Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
saa
Detectarea și cuantificarea speciilor de
carne prin qPCR (in timp real) în
sdawfaesalimente prelucrateaawddaw
termic care conțin AwdaDN
fragmentat
Detectarea și cuantificarea speciilor de carne prin qPCR (in timp real) în alimente
prelucrate termic care conțin ADN fragmentat
INTRODUCERE
Controlul calităţii produselor alimentare de origine animală abordează aspecte legate de
calitatea cărnii/produselor din carne din punct de vedere al consumatorului, al societăţii şi
îmbunătăţirea calităţii şi siguranţei alimentelor.
Mai sigure (ADN prezintă stabilitate la temperaturi ridicate, presiune şi tratament chimic)
Printre cele mai consumate produse alimentare, in intreaga lume, sunt cele compuse din
combinatii de carne de porc si vita. Pentru a eticheta conform un produs alimentar si a se elimina
frauda cu carne, sunt necesare metode analitice precise si robuste in laboratoarele de control.
Până în acest moment, atât metodele PCR în timp real, cât și metodele de imunodetecție
bazate pe proteine s-au dovedit a fi cele mai bune pentru detectarea de rutină și cuantificarea
speciilor de carne din produsele alimentare.
Totusi, pentru detectarea proteinelor animale se utilizeaza frecvent ELISA, care
reprezinta o metoda rapida si ieftina pentru detectarea acestora. De asemenea, ELISA reprezinta
o metoda specifica a determinarii ADN-ului din produsele alimentare. Utilizarea acestor metode
în alimentele foarte procesate este de obicei limitată din cauza denaturării proteinelor.
De cele mai multe ori, pentru o detectie corecta, in aceasta lucrare a fost propusa
utilizarea standardelor adaptate la matrice. Aceasta nevoie aparare deoarece măsurările exacte ale
proporțiilor de carne în probe sunt compromise de varietatea tipurilor de țesuturi utilizate în
fabricarea alimentelor. Fracțiunile ADN pot să nu se coreleze cu conținutul de carne din probă
dacă metoda este calibrată cu ADN obținut din țesuturi (slănină grasă, mușchi fără grăsime, țesut
conjunctiv) diferite de cele prezente în probă.
produse care să reziste mai bine la lovire, reducând pierderile înregistrate de la recoltare
până la desfacere sau procesare prin manipulare necorespunzătoare;
obţinerea unor OMG-uri cu gusturi şi culori diferite, în vederea diversificării ofertei;
rezistenta la îngheţ sau alte condiţii extreme de mediu
Produsele alimentare MG îşi pot modifica foarte mult compoziţia şi valoarea nutritivă.
Astfel, unele produse derivate din OMG-uri pot conţine substanţe toxice sau alergenice pentru
consumatori.
Detectoarele bazate pe sondă MGB care vizează carnea de vită și porc sunt testate în
această lucrare pe amestecuri standardizate de carne de vită și carne de porc, atât crude, cât și
fierte / sterilizate, pentru a-și stabili capacitatea de a obține rezultate cantitative precise. În plus,
efectele gătitului și sterilizării termice asupra fragmentării ADN din aceste probe au fost, de
asemenea, testate, permițând corelarea gradului de deteriorare a ADN-ului prin proceduri de gătit
și rezultatul PCR.
Clasificarea produselor care pot fi testate pentru prezenta OMG-urilor se poate face după:
gradul de procesare;
tipul ingredientelor;
modul de prezentare;
gradul de umiditate.
Aceste aspecte sunt importante deorece o cunoaştere cât mai bună a proprietătilor intrinseci
ale probelor ajută la alegerea celor mai potrivite metode de eşantionare, pregătire şi extractie.
OMG (Organisme modificate genetic) = organisme (respectiv plante) al caror material genetic a
fost “transformat “ prin aplicarea tehnicilor de recombinare ADN.
Procesul de eşantionare reprezintă întodeauna o sursă de eroare care apare atunci când din
lotul de dimensiuni mari se aleg obiecte pentru a constitui proba ce va fi utilizată direct în
laborator. O bună practică de eşantionare asigură reducerea erorilor, ceea ce înseamnă de fapt
creşterea gradului de reprezentativitate al probei pentru populatia din care provine.
ANALIZA PCR
PCR : Realizează copii multiple ale unei secvenţe ADN specifice prin replicări succesive având
la bază proprietate ADN polimerazelor de a sintetiza în direcţia 5’-3’ o secvenţă de nucleotide
complementară cu secvenţa ADN ţintă (matriţă) pornind de la un primer cu capăt 3’-OH liber.
Astfel, numărul de copii ale secvenţei ţintă este dublat la fiecare replicare (ciclu), acesta crescând
deci exponenţial odată cu fiecare ciclu de amplificare.
ETAPELE PCR
3. Polimerizarea sau sinteza unei noi catene avănd drept matriţă catena veche ADN
Matriţa ADN poate fi: ADN genomic, mitocondrial, viral, ADNc (caz particular ARN
total – RTPCR)
ADN polimeraza: iniţial s-a folosit fragmentul Klenow al ADN polimerazei din E. Coli.
Ulterior au fost descoperite şi utilizate ADN polimeraze termostabile ca:
AmpliTaq polimeraza are aceleaşi proprietăţi cu Taq polimeraza dar este produsă
în E. Coli prin recombinare genetică. Reproductibilitatea şi puritatea acesteia este
mult mai mare decât a Taq polimerazei simple.
primerii trebuie să conţină un număr aproximativ egal din cele patru baze azotate,
evitându-se pe cât posibil regiunile cu repetiţii de nucleotide (evitare structuri
hairpin).
distanţa dintre doi primeri la nivelul matriţei trebuie să fie mai mică de 5-10 kpb,
dar s-a observat o eficienţă foarte scăzută a reacţiei în cazul în care lungimea
produsului de amplificare depăşeşte 3 kpb.
- Probele de carne proaspătă s-au obtinut din surse comerciale și depozitate congelate la
20°C pana in momentul experimentului.
- Amestecurile binare de carne de vită și porc au fost preparate prin combinarea cantităților
adecvate de carne tocată, slabă.
EXTRACȚIA ADN-ULUI
Citirile au fost luate la fiecare ciclu, iar creșterea fluorescenței a fost reprezentată grafic
față de numărul ciclului. Pentru a testa amplificarea ADN-ului din specii încrucișate, toate testele
PCR au inclus cel puțin trei reacții independente de control ADN nețintă (NTD) pentru fiecare
detector, conținând 4 ng de carne de vită (sau porc), ADN de pui sau curcan. Pragul de
fluorescență a fost fixat la același nivel exponențial mediu pentru toate cursele.
Pentru a cuantifica proporția de carne de porc în carne de vită: carne de porc amestecurile
binare, curbele standard folosind diluții de ADN de carne de porc și carne de porc au fost
obținute în primul rând prin reprezentarea grafică a ADN-ului vs. pentru ambele specii.
Amplificările qPCR au fost apoi efectuate în duplicat folosind 2 ng lL-1 de ADN obținut
din amestecuri binare F și T și CT-ul mediu înregistrat de detector au fost interpolați în curba
standard corespunzătoare pentru a obține conținutul de ADN din carne de vită în eșantion.
CT înregistrat de detector nu a fost interpolat direct pe curba standard, în schimb, carnea
de vită 50:50: probele de porc au fost utilizate ca referință matricială pentru a calibra diferențele
de conținut de ADN pentru cantități egale de carne de vită și carne de porc. Această diferență, D,
a fost definită ca numărul de cicluri care trebuie adăugate la experimental și interpolate pe
curbele standard corespunzătoare pentru a obține aceeași cantitate de ADN detectat în eșantionul
50:50. Astfel, dacă curbele standard sunt definite de CT m log Nb. Pentru calcul s-au efectuat
formulele de mai jos:
- Unde, unde CTb50 și CTp50 sunt CT obținute cu detectoare și din referința matricei
50:50.
ADN timus de vițel a fost digerat cu 10—3–2 × 10—4U lL — 1 din DNază I, timp de 10
min la 37 ° C în 500 lL de tampon de digestie conținând 50 mM Tris – HCI (pH 7,5), 10 mM
MgCl2 și 50 lg mL — 1 BSA. Toate digestiile au fost efectuate prin duplicat.
Reacția a fost oprită prin adăugarea a 25 lL de 0,5 M EDTA pH=8 și incubare la 100 ° C
timp de 10 min, urmată de fenol / clor, extracția cloroformului și precipitarea ADN-ului prin
adăugarea unui volum de 1,2-propanol. Peleta a fost spălată cu etanol 70% și ADN-ul a fost
rehidratat prin adăugarea a 20 lL apă și incubarea peste noapte la 4 ° C. O probă fără enzimă a
fost preparată ca martor la normalitează rezultatele.
Identificarea cărnii de vită și de porc a fost efectuată folosind truse ELISA pentru
alimentele crude sau conform instrucțiunilor producătorului.
După 10 min la temperatura camerei, extractele au fost apoi condiționate prin diluarea
1/10 (v / v) în soluție salină tamponată cu fosfat (10 mM fosfat, 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, pH
7,4). 100 lL din fiecare extract reconstituit a fost verificat de ELISA. Etapele de spălare au fost
efectuate cu ajutorul unui inel microplate. Absorbanța a fost citită cu un cititor de microplacă
Spectra MAX340pc la 450 nm.
REZULTATE
Eficiențele PCR măsurate atât pentru detectoarele utilizate pe amestecuri 50:50 (2,2 ± 0,2
și respectiv 2,0 ± 0,3, respectiv) nu au fost statistic diferite (p> 0,05) de cele observate la carnea
pură de vită sau de porc (2,0 ± 0,1) și respectiv 2,3 ± 0,3).
În mod similar, nu s-au observat diferențe în probele de T tratate termic. Astfel, s-ar putea
concluziona că procesele de gătit și sterilizare utilizate nu afectează în mod semnificativ
răspunsul qPCR la diferite concentrații de ADN și că prezența ADN nețintă în amestecul de
carne, nu afectează eficiența PCR.
Pentru exemplificarea acestor rezultate, se vor folosii urmatoarele grafice, execuate in
momentul experimetului:
De asemenea, s-a arătat că utilizarea ADN extras din materialul de referință adaptat la
matrice conținând diferite proporții de specii de carne produce rezultate mai precise decât
utilizarea diluțiilor ADN pentru a construi curbe de calibrare. În consecință, curbele standard
prezentate în Fig. 1 pot fi utilizate direct pentru a interpola valorile qPCR obținute din ADN
extras din amestecuri de carne de vită și carne slabă de porc pentru a stabili proporțiile fiecărei
specii.
FIGURA 3: Cantificarea cărnii de porc în carne de vită: amestecuri binare de carne de porc
utilizând standarde de matrice 50:50 pentru calibrare. Procentul de carne de porc din probele
din seria F și T a fost calculat folosind ecuația reprezentata anterior. Rezultatele prezentate
reprezintă media a 4 teste independente ± SD.
Rezultatele obținute pe ADN-ul digerat arată că detectoarele BOS pot fi utilizate pentru a
obține o estimare a degradării ADN-ului în produsele din carne procesate. Pentru a testa acest
lucru, probele de carne de vită au fost gătite și tratate termic în condiții diferite, iar valorile r care
țin cont de degradarea ADN-ului au fost obținute folosind detectoarele BOS.
In Fig. 4A, este aratat ca exista posibilitatea chiar și la cea mai mică concentrație de DNază
utilizată, ca si cantitatea de ADN amplificat de detector de 204 bp a fost de aproape o pătrime
din ADN-ul amplificat în ADN-ul nedigerat.
In Fig. 4B, se indica faptul că, în timp ce prăjiți în ulei vegetal la 65 ° C, chiar și pentru
perioade lungi de timp, nu afectează în mod semnificativ amplificarea detectorului, reduce
cantitatea detectată cu detectorul. Acest lucru sugerează că, în aceste condiții, majoritatea ADN-
ului este prezent în fragmente de 200 până la 300 bp. Sterilizarea la 126 ° C, chiar și pentru
perioade scurte de timp, reduce drastic semnalul recuperat de detectoare, ceea ce sugerează
apariția fragmentării ADN sub 200 bp în medie.
FIGURA 4: Amplificarea ADN-ului prin qPCR pe probe degradate de ADN. (A) Amplificarea
pe ADN timus de vițel digerat cu DNaseI. Raportul dintre amplificarea ADN-ului digerat și cel
digerat a fost obținut după incubare cu concentrații diferite de DNaseI. (B) Amplificarea pe
probe de carne de vită prăjite în ulei vegetal la 65 ° C timp de 30 de minute. urmată de
sterilizare la B2: 126 ° C timp de 10 minute; B3: 20 min și B4: 30 min. B1: martor nesterilizat.
Raporturile r1-2 (negru) și r1-3 (gri) au fost calculate.
CONCLUZII
Această abordare poate contribui la îmbunătățirea proiectării unor metode robuste pentru
cantificarea speciilor în alimentele procesate.