a
reacţiilor multiplex (71) diferiţi autori raportând discriminarea unor ampliconi a
căror temperaturi de denaturare difereau doar prin 1,5-2 ºC (155). Ca şi în cazul
tehnologiei microarray, tehnica oferă un deosebit potenţial pentru rezolvarea
problemelor determinate de creşterea numărului de evenimente de transformare
comercializate (71).

187
 Un incovenient al substanţei SYBR Green I este faptul că inhibă
activitatea Taq ADN polimerazei, motiv pentru care trebuie utilizată în
concentraţii reduse, ceea ce diminuează semnificativ capacitatea de a indica
schimbări mici în gradul de hibridare al macromoleculei de ADN. Pentru
rezolvarea acestei probleme se pot utiliza alţi agenţi de intercalare (ex. LC
Green, EvaGreen). LC Green nu inhibă activitatea polimerazei şi poate fi
utilizată în concentraţii suficient de mari astfel încât să poată satura siturile
dublu-catenare de intercalare care apar odată cu acumularea produşilor PCR
(Fig. 8.20) (224). În acest caz, saturarea siturilor de intercalare elimină
posibilitatea ca o moleculă de fluorocrom să fie redistribuită din regiuni care au
devenit monocatenare în cele care sunt încă dublu-catenare, problemă întâlnită
la sistemele care utilizează SYBR Green I. Utilizată în combinaţie cu
instrumentul HR-1 (High Resolution Melter) (Idaho Technology), LC Green
facilitează detecţia precisă a unor variaţii reduse ale semnalului fluorescent care
indică stadiul de hibridare al produslui PCR. Sistemul a fost creat pentru
identificarea mutaţiilor, dar prezintă un mare potenţial şi pentru testele de
cuatificare prin real-time PCR.

Fig. 8.20. Diferenţe între modul de intercalare al

moleculelor de SYBR Green I (sus) şi LC Green
(jos). (202.)

Sonde şi primeri specifici marcaţi

Specifictatea detecţiei este o caracteristică esenţială pentru analizele
cantitative. Pentru sporirea acesteia se pot utiliza diferite construcţii
oligonucleotidice marcate fluorescent, care au capacitatea de a detecta doar
secvenţa ţintă, fără a influenţa negativ procesul PCR. Aceste construcţii
oligonucleotidice sunt împărţite în două mari grupe, sonde şi primeri marcaţi.
Diferenţa esenţială dintre acestea este dată de rolul pe care îl joacă în cadrul
experimentului. Astfel, sondele au doar rol de detecţie, pentru amplificarea
fragmentului de interes fiind necesară utilizarea a doi primeri convenţionali. În
188
schimb, primerii marcaţi funcţionează şi ca amorse pentru reacţia de
polimerizare a uneia dintre catenele moleculei ţintă, de aceea în aceste
experimente se utilizează doar un primer obişnuit. O clasificare a
oligonucleotidelor utilizate pentru detecţie şi cuantificare pe baza înregistrării
emisiei fluorescente este realizată de Kubista et al. (87).
 sonde hidrolizabile, denumite şi TaqMan, descrise de Holland et al.;
 balize moleculare, descrise de Tyagi şi col;
 sonde de hibridare descrise de Caplin et al;
 sondele Lion, produse de Biotools.
Aceste sonde sunt marcate cu doi fluorocromi ce formează o pereche
donor-acceptor, în care primul, în stare excitată, îşi transferă energia celui de-al
doilea, aflat în proximitate. Acesta din urmă suprimă astfel activitatea
fluorescentă a donorului, motiv pentru care este denumit şi represor (quencher).
Molecula represoare poate fi fluorescentă (fluorescent quencer), disipând cea
mai mare parte din energia primită sub formă de lumină, sau nefluorescentă
(dark quencher), caz în care energia primită este eliberată sub formă de căldură.
Primerii modificaţi sunt clasificaţi după cum urmează (87):
 primerii de tip Scorpion descrişi de Whithcombe et al. (1999);
 primerii LUX descrişi de Nazarenko et al. (2002);
 primerii Ampliflour descrişi de Uchara et al. (1999);
 sistemul Qzyme (Clonetech).
Fiecare dintre aceste principii prezintă avantaje şi limite, cele mai
utilizate în practică fiind sondele, iar dintre acestea cele hidrolizabile. Avantajul
principiului TaqMan este dat de uşurinţa de proiectare comparativ cu celelalte
tipuri de sonde.
Oligonucleotidele marcate pot fi constituite din nucleotide normale sau
molecule sintetice similare acestora (peptide nucleic acid/PNA, sau locked
nucleic acid/LNA). Al doilea element major care intră în alcătuirea
oligonucleotidelor marcate îl constituie substanţele fluorescente (reporter
dyes), denumite şi fluorocromi sau cromoforii.
FRET (fluorescence/Förster resonance energy transfer) reprezintă
mecanismul de transfer al energiei între doi fluorocromi (209; 68) şi stă la baza
principiului de funcţionare al sondelor marcate. În continuare este descris acest
principiu conform Roche (221). Sursa de lumină a instrumentului excită
molecula donoare prin intermediul unui filtru cu lungime de undă
corespunzătoare absorbţiei maxime a acesteia. În această stare, anumiţi
electroni din molecula donoare sunt excitaţi, ajungând de la nivelul de
bază la un nivel energetic superior. În mod normal, energia acumulată de
donor este disipată sub formă de emisie fluorescentă cu lungime de undă
diferită, mai mare decât cea de excitaţie. Pentru ca transferul de energie să
aibă loc (Fig.8.21) este necesară îndeplinirea următoarelor condiţii: apropierea
189
în spaţiu a celor două molecule (donor şi acceptor) (de obicei 10-100 Å) şi
suprapunerea spectrului de emisie a donorului cu spectrul de excitare a
acceptorului. În aceste condiţii o mare parte din energia donorului este
transferată acceptorului. În urma transferului energetic, electronii
donorului revin la nivelul de bază, în timp ce o parte din electronii
acceptorului trec într-o stare de excitaţie. Energie înmagazinată va fi
disipată sub formă de radiaţie luminoasă sau căldură, în funcţie de tipul
moleculei acceptoare. Astfel, emisia fluorescentă a donorului este
suprimată.
Există mai multe strategii de utilizare a acestui mecanism pentru detecţia
specifică a ampliconilor. Astfel, sondele hidrolizabile sunt bazate pe utilizarea
unui acceptor de tipul „dark quencher”, în timp ce sondele de hibridare
utilizează molecule acceptoare cu emisie fluorescentă.

(a) (b)

Fig. 8.21 . Principiul FRET. (a) FRET nu are loc datorită distanţei dintre
donor şi acceptor. (b) În cazul în care cele două molecule sunt apropiate în
spaţiu, FRET apare, sub forma transferului de energie de la donor la
acceptor. (După 209, modificat)

Programele de amplificare pentru sondele TaqMan sunt constituite, în

general, din cicluri de amplificare cu două trepte de temperatură (se foloseşte un
singur nivel pentru hibridare şi extensie). Acest sistem poate influenţa negativ
eficienţa polimerazei, de aceea este necesar ca secvenţele ţintă să fie de lungimi
reduse (87). În cazul cuantificării OMG-urilor condiţia referitoare la lungimea
ampliconilor este însă necesară şi datorită faptului că ADN-ul poate fi puternic
degradat.
Sondele de hibridare. Pentru monitorizarea formării produşilor PCR cu
ajutorul acestui sistem, pe lângă primerii PCR, trebuie utilizate două sonde
oligonucleotidice specifice, marcate cu fluorocromii corespunzători şi denumite
sonde de hibridare. Acestea sunt proiectate sub formă de pereche, una fiind
marcată la capătul 3’ cu fluorocromul donor (ex. Fluoresceine), iar cealaltă la
capătul 5’ cu fluorocromul acceptor (ex. Red 640, Red 705) (Fig.8.22).
190
Deoarece FRET scade odată cu mărirea distanţei dintre cei doi fluorocromi,
sondele trebuie concepute astfel încât să hibrideze regiuni adiacente ale
moleculei de ADN ţintă (de obicei sunt desparţite de 1-5 nucleotide).

(a) (b) (c)

Fig. 8.22. Detecţia cu sonde FRET. (a) Sonda donoare este marcată
cu fluoresceină (verde) la capătul 3’, iar cealaltă sondă este marcată
cu un fuorocrom acceptor la capătul 5’ (roşu). Sonda acceptoare este
de asemenea fosforilată la capătul 3’ pentru a împiedica
polimerizarea. Fluorocromii pot fi plasaţi şi invers pe cele două
sonde. În faza de denaturare nu are loc extensia. Datorită distanţei
dintre dintre cei doi flourocromi transferul de energie (FRET) nu
apare în această etapă, fluorocromul acceptor nefiind astfel excitat.
(b) În timpul etapei de elongaţie cele două sonde hibridează situri
adiacente ale segmentului de ADN ţintă. Fluorocromul donor este
excitat de sursa de lumină a instrumentului. Energia acestuia nu este
disipată sub formă de lumină fluorescentă, ci este transmisă
acceptorului, excitându-l. Fluorescenţa emisă de acceptor este
măsurată la sfărşitul etapei de alipire, când aceasta este maximă. (c)
După alipire, temperatura este ridicată iar sondele se desprind în
timpul etapei de elongaţie. La sfărşitul acestei etape sondele sunt din
nou depărtate una faţă de cealaltă, iar astfel transferul de energie nu
are loc. (221).

Datorită utilizării celor două sonde, aceste sisteme de cuantificare sunt

caracterizate printr-un înalt nivel al specificităţii detecţiei. În timpul amplificării
sondele nu sunt degradate ceea ce permite şi efectuarea analizei curbei de
denaturare în vederea confirmării specificităţii reacţiei PCR.
Sondele de degradare (sondele hidrolizabile sau principiul TaqMan)
se bazează pe activitatea exonucleatică 5’-3’ a Taq ADN polimerazei, respectiv
capacitatea de a hidroliza în timpul extensiei orice segment oligonucleotidic
alipit la molecula matriţă (Lie şi Petropoulos, 1998, cit de 171). Sonda
(denumită TaqMan sau hidrolizabilă) are, în general, o lungime de 20-30 baze,
iar temperatura de alipire este cu aproximativ 10 °C mai mare decât a
primerilor. Nucleotida de la capătul 5’ are ataşat un fluorocrom reporter (de
obicei FAM), iar cea de la capătul 3’ unul represor (TAMRA) (Fig. 8.23). De
191
asemenea capătul 3’ este blocat pentru a împiedica extensia sondei asemănător
primerilor.

Fig. 8.23 Principiul TaqMan. (a) O sondă hidrolizabilă este marcată cu doi
fluorocromi adiacenţi, astfel încât molecula represoare împiedică activitatea
fluorescentă a reporterului. (b) În etapa de alipire, primerii şi sondele se
alipesc specific secvenţei ţintă. (c) În timpul elongaţiei, polimeraza întâlneşte
sonda şi are capacitatea de a o degrada, datorită proprietăţilor sale
exonucleatice. (d) În acest moment cei doi fluorocromi nu mai sunt adiacenţi,
astfel încât energia internă a reporterului este disipată sub formă de lumină
fluorescentă care este măsurată de instrument. În acest mod creşterea
intensităţii fluorescente a fluorocromului reporter este corelată cu acumularea
produsului ţintă care determină degradarea sondelor. Semnalul fluoescent este
măsurat la sfârşitul etapei de elongaţie. (199).

192
 Cât timp sonda este intactă, apropierea reporterului faţă de represor face
posibil trasferul de energie între cele două molecule, determinând suprimarea
emisiei fluorescente. În timpul reacţiei PCR, în prezenţa unei molecule ţintă,
sonda se alipeşte specific între siturile complementare primerilor. Apoi, în etapa
de extensie a primerilor, Taq ADN polimeraza se deplasează de-a lungul
moleculei ţintă sintetizând noua catenă, proces în care hidrolizează sonda
TaqMan. Degradarea întrerupe transferul de energie de la reporter către
represor, semnalul fluorescent propagându-se în mediul de reacţie şi fiind
înregistrat. În acest mod este indicată acumularea produsului PCR. Degradarea
unor noi sonde în ciclurile succesive va determina sporirea numărului de
fluorocromi liberi şi implicit creşterea semnalului fluorescent. Creşterea
intensităţii semnalului fluorescent, ca rezultat al degradării sondelor odată cu
acumularea produsului de amplificare, are loc în fiecare ciclu PCR şi nu
influenţează desfăşurarea reacţiei.
Deoarece semnalul reporterului apare doar dacă primerii PCR şi sonda
TaqMan se alipesc secvenţei de ADN ţintă, specificitatea de detecţie a acestui
sistem este semnificativ mai mare decât a sistemelor PCR clasice sau a
sistemelor real-time PCR care utilizaeză SYBR Green I.
Hagen şi Beneke (2002) citaţi de Ahmed (1) precizează că 179 de
produse alimentare pe bază de soia (inclusiv produse pentru sugari, produse de
slăbit, băuturi, fulgi, tofu, tăiţei, uleiuri şi condimente) au fost analizate
utilizând sistemul TaqMan, acesta fiind destul de sensibil încât să permită
detecţia moleculelor ţintă. ADN-ul de soia nu a putut fi însă detectat în
matricile intens procesate ca uleiuri şi condimente.

Confirmarea absenţei inhibitorilor PCR

Pentru evaluarea efectului substanţelor inhibitoare s-au efectuat
determinări real-time PCR ale unei endogene în diluţii seriate ale extractelor,
utilizând un sistem TaqMan. Concentraţiile extractelor analizate au fost ajustate
la 50 ng/µl, iar din aceste soluţii (denumite 1:1) au fost preparate diluţii seriate
de factor patru (1:4, 1:16, 1:64, 1:256). Reacţiile pot fi efectuate fără repetiţii
(181) sau în duplicat (58) (fig. 8.24).
După efectuarea experimentelor, valorile CT ale soluţiilor diluate au fost
introduse într-un grafic, în funcţie de logaritmul factorului de diluţiei. Utilizând
regresia liniară, s-a construit dreapta de regresie, iar apoi s-au calculat parametri
de interes ai reacţiei de amplificare.
Valoarea CT a probei nediluate a fost determinată prin extrapolare cu
ajutorul ecuaţiei de regresie liniară. Valoarea CT astfel calculată a fost ulterior
comparată cu valoarea CT măsurată pentru acestă probă, diferenţa (ΔCT) mai
mică de 0,5 între cele două valori indicând o influenţă redusă, sau chiar absenţa
inhibitorilor

193
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2
A
WD WD 1:4 1:4 1:16 1:16 1:64 1:64 1:256 1:256 WD WD
2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3
B
1:4 1:4 1:16 1:16 1:64 1:64 1:256 1:256 WD WD 1:4 1:4
3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4
C
1:16 1:16 1:64 1:64 1:256 1:256 WD WD 1:4 1:4 1:16 1:16
4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5
D
1:64 1:64 1:256 1:256 WD WD 1:4 1:4 1:16 1:16 1:64 1:64
(a) E
5 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6
1:256 1:256 WD WD 1:4 1:4 1:16 1:16 1:64 1:64 1:256 1:256
7 7 7 7 7 7 7 7 7 8 8
F 7 1:16
WD WD 1:4 1:4 1:16 1:64 1:64 1:256 1:256 WD WD
8 8 8 8 8 8 8 8 9 9 9 9
G
1:4 1:4 1:16 1:16 1:64 1:64 1:256 1:256 WD WD 1:4 1:4
9 9 9 9 9 9
H PC PC NTC NTC
1:16 1:16 1:64 1:64 1:256 1:256

Sample code : 1 A Sample code : 2A

Measured Expected Measured Expected
34 34
Dilution factor Ct Ct Mean DCt DCt Logarithm Dilution factor Ct Ct Mean DCt DCt Logarithm
32 32
1:4 22.97 -0.6021 1:4 26.44 -0.6021
22.83 22.90 1.88 2 -0.6021 30 26.35 26.40 3.36 2 -0.6021 30
1:16 24.77 -1.2041 28 1:16 26.88 -1.2041 28
24.90 24.83 1.93 2 -1.2041 26.69 26.78 0.39 2 -1.2041
26 26

Ct
Ct

1:64 26.93 -1.8062 1:64 28.75 -1.8062

26.81 26.87 2.04 2 -1.8062 24 28.62 28.68 1.90 2 -1.8062 24
1:256 28.74 -2.4082 22 1:256 30.55 -2.4082 22
28.88 28.81 1.94 2 -2.4082 30.58 30.57 1.88 2 -2.4082
20 20

Measured Extrapol. 18 Measured Extrapol. 18

Ct Ct Mean Ct Extrapol. - Mean Ct -4 -3 -2 -1 0 Ct Ct Mean Ct Extrapol. - Mean Ct -4 -3 -2 y-1= -2.3920x +024.5082
21.064 log(1/dilution factor) y = -3.2847x + 20.9080
Out of log(1/dilution factor) R2 = 0.9374
23.13
Ok R2 = 0.9990
Working dilution 20.963 21.01 20.91 0.11 Working dilution 22.94 23.04 24.51 1.47 A.C.

Sample code : 1 B Sample code : 2B

Measured Expected Measured Expected
34 34
Dilution factor Ct Ct Mean DCt DCt Logarithm Dilution factor Ct Ct Mean DCt DCt Logarithm
32 32
1:4 23.37 -0.6021 1:4 25.72 -0.6021
23.59 23.48 1.81 2 -0.6021 30 25.99 25.85 2.94 2 -0.6021 30
1:16 25.49 -1.2041 28 1:16 26.71 -1.2041 28
25.42 25.45 1.98 2 -1.2041 26.69 26.70 0.85 2 -1.2041
26 26
Ct

Ct
1:64 27.60 -1.8062 1:64 28.52 -1.8062
27.45 27.52 2.07 2 -1.8062 24 28.45 28.48 1.78 2 -1.8062 24
1:256 29.46 -2.4082 22 1:256 30.75 -2.4082 22
29.77 29.62 2.09 2 -2.4082 30.84 30.80 2.31 2 -2.4082
20 20
Measured Extrapol. 18 Measured Extrapol. 18
Ct Ct Mean Ct Extrapol. - Mean Ct -4 -3 -2 -1 0 Ct Ct Mean Ct Extrapol. - Mean Ct -4 -3 -2 y-1= -2.7592x +023.8056
log(1/dilution factor) y = -3.4048x + 21.3932
21.71 22.87 Out of log(1/dilution factor) R2 = 0.9604
Ok R2 = 0.9978
Working dilution 21.62 21.66 21.39 0.27 Working dilution 22.97 22.92 23.81 0.89 A.C.

(b) (c)

Fig. 8.24 . Evaluarea efectului inhibitorilor PCR. (a) Exemplu de setare a unui
experiment de evaluare a efectului substanţelor inhibitoare. Sunt analizate nouă
extracte de ADN (1-9), fiecare nediluat (WD) şi în patru diluţii seriate (1:4,
1:16, 1:64, 1:256). Toate probele sunt analizate în duplicat. O probă de control
pozitivă (PC) şi una de control a reactivilor (NTC) sunt de asemenea incluse în
experiment. Trebuie avut în vedere că valoarea ΔCT aşteptată în cazul diluţiilor
1:4 este 2 (ΔCT = log24 = 2), iar valoarea aşteptată pentru panta unei reacţii
PCR cu eficienţa de 100% este -3,32. Criteriile de acceptrabilitate sunt: ΔCT <
0,5; -3,6 < valoarea pantei < -3,1; R2 > 0,98. (b) Experimente în care nu există
efect de inhibiţie. (c) Experimente în care există efecte de inhibiţie.

8.3 Secvenţierea ADN

Secvenţierea originală a terminaţiei lanţului dideoxi necesita o matriţă
monocatenară. Secvenţierea Sanger este o modificare a procesului de replicare a
ADN-ului. Produşii PCR după purificare (cu kit-ri speciale) sunt folosiţi ca
matriţe pentru secvenţiere. Ampliconii sunt migraţi pe gel de agaroză iar
benzile sunt extrase sub raze UV prin decupare. Pentru reacţiile de secvenţiere
dideoxi este folosit un primer complementar secvenţei ADN-ului de secvenţiat.
Poate fi marcat primerul în 5' cu dATP cu 32P, 33P, 35S prin intermediul T4
194
polinucleotidkinazei. Pentru secvenţiere se pot utiliza T7 ADN polimeraza şi
Taq ADN polimeraza. Principiul de bază este asemănător pentru ambele
enzime (163).

8.3.1 Secvenţierea ADN cu T7 ADN polimeraza

Primerul se hibridează prin complementaritate de ADN de secvenţiat la

capătul 3' al acestuia. Amestecul reacţional este repartizat în 4 tuburi marcate
GATC. În fiecare tub se adaugă T7 ADN polimeraza, cele 4 deoxinucleotide
(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) şi câte un dideoxinucleotid diferit (ddATP,
ddGTP, ddCTP, ddTTP).
 T7 ADN polimeraza va adăuga nucleotidele complementare de la
extremitatea 3' a amorsei şi va continua de la 5' la 3' (la 37˚C).
 În timpul acestei polimerizări vor fi încorporate uneori ddNTP în
loc de dNTP. Când se încorporează un ddNTP polimeraza nu mai
poate continua polimerizarea.
 Didezoxinucleotidele (ddNTPs) sunt dezoxinucleotide (baze)
modificate capabile de a se integra într-un lanţ de ADN în sinteză,
care să împiedice încorporarea nucleotidei următoare.
 Reacţia se opreşte pentru că ddNTP nu posedă grupul 3'OH necesar
în reacţiile de polimerizare cu enzime (fig. 8.25; fig.8.26).

Fig. 8.25. Diferenţa între o dezoxinucleotidă şi didezoxinucleotidă utilizată

pentru secvenţiere.

195
Fig. 6.26 Replicarea ADN (stânga) este terminată de absenţa grupării 3’ hidroxil pe
nucleootida dideoxiguanozin (dreapta). Fragmentul rezultat se termină în ddG.

Reacţia se va opri pentru câte un ddNTP diferit în fiecare tub. Se obţin

în tub produşi de mărime diferită. Reacţia de secvenţiere se face pornind de
la lanţul antisens care serveşte ca matrice. Se analizează, se depun produşii
reacţiilor de secvenţiere pe un gel de poliacrilamidă de mari dimensiuni în
condiţii denaturante (uree sau formaldehidă). Fiecare tub de reacţie A, G, T,
C, va fi depus într-un godeu diferit. Deci 4 godeuri pentru o reacţie de
sevenţiere. Migrarea se face pe gel vertical între 2-4 ore, uneori mai mult în
funcție de lungimea fragmentelor (fig. 8.27).

Fig. 8.27. Fragmentul de AND de secvenţiat şi primerul ataşat complementar la

capătul 3' (241, 242).

196
 Odată ce gelul este uscat şi expus la film de raze X, migrarea
fragmentelor poate fi vizualizată datorită secvenţei semnal situată pe primerul
sau nucleotida marcată 32P. Toate fragmentele dintr-un tub dat se vor termina în
acelaşi ddNTP, de ex: toate fragmentele sintetizate în tubul ddCTP se vor
termina în C. Gelul obţinut prin migrarea produşilor reacţiei de secvenţiere pe
cele 4 coloane este numit scală de secvenţiere. Scala este citită pentru a deduce
secvenţa de ADN. Din partea de sus a gelului, cel mai mic fragment (migrarea
cea mai rapidă) este acela în care sinteza se încheie cel mai aproape de primer.
Identitatea ddNTP la o poziţie particulară este determinată de coloana în care
apare banda. Dacă cea mai mică bandă este în coloana ddATP, prima bază este
un A. Următorul fragment mare este cel terminat la următoarea poziţie a
matriţei. Coloana care are următoarea bandă mare identifică nucleotida
următoare din secvenţă. In figura 8.28, următoarea bandă mare este găsită în
coloana ddGTP, deci următoarea bază este G. Secvenţa este astfel citită din
partea de jos (cea mai mică, maxim-5’) spre vârf (cea mai mare, maxim-3’) a
fragmentelor între sau în cadrul coloanelor, pentru a determina identitatea şi
ordinea nucleotidelor din secvenţă (125, 149) (fig. 8.28).

Fig. 8.28 O scală de secvenţiere este citită de la baza gelului către vârf. Fragmentul
cel mai mic reprezintă prima nucleotidă ataşată la primer de către polimerază. Cum
acest fragment este în coloana A, din reacţia ce conţine ddATP (stânga), citirea
secvenţei începe cu A. Următorul mare fragment este în coloana G. Apoi secvenţa
citeşte AG. Următorul fragment mai mare este în coloana C, formând secvenţa AGC şi
tot aşa până în vârful gelului. Benzile mai mari pe un gel de secvenţiere pot fi uneori
compresate, limitând mărimea secvenţei ce poate fi citită la o singură rulare pe gel.
(stânga)

197
 O metodă alternativă de detectare este aceea de a încorpora
deoxinucleotide marcate 32P sau 35S în mixul de reacţie al secvenţierii.
Procedura se numeşte etichetare internă.
La fel ca şi în reacţia de replicare in vitro a ADN-ului, se produce
polimerizarea deoxinucleotidelor pentru a realiza copii întegi ale matriţei ADN.
Pentru secvenţiere, derivaţii dideoxinucleotidici (ddNTP) sunt adăugaţi în
mixul de reacţie. Sinteza ADN se va opri după încorporarea ddNTP în lanţul
crescând de ADN deoarece fără gruparea hidroxil la 3’ al ozei, legătura
fosfodiesterică 5’-3’ nu mai poate încorpora o nucleotidă subsecventă. Prin
urmare noul lanţ sintetizat se va termina cu ddNTP.
Raportul ddNTP:dNTP este critic pentru generarea secvenţei decelabile.
Dacă concentraţia de ddNTP este prea mare, polimerizarea se va termina adesea
timpuriu, de-alungul matriţei. Dacă concentraţia de ddNTP este scăzută,
încheierea va fi rară sau inexistentă. La începuturile secvenţierii, raportul optim
ddNTP:dNTP era stabilit empiric. Secvenţierea modernă presupune utilizarea
unor mixuri preoptimizate.
După adaugarea ADN polimerazelor în cele 4 tuburi, începe reacţia. In
aprox. 20min, reacţiile sunt terminate prin adăugarea unei soluţii tampon de
stopare. Această soluţie este format din: 20mM EDTA ce chelatează cationii şi
opreşte activitatea enzimei, formamida pentru denaturarea produselor reacţiei
de sinteză, şi coloranţi (albastru de bromfenol). Este important ca toate cele 4
reacţii sa fie realizate în timp egal. Menţinerea timpilor de reacţie egali va
determina intensităţi asemănătoare ale benzilor în toate cele 4 coloane, ceea ce
facilitează citirea.

Manganaza (Mn++) poate fi adaugată la reacţia de secvenţiere pentru a

promova încorporarea egală a tuturor dNTP-urilor de către polimeraza (147,
148). Incorporarea egală a dNTP-urilor determină apariţia benzilor uniforme ca
intensitate pe gelul de secvenţiere, ce uşurează interpretarea secvenţei.
Manganaza creşte încorporarea relativă a ddNTP-urilor, ce va cuprinde citirea
primei părţi a secvenţei prin creşterea intensităţii benzilor mai mici din gel.
Nucleotidele modificate, dGTP-aza şi deoxinozin trifosfatul (dITP) sunt
adăugate deasemenea la reacţia de secvenţiere pentru a inhiba formarea unor
structuri secundare în fragmentele sintetizate (19).

8.3.2 Secvenţierea fluorescentă automată

Cele mai multe metode de secvenţiere moderne sunt realizate cu matriţe

bicatenare, eliminând prepararea incomodă a versiunilor monocatenare ale
ADN-ului de secvenţiat.
Capacitatea de citire a 500 de baze/citire a constituit un progres în
tehnologia gelurilor şi a enzimelor. Tehnologia de secvenţiere a fost
198
îmbunătăţită semnificativ faţă de procedurile manuale de secvenţiere iniţiale.
Sunt disponibile polimerazele recombinante precum Sequenaza (129) si
enzimele termostabile, Thermosequenaza şi Therminator (133).
Aceste enzime modificate sunt mai rapide, încorporează mult mai
eficient ddNTP-urile şi nucleotidele analoage ca dITP (dezoxinozin trifosfat)
sau -7dGTP-aza ce sunt folosite să descurajeze formarea structurilor secundare
în matriţă şi în produsele de secvenţiere.
Imbunătăţirile în tehnologia coloranţilor fluorescenţi au dus la
automatizarea procesului de secvenţiere şi determinarea secvenţei.
Procedura pentru secvenţierea automată este aceeaşi, descrisă anterior,
folosind matriţe AND bicatenare, dar mai eficientă (48 de probe, in 35 minute).
Electroforeza şi citirea scalei de secvenţiere este deasemenea
automatiză. Pentru citirea automată a scalei secvenţei ADN sunt folosite
sondele (primeri) sau nucleotidele marcate fluorescent în locul celor radioactive
din metoda anterioară.
Coloranţii fluorescenţi folosiţi pentru secvenţiere au “culori” distincte
sau lungimi de undă ale emisiei fluorescente, ce pot fi distinse de secvenţele
automate. Avantajul de a avea patru culori diferite este acela ca toate cele 4
mixuri de reacţie pot fi citite în aceeaşi coloană a gelului sau capilarului.
Culoarea colorantului fluorescent marchează fragmentele ce se termină in
A,T,G sau C în cadrul scalei de secvenţiere (95) (Fig.8.29)

Fig. 8.29 Marcajul fluorescent al ddNTP determină idividulizarea

colorimetrică a fragmentelor ce se termină in A,T,G sau C în cadrul scalei de
secvenţiere.

Coloranţii fluorescenţi folosiţi pentru secvenţierea automată includ

fluoresceina, rodamina şi derivaţi ai colorantului Bodipy ce sunt recunoscute ca
sisteme de detecţie comerciale. Cititorii automaţi ai secvenţelor excită coloranţii

199
cu un laser şi detectează fluorescenţa emisă la lungimi de unde predeterminate.
(95).
Abordări ale secventierii automate
Există două abordări ale secvenţierii fluorescente automate;
- secvenţierea ce utilizează primerul marcat colorimetric şi
- secvenţierea cu marcaj colorimetric al ddNTP-ul terminal terminal (Fig.
8.30).
Scopul ambelor abordări este acelaşi: etichetarea fragmentelor
sintetizate în timpul reacţiei de secvenţiere. A doua metodă presupune următorii
coloranti:
- ddATP, citite ca A în secvenţă, vor fi etichetate cu “verde”;
- fragmentele ce se termină în ddCTP, citite ca C în secvenţă, vor fi
etichetate albastru;
- fragmentele terminate în ddGTP, citite ca G în secvenţă, vor fi etichetate
cu “negru” sau “galben”;
- fragmentele ce se termină în ddTTP, citite ca T în secvenţă, vor fi marcate
cu “roșu” .Aceștia facilitează citirea secvenţei de către secvenţiatorul
automat.

Fig. 8.30 Secvenţierea fluorescentă. Secvenţierea sondelor de culoare foloseşte

sonde marcate (A). Produsele celor patru reacţii sunt revelate împreună înrtr-o
singură coloana de gel sau capilar. Folosind terminatori de culoare (B) doar un
flacon de reacţie este necesar, din moment ce fragmentele pot fi distinse direct
de către didezoxinucleotide la capetele 3’.

200
 In secvenţiere cele patru culori diferite sunt atașate primerilor.
Moleculele de colorant sunt ataşate covalent la capătul 5’ al primerului în
timpul sintezei chimice, rezultând patru versiuni ale aceluiaşi primer cu etichete
de culoare diferite. Primerii etichetaţi cu fiecare culoare sunt adăugați în cele
patru tuburi diferite de reacţie, fiecare cu ddATP, ddCTP, ddGTP sau ddTTP.
După adăugarea tuturor componentelor reacţiei de secvenţiere şi în final a
polimerazei termostabile, reacţia de secvenţiere se derulează într-un regulator
termic (133).
O altă abordare este aceea de a lega terminatorii de culoare pe sfere
magnetice speciale şi recuperarea scalei ADN din supernatant odată ce sferele
sunt ţinute de un magnet aplicat în afara flaconului sau plăcii. Fragmentele
scalei de secvenţiere ar trebui denaturate complet înaintea rulării pe gel sau în
capilar. Condiţiile de denaturare (50 - 60 grade C, formamidă, gel denaturant de
uree) ar trebui menţinute în timp ce fragmentele trebuie decelate în funcţie de
mărime. Structura secundară poate afecta viteza de migrare şi scade calitatea
secvenţei. Inaintea încărcării pe un instrument cu gel sau capilar, scalele de
secvenţiere sunt curăţate, încălzite la 95-98ºsC pentru 2-5 minute şi plasate pe
gheaţă înaintea încărcării.

8.3.3 Electroforeza şi interpretarea secvenţei

Atât reacţia de secvenţiere a terminatorului de culoare cât şi cea a sondei

de culoare sunt încărcate pe o placă de gel sau într-un capilar, într-o singură
coloană. Coloranţii fluorescenţi favorizează distingerea nucleotidei de la capătul
fiecărui fragment. Fragmentele migrează prin gel în concordanţă cu mărimea şi
trec la rândul lor pe lângă un fascicul laser care le citeşte automat. Laserul
excită colorantul ataşat la fiecare fragment, facându-l să emită fluorescenţă ce
este capturată de un detector. Detectorul converteşte fluorescenţa într-un semnal
electric ce este recunoscut de un software ca un flash sau vârf de culoare.
Echipamentele de detectare a fluorescenţei produc rezultate
asemănătoare unei electroferograme. Secvenţiatorul automat citeşte bazele
fragmentelor mici ce trec primele de detactor apoi pe cele mai mari (fig. 8.31).
Softul atribuie una din cele 4 culori arbitrare şi o literă, vârfurilor, pentru a
uşura interpretarea. Ca şi la secvenţierea manuală, raportul ddNTP:dNTP este
cheia lungimii secvenţei citite (secvenţa matriţă poate fi determinată). Calitatea
secvenţei (înălţimea şi separarea vârfurilor) se îmbunătăţeşte de la primer şi
scade spre final. Pot fi citite uşor cel puţin 400-500 de baze prin aceste
proceduri de secvenţiere (66, 124, 163).

201
 Fig. 8.31 Citirea secvenţei de ADN Citirea secvenţei de ADN utilizând
utilizând secvenţiatorul automat (237). secvenţierea clasică (238).

202
 9. METODE DE DETECŢIE A ACIZILOR NUCLEICI ŞI
PROTEINELOR

9.1 Electroforeza

Constituie deplasarea moleculelor sub influenţa unui curent electric.

Aceasta poate apărea în soluţie, dar practic este realizată într-o matrice pentru a
limita migraţia, şi conţine materialul migrator. Electroforeza este aplicată în
analiza proteinelor şi a acizilor nucleici. Fiecare grupare fosfat dintr-un polimer
ADN este ionizată, încărcată negativ. Sub influenţa unui curent electric, ADN-
ul va migra către polul pozitiv (anod). Când ADN-ul macromolecular este
aplicat pe gel de agaroză sau poliacrilamidă, migraţia este împiedicată,
depinzând de mărimea ADN-ului şi spaţiile din gel. Fragmentele de ADN vor
migra cu viteze invers proporţionale cu mărimea lor. Electroforeza poate fi
realizată în tuburi, cuve sau capilare. Electroforeza pe gel în cuve poate avea un
format orizontal sau vertical (Fig.9.1 ).

Fig. 9.1 Electroforeză orizontală (a) şi verticală (b). In ambele formate,

proba este introdusă în gel, la catod (-) (săgeţile mici) şi migreză înainte spre
anod;
(javeriana.edu.cotemasdebioquimica.wordpress.com;temasdebioquimica.wordp
ress.com; 228)

Sistemele Gel
Matricile gel dau rezistenţă la mişcarea moleculelor sub influenţa
curentului electric. Ele previn difuzia şi reduc curenţii de convecţie astfel încât
moleculele separate să formeze grupuri definite sau “benzi”.
Gelul poate servi apoi ca suport pentru analiza componentelor separate.
Aceste matrici trebuie, să fie simplu de preparat şi maleabile la modificări.
Agaroza şi poliacrilamida, întrunesc aceste criterii (122).

203
 Gelurile de agaroza. Agaroza este un polimer polizaharidic extras din
iarba de mare (Agar agar). Este o componentă a agarului folosit în mediile de
cultură pentru bacterii.
Geluri de agaroză hidratate pot fi procurate ca atare, preformate.
Forma pudră, pentru folosire este suspendată în soluţie tampon, încălzită
şi turnată într-o matriţă. Concentraţia agarozei, dictează mărimea spaţiilor din
gel şi va determina astfel lungimea ADN-ului de studiat migrat. Fragmente mici
de ADN (50-500 bp) sunt evidenţiate în geluri de agaroză concentrate, ex: 2% -
3%. Fragmentele mai mari de ADN (2000-50000) sunt determinate mai bine în
concentraţii de agaroză mai scăzute, ex: 0.5 – 1%. Concentraţiile peste 5% şi
sub 0.5% nu au interes practic. Cele mari vor împiedica migraţia, iar cele
scăzute vor produce un gel slab, cu integritate limitată (8).

Gelurile de poliacrilamidă
Fragmentele de ADN foarte mici şi ADN-ul monocatenar sunt decelate
cel mai bine prin electroforeza în gel de poliacrilamidă (PAGE).
Aceasta a fost folosită iniţial pentru separarea proteinelor, dar s-a
dovedit utilă şi pentru analiza acizilor nucleici. Gelurile de poliacrilamidă sunt
folosite pentru secvenţierea acizilor nucleici şi detectarea mutaţiilor,
- a testelor de protecţie a nucleazelor. Acrilamida pudră este o
substanţă neurotoxică şi cancerigenă, deci trebuie manipulată cu
atenţie. Amestecul format din acrilamidă şi bis-acrilamidă este mai
puţin periculos şi mult mai uşor de manevrat. Gelurile preformate
sunt mai convenabile. Un alt avantaj al poliacrilamidei sintetice este
acela că modificarea dimensiunii porilor (T) şi a concentraţiei
gelului (C) poate schimba proprietăţile de migrare, într-o maineră
predictibilă şi reproductibilă. Mărimea minimă a porilor (rezoluţia
maximă pentru molecule mici) intervine la o valoare C de 5%.
Variaţia C peste sau sub 5% va creşte mărimea porilor (fig. 9.2). De
obicei, C este setat la 3,3% pentru ADN-ul natural şi 5% pentru
ADN-ul standard şi gelurile ARN (149).

Fig. 9.2. Migrarea diferită a

ADN în funcţie de
dimensiunea fragmentelor
(229).

204
 Sistemele tampon
Scopul tamponului este de a conduce curentul şi de a proteja probele în
timpul electroforezei, datorită caracteristicilor electrochimice pe care le posedă.
pH-ul unei soluţii tampon rămâne constant. Moleculele din soluţie atrag sau
eliberează protonii eliminaţi sau absorbiţi de alte soluţii. Controlul pH-ului unui
gel de către soluţia tampon protejează moleculele probei.
Crescând concentraţia tampon, creşte şi conductivitatea electroforezei,
generând mai multă caldură la un voltaj dat. Acest lucru influenţează
stabilitatea gelului şi poate determina denaturarea probei. Concentraţiile de
tampon ridicate trebuiesc compensate prin voltaj scăzut. Pentru ca acizii
nucleici să migreze corect, sistemele de gel trebuie imersate în soluţii tampon ce
conduc eficient curentul electric (220).
- Componentele soluţiei tampon ca baza Tris sau boratul sunt
preferate deoarece ramân parţial neîncarcate la pH-ul dorit.
Cele mai folosite soluţii pentru electroforeza ADN sunt: Tris borat
EDTA (TBE); 0.089 M Trisbase, 0.089 M boric acid, 0.0020 M EDTA), Tris
fosfatul (TPE); 0.089 M Tris-base, 1.3% phosphoric acid, 0.0020 M EDTA) şi
Tris acetatul EDTA (TAE; 0.04 M Tris-base, 0.005 M sodiu acetate, 0.002 M
EDTA). pH tamponului în cazul migrării ADN trebuie să fie 8 (8).
Migrarea ionilor soluţiei tampon nu este împiedicată de matricea de gel,
deci viteza mişcării sub influenţa unui curent este guvernată strict de mărimea
ionilor şi încărcarea acestora (raportul încărcare/masă). Tris este o moleculă
relativ mare, deci raţia încărcare-masă este scăzută, şi se deplasează prin curent
cu o viteză relativ scăzută chiar şi la concentraţii crescute, dând o capacitate de
tamponare crescută (196, 221).

Aditivii tampon sunt adesea folosiţi la modificarea moleculelor de

probă care le afectează migraţia; ex. formamida, ureea şi diverşi detergenţi.
Formamida şi căldura aplicate ADN-ului şi ARN-ului, rup legăturile de
hidrogen, împiedicând renaturarea secvenţelor complementare. Rezultatul este
că moleculele se alungesc, devin drepte şi formează lanţuri monocatenare.
Ureea şi căldura aplicate gelului menţin conformaţia, încât hibridarea dintre
moleculele de acid nucleic nu afectează viteza de migraţie, iar separarea poate
interveni strict în conformitate cu mărimea şi lungimea moleculelor.
Electroforeza ARN-ului necesită condiţii diferite oferite de aditivi (149).
Deoarece ARN-ul este monocatenar şi tinde să se plieze şi să renatureze,
trebuie să fie complet denaturat pentru a preveni plierea înainte de a-şi
determina mărimea şi migraţia într-un sistem de gel. Structurile secundare
formate de ARN sunt puternice şi mult mai dificil de denaturat decât ADN-ul
omolog. Unul dintre denaturanţii folosiţi pentru ARN este hidroxidul
metilmercuric (MMH), ce reacţionează cu grupările amino din ARN prevenind
împerecherea bazelor dintre nucleotidele omoloage şi aldehide (formaldehida,
205
glioxal). Nu este folosit în mod obişnuit din cauza toxicităţii extreme. Din cauza
deviaţiei pH-ului (descreşterea pH-ului la catod {-} şi creşterea la anod {+}) în
timpul rulării, soluţia tampon ar trebui să fie recirculată de la capătul anod la
catod (30).

Echipamente pentru electroforeză

Electroforeza pe gel poate fi realizată în una sau două forme, orizontală
sau verticală. În general gelurile de agaroză sunt rulate orizontal iar cele de
poliacrilamidă, vertical. Gelurile orizontale sunt rulate în containere de acril
(cutii de gel sau băi) divizate în două părţi, fiind depuse pe o platformă centrală
pe care sunt dispuse gelurile. Electrozii sunt conectaţi la o sursă de curent prin
conectori prin pereţii containerului. Gelul este scufundat în soluţia tampon de
electroforeză ce umple ambele compartimente şi formează un sistem continuu
prin care circulă curentul. Grosimea gelului şi volumul de soluţie tampon
afectează migraţia, astfel încât parametrii ar trebui păstraţi constant pentru
rezultate corecte. Deoarece gelul este scufundat în timpul încărcării şi
electroforezei, sistemul orizontal este denumit adesea gel submers (fig.9.3).
Sursa de curent dă voltajul, stabilind curentul care străbate gelul şi soluţia
tampon, purtând proba încărcată prin matrice la o viteză corespunzătoare cu
raportul încărcare electrică/masă moleculară. Gelurile orizontale de agaroză
sunt exprimate ca matrici pătrate sau rectangulare de mărimi variabile (3, 122).

Fig. 9.3 Un sistem tipic de gel submers. Un conector roşu este ataşat la polul
pozitiv al sursei de curent iar cel negru la polul negativ (www.dnalc.org).

Sistemul vertical are camere separate ce sunt conectate de gel. Electrozii

sunt ataşaţi în camerele superioare şi inferioare pentru a stabili curentul ce va
străbate gelul. Gelul trebuie poziţionat înaintea umplerii camerei cu soluţie
tampon. Unele sisteme au o placă metalică ataşată în spatele gelului pentru a
menţine temperatura constantă. Aceasta este o problemă pentru gelurile
206
verticale, deoarece marginile extreme se răcesc mai repede decât centrul,
încetinind migraţia faţă de zona centrală. Acest ansamblu este denumit “gel
smiling” deoarece benzile de mărimi similare din zonele extreme reci vor migra
mult mai încet decât cele din zonele interioare. Asigurând o temperatură
invariabilă de-alungul gelului, se previne “gel smiling-ul”(8) (fig. 9.4; fig. 9.5).

Fig. 9.4 Gel smiling (247). Fig. 9.5 Un aparat tipic cu gel
vertical (lclane.net).

Sistemele verticale cu gel variază de la sisteme mari de secvenţiere (35

cm x 26 cm) la mini sisteme (8 cm x 10 cm). Unele mini sisteme sunt destul de
mari pentru acomodarea a două geluri în acelaşi timp (fig. 7.40). Mini sistemele
sunt folosite extensiv pentru analize ce nu necesită rezoluţia unei perechi de
baze.
Gelurile polimerizate sunt prinse în forme şi plasate în baie. Electrodul
pozitiv va fi în contact cu capătul de jos al gelului şi a soluţiei tampon, umplând
aproximativ o treime din baie. Electrodul negativ va fi în contact cu partea de
sus a gelului şi cu un compartiment separat de soluţie tampon în partea de sus a
inserţiei (220).
Sistemele mai mari sunt folosite pentru secvenţiere sau pentru alte
proceduri ce necesită decelarea unei singuri baze. Gelurile sunt încărcate pe la
vârf, dedesubtul unui strat de soluţie tampon, în camera superioară. Vârfurile
pipetelor de încărcare plasează eşantionul la bază, crescând decelarea benzilor
şi recuperarea probelor.
Gelurile verticale sunt modelate între plăci de sticlă separate de
limitatoare care determină grosimea gelului (0,05mm). Baza gelului este
securizată cu banda sau cu o garnitură în tăvi cu gel special proiectate. După
207
adăugarea agenţilor de polimerizare acrilamida lichidă este turnată între plăcile
de sticlă cu ajutorul unei pipete sau seringi. Pieptenele este apoi plasat în
capătul gelului. În timpul acestui proces este important să nu se introducă aer în
sau sub gel. Bulele vor forma discontinuităţi iar oxigenul va inhiba
polimerizarea acrilamidei. Pieptenele este de o grosime egală cu cea a
limitatoarelor astfel încât gelul va avea aceeaşi grosime. Ca şi la gelurile
orizontale, mărimea şi numărul dinţilor pieptenului va determina numărul
fantelor din gel şi volumul ce poate fi adăugat în fiecare. Piepteni specifici
denumiţi piepteni dinţi de rechin sunt adesea folosiţi pentru secvenţierea
gelurilor (fig. 9.6). După ce polimerizarea este completă, pieptenele este extras
şi plasat cu dinţii în jos în capătul gelului de încărcat (220, 221).

Fig. 9.6 Piepteni pentru electroforeză pe gel de poliacrilamidă. A.Dinţii

normali ce formează fantele din gel. B.Pieptenele dinţi de rechin. Proba este
încărcată între dinţii pieptenului (247).

Cu această configuraţie, spaţiile dintre dinţii pieptenului formează fante,

opuse dinţilor. Avantajul acestei aranjări este acela că benzile sunt plasate
adiacent celorlalte facilitând comparaţia bandă-bandă. Pieptenii standard sunt
extraşi înaintea încărcării gelului, în timp ce dinţii de rechin sunt folosiţi în aşa
fel încât fantele să poată fi încărcate în timp ce pieptenele este încă în poziţia
iniţială. Când pieptenii standard sunt retraşi din gel, trebuie avută grijă ca
“urechile” formate de spaţiile dintre dinţii pieptenului care separă fantele de gel
să nu fie dislocate.
Gelurile de poliacrilamidă pot fi modelate în tuburi, pentru focusare
electrică sau electreforeza pe gel bidimensional. Tuburile ce conţin gelurile sunt
plasate într-o cameră separată ca pentru gelurile verticale colorate. Ele sunt
ţinute pe loc de garniturile din camera superioară. Această configuraţie a
gelului, limitează numărul de probe deoarece numai o singură probă poate fi
rulată pe gel (221).

208
 Încărcarea gelului
Înainte de încărcarea gelului cu acid nucleic sunt adăugate în probă:
colorantul de urmărire şi un agent de densitate. Coloranţii de urmărire sunt:
albastrul bromofenol şi verdele cianol.
Colorantul de urmărire este folosit pentru monitorizarea progresului
electroforezei. Migrează la viteze specifice într-o concentraţie de gel dată,
înaintea celor mai mici fragmente de ADN. Nu se leagă de probele de AND,
neafectând separarea sau migrarea diferenţiată a ADN. Când colorantul de
monitorizare se apropie de capătul fantelor, electroforeza este terminată,
aparatul se decuplează de la sursa de curent electric. Albastrul bromofenol este
unul dintre coloranţii de urmărire frecvent folosit pentru multe aplicaţii (107).
Agenţi ca Ficoll, sucroză sau glicerol cresc densitatea soluţiei
comparativ cu soluţia tampon de electroforeză. Când probă este dispusă în
fantele gelului, sub stratul de soluţie tampon, aceasta se scufundă nu se
dezintegrează în soluţia tampon (149, 191).

9.2 Sisteme de detecţie

Statusul probelor din timpul şi de după electroforeză este desăvârşit

folosind coloranţi ce se asociază specific cu acizii nucleici. Agenţii folosiţi cel
mai des pentru aceste aplicaţii sunt coloranţi artificiali şi săruri de argint.
Coloranţii specifici acizilor nucleici
Bromura de etidiu, (EtBr) este unul dintre agenţii care se intercalează
între bazele azotate ale acizilor nucleici bicatenari (fig. 9.7). Sub acţiunea
luminii UV la 300nm, EtBr din ADN emite lumină vizibilă de 590 nm. Prin
urmare, ADN-ul separat în agaroză sau acrilamidă şi expus la EtBr va emite
lumina portocalie. EtBr a fost cea mai des utilizată în analizele iniţiale ale ADN
şi ARN. Manipularea EtBr trebuie făcută cu atenţie deoarece este cancerigenă.
După electroforeză, gelul de agaroză sau acrilamidă poate fi hidratat în soluţie
de 0.1 – 1mg/ml EtBr în soluţie tampon (TAE,TBE sau TPE) sau TE. Coloranţii
pot fi adăugaţi în gel înaintea polimerizării sau adăugării sol tampon. Adăugat
în sol tampon produce o colorare mult mai intensă generând resturi mult mai
periculoase. Unele sisteme închise cu gel conţin EtBr în cadrul unei casete
închise limitând expunerea sau pierderea (19). După hidratarea sau rularea în
EtBr, ADN-ul expus la UV va apărea sub forma de benzi portocalii în gel.
Imaginea poate fi capturată cu o camera sau prin transfer digital către
softwareul analitic (132).

209
 Fig.9.7 Bromura de etidiua, (EtBr) intercalată între bazele azotate ale
acizilor nucleici bicatenari (215).

SyBr verde este unul dintre coloranţii introduşi în 1995 specific acizilor
nucleici. Diferă de EtBr deoarece nu se intercalează între baze; se dispune în
fereastra mică a dublu helixului. SyBr verde asociat cu ADN sau ARN emite de
asemenea lumină în spectrul portocaliu. Colorarea SyBr este de 25-100 de ori
mai intensă decât EtBr (nivel de detecţie: 60 pg de ADN bicatenar vs. 5ng
pentru EtBr). Poate fi utilizată o diluţie a soluţiei 1/10.000 SyBr verde în
TAE,TBE sau TE poate fi utilizată ca şi pentru EtBr. O diluţie 1/100 de SyBr
verde poate fi adăugată direct în proba de ADN înaintea electroforezei (116,
123).
Precolorarea ADN-ului descreşte cantitatea de colorant necesar pentru
vizualizare dar micşorează sensibilitatea detecţiei iar la cantităţi mari de ADN,
poate interfera cu migraţia acestuia prin gel (98). Deoarece SyBr verde nu este
un agent intercalant, nu este mutagen (116). Deşi SyBr verde are unele avantaje
comparative cu EtBr, multe laboratoare continuă să-l folosească pe cel din urmă
din cauza cerinţelor pentru filtrele optice speciale pentru detectarea SyBr verde.
Echipamentele de scanare şi fotografiere optimizate pentru EtBr ar trebuie să fie
modificate pentru detectarea optimă a coloranţilor SyBr verde. Instrumentele
noi cu sisteme de detecţie mult mai sensibile, permit utilizarea coloranţilor
SyBr verde (preferată pentru metodele de Real-time PCR) (19, 132).

Colorarea cu argint
Un sistem mai sensibil dezvoltat iniţial pentru vizualizarea proteinelor,
este colorarea cu argint. Dupa electroforeză, proba este fixată cu metanol sau
acid acetic. Gelul este impregnat apoi cu soluţii de argint amoniacal sau nitrat
de argint într-o soluţie slabă de acid. Interacţiunea ionilor de argint cu gruparile
acide sau nucleofilice, determină cristalizarea sau depozitarea argintului metalic
210
în condiţii optime de pH. Sarea de argint negru insolubilă, precipită odată cu
introducerea formaldehidei într-o soluţie de acid slab sau o soluţie alcalină
pentru nitratul de argint. Din cele două proceduri, argintul amoniacal este mai
bun pentru gelurile subţiri, în timp ce nitratul de argint este considerat a fi mult
mai stabil (111).
Colorarea cu argint evită pericolele agenţilor de intercalare. Este utilă în
mod special pentru analizarea proteinelor şi pentru detectarea cantităţilor
limitate de produs (107, 122).

9.2.1 Electroforeza pe gel în câmp pulsat

Fragmentele foarte mari (ex: 50000 – 250 000 bp) de ADN nu pot fi
decelate prin electroforeza simplă pe agaroză. Chiar şi în cele mai reduse
cantităţi de agaroză, fragmentele mari de baze sunt sever împiedicate de a avea
o rezoluţie corectă (cunoscută şi ca limitarea mobilităţii). Mobilitatea limitată
este atinsă atunci când moleculele de ADN se pot mişca doar în lungime printre
porii succesivi ai gelului, proces numit reptaţie. Pentru moleculele de ADN
genomic, impulsurile de curent aplicate gelului în cantităţi alternative, sporesc
migraţia. Acest proces este numit electroforeza pe gel în câmp pulsat (PFGE)
(Fig. 9.8). Cea mai simplă variantă a acestei metode este electroforeza pe gel în
câmp inversat (FIGE) (27).

FIGE funcţionează prin schimbarea alternativă a electozilor pozitivi şi

negativi în timpul electroforezei. În acest tip de separaţie, ADN-ul merge
periodic înainte şi/sau înapoi. Metoda necesită un control al temperaturii şi un
mecanism de schimbare. Electroforeza în câmp pulsat poate fi în: câmp electric
omogen sferic închis, câmp transvers alternant, gel rotativ şi cu reorientarea
transversă a unghiului. Aceste sisteme necesită o cutie specială cu gel, cu
electrod special şi configuraţie specifică a gelului şi un control electronic
adecvat pentru schimbarea câmpurilor electrice. Folosind PFGE, fragmentele
mari sunt decelate nu numai prin cernerea prin spaţiile din polimer ci şi prin
reorientarea lor şi timpul necesar pentru a se realinia şi a se muta în a doua
dimensiune, de obicei situată într-un unghi 120° (180° pentru FIGE) faţă de
direcţia originală a migraţiei (27, 55).
ADN-ul de decelat prin aceste metode trebuie protejat de rupere şi
forfecare. Prin urmare, specimenele sunt imobilizate în agaroză înaintea lizei
celulare. Tratamentul ulterior al ADN-ului, cu enzime de restricţie, este realizat
în timp ce ADN-ul este imobilizat în agaroza. După tratament, ADN este
introdus direct în agaroză, pentru electroforeza.

211
Fig. 9.8 Electroforeza în câmp pulsat. Săgeţile arată calea migraţiei ADN-ului.
(230, 231).
Instrumentele PFGE sunt proiectate să aplice curent în direcţii
alternative în timpi specifici (numiţi interval de schimbare) setaţi de către
operator. Aceşti parametri sunt bazaţi pe mărimea generală a fragmentelor de
analizat ex: un fragment mai mare va necesita un timp de schimbare mai mare.
PFGE este o metodă de migrare lentă. Deplasarea probelor poate dura 24 ore
sau mai mult (28). Electroforeza în câmp alternant este folosită pentru aplicaţii
ce necesită decelarea fragmentelor de ADN ale cromozomilor bacterieni în
212
scopuri epidemiologice. Contactul ADN-ului genomic cu enzime de restricţie
va produce fragmente specifice pentru fiecare organism. Prin compararea
acestor fragmente poate fi evaluată similitudinea organismelor izolate din surse
variate. Această tehnică este utilă în special în determinarea cauzei şi
epidemiologiei bolilor infecţioase (exemple: gripă aviară, pesta porcină etc.) (7,
9, 125, 137). Într-un focar de gripă aviară se poate stabili dacă persoanele sunt
purtătoare de virus.

9.2.2 Electroforeza capilară

In acest tip de electroforeză, proba de analizat este separată într-un

capilar de sticlă subţire (siliciu topit) de 30-100 cm lungime şi un diametru de
25-100 micrometri. Sticla este acoperită cu un înveliş de poliamidă, pentru
protecţie. Există şi o fereastră neacoperită unde lumina este reflectată peste
fragmente, pe masură ce acestea trec de detector. Sticla are sarcini negative de-a
lungul pereţilor capilarului generate de disocierea ionilor de hidroxil (66).
Acestea stabilesc un flux electro-osmotic atunci când un curent este
introdus de-alungul capilarului. Sub forţa acestui curent, moleculele mici şi
încărcate negativ migreză mai repede decât moleculele mai mari şi încărcate
pozitiv (Fig. 9.9 ).

Fig. 9.9 Capilar de sticlă subţire (siliciu topit) utilizat în electroforeza

capilară (232).

În general, în capilar este introdus 1-50 μL de acid nucleic denaturat în

soluţie tampon ce conţine formaldehida şi este ţinut la temperatura de
denaturare în timpul migraţiei. Proba este injectată în capilar electrokinetic,
hidrostatic sau pneumatic. Pentru analiza acizilor nucleici este folosită
injectarea electrokinetică. Electrodul de platină apropiat de capătul capilarului
prezintă sarcini tranzitorii pozitive care atrag probele. Pentru decelarea acizilor
nucleici, electroforeza capilară este analoagă cu cea pe gel. Volumul mic al
213
capilarului comparativ cu matricea de gel poate disipa caldura mult mai eficient
în timpul procesului de electroforeză. Aceasta permite tehnologilor să ruleze
probe la o sarcină mai mare per surpafaţă, ceea ce înseamnă că probele
migrează mai repede, prin urmare scazând timpul de rulare (19).
Decelarea acidului nucleic prin eletroforeza capilară este folosită
intensiv în aplicaţii criminalistice şi testele de paternitate realizate prin analiza
polimorfismului repetitiv. Are şi alte aplicaţii în laborator: testele de clonare,
detectarea instabilităţii microsateliţilor cromozomiali şi analizele grefelor de
măduvă osoasă utilizate în tratamentul leucemiilor. Softuri proiectate special
pot folosi sonde marcate fluorescent cu greutate moleculară diferită (markeri
alelici) care migrează în capilar alături de fragmente de interes, fiind
identificate prin hibridarea cu sondă specifică. Sistemul capilar are sensibilitate
crescută comparativ cu tehnicile de electroforeză tradiţionale pe matrice de gel,
încât cantităţile mici de acid nucleic pot fi analizate iar benzile dorite sunt
detectate imediat. Deşi aparatura pentru electroforeză capilară şi softurile
analitice sunt costisitoare iar detectarea necesită marcarea fluorescentă a
sondelor, munca şi timpul de rulare scad semnificativ comparativ cu
electroforeza pe gel. In plus, se pot analiza automat rezultatele cu detectorul
electroforezei capilare (20).

214
 10. TEHNICI DE HIBRIDARE

10.1 Enzimele de restricţie

Enzimele de restricţie fac posibilă manipularea secvenţelor acizilor

nucleici. Au fost identificate, purificate şi clonate numeroase astfel de enzime
care participă la fenomenul de restricţie, asigurând un sistem de apărare a
bacteriilor faţă de bacteriofagi. Unele tulpini sau suşe bacteriene conţin enzime
din familia endonucleaze şi decupează ADN la nivelul secvenţei recunoscute
specific. Dacă o colonie infectată de un bacteriofag sintetizează această enzimă
şi o posedă în genom, fagul va fi incapabil să se multiplice şi să lizeze bacteria.
Ca urmare ADN-ul său va fi secţionat în fragmente în situsuri specifice
genomului fagic (149).
De ce ADN bacterian nu este distrus de aceste enzime?
Există 2 posibilităţi: fie ADN bacterian nu conţine secvenţe recunoscute
de enzimă, fie acesta este metilat la nivelul resturilor de A sau C de către
metilaza bacteriană ceea ce determină nerecunoaşterea secvenţelor metilate de
către enzimele de restricţie. Denumirea enzimei de restricţie vine de la faptul că
există o restricţie a infecţiei fagilor faţă de anumite suşe bacteriene care
sintetizează endonucleaze, altele fiind lizate. Numele enzimei provine de la
numele genului şi speciei de la care a fost izolată. Se disting 3 grupe de enzime
de restricţie: I, II şi III (8).
Enzimele de tip II sunt endonucleaze bacteriene care clivează specific
cele două lanţuri de ADN la nivelul unei secvenţe definite de 4-8 nucleotide
(fig.10.1). Ele au particularitatea de a recunoaşte secvenţele palindromice (citite
în sensul 5'-3' şi în 3'-5' sunt identice).

Fig. 10.1 Enzime de restricţie: Eco R1 şi PstI.

215
 Secvenţele recunoscute sunt secţionate la situsul de restricţie. Două
enzime de restricţie pot recunoaşte acelaşi situs, fiind numite şi izochizomere.
Foarte multe enzime de restricţie sunt disponibile în comerţ, însoţite de
mediu sau tampon de reacţie şi menţionarea temperaturii optime de funcţionare.
Este posibilă digerarea aceluiaşi fragment de ADN de către 2 enzime de
restricţie diferite. Dacă ele funcţionează în condiţii analoage (concentraţia în
săruri, pH, temperatură) cele două digestii se pot desfăşura simultan. Dacă un
fragment de ADN trebuie digerat de 2 enzime care funcţionează în condiţii
diferite, se folosesc succesiv şi se schimbă mediul pentru fiecare reacţie
enzimatică.
Tăieturile realizate de enzimele de restricţie sunt de două feluri:
- tăietura dreaptă, în urma căreia se obţin extremităţi drepte în acelaşi
loc la ambele catene (fig. 10.2) ;
- tăietură decalată a celor două catene, generând extremităţi
monocatenare cu secvenţe complementare, numite extremităţi
coezive sau colante (149).

Fig. 10.2 Enzime de restricţie care dau capete drepte şi colante (243).

Un exemplu de enzimă de restricţie este Hind III produsă de

Haemophilus influenzae, serotipul Rd. Situsul de legare a ADN este format din
6 perechi de nucleotide 5 AAGCTT 3. Situsurile de restricţie sunt adesea
palindroame. Dacă se hidrolizează legăturile fosfodiester, aceasta se face
departe de centru de simetrie a palindromului, unele perechi de nucleotide
rămânând neîmperecheate. Fragmentele care rezultă sunt aşa zise „capete
colante” (fig. 10.3).

216
 Fig. 10.3. Enzime de restricţie Hind III.

Metilarea primei adenine sau a citozinei de la locul hidrolizei inhibă

recunoaşterea situsului de către Hind III. ADN-ul bacteriei astfel metilat nu este
hidrolizat, în timp ce ADN-ul parazit, care nu este metilat, va fi hidrolizat.
Enzimele de restricţie sunt foarte utilizate. Ele stau la originea tehnicii
polimorfismului fragmentelor de restricţie RFLP şi reprezintă mijloacele majore
în tehnica de clonare. Unele enzime sunt sensibile la metilare. Ele nu vor
secţiona un ADN de eucariot pe o citozină metilată, dar vor secţiona aceeaşi
secvenţă nemetilată. Exemplu: două izochizomere MspI şi HpaII recunosc
secvenţa CCGG. Dacă C este metilată HpaII nu va secţiona în situsul respectiv,
în timp ce MspI o va face.
Expresia unor gene depinde de starea de metilare a domeniilor GC
prezente pe promotor sau în unele regiuni ale genelor. Două enzime vor permite
diferenţierea stării de metilare şi precizarea dacă gena se exprimă sau nu.
Enzimele de restricţie termofile - Bso şi BI izolate de la B. stereotermophilus au
activitate optimă la 65˚C şi sunt utilizate în metodele de amplificare prin
deplasarea catenei.
Enzimele de restricţie tip I şi III sunt utilizate mai rar.
Tipul I. Odată secvenţa specifică recunoscută de enzimă, aceasta va
secţiona aleatoriu la 1000-5000 pb mai departe.
Tipul III recunosc o secvenţă şi secţionează la 10-20 pb (9, 19).

10.1.1 Harta de restricţie

Analizele clinice şi judiciare necesită caracterizarea unor gene sau

regiuni genomice specifice la nivel molecular. Datorită activităţii specifice
secvenţiale, endonucleazeale de restricţie reprezintă un instrument util pentru
caracterizarea moleculara ă ADN- ului.
Enzimele de restricţie utilizate în mod obişnuit în laborator au
capacitatea de a recunoaşte patru sau şase perechi de baze numite locuri sau
situs-uri de restricţie şi secţionează ADN. Orice situs de restricţie apare la
217
întâmplare într-o secvenţă suficient de lungă de ADN. Cartografierea locurilor
de restricţie (sau determinarea acestora într-o secvenţă ADN) s-a efectuat iniţial
utilizând plasmide bacteriene. Hărţile rezultate au fost folosite pentru a
identifica şi caracteriza plasmidele, ce apar în mod natural şi pentru a construi
plasmidele recombinante (76).
Pentru a face o hartă de restricţie, ADN-ul este tratat cu enzime de
restricţie. De exemplu, un fragment liniar de ADN este tăiat cu enzima PstI.
După incubarea cu enzimă, fragmentele rezultate sunt separate prin
electroforeză în gel. Imaginea gelului dezvăluie patru fragmente marcate A, B,
C, si D, produse de PstI (Fig. 10.4). Din numărul de fragmente se pot deduce
numărul de locuri PstI: trei. Mărimea fragmentelor determinate comparativ cu
standarde de greutăţi moleculare cunoscute, indică distanţa dintre aceste locuri
şi distanţa de la un loc la capătul fragmentului. Cu toate că analiza PstI a acestor
fragmente dezvăluie un model caracteristic de restricţie cu patru benzi, nu
indică ordinea celor patru produşi din fragmentul original. Pentru determinarea
ordinii fragmentelor de restricţie, este folosită o altă enzimă, de exemplu
BamHI.

Fig. 10.4 Cartografia restricţionării pentru un fragment de ADN liniar.

218
 Fragmentul este mai întâi tăiat cu enzima PstI. Cu ajutorul electroforezei
cu gel în agaroză sunt evidenţiate fragmentele, aflându-se astfel distanţa dintre
locurile de restricţie. O a doua tăiere cu BamHI (dedesubt) oferă două
fragmente, indicând un singur loc (fig. 10.5). Din moment ce fragmentul
BamHI (E) este foarte mic, locul BamHI trebuie sa fie lângă un capăt al
fragmentului. Tăierea cu ambele enzime indică faptul că locul BamHI este în
fragmentul A PstI (239).

Figura 10.5- Doua hărţi gradate posibile după rezultatele din Fig.

Locul BamHI poziţionează fragmentul A la un capăt sau celelălt al

hărţii. Determinarea hărţii complete necesită informaţii de la tăierile enzimatice
adiţionale (239).
Secţionându-se acelaşi fragment cu BamHI se obţin două piese,
indicând un loc BamHI în acest fragment liniar. Un produs de restricţie (F) este
mult mai mare decât celălalt (E), ceea ce înseamnă că locul BamHI este aproape
de un capăt al fragmentului. Cand fragmentul este tăiat simultan cu PstI şi
BamHI, se obţin cinci secvenţe. Prin calcularea numărului şi lungimii
produşilor realizaţi de diferite enzime, locurile de restricţie pot fi plasate într-o
ordine liniară de-a lungul secvenţei de ADN. Figura 10.4 arată două hărţi
posibile bazate pe rezultatele tăierii fragmentului cu PstI si BamHI. Utilizând
enzime combinate adecvate se poate genera o hartă detaliată a acestui fragment
(8).
Cartografierea unei plasmide circulare este uşor diferită, deoarece nu
există nici un capăt liber. În figura 10.6 a este prezentată o plasmidă circulară 4-
kb cu un loc BamHI și două locuri XhoI. Tăind plasmida cu 5BamHI va rezulta
un singur fragment de mărimea plasmidei. Două fragmente eliberate de XhoI
indică faptul ca sunt două locuri XhoI în plasmidă și că sunt situate la o distanţă
de 1,2 şi 2.8 kb perechi una de cealaltă. Ca şi în cartografia liniară, taierea
plasmidei cu XhoI şi BamHI în acelaşi timp va stabili locurile potrivite pe
plasmida. Un aranjament posibil este arătat în figură 10.6. Cu cât sunt utilizate
mai multe enzime, harta devine mai detaliată (19).
219
 Fig. 10. 6. Reprezentarea restricţiei unei plasmide.

După incubarea plasmidei ADN cu enzime de restricţie, modelele de

legare, relevate pe electroforeza pe gel de agar indică numărul locurilor de
restricţie şi distanţa dintre ele (239).
Datorită succesiunii diferite a nucleotidelor în secventele de ADN
moştenite, numărul locaţiilor situsurilor de restricţie pentru o enzimă de
restricţie dată nu este aceleaşi la toţi indivizii. Localizarea şi ordinea locurilor
de restricţie enzimatică pe un fragment de ADN este o caracteristică moleculară
a acestuia. Diferenţele rezultate în ceea ce priveşte mărimea şi numărul
fragmentelor de restricţie sunt numite polimorfisme de lungime ale
fragmentului de restricţie (RFLPs). Acestea au stat la baza metodelor de
identificare şi cartografiere umană la nivel molecular. RFLPs pot fi de
asemenea folosite pentru analiza schimbărilor structurale în cromozomi asociate
cu anumite boli (translocaţii, deleţii, inserţii, etc.).

10.1.2 Polimorfismul lungimii fragmentelor de restrictie (RFLP)

Primul RFLP a fost descris în 1980. Tehnica este folosită pentru

cartografia genelor, identificarea umană şi testarea parentală şi se bazează
pe diferenţele de mărime şi număr dintre fragmentele generate de digestia ADN
cu enzimele de restricţie (Fig. 10.7 ). Mărimea fragmentelor poate varia datorită
mutaţiilor în secvenţa ADN, care modifică situsurile de restricţie, împiedicând
recunoaşterea lor de către enzimele specifice.
Primul pas în utilizarea RFLP a fost construirea unei hărți a regiunilor
de ADN investigate, utilizând enzime de restricţie. De exemplu o secvenţă
220
normală are un situs recunoscut de enzima EcoR1 (GAATTC). Substituţia unei
singure baze (mutaţie punctiformă) poate distruge situsul EcoR1 sau poate crea
unul nou. Mutaţiile prin inserţie, duplicaţie sau deleţie, indiferent de numărul de
nucleotide afectat pot schimba mărimea fragmentului, făra a afecta locurile de
restricție.

SNPs, RFLPs, point mutations

GAATTC GAATTC GAATTC GAATTC GAATTC GAATTC

GACTTC
GAATTC GAATTC GAGTTC GAATTC GAATTC RFLP
RFLP Pt mut
SNP SNP
Pt mut
SNP SNP

50

Fig. 10.7 Mutaţia punctiformă determină polimorfismul fragmentelor de

restricţie (8).

Numărul şi mărimea fragmentelor de restricţie ale unei regiuni de ADN

de testat secţionate cu enzime de restricţie se compară cu harta de referinţă.
În prima fază RFLP la om necesită utilizarea unei tehnici de transfer
Southern. ADN-ul, secționat cu enzime de restricție, migrat pe gel de
electroforeză, transferat pe o membrană este pus în contact cu sonde formate
din regiuni specifice ale ADN-ului, care hibridează cu complementarele de pe
membrană, pentru a determina mărimea benzilor rezultate.
Chiar dacă fragmentele de restricţie nu sunt detectate în totalitate de
sondă, polimorfismele pot fi identificate, deoarece în secvența ADN doar
fragmentele complementare unei sonde pot fi vizualizate. De ex. o mutatie G-T
va schimba secvența unui situs normal (+) în cel nerecunoscut de enzimă (-).
Fiecare cromozom are un polimorfism propriu, astfel încât progenitura
moşteneşte o combinaţie a polimorfismelor parinţilor. Când sunt vizualizate ca
şi fragmente polimorfe, benzile reprezintă combinaţia de RFLP moştenită de la
fiecare părinte. Datorită recombinării întâmplătoare, fiecare persoană are un set
unic de RFLP. De-a lungul generaţiilor, mutaţiile, recombinările intra şi
intercromozomale, conversia genelor şi alte evenimente genetice au crescut
diversitatea secvenţelor ADN. O consecinţă a acestei diversităţi genetice este
aceea că un singur loc, adică o genă sau o regiune de ADN, va avea mai multe
versiuni, sau alele. Omul, ca și marea majoritate a animalelor este diploid,

221
având două copii ale fiecarui locus. Dacă alelele sunt identice, locusul este
homozigot, iar daca sunt diferite, locusul este heterozigot. Au fost descrise
peste 2000 de locusuri RFLP în ADN-ul uman. Unicitatea polimorfismului la
fiecare individ stă la baza identificarii umane la nivel molecular (149).
Detectarea RFLP cu ajutorul transferului Southern a făcut posibilă
pentru prima data testarea paternității și identificarea umană. Protocoalele
RFLP pentru identificarea umană folosesc preponderent pentru fragmentarea
ADN-ului genomic enzima HaeIII în America și HinflI în Europa. Acestea taie
ADN-ul destul de frecvent pentru a dezvălui polimorfismele în multiple locaţii
din genom.

Cartografierea genetică cu RFLP

Polimorfismele sunt moştenite după modelul mendelian şi locaţiile lor în
genom pot fi determinate, fiind folosite ca şi markere, pentru a determina
locaţia unor gene. Pe lângă posibilitatea de a stabili istoria familiei, se poate
stabili dacă o boală are o componentă genetică, prin demonstrarea unei asocieri
genetice apropiate sau a unei legături cu un marker cunoscut. Pentru a
determina probabilitatea că o genă necunoscută este localizată aproape de un
marker cunoscut din genom sunt folosite metode statistice. Cu cât un
polimorfism anume este prezent la persoanele cu un fenotip al bolii, cu atât este
mai probabil ca gena afectată să fie localizată aproape de acesta. Metoda stă la
baza cartografierii genetice a unor boli. De ex. RFLP a fost folosit pentru a
cartografia genele mutante în cancer. Urmărind familiile cu o incidenţă mare de
cancer de sân şi ovarian, RFLP a fost prezent aproape permanent. Locaţia RFLP
pe genom a fost stabilită (17q21),iar gena BRCA1 a fost trecută pe hartă la
această poziţie pe bratul lung al cromozomului 17 (126, 142).

RFLP şi testarea parentală

La organismele diploide, secvenţa cromozomială este moştenită în
proporție de 50% de la fiecare părinte, ca urmare a recombinării gameților.
Aceasta include polimorfismele ADN situate în genom. Profitând de avantajul
unei combinaţii unice, prin RFLP se poate deduce contribuţia unui părinte cu
alele pentru un fiu sau fiică. Testul de paternitate analizează alelele sau
mărimea fragmentelor unei progenituri comparativ cu ale mamei. Fragmentele
care nu se potrivesc mamei trebuie să provină de la tată. Presupuşii taţi sunt
identificaţi datorită compatibilității cu alelele rămase.
Un test de paternitate RFLP simplificat. Dintre cei doi presupuşi taţi,
doar unul are fragmente ce nu provin de la mama. In figura 10.8 sunt prezentate
două locusuri. Un test de paternitate necesită analiza a cel putin opt locusuri. Cu
cât sunt testate mai multe locusuri cu atât creşte probabilitatea unei identificari
corecte a tatalui (125).

222
 Moştenirea RFLP.
Sunt prezentate două regiuni genetice diferite, locusul 1 si 2. Există
mai multe versiuni sau alele pentru fiecare locus (fig. 10.8).
1. Tatăl este heterozigot la locusul 1 şi homozigot la locusul 2. Alelele
de la copil vor fi o combinaţie de o singură alelă de la fiecare părinte.
2. Doi presupuşi taţi (AF) sunt testaţi pentru paternitata unui copil al
cărui profil parțial RFLP este arătat în gelul inferior. Alelele mamei, utilizate
pentru comparație, permit excluderea de la paternitate a AF1.

T F M AF1 F AF2

Caz 1 Caz 2
Fig. 10.8 Test de paternitate simplificat prin RFLP.

RFLP poate apărea ca urmare a numeroase evenimente genetice. Unul

dintre acestea este inserţia sau deleţia nucleotidelor din locusurile de restricţie,
frecvent în secvenţele repetate de ADN. Repetările în tandem ale secvenţelor de
toate mărimile sunt prezente în număr variabil (VNTR) sau minisateliţi. Acestea
sunt destul de frecvente, astfel încât pierderea sau caştigul unui fragment poate
fi detectat cu ajutorul electroforezei prin digestia cu o enzimă de restricţie.
Enzimele HaeIII (locul de recunoastere GGCC) sau HinfI (pentru recunoașterea
GATC), generează fragmente mici, care dau un model informativ pentru
transferul Southern (19).

Metode de clivaj. Polimorfismul mărimii fragmentelor de restricţie.

Dacă o mutaţie modifică ţinta enzimei de restricţie sau mărimea unui
fragment generat de enzimă, analiza RFLP poate fi folosită pentru detectarea
alterării secvenţelor. Pentru a realiza PCR-RFLP, regiunea din jurul mutaţiei
este amplificată iar mutaţia este detectată prin tăierea ampliconului cu enzima
223
de restricţie corespunzătoare. Mutaţiile pot inactiva o locaţie de restricţie cu
apariţie naturală astfel încât digestia produsului PCR să determine tăierea
ampliconului mutant dar nu şi a celui normal. Deşi aparent simplu, PCR-RFLP
necesită o proiectare atentă, întrucât polimorfisme care pot surveni rar dau
rezultate false.
Unele metode PCR-RFLP sunt folosite frecvent pentru detectarea
mutaţiilor dominante, precum factorul V Leiden și mutațiile HFE (118). PCR-
RFLP a fost folosit de asemenea pentru tipizarea HLA. PCR-RFLP poate fi
multiplex să detecteze mai multe mutaţii simultan (gene separate ce afectează
acelaşi fenotip ex: factorul V Leiden şi protrombina). O combinaţie de SSP-
PCR şi PCR-RFLP este aplicată pentru detectarea simultană a mutaţiilor care
afectează mai multe locusuri (45).

10.2 Tehnici de hibridare- generalităţi

Procedurile realizate în laboratoarele de clinică moleculară sunt

îndreptate spre ţinte specifice din ADN-ul genomic. Aceasta necesită
vizualizarea sau detectearea unor gene specifice sau a unor porţiuni de ADN din
gene. Sunt mai multe căi de a găsi o anumită regiune de ADN din care se va
izola proba. Metoda iniţială pentru analiza moleculară a locurilor specifice de
ADN dintr-o mulţime complexă a fost transferul Southern. Modificările
transferului Southern sunt aplicate pentru analiza ARN-ului şi proteinelor,
pentru a studia expresia genelor şi reglarea lor.
Principiile hibridării acizilor nucleici Hibridarea acizilor nucleici
reprezintă procesul prin care 2 monocatene ADN sau ARN din surse biologice
diferite reformează configuraţia dublu catenară. Din punct de vedere chimic,
procesul de hibridare se bazează pe :
– principiul complementarităţii dintre cele 2 catene ale unui duplex
ADN sau ARN ;
– eventuala omologie de secvenţă dintre cele 2 surse ADN.
Pe baza acestor principii se pot forma hibrizi ADN : AND; ARN : ARN
sau ADN : ARN (125).
In majoritatea cazurilor, scopul tehnicilor de hibridare este identificarea
sau localizarea anumitor fragmente de acizi nucleici.
In foarte multe variante tehnice, hibridarea acizilor nucleici se realizează
pe suport solid, purtând denumirea de blotting. Exista 3 categorii principale de
blotting :
1. Southern blotting (după numele autorului – Southern, 1975) –
identifică fragmente de ADN folosind sonde ADN sau ARN;
2. Northern blotting- identifică fragmente ARN folosind sonde ARN
sau ADN;
3. Westhern blotting - identifică fragmente proteice folosind anticorpi
224
 specifici.
Tehnica ADN microarray – reprezintă o tehnologie multiplex utilizată
în studii de biologie moleculară şi medicină. S-a dezvoltat din metoda Southern
blotting. Fragmentele de ADN sunt ataşate pe un substrat şi sunt hibridate cu
sonde marcate, care reprezintă fragmente de gene sau gene integrale.
Spoturile sunt acoperite de fragmente scurte de gene – SONDE –
utilizate la hibridarea ADNc – ȚINTĂ, în condiţii foarte bine definite.
Complexele sondă-ţintă pot fi vizualizate şi cuantificate pe baza
detecţiei în fluorescenţă a unui fluorocrom – marker fluorescent ataşat ţintei în
vederea cuantificării relative a cantităţii acizilor nucleici existenţi în proba ţintă
(8, 19, 149).
In transferul Southern, ADN-ul este izolat şi tăiat cu enzimele de
restricţie. Fragmentele sunt separate prin electroforeză în gel, depurinate şi
denaturate şi apoi transferate pe un support solid cum ar fi nitroceluloză. In
pasul final al procedurii, fragmentele de ADN sunt expuse la o sondă marcată
(ARN sau ADN complementar) care este specifică secvenţei de interes. Sondele
nehibridate sunt înlăturate şi semnalul specific al sondei este detectat pentru a
indica prezenţa secvenţei de interes. Metoda originală utilizează hibridarea unei
sonde marcată radioactiv pentru a detecta regiunea de ADN care trebuie
analizată. Atâta timp cât există o sondă cu o identitate cunoscută, această
procedură poate analiza orice genă sau regiune a genei din genom la nivel
molecular (8).

10.2.1 Sondele de acizi nucleici

Sondele pentru transferul Southern și Northern sunt fragmente

monocatenare de acizi nucleici. Scopul lor este de a identifica una sau mai
multe secvenţe de interes dintr-o cantitate mare de acizi nucleici. Sonda ar
trebui să hibrideze în special cu ADN-ul ţintă sau cu ARN-ul care trebuie
analizat. Sonda poate fi ARN, ADN denaturat sau alţi acizi nucleici modificaţi
(18).
Sondele de ADN sunt create prin diferite metode. Un fragment de genă
care urmează să fie analizat poate fi clonat pe o plasmidă bacteriană şi apoi
izolat prin digestie cu enzime de restricţie şi purificat în gel. Fragmentul, după
marcare şi denaturare, poate fi folosit în procedurile de transfer Southern sau
Northern ca sondă.
Alte surse de sonde de ADN includ izolarea unei secvenţe de interes din
genom viral şi sinteza lui in vitro. Metoda este folosită numai pentru sonde
scurte, oligomerice (125).
Sondele pot fi de asemenea sintetizate folosind reacţia în lanţ a
polimerazei (PCR) pentru a genera cantităţi mari de secvenţe ADN specifice.
Lungimea sondei va determina parţial specificitatea reacţiei de
225
hibridare. Sonda este cuprinsă între zeci şi mii de perechi de baze. In transferul
Southern se utilizează sonde mai lungi, specifice regiunilor de ADN,
complementare cu o secvenţă ţintă. Sondele mai scurte nu sunt de obicei
folosite în transferurile Southern deoarece îşi pot găsi mai multe complementare
în genom, neînrudite cu regiunea de interes. Ele sunt mai potrivite pentru
analiza mutaţională deoarece sunt mai sensibile la polimorfismul unei
nucleotide (67, 69). Sonda este contruită astfel încât să aibă o secvenţă
complementară ţintei. Exită copii mai puţin tipice ale unei secvenţe specifice
din genom şi, de aceea, doar câteva benzi vor fi vizibile la detecţie. Sondele de
ADN pregătite şi depozitate corect sunt relativ stabile şi mai uşor de obţinut.
Inainte de utilizare se tratează sonda termic (de exemplu 95 °C timp de 10-15
minute) în soluţie de hibidizare sau cu 50% formaida/ 2X SSC la o temperatură
mai mică, pentru un timp mai scurt (de exemplu 75 °C, timp de 5-6 min).
Sondele ARN sunt deseori obţinute prin transcripţia de pe o matriţă
ADN şi sinteza ARN in vitro. Acesta sunt similare sondelor de ADN, cu o
afinitate de legare mai mare sau egală de secvenţele omoloage complementare.
Sondele ARN pot oferi o sensibilitate mai mare decât cele de ADN în transferul
Southern. Ele pot fi sintetizate direct de pe o matriţă integrată în plasmidă sau
de pe o matriţă ADN ca produs PCR. Sunt disponibile sistemele preconcepute
comercial pentru acest scop. Acestea includ un vector plasmidic de ADN cum
ar fi pGEM (PromegAa) sau pBluescript (Stratagene), ce conţine un situs de
legare pentru polimeraza ARN (promotor), un situs de clonare pentru secvenţa
de interes şi o polimeraza ARN dependentă de ADN, de la bacteriofagul
Samonella SP6 sau bacteriofagii E. coli T3 sau T7. Secvenţele de ADN
complementare ARN care trebuie analizat sunt clonate pe vectorul plasmidic,
folosind enzimele de restricţie. Vectorul recombinat ce conţine gena de interes
este apoi liniarizat, şi sonda de ARN este transcrisă in vitro de pe promotor.
Sondele ARN sunt marcate prin încorporarea nucleotidelor radioactive sau
modificate în timpul procesului de transcripţie in vitro (126).
Atât secvenţa de codare cât şi ARN-ul complementar se vor hibrida pe
un ADN ţintă. In conceperea sondelor ARN pentru transferul Northern secvenţa
complementară ţintei trebuie să fie folosită ca sondă. O sondă cu secvenţă
identică cu cea a ARN-ului ţintă (secvenţă de codare) nu se va hibrida. Sondele
de ARN marcate în timpul sintezei au o sensibilitate mare. Pentru a evita un
mediu aglomerat, unele protocoale includ digestia ARN-ului nehibridat,
folosind RNaze specifice cum ar fi RNaza H, dupa ce hibridarea este completă.
Sondele ARN sunt în general mai puţin stabile decât cele ADN şi nu pot
fi depozitate pentru un timp îndelungat. Sinteza unei sonde ARN, prin
transcripție de pe o matriţă integrată într-un vector este relativ simplă şi ar
trebui să fie făcută în câteva zile. Matriţa de ADN poate fi înlăturată din probă
prin tratarea cu DNaza fără RNază. Cu toate că ARN-ul are deja o singură
secvenţă este recomandată denaturarea înaintea utilizării pentru a elimina
226
structura secundară a moleculei de ARN (149).
Alte tipuri de sonde
Pot fi sintetizate sondele de acizi nucleici peptidici şi acizi nucleici
blocaţi folosind metode chimice. Aceşti acizi nucelici modificaţi au avantajul de
a fi rezistenţi la nucleaze, care degradează ADN-ul şi ARN-ul prin ruperea
coloanei fosfodiesterice. Mai mult, încărcarea negativă a coloanei
fosfodiesterice a ADN-ului şi ARN-ului neutralizează legăturile de hidrogen
dintre bazele sondei şi secvenţele ţintă. Structuri cum ar fi PNA care nu sunt
încărcate negativ hibrideaza mai efficient (18, 87).
Aceste structuri nu sunt utile doar în laborator, ci au şi o potenţială
valoare în clinică. Au fost propuse câteva structuri pentru utilizarea în terapia
genetică antisens. Introducerea secvenţelor complementare ARN-ului mesager
al unei gene (secvenţa antisens) va preveni translaţia mARN-ului şi expresia
genei. Dacă acest lucru ar putea fi obţinut în întregul organism, genele
exprimate aberant sau genele virale ar putea fi blocate. Un obstacol al acestei
tehnologii este degradarea naturală a ARN-ului şi al ADN-ului prin nuclează
intracelulară. Structurile rezistente la nuclează sunt mult mai stabile şi
disponibile pentru hibridarea ARNm ţintă.
Sondele proteice pentru transferul Western sunt anticorpi policlonali
sau monoclonali ce se leagă în mod specific de proteina ţintă imobilizată.
In tehnologia de transfer Western, anticorpii policlonali pot da un
semnal mai puternic. Anticorpii monoclonali sunt mai specifici şi pot da un
fond mai slab. Diluţia anticorpului primar poate fi cuprinsă între 1/1000 şi
1/100,000, depinzând de sensibilitatea sistemului de detecţie (19).
Cele mai importante puncte ale oricarei proceduri de hibridare sunt
conceperea şi hibridarea optimă a sondelor, care vor determina specificitatea
rezultatului. La acizii nucleici, trebuie stabilite condiţiile optime de hibridare
între sondă şi ţintă. Sondele lungi (500-5000 bp) oferă o specificitate mai mare,
dar pot fi dificile sau costisitoare. Sondele mari sunt mai puţin afectate de
polimorfismul unei singure nucleotide în secvenţa ţintă.
Sondele mici (< 500bp) sunt mai puţin specifice decât cele lungi în
aplicaţiile transferului Southern. O secvenţă scurtă are o şansă mai mare de a fi
repetată la întâmplare în regiuni neînrudite ale genomului. Sondele scurte sunt
ideale pentru analiza mutaţiilor, deoarece afinitatea de legare este sensibilă la o
singură pereche de baze.
Proteinele folosite în transferul Western pot fi legate covalent de o
enzimă, de obicei peroxidaza de hrean sau fofataza alcalină. Anticorpii
neconjugaţi pot fi detectaţi după legarea cu anticorpi secondari, care vor
recunoaşte orice anticorp primar, prin intermediul regiunii Fc (12).

227
 10.2.1.1 Marcarea sondelor

Pentru o vizualizare mai uşoară este indispensabilă marcarea sondei.

Marcarea ADN se face prin 3 tehnici:
a. de înlocuire a nucleotidelor nemarcate prin nucleotide marcate sau
translaţia secţiunii
b. de sinteză a ADN marcat:
- randomizat sau întâmplător;
- sinteza sondelor prin PCR;
c. marcarea oligonucleotidelor (149).

Translaţia secţiunii utilizează 2 enzime:

- DNaza I – endonucleaza specifică ADN-ului dublu catenar, care
hidrolizează legăturile fosfodiesterice ale lanţurilor ADN. Această
acţiune antrenează formarea de scurte oligonucleotide caracterizate
prin prezenţa grupărilor fosfat (fig. 10.9).
În prezenţa ionilor de Mg 2+ scade acţiunea DNazei I. Are loc
secţionarea unei singure catene. DNaza I exercită o acţiune independentă pe
fiecare lanţ.
Numărul de secţiuni de pe ADN depinde de concentraţia DNazei I
utilizate. Cu cât scade cantitatea acestei enzime, scade numărul de secţiuni pe
fiecare lanţ, care sunt repartizate în lungul genomului.
- ADN polimeraza I posedă 3 activităţi
 5'-3' polimerazică
 3'-5 'exonucleazică (o activitate de corectare a erorilor)
 5'-3' exonucleazică.
Prezenţa grupului 5' fosfat la nivelul fiecărei secţiuni efectuate prin
DNaza I declanşează acţiunea celei de-a II-a enzime. Activitatea 5'-3'
exonucleazică îndepărtează progresiv deoxinucleotidele de la secţiune din 5'
către 3' de unde denumirea de translaţia secţiunii.
Activitatea 5'-3' polimerazică, va completa lanţul adăugând la
extremitatea 3'OH dezoxinucleotide marcate prin anumiţi markeri, fie cu izotopi
32P, fie prin haptene, de exemplu digoxigenină. Prin sinergia celor 2 activităţi
se produce o alungire a ADN de la 5'-3' şi se termină cu 3'.

228
 Fig. 10.9 . Translaţia unei secţiunii (238).

Cele două lanţuri sunt atacate prin DNaza I, în acelaşi fel, deci sunt total
marcate în cursul reacţiei. Sonda obţinută va fi dublu catenară şi va fi
denaturată înainte de utilizare (30, 149). Există totuşi un parametru critic în
această reacţie: raportul DNază I/polimerază I. Acesta este variabil şi depinde
de cantitatea, lungimea secvenţei şi configuraţia ADN-ului marcat. Trebuie să
se determine raportul optim a celor două enzime, fiecare cu un tip de ADN
utilizat pentru marcarea unei sonde. Raportul ADN/markeri dNTP se determină
empiric.
Marcajul este optim între 1 şi 24 de ore şi descreşte odată cu trecerea
timpului.
229
 Amorsarea aleatorie (random priting)
Pentru această tehnică este utilizată Klenow polimeraza, o ADN
polimerază modificată. Fragmentul Klenow rezultă prin clivarea proteolitică a
ADN polimerazei I de E. coli cu subtilizină. Ea posedă 2 proprietăţi:
- activitate de ADN polimerază 5'-3'
- activitate de corectare a erorilor exonucleazică 3'-5'.
Principiul acestei tehnici este următorul: ADN dublu catenar este
denaturat prin căldură, apoi monocatenele sunt puse în gheaţă pentru stabilizare.
Este adăugat un amestec de hexanucleotide conţinând toate combinaţiile
posibile (46 hexanucleotide diferite). Hexanucleotidele se vor hibrida cu secvenţe
complementare care sunt recunoscute pe ADN (fig. 10.10). Statistic numărul de
hexanucleotide care se găsesc pe un fragment de ADN marchează o secvenţă
complementară. Aceste nucleotide vor servi ca amorse pentru acţiunea ADN
polimerazei (Klenow polimeraza).

Fig. 10.10 .Amorsare aleatorie.

Se adaugă deci în amestec enzima şi nucleotidele necesare, care sunt

modificate fie prin marcaj radioactiv, fie cu ajutorul unor haptene, de exemplu
digoxigenina sau biotina. În cazul biotinei sau digoxigeninei se înlocuiesc
nucleotidele dNTP prin dUTP. Markerii se vor fixa pe faţa covalentă prin
230
intermediul unui braţ care va permite încorporarea nucleotidelor şi reacţii de
hibridare subsecvente, fără alterarea markerilor: exemplu DIG-dUTP). Toate
combinaţiile de hexanucleotide, sunt statistic posibile, prin hibridare pe toate
secvenţele ţintă. Klenow polimeraza încorporează nucleotidele între amorsele
hexanucleotidice. Sondele astfel fabricate vor fi intens marcate (8, 30).
În cursul acestei tehnici, cele două lanţuri ADN servesc ca substrat
pentru acţiunea enzimei. Pentru a împiedica reasocierea celor două catene
ADN, reacţia se face la o temperatură corespunzătoare utilizând amorsele într-o
concentraţie crescută.
Raportul ADN/amorse-ţintă controlează numărul sondelor sintetizate.
Sondele marcate rezultate sunt complexe de lanţuri complementare ADN-ului
ţintă. Densitatea sondelor marcate depinde de raportul haptene-dUTP/dNTPs.
De exemplu, în cazul utilizării digoxigeninei raportul optim este de 35% Dig-
dUTP/65% dTTP. Sondele obţinute sunt foarte scurte ca şi ADN-ul ţintă
utilizat.
Cele două lanţuri de ADN care au servit ca substrat pentru sinteza
sondelor sunt denaturate înainte de utilizare. Încorporarea se menţine în platou
30-60 minute. Tehnica este foarte utilă pentru marcarea ADN în vederea
electroforezei şi a identificării unor microorganisme cu genom format din ADN
(151).

Marcarea prin reacţia de înlocuire

ADNpolimeraza I provenită de la E. coli sau fragmentul Klenow poate,
prin activitatea exonucleazică 3'-5' să degradeze un ADN dublu catenar
începând de la extremitatea 3'. Dacă un singur precursor deoxitrinucleotidic este
prezent şi el este, de exemplu, dTTP va fi marcat cu 32P de către ADN
polimeraza fragmentului Klenow. Aceasta recunoaşte o bază complementară a
precursorului respectiv dATP α32P şi o va încorpora (fig. 10.11).

Fig. 10.11 Marcarea ADN la capete.

231
 Va avea loc în această poziţie o înlocuire a nucleotidei „reci” cu una marcată.
Fragmentul ADN nu poartă, decât o singură moleculă marcată pe fiecare lanţ.
Hibridarea acizilor nucleici este o metodă fundamentală pentru biologia moleculară,
cu scopul detectării unei secvenţe de ADN de cercetat (fig.10.12).

Fig.10.12 Hibridarea unei sonde ADN marcată radioactiv cu un

fragment de ARNm complementar.

Ea este foarte frecvent utilizată la criblajul băncilor de ADN complementar,

pentru studiul organizării regiunilor specifice ale genomului (prin Southern blot) sau la
analiza acumulării transcripţiilor (Nourthern blot). Aceste metode permit obţinerea
sondelor de ADN, marcate radioactiv sau chimic, uniform sau la extremităţile lor (fig.
10.13).

232
 Fig.10.13 Sonde marcate radioactiv uniform

Markarea sondelor prin PCR

Două lanţuri de ADN sunt marcate prin activitatea Taq polimerazei
(ADN polimerază), prin încorporarea de deoxinucleotide radioactive, sau de
deoxinucleotide modificate prin fixarea unor haptene (digoxigenina-DIG-
dUTP). Raportul optim dTTP/DIG-dUTP este 2/1 (fig. 10.14).

Fig. 10.14 Marcarea sondelor cu digoxigenină prin PCR.

Se pot utiliza de asemenea amorse marcate pe extremitatea 5'. Cel mai

adesea se utilizează biotina sau markeri fluorescenţi. Se poate utiliza şi ARN
care a suferit în prealabil o etapă de transcripţie inversă, obţinându-se în final

233
ADNc.
Această tehnică este foarte sensibilă şi permite în acelaşi timp obţinerea
unei sonde începând cu un produs subclonat. Sonda este marcată pe cele două
lanţuri, este deci necesară denaturarea înainte de utilizare (112).

Marcarea oligonucleotidelor
Oligonucleotidele (20-30 pb şi mai puţin) sunt marcate prin transferaza
terminală. Acestă enzimă catalizează adaosul mai multor dezoxinucleotide la
extremitatea 3'OH a ADN. Dezoxinucleotidele vor forma o „coadă” care nu se
va hibrida cu secvenţa studiată. Lungimea cozii variază în funcţie de raportul
deoxinucleotide/haptene ataşate deoxinucleotidelor. În consecinţă, singura
extremitate 3' a sondei este marcată. Dacă este utilizat un raport 1/10 DIG-
dUTP/dTTP va permite încorporarea a 10-12 DIG-dUTP pe o coadă cu lungime
în jur de 40-50 nucleotide. Utilizând dideoxinucleotide (de exemplu DIG-
ddUTP) transferaza terminală nu va adăuga decât o singură dideoxinucleotidă la
extremitatea 3'OH.
Această tehnică nu modifică Tm al oligonucleotidelor rămase. Ea poate
fi utilizată pentru marcarea fragmentelor scurte de ADN (până la 200 pb), dar
sensibilitatea va fi mai mică decât a altor tehnici (69).

Marcarea sondelor ARN

Sondele ARN sunt sintetizate cu ajutorul ARN polimerazei provenită
din bacteriofagul SP6, T7 sau T3 prin transcripţia in vitro a ADN urmată de
subclonarea în vectorul conţinând promotori specifici SP6, T7 sau T3 (fig.
10.15).
Nucleotidele marcate sunt adăugate în amestecul reacţional
(deoxinucleotidele radioactive sau neradioactive, haptene UTP) şi sunt
încorporate în cursul reacţiei. Reacţia de polimerizare a ARN este realizată pe
un vector linearizat. Ea debutează în aval de promotor pe o secvenţă definită ca
situs de iniţiere a transcripţiei şi se termină la sfârşitul vectorului linearizat.
Aceşti promotori sunt scurţi (17 pb). Atunci când promotorul diferă de altul
prin puţine nucleotide, polimerazele sunt foarte specifice secvenţei
promotorului utilizat SP6, T7 sau T3.
În medie, aceste reacţii sunt realizate în 1-2 ore. ADN este ulterior
eliminat prin tratarea cu o DNază. În cazul a doi promotori diferiţi pe fiecare
lanţ ADN se poate obţine o sondă pentru fiecare lanţ (sens antisens).
Sondele de ARN prezintă numeroase avantaje:
- sunt monocatenare,
- au o relativă absenţă de autocomplementaritate;
- au lungime definită,
- conferă stabilitate hibrizilor ADN/ARN (125).

234
 Fig. 10.15 Obţinerea sondelor ARN.

10.2.2 Hibridarea ADN-ADN sau tehnica Southern blot

Transferul Southern are următoarele etape:

1. Izolarea şi secţionarea ADN-ului cu enzimele de restricţie
2. Electroforeza ADN pe gel agaroza
3. Depurinarea ADN
4. Denaturarea ADN
5. Transferul ADN-ului monocatenar pe membrane de nitroceluloză sau
naylon
6. Contactul membranei cu sonde marcate (ARN sau ADN complementar)
specifice secvenţei de interes
7. Vizualizare prin autoradiografie

Secţionarea ADN-ului cu enzime de restricţie

După izolarea ADN-ului, primul pas în procedura de transfer Southern
este digestia ADN-ului cu enzime de restricţie. Alegerea enzimelor va depinde
de aplicaţie. Pentru teste de rutină în laborator se vor utiliza hărţile de restricţie
ale regiunilor ADN ţintă.
Cantitatea de ADN genomic necesară este între 10 si 50 μg. depinzând
de sensibilitatea sistemului de detecţie şi abundenţa ADN-ului ţintă.
După digestia cu enzime de restricţie, fragmentele rezultate sunt supuse

235
electroforezei. Compoziţia şi natura gelului depinde de mărimea regiunilor de
ADN care vor fi analizate. In primul godeu se pune un ADN cu o greutate
moleculară standard iar în restul ADN de analizat (8).

Prepararea ADN-ului activat pentru transfer

Scopul procedurii de transfer Southern este de a analiza o regiune
specifică a probei de ADN. Fragmentele ţintă pot fi detectate prin hibridare cu o
secvenţă omoloagă a unui ADN sau ARN, marcat cu un marker detectabil.
Pentru a obţine legatură de hidrogen optime între sondă şi secvenţa ei
complementară în ADN fragmentat, ADN dublu catenar din gel trebuie să fie
denaturat şi transferat pe o membrană de nitroceloluză.

Depurinarea
Inainte de transferul din gel pe membrane, fragmentele de ADN cu
dublă secvenţă trebuie să fie denaturate. Acest lucru este făcut în timp ce ADN-
ul ramâne în gel. Cu toate că fragmentele mici pot fi denaturate direct, cele mai
mari (>500 bp) sunt denaturate mai eficient dacă sunt depurinate înainte de
denaturare. De aceea, pentru fragmente mai mari gelul este mai intâi tratat cu
soluţie de HCL, un proces ce înlatură bazele purinice din coloana
fosfodiesterică. Acest procedeu va “lărgi” fragmentele mai mari pentru o
denaturare completă (fig. 10.16).

Figura 10.16. Un loc apurinic în ADN-ul cu dublă secvenţă. Pierderea

guaninei (dreapta) lasă un loc liber dar nu rupe coloana fosfoglucidică a
ADN-ului.

236
 Denaturarea
Dupa depurinare ADN-ul este denaturant prin expunerea într-un gel cu
agent denaturant de ex. hidroxid de sodiu. Secvenţele de ADN monocatenar
rezultate sunt apoi disponibile legăturilor de hidrogen cu sonde (monocatenare).
Mai mult, ADN-ul monocatenar se va lega mai bine decât un ADN
dublucatenar de o membrană de nitroceluloză în urma unui transfer (76).

Transferul
Inaintea expunerii ADN denaturat acţiunii sondelor, acesta trebuie să fie
transferat pe un substrat solid, ce va facilita legarea sondei şi detectarea
semnalului. Acest substrat este de obicei nitroceluloza, pe un suport inert, nylon
sau celuloză modificată, cu un dietil amino etil, sau cu o grupare carboximetil.
Pentru imobilizarea proteinelor şi evidenţierea cu anticorpi (transfer Western)
sunt folosite membrane de alt tip, difluor polivinil (PVDF).
Tipuri de membrane
ADN-ul monocatenar se leagă de membranele de nitroceluloză prin
legatură necovalentă dar ireversibilă. Legăturile sunt hidrofobe şi electrostatice
între ADN –ul încărcat negativ şi membrana pozitivă. Membranele bazate pe
nitroceluloză leagă 70-150 μg de acizi nucleici pe centimetru pătrat. Mărimea
porilor membranei (0.05- 0.45μm) este potrivită pentru fragmente mici de ADN
până la > 20,000 bp lungime.
Nitroceluloza pură are o capacitate mare de legare pentru proteine, dar şi
pentru acizi nucleici. Este mediul cel mai instabil pentru aplicaţii ale
transferului molecular. Este compatibil cu diferite tampoane de transfer şi
sisteme de detecţie. Nitroceluloza nu este la fel de rezistentă ca alte medii şi
devine fragilă după multiple utilizări; reîntărită este mai potrivită pentru
aplicaţii unde sunt necesare mai multe sonde. Aceste membrane au o capacitate
de legare foarte mare (până 400 μg/cm2 ). O ataşare covalentă a acizilor nucleici
la aceste membrane este obţinută prin cross-link-ul cu UV (30).
Celuloza conjugată cu dietilaminoetil (DEAE) leagă în mod eficient
acizii nucleici şi proteinele încărcate negativ. Difluor polivinilid (PVDF) şi
membranele de celuloză incărcate cu carboximetil sunt folosite numai pentru
transferul proteic (Western). Aceste membrane leagă acizii nucleici şi
proteinele prin interacţiuni ionice şi hidrofobe, având o capacitate de legare de
20-40 μg/cm2 până la 150 μg/cm2 pentru PVDF.
Legăturile dintre ADN şi membrane sunt mult mai puternice decât
legăturile de hidrogen dintre secvenţele complementare,ceea ce permite
înlăturarea sondelor şi retestarea fragmentelor imobilizate, dacă este necesar.
Membranele cu o incărcare pozitivă leagă mai eficient fragmentele mici
de ADN. Acestea, vor reţine proteine sau alte elemente contaminante.
Inainte de transferul probei, membranele sunt umezite prin scufundare
în tamponul de transfer. Orice zonă unde membrana nu s-au hidratat suficient
237
va ramâne albă, în timp ce restul membaranei se înnegreste datorită tamponului.
Dacă membrana nu se hidratează uniform, locurile uscate vor inhiba legarea de
sondă (125, 149).

Metode de transfer
Transferul poate fi facut prin mai multe metode:
1. Capilar
2. Electroforetic
3. În vid
Scopul tuturor metodelor este de a transfera ADN-ul din gel pe un
substrat membranar pentru testare.
Transferul capilar. Metoda originală dezvoltată de Southern a folosit
transferul capilar, care este simplu şi relativ ieftin, deoarece nu utilizează nici
un aparat. Transferul poate fi mai puţin eficient pentru geluri mari. Bulele sau
cristalele dintre membrane şi gel pot cauza pierderi de informaţii sau artefacte
de colorare. Procedura este lentă, durând până la 12 ore pentru fragmente mari
(76) (fig. 10.17).
Pentru transferul capilar gelul este plasat deasupra unui container de
mică adâncime cu tampon de transfer cu salinitate mare. Membrana de
nitroceluloză este aşezată direct pe gel, şi membranele absorbante uscate sau
prosoape de hârtie sunt stivuite deasupra. Tamponul este transportat prin
capilaritate de la rezervorul inferior pe materialul uscat de deasupra gelului.
Mişcarea tamponului prin gel va duce la transferul şi denaturarea ADN. Când
ADN-ul intră în contact cu membrana de nitroceluloză, acesta se va lega de ea,
în timp ce soluţia tampon va trece prin membrana sau prosoapele de hârtie de
deasupra (149).

Fig. 10.17 Transferul capilar. Mişcarea capilară faciliteaza trasportul

tamponului de pe foaia imbibată pe cea uscată, ADN-ul denaturat este reţinut
pe membrană (232).

238
 O a doua metodă, numită transfer electroforetic, utilizează curentul.
Electrozii sunt ataşaţi deasupra membranei (anod) şi dedesubtul gelului (catod).
Curentul transportă ADN-ul transversal din gel spre membrană. Transferul
electroforetic este efectuat prin două metode ‘bazin’ şi ‘semiuscată’ (fig.10.18).
În metoda bazinului, electrozii transferă current prin membrane în
tamponul de electroforeză.
În cazul metodei semiuscate, electrozii contactează direct sandwich-ul
gel-membrană, necesitând soluţie tampon doar pentru a îmbiba gelul şi
membrana. Transferul electroforetic cu ajutorul bazinului este preferat pentru
proteine mari activate pe geluri de acrilamidă, în timp ce metoda semiuscată
este utilizată frecvent pentru fragmente mici (129).

Figura 10.18 Transferul electroforetic (232).

Transferul în vid foloseşte sucţiunea pentru a fixa ADN-ul din gel pe

membrane într-un tampon recirculant (fig.10.19). Ca şi transferul electroforetic,
această metodă transfera ADN-ul mai rapid, de exemplu, în ore faţă de zile cum
se întâmpla în cazul transferului prin capilare. Transferul discontinuu datorat
aerului prins între membrane şi gel este evitat. Un dezavantaj al celei de-a doua
si de-a treia metode este costul şi mentenanta echipamentului de vid şi
electroforeză (19).

Figura 10.19. Transferul in vid (19).

239
 După legarea acizilor nucleici pe membrane, ADN-ul secţionat şi
denaturat este imobilizat permanent pe membrane prin uscarea lor într-un
cuptor cu vid (800 C 30-60 min) sau prin ataşarea covalentă folosind energia
luminii UV, pentru a preveni spălarea sau transferul pe membrane.
După imobilizarea ADN-ului este necesar un pas de prehibridare pentru
a preveni legarea sondei de locuri nespecifice de pe suprafaţa membranei.
Prehibridarea implică incubarea membranei în aceeaşi soluţie tampon în care se
vor introduce ulterior sondele. In acest stadiu, soluţia tampon nu conţine sonde.
Membrana este expusă tamponului la o temperatură de prehibridare optimă,
timp de 30 de minute până la câteva ore, depinzând de protocolul specific. In
acest stadiu proba este gata pentru hibridarea cu sondă, fapt care va permite
vizualizarea genelor specifice sau a regiunilor de interes (19, 30, 149).

10.2.3 Hibridarea ADN-ARN sau transferul Northern

Are următoarele etape:

1. extracţia ARN;
2. electroforeza pe gel denaturant;
3. înlaturarea denaturantului din gel;
4. transferul pe membrane;
5. prehibridarea şi hibridarea membranelor cu sondele marcate radioactive;
6. expunerea filmului autoradiografic pe membrană (autoradiografia) (fig.
8.20).
Transferul Northern este o variantă modificată a tehnicii Southern şi a
fost conceput pentru a investiga structura şi cantitatea de ARN. Cu toate că
majoritatea analizelor Northern sunt făcute pentru a investiga nivelul de
expresie a genelor şi stabilitatea acestora, metoda poate fi folosită şi pentru a
investiga anomaliile structurale ale ARN-ului din aberaţiile de sinteza sau
procesare, cum ar fi legarea alternativă. Anomaliile de lipire sunt responsabile
de boli ca beta talasemia (boală a sângelui) şi o deficienţă familială a
hormonului de creştere. Analiza structurii si cantităţii de ARN dezvăluie
indirect mutaţii în semnalele de activare şi lipire în AND (30, 125).
ARN trebuie extras cu atenţie pentru a menţine un mediu fără RNaze.
După izolarea şi cuantificarea ARN-ului, probele pot fi aplicate direct pe geluri
de agar. sau poliacrilamidă (pentru analiza expresiei genice virale (156).
Electroforeza pe gel a ARN-ului trebuie efectuată în condiţii de denaturare
pentru a testa corect mărimea trascripţiei. Este necesară denaturarea completă
pentru un transfer eficient al ARN-ului din gel pe membrane, ca şi în cazul
transferului de ADN în metoda Southern. Deoarece denaturarea se desfăşoară în
timpul electroforezei, nu este necesar un pas de denaturare separat. După
electroforeză, benzile reprezentative pot fi tăiate din gel, trecute prin acetat de
amoniu pentru a înlătura denaturantul şi colorate cu bromura de etidiu pentru a
testa calitatea şi încărcarea probei.
240
 Denaturantul, trebuie înlăturat din gel înainte de transfer deoarece acesta
inhibă legarea ARN-ului de nitroceluloză. Aceasta lucru se realizează prin
clătirea gelului în apa deionizată(fig.10.20)
ARN-ul este transferat utilizând una din soluţiile tampon 10X sau 20X
SSC, sau 10X SSPE pentru nitroceluloză (125, 149).

Fig. 10.20. Tehnica Northern blot (233, 234).

Prehibridarea şi hibridarea membranei cu sonde marcate radioactiv se

realizează în soluţiile tampon formamidă/SCC/SDS.
Citirea se face prin autoradiografie (30).

10.2.4 Transferul proteinelor pe membrane (Western)

Este o variantă a transferului Southern, folosit pentru proteine cu

următoarele etape:
1. extracţia;
2. denaturarea;
3. electroforeza proteinelor pe gel SDS-poliacrilamidă;
4. transferul proteinelor pe membrane;
5. contactul cu anticorpul primar (Ac);
6. contactul cu anticorpul secundar, ce are ataşată o enzimă (fig. 10.21)
7. Substratul este degradat de enzima Ac secundar şi marchează colorimetric
sau prin chemiluminiscenţă zona de contact a Ac primar cu proteina ţintă
de interes.

241
 Figura 10.21. Identificarea proteinei de interes. Ataşarea anticorpului
primar, secundar ce are ataşată peroxidaza care degradează substratul ce
marchează colorimetric zona în care este situatăpe membrană proteina de
interes (235).

Ţinta imobilizată pentru un transfer Western este proteina.

Serul, lizatul cellular sau extractul sunt migrate pe un gel SDS-
poliacrilamida (SDS-PAGE) sau pe geluri cu puncte izoelectrice (IEF). Prima
tehnică descompune proteinele în funcţie de masa moleculară, iar cea de-a doua
în funcţie de încărcarea electrică.
Pentru separarea proteinelor în subunităţi se folosesc ditiotreitol sau 2-
mercaptoetanol. Inainte de a încărca gelul, proteinele sunt tratate cu
denaturant. Probele sunt analizate utilizând standardele de greutate moleculară
precolorate pentru a stabili dimensiunea fragmentelor proteice de transfer şi
tipul membranei. Standardele sunt cuprinse între 11,700 d (citocrom C) si
205,000 d (miozina) (76).
Concentraţia de poliacrilamidă variază între 20-50% în funcţie de
complexitatea şi cantitatea proteinei ţintă. Se utilizează 1-50 μg de proteină în
fiecare godeu. Proteinele sunt supuse electroforezei.
Dupa electroforeză, proteinele sunt transferate pe membrane prin
capilaritate sau transfer eletroforetic. Nitroceluloza are o afinitate mare
pentru proteine şi este prehibridată prin tratare cu detergent (0.1% TWEEN 20
în 0.05 MTris si 0.15 M clorură de sodiu, pH 7.6) pentru a preveni legarea
anticorpului primar de membrane înainte de hibridare.
Membranele folosite pentru transfer sunt: nitroceluloza, PVDF şi
celuloză cu schimbare de anioni (DEAE) sau cationi (CM).
242
 După transfer membrana este incubată cu o proteină nespecifică
(cazeina sau albumina) care se leagă de locurile neocupate de pe membrană.
Membrana este pusă în contact cu anticorpul primar, capabil să se
lege de proteina specifică, apoi are loc spălarea membranei pentru a îndepărta
anticorpii nelegaţi;
-a doua incubare, cu anticorpul secundar. Anticorpul secundar este
conjugat cu o enzimă care recunoaşte anticorpul primar de pe membrană
permiţând detecţia printr-o metodă colorimetrică sau de fluorescenţă (2, 8).
Mod de lucru
1. Se asamblează aparatul şi se umple cuva cu tampon de transfer. Dacă
aparatul este prevăzut cu sistem de răcire, acesta se deschide înaintea
tranferului.
2. Din partea catodică (neagră) la cea anodică (roşie) a casetei de transfer se
aşează în ordine urmatoarele:
- buretele ;
- hârtia de filtru umezită;
- gelul de migrare echilibrat în prealabil cu tamponul de transfer timp de
30 minute membrana umezită în tampon de transfer ;
- a doua hârtie de filtru umezită;
- burete. Se închide caseta cât mai etanş şi se introduce în cuvă.
Proteinele migrează de la catod la anod la pH -ul tamponului.
3. Transferul se realizează la 150V (aprox 350 mA) timp de două ore (pentru
proteinele de peste 100 Kd) sau 30V (80 mA) peste noapte în camera rece.
4. După ce s-a realizat transferul membranar trebuie spălată de doua-trei ori
în TBS/T si apoi blocată cu 3-5% lapte praf degresat. Gelul rămas se
colorează cu bleu de Coomasie pentru a verifica dacă transferul a fost
complet. Verificarea transferului se mai poate face utilizând markeri de
greutate moleculară coloraţi. In cazul în care transferul a fost incomplet şi
nu s-a desprins gelul de pe membrană se poate reintroduce la migrat
(149).
5. Pentru tratamentul cu anticorpi, în cazul membranei uscate de
diflorura de poliviniliden (hidrofoba) se umectează cu metanol (pentru a
revela siturile de legare, cea de nitroceluloza (hidrofilă) neavând nevoie
de acest tratament;
6. Ulterior membrana va fi imersată în soluţia cu anticorpul primar preparat
în diluţie 1/100-1/1000 în tampon de transfer. În cazul
chemiluminescenţei concentraţiile de anticorpi pot fi micşorate de 10X.
Această etapă va dura 1-2h la temperatura camerei sau o noapte la 4°C, cu
o agitare uşoară ;
7. După tratarea cu anticorpul primar membrana se spală de patru ori câte
15 minute în tampon de blocare (200 ml) la teperatura camerei.
Complexele antigen-anticorp sunt detectate cu anticorpi secundari de tip
anti Ig G cuplaţi cu peroxidaza sau fosfataza alcalină, în diluţie care se
tatonează (1/1000-1/10000), tratamentul durând 1h la agitare uşoara pe un
agitator orbital;

243
 8. Membrana se se spală apoi de trei ori în TBS/T. După ultima spălare
membrana este imersată în soluţia ce conţine luminol pentru peroxidază
(se utilizează Lumigen TMA-6, GE Healthcare UK, soluţie A si B în
cantităţi egale).
Cel mai bun semnal se obţine în primele secunde până la primele
minute, cu ajutorul unui aparat digital de fotografiat-Singene-cu ajutorul
programului GeneSnap-Gbox(LFB)-chemisample.
Există posibilitatea fotografierii succesive la intervale de timp alese,
urmată de cumulare (30, 125, 149).

10.3 Condiţii de hibridare, stringenţa

Condiţiile de realizare a transferului Southern si Northern trebuie sa fie

optimizate pentru fiecare acid nucleic ţintă. Stringenţa este o combinaţie de
condiţii în care ţinta este expusă sondei. O stringenţă mare necesită mai multe
sonde complementare ţintei. Condiţiile pentru o stringenţă mai mică sunt mai
îndulgente. Dacă aceste condiţii sunt fixate prea sus, sonda nu se va lega de
ţintă. Dacă ele sunt setate prea jos sonda se va lega de ţinte greşite complicând
interpretarea rezultatelor finale.
Caţiva factori influenţează stringenţa:
- temperatura de hibridare,
- concentraţia sării în soluţia tampon de hibridare şi
- concentraţia denaturantului.
Secvenţa sondei poate, de asemenea, influenţa nivelul de stringenţă. O
sondă cu un procentaj mai mare de baze G sau C se va lega sub condiţii de
stringenţă mai stricte decât una cu un număr mai mare de baze A şi T.
Condiţiile ideale de hibridare pot fi estimate din calcularea temperaturii de
topire sau Tm a sondei (149).
Hibridările sunt în general făcute în pungi de hibridare sau cilindre de
sticlă. Volumul recomandat de tampon de hibridare este de aproximativ 10
mL/100 cm3 de suprafaţă membranară.
Formamida din tampon scade temperatura optimă de hibridare. Acest
lucru este util în special pentru sondele de ARN ţintă, deoarece, datorită
structurii secundare sunt mai dificil de denaturat şi tind să aibă o temperatură de
renaturare (hibridare) mai mare. Incubarea sistemului de hibridare în pungi
sigilate, în baie de apă sau în cilindri de sticlă acoperiţi, situaţi în cuptoare
rotative, menţin transferul la o temperatură constantă.
Sondele scurte (< 20 de baze) pot hibrida în 1-2 ore. Sondele mai lungi
au nevoie de un timp mult mai mare. Pentru transferurile Southern şi Northern
cu sonde de >1000 de baze, incubaţia se desfăşoară mai mult 16 ore. Crescând
concentraţia sondei putem mări rata de hibridare. Polimerii inerţi, cum ar fi
dextran sulfat, polietilenglicolul, sau acidul poliacrilic pot accelera rata de
hibridare pentru sondele mai lungi de 250 de baze (125).
244
 Sisteme de detecţie
Sondele originale marcate cu 32P oferă avantajul unei detectări sensibile
şi simple (fig. 10.22).

Fig. 10.22 O sondă de ADN sau ARN marcată cu atomi radioactivi (32P
sau 33P) hibridează secvenţele ţintă (omoloage) pe o membrană de
nitroceluloză. Fragmentele de care se leagă sonda pot fi detectate de
expunerea filmului autoradiografic pe membrană (234).

Dupa hibridare, sondele nelegate sunt spălate şi membrana este expusă

la un film sensibil la lumina pentru a detecta fragmentele care sunt hibridate cu
sondele radioactive. Acestea trebuie sa fie formulate astfel încât doar sondele
complet hibridate să rămână pentru transfer. Condiţiile de spălare tipice sunt
mai stringente decât cele folosite pentru hibridare.
245
 Sistemele de detectare neradioactive
Pentru majoritatea sistemelor neradioactive, sonda este marcată printr-o
nucleotidă legată covalent de digoxigenină sau de biotină. Nucleotida marcată
este încorporată în lanţul de nucleotide al sondei prin transcripţie in vitro,
extensia primerului sau prin transferaza terminală. Sondele marcate cu biotină
sau digoxigenină sunt incubate împreună cu mostrele de transport ce conţin
secvenţe ţintă pentru a permite apariţia hibridării. După hibridare, sondele
nelegate sunt spălate, apoi anticorpul anti-digoxigenină, streptavidina sau
cunjugat de fosfataza alcalină (conjugatul AP, Fig.10.23) sunt adăugate la
reacţie pentru a forma complexul sondă: ţintă marcat (30).
După legarea conjugatului, membrana este spălată într-o soluţie de
substrat care, atunci când este oxidată cu HPR sau defosforilată de AP, produce
un semnal. Substraturile frecvent utilizate sunt dioxietan sau derivaţi de
colorant tertrazoliu, care generează o chemiluminescenţă sau semnale
cromogene (19).
Substratul cel mai des folosit pentru detectarea cromogenă este un
amestec de tetrazoliu albastru (NBT) şi 5- bromo- 4- cloro- 3- indolil fosfat
(BCIP). După defosforilarea BCIP cu ajutorul fosfatazei alcaline se oxideaza cu
NBT pentru a obţine o culoare indigo închis ca şi produs de oxidare (fig.8.23).
BCIP este redus pe parcursul procesului, şi produce un compus albastru.
Ca şi în cazul detecţiei radioactive, semnalul chemiluminescent produs
de acţiunea enzimei asupra dioxetanului se evidenţiază la întuneric prin
autoradiografie (19) (fig 10.24).
Detectarea chemiluminescenţei este deseori mai puternică şi se dezvoltă
mai rapid decât cea radioactivă. Un dezavantaj al metodei e că este mai greu de
controlat şi câteodată produce un fundal aglomerat. Noi substanţe au fost
concepute pentru a minimiza aceste impedimente.
Autoradiografia este o tehnică de mare sensibilitate pentru localizarea
substanţelor marcate cu izotopi radioactivi ca: 14C, 32P, 35S, 59Fe, 125I sau 131I.
Printr-o metodă de cartare ce dă naştere în gel unor spoturi foarte
compacte, O’Farell (1975) a arătat că a folosit o coloraţie cu Coomassie Blue R
250 prin care pot fi evidenţiate chiar 0,01 g de proteină.
Autoradiografia este de 100 de ori mai sensibilă, iar uneori chiar de
1000 ori decât metodele anterioare.
Pentru autoradiografie cu izotopi înalt energizaţi 32P, 59Fe, 59C, gelul ar
trebui acoperit cu folie subţire de polietilenă şi pus în contact cu un film sensibil
la radiaţii X.

246
 Fig. 10.23. Detectarea zonelor de hibridare a sondelor prin marcaj
neradioactiv (232).

Figura 10.24 Lumina este emisă din substratul 1-2 dioxetan, după
defosforilare cu fosfatază alcalină până la o structură instabilă. Această
structură eliberează un anion excitat ce emite lumina (19).

Unii izotopi au tendinţa de a se rearanja sau dezintegra. Dezintegrarea

247
implică eliberarea particulelor subatomice sau a radiaţiilor electromagnetice.
Emisia radioactivă generează un flux de lumină. Intensitatea luminoasă este
proporţională cu energia emisă. Expunerea unui film sau a unei emulsii
fotografice peste un gel care conţine molecule marcate cu izotopi radioactivi îl
marchează (125).
Pentru autoradiografie gelurile trebuiesc uscate. După decolorarea finală
gelurile se retractă până la dimensiunea iniţială, chiar mai mult, în metanol 65%
cu glicerol 0,5%.
Cheia unei metode de transfer de succes este un raport mare semnal-
fond. Ideal, sonda şi sistemul de detectare ar trebui să prezinte un semnal
specific şi puternic. Un semnal specific intens, poate fi însoţit de un semnal de
fond mare. De aceea, sensibilitatea detecţiei este uneori sacrificată pentru a
genera un semnal specific (149).

Interpretarea rezultatelor
Când o sondă specifică se leagă de ţinta imobilizată pe membrana,
legatura este detectată după cum s-a descris anterior, prin vizualizarea unei
„benzi” pe membrana sau film. Analiza benzii, produsă de transferul Southern
poate fi simplă sau complexă depinzând de mostra sau conceptul procedurii.
Transferul Southern nu poate detecta micile deleţii sau inserţii ale nucleotidelor
sau diferenţa de o singură nucleotidă, decât daca afectează un loc de restricţie
specific. Hibridarea încrucişată poate deregla rezultatele. Aceste artefacte pot fi
identificate prin prezenţa lor pe fiecare suprafaţă cu o mărime constantă (8, 19,
30).
Transferurile Northern (sau Western) sunt de obicei folosite pentru
analiza expresiei genice, cu toate că pot fi utile şi pentru a analiza mărimea
transcripţiei, procesarea transcripţiei şi modificarea proteică. Pentru aceste
analize, în special când se estimează expresia, este important să se includă toate
controalele interne de corectare a erorilor de izolare, încărcarea gelului sau
transferul probelor. Cantitatea de expresie este apoi deteminată faţă de
standardul (125).

10.4 Tehnica ADN microarray

Microcipurile microarray tradiţionale reprezintă o colecţie de spoturi

ADN microscopice ataşate de o suprafaţă solidă – sticlă, plastic sau silicon,
numite biocipuri.
Etapele tehnicii:
1. extracţia ARNm din celule bolnave şi sanatoase;
2. transformarea ARNm în ADNc prin intermediul reverstranscriptazei;
3. marcarea fluorescentă a celor 2 tipuri de ADNc;
4. contactul ADN din spoturi cu ADNc marcat;
5. evaluarea prin scanare a zonelor de hibridare de la nivelul spoturilor.
248
 In 1987, s-au dezvoltat tehnicile de testare prin utilizarea sticlei în locul
membranelor de nitroceluloză sau nylon. Tehnologiile de colorare s-au
îmbunatăţit, iar abilitatea de a depozita picături foarte mici de ţintă pe un
substrat de sticlă a detrminat apariţia microtestelor. Zeci de mii de ţinte pot fi
scanate simultan pe o arie foarte mică, prin minimizarea spoturilor de ţinte.
Sistemele de depozitare automată pot plasa 80,000 -100 000 de ţinte pe un
substrat de sticlă de mărimea unei lame de microscop ce are 384 de cip-uri (fig.
10.25). Completarea imaginii brute a secvenţei genomului uman a dezvăluit că
acesta poate avea mai puţin de 30,000 de gene. Scopul tehnologiei de testare
este scanarea simultană a întregului genom uman pe un singur, la nivelul căruia
se află secvenţe reprezentative colorate ale fiecarei gene, în triplicat (19, 59).

Figura 10.25- Testerele sunt uneori suplimentate cu nucleotide

fluorescente utilizate în marcarea sondelor de testare si software pentru
identificarea zonelor de hibridare de pe lama cu ajutorul cititorului (19).

Ţintele sunt de obicei ADN, cADN, produşi PCR sau oligomeri, dar pot
fi ARN sau proteine. Ţintele sunt colorate în triplicat şi împrăştiate pe spot
pentru a evita orice artefacte care pot apare din hibridarea inegală. Sondele sunt
de obicei generate de cADN din proba de ARN, dar pot fi şi ADN genomic,
ARN sau proteine.
Etapa de hibridare se realizează cu 2 sonde de ADNc care urmează a fi
comparate (sonde de ţesut bolnav / ţesut sănătos; celule tratate / celule netratate)
marcate cu doi fluorocromi diferiţi.
Marcerii fluorescenţi sunt: cianina Cy3, cu lungime de undă emisă de
570 nm (corespunzător spectrului cu lumina verde), si Cy5 cu lungime de undă
emisă de 670 nm (corespunzator spectrului cu lumina rosie).
Cele două tipuri de sonde - cDNA- marcate Cy sunt amestecate şi
hibridate pe acelaşi cip microarray, care va fi scanat pentru a analiza
intensitatea semnalului fluorescent a celor doi fluorocromi (fig. 10.26).
Intensităţile relative ale semnalului fluorescent al celor doi markeri pot
fi analizate în vederea identificării genelor cu expresie stimulată sau inhibată
(97).

249
 Fig. 10.26 Etapele hibridării microarray (97).

Fields a văzut că întreaga colecţie de proteine codată de un genom,

cunoscut ca şi proteom, poate fi de zece ori mai complexă decât genomul.
Studiul întregului set de proteine, sau proteomica, va fi facilitat prin tehnologia
microtestării, folosind legături antigen/ anticorp sau receptor/ligand.
Spectroscopia în masă poate de fi aplicată studiului proteomicii.
Alte metode folosite pentru depozitarea ţintelor pe cipuri includ
efectuarea sintezei ADN direct pe sticlă sau pe un suport de silicon (46).
Această tehnică foloseşte informaţii secvenţiale pentru a concepe nucleotidele şi
pentru a masca, activa selectiv şi a ataşa covalent nucleotidele pe poziţii
desemnate de pe spot (fig. 10.27). Tehnici patentate de fotolitografie
(Affmetrix) permit sinteza cu eficienţă mare a oligomerilor scurţi (de 10-25 de
perechi de baze) pe spot-uri de densitate mare. Acesti oligomeri sunt puşi în
contact cu sonde marcate ale secvenţelor de testat. Utilizând această tehnologie,
mai mult de 100 000 de ţinte pot fi aplicate pe spot. Aceste tipuri sunt numite
testări de oligonucleotide de mare densitate şi sunt folosite pentru analiza
mutaţiilor, a polimorfismului nucleotidelor simple şi secvenţiere (46).

250
 Alt tip de testare foloseşte microelectronica pentru a concentra
ţintele în poziţii specifice pe lamă. Odată legate, aceste ţinte pot fi hibridate pe
sonde marcate de ADN sau ARN în anumite condiţii. In această tehnologie,
fiecare poziţie de pe lamă este ataşată de un electrod care poate fi programat să
atragă şi să concentreze sonda marcată. Prin modificarea separată a condiţiilor
de hibridare pentru fiecare spot, rezoluţia unei singure nucleotide este posibilă,
prin utilizarea fragmentelor mai lungi de sondă (19).

Figura 10.27 Sinteza ţintei fotolitografice. O mască permite activarea la

lumina de pe cip. Când o nucleotidă este adugată, doar punctele activate o vor
lega covalent. Procesul este repetat până secvenţele dorite sunt generate în
fiecare poziţie pe cip (19).

Prepararea sondelor pentru analiza matricilor necesită marcare

fluorescentă a acestora. Teste reprezentate de micromatrici şi alte matrici de
densitate mare sunt citite prin sisteme de detecţie fluorescentă automată. Cea
mai frecventă metodă de obţinerea sondelor marcare este precedată de sinteza
cADN cu încorporarea nucleotidelor marcate. Pentru ADN, este folosită
imprimarea întâmplătoare (11).
Pentru analizele de expresie a genelor ţintele imobilizate în cipuri sunt
hibridate cu mARN marcat extras din celulele tratate sau diferite tipuri de
celule. Matricile folosite în această aplicaţie sunt clasificate ca matrici de
expresie (55). Acestea măsoară producerea sau transcripţia relativă a
proteinelor din probe netratate sau normale.

Tehnica ADN microarray poate fi utilizată în:

- detectarea polimorfismului unei singure nucleotide (SNPs);
- detectare ADN sau ARN care poate fi implicat în traducere în protein;
- Măsurarea nivelului de expresie genică pe baza ADNc poartă denumirea
de analiza expresiei genice.

251
 In cazul analizei ARNm sau a profilului de expresie genică se
monitorizează nivelul de expresie a mii de gene simultan, în vederea
diagnosticului unor boli sau pentru analiza genică a stadiilor de dezvoltare ale
ţesuturilor sau organismelor.
De exemplu, pe baza analizei microaray se pot identifica genele a căror
expresie se modifică sub acţiunea unui anumit agent patogen, comparând
nivelul de expresie din celule sau ţesuturi infectate cu cel din celulele sau
ţesuturile sănătoase (59, 128).
Medicina personalizată, înseamnă acordarea unui tratament
individualizat pentru pacienţi diferiţi care au aceeaşi boală. Această diferenţiere
se bazează pe particularităţile de ordin genetic, reflectate în compoziţia şi
funcţionarea proteomului, ale prezumtivului pacient.
In timp ce sunt descoperite diferenţele genetice dintre indivizi,
cercetătorii se aşteaptă să fie capabili să utilizeze aceste noi tehnologii pentru a
creea medicamente personalizate, care vor fi mult mai eficiente pentru fiecare
pacient in parte (97).
De exemplu: se spera să se descopere noi medicamente care vor avea
drept ţinta inactivarea proteazei HIV-1A, o enzimă capabilă de a cliva o
proteină a virusului imunodeficienţei umane în părţi mult mai mici, inactive. Ar
fi una din cele mai eficiente terapii împotriva HIV (37).

10.5 Cariotiparea

Mutaţiile genomice prin aneuploidie pot fi detectate prin metode

indirecte cum ar fi citometria în flux şi cariotiparea. Un cariotip este reprezentat
de un set complet de cromozomi dintr-o celulă. Cariotiparea constă în analiza
structurii cromozomilor în metafază prin aranjarea lor în funcţie de mărime.
Necesită colectarea celulelor vii şi creşterea lor într-o cultură, în laborator timp
de 48 - 72 de ore. Diviziunea celulară este stimulată de un mitogen, de obicei
fitohemaglutinina. Celulele sunt apoi stagnate în metafaza cu colcemid, un
inhibitor al polimerizării tubulinelor (blocând formarea fusului mitotic).
Cromozomii din celulele aflate în diviziune apar ca metafaze dispersate în urma
unui tratament cu o soluţie salină hipotonă. Perechile de cromozomi pot fi
asamblate într-o prezentare organizată, sau cariotip, în funcţie de mărimea lor şi
poziţionarea centromerului. Aneuploidia poate fi observată afectând câţiva
cromozomi sau unul singur (19, 101).
Prin cariotipare se pot detecta mutaţii cromozomiale precum
translocaţiile. Translocarea neechilibrată în celulele germinale se produce în
timpul meiozei afectând fenotipul progeniturii. O translocaţie robertsoniană
constă în deplasarea majorităţii fragmentelor cromozomiale la centromerul altui
cromozom. Acest tip de translocaţie poate deveni neechilibrat în timpul
reproducerii şi determină un câştig net sau o pierdere a materialului
252
cromozomial la progenitură.
Alte tipuri de mutaţii cromozomale care sunt uneori vizibile prin
cariotipare sunt cele prin deleţii mari (zone de milioane perechi de baze).
Deleţiile mici nu sunt văzute uşor cu ajutorul acestei tehnici.
Inserţia este un câştig de material cromozomal. Secvenţele inserate pot
apărea prin duplicarea unor regiuni din cromozomul afectat sau din fragmentele
altor cromozomi.
Inversiile la nivelul centromerului se numesc pericentrice. Cele
paracentrice implică secvenţe dintr-un braţ al cromozomului. Un izocromozom
este un cromozom metacentric ce rezultă din despărţirea transversală a
centromerului în timpul diviziunii celulare. Aceasta produce două braţe lungi
sau scurte pentru a separa în celule fiice anormal cu un braţ lung şi unul scurt.
Braţele unui izocromozom sunt, deci, egale ca şi lungime şi identice genetic.
Un cromozom inel rezultă din deleţia regiunilor de la ambele capete şi
reunirea capetelor pentru a forma un cerc.
Un cromozom derivativ este anormal, fiind alcătuit din părţi translocate
sau rearanjate de la doi sau mai mulţi cromozomi neidentificaţi reunite.
Rezultate ale cariotipării sunt exprimate ca numărul de cromozomi/
nucleu, cromozomii sexului (XX sau XY), urmate de orice anormalitate
genetică observată (125).

10.5.1 Fluorescenţa în hibridarea in situ

Interfaza FISH
Hibridarea fluorescentă in situ (FISH) este o metodă des folosită pentru
a detecta proteine, ARN dar şi structuri ADN din celulă sau in situ. Pentru
analiza citogenetică, celulele fixate sunt expuse unei sonde, constituită dintr-un
fragment de ADN de 60-200 kb ataşat covalent de o moleculă fluorescentă.
Sonda se va hibrida cu secvenţa complementară din ADN-ul celular. In FISH,
sonda legată poate fi vizualizată cu un microscop fluorescent, în nucleul celulei.
Sondele sunt concepute pentru a fi specifice unor cromozomi sau unor regiuni
cromozomiale specifice, astfel încât imaginea de la microscop să se coreleze cu
starea acelui cromozom sau a acelei regiuni. De exemplu, o sonda la orice
regiune unică de pe cromozomul 22 ar trebui să arate o imagine a două semnale
pentru nucleu, reflectând cele două copii ale cromozomului 22 din nucleul
celulelor somatice. Modificarea regiunii hibridate la sondă va determina apariţia
în nucleu a unui singur semnal sau a mai mult de două semnale. Multe sonde
cuprind regiuni mari folosite pentru a detecta deleţiile regionale (82). Un
avantaj al interfazei FISH este faptul că, creşterea celulelor într-o cultură nu
este necesară. Metodele FISH sunt, deci, folosite deseori pentru a studia probele
prenatale, tumorile şi bolile hematologice, nu toate fiind aduse în mod
convenţional în metafază în timpul culturii (101, 161).
253
 Translocaţiile sau alte rearanjamente pot fi detectate folosind sonde de
diferite culori, complementare regiunilor fiecărui cromozom ce ia parte la
translocaţie. Un cromozom translocat va combina culorile celor două sonde cu
o pierdere a unui semnal. Analiza semnalelor translocaţiei este uneori
complicată de semnalele false ce rezultă din doi cromozomi aşezaţi foarte
aproape unul de celălalt în nucleu, astfel încât sondele legate poate să dea un
semnal similar cu cel exprimat de o translocaţie. Aceste semnale false pot fi
distinse de adevăratele translocaţii prin mărimea imaginii fluorescente, dar
necesită un ochi antrenat. Luând în calcul semnalele fals pozitive ca şi erorile
de fond sensibilitatea acestui test este limitată.
Sensibilitatea analizei de interfază FISH poate fi crescută folosind
sondele cu două culori sau sondele cu dublă fuziune. Aceste sonde, cu marimea
cuprinsă între 0.8-1.5Mb, sunt concepute pentru a se lega de regiunile ce
acoperă punctul de rupere a ambilor parteneri de translocaţie (70).
O translocaţie va fi observată ca un semnal atât de la joncţiunea
translocţiei cât şi de la joncţiunea reciprocă a translocaţiei; de exemplu, t(9;22)
si t(22;9). Sondele cu dublă fuziune, reprezintă o altă posibilitate de a identifica
translocaţiile. Aceste sonde sunt concepute să se lege la cromozomul intact, ca
să apară punctul de rupere al translocaţiei. Când apare o translocaţie, cele două
sonde se separă.
Sondele centromerice (CEP) sunt concepute să se hibrideze la o
secvenţă satelit alfa foarte repetitivă ce înconjoară centromerii. Acestea
detectează aneuploidia oricărui cromozom. Adăugarea unui CEP la o sondă cu
două culori serveşte ca şi control pentru amplificarea sau pierderea unui
cromozom implicat în translocaţie.
Sondele telomerice sunt utile pentru detectarea anomaliilor structurale
ale cromozomilor cum ar fi translocaţiile criptice sau deleţiile mici, care nu sunt
uşor de vizualizat prin cariotiparea standard (101).
Deoarece celulele de interfază pentru FISH nu necesită cultivarea lor şi
stimularea divizării pentru a le surprinde în metafază, ca în cariotiparea
standard, interfaza FISH este mai rapidă decât metodele ce folosesc celule în
metafază şi este valoroasă pentru analiza celulelor ce nu se divid bine în cultură,
inclusiv celulele fixe (63). In plus, între 200-500 de celule pot fi analizate
microscopic folosind interfaza FISH, iar sensibilitatea detecţiei este mai mare
decât la procedurile de metafază, care examinează de obicei 20 de celule. O
limitare a metodei FISH este incapacitatea de a identifica schimbări
cromozomiale în afara de cele de la regiunea de legătură specifică sondei. Pe de
altă parte, cariotiparea este o metodă mai generică ce poate detecta orice
schimbare cromozomală ce cauzează schimbări în mărimea cromozomială,
număr sau modelul de legare (103).
Prepararea unei sonde este critică în analiza interfazei FISH, atât pentru
a permeabiliza celulele pentru interactiunea optimă sondă-tintă cât şi pentru a
254
menţine morfologia celulară (161). Rezultatele optime sunt obţinute dacă
celulele în interfază prospete sunt incubate peste noapte, după depozitarea pe
lame. Ulterior celulele sunt tratate cu protează pentru a minimiza interferenţa
proteinelor citoplasmatice şi sunt fixate cu 1% soluţie de formaldehidă pentru a
stabiliza morfologia nucleară. Inainte de denaturarea ADN, celulele sunt
deshidratate în concentraţii gradate de etanol. Ţesuturile tratate cu parafină
trebuie deparafinate în xilen înainte de tratarea cu protează şi formaldehidă.
Calitatea sondei ar trebui de asemenea verificată şi performanţa sa
validată înainte de utilizare. Se recomandă ca performanţa sondei să fie
observată pe un ţesut de control înainte de utilizare. Sub un microscop
fluorescent, de fond puternic, cu un filtru de distingere a culorii potrivit
semnalului sondei. Sondele diferă prin caracteristicile semnalului şi intensitate
(8).
Asemănător cu procedurile de transfer Southern si Northern, atât
sondele cât şi ţintele trebuie să fie denaturate înainte de hibridare. Timpul
necesar hibridării şi utilizarea ADN-ului Cot- 1 (pentru a reduce legarea
nespecifică) sau de facilitatori (sulfatul de dextran) pentru a creşte concentraţia
sondei efective, depinde de complexitatea secvenţei. O sondă de 10 ng-1μg
poate fi folosită într-un volum de hibridare de 3-10 μL. Hibridarea sondei pe
celulele ţintă ar trebui efectuată la 37-42 °C într-o camera cu umiditate. Lamele
sunt acoperite prin alunecare şi sigilate pentru a optimiza condiţiile de
hibridare.
După hibridare şi înlăturarea sondei nelegate, prin clătirea în borcane
Coplin, sonda este observata la microscop. Semnalele sondei ar trebui să fie
vizibile din întregul nucleu intact. Cu toate că un număr adecvat de celule
trebuie să fie vizibile, celulele înghesuite unde nucleii şi semnalele se suprapun
nu arată un rezultat adecvat. Mai mult, ţesuturile au calităţi ale imaginii diferite
şi caracteristici ce trebuie luate în considerare când se accesează o imagine
FISH.

Metafaza FISH
Analiza metafazei a fost dezvoltată prin utilizarea sondelor fluorescente
ce se leagă de regiunile cromozomale în metafază sau de întregii cromozomi.
Sondele ce acoperă întregul cromozom sunt valoroase pentru detectarea micilor
rearanjamente ce nu sunt vizibile prin legarea normală a cromozomilor. Prin
amestecarea unei combinaţii de cinci fluoruri şi folosind un software de imagine
special, cariotiparea spectrală poate distinge toţi cei 23 de cromozomi umani
prin culori specifice fiecăruia (101). Tehnica poate fi folosită pentru a detecta
anormalităţi ce afectează cromozomi mulipli după cum se întâmplă de multe ori
în cazul celulelor canceroase sau in liniile de celule imortalizate (83, 104).
Sondele telomerice şi centromerice sunt de asemenea aplicate cromozomilor în
metafază pentru a detecta aneuploidia şi anormalităţile structurale.
255
 Prepararea cromozomilor pentru procedurile de matafază FISH începe
cu cultura celulară timp de 72 de ore. Cu circa 45 de minute înainte de recoltare,
este adăugat colcemid pentru a opri celulele în metafază (8, 19).
Deşi secvenţierea ADN este cea mai clară metodă pentru detectarea
mutaţiilor, este posibil ca metoda să nu fie potrivită, pentru procedurile cu
cantităţi mari. Au fost proiectate tehnici pentru detectarea mutaţiilor de ADN de
la schimbări ale perechilor de baze la reararanjamente cromozomiale mari, fără
să trebuiască să determine secvenţa primară de ADN. Metodele de detectare a
secvenţei pot fi clasificate general în concordanţă cu trei abordări principale:
bazate pe hibridare, metode bazate pe secvenţă (polimerizare) şi enzimatice sau
de clivaj chimic.

10.6 Metode de diagnostic bazate pe hibridare

Polimorfismul de conformaţie monocatenară (SSCP) (4, 6) este una

dintre metodele de screening cel mai des folosite, în laboratorul clinic. Metoda
este bazată pe preferinţa ADN-ului (dar şi ARN-ului) de a lua mai degrabă
forma bicatenară decât monocatenară. In absenţa unei catene complementare,
acizii nucleici formează duplexuri intracatenare pentru a atinge cât mai mult
posibil din condiţia bicatenară. Fiecare catenă pliată formează o structură
tridemensională, sau conformer, determinată de secvenţa primară a catenei
pliate (45).
SSCP este determinat de migrarea conformerilor monocatenari în
gelurile de poliacrilamidă sub condiţii de denaturare şi temperaturi controlate.
Pentru SSCP, concentraţiile diluate de produse PCR scurte, bicatenare, optim
100 - 400 perechi de baze lungime sunt denaturate, urmate de răcirea rapida.
Deoarece monocatenele diluate nu pot găsi singure partenerii omologi în
condiţiile de concentraţie, soluţie tampon, şi temperatura folosite ele se pliază
prin hibridare intracatenară, formând conformeri tridimensionali. Forma
conformerilor depinde de nucleotidele complementare disponibile pentru
legături de hidrogen si pliere. O diferenţă de o singură pereche de baze în
secvenţa de ADN poate cauza o pliere diferită a conformerului. Aceşti
conformeri sunt relevaţi într-un gel de poliacrilamidă sau prin electroforeza
capilară. Viteza migraţiei depinde de forma şi mărimea conformerului.
Diferenţele în forma conformerilor (indoituri, bucle, bule şi cozi) sunt cauzate
de diferenţele de secvenţa din ADN-ul monocatenar. Benzile sau modelele de
vârf sunt detectate prin colorarea cu argint, radioactivitate sau fluorescenţă.
Pentru a evita renaturarea partenerilor omologi, după denaturare trebuie
menţinuta o concentraţie scăzută a produselor. Ca o consecinţă, coloranţii mai
puţin sensibili precum bromura de etidiu nu sunt adesea folosiţi pentru acest tip
de test. Benzile sau modelele de vârf diferă de cele ale conformerilor de control
ai unei secvenţe normale preparate simultan cu conformerii de testat, indicând
256
prezenţa unor mutaţii (174).
SSCP a fost raportat ca detectând 35%-100% din mutaţiile posibile.
Testul poate fi destul de sensibil detectând mutaţii în probe conţinând 15%
celule cu potenţial mutagen rezultatele sunt mai fiabileodată cu creşterea
proporţiei acestora. Această cerinţă este îndeplinită în mutaţiile moştenite unde
cel putin 50% din celulele specimenului vor fi potenţiale purtătoare de mutaţii.
Pentru mutaţiile somatice, precum analiza celulelor tumorale, celulele mutante
pot fi amestecate sau înconjurate de celule normale. In consecinţă este
recomandată o suspensie de 30% celule tumorale sau microdisecţie de ţesut
tumoral fixat sau ingheţat. Pentru microdisecţia secţiunilor de ţesut, preparatele
sunt colorate cu o mixtură 0.125% albastru de toluidină şi 0.008% albastru de
metilen şi sunt examinate la microscop (137).

10.6.1 Electroforeza în gel cu gradient de denaturare (DGGE)

DGGE exploatează diferenţele în denaturare dintre o molecula de ADN

normală şi una mutantă cauzate chiar de o singură nucleotidă diferită în
secvenţă. Atracţia dintre baze succesive din acelaşi ADN (stacking) poate afecta
denaturarea ADN-ului bicatenar (56, 57, 108). Pentru DGGE fragmentele de
ADN bicatenar în lungime de 200 - 700 bp sunt preparate prin amplificarea
PCR a secvenţelor de testat sau prin digestia cu enzime de restricţie.
Fragmentele sunt reperate în geluri de poliacrilamida ce conţin un gradient de
concentrare, de uree si formamida. O soluţie 100% denaturantă este 7M uree si
40% formamidă. Gradienţii variază între 15% - 90% denaturanţi, de obicei
concentraţia denaturantă este mare la baza gelului şi scade în partea de sus a
gelului. Gelurile de gradient pot fi preparate manual sau cu echipamente
speciale.
In timp ce fragmentele de ADN bicatenar se mişcă prin gel, cresc
condiţiile de denaturare, iar catenele complementare încep sa denatureze.
Domenii ale secvenţelor cu diferite caracteristici de topire, denaturează la
puncte diferite în gradient. Formarea zonelor monocatenare încetineşte migraţia
fragmentului prin matricea de gel, din punctul de denaturare iniţial. Chiar şi o
diferenţă de o nucleotidă între două molecule de ADN determină denaturarea
celor două molecule la poziţii diferite pe gel. Banda de ADN mutagenă, îşi
schimbă poziţia în gel în comparaţie cu banda de ADN normal. Separarea
completă a catenei este prevenită prin intercalarea naturală sau artificială a unor
secvenţe bogate în GC (GC clamps). Acestea pot fi plasate la capetele
produselor PCR prin folosirea primerilor cu coada la capatul 5’.
Două orientări de gradient sunt folosite în DGGE. Gradientul poate
creşte orizontal de-a lungul gelului sau perpendicular pe direcţia de migrare a
probei. In vechea configuraţie, o mixtură de probe este încărcată într-o singură
fantă, fiind observată o curbă sigmoidă de migrare, ce corespunde
257
caracteristicilor denaturante ale secvenţei (11, 13).
DGGE necesită un volum semnificativ de muncă preparatorie pentru a
optimiza condiţiile de detecţie a mutaţiilor particulare ale genelor. In primul
rând se realizează fragmente de restricţie şi produse PCR. Primerii sunt aleşi
astfel încat regiunea pentru examinare a mutaţiilor să aibă una sau doua
domenii de topire discrete (înafara de clemele GC), deoarece mai mult de două
domenii pot da un model complex dificil de interpretat. Domeniul GC ar tebui
poziţionat adiacent la cel mai înalt domeniu de topire. Designul primerilor şi
caracteristicile de topire ale produsului rezultat necesită inspecţia secvenţei ce
terbuie examinată pentru mutaţii. Gradientul optim şi condiţiile de rulare ale
gelului trebuie de asemenea stabilite. Iniţial, secvenţele de probă sunt separate
pe un gradient intins (20-80% formamidă) pentru a găsi zona unde migrările
secvenţei sunt mult mai distincte. Această zonă va defini un gradient mai
restrâns (30 - 55%) pentru a fi folosit. Condiţiile de rulare pe gel trebuie strict
controlate pentru rezultate reproductibile. Dacă timpul de rulare sau
temperatura nu sunt optime, decelarea secvenţelor diferite poate fi ratată (137).
Se poate realiza şi DGGE paralel folosind un gradient mai mic; probele
sunt încarcate în linii simple şi analizate prin compararea acestora. Deoarece
pentru acest test sunt folosite concentraţii mari de ADN, detectarea cu bromura
de etidiu este suficientă pentru a vizualiza rezultatele electroforezei. Regiunile
specifice cu zone mari de secvenţe pot fi vizualizate prin transferul benzilor din
gelul DGGE pe o membrană de nitroceluloză, urmat de contactul cu sonde
pentru secvenţa specifică (transferul Southern). Gelurile SSCP, DGGE sunt
analizate prin compararea benzilor specimenelor de testat, ce diferă de cele din
secvenţele de control.
DGGE a fost folosit în detectarea mutaţiilor genelor supresoare ale
tumorilor (67), clonare şi polimorfismul populaţional (108). In DGGE genomic
(138) fragmentele de restricţie ale ADN-ului genomic sunt separate pe un gel de
gradient şi apoi transportate şi cercetate prin transfer Southern. Orice zone din
genom poate fi cercetată pentru mutaţii. Două metode asemănătoare în design
cu DGGE sunt: electroforeza in gel cu gradient constant (CDGE(84) si
electroforeza in gel cu gradient cu temperatură temporizată (TTGE) (165, 174).
CDGE necesită determinarea iniţială a concentraţiilor de denaturare
optime pentru o mutaţie a unei ţinte particulare. Aceasta poate fi constatată prin
DGGE perpendicular sau prin folosirea programelor de calculator proiectate să
prezică pentru caracteristicile de topire ale unei secvenţe de nucleotide pentru o
paletă de condiţii de temperatură şi denaturare. Proba este rulată apoi la
combinaţia optimă de concentraţie de denaturare şi temperatură. Cum
parametrii trebuie setaţi în acest fel, CDGE este folosit mai degrabă în
detectarea mutaţiilor cunoscute decât screeningul mutaţiilor necunoscute.
CDGE a fost extins la electroforeza capilară cu denaturare constantă ce creşte
viteza şi rularea separării (11, 119). CDGE a fost folosit în detectarea mutaţiilor
258
responsabile de cancer. TTGE este similară cu CDGE după concentraţiile
specifice de formamidă şi uree folosite în denaturarea duplexului ADN. In
TTGE, spre deosebire de CDGE, diferenţele în denaturare sunt revelate prin
creşterea lentă a temperaturii gelului în timpul migraţiei, ex: 63 grade – 68
grade C (cu 1.7 grade C/h). Acest lucru dă o paletă mai întinsă de condiţii de
denaturare astfel încât fragmentele ce necesită compoziţii diferite de denaturare
prin CDGE să poată fi revelate pe un singur gel, ca TTGE. Această tehnică a
fost folosită în cancer (104), genetic (80) şi aplicaţii industriale .

10.6.2 Hibridarea oligomerilor specifici alelelor

Hibridarea specifică a alelelor sau ASO, se bazează pe diferenţe ale

temperaturii de topire a secvenţelor scurte de aprox. 20 baze cu una sau două
perechi necomplementare sau fără nici o complementaritate. La condiţii şi
temperaturi specifice de hibridare (stringenţă), sonda monocatenară nu se va
lega la o secvenţă ţintă apropiată, cu una sau doua baze necomplementare, pe
când o sondă perfect complementară va hibrida cu ţinta. ASO este o metodă dot
blot, asemănătoare cu transferul Southern, folosind ţinte imobilizate şi sonde
marcate, prezente în soluţie. A fost folosită pentru cercetarea mutaţiilor
cunoscute şi cu apariţie frecventă: spre exemplu mutaţiile BRCA1 şi BRCA2
frecvent observate în cancerul de sân (126) şi mutaţiile genei p16 în melanomul
familial (79).
Procedura începe cu amplificarea regiunii genei de interes prin PCR.
După ce produsul PCR este identificat şi transferat pe nitroceluloză sau
membrane de naylon, acestea sunt umezite într-o soluţie de denaturare puternic
salină, NaOH. ADN-ul de pe membrane este neutralizat cu acid diluat şi aplicat
permanent pe membrană. Sondele marcate, complementare secvenţelor mutante
sunt hibridate apoi transferate pe membrane, prin reacţii separate, sub condiţii
de stringenţă specifice. Unele protocoale recomandă adăugarea sondelor
nemarcate, dirijate de secvenţe ţinte marcate în ordinea creşterii specificităţii de
legare. Hibridarea poate dura 2 - 12 ore. După hibridare, sondele libere sunt
îndepărtate prin clătirea membranelor, iar semnalul sondei este detectat
deasupra punctelor ce conţin secvenţe complementare. Această metodă a fost
folosită în testările clinice, pentru detectarea mutaţiilor specifice şi a
polimorfismului precum şi pentru tipizarea organismelor. ASO este folosită
totodată ca metodă de rutină în laboratoarele clinice pentru tipizarea ţesuturilor.
Analiza ASO poate fi realizată ca reverse dot blot, într-o placă cu 96 de
fante, similară cu metodele dezvoltate pentru testarea bolilor infecţioase ex:
Chlamydia trachomatis (Amplicor CT/NG; Roche) şi Mycobacterium
tuberculosis (Amplicor MTB; Roche). Pentru analiza mutaţiilor, sondele mutant
sau normale sunt imobilizate în membrană. Secvenţa de testat este amplificată
prin PCR cu un primer normal şi unul biotinilat .
259
 Produsele biotinilate sunt expuse apoi sondelor imobilizate sub condiţii
setate astfel încât doar secvenţa complementară exactă să fie hibridată.
Produsele nelegate sunt spălate şi îndepărtate, iar cele care rămân fixate sunt
detectate cu un fragment FAB anti-biotin peroxidază şi expuse substratului
cromogenic. Generarea unei reacţii de culoare indică legarea unui test ADN la
proba normală sau mutantă. Această metodă a fost propusă pentru detectarea
mutaţiilor cu apariţie frecventă precum factorul V Leiden (179).

11. CLONAJUL MOLECULAR

Ingineria genetică cuprinde tehnici efectuate in vitro cu gene,

cromozomi sau celule întregi, în scopul construirii unor structuri reprogramate
genetic.
Tehnologia ADN recombinat reprezintă un ansamblu de metode prin
care se realizează in vitro, moleculele de ADN recombinate, permiţând,
clonarea unor gene de origini diferite, atât în celula procariotă cât şi în cea
eucariotă. Realizarea acestei tehnologii presupune construirea unor vectori de
clonare, izolarea unor gene de interes (ADN heterolog) şi utilizarea unui
echipament enzimatic corespunzător: endonucleaze de restricţie, ADN ligaze,
polimeraze, exonucleaze, fosfataze alcaline, revertranscriptaze,
terminaltransferaze etc.
Vectorii reprezintă molecule de ADN în interiorul cărora se introduc
fragmentele de ADN de studiat (ADN pasager, heterolog), ce poate fi de origine
pro- sau eucariotă (8, 30).
Vectorii pot fi clasificaţi în funcţie de diferite criterii:
a. după posibilitatea studierii exprimării fragmentelor de ADN
heterolog, vectorii se împart în:
- vectori de clonare – care nu au în structură secvenţe de tip
promotor şi, ca atare, permit doar clonarea unor fragmente
de ADNheterolog, dar nu şi analiza exprimării acestora, şi
- vectori de exprimare (implicit şi de clonare) care au în structură
secvenţe de tip promotor, permiţând atât clonarea, cât şi
analiza exprimarii fragmentului clonat.
b. după tehnica de clonare folosită, vectorii pot fi:
- de clonare inserţională - ADN heterolog este clonat prin inserţie
la un situs unic de restricţie din vector şi
- de clonare prin substituţie - ADN clonat înlocuieşte un fragment
din vector, în urma digestiei cu două endonucleaze de
restricţie.
c. După structura şi modul de funcţionare, vectorii se împart în:
- vectori plasmidiali (derivaţi din plasmide);
260
 - vectori virali (derivaţi din genom viral). Retrovirusurile,
adenovirusurile şi virusurile adeno-asociate au fost testate
pentru capacitate lor de a infecta anumite populaţii celulare
(30, 151, 164).
- vectori hibrizi - fagimide (cu structură hibridă, de genom de fag
filamentos şi de plasmid) şi cosmide (cu structură hibridă, de
genom de fag λ şi de plasmid).

11.1 Caracteristicile vectorilor de clonare

Obţinerea de rezultate certe în cazul folosirii vectorilor este posibilă

numai dacă aceştia au o serie de caracteristici care fac ca utilizarea lor să fie
eficientă:
- posibilitatea izolării cu uşurinţă în stare pură;
- replicarea activă în celulele gazdă, independent de ADN-ul
acestora, fără perturbarea lor şi având ca rezultat un număr cât mai
mare de copii/celulă;
- menţinerea fără modificări în celulele gazdă, indiferent de numărul
de generaţii;
- capacitatea de acceptare şi vehiculare a unei gene străine;
- ADN-ul vectorului să includă în structura sa un singur situs ţintă
pentru orice endonuclează de restricţie;
- în cazul existenţei mai multor situsuri ţintă, o parte dintre
segmentele vectorului (de exemplu ale unei plasmide) pot fi
pierdute sau rearanjate în timpul clonării. În schimb, cu cât există
mai multe endonucleaze de restricţie pentru care o plasmidă. Vector
are situs-uri unice, cu atât acel vector este mai potrivit pentru
realizarea obiectivelor utilizării sale;
- este şi mai util ca aceste situs-uri să fie localizate în genele de
elecţie, astfel încât integrarea ADN-ului de import să permită
izolarea recombinantului;
- prezenţa în structura vectorului a unui operon procariot, inclusiv o
secvenţă de mici dimensiuni dintr-o genă structurală aparţinând
acelui operon;
- prezenţa în structura vectorului a unuia sau a mai multor markeri
genetici şi deci a unor proprietăţi selectabile cu uşurinţă ca, de
exemplu, rezistenţa la unele antibiotice (în cazul plasmidelor);
- absenţa din structura vehicului a unor gene care au efecte nocive;
- dimensiunile cât mai reduse, de unde rezultă posibilitatea inserării
unei cantităţi mari de ADN, manipulării mai uşoare a
recombinanţilor şi obţinerii rapide a unui număr mare de copii în
fiecare celulă gazdă;
261
 - existenţa unei origini a replicării în structura vectorului. Aceasta
asigură multiplicarea în celula gazdă. (164)

11.2 Plasmidele

Plasmidele şi fagimidele se dezvoltă în bacterii şi sunt foarte frecvent

utilizate pentru manipularea fragmentelor de gene, indiferent de organism, ca
urmare a utilizării enzimelor de restricţie, PCR şi a clonării moleculare.
Un plasmid este o moleculă de ADN dublu catenară circulară,
extracromozomială, capabilă de a se replica, independent de cromozomul
bacterian într-o celulă şi de a fi transferată la alte celule.
Sunt molecule mici de 3-10 Kb. Plasmidele utilizate în ingineria
genetică au fost modificate. Conţin:
- regiune de replicare (regiunea principală),
- una sau mai multe gene de rezistenţă (la antibiotice, de ex. care
permit selectarea bacteriilor care au integrat acest plasmid) şi
- un situs de policlonare.
Cei mai utilizaţi sunt vectorii derivaţi din vectorul pBR322, pSC 101 ,
în care pot fi inserate fragmente relativ scurte de ADN (30) (fig. 11.1).

Fig. 11.1 Plasmidul pBR322 şi clonajul unui ADN exogen (a). Selectarea
bacteriilor care au integrat acest plasmid ce conţine gene de rezistenţă la
antibiotice (b) (30).

Situsul de policlonare este o secvenţă de ADN constituită dintr-o

262
succesiune de secvenţe recunoscute şi secţionate de diferite enzime de restricţie.
Aceste situsuri sunt unice (nu apar decât în acelaşi loc în toată secvenţa
plasmidului) şi sunt utilizate în tehnicile de clonaj.
Moleculele de ADN exogene de ordinul a 4 Kb pot fi uşor integrate în
vectori plasmidici, dar nu şi moleculele mai mari (fig.9.1b).

11.2.1 Clonajul molecular la plasmide

Constă în inserţia unui fragment de ADN exogen într-un plasmid.

Principiul metodei
Vectorii de clonaj (plasmidele) sunt decupaţi prin enzime de restricţie
recunoscute de un situs unic (în general situat în situsul de policlonare) (fig.
11.2). Vectorul după secţionare este linearizat şi posedă la fiecare extremitate o
parte din secvenţa de ADN recunoscută de enzima de restricţie.

Fig. 11.2. Clonarea în cazul folosirii

unei singure enzime de restricţie.

263
 ADN exogen organismului donator este digerat de aceeaşi enzimă de
restricţie ca şi cea utilizată pentru liniarizarea vectorului. Fragmentele obţinute
posedă la cele două extremităţi în mod egal o parte din secvenţa de ADN
recunoscută de enzima de restricţie. Atunci când plasmidul linearizat şi
fragmentele de ADN donator sunt confruntate, se realizează hibridarea
extremităţilor coezive complementare (formându-se legături de H), următoarele
fiind adăugate pe bază de complementaritate (AT, GC). Se adaugă o enzimă
care permite formarea unor legături covalente între aceste fragmente de ADN
hibridat (fig. 11.3 ). Aceasta este o ADN ligază, care realizează legături
fosfodiesterice între extremităţile coezive ale fragmentului ADN exogen şi ale
plasmidului (5P şi 3OH) devenite adiacente (125).

Fig. 11.3 Clonarea în cazul folosirii a două enzime de restricţie.

Plasmidul obţinut este din nou circular, dar este recombinant pentru că a
integrat o inserţie.
Dacă ADN plasmidic şi inserţia sunt digerate printr-o singură enzimă de

264
restricţie, inserţia poate să se integreze cu două orientări întâmplătoare, fie cu 3
fie cu 5. Va trebui determinat sensul de inserţie, prin secvenţierea plasmidului
recombinant.
În clonajul realizat după secţionarea cu o singură enzimă de restricţie se
pot produce două tipuri de legări: legarea la plasmid a moleculei de inserat sau
recircularizarea plasmidului pe el însuşi, fără inserţie. Această ultimă
posibilitate este frecventă de aceea se urmăreşte dirijarea legării inserţiei (149).
În scopul favorizării inserţiei fragmentului de ADN străin şi deci a
îmbogăţirii populaţiei cu plasmidele recombinate, recircularizarea vectorului pe
el însuşi este împiedicată prin tratamentul cu fosfataza alcalină. Grupările fosfat
prezente la extremitatea 5P din vectorul linearizat sunt eliminate. Ligaza nu
poate să catalizeze formarea de legături fosfodiesterice între două extremităţi
defosforilate ale plasmidului. Ea poate să catalizeze legătura între o extremitate
defosforilată a plasmidului şi o extremitate fosforilată a inserţiei (fig. 11.4).

Fig. 11.4 Prevenirea recircularizării vectorului pe el insuşi prin tratare cu

fosfataza alcalină.

Cazurile mai puţin favorabile se pot întâlni atunci când plasmidul şi

fragmentul de ADN străin sunt secţionate prin enzime de restricţie, generând
capete drepte. Principiul este acelaşi, dar eficacitatea legăturii este redusă.
Totuşi avantajul acestei metode este de a permite legarea oricărei extremităţi
chiar dacă ea nu posedă secvenţe complementare. Astfel se pote face clonarea
în plasmide a fragmentelor de ADN obţinute prin PCR (129).

265
 Dacă vectorul în situsul de policlonare şi ADN-ul exogen nu a fost
digerat de aceeaşi enzimă de restricţie şi nu posedă extremităţile drepte sau
compatibile, este indispensabil a se crea extremităţi drepte pentru a insera ADN
exogen. Acest lucru se realizează prin acţiunea unei ADN polimeraze care
completează lanţul, prin adăugarea nucleotidelor la extremităţile 5P a
protuberanţei. Prin activitatea 3-5 exonucleazei se realizează ajustarea
extremităţii 3 protuberante (fig. 11.5).

Fig. 11.5 Crearea extremităţilor drepte.

În unele cazuri fragmentul ADN de digerat şi plasmidul sunt digerate

fiecare prin 2 enzime de restricţie diferite. Astfel clonajul este direcţionat
deoarece integrarea inserţiei se realizează într-un singur sens.

11.3 Fagii sau bacteriofagii

ADN-ul fagic este învelit într-un strat proteic.

Fagii filamentoşi (M13, f1, fd, Pf1) au genomul format dintr-o moleculă
de ADN monocatenar, circular închis. După pătrunderea în celula bacteriană,
ADN fagic iniţiază ciclul de replicare.
Replicarea se face după modelul cercului rotativ şi are ca rezultat
formarea unui mare număr de catene ADN, notate prin convenţie - catene ″−″
(catena infectantă este notată cu ″+″). Aceste catene vor servi ca matriţa în
transcrierea genelor fagice.
M13 este un fag filamentos specific pentru Escherichia coli. Are
genom ADN monocatenar, (6.4 kb) cu omologie mare cu genomul fagilor f1 şi
fd. 90% din genom este reprezentat de gene ce codifică proteine.
În practică fagii sunt utilizaţi ca vectori pentru construirea băncilor de
ADN complementar sau genomice. Vectorii din seria mp (dintre care cei mai
folosiţi sunt M13 mp 18/19 - 7.5 kb) sunt structuraţi din:
1. gena lac I = ce codifică represorul operonului Lac
2. gena lac Z′ = lac Z defectivă, ce codifică extremitatea NH4-
266
 terminală a β-galactozidazei
3. situsul PCS = situs de policlonare
4. Gene implicate in morfogeneza virala (I-X)
Aceste secvenţe permit identificarea clonelor celulare infectate cu vector
recombinat pe baza complementarităţii intra-alelice a celor 2 gene lac Z
defective (una pe cromozom, cealaltă pe vector) şi a blocării transcrierii de la
promotorul lac prin inserţia ADN heterolog.

Strategia de clonare în vectorii M13 mp 18/19

În experimentele de clonare cu aceşti vectori, de regulă, un fragment de
ADN heterolog este clonat în ambele variante: M13 mp 18 şi M13 mp 19 (30,
129).
- Inserţia ADN heterolog în vector
Forma replicativă (RF), dublu-catenară, a vectorilor M13, mp 18 /19, se
supune digestiei cu 2 endonucleaze de restricţie (fig. 11.6). Vectorii astfel
linearizaţi nu se pot recirculariza decât cu capete compatibile cu cele ale ADN
heterolog.
- ADN heterolog se supune şi el digestiei succesive cu aceleaşi 2
enzime de restricţie;
- ADN heterolog se amestecă separat cu fiecare dintre cei 2 vectori
linearizaţi şi se adaugă o ADN-ligaza;
Rezultă 2 tipuri de vectori recombinanţi, care au ADN heterolog inserat
în orientări opuse.

Fig. 11.6 Structura vectorilor M13, mp 18 /19.

Dacă genele de cercetat din ADN exogen au fost reperate ele vor fi
267
decupate de enzimele de restricţie şi fragmentele obţinute sunt integrate într-un
vector plasmidic iar fenomenul se numeşte subclonaj.
Fagimidele sunt molecule hibride de ADN bicatenar, circulare, dintre
un plasmid şi un fag, care pot fi obţinute sub formă monocatenară în anumite
condiţii. Ele posedă două origini de replicare: una ori-Col E1 care generează
replicare de tip plasmidial (de regulă, mecanismul circular) şi una dintr-un fag
filamentos, ori-M13 sau f1) care generează replicare de tip fag filamentos,
adică monocatene. Acestea sunt ulterior folosite în experimentele de
secvenţiere ADN sau ca sonde ADN monocatenar (30, 149).
ADN clonat în fagii filamentoşi s-a dovedit a fi instabil în timp (cu cât
este mai mare fragmentul, cu atât mai instabil), suferind deleţii şi
rearanjamente. Astfel, avantajul major al fagimidelor îl reprezintă posibilitatea
păstrării ADN heterolog inclus într-un ADN circular şi, ca atare, ADN clonat
este mult mai stabil.
Pe de altă parte, pUC 118/119 pot accepta ADN heterolog mult mai
mare decât pUC 18/19. În general, promotorii de ARN polimerază au fost
introduşi în amonte sau în aval de situsul de policlonare pentru a produce
ARNm prin transcrpţie in vitro. Fragmentele de ADN de câteva Kb până la 10
Kb pot fi introduse în aceşti vectori (fig. 11.7 ).

Fig. 11.7 Structura vectorului pUC 118/119

268
 11.4 Cosmidele

Cosmidele sunt utilizate la fel ca şi plasmidele ca vectori de clonaj

îndeosebi pentru a realiza bănci. Structural, cosmidele sunt vectori hibrizi de
talie mică având caracteristicile plasmidului (originea replicării, gena de
selecţie) şi a unui bacteriofag λ (secvenţa cos necesară încapsidării ADN-ului în
particulele fagice). Fragmentele de ADN exogen introduse în cosmid între
două situsuri cos trebuie să aibă dimensiunea de 35-45 Kb (125).
Frecvent este utilizat Cosmidul pJB8.
Acest vector are 5.4 kb şi conţine următoarele secvenţe:
- ori din plasmidul Col E1, care îi permite replicarea de tip
plasmidial în celule de E.coli;
- gena de rezistenţă la ampicilină (Apr) ce reprezintă markerul de
selecţie pe mediul cu acest antibiotic;
- situsul cos (derivat din vectorul Charon 4A) care permite
împachetarea vectorului recombinat în particule fagice mature
(fig.11.8);
- regiunea de policlonare care conţine situsuri pentru 4
endonucleaze de restricţie (BamH I, EcoR I, Cla I, Hind III).
- După legarea unui cosmid în prealabil linearizat şi a unui fragment de
ADN străin, de mărime convenabilă, ADN recombinant poate fi
încapsidat şi apoi utilizat pentru a infecta bacterii (149).
- Odată pătruns în bacterie cosmidul se replică la fel ca un plasmid,
deoarece nu posedă genele fagului pentru producerea de noi particule.
Cosmidele sunt vectori utilizaţi pentru construirea băncilor de ADN
genomic. Aceste bănci sunt mai greu de construit şi de menţinut decât
cele de bacteriofagi şi sunt utilizate când gena de cercetat este foarte
mare, peste 20 Kb (fig.11.9).

269
Fig. 11.8 Structura Cosmidului pJB8. Clonaj molecular.

270
Fig. 11.9 Construirea unei bănci de cosmide (30).

271
 11.5 Cromozomul artificial de drojdie -Yac

Cercetările care vizează caracterizarea structurii genomului în întregime,

necesită utilizarea vectorilor de clonaj care să permită inserţia unor fragmente
mari de ADN. Aceasta determină manipularea unui număr restrâns de vectori
recombinaţi pentru descoperirea genomului întreg.
Yac şi BAC sunt vectori care acceptă fragmente mari de ADN.
Cuvântul Yac provine de la Yeast Artificial Cromozom sau cromozomul
artificial de drojdie. Yac-urile sunt vectori construiţi din secvenţe de ADN
cromozomial al levurilor (drojdiilor). Ei posedă o origine de replicare (ARS),
un sit centromeric (CEN) şi secvenţe telomerice (TEL), care le permit să se
comporte ca un cromozom atunci când sunt introduse sub formă liniară într-o
levură (149, 164) (fig.11.10).

Fig. 11.10. Sructura unui YAC (30).

272
 De asemenea prezintă:
- mai multe gene de selecţie, care codifică enzimele ce permit
selectarea levurilor care au încorporat un vector viabil (TRP1,
URA3);
- un sit de clonaj unic, situat pe gena SUP4, care permite introducerea
ADN-ului străin şi detectarea unui vector recombinat, care va fi
introdus în levură.
Fragmentele foarte mari de ADN exogen, de 150-1000 Kb pot fi
introduse în Yac. La ora actuală cele mai mari inserţii clonate au mărimea de
2900 Kb. Aceşti vectori sunt instrumente de preferat pentru analiza genomurilor
complexe, în particular a celui uman, dar şi pentru cartagrafierea genelor (149)
(fig.11.11).

Fig.11.11 YAC cu ADN uman inserat.

Pentru clonajul fragmentelor mari de ADN se mai folosesc Bac

(Bacterial Artificial Cromozome) sau fagul P1.
273
 Aceşti vectori sunt capabili ca şi Yac să încorporeze fragmente mari de
ADN. Ei se comportă ca şi plasmidele foarte mari, dar se manipulează ca
bacteriofagii de tip I. BAC sunt frecvent utilizate. În clonajul ADN sunt cele
mai sigure şi mai eficace în E.coli decât în levuri. Mărimea fragmentelor
integrate nu depăşeşte 300 Kb (30, 125).

Genele marker şi genele raportoare

Genele marker permit selecţia celulelor care le poartă, iar genele
raportoare codifică proteine uşor de evidenţiat în celule sau extracte celulare.
Unele gene pot fi considerate atât marker cât şi raportoare.
In general ca marker se utilizează gene care conferă rezistenţă la
antibiotice sau erbicide, dar mai recent s-au dezvoltat şi metode de selecţie
pozitivă utilizând gene bacteriene ce permit metabolizarea unui anumit
substrat (manoză sau xiloză).
Gena raportoare luc pentru enzima luciferază foloseşte un sistem
substrat-enzimă care produce bioluminiscenţă. A fost izolată de la o specie de
licurici din America de Nord, Photinus pyralis, fiind exprimată în plante.
Produsul genei, luciferaza, poate fi extras din ţesuturi iar activitatea ei
poate fi determinată în prezenţa luciferinei. Dar există şi o metodă de
determinare non-letală şi neinvazivă direct în ţesuturile şi organele plantelor
transformate, pentru măsurarea bioluminescenţei fiind necesar un
luminometru.
Gena gfp pentru proteina cu fluorescenţă verde (GFP) – reprezintă
cea mai nouă genă raportoare, spectaculoasă şi avantajoasă. A fost izolată de la
o meduză, Aequarea victoria, fiind transferată la câteva specii de plante (30,
176).
GFP prezintă o serie de avantaje şi anume:
- nu necesită un substrat,
- proteina se evidenţiază în ţesuturi intacte in vitro şi in vivo, prin
expunerea la UV;
- proteina poate fi fuzionată cu alte proteine permiţând monitorizarea
traficului proteic şi a metabolismului.

11.6 Vectori de expresie

permit evidenţierea expresiei unei gene de interes.

Unul dintre vectorii de expresie utilizati este pBluescript. Acesta are 2
origini de replicare: una din plasmidul Col E1 (de la Escherichia coli) şi
cealaltă din fagul filamentos f1 (fig.11.12).
Originea din Col E1 controleaza replicarea vectorului prin mecanismul
cercului rotativ şi permite menţinerea vectorului sub forma de moleculă de
ADN dublu catenarc circular covalent închis (CCC).
274
 Originea din fagul f1 este activată prin secventa trans de proteine
codificate de genomul unui alt fag (M13), introdus ca helper, cu genom
modificat, astfel încât acesta nu se poate replica.
Situsul PCS sau de policlonare.
Regiunea de policlonare din pBluescript conţine situsuri pentru 20 de
endonucleaze de restricţie: Sac I, Bst XI, Sac II, Not I, Eag I, Xba I, Spe I,
BamH I, Sma I, Pst I, EcoR I, EcoR V, Hind III, Cla I, Sal I, Acc I, Hinc II,
Xho I, Apa I, Dra II, Kpn I, oferind astfel un set foarte bogat de enzime pentru
clonare.
Există diverse variante de vectori pBluescript - SK, KS – funcţie de
orientarea situsurilor de restricţie (Sac I → Kpn I sau Kpn I → Sac I) (37).
Regiunea este încadrată de promotorii T3 şi T7 şi întreg acest complex
este flancat de câte un situs pentru endonuclează de restricţie BssH II (situs
extrem de rar în genomuri), cu ajutorul căreia poate fi excizat.

Transcriere în vitro
Situsul de policlonare este încadrat de promotorii T3 şi T7 care permit
desfăşurarea unui proces de transcriere în vitro. Din multitudinea de promotori
disponibili la bacterii şi bacteriofagi au fost aleşi aceşti 2 promotori din fagii
T3 şi T7, datorită faptului că ei sunt recunoscuţi foarte specific de ARN
polimerază, astfel încât se elimină riscul ca această enzimă să desfaşoare
transcriere de la alt promotor. Aceşti 2 promotori se găsesc în orientare
inversă unul faţă de celălalt şi ca atare, ADN heterolog clonat poate fi
transcris pe oricare din cele 2 catene în funcţie de orientarea pe care o are în
molecula de vector recombinat. Transcrierea în vitro permite obţinerea de
molecule ARN ce pot fi apoi folosite ca sonde moleculare în experimente de
hibridare conducând la obţinerea de proteine care pot fi ulterior analizate (146,
147).

Obţinerea de proteine de fuziune

Pentru obţinerea unei cantităţi suficiente din proteina heterologă, sub o
formă moleculară neatacabilă de către proteazele celulare se poate realiza un
proces de transcripţie şi traducere in vitro, pornind de la promotorul lac. ADN
heterolog fiind clonat în situsul de policlonare, deci, în interiorul genei LacP,
în urma traducerii se va obţine o proteină de fuziune - proteina heterologă plus
β-galactozidaza.

275
 Fig. 11.12 Vectorul de expresie pBluescript.

Sunt virusuri care infectează anumite bacterii. Molecula bicatenară şi

lineară de ADN (45 kb) a bacteriofagilor prezintă la ambele extremităţi
segmente monocatenare, adezive aşa numitele secvenţe cos, care-i permit să
se circularizeze în caz de infecţie. Secvenţele cos permit inserţia ADN-ului
fagic în cromozomul bacterian
La nivelul regiunii centrale a moleculei de ADN fagic există un
segment (10-20kb) neesenţial pentru replicare, care poate fi decupat şi
276
înlocuit cu ADN exogen, rezultând fagi recombinaţi, care pot fi introduşi în
bacterii cu scopul amplificării fragmentului de ADN exogen (146, 147).
Detectarea vectorilor recombinanţi
Se bazează pe identificarea unui marker caracteristic: rezistenţa la
antibiotice, gena ce codifică beta-galactoza, gena pentru leucină etc.

Transformarea
Este operaţiunea prin care molecula hibridă de ADN recombinat este
grefată în celula receptoare. După integrarea genei de interes, are loc
multiplicarea moleculei hibride stabil şi independent de genomul celulei gazde.

Identificarea şi selecţia genei de interes

Pentru această etapa se pot folosi două metode:
A) Tehnica hibridării coloniilor in situ se bazează pe utilizarea unei
sonde moleculare cunoscute (un fragment de acid nucleic) marcată cu un izotop
radioactiv sau cu un marker nonradioactiv.
B) O tehnică imunologică ce se bazează pe utilizarea anticorpilor
monoclonali care recunosc şi reacţionează cu produsul codificat de gena care a
făcut obiectul transferului (30).

11.7 Construcţia unei bănci de ADN genomic

Obţinerea unei bănci genomice este necesară atunci când se doreşte

caracterizarea unei secvenţe genomice particulare, stabilirea hărţii fizice a unui
genom, sau secvenţializarea la scară mare a porţiunilor sau a unui genom în
totalitate.
O bancă de ADN genomic este un ansamblu de vectori recombinanţi
conţinând fiecare un segment diferit din genomul speciei studiate. Principiul
constă în izolarea ADN genomic al speciei de interes, digerarea acestuia cu
enzimă de restricţie, care permite eliberarea fragmentelor de mărime
compatibilă cu vectorul ales, cu scopul clonării acestora în vectori de clonaj
urmează integrarea acestor vectori recombinanţi în microorganisme, în vederea
multiplicării.
Vectorii fagici sunt cel mai bine adaptaţi pentru clonarea unei secvenţe
genomice, în special atunci când vor fi alese cosmidele şi Yac-urile cu scopul
caracterizării unui genom. Banca obţinută este constituită din milioane de clone
recombinante (125, 149).
ADN-ul genomic fiind considerat identic în toate celulele aceluiaşi
individ, provenienţa tisulară a ARNm nu are importanţă. De exemplu, o bancă
genomică făcută din ADN-ul rădăcinii unei plante este identică cu cea fabricată
din ADN -ul frunzelor (fig.11.13).

277
 Fig. 11.13 Construcţia unei bănci de ADN genomic.

11.8 Construcţia unei bănci de ADN complementar

Populaţiile de ARNm acumulate într-un ţesut dat sunt reprezentative

pentru acesta. Ele sunt importante în primul rând pentru a putea caracteriza
genele exprimate într-un organ determinat (fig. 11.14).

278
 Fig. 11.14 Construcţia unei bănci de ADNc (30).

Dar manipularea ARNm este delicată (trebuie folosită o cantitate mică,

fiind foarte sensibil la nucleaze) şi de aceea este necesară transformarea
acestuia în ADN dublu catenar, uşor de manipulat şi adaptat la clonaj în vectori
bacterieni. O bancă de ADN complementar este deci reprezentată de populaţiile
de ARNm prezente într-un ţesut dat, într-un stadiu de dezvoltare al acestuia.
Spre deosebire de banca genomică, cea de ADN complementar va fi specifică
unui ţesut. Ea poate fi considerată o fotografie instantanee a populaţiilor de
ARNm reprezentate într-un organ (30, 149).
279
 Construcţia unei bănci de ADNc necesită numeroase etape.
 Principiul constă în purificarea ARNm poliadenilat al organului prin
cromatografie cu afinitate pe o coloană poliT.
 Copierea acestui ARNm în ADN monocatenar complementar, prin
acţiunea unei reverstranscriptaze.
 Eliminarea specifică a ARNm prin ARN-aza H sau folosind o
soluţie bazică.
 Sinteza catenei complementare ADN de către o ADN polimerază.
 Legarea oligonucleotidelor adaptatoare pentru crearea situsurilor de
restricţie.
 Legarea într-un vector de clonaj (plasmid sau fag).
 Integrarea vectorilor recombinaţi într-o bacterie. Vectorii de clonaj
utilizaţi pentru construirea băncii de ADNc sunt fie plasmide fie
fagi.
Sinteza catenelor de ADNc este amorsată în general prin fixarea unei
secvenţe scurte poli T pe extremitatea poliA a ARNm.
O altă metodă o constituie utilizarea ca amorsă a unui amestec de
hexanucleotide sintetice care corespund la numeroase secvenţe diferite şi
hibridate la întâmplare pe ARNm. Întrucât cum prin definiţie amorsarea sintezei
de ADNc se face pe partea internă a ARNm, ADNc obţinut nu corespunde
decât fragmentelor de ARNm (125).
Banca de ADNc poate fi utilizată pentru diagnosticul precoce al unor
boli ale organelor, genetice sau dobândite. Este posibilă detectarea ARNm
patologic, înainte ca boala să se exprime clinic.

Criblajul unei bănci

Criblajul unei bănci genomice sau de ADNc constă în selecţionarea
specifică a clonelor care conţin secvenţa genei de cercetat.
Pentru a identifica clonele care interesează, este indispensabilă o etapă
prealabilă de replicare a băncii. Coloniile bacteriene sau plajele de liză sunt
transferate pe o membrană de hibridare de nitroceluloză sau naylon (fig. 11.15).
ADN-ul lor este denaturat prin scufundare într-o baie de sodă caustică,
fixat covalent pe o membrană şi hibridat cu diferite tipuri de sonde nucleotidice
marcate radioactiv. Se detectează sondele pozitive care răspund la hibridare şi
care pun în evidenţă secvenţa de cercetat (149).

280
 Fig.11.15 Criblajul unei bănci cu ajutorul unui fragment de ADN.

Utilizarea unui fragment de ADN ca sondă

Fragmentele de ADN (ADNc, fragmente rezultate în urma PCR,
oligonucleotide) cunoscute ca posedând o omologie cu ADNc sau al genei de
cercetat pot servi ca sonde în vederea criblajului băncii (fig. 11.16).
Fragmentul de ADN sondă este marcat prin amorsaj aleatoriu sau prin translaţia
secţiunii. Membranele de hibridare consţinând vectori ai băncii sunt incubate cu
aceste sonde şi clonele pozitive (hibridaţi cu sondă) sunt reperate şi prelevate.

281
 Fig. 11.16 Utilizarea unui fragment de ADN ca sonda

Utilizarea unui oligonucelotid de sinteză ca sondă

Cunoaşterea secvenţelor de proteine pentru care se doreşte izolarea
genei face posibilă desemnarea unei secvenţe de nucleotide corespondente,
urmărind regulile codului genetic. Datorită degenerării codului genetic sunt
obţinute mai multe secvenţe nucleotidice. Un aminoacid este codificat prin mai
mulţi codoni diferiţi. Exemplu, alanina, este codificată de 4 codoni: GCU,
GCC, GCA, GCG. Amestecul de nucleotide (20 - 30 baze pentru fiecare
oligonucleotid), este sintetizat, marcat radioactiv şi hibridat cu clone fixate pe
filtru (8, 149).

Criblaj prin anticorpi

Uneori nu se cunoaşte secvenţa proteinei şi a genei de clonat. O metodă
biochimică poate duce la purificarea unui polipeptid şi obţinerea anticorpilor
specifici acestei proteine. Aceşti anticorpi pot fi utilizaţi pentru a izola ADNc,
pornind de la o bancă de ADNc corespondentă. Aceasta presupune că banca
ADNc să fie construită într-un vector de expresie. Situsul de inserţie a ADNc în
vector se găseşte în aval sau după promotorul bacterian (149).
Astfel, bacteriile din bancă conţinând aceşti vectori recombinanţi sunt
capabile de sinteza proteinelor corespunzătoare secvenţei de ADNc.
Membranele de hibridare conţinând banca de ADNc sunt incubate cu anticorpi
specifici proteinelor din care se vrea clonarea ADNc. Bacteriile care posedă
ADNc corespondent vor putea sintetiza proteina care va fi recunoscută de

282
anticorpi. Pentru aceasta trebuie ca ADNc să fie în bună stare de citire, pentru
ca aceşti codoni să fie citiţi corect (fig. 11.17).

Fig. 11.17 Criblajul unei bănci cu ajutorul

anticorpilor.

Complexele stabile antigen-anticorp sunt puse în evidenţă prin reacţii

colorimetrice cu ajutorul unor anticorpi primari, cuplaţi cu alţii secundari
specifici primilor, care au ataşată fosfataza alcalină ce degradează substratul.
Clonele care răspund de aceste hibridări sunt reperate pe plăcile Petri datorită
zonelor marcate colorimetric prin dizolvarea substratului şi sunt prelevate.
O varianta a tehnicii de mai sus este metoda ELISPOT

Principiul metodei ELISPOT

Prepararea splenocitelor de şoarece
Disecarea şi prelevarea splinei de şoarece se realizează într-un adăpost
de animale de laborator. După prelevare, splinele sunt triturate, iar suspensia
celulară obţinută este centrifugată în vederea obţinerii depozitului de splenocite.
Globulele roşii sunt lizate cu ajutorul unui tampon de liză I0Test-3.
Acţiunea tamponului de liză este diluată prin adăugarea mediului de
cultură.
Este necesară o centrifugare pentru a obţine depozitul de globule albe
care sunt rediluate cu mediu de cultură (fig. 11.18).
Celulele sunt ulterior numărate cu aparatul Nucleocounter (7).

283
 Fig. 11.18 Tehnica Elispot (7)

12. APLICAȚII PRACTICE ALE BIOLOGIEI MOLECULARE

Tenici de diagnostic bazate pe ADN/ARN: PCR

Fiecare virus, bacterie, micet sau parazit poartă secvenţe specifice de
ADN care-i determină toate caracteristicile morfologice, serologice, de afinitate
faţă de gazdă, de patogenitate şi de răspuns la tratament. În acest context
tehnicile de diagnostic bazate pe reacţia polimerazei în lanţ sunt ideale în
identificarea unor secvenţe minuscule dar unicat de ADN sau ARN,
aparţinătoare unui agent patogen specific. Amplificarea progresivă a unui
asemenea fragment genetic permite diagnosticarea fără dubiu a prezenţei
agentului patogen şi confirmă infecţia sau infestarea gazdei.
Identificarea agenților patogeni cu ajutorul PCR a revoluţionat
metodologia diagnosticului prin sensibilitate şi specificitate comparativ cu
metodele contemporane de diagnostic, inclusiv ELISA (Enzyme Linked
Immunoabsorbent Assay). Tehnica PCR a devenit indispensabilă, fiind uzuală
în toate laboratoarele moderne de diagnostic din lume.

284
 Bazate pe tehnologia ADN, tenicile de diagnostic sunt atât de sensibile
şi au atâta acurateţe încât permit diferenţierea între răspunsul imun generat de
un vaccin și cel generat de infecţia naturală. Mai mult, prin tehnici de diagnostic
ADN combinate cum ar fi hibridarea acizilor nucleici şi cartarea ADN cu
endonucleaze de restricţie se poate pune un diagnostic diferenţial între pesta
rumegătoarelor mici şi pesta bovină, boli care clinic pot fi identice, dar cu
ajutorul reagenţilor serologici existenţi nu se pot identifica diferenţele
antigenice virale.
Diagnosticul prenatal al bolilor genetice este o altă aplicaţie majoră a
PCR. Identificarea prenatală a unor mutații are importanţă atât pentru starea de
sănătate a mamei, dar mai ales a fătului, acesta putând fi purtătorul unor
afecţiuni grave. Tot prin tehnica PCR poate fi determinat cu multă precizie
sexul embrionar sau fetal.

Vaccinuri ADN
Odată cu tehnologiile ADN a apărut o nouă generaţie de vaccinuri:
vaccinurile ADN. Acestea conţin gene ale antigenilor bacterieni sau virali cu
exprimare în celulele gazdei de imunizat. Construcţia de vaccinuri bazate pe
gene imunogene permite obţinerea unui răspuns imun controlat, cu adiţionarea
de antigeni cu efect sinergic, cu sinteza de citokine imunostimulatoare cu
expresia tranzitorie sau permanentă a gelor imunogene, cu definirea precisă a
ţesutului sau celulelor în care să se exprime, cu variate modalităţi de
administrare (injectare, electroporare, administrare locală la nivelul unei
anumite mucoase, furajare etc.). În plus este posibilă diferențierea răspunsului
imun vaccinal față de cel indus de agentul patogen, ceea ce are o mare
importanță epidemiologică.

Tratmentul bolilor genetice

Descifrarea genomului a numeroase specii de animale a permis
detectarea genelor responsabile de producerea a sute de boli. Numai la câine
sunt cunoscute 430 de boli ereditare. Unele ar putea beneficia de profilaxie
(excluderea de la reproducție a părinților purtători) sau chiar terapie genică.
În combaterea unor forme de cancer sunt utilizate imunotoxinele
obţinute prin recombinare genetică. Astfel, fragmentele Fv ale anticorpilor cu
specificitate pentru celulele tumorale ţintă sunt conjugate cu variante de
exotoxine bacteriene obţinute prin inginerie genetică.
Terapia genică în cancer şi boli genetice de metabolism este în plină
evoluţie iar controlul expresiei genice începând cu managementul ADN,
controlul transcripţiei şi mergând până la suprimarea translaţiei cu ajutorul
ADNi constituie tot atâtea speranţe în vindecarea acestor categorii de boli.
Identificarea genelor deteriorate permite, pe de-o parte, detectarea precoce a
genotipurilor cu risc înalt de apariţie a unei boli, iar pe de altă parte generează
285
noi strategii şi biotehnologii terapeutice. Tratamentul bolilor produse de gene
specifice sau de genotipuri cu risc înalt de a declanşa o boală genetică şi sau
ereditară se bazează pe designul de noi medicamente realizate prin modelarea
moleculară dar aceste molecule trebuie să poată ajunge la celulele ţintă. Aşa s-a
născut biotehnologia dendrimerilor, molecule cu grupuri funcţionale ramificate
şi multiplu repetate care pot fi utilizate în sistemele de direcţionare a
micamentelor către ţesutul ţintă afectat (DDS drug delivery systems).
Încapsularea celulelor la Langerhans sau a fragmentelor de insule secretoare de
insulină într-o substanţă biocompatibilă (polietilenglicol) este deja testată pe
animale de experienţă cu diabet. Încapsularea permite glucozei şi insulinei să
traverseze nestingherite capsula protectoare, în timp ce sistemul imunitar al
gazdei nu poate percepe prezenţa celulelor alogenice imunohistocompatibile
Utilizarea tehnologiei de încapsulare a celulelor secretoare de insulină a
dat deja bune rezultate în diabetul maimuţelor, astfel că se aşteaptă primelor
încercări clinice la om. Încapsularea moleculelor (dendrimerii) sau a celulelor
utilizate în terapia reparatorie este o altă biotehnologie cu evoluţie extrem de
rapidă în ultimii ani (29).

Ingineria tisulară şi terapia cu celule stem

Secolul XXI a început sub zodia celulei stem. Pe măsură ce avansăm în
cunoaşterea şi reglajul funcţiilor celulare, ingineria tisulară şi reparatorie cu
celule stem devine tot mai mult o certitudine pentru tratamentul cancerului şi a
bolilor degenerative.
Celulele stem au un rol important în medicina regenerativă, având
capacitatea de a produce orice tip de celulă şi ţesut. Celulele stem embrionare,
hematopoetice, mezenchimale, stromale etc. se pot diferenția în alte tipuri de
celule sau țesuturi, fiind surse majore utilizabile în terapia celulară.
Înainte de utilizarea clinică populaţia celulară prelevată este
caracterizată prin identificarea markerilor specifici. Prin adaosul în mediul de
cultură a unor biomolecule speciale se poate dirija diferențierea celulelor către
un anumit țesut, în funcție de interesul terapeutic. Practic orice boală
degenerativă, accidentală sau sistematică poate beneficia de terapia bazată pe
celule stem.
Obţinerea animalelor trangenice
Animalele transgenice rezultă în urma inserării deliberate la nivelul
organismului a unor gene aparținând altor specii sau rase, diferite genetic, astfel
că organismul creat va manifesta noi proprietăți pe care le va transmite apoi la
descendenți. S-au creat, de exemplu, șoareci transgenici cu ficat umanizat
(conținând hepatocite umane), foarte utili pentru studiul patogenezei hepatitelor
virale sau porci trangenici cu ficat umanizat, acesta putând fi utilizat pentru
transplant la om.

286
 Metoda pronucleilor se referă la injectarea ADN-ului recombinat care se
dorește a fi transferat în pronucleul mascul al unui zigot proaspăt fertilizat.
Conservarea resurselor genetice
Abordarea conservării genofondului se poate face prin biotehnologii de
conservare ex situ. Pentru efectivele deja restrânse, crioconservarea materialului
seminal, a ovocitelor, a embrionilor, a unor fragmente de ADN sau nuclei
celulari, fecundarea in vitro, clonarea și transferul de embrioni constituie
mijloace tehnologice care pot fi aplicate cu succes la cele mai multe dintre
speciile domestice (29).
Real-Time PCR poate fi utilizat pentru:
Genotipare
Trisomii şi detectarea numărului de gene unice din
genom
Genotiparea microdeleţiilor
Haplotipare
Analiza cantitativă a microsateliţilor
Diagnosticul prenatal al celulelor fetale din sângele
matern
Diagnosticul cancerelor
Cuantificarea expresiei genelor
Măsurarea expunerii la radiaţii
Studiul ADN mitocondrial
Detecţia inactivării cromozomului X
Rezultate semnificative obținute în prezent:
2008: UCL Institute of Ophthalmology – ameliorarea vederii în
urma terapiei genice a unei forme ereditare de cecitate (orbire).
2007: University of Texas și M. D. Anderson Cancer Center - un
studiu pe soareci (combinatie de terapie genica + tehnici
nanotehnologice de introducere a genelor) au indus scăderea
semnificativă a volumului unor tumori pulmonare.
2006: National Cancer Institute (SUA) – a obţinut limfocite
modificate genetic care atacă celule tumorale de melanom malign.
2005 tratatamentul cu succes al surdității datorate distrugerii
celulelor cohleare, la hamsteri, prin introducerea unei gene care a
determinat regenerarea cohleei.
Alte rezultate promiţătoare – deocamdată neconfirmate prin
studii pe animale de laborator sau studii clinice: tratamentul coreei
Huntington, bolii Parkinson, talasemiei, fibrozei chistice, anumitor
forme de cancer, leucemii, sicklemie etc.
Premiul Nobel pentru Fiziologie și Medicină în 2007 a fost
acordat echipei: M. Capecchi, M. J. Evans şi O. Smithie. Ei au
descoperit cum să folosească celule stem embrionare pentru a crea
287
schimbări genetice precise şi permanente la şoareci. Şoarecii produşi în
acest fel sunt cunoscuţi ca şoareci “knockout” pentru că schimbarea
poate conduce la eliminarea (knock-out) funcţiei unei gene.
Actualmente sunt disponibile o multitudine de linii de șoareci
knockout. Peste 10.000 de diferite gene au fost modificate, fie inactivate,
fi activate (knock-on), modificându-li-se funcția sau au fost înlocuite de
alte gene (knock-in). Această tehnică a devenit atât de precisă încât este
posibilă activarea genei sau dezactivarea genei numai în anumite
țesuturi, de exemplu în celulele sangvine sau sistemul nervos, sau în
multe dintre celulele sistemului imun.
A devenit totodată posibilă stabilirea cu precizie a nivelului de
dezvoltare la care o genă ar trebui să devină activă sau inactivă. Temelia
acestui sistem ingenios constă în faptul că genei introduse îi este ataşată
o secvenţă start specială, în aşa numita zonă promotor. Această secvenţă
necesită adiţia unor substanţe specifice înainte ca gena să poată fi citită
şi ca ea să iniţieze formarea proteinei. Substanţa poate fi un antibiotic,
de exemplu, pe care şoarecii îl primesc la un moment dat.

288
 BIBLIOGRAFIE

1. Ahmed, F. E., Detection of genetically modified organisms in foods,

2002. Trends Biotechnol, 20:5, 215-223.
2. Alary, R., A. Serin, Delphine Maury, H. B. Jouira,J.-P. Sirven,
Marie-Françoise Gautier, P. Joudrier, 2002, Comparison of simplex
and duplex real-time PCR for the quantification of GMO in maize and
soybean, Food Control, 13, 235-244.
3. Alberts B, Bray D, Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D., 1989-
Molecular biology, of the cell, 2ed.Garland Publishing, New York.
4. Alberts, B., Johnson A., Lewis, Raff M., Roberts P., Walter P., 2002..
Molecular Biology of the Cell. New York: Garland Science.
5. Ambros V, Lee RC , Lavanway A, et al., 2003- MicroRNAs and other
tiny endogenous RNAs in C. elegans. Current Biology ;13:807–18.
6. Angonesi Brod, F. C., Cibele dos Santos Ferrari, Luciana Lehmkuhl
Valente, Ana Carolina Maisonnave Arisi, 2007, Nested PCR detection
of genetically modified soybean in soybean, LWT, 40, 748-751.
7. Bejanariu Ana, 2012- Evaluarea şi testarea de noi vaccinuri antigripale
bazate pe vectori lentivirali la suine şi păsări. Teză de doctorat, USAMV
Iași
8. Bogard M., Lamoril J. 2000 –Biologie Moleculaire en biologie
clinique. I. Methodes. Ed. Elsevier.
9. Bor M, Balogh K, Pusztai A, et al.,2000, Genetic screening of exon 12
of the hydroxymethyl-bilane synthase enzyme of patients with acute
intermittent porphyria. Journal of Physiology 526:111P.
10. Borresen A, Hovig E, Smith-Sorensen B, et al. 1991- Constant
denaturant gel electrophoresis as a rapid screening technique for p53
mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences; 88: 8405–
8409.
11. Borresen A-L, Hovig E, Smith-Sorensen B, et al. 1991, Mutation
analysis in human cancers using PCR and constant denaturant gel
electrophoresis (CDGE). Advances in Molecular Genetics; 4:63–71.
12. Bowen B, Steinberg J, Laemmli UK, et al. 1980- The detection of
DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research
8(1):1-20.
13. Brady S, Magro CM, Diaz-Cano SJ, et al., 1999- Analysis of clonality
of atypical cutaneous lymphoid infiltrates associated with drug therapy
by PCR/DGGE. Human Pathology 30(2):130–36.
14. Branford S, Hughes TP, Rudzki Z., 1999, Monitoring chronic
leukemia therapy by real-time quantitative PCR in blood is a reliable
alternative to bone marrow cytogenetics. British Journal of
Haematology;107:587–99.
15. Brogna S, Sato TA, Rosbash M., 2002, Ribosome components are
associated with sites of transcription. Molecular Cell 10(4):93–104.
16. Brown TA., 2002- Genomes, 2nd edition, Oxford: Wiley-Liss,
289
17. Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R, 2002- A system for stable
expression of short interferig RNAs in mammalian cells. Science 296:
550-553
18. Buchardt O, Berg RH, Nielsen PE., 1993- Peptide nucleic acids and
their potential applications in biotechnology. Trends in Biotechnology
11(9): 384-86.
19. Buckingham L., Maribeth L., 2007- Molecular diagnostics :
fundamentals, methods, and clinical applications. F.A. Davis Company,
Philadelphia
20. Burgess R, Travers AA, Dunn JJ, et al., 1969- Factor-stimulating
transcription by RNA polymerase. Nature,221:43–47.
21. Burmeister M, diSibio G, Cox DR, et al., 1991- Identification of
polymorphisms by genomic denaturing gradient gel electrophoresis:
Application to the proximal region of human chromosome 21. Nucleic
Acids Research 19(7):1475–81.
22. Burns M., P. Corbisier, G. Wiseman, H. Valdivia, P. McDonald, P.
Bowler, Katrina Ohara, H. Schimmel, D. Charels, A. Damant, N.
Harris, 2006, Comparison of plasmid and genomic DNA calibrants for
the quantification of genetically modified ingredients, Eur Food Res
Technol, 224:249-258.
23. Burns, M. J., H. Valdivia, N. Harris, 2004, Analysis and interpretation
of data from real-time PCR trace detection methods using quantitation of
GM soya as a model
24 Calderon A, Lavergne JA., 2005- RNA interference: A novel and
physiologic mechanism of gene silencing with great therapeutic
potential. Puerto Rico Health Sciences Journal 24(1):27–33
25 Campbell P.N., Smith A.D., 2004- Biochimie ilustrată. Editura
Academiei Române
26 Cankar, Katarina, D. Štebih, Tanja Dreo, Jana Žel, Kristina
Gruden, 2006, Critical points of DNA quantification by real-time PCR –
effects of DNA extraction method and sample matrix on quantification of
genetically modified organisms, BMC Biotechnology, 6, 37-52.
27 Carle G, Frank M, Olson MV., 1986- Electrophoretic separation of
large DNA molecules by periodic inversion of the electric field. Science
232: 65–68.
28 Carter MJ., Milton ID., 1993- An inexpensive and simple method for
DNA purifications on silica particles. Nucleic Acids Research
21(4):1044.
29 Ciupercescu, D.D.. Groza I., M Cernariu, Emoke Pall, Laura
Catană, Brânduşa Stegerean- Molecular genetics application in
veterinaryand animal breeding biotechnologies, Lucrări Ştiinţifice,
USAMV Bucureşti, Med. Vet. 51, 164-177, 2007.
30 Clark D. 1995 – Molecular Biology, Ed. Elsevier
31 Cook J.2004-Paraffin section interphase fluorescence in situ
hybridization in the diagnosis and classification of non-Hodgkin
lymphomas. Diagnostic Molecular Pathology 13(4):197-206.
290
32 Cooper GM., 2000- The Cell, A Molecular Approach 2nd edition.,
Sunderland (MA): Sinauer Associates,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9839/
33 Coombs N, Gough AC, Primrose JN., 1999- Optimisation of DNA and
RNA extraction from archival formalin-fixed tissue. Nucleic Acids
Research 27(16):e12.
34 Costache Marieta, Anca Dinischiotu, 2004, Biochimie Generală, vol II,
Acizi nucleici: Structură şi organizare, Ed. Ars Docendi, Bucuresti
35 Cotea C., 2008 – Biologie celulară, Embriologie generală, Histologie
generală. Ed. Tehnopress, Iasi
36 Covic, M., Ștefănescu D., Sandovici I., 2004- Genetică Medicală, Ed.
Polirom, București
37 Creighton T.E., 1999- Encyclopedia of Molecular Biology, vol. 1-4,
John Wiley & Sons, Inc., New York.
38 Dalgleish, R., 2007, The polymerase chain reaction (PCR),
39 Dalmay T, Hamilton A, Rudd S, et al., 2000- An RNAdependent RNA
polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene
silencing mediated by a transgene but not by a virus. Cell 101(5):543–53.
40 Debode F., E. Janssen, G. Berben, 2007, Physical degradation of
genomic DNA of soybean flours does not impair relative quantification
of its transgenic content, Eur Food Res Technol (2007) 226:273-280.
41 Deisingh, A. K., Neela Badrie, 2005, Detection approaches for
genetically modified
42 Deuerling E, Schulze-Specking A, Tomoyasu, T, et al., 1999- Trigger
factor and DnaK cooperate in folding of newly synthesized proteins.
Nature 400: 693–96.
43 Dickson K, Thompson SR, Gray NK, et al., 2001- Poly (A) polymerase
and the regulation of cytoplasmic polyadenylation. Journal of Biological
Chemistry 276(45): 41810–16.
44 Doring V, Mootz HD, Nangle LA, et al., 2001- Enlarging the amino
acid set of Escherichia coli by infiltration of the valine coding pathway.
Science 292: 501–504.
45 Ellison J, Dean M, Goldman D., 1993- Efficacy of fluorescence-based
PCR-SSCP for detection of point mutations. BioTechniques 15:684–91.
46 Edman CF, Raymond DK, Wu E, et al., 1997- Electric field–directed
nucleic acid hybridization on microchips. Nucleic Acids Research
25(24): 4907-14.
47 Edmonds M, Caramela MG., 1969- The isolation and characterization
of AMP-rich polynucleotide synthesized by Ehrlich ascites cells. Journal
of Biological Chemistry 244:1314–24.
48 Elbashir SM., Martinez J., Patkaniowska A., et al., 2001- Functional
anatomy of siRN for mediating efficient RNAi in Drosophila
melanogaster embryo lysate. EMBO J 20: 6877-6888
49 Eliceiri G. 1999- Small nucleolar RNAs. Cellular and Molecular Life
Sciences 56(1-2):22–31.
50 Engel, K.-H., F. Moreano, Alexandra Ehlert, U. Busch, 2006,
291
 Quantification of DNA from genetically modified organisms in
composite and processed foods, Trends in Food Science & Technology
17, 490-497.
51 Falcă G, C. M Mircean, T Mot, C M Braslasu, G Giurgiu, C
Vlagioiu, C Pop, I Papuc, G. Solcan, V Vulpe, 2011, Medicina interna
a animalelor, vol. 1-2, Ed. Eurostampa, Timișoara
52 Ferguson-Smith M.A., Andrews T., 1996- Cytogenetics analysis - in
"Emery and Rimoin Principles and practice of Medical Genetics" 3rd
Edn, ed. D.L Rimoin, J.M. Connor, R. E. Pyeritz, Churchil Livingstone,
New York.
53 Fields S., 2001- Proteomics: Proteomics in genome land. Science
291(5507):1221-24.
54 Fire A, Xu S, Montgomery MK, et al., 1998- Potent and specific
genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.
Nature 391 (6669):806–11.
55 Fischer S, Lerman LS., 1983- DNA fragments differing by single base-
pair substitutions are separated in denaturing gradient gels:
Correspondence with melting theory. Proceedings of the National
Academy of Sciences 80(6):1579–83.
56 Fisher S, Lerman LS., 1979- Length-independent separation of DNA
restriction fragments in two-dimensional gel electrophoresis. Cell
16:191–200.
57 Fodde RLM., 1994- Mutation detection by denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE). Human Mutation, 3(2):83–94.
58 Foti, Nicoletta, Roberta Onori, Erica Donnarumma, Barbara De
Santis, Marina Miraglia, 2006, Real-time PCR multiplex method for
the quantification of Roundup Ready soybean in raw material and
processed food, Eur Food ResTechnol, 222, 209-216.
59 Freeman W, Robertson DJ, Vrana KE., 2000, Fundamentals of DNA
hybridization arrays for gene expression analysis.
BioTechniques;29(5):1042-55.
60 Frolova L, Merkulova TI, Kisselev LL., 2000- Translation termination
in eukaryotes: Polypeptide release factor eRF1 is composed of
functionally and structurally distinct domains. RNA 6(3):381–90.
61 Gardiner K., 1995- Human genome organization.
Curr.Opin.Genet.Develop. 5:445-476
62 Gavrilă L., 2003- Genomica. Vol.I, II. Ed. Enciclopedică, Bucureşti.
63 Gellrich S, Ventura R, Jones M, et al., 2004- Immunofluorescent and
FISH analysis of skin biopsies.American Journal of Dermatopathology
26 (3):242-47.
64 Gemmill R., 1991- Pulsed field gel electrophoresis. In Chrambach A,
Dunn MJ, Radola, BJ, eds. Advances of Electrophoresis, vol. 4
Weinheim, Germany: VCH, 1–48.
65 Germini, A., A. Zanetti, Claudia Salati, S. Rossi, Christel Forreä, S.
Schmid, Rosangela Marchelli, 2004, Development of a seven-target
multiplex PCR for the simultaneous detection of transgenic soybean and
292
 maize in feeds and foods, J. Agric. Food Chem., 52, 3275-3280
66 Gunasekera N, Lee SW , Kim S , et al., 2004- Nuclear localization of
aminoacyl-tRNA synthetases using single-cell capillary electrophoresis
laser-induced fluorescence analysis. Analytical Chemistry; 76(16):4741–
46.
67 Hayes V, Bleeker W, Verind E, et al. Comprehensive TP53-denaturing
gradient gel electrophoresis mutation detection assay also applicable to
archival paraffin embedded tissue. Diagnostic Molecular
Pathology;8(1):2–10.
68 Haugland, R. P., 2002, The handbook of fluorescent probes and
research products,
69 Hayashi K., 1991, A simple and sensitive method for detection of
mutations in the genomic DNA. PCR Methods and Applications
1991;1:34–38.
70 Heng HHQ, Spyropoulos B, Moens PB., 1997- FISH technology in
chromosome and genom research –BioEssays, 19,75-84
71 Hernández, Marta, D. Rodríguez-Lázaro, Teresa Esteve, Salomé
Prat, Maria Pla, 2003, Development of melting temperature-based
SYBR Green I polymerase chain reaction methods for multiplex
genetically modified organism detection, Analytical Biochemistry, 323,
164-170.
72 Hernández, Marta, Marie-Noëlle Duplan, G. Berthier, M.
Vaïtilingom, W. Hauser,Regina Freyer, Maria Pla, Y. Bertheau,
2004b, Development and comparison of four real-time polymerase chain
reaction systems for specific detection and quantification of Zea mays L.,
J. Agric. Food Chem., 52, 4632-4637.
73 Hernández, Marta, Teresa Esteve, Salomé Prat, Maria Pla, 2004a,
Development of real-time PCR systems based on SYBR Green I,
Amplifluor and TaqMan technologies for specific quantitative detection
of the transgenic maize event GA21, Journal of Cereal Science, 39, 99-
107.
74 Horn P.J., Peterson L.C., 2002- Chromatin higher order folding
wrapping up transcription. Science; 297:1824-1827.
75 Horwich A. 2004- Sight at the end of the tunnel. Nature, 431:520–22.
Proteins Chapter 3 63
76 Housset C., Raisonnier A., 2006-Biologie moleculaire, CHU-ps, Paris.
77 Huang Q, Schantz SP, Pulivarthi HR, et al., 2000- Improving
degenerate oligonucleotide primed PCR comparative genomic
hybridization for analysis of DNA copy number changes in tumors.
Genes, Chromosomes and Cancer 28:395-403.
78 Huang, C.-C., T.-M. Pan, 2005, Event-specific real-time detection and
quantification of genetically modified Roundup Ready soybean, J. Agric.
Food Chem., 53, 3833-3839.
79 Hussussian C, Struewing JP, Goldstein AM, et al., 1994- Germline
p16 mutations in familial melanoma. Nature Genetics,8:15–21.
80 Iborra FJ, Jackson DA, Cook PR., 2001- Coupled transcription and
293
 translation within nuclei of mammalian cells. Science, 293:1139–42.
81 John S, Erming T, Jeffrey S, et al. 2000- High incidence of
chromosome 13 deletion in multiple myeloma detected by multiprobe
interphase FISH. Blood 96(4):1505-11.
82 Juliusson G, Oscier DG, Fitchett M., 1990- Prognostic subgroups in B-
cell chronic lymphocytic leukemia defined by specific chromosomal
abnormalities. New England Journal of Medicine 323: 720-24.
83 Kakazu N, Abe T., 1998- Cytogenetic analysis of chromosome
abnormalities in human cancer using SKY. Experimental Medicine
16:1638-41.
84 Khrapko K, Hanekamp JS, Thilly WG, et al., 1994- Constant
denaturant capillary electrophoresis (CDCE): A high resolution approach
to mutational analysis. Nucleic Acids Research 22:364–69.
85 Knight S.J.L., Flint J., 2000- Perfect endings: a review of subtelomeric
probes and their use in clinical diagnosis. J.Med.Genet. 37:401-409.
86 Koshkin AA, Nielson P, Rajwanshi VK, et al., 1998- Synthesis of the
adenine, cytosine, guanine, 5-methlycysteine, thymine and uracil
bicyclonucleoside monomers, oligomerisation, and unprecedented
nucleic acid recognition. Tetrahedron, 54: 3607-30.
87 Kubista, M., J. M. Andrade, M. Bengtsson, A. Forootan, J. Jonák, K.
Lind, R.Sindelka, R. Sjöback, B. Sjögreen, L. Strömbom, A.
Ståhlberg, N. Zoric, 2006,The real-time polymerase chain reaction,
Molecular Aspects of Medicine, 27, 95-125.
88 Kuperwasser N, Brogna S, Dower K, et al., 2004- Nonsense-mediated
decay does not occur within the yeast nucleus. RNA 10(2):1907–15.
89 Kuwabara T, Hsieh J, Nakashima K, et al., 2004- A small modulatory
dsRNA specifies the fate of adult neural stem cells. Cell 116:779–93.
90 Lapierre J, Cacheux V, Da Silva F, et al., 1998- Comparative genomic
hybridization: Technical development and cytogenetic aspects for routine
use in clinical laboratories. Ann Genet 41(1):56-62
91 Lamond A, Earnshaw WC., 1998- Structure and function in the
nucleus. Science 280:547–53.
92 Lau NC, Lim LP, Weinstein, EG, et al., 2001- An abundant class of
tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans.
Science 294: 858–62.
93 Lee RC, Ambros V., 2001- An extensive class of small RNAs in
Caenorhabditis elegans. Science 294:862–64.
94 Lee LG, Connell CR, Bloch W. 1993- Allelic discrimination by nick-
translation PCR with fluorogenic probes. Nucleic Acids Research
21:3761–66.
95 Lewis E, Haaland WC, Nguyen F, et al., 2005- Colorblind fluorescence
detection for four-color DNA sequencing. Proceedings of the National
Academy of Sciences 102(15):5346–51. 224 Section 2 Common
Techniques in Molecular Biology
96 Lehninger A.L. , 1992- Biochimie- Editura Tehnică, București.
97 Lipschultz RJ, Fodor TR, Gingeras DJ, et al., 1999- Highdensity
294
 synthetic oligonucleotide arrays. Nature Genetics 21:20-24.
98 Lin, H.-Y., H.-A. Wei, F.-P. Lin, D. Y.-C. Shih, 2006, Study of PCR
detection methods for genetically modified soybeans with reference
molecules, Journal of Food and Drug Analysis, 14, 194-202.
99 Loadish, Berk Kaiser, Krieger, Bretscher, Ploegh, Maloudasa, 2008-
Molecular Cell Biology W.H. Freeman and Company
100 Lyon MF., 1999- X-chromosome inactivation - Curr. Biol., 9, R235-
R237
101 Macville M, Veldman T, Padilla-Nash H, et al., 1997- Spectral
karyotyping, a 24-colour FISH technique for the identification of
chromosomal rearrangements. Histochemical Cell Biology 108 (4-
5):299-305.
102 Maillet M.M., 1996 – Biologie cellulaire, Ed. Dumond, Paris
103 Manuelidis L., 1990- A view of interphase chromosomes - Science, 250,
1533-1540.
104 Mehra S, Messner H, Minden M, et al., 2002- Molecular cytogenetic
characterization of non-Hodgkin lymphoma cell lines. Genes
Chromosomes and Cancer 33(3):225-34.
105 Meyer, R., 1999, Development and application of DNA analytical
methods for the detection of GMOs in food, Food Control, 10, 391-399.
106 Moldoveanu Elena, Monica Neagu, 2001- Dicţionar de biochimie şi
biologie molecular. Ed.Medicală, Bucureşti
107 Miller S, Taillon-Miller P, Kwok P., 1999- Cost-effective staining of
DNA with SyBr green in preparative 92 Section 2 Common Techniques
in Molecular Biology agarose gel electrophoresis. BioTechniques
27(1):34–36.
108 Miller K, Ming TJ, Schulze AD, et al., 1999- Denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE): A rapid and sensitive technique to screen
nucleotide sequence variation in populations. BioTechniques 27: 1016–
30.
109 Miller O.J., 1996- Chromosomal Basis of Inheritance - in "Emery and
Rimoin Principles and practice of Medical Genetics" 3rd Edn, ed. D.L
Rimoin, J.M. Connor, R. E. Pyeritz., Churchil Livingstone, New York,
p.235-252.
110 Mittelman F (ed), 1995- An International System for Human
Cytogenetic Nomenclature (ISCN)- Karger, Basel
111 Moens, W., M. Deloose, J. Remarcle, A. Callebaut, G. Berben, 2005,
Tracing and authentication of GMOs and derived products in the food-
processing area: final report, Belgian Science Policy, Brussels: Federal
Science Policy, disponibil online la
http://www.belspo.be/belspo/home/publ/pub_ostc/CPagr/rappCP32_en.p
df, pagină consultată în octombrie 2009.
112 Műlhardt C. and E.W Beese M.D., 2007- Molecular Biology and
Genomics. Ed. Elsevier
113 Murthy S, Kamine J, Desrosiers RC., 1986- Viral-encoded small
RNAs in herpes virus saimiri–induced tumors. EMBO Journal
295
 5(7):1625-32.
114 Ogle JM, Brodersen DE, Clemons WM Jr, et al., 2001- Recognition of
cognate transfer RNA by the 30S ribosomal subunit. Science 292:897–
902.
115 Oostlander A, Meijer GA, Ylstra B., 2004- Microarraybased
comparative genomic hybridization and its applications in human
genetics. Clinical Genetics 66(6):488-95.
116 Pauling L, Corey RB., 1951- The structure of proteins; two hydrogen-
bonded helical configurations of the polypeptide chain. Proceedings of
the National Academy of Sciences 205(4):205–11.
117 Paushkin S, Patel M, Furia BS, et al., 2004- Identification of a human
endonuclease complex reveals a link between tRNA splicing and pre-
mRNA 3_-end formation. Cell 117:311–21.
118 Peltonen L., McKusick V.A., 2001- Dissecting human disease in the
postgenomic era. Science ; 291:1224-1229
119 Pfeffer ZM, Grasser FA, Chien M, et al., 2004- Identification of virus-
encoded microRNAs. Science 304:734–36.
120 Querci, Maddalena, F. Weighardt, Nicoletta Foti, Claudia Paoletti,
M. Mazzara, 2005, Detecting GMOs, European Communities, Office
for the Official Publications of the European Communities, Luxemburg.
121 Querci, Maddalena, M. Mazzara, 2004b, Characteristics of the
qualitative PCR systems described in the manual În: Querci, Maddalena,
M. Jeremi, G. Van den Eede, Training course on the analysis of food
samples for the presence of genetically modified organisms, Office for
the Official Publications of the European Communities, Luxemburg,
disponibil on-line la
122 Rabilloud T., 1992- A comparison between low background silver
diamine and silver nitrate protein stains. Electrophoresis 13(6):429–39.
123 Merrill C., 1990- Gel-staining techniques. Methods in Enzymology
182:477–88.
124 Metzker ML, Lu J, Gibbs RA., 1996- Electrophoretically uniform
fluorescent dyes for automated DNA sequencing. Science 271:1420–22.
125 Ream W., Katharine G. Field, 1999– Molecular Biology Techniques
Ed. Elsevier
126 Roa B, Boyd AA, Volcik K, et al., 1996- Ashkenazi Jewish population
frequencies for common mutations in 196 Section 2 Common
Techniques in Molecular Biology BRCA1 and BRCA2. Nature Genetics
14: 185–87.
127 Rosenthal N., 1995- DNA and the genetic code - N.Engl.J.Med.;
331:39-41
128 Richter A, Schwager C, Hentz S, et al., 2002- Comparison of
fluorescent tag DNA labeling methods used for expression analysis by
DNA microarrays. Bio-Techniques 33(3):620-30.
129 Robert W. S. , 2002- Advanced Molecular Genetics Course, UCLA
130 Rott, M. E., Tracy S. Lawrence, Erika M. Wall, Margaret J. Green,
2004, Detection and quantification of Roundup Ready soy in foods by
296
 conventional and real-time polymerase chain reaction, J. Agric. Food
Chem., 52, 5223-5232.
131 Ruusala T, Ehrenberg M, Kurland CG., 1982- Is there proofreading
during polypeptide synthesis? EMBO Journal 1(6):741–45.
132 Singer V, Lawlor TE, Yue S., 1999- Comparison of SyBr green I
nucleic acid gel stain mutagenicity and ethidium bromide mutagenicity
in the salmonella/mammalian microsome reverse mutation assay (Ames
test). Mutation Research 439(1):37–47.
133 Smith L, Sanders JZ, Kaiser RJ, et al., 1986- Fluorescence detection in
automated DNA sequence analysis. Nature 32(6071):674–79.
134 Somma, M., Maddalena Querci, 2004b, The polymerase chain reaction
(PCR) In:Querci, Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede, 2004,
Training course on the analysis of food samples for the presence of
genetically modified organisms,Office for the Official Publications of the
European Communities, Luxemburg, disponibil on-line la
http://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/
135 Sommer P, Nehrbass U., 2005- Quality control of messenger
ribonucleoprotein particles in the nucleus and at the pore. Current
Opinions in Cell Biology 17(3):294–301.
136 Snustad, Peter and Simmons, Michael 2003,. Principles of Genetics.
John Wiley & Sons, Inc,.
137 Sosnowski RG, Tu E, Butler WF, et al., 1997- Rapid determination of
single base mismatch mutations in DNA hybrids by direct electric field
control. Proceedings of the National Academy of Sciences 94:1119-23.
138 Southern E, Anand R, Brown WRA, et al.,1987- A model for the
separation of large DNA molecules by crossed field gel electrophoresis.
Nucleic Acids Research 15, 5925–43.
139 Speicher M.R., Ward D.C., 1996- The coloring of cytogenetics. Nature
med.; 2:1046-1049
140 Steitz T, Moore PB., 2003- RNA, the first macromolecular catalyst: The
ribosome is a ribozyme. Trends in Biochemical Sciences 28(8):411–18.
141 Strachan T, Read AP.,1999- Human Molecular Genetics. 2nd edition.,
Wiley-Liss, New York
142 Struewing J, Hartge P, Wacholder S, et al., 1997- The risk of cancer
associated with the 185delAG and 5382insC mutations of BRCA1 and
the 6174delT mutation of BRCA2 among Ashkenazi Jews. New England
Journal of Medicine 336(20): 1401–1408.
143 Sum E, Segara D, Duscio B, et al., 2005- Overexpression of LMO4
induces mammary hyperplasia, promotes cell invasion, and is a predictor
of poor outcome in breast cancer. Proceedings of the National Academy
of Sciences.
144 Sunohara T, Jojima K, Yamamoto Y, et al., 2004- Nascentpeptide-
mediated ribosome stalling at a stop codon induces mRNA cleavage
resulting in nonstop mRNA that is recognized by tmRNA. RNA
10(3):378–86.
145 Sutherland G.R., Baker E., Richards R.I., 1998- Fragil sites still
297
 breaking. TIG; 14:501-505
146 Tabor S, Richardson CC.,1989, Selective inactivation of the
exonuclease activity of bacteriophage T7 DNA polymerase by in vitro
mutagenesis. Journal of Biological Chemistry 264(11):6447–58.
147 Tabor S, Richardson CC., 1989- Effect of manganese ions on the
incorporation of dideoxynucleotides by bacteriophage T7 DNA
polymerase and E. coli DNA polymerase I. Proceedings of the National
Academy of Sciences 86: 4076–80.
148 Tabor S, Richardson CC., 1990- Sequence analysis with a modified
bacteriophage T7 DNA polymerase: Effect of pyrophorolysis and metal
ions. Journal of Biological Chemistry 265:8322–28.
149 Tagu D., 1999- Principes des techniquesde biologie moleculaire.INRA,
Paris.
150 Tani, H., N. Noda, K. Yamada, S. Kurata, S. Tsuneda, A. Hirata, T.
Kanagawa, 2005, Quantificationog genetically modified soybean by
quenching probe polymerase chain reaction, J. Agric. Food Chem., 53,
2535-2540.
151 Tasuku H., Frederick W., Neuberger M.S., 2007- Molecular Biology
of B Cells. Ed. Elsevier
152 Taverniers, Isabel, P. Windels, M. Vaïtilingom, Anne Milcamps, E.
Van Bockstaele, G. Van Den Eede, M. De Loose, 2005, Event-specific
plasmid standards and real-rime PCR methods for transgenic Bt11,
Bt176, and GA21 maize and transgenic GT73 canola, J. Agric. Food
Chem., 53, 3041-3052.
153 Taverniers, Isabel, E. Van Bockstaele, M. De Loose, 2001, Use of
cloned DNA fragments as reference materials for event specific
quantification of genetically modified organisms (GMOs), Meded
Rijksuniv Gent Fak Landbouwkd Toegep Biol Wet., 66:3b, 469-472.
154 Taverniers, Isabel, P. Windels, M. Vaïtilingom, Anne Milcamps, E.
Van Bockstaele, G. Van Den Eede, M. De Loose, 2005, Event-specific
plasmid standards and real-rime PCR methods for transgenic Bt11,
Bt176, and GA21 maize and transgenic GT73 canola, J. Agric. Food
Chem., 53, 3041-3052.
155 Taverniers, Isabel, E. Van Bockstaele, M. De Loose, 2001, Use of
cloned DNA fragments as reference materials for event specific
quantification of genetically modified organisms (GMOs), Meded
Rijksuniv Gent Fak Landbouwkd Toegep Biol Wet., 66:3b, 469-472.
156 Tollervey D., 2004- Termination by torpedo. Nature 432:456–57.
157 Tominaga T., 2004- Rapid identification of pickle yeasts by fluorescent
PCR and microtemperature-gradient gel electrophoresi. FEMS Microbiol
Letters 238 (1):43–48.
158 Travers A, Burgess RR., 1969- Cyclic reuse of the RNA polymerase
sigma factor. Nature 222: 537–40.
159 Tuschl T, Weber K., 2001- Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate
RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411(6836): 494–
98.
298
160 Tyler-Smith C., Willard HF., 1993- Mammalian chromosome structure
- Curr. Opin. Gene Dev., 3, 390-397.
161 Van Stedum S, King W., 2002- Basic FISH techniques and
troubleshooting. Methods in Molecular Biology 204:51-63.
162 Vaïtilingom, M., H. Pijnenburg, F. Gendre, P. Brignon, 1999, Real-
time quantitative PCR detection of genetically modified Maximizer
maize and Roundup Ready soybean in some representative foods, J.
Agric. Food Chem., 47, 5261-5266.
163 Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W. et al., 2001- The sequence of
the human genome. Science; 291: 1304-1351
164 Vior C., 2000 – Biotehnologii medicale, Ed. Fundaţiei ”România de
mâine”, Bucureşti.
165 Yoshino K, Nishigaki K, Husimi Y., 1991- Temperature sweep gel
electrophoresis: A simple method to detect point mutations. Nucleic
Acids Research;19:3153.
166 Yusupov M, Yusupova GZ, Baucom A, et al., 2001- Crystal structure
of the ribosome at 5.5A resolution. Science 292:883–96.
167 Walsh P, Metzger DA, Higuchi R., 1991- Chelex 100 as a medium for
simple extraction of DNA for PCRbased typing from forensic material.
BioTechniques; 10(4):506–13.
168 Wang L, Brock A, Herberich B et al., 2001- Expanding thegenetic
code of Escherichia coli. Science; 292: 498–500.
169 Wang G, Maher E, Brennan C, et al., 2004- DNA amplification
method tolerant to sample degradation. Genome Research;14(11):2357-
66.
170 Weinberg RA, Penman S., 1970- Processing of 45S nucleolar RNA.
Journal of Molecular Biology;47: 169–78.
171 Weighardt, F., 2004, Quantitative PCR for the detection of GMOs In:
Querci, Maddalena, M. Jeremi, G. Van den Eede, 2004, Training course
on the analysis of food samples for the presence of genetically modified
organisms, Office for the Official Publications of the European
Communities, Luxemburg, disponibil on-line
lahttp://mbg.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20EN
172 Wickens M, Gonzalez TN., 2004- Knives, accomplices and RNA.
Science; 306:1299–300.
173 Wienberg J, Stanyon R., 1997- Comparative painting of mammalian
chromosomes. Current Opinion in Genetics and Development;7(6):784-
91.
174 Wiese U, Wulfert M, Prusiner S, et al., 1995- Scanning for mutations
in the human prion protein open reading frame by temporal temperature
gradient gel electrophoresis. Electrophoresis;16:1851–60.
175 Wittwer C, Gudrun HR, Gundry CN, et al., 2003- Highresolution
genotyping by amplicon melting analysis using LC Green. Clinical
Chemistry;49(6): 853–60.
176 Zamecnik PC., 1969- An historical account of protein synthesis with
current overtone: A personalized view. Cold Spring Harbor Symposium
299
 on Quantitative Biology;34:1–16. Wolffe A., 1997- Mithocondrial
disease in man and mouse. Science; 283:1482-1488
177 Žel, Jana, Katarina Cankar, Maja Ravnikar, Marjana Camloh,
Kristina Gruden, 2006, Accreditation of GMO detection laboratories:
improving the reliability of GMO detection, Accred Qula Assur, 10, 531-
536.
178 Zhouravleva G, Frolova L, Le Goff X, et al., 1995 Termination of
translation in eukaryotes is governed bytwo interacting polypeptide chain
release factors, eRF1 and eRF3. EMBO Journal;14(16): 4065–72.
179 Ørum H, Jakobsen MH, Koch T, et al., 1999- Detection of the factor V
Leiden mutation by direct allelespecific hybridization of PCR amplicons
to photoimmobilized locked nucleic acids. Clinical Chemistry;45:1898–
1905.
180 ***International Human Genom Sequencing Consortium, 2001- Initial
sequencing and analysis of the human genome. Nature; 411:860-
920
181 http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/ CRL-GMFF, 2007
182 http://www.geneticstesting.com/ Center for Medical Genetics 2007
183 http://www.biofiredx.com/ Idaho Technology, 2009
184 http://en.wikipedia.org/wiki/Institute_for_Reference_Materials_and_Mea
surements IRMM, 2008a
185 http://www.iso.org/iso/catalogue_detail.htm ISO 17511, In vitro
diagnostic medical devices -- Measurement of quantities in
biological samples -- Metrological traceability of values assigned
to calibrators and control materials
186 http://www.biokurs.de/
187 http://www.webstatsdomain.com/domains/josephgroup.ucsd.edu/
(josephgroup.ucsd.edu translatia cu factoriide elongare)
dedunn.edublogs.org (imag selectata ptr pag 8)
188 https://confluence.crbs.ucsd.edu/display/CRBS/Home 10976.jpg;
nucleol)
189 http://medcell.med.yale.edu/yale_medical_cell_biology.php Quiz1.jpg;
(Imag cel la me cu nucleol)
190 http://www.bioinformatics.org/sms2/split_codons.html Dna-split-
152x300.png; (ADN cu furca)
191 www.appliedbiosystems.com
192 http://www.qiagen.com/corbett/welcome.aspx
193 www.molecularstation.com/
194 http://www - Dicţionar de biologie
celulară:
195 http://www.ebi.ac.ku- European Bioinformatics Institute (EBI)
196 http://www.biotech.chem.indiana.edu Indiana University Biotechnology
197 http://gdbwww.gdh.org/ Genome Data Base
198 http://www.genethon.fr Genethon (France)
199 http://www.ncgr.org National Center for Genomic Resources
200 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ National Center for Biotechnology
300
 information (NCBI)
201 http://www.nhgri.nih.gov National Human Genome Research Institute
202 http://www.nature.com/genomics/huamn Nature –Genome gateway
203 http://www.ftp.tigr.org Institute for genomic research
204 http://www.kumc.edu/gec/geneinfo.html
205 http://www.mpimg-berlin-dahlem.mpg.de/~cytogen/
206 http://drglas.wordpress.com/2009/06/29/pfge-intro/
207 http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:3t-
YX6zl4NoJ:www.biostudio.com/d_%2520RFLP%2520Analysis.h
tm+rflp2+animation&cd=1&hl=ro&ct=clnk&gl=ro
208 http://www.ruclip.com/video/9rPDa2ACtog/snps-single-nucleotide-
polymorphisms.html
209 http://ro.wikipedia.org/wiki/Acid_ribonucleic
210 http://www.bing.com/images/search?q=genomic+mutation
211 http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/images/ics_organized/brands
/Dynal.Par.54743.Image.275.688.1.gif
212 U.S National Library of Medicine, Gene Mutations | LaraSig342 x 252 ·
65 kB · jpegwww.larasig.com
213 http://www.imgt.org/IMGTeducation/IMGTlexique/M/mutation.png
214 http://bio1100.nicerweb.com/Locked/media/ch11/base_substitution.html
215 http://www.bing.com/images/search?q=stain+Bromide++Ethidiu+++inte
rcalat+in++ADN
216 http://www.sunbio.com.cn/bestsun/Editor/Example/NewsSystem/NewsFi
le/2009612122950561.jpg
217 http://www.scribd.com/doc/47361445/sinteza-proteinelor-0
218 http://www.NGHGR
219 http://www. SREN ISO 24276: 2006
220 http://www. Promega
221 http://www.Roche
222 http://www.Regulament 641/2004
223 http://www.ISO 17511
224 http://www.Idaho
225 http://www.bing.com/images/search?q=genomic+mutation
226 .(http://www.cambio.co.uk/library/images/html_images/masterpure_com
plete_graph.gif).
227 http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/images/ics_organized/brands
/Dynal.Par.54743.Image.275.688.1.gif
228 http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/a6/Gel_electro
phoresis_apparatus.JPG/160px-Gel_electrophoresis_apparatus.JPG
229 http://www.bing.com/images/search?q=electrophoresis
230 http://www.bing.com/images/search?q=protocol+electroforesis
231 http://www.nature.com/nprot/journal/v2/n3/images/nprot.2007.94-F1.jpg
232 http://content.answcdn.com/main/content/img/McGrawHill/Encyclopedi
a/images/CE226400FG0010.gif
233 http://www.scientific-
234 web.com/en/Biology/Molecular/images/NorthernBlot.jpg
301
235 http://www.takween.com/techniques/blotting-anticorps.gif
236 http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:MRNA_structure.png
237 www.quia.com.; labs.fhcrc.org.
238 jpegwww.biochemistry.ucla.edu
239 www Web.SiteSyllabus Molecular Biology
240 www. tbi.univie.ac.at- RNA secondary prediction
241 www.genetics. Wustl.edu/eddy/RNAscan-SE
242 http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem
243 www.cellbio.com/Cell and Molecular Biology on line
244 http://bio1100.nicerweb.com/Locked/media/ch11/base_substitution.htmlf
aculty.southwest.tn.edu
245 jpegwww.larasig.com
246 gifwww.newworldencyclopedia.org
247 www.6mgel.com
248 www.scribd.com/doc/25904935/Genetica-Microorganismelor
249 249. (http://ro.wikipedia.org/wiki/Nucleotid%C4%83

302
 Consilier editorial: Vasile VÎNTU
Tehnoredactori: Răzvan Nicolae MĂLĂNCUȘ
Gheorghe SOLCAN
Corector: Gheorghe SOLCAN

Bun de tipar: 10.09.2012

Apărut: 2012, 70x100/16
Editura: “Ion Ionescu de la Brad” Iași
Aleea M. Sadoveanu nr. 3
Tel.: 0232-218300; 0232 407471
E-mail: editura@uaiasi.ro

ISBN 978-973-147-115-0

PRINTED IN ROMANIA

303