22 - DR Ruxandra Luca - Teza de Doctorat

Ramona-Emanuela Maghet Digitally signed by Ramona-Emanuela Maghet
Date: 2020.11.12 15:01:45 +02'00'
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

“VICTOR BABEȘ” TIMIȘOARA
FACULTATEA DE MEDICINĂ DENTARĂ
DEPARTAMENTUL II
LUCA RUXANDRA ELENA
TEZĂ DE DOCTORAT
STUDIUL INFLUENȚEI RADIAȚIEI LASER
CU NIVEL ENERGETIC SCĂZUT
ASUPRA MECANISMULUI BIOLOGIC
AL REGENERĂRII OSOASE GHIDATE
Conducător Științific
PROF. UNIV. DR. CARMEN TODEA
Timișoara
2020
II
III
CUPRINS
Lista lucrărilor publicate .................................................................................... VI

Lista abrevierilor ............................................................................................... VII
Indexul figurilor ................................................................................................... X
Indexul tabelelor .............................................................................................. XV
Dedicație ........................................................................................................ XVI
Mulțumiri ........................................................................................................ XVII
INTRODUCERE ............................................................................................. XIX
PARTE GENERALĂ - Stadiul actual al cunoaşterii

Capitolul 1. Generalități privind fiziologia osoasă și tehnicile de
regenerare osoasă ghidată ............................................................. 1
1.1. Fiziologia țesutului osos și mecanismul biologic al vindecării
osoase .................................................................................................. 1
1.1.1. Generalități referitoare la țesutul osos .......................................... 1
1.1.2. Procesul fiziologic de formare osoasă ......................................... 2
1.1.3. Procesul de vindecare osoasă ..................................................... 3
1.1.4. Particularități ale osului alveolar ................................................... 8
1.2. Prevenirea resorbției alveolare și conceptul de regenerare
osoasă ghidată .................................................................................... 10
1.3. Materiale de substituție osoasă și membrane utilizate în
tehnicile de regenerare osoasă ghidată .............................................. 12
1.3.1. Autogrefele osoase .................................................................... 12
1.3.2. Xenogrefele osoase ................................................................... 14
1.3.3. Alogrefele osoase ....................................................................... 14
1.3.4. Grefele sintetice/aloplastice........................................................ 15
1.3.5. Rolul membranelor în tehnicile de regenerare osoasă ............... 17
1.3.6. Vascularizația și angiogeneza în procesele de regenerare
osoasă........................................................................................ 20
1.4. Metode de evaluare a cantității și a calității substratului osos ............. 21
1.4.1. Osteodensitometria DEXA (Dual-energy x-ray
absorptiometry - DXA) ............................................................... 22
IV
1.4.2. Tomografie computerizată (CT).................................................. 23

1.4.3. Tomografie calculată cantitativă periferică de înaltă
rezoluție - HR-pQCT .................................................................. 24
1.4.4. Microtomografia computerizată - micro-CT sau μCT.................. 24
1.4.5. Tomografie computerizată cu fascicul de con – CBCT .............. 26
1.4.6. Tomografia în coerență optică (OCT) ......................................... 28
Capitolul 2. Mecanismul, rolul și beneficiile terapiei laser în cadrul
procedurilor de augumentare și regenerare osoasă ..................... 29
2.1. Generalități cu privire la fotobiomodulare în sfera medicinei dentare . 29
2.2. Doza de radiație laser ......................................................................... 30
2.3. Mecanismul de acțiune al fotobiomodulării laser ................................. 34
2.4. Efectele radiației laser la nivelul țesutului osos ................................... 39
PARTE SPECIALĂ – Contribuții personale

Capitolul 3. Date preliminare necesare realizării cercetării personale și
stabilirea modelului experimental .................................................. 43
3.1. Date preliminare necesare realizării cercetării personale și
scopul studiului ................................................................................... 43
3.2. Date preliminare necesare pentru stabilirea modelului
experimental ...................................................................................... 46
3.3. Material și metodă ............................................................................... 48
3.3.1. Stabilirea modelului animal și a grupelor de studiu ................... 48
3.3.2. Intervenția chirurgicală pe modelul animal ................................ 49
3.3.3. Expunerea la radiația laser ........................................................ 52
3.3.4. Recoltarea și pregătirea probelor ............................................... 53
Capitolul 4. Studiul eșantioanelor prelevate cu ajutorul Master Slave OCT ..... 55
4.1. Scanarea eșantioanelor recoltate ........................................................ 55
4.2. Evaluarea cantitativă a osului nou format ........................................... 57
4.3. Rezultate ............................................................................................. 58
4.4. Discuții ................................................................................................. 67
4.5 Concluzii ............................................................................................... 74
V
Capitolul 5. Studiul histologic al eșantioanelor prelevate ................................. 75

5.1. Examinarea histologică a probelor ...................................................... 75
5.2. Rezultate ............................................................................................. 75
5.3. Discuții și concluzii .............................................................................. 86
Capitolul 6. Studiul eșantioanelor prelevate cu ajutorul Microtomografiei
Synchrotron ................................................................................... 87
6.1. Scanarea eșantioanelor recoltate ........................................................ 87
6.2. Evaluarea cantitativă a osului nou format ........................................... 88
6.3. Rezultate ............................................................................................. 89
6.4. Discuții ................................................................................................. 95
6.5. Concluzii .............................................................................................. 98
Capitolul 7. Studiul retrospectiv al tomografiei computerizate cu fascicul
conic în cazul pacienților care au urmat tratament de
fotobiomodulare ............................................................................ 99
7.1. Introducere și scopul studiului ............................................................. 99
7.2. Material și metodă de lucru ............................................................... 101
7.3. Rezultate ........................................................................................... 104
7.4. Discuții ............................................................................................... 110
7.5. Concluzii ............................................................................................ 113
CONCLUZII FINALE ȘI CONTRIBUȚII PROPRII .......................................... 114
BIBLIOGRAFIE ............................................................................................. 119
ANEXE ................................................................................................................ I
VI
LISTA LUCRĂRILOR PUBLICATE
1. Luca RE, Giuliani A, Mănescu A, Heredea R, Hoinoiu B, Constantin

GD, Duma VF, Todea CD. Osteogenic Potential of Bovine Bone Graft
in Combination with Laser Photobiomodulation: An Ex Vivo
Demonstrative Study in Wistar Rats by Cross-Linked Studies Based on
Synchrotron Microtomography and Histology. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21,
778. IF 4.18
2. Luca R, Todea CD, Duma VF, Bradu A, Podoleanu A. Quantitative

assessment of rat bone regeneration using complex master–slave
optical coherence tomography. Quant. Imaging Med. Surg. 2019, 9,
782–798. IF 3.22
3. Luca R, Todea CD, Constantin GD, Mocuta D, Munteanu R. Animal

models in guided bone regeneration using photobiomodulation: general
aspects and particularities influencing the studies outcome - a review.
Proc. SPIE 10831, 2018,Seventh International Conference on Lasers in
Medicine, 108310A doi: 10.1117/12.2285172
VII
LISTA ABREVIERILOR
+LLLT - grup de studiu

3D - tridimensional
ATP - adenozin trifosfat
BDNF - factorul neurotrofic derivat din creier
bFGF - factorul de creștere fibroblastică
BMC - conținut mineral osos (bone mineral content)
BMD - densitatea minerală osoasă (bone mineral density)
BMP - proteina morfogenetică osoasă
CAD/CAM - proiectare asistată de computer / fabricație asistată de
computer
cAMP - adenozin monofosfat ciclic
CBCT - tomografia computerizată cu fascicul de con
CBVS - volum cu fascicul de scanare conic
CBVI - imagistică volumetrică cu fascicul conic
CCO - citocromul c oxidază
CCP - colagen-fosfat de calciu biomimetic
CG - colagen-glizozaminoglican
CMS/SS OCT - sistemul multimodal de tomografie în coerență optică dezvoltat
intern
CT - tomografia computerizată
DBM - matrice osoasă demineralizată (demineralized bone matrix)
DEXA - osteodensitometrie (dual energy X-ray absortiometry)
DICOM - Digital Imaging and Communications in Medicine
DVT - tomografie digitală volumetrică
FGF - factorul de creștere fibroblastic
GaAlAs - Gallium-Aluminum–Arsenide (laser)
VIII
GTR - regenerare tisulară ghidată

HE - hematoxilină și eozină
HIF-1α - factorul de inducere a hipoxiei
HGF - factorul de creștere hepatocitară
HSP - proteina de șoc termic
HR-pQCT - tomografia calculată cantitativă periferică de înaltă rezoluție
HU - unități Hounsfield
IGF-1, IGF-2 - factorii de creștere insulin-like
IL-1, IL-6 - interleukinele 1, 6
KGF - factorul de creștere keratinocitar
LCI - interferometria în coerență joasă
LED - light-emitting diode
LLLT - laser cu nivel energetic scăzut
micro-CT - microtomografie computerizată
MDCT - tomografie computerizată multidetector
MDDr - distribuția densității de masă osoasă relativă
MSC - celule stromale multipotente
MSCT - tomografia computerizată multistrat
NC - grup control negativ
NFkB - factorul nucelar kappa B
NIR - radiație din spectru infraroșu apropiat
NO - oxid nitric
OCT - tomografia în coerență optică
OLED - organic light-emitting diode
OMS - Organizația Mondială a Sănătății
PBM - fotobiomodulare
PC - grup de control pozitiv
PDGF - factorul de creștere derivat din trombocite
IX
PTFE - politetrafluoroetilena (teflon)

RANKL - receptor activator al ligantului de factor nuclear kapp-B
ROI - arie de interes
ROS - specii de oxigen reactiv
SR - radiație synchorotron
Tb.N - număr de trabecule
Tb.Sp - distanța dintre trabecule
Tb.Th - grosimea medie a trabeculelor
TNF-α - factorul de necroză tumorală
TGF-β - factorul de creștere
TMD - densitatea minerală a țesutului osos
TRP - canale de potențial tranzitor al receptorilor
VEGF - factorul de creștere vascular endotelial
X
INDEXUL FIGURILOR
Fig. 1. Curba Arndt-Schulz. Axa orizontală prezintă creșterea dozei (de la stânga la
dreapta) și indică faptul că biostimularea apare cu doze relativ mai mici în
comparație cu dozele mai mari care provoacă bioinhibiția (adaptare după
191,196) ............................................................................................................................ 32
Fig. 2. Fereastra terapeutică în funcție de lungimea de undă (adaptare după 197) ....................... 34
Fig. 3. Principalele mecanisme de acțiune ale fotobiomodulării (adaptare după 196) ................... 36
Fig. 4. Schema defectului creat la nivelul osului parietal al animalului studiat ............................. 50
Fig. 5. Etapele din cadrul intervenției chirurgicale: reflectarea lamboului (a), realizarea
defectului parietal cu ajutorul frezei burghiu de diametru 5 mm (b), aspectul
circumferinței defectului în timpul îndepărtării capacului osos (c, d, e),
augumentarea defectului cu xenogrefă (f), plasarea membranei de colagen (g),
sutura plăgii în 2 planuri, profund (h) și superficial (i) .................................................... 51
Fig. 6. Aspectul ghidului de plastic realizat intraoperator, cu repere craniene pentru
poziționare corectă a fibrei laser (a), aspect în timpul biomodulării laser (b),
aparatul laser utilizat, IRRADIA Mid-Laser® (c)............................................................. 52
Fig. 7. Aspectul diferilor tipuri de probe recoltate: grup control negativ, cu defect
neaugumentat, lăsat pentru vindecare spontană (A), grup control pozitiv, cu
defect augumentat cu xenogrefă (B), grup de studiu cu defect augumentat și
supus biomodulării laser (C) .......................................................................................... 54
Fig. 8 a-f. Scanarea eșantioanelor cu ajutorul sistemului dezvoltat intern CMS / SS OCT .......... 55
Fig. 9. Schița defectului analizat (A), schița celor 4 cadrane analizate (B), imaginile
obținute cu ajutorul sistemului dezvoltat intern CMS / SS OCT ..................................... 56
Fig. 10. Pragurile de luminozitate stabilite pentru analiză ............................................................ 58
Fig. 11. Vizualizare în 12 imagini pentru o pereche de imagini formate din grupul A și
grupul C. Imaginile grupului A au fost înregistrate după cel mai scurt interval
de timp considerat (14 zile) și imaginile din grupul C au fost înregistrate după
cel mai lung interval de timp considerat (30 de zile). Diferențele dintre un
eșantion cu cel mai mic și cea mai mare cantitate de os nou format este
evidențiată. Se arată perechea de imagini pentru fiecare din cele patru
cadrane (i) - (iv) conform notației din figura 9A. Fiecare imagine OCT en-face
are o suprafață pătrată (în planul xy) de 2,8 × 2,8 mm2. Imaginea este cea a
perechii de 12 imagini pentru cadran (iii). Prima imagine en-face este colectată
la o adâncime z = 0,4 mm, în timp ce distanța dintre imaginile en-face afișate
este de 42,56 µm. Raza axială a celor două imagini cu B-scan este de 1,6
mm. Toate distanțele sunt măsurate în aer ................................................................... 60
Fig.12. Monitorizarea procesului de formare a osului nou pentru cele trei grupuri A, B și
C - după (1) t1 = 14 zile, (2) t2 = 21 zile și (3) t3 = 30 zile. Au fost luate în
XI
considerare cadranul din stânga sus (ii) al fiecărui eșantion (a se vedea Fig. 9
(a)). Fiecare imagine OCT en-face are o suprafață pătrată (în planul xy, a se
vedea Fig. 9) de 2,8 × 2,8 mm2. Prima imagine en-face afișată este colectată
la adâncimea z = 0,4 mm, în timp ce distanța dintre imaginile afișate este de
42,56 µm. Domeniul axial (în profunzimea probei) din imaginile B-scan este de
1,6 mm ........................................................................................................................... 62
Fig. 13. Același studiu ca în Fig. 11, care arată reconstrucțiile 3D-OCT ale cadranului
din stânga sus a probelor pentru fiecare grup, A, B și C după (1) t1 = 14 zile,
(2) t2 = 21 zile și (3) t3 = 30 zile .................................................................................... 63
Fig. 14. Corespondența dintre schema defectului osos prezentată anterior (în fig. 4) și
diferite tipuri de os din interiorul defectului, folosind imagini OCT ................................. 64
Fig. 15. Aspect din timpul prelucrării imaginilor obținute, cu ajutorul software-ului dedicat
dezvoltat in-house.......................................................................................................... 64
Fig. 16. Colaj de imagini en-face care prezintă structura osoasă diferită în imaginile
obținute cu scanări OCT: reprezentarea vindecării osoase pentru grupul de
control negativ A (a) (la 14 zile, 21 de zile, 30 de zile), pentru grupul de control
pozitiv B (b) (la 14 zile, 21 de zile, 30 de zile) și pentru grupul experimental C
(c) (la 14 zile, 21 de zile, 30 de zile). Procentul fiecărui tip de os este indicat pe
fiecare imagine OCT ...................................................................................................... 66
Fig. 17 Valori medii și abateri standard pentru reprezentarea (A) a osului nativ, (B)
xenogrefă (os bovin), (C) țesut osos nou format în grupele studiate,
numerotate de la I la IX, în funcție de timpul de vindecare și de tipul a
tratamentului aplicat:(I)control negativ Grupul A, timp de vindecare 30 de zile
(defect vindecat spontan); (II)control pozitiv Grupul B, timp de vindecare 30 de
zile (defect umplut cu xenogrefă de os bovin); (III)grupul de studiu C, timp de
vindecare 30 de zile (defect umplut cu xenogrefă; s-a aplicat radiație
laser);(IV)control negativ Grupul A, timp de vindecare 21 de zile (defect
vindecat spontan); (V)control pozitiv Grupul B, timp de vindecare 21 de zile
(defect umplut cu xenogrefă); (VI)grupul de studiu C, timp de vindecare 21 de
zile (defect completat cu xenogrefă; s-a aplicat radiație laser); (VII)control
negativ Grupul A, timp de vindecare 14 zile (defect vindecat spontan);
(VIII)control pozitiv Grupul B, timp de vindecare 14 zile (defect umplut cu
xenogrefă);(IX)grupul de studiu C, timp de vindecare 14 zile (defect umplut cu
xenogrefă; radiație laser aplicată) .................................................................................. 71
Fig. 18 Comparație între cele trei grupuri de studiu privind osul nou format, cu
semnificație din punct de vedere statistic (P <0,05)....................................................... 71
Fig. 19. Colorația tricromă Masson 10 ×, care demonstrează rezultate diferite pentru (A)
grup V (grup pozitiv de control B, timp de vindecare 21 de zile, defect umplut
cu grefă de os bovin) și (B) grupa VI (studiu de grup C, timp de vindecare 21
de zile, defect umplut cu grefă osoasă bovină; s-a aplicat radiație laser).
Câteva elemente celulare inflamatorii, material eozinofilic omogen încrucișat
cu țesut fibros într-o cantitate mică (aproximativ 2:1) și granuloame din
XII
materialul de sutură este prezentat în (A). Lamele osteoide care tind să lege
țesutul osos de materialul eozinofil (care este reprezentat de grefa osoasă
bovină) sunt prezentate în (B), unde unele dintre lamele osoase sunt delimitate
focal de osteoblaste. *, lamele osteoide ........................................................................ 73
Fig. 20(a). Probele după 14 zile de vindecare: grup NC. N- necroză; EM-material
eozinofil; CT-țesut conjunctiv; G-granuloame; Ob-osteoblaste; OT-țesut osos.
Colorare HE (stânga), mărire originală: 10x, Tricromă Masson (dreapta),
mărire originală: 10x ...................................................................................................... 76
Fig. 20(b). Probele după 14 zile de vindecare: grup PC. N- necroză; EM-material
Colorare HE, mărire originală: 10x, Tricromă Masson (dreapta), mărire
originală: 20x. Bogat infiltrat inflamator polimorf predominat granulocitar, arii
extinse de necroză fibrinoidă (N), țesut conjunctiv cu benzi subtiri de colagen,
”corp străin” în periferie .................................................................................................. 77
Fig. 20(c). Probele după 14 zile de vindecare: grup +LLLT. N- necroză; EM-material
Colorare HE, mărire originală: 10x, Tricroma Masson (dreapta), mărire
originală: 10x. Țesut conjunctiv fibros (CT) ce înglobează material eozinofil
omogen, prezente celule gigante multinucleate (CGM) și infiltrat inflamator ................. 78
Fig. 21(a). Probele după 21 zile de vindecare: grup NC. N- necroză; EM-material
originală: 10x. Bogat țesut conjunctiv fibros (CT), arii de osteoid (Ob),
extravazate hematice..................................................................................................... 79
Fig. 21(b). Probele după 21 zile de vindecare: grup PC. N- necroză; EM-material
originală: 10x. Material eozinofil abundent care este disecat de tesut fibros,
prezente celule gigante multinucleate ........................................................................... 80
originală: 10x. Lamele osteoide care tind să facă legătura între țesutul osos
(OT) și materialul eozinofil, unele lamele osoase sunt delimitate focal de
osteoblaste (Ob) ............................................................................................................ 82
Fig. 22(a). Probele după 30 zile de vindecare: grup +LLLT. N- necroză; EM-material
originală: 10x. Lamele de țesut osos în diferite stadii de maturare cu țesut
conjunctiv fibros (CT) în cantitate scăzută ..................................................................... 83
Fig. 22(b). Probele după 30 zile de vindecare: grup +LLLT. N- necroză; EM-material
XIII

originală: 4x. Țesut conjunctiv fibros (CT) ce înglobează țesut osos (OT) nou
format și material eozinofil. Lamele de țesut osos tapetate de osteoblaste,
bogat infiltrat inflamator polimorf cu celule gigante multinucleate (CGM) dispus
difuz ............................................................................................................................... 84
originală: 10x. Țesutul conjunctiv fibros(CT) înglobează materialul omogen
eozinofil, se identifică fragment de tesut osos (OT), bogat infiltrat inflamator
dispus difuz, celule gigante multinucleate...................................................................... 85
Fig. 23. Fixarea eșantionului în ceară tip Kerr (a) și scanarea cu ajutorul
Microtomografiei Synchrotron (B) .................................................................................. 87
Fig. 24. Imagini micro-CT ale defectelor în stadii diferite de vindecare, în eșantioane
prelevate reprezentativ. (a-f) Grupa I: probe recoltate după 14 zile: (a-c)
Reconstituiri 3D: (a) control negativ (NC); (b) control pozitiv (PC); (c) tratat cu
LLLT; (d-f) secțiuni transversale ale defectului: (d) NC; (e) PC; (f) tratat cu
LLLT. (g-l) Grupa II: probe recoltate după 21 de zile: (g-i) Reconstituiri 3D: (g)
NC; (h) PC; (i) tratat cu LLLT; (j-l) secțiuni transversale ale defectului: (j) NC;
(k) PC; (l) tratat cu LLLT. (m-r) Grupul III: probe recoltate după 30 de zile: (m-
o) Reconstrucții 3D: (m) NC; (n) control PC; (o) tratat cu LLLT; (p-r) secțiuni
transversale ale defectului: (p) NC; (q) PC; (r) tratat cu LLLT. În reconstrucțiile
3D țesutul cenușiu este osul matur; țesutul roșu este osul în curs de
remodelare; țesutul alb este biomaterialul adăugat; săgețile galbene indică
osul nou format, la periferia defectelor. În secțiunile transversale ale defectului:
țesutul alb este biomaterial; culorile reprezintă mineralizarea osului
proporțional cu harta din partea de jos (albastru înseamnă densitate de masă
scăzută; roșu înseamnă densitate de masă mare) ........................................................ 91
Fig. 25. Analiza morfometrică cantitativă. (a-c) Procentele medii de volum (vol.%) ale
diferitelor faze mineralizate (osul în curs de remodelare, osul matur și
biomaterial) raportat la volumul total mineralizat: (a) grup NC; (b) grup PC; (c)
+ grup LLLT. (d-f) Analiza volumetrică cantitativă a țesutului osos în fază de
remodelare, după (d) 14 zile, (e) 21 de zile și (f) 30 de zile de la operație.
Barele de eroare sunt indicate ....................................................................................... 93
Fig. 26. Studiul distribuției densității de masă relativă (MDDr). (a) Fragment din
histograma unei probe: vârful din stânga se referă la osul mineralizat total,
vârful din dreapta se referă la biomaterialul (xenogrefă) utilizat pentru
umplerea defectului; (b) studiul osului mineralizat: sunt indicați parametrii
investigați cu abordarea Roschger247. Pragul de p = 0.005 a fost selectat, ca
un bun compromis de a menține o sensibilitate bună și de a reduce în același
timp potențiale artefacte datorate efectelor parțiale de volum în evaluarea
MDDrlow; (c) parametrii care derivă din profil sunt indicați ............................................ 94
XIV
Fig. 27. Imagini micro-CT ale defectelor regenerate în eșantion prelevat reprezentativ,
evaluat la 30 de zile postoperator. Periferia defectului nu au fost acoperită cu
xenogrefă, fiind astfel expusă direct radiației laser. O mare cantitate de os nou
format poate fi observată la periferia defectului, așa cum este indicat cu
săgețile galbene. A: reconstrucție 3D; B: secțiune transversală. Țesutul gri
este osul matur; țesutul roșu este osul în curs de remodelare; țesutul alb este
biomaterial .................................................................................................................... 97
Fig. 28. Schema de reprezentare a celor 3 puncte de aplicare a radiației laser: mezial,
distal și apical, în dreptul fiecărui implant dentar inserat ............................................. 102
Fig. 29. Aspect CBCT inițial, cu delimitarea zonelor de interes (a); aspect CBCT post-
chirurgical și după tratamentul de fotobiomodulare, la aprox. 12 luni, în
aceleași arii de interes anterior definite (b) .................................................................. 104
Fig. 30. Densitatea minerală osoasă medie, măsurată la nivel cortical, în unități
Hounsfield, înainte de intervenția chirurgicală (albastru) și la aproximativ 1 an
după intervenția chirurgicală și tratamentul de fotobiomodulare laser
(portocaliu) ................................................................................................................... 105
Fig. 31. Densitatea minerală osoasă medie, măsurată la nivel medular, în unități
(portocaliu) ................................................................................................................... 105
(portocaliu) ................................................................................................................... 106
(portocaliu) ................................................................................................................... 106
Fig. 34. Densitatea minerală osoasă medie, măsurată la nivel cortical, în unități
Hounsfield, înainte de intervenția chirurgicală și la aproximativ 1 an după
intervenția chirurgicală și tratamentul de fotobiomodulare laser ................................. 107
Hounsfield, înainte de intervenția chirurgicală și la aproximativ 1 an după
intervenția chirurgicală și tratamentul de fotobiomodulare laser .................................. 107
Fig. 36. Test Tukey aplicat indicilor HU măsurați la nivel cortical, înainte și după
tratamentul de fotobiomodulare, p=3,6% ..................................................................... 108
Fig. 37. Test Tukey aplicat indicilor HU măsurați la nivel medular, înainte și după
tratamentul de fotobiomodulare, p=0% ........................................................................ 109
XV
INDEXUL TABELELOR
Tabel 1. Factori biologici implicați în regenerarea osoasă, după 17 ................................................ 6
Tabel 2. Descriere sumară a tehnologiilor bazate pe raze X, după 108, 183-185 ............................... 28
Tabel 3. Efectele PBM asupra principalelor molecule, după 190 ................................................... 37
Tabel 4. Grupele de studiu în funcție de tratamentul aplicat și de perioada de vindecare ........... 49
Tabel 5. Specificațiile tehnice ale echipamentului laser utilizat în studiu ..................................... 53
Tabel 6. Test Anova aplicat indicilor HU măsurați la nivel cortical, înainte și după
tratamentul de fotobiomodulare, pentru grupul de femei ............................................. 108
Tabel 7. Test Anova aplicat indicilor HU măsurați la nivel cortical, înainte și după
tratamentul de fotobiomodulare, pentru grupul de bărbați ........................................... 108
Tabel 8. Test Anova aplicat indicilor HU măsurați la nivel medular, înainte și după
tratamentul de fotobiomodulare, pentru grupul de femei ............................................. 109
Tabel 9. Test Anova aplicat indicilor HU măsurați la nivel medular, înainte și după
tratamentul de fotobiomodulare, pentru grupul de bărbați ........................................... 109
XVI
DEDICAȚIE
Dedic această lucrare părinților mei, pe al căror

sprijin necondiționat m-am bazat pe tot parcursul
meu evolutiv, profesional și personal.
XVII
MULȚUMIRI
În elaborarea acestei lucrări m-am bucurat de colaborarea unor

specialişti cu calităţi profesionale şi umane de excepţie, cărora doresc să le
mulţumesc.
Mulțumirile și întreaga mea recunoștință sunt îndreptate, în primul

rând, către coordonatorul meu științific, Prof. Univ. Dr. Carmen Todea,
fără a cărei atentă îndrumare și exigență nu aș fi desăvârșit această
lucrare; îi sunt profund recunoscătoare pentru modul complet și complex în
care a dorit să abordăm o temă de cercetare atât de vastă, pentru răbdarea,
generozitatea, înţelegerea şi întreaga contribuţie la formarea mea ca tânăr
cercetător.
Mulţumesc distinşilor referenţi oficiali, Prof. Univ. Dr. Băciuț

Mihaela, Prof. Univ. Dr. Silviu Brad, Prof. Univ. Dr. Laurențiu Mogoanță
și doresc să îmi exprim gratitudinea pentru sfaturile și sugestiile oferite.
Totodată, doresc să mulțumesc colectivului de cercetare alături de

care am realizat studiile de tomografie în coerență optică, în cadrul
Universității Kent (Canterbury, Regatul Unit), domnului Prof. Adrian
Podoleanu, domnului Prof. Virgil Duma, domnului Ș.L. Adrian Bradu,
precum și echipei de cercetare cu sprijinul căreia am efectuat
microtomografiile Synchrotron, în cadrul bazei de cercetare Elletra
(Basovizza, Italia) și a Universității Politehnice din Ancona (Italia), respectiv
doamnei Prof. Alessandra Giuliani și domnului Prof. Adrian Mănescu.
Aveți toată recunoștința și aprecierea mea pentru profesionalismul, sprijinul
și colaborarea consistentă și de lungă durată, fără de care abordarea
multidisciplinară a acestei teme de cercetare nu ar fi fost posibilă.
De asemenea, doresc să le mulțumesc doamnelor doctor Romanița

Glăja și Rodica Heredea, fără a căror contribuție în etapa de analiză
histologică și confirmare a rezultatelor, lucrarea prezentă nu s-ar fi putut
finaliza și domnului dr. Bogdan Honoiu, al cărui sprijin valoros s-a
concretizat pe toată perioada studiului experimental animal.
Mulțumesc de asemenea, colectivului Disciplinei de Reabilitare

Orală și Urgențe în Medicina Dentară, în cadrul căreia mi-am desfășurat
XVIII
activitatea didactică, în special dr. George Constantin, pentru sprijinul

acordat pe toată perioada desfășurării experimentului animal.
În final, recunoștința mea este îndreptată către familia mea, care a

acceptat și a sprijinit toate sacrificiile impuse de implicarea în activităţile
legate de pregătirea şi elaborarea acestei teze, fiindu-mi un real sprijin chiar
și în momentele în care reușitele întârziau să apară. Exemplul lor
consistent, educația, înțelegerea, dragostea și respectul pentru muncă pe
care mi le-au oferit reprezintă premisele fundamentale ale devenirii mele
umane și profesionale, deopotrivă.
XIX
INTRODUCERE
Destul de frecvent în practica medicii dentare curente, pierderea unui dinte

nu coincide cu înlocuirea sa printr-un implant imediat, fapt datorat numeroaselor
cauze, variind de la factorul psihologic, până la cel material sau privitor la dotarea
și posibilitățile cabinetului de medicină dentară. Cel mai adesea, intervin numeroși
ani până în momentul în care o breșă edentată se prezintă în vederea instituirii
tratamentului cu ajutorul implantelor dentare. Adresabilitatea pacientului în
vederea instituirii unui asemenea tratament a crescut considerabil, ca atare
cerințele în legătură cu tehnicile de augumentare osoasă în vederea creșterii
volumului osos, anterior plasării implantelor și a restaurărilor protetice, reprezintă
teme de actualitate în medicina dentară1. Resorbția crestei alveolare consecutivă
pierderii dinților este un fenomen comun. Ulterior extracției unui dinte, creasta
alveolară descrește foarte rapid în lățime și înălțime, cu o pierdere de aproximativ
40-60% în primii 3 ani, după care procentul scade la 0.25-0.5% pierdere anuală
ulterioară. Cauzele resorbției osului alveolar au fost puse pe seama atrofiei prin
lipsa funcționalității, a descreșterii aportului sangvin, a procesului inflamator
localizat sau a presiunilor exercitate de către diverse tipuri de restaurări protetice2.
Conceptul de regenerare osoasă a apărut ca și o consecință firească a
nevoii de reabilitare orală a pacienților parțial sau total edentați, care nu
beneficiază de o ofertă osoasă suficientă restaurărilor protetice tradiționale sau a
celor pe implanturi dentare. Reabilitarea orală a pacienților parțial sau total
edentați cu ajutorul implanturilor dentare a devenit un tratament de rutină în
ultimele decade, cu rezultate viabile pe termen lung. Chiar și așa, condițiile locale
nefavorabile, ce țin de oferta osoasă, datorită atrofiei, bolii parodontale sau a
sechelelor după traume, oferă volum osos insuficient sau relații intermaxilare
verticale, orizontale și sagitale nefavorabile, ceea ce poate determina fie
imposibilitatea plasării implantelor, fie plasarea incorectă a acestora, din punct de
vedere funcțional și estetic3. Biologia țesutului osos ne indică o structură
histologică dinamică, adaptată la procesele metabolice locale, prin intermediul
celulelor osoase implicate în procesele de resorbție și de neoformare. S-a arătat
faptul că activitatea osteocitelor și cea a osteoclastelor durează de la câteva zile la
câteva săptămâni, timp în care la nivelul lacunelor celulare apar osteoclastele cu
rol de resorbție a țesuturilor inactive, formând o suprafață la nivelul căreia vor
acționa osteoblastele, prin formarea de lamele concentrice de os compact imatur,
respectiv lamele rectilinii de os spongios, care se vor mineraliza dupa 1-2 zile4.
În sensul satisfacerii nevoii de țesuturi dure și moi în implatologia orală, au
fost dezvoltate mai mult metode și tehnici de creștere a volumului osos și a calității
XX
acestuia. În prezent, augumentarea osoasă este utilizată pe scară largă, având la

dispoziție numeroase alternative de materiale folosite ca subsituent al osului
natural al pacientului. Dintre cele mai frecvente enumerăm: augumentările cu
blocuri osoase, augumentările cu grefe aloplastice (materiale sintetice) sau cu
xenogrefe (materiale de proveniența animală), regenerarea osoasă ghidată,
osteodistracția. Dintre acestea, osul anorganic de proveniență bovină este
materialul cel mai îndelung cercetat și utilizat, datorită asemănării sale cu osul
uman și a avantajelor legate de disponibilitate și de ușurința tehnicii operatorii.
Materialele sintetice au tendința de a fi utilizate ca grefe osoase din cauza unor
avantaje, cum ar fi, de exemplu lipsa de contaminare, biodisponibilitatea bună,
ușurință în manevrare și o bună acceptare de către pacient. O altă proprietate
importantă este capacitatea de a adăuga medicamente, celule și molecule într-o
manieră controlată5. Având la îndemână o gamă atât de largă de biomateriale,
rămân însă dezavantaje cărora fiecare clinician trebuie să le facă față și care, în
final, conduc spre prognostic incert în procesul de vindecare. De aceea,
tratamentele curente încearcă să influențeze pozitiv rezultatul final prin
îmbunătățirea răspunsului gazdei la tratamentul, tehnica sau materialele instituite.
Terapia laser reprezintă, din acest punct de vedere, un instrument adjuvant de
mare valoare, întrucât poate acționa la nivel celular în țesutul receptor,
îmbunătățind rezultatul final din punct de vedere calitativ sau cantitativ. Utilizarea
terapiei laser în domeniul implantologiei are o aplicabilitate largă, datorită efectului
pozitiv pe care îl exercită radiația laser asupra proceselor de reparație tisulară.
Rolul fotobiomodulării în cadrul proceselor de vindecare, reparare și regenerare
osoasă au avut la bază studiile anterioare, care au demonstrat faptul că fibroblaștii
iradiați prin fotobiomodulare au produs o cantitate mai mare de colagen. Pe
același raționament, s-a mers mai departe, considerându-se că osteoblaștii iradiați
cu laser vor fi stimulați în vederea formării matricei osteoide. Indiferent de factorul
care a cauzat defectul osos, procesele de reparare de la acest nivel urmează
aceeași succesiune de etape. De asemenea, s-a observat că procese care apar
în vindecarea țesuturilor moi, au loc și la acest nivel: inflamație, fibroplazie,
remodelare. Spre deosebire de procesele de vindecare a țesuturilor moi, la nivel
osos, odontoblaștii și osteoclastele acționează prin reconstrucția și remodelarea
țesutului osos lezat. Datorită efectelor pozitive asupra metabolismului osos,
observate în special în cazul consolidării fracturilor, utilizarea laserului terapeutic
cu nivel energetic scăzut (denumit în continuare LLLT sau fotobiomodulare) a fost
încurajată în practica clinică. În plus, laserul pare să accelereze procesul de
reparare a fracturilor și produce o creștere a volumului calusului format și o
creștere a densității minerale osoase. Efectele legate de biomodulare includ
vascularizație crescută, creșterea activității osteoblastice, organizarea de fibre de
XXI
colagen și schimbări în nivelul mitocondrial si intracelular de adenozin trifosfat.

Este o metodă neinvazivă de a stimula osteogeneza și de a accelera vindecarea
defectelor osoase6-9.
Cercetarea prezentă urmărește o evaluare complexă a rezultatelor terapiei
laser cu nivel energetic scăzut, denumită actual fotobiomodulare, în domeniul
regenerării osoase. Studiul își propune evaluarea efectelor fotobiomodulării
asupra proceselor de reparare osoasă și obținerea de doze de tratament laser
aplicabile în practica curentă de regenerare osoasă ghidată. Obținerea acestui
deziderat se intenționează a fi realizată integrând în prezentul studiu mai multe
tehnologii cu specificitate și aplicabilitate în domeniul nostru de interes, și anume
micro-CT utilizând radiația Synchorotron, tomografia în coerență optică,
tomografia computerizată cu fasicul conic și standardul de aur în ceea ce privește
evaluarea calitativă a reparării osoase – analiza histologică. În felul acesta,
urmărim să evaluăm procesul de reparare osoasă în complexitatea sa, nu doar
din punct de vedere cantitativ sau al microarhitecturii osoase, ci și din punct de
vedere calitativ, al componenței și al gradului de mineralizare, pentru a obține o
vedere de ansamblu asupra rezultatelor obținute prin tehnica propusă. Integrarea
în cercetare a patru metode de investigare cu specificitate înaltă pentru domeniul
nostru de interes, în vederea obținerii unor rezultate cât mai concludente și lipsite
de erori, reprezintă o abordare nouă în cercetarea amănunțită a proceselor de
reparare și regenerare osoasă. La acestea, se adaugă nevoia realizării unor
investigații suplimentare în ceea ce privește efectele terapiei laser cu nivel
energetic scăzut în domeniul regenerării osoase ghidate, modul de interacțiune cu
diferitele materiale de substituție osoasă și sistematizarea unui protocol de lucru
versatil și reproductibil.
În cadrul acestei teme de cercetare au fost luate în considerare mai multe
obiective, pe baza cărora s-a întocmit graficul de realizare a cercetării, conform
etapelor și activităților planificate. S-au încheiat protocoale de colaborare cu
institute de cercetare internaționale în domeniile vizate de direcțiile de cercetare
stabilite, în vederea conlucrării pentru definitivarea activităților propuse, precum și
a confirmării și validării rezultatelor obținute. Definirea obiectivelor a fost realizată
ținând cont de evaluarea situației existente atât pe plan național, cât și
internațional, controlul și acoperirea riscurilor legate de utilizarea tehnologiei laser
în medicina dentară, estimarea aportului cercetării în ceea ce privește integrarea
în practica medicală curentă a unor tehnici noninvazive, lipsite de durere și cu
grad mare de acceptabilitate din partea pacientului.
Primul obiectiv a constat în realizarea unui model experimental care să
permită reproducerea studiului pe un număr suficient de subiecți, astfel încât
rezultatele să poată fi evaluate din punct de vedere statistic. Cele mai multe
XXII
cercetări realizate în direcția reparării și regenerării osoase se bazează pe studii

animale, cel mai investigat tip de animal fiind șobolanul. Pentru ingineria țesutului
osos, există un număr destul de redus de modele animale, majoritatea studiilor
folosind în prezent osul tibiei la șobolani. Studiul de față își propune să utilizeze
defecte create în calvaria animalelor de studiu, acesta fiind un model versatil, care
permite evaluarea biomaterialelor și a ingineriei țesutului osos abordate într-un sit
ortopedic reproductibil și lipsit de încărcare cu forțe mecanice. Acest tip de model
experimental aduce o contribuție substanțială în direcția reproducerii condițiilor
necesare studiului mecanismului biologic al regenerării osoase.
Cel de-al doilea obiectiv face referire la cunoașterea rolului și a
beneficiilor terapiei laser în cadrul procedurilor de augumentare și regenerare
osoasă. Pe plan național, utilizarea tehnologiei laser în medicina dentară a devenit
o preocupare și pentru medicii din cabinetele private, însă majoritatea le utilizează
pe baza unor informații tehnice și aplicative sumare, puse la dispoziție de către
firmele producătoare. Este deci necesară o formare profesională în această
direcție și o standardizare a protocoalelor de lucru, care să poate fi aplicată cu
ușurință în practica curentă de medicină dentară. Pentru a obține efectele dorite,
operatorul trebuie să stăpânească cunoștințe solide legate de utilizarea terapiei
laser, care includ: dozele de radiție, punctele de aplicare a acesteia, specificitatea
lungimii de undă indicate în tratamentele postchirurgicale, întrucât utilizarea
incorectă a radiației laser poate provoca efecte necontrolate la nivelul țesuturilor
orale. Din punct de vedere al proprietăților optice, țesuturile de la nivelul cavității
bucale nu sunt foarte omogene, aspect important de luat în considerare în calculul
dozei și a modului de administrare a radiației. Doza de radiație sau densitatea de
energie constituie cel mai important parametru al terapiei laser, având limitele sale
minime și maxime. Dacă se utilizează o doză laser insuficientă, efectele dorite nu
vor fi obținute; dacă, dimpotrivă, dozele sunt prea crescute, este posibil să apară
efecte negative sau un rezultat contrar. Rezultatele clinice sunt explicabile prin
intermediul unei reacții în lanț, atunci când discutăm despre aplicații cu efecte în
profunzime de milimetri-centimetri. Radiația laser monocromatică determină
absorbția selectivă de către cromofori, care răspund uneia sau mai multor lungimi
de undă, fenomen cunoscut sub denumirea de rezonanță la o anumită frecvență.
Unidirecționalitatea și coerența sunt alte două caracteristici care ne permit să
avem o mai mare densitate de putere, observând reacții diverse în zona aplicării
radiației laser. Existența acestor fotoreceptori nespecifici, care prezintă
sensibilitate pentru o anumită lungime de undă, a fost demonstrată încă din
secolul 20, în special în ceea ce privește lungimile de undă albastră și roșie.7 În
ciuda numărului tot mai mare de utilizări cu succes ale laserului terapeutic cu nivel
energetic scăzut în numeroase domenii, există relativ puține rapoarte cu privire la
XXIII
efectul lor asupra reparării osoase care sunt bazate pe dovezi. Efectele
biomodulării, în asociere cu biomateriale în procesele de reparare a defectelor
osoase, au nevoie de studii suplimentare, întrucât s-au constatat răspunsuri
diferite din partea organismului gazdă.
Un al treilea obiectiv și aspect particular al acestei cercetări îl constituie
stimularea colaborării cu centre internaționale specializate în acest domeniu, care
sunt interesate, la rândul lor, să-și aducă contribuțiile în aceste direcții de interes
medical. Se va obține astfel, o permanent informare în acest domeniu de vârf din
medicina dentară și un feed-back pentru rezultatele obținute, publicarea studiilor
multicenter având un rol determinant în implementarea eficientă a acestor metode
de tratament de avangardă. Acest obiectiv are la bază scopul final al activității de
cercetare fundamentală și aplicativă de mare complexitate desfășurată în
colaborare interdisciplinară, și anume acela de a obține o creștere a calității actului
medical, datorită încorporării tehnologiei laser ca și terapie dedicată în cabinetele
de medicină dentară.
În acest sens, metodele de evaluare și tehnologiile incluse în studiu
prezintă specificitate înaltă și aplicabilitate largă în domeniul nostru de interes.
Tomografia computerizată este o tehnică neinvazivă imagistică morfologică ce
poate cuantifica structura internă a unui obiect tridimensional. Aceasta oferă
imagini biologice cu rezoluții izotrope variind de la câțiva milimetri în aparatele
clinice de tomografie computerizată, până la câțiva zeci de micrometri în aparatele
de micro-CT din laboratoarele de cercetare, și în cele din urmă în aparate cu
radiație de tip sincrotron, rezoluția poate să coboare până mai jos de 100 nm. În
prezent, s-au produs multe îmbunătățiri în achiziționarea și analizarea de imagini
de micro-CT pentru structura osoasă trabeculară și a biomaterialelor utilizate în
regenerare osoasă. Utilizarea radiației synchorotron (SR) în relație cu micro-CT, în
locul radiațiilor X convenționale, a adus numeroase avantaje în ceea ce privește
calitatea imaginii și raportul dintre semnal și zgomot. Datorită proprietăților radiației
synchorotron, această metodă ne permite studierea simultană a microstructurii și
a mineralizării osoase, nu doar prin intermediul furnizării de imagini, ci și prin
tehnici de cuantificare și de măsurare a parametrilor ce țin de geometria și
topologia arhitecturii și a structurii osoase10.
Cea de-a doua metodă propusă de analiză a rezultatelor este reprezentată
de tomografia în coerență optică (OCT). Aceasta este o tehnică atractivă, non-
invazivă, prin care se pot obține imagini de rezoluții înalte, bazându-se pe
interferometria în coerență joasă (LCI), prin intermediul căreia se pot obține
secțiuni la scala micrometrică11. Tomografia în coerență optică extinde capacitățile
razelor X, păstrându-și caracterul de metodă neinvazivă, cu aplicabilitate atât în
practica medicinei dentare, cât și în domeniul cercetării științifice. Majoritatea
XXIV
studiilor realizate până în prezent utilizând această tehnologie includ atât imagini
ale structurilor dentare dure normale și patologice, cât și investigații ale calității
diverselor tratamente dentare. În acest sens, s-au evaluat defecte ale materialelor
de obturație, microinfiltrațiile de la nivelul interfeței dinte-obturație dentară,
calitatea adeziunii bracket-ului la țesutul dur dentar, restaurările protetice și
microinfiltrațiile de la nivelul dinte-restaurare protetică12-13. OCT-ul se mai folosește
pentru redarea imaginilor de la nivelul canalelor și a dentinei radiculare, pentru
prezența sau absența microinfiltrațiilor periapicale și pentru evaluarea
osteointegrării implantelor. Această metodă imagistică prezintă o sensibilitate
crescută comparativ cu alte metode de investigare în acest sens, motiv pentru
care este justificată integrarea sa ca parte componentă a prezentei cercetări.
Ambele metode imagistice au fost coroborate cu standardul de aur în ceea
ce privește analiza calitativă a vindecării osoase, examenul histologic al
eșantioanelor studiate.
În cele din urmă, rezultatele studiului experimental au fost completate cu
cele obținute în urma unei analize retrospective a vindecării osoase în cazul
pacienților supuși intervențiilor chirurgicale din sfera orală, care au primit ulterior
tratament prin fotobiomodulare, iar investigațiile computer tomograf cu fascicul
conic mi-au permis analiza modificărilor în densitatea minerală osoasă.
Prezentul studiu a urmărit, așadar, obținerea unei perspective reale asupra
tehnicilor și materialelor de uz curent în practica stomatologică, cu accent pe un
protocol predictibil de utilizare a radiației laser în cadrul proceselor de regenerare
osoasă ghidată, cu beneficii directe în rândul pacienților și al medicilor.
În prima parte a tezei sunt prezentate o serie de noțiuni din literatura de
specialitate, care reprezintă stadiul actual al cunoașterii în domeniul de interes, iar
în partea a doua sunt prezentate pe larg materialele, metodele și rezultatele
obținute prin cercetările personale.
PARTE GENERALĂ
STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII
Capitolul 1.
GENERALITĂȚI PRIVIND FIZIOLOGIA OSOASĂ ȘI
TEHNICILE DE REGENERARE OSOASĂ GHIDATĂ
1.1. FIZIOLOGIA ȚESUTULUI OSOS ȘI MECANISMUL BIOLOGIC AL

VINDECĂRII OSOASE
1.1.1. GENERALITĂȚI REFERITOARE LA ȚESUTUL OSOS

Osul este un țesut conjunctiv specializat cu o matrice extracelulară
mineralizată care funcționează pentru a oferi suport, formă și rigiditate
scheletului uman și pentru a furniza un depozit vast de calciu necesar pentru
homeostazia acestuia14. Oasele organismului uman au o compoziție complexă
care include celule, matrice extracelulară și lipide, aproximativ 20% fiind
reprezentat de apă, 30-35% substanța organică și 65-70% componentă
anorganică. Componenta celulară este reprezentată de osteoblaste, osteocite,
osteoclaste și celule precursoare osteogenice (celule osteoprogenitoare
mezechimale). Osteoblastele și osteoclastele se diferențiază din celulele stem
mezechimale, osteoblastele având multiple roluri, dintre care enumerăm
producerea de colagen, sinteza, depunerea și mineralizarea matricei
extracelulare, menținerea homeostaziei calciu-sânge și rolul de senzor
mecanic pentru organul osos. Osteoclastele multinucleate derivă din linia
macrofage-monocite, produc enzime proteolitice și exercită un rol deosebit în
resorbția, vindecarea și remodelarea osoasă, precum și în excreția de calciu și
fosfor. Celulele precursoare osteogenice, asemănătoare celulelor stem, sunt
derivate din celulele mezechimale și au capacitatea de a se diferenția în
osteoblaste mature și ulterior, osteocite. Faza organică a țesutului osos include
fibre de colagen de tip I, alte tipuri de colagen (tip III, tip IV), proteine
noncolagenice (proteoglicani, glicoproteine, fosfoproteine, osteonectina,
fibronectina, osteopontina, osteocalcina, fosfolipide), în timp ce faza
anorganică este în principal compusă din săruri minerale și calciu sub formă de
hidroxiapatită. Pe lângă acestea, regăsim 85% tricalciu fosfat, 10% carbonat
de calciu și 5% derivați precum fluoruri de calciu și de magneziu.
2
1.1.2. PROCESUL FIZIOLOGIC DE FORMARE OSOASĂ

Sunt descrise două tipuri de țesut osos: osul medular sau trabecular,
compus din trabecule osoase și osul compact sau cortical, care se alcătuiește
din sisteme haversiene. În cursul creșterii scheletale sau a proceselor de
vindecare osoasă, osul cortical, lamelar, dur, este precedat de o fază
temporară de matrice cu fibre de colagen neregulate și cristale de os
dispersate. Formarea țesutului osos matur și homeostazia acestuia are la bază
o bună vascularizație, cu anastomoze multiple intracorticale, între vasele
sanguine din medulară și cele din periost. Tiparul de formare osoasă cunoaște
două mecanisme principale: modelul de formare intramembranoasă și cel de
formare encondrală, existând și combinația dintre cele două. Diferența
esențială este reprezentată de faptul că formarea de tip intramembranos are
loc fără medierea unei faze cartilaginoase, sursa celulelor precursoare osoase
fiind stratul intern periostal (celulele precursoare mezechimale se diferențiază
direct în osteoblaste), în timp ce dezvoltarea encondrală presupune
diferențierea celulelor mezenchimale în condrocite, care vor secreta matricea
cartilaginoasă care stă la baza viitorului țesut osos. Acest proces complex de
formare encondrală se constituie în final, într-un țesut osos cu proprietăți
biomecanice superioare osului de origine intramembranoasă15.
Mecanismul intramembranos de formare osoasă presupune
transformarea membranei țesutului conjunctiv din celulele mezenchimale
nediferențiate în celule osoase și matrice. Cele mai precoce semne de
osificare intramembranoasă apar în cea de-a șasea săptămână de sarcină, în
etapa de debut a formării osului mandibular. Acest mecanism de formare
osoasă este tipic oaselor craniului uman, sfenoidului și mandibulei, însă nu
exclude existența unei osificări endocondrale, care are loc în același timp.
Etapele mecanismului intramembranos de formare osoasă sunt următoarele16:
- apariția unui centru de osificare în membrana de țesut conjunctiv
fibros; celulele mezenchimale încep diferențierea în celule specializate, în
capilare, celule osteogenice și osteoblaste, formând un centru de osificare;
- este secretată matricea osoasă (osteoid), la nivelul membranei
fibroase, de către osteoblaste; în cateva zile, matricea osoasă se va
mineraliza, iar osteoblastele rămase captive vor deveni osteocite;
- se formează țesutul osos și periostul, cu încapsularea celulelor și a vaselor
de sânge și cu acumularea unei rețele trabeculate osoase; periostul ia naștere prin
condensarea mezenchimului vascular pe fața externă a osului format;
- continuă producția de țesut osos, prin apoziția realizată de către
osteoblastele din periost pe fața externă a țesutului deja existent; țesutul osos
3
imatur este ulterior înlocuit cu os lamelar matur, iar osul spongios, format din
trabecule distincte, persistă intern și țesutul său vascular devine măduva roșie;
- calcificarea osteoidului, care are rolul de a-l transforma într-un țesut
relativ impermeabil, a cărui nutriție este asigurată în continuare de rețeaua
vasculară internă;
- formarea unei membrane externe cu rol de protecție, a cărei
distrugere poate cauza moarte celulară și pierdere osoasă.
Formarea osoasă de tip intramembranos este mediată de către
structurile mezenchimale scheletogene și este aproape integral controlată prin
factori locali (musculari, de presiune, limbă, nervi) și indirect, prin osificarea
endocondrală. Factorii genetici au o influență redusă, influențând doar
dimensiunile externe osoase și episoadele de creștere.
Setiawati și colab.16 descriu foarte sistematic și mecanismul encondral de
formare osoasă, tipic oaselor lungi, care are la bază formarea inițială a unui țesut
cartilaginos, înconjurat de pericondru și care ulterior se transformă în periost. În
funcție de localizarea mineralizării, aceasta poate fi pericondrală sau encondrală,
ambele fiind întâlnite în formarea oaselor lungi, însă numai osificarea encondrală dă
naștere oaselor scurte. Etapele de formare sunt următoarele:
- Gruparea celulelor mezenchimale sub forma șablonului viitorul os;
- Diferențierea celulelor mezenchimale în condrocite;
- Hipertrofierea condrocitelor și formarea matricei cartilaginoase cu
zonă centrală calcificată;
- Formarea vaselor sanguine, care asigură nutriția pericondrului și
stimulează celulele osteoprogenitoare de la acest nivel să producă
osteoblaste, care vor transforma pericondrul în periost și vor iniția
formarea centrelor de osificare;
- Continuă dezvoltatea periostului și divizia celulară, ceea ce asigură
creșterea producției matricei osoase; membrana pericondrului
dezvoltă noi condroblaști, care asigură creșterea apozițională, iar
celulele centrale determină calcificarea.
Acest proces complex de formare osoasă encondrală este determinat

în principal de factori genetici, factorii locali putând doar să influențeze forma și
direcția de osificare a cartilajului16.
1.1.3. PROCESUL DE VINDECARE OSOASĂ

Pentru a dezvolta noi metode terapeutice, pentru a le îmbunătăți pe
cele existente și pentru a utiliza în mod corect biomaterialele disponibile la ora
actuală, este necesar a se cunoaște prototipul de vindecare și de regenerare
4
osoasă care are loc în cazul unui defect existent. Acest proces complex
implică interacțiunea dintre celule, factori de creștere și matrice extracelulară și
constă în faze multiple și bine organizate, care încep imediat după ce defectul
a luat naștere, debutând cu răspunsul inflamator local, care este urmat de
mobilizarea celulelor hematopietice și stem mezenchimale, care vor forma o
nouă rețea vasculară, urmată de o matrice de țesut moale și, în final, vor
induce formarea de os nou17-20(tabel 1). Biologia țesutului osos ne indică o
structură histologică dinamică, adaptată la procesele metabolice locale, prin
intermediul celulelor osoase implicate în procesele de resorbție și de
neoformare. S-a arătat faptul că activitatea osteocitelor și cea a osteoclastelor
durează de la câteva zile la câteva săptămâni, timp în care la nivelul lacunelor
celulare apar osteoclastele cu rol de resorbție a țesuturilor inactive, formând o
suprafață la nivelul căreia vor acționa osteoblastele, prin formarea de lamele
concentrice de os compact imatur, respectiv lamele rectilinii de os spongios,
care se vor mineraliza dupa 1-2 zile4,21. Toate cele 4 componente majore ale
unei plăgi osoase, incluzând osul cortical, osul medular, periostul și țesutul
moale învecinat contribuie la procesul de vindecare osoasă în maniere diferite,
care depind de parametri precum factorii de creștere, hormonii și nutrienții, pH,
stabilitatea mecanică etc22.
Din punct de vedere cronologic, procesul de vindecare osoasă
parcurge câteva etape a căror cunoaștere este de o importanță majoră17:
- Imediat după trauma osoasă, prejudiciul adus rețelei vasculare locale
este responsabil de formarea unui cheag de sânge sau a unui
hematom, care va avea în componența sa trombocite, leucocite,
macrofage, fibrină, factori de creștere și citokine, care vor forma o
matrice ce permite migrarea celulelor inflamatorii, a celulelor
endoteliale și a fibroblaștilor.
- Prima etapă în vindecarea fracturilor osoase este reprezentată de faza
inflamatorie, care debutează în primele 12-24h, are punctul culminant la
24h și durează aproximativ 7 zile. Această etapă este caracterizată de o
fază destructivă, cu răspuns local marcat inflamator și hipoxie, de care
sunt responsabile primele celule ajunse la nivelul plăgii, neutrofilele,
urmate fiind de macrofage și limfocite. Rolul macrofagelor este acela de a
fagocita țesuturile necrotice și de a elibera factori de creștere și citokine,
care vor iniția procesul de vindecare osoasă23. Factorii de creștere
implicați în acest proces sunt: factorul de creștere TGF-β, factorul de
creștere vascular endotelial VEGF, factorul de creștere derivat din
trombocite PDGF, interleukinele 1 și 6 (IL-1, IL-6), factorul de necroză
tumorală TNF-α, proteinele morfogenetice osoase BMP, factorul de
5
creștere fibroblastic FGF, factorii de creștere insulin-like IGF-1 și IGF-2.

Aceștia stimulează migrarea celulelor stem multipotente, care vor induce
diferențierea celulară în celule mezenchimale de tipul angioblastelor,
condroblastelor și osteoblastelor20,23.
- Etapa următoare este una constructivă, caracterizată de formarea de
noi vase de sânge și organizarea trombilor în țesut de granulație, care
va folosi drept suport de formare a matricei osteoide. Din acest moment
înainte, vindecarea poate urma două căi distincte, în funcție de tipul
osului afectat, de morfologia și structura osoasă, precum și de metoda
de fixare. Una din posibilitățile de evoluție este reprezentată de
osificarea intramembranoasă, care este o vindecare primară, în cadrul
căreia osteoblastele secretă matrice osteoidă, care se va mineraliza
ulterior. Cealaltă posibilitate de evoluție este cea prin osificarea
encondrală, care este o vindecare secundară, ce presupune formarea
unei matrici cartilaginoase de către condroblaste, care va fi ulterior
înlocuită de matrice osteoidă22-24.
Schmidt-Bleek25 a sintetizat, în 2014, acest proces complex complex și

dinamic de vindecare osoasă în cinci etape reprezentative, care se pot
suprapune în timp: faza de formare a hematomului (faza pro-inflamație), faza
antiinflamatoare, faza de formare a calusului moale (faza proliferativă), faza de
formare a calusului dur (maturizare sau modelare) și faza de remodelare. Pe
parcursul acestor etape, numeroase procese la nivel intracelular, celular și
tisular se coordonează pentru a restabili forma și funcția osului, la nivel de
organ. La nivel intracelular, moleculele de semnalizare interacționează pentru
a activa genele specifice, cu rol de determinare a funcțiilor celulare. La nivel
celular, au loc proliferarea, migrarea, diferențierea celulară și sinteza matricei
extracelulare. La nivel tisular, osul, cartilajul și țesuturile fibroase sunt
organizate în vederea creării spațiului extracelular necesar vindecării osoase26.
Există numeroși factori care pot influența parcursul acestui proces complex de
vindecare: spre exemplu, tiparul de vindecare osoasă poate fi influențat de
numărul celulelor prezente în regiunea de vindecare, de capacitatea acestora
de migrare și de proliferare, precum și de cantitatea de matrice extracelulară
produsă de diverse fenotipuri celulare26. Factorii de creștere joacă de
asemenea un rol determinant, prin capacitatea de a modela activitatea celulară
și a intermedia comunicarea intercelulară. Un singur factor de creștere poate
exercita efecte diferite pe mai multe tipuri celulare, ceea ce rezultă în
inducerea de funcții diferite și o cascadă de interacțiuni extrem de complexe.
Pentru o mai bună înțelegere a acestora, s-a încercat realizarea unor modele
6
computerizate care să simuleze comportamentul și rezultatele obținute prin

varierea acestor factori. Bailón-Plaza a fost cel care, în 2001, a prezentat, în
premieră, un astfel de model matematic bidimensional, cu scopul de a analiza
influența a doi factori de creștere asupra tiparului de vindecare osoasă în caz
de fractură: proteinele morfogenetice osoase 2 și 4, respectiv factorul de
creștere β-1. Faza inflamatorie și etapele de regenerare au fost simulate prin
modelarea migrării celulelor mezechimale, a proliferării condrocitelor și
osteoblastelor, precum și diferențierea, sinteza și degradarea matricei
extracelulare pe parcursul vindecării. Modelul creat ajută la întelegerea
importanței factorilor de creștere în procesul de vindecare și reparare osoasă,
până la osificarea completă27.
Studiile ulterioare au încercat să supună modelului matematic
parametrii care pot influența un alt proces determinant în cadrul reparării
osoase, cel de angiogeneză. Progresia vindecării osoase este în strânsă
legătură cu revascularizația zonei, care are loc prin formarea de noi capilare
vasculare. Modelul creat a încercat să demonstreze faptul că celulele
endoteliale sunt atrase de gradientul factorilor de creștere vasculari endoteliali,
care sunt secretați de către condrocite și osteoblaste, așadar o angiogeneză
compromisă conduce la o vindecare osoasă precară28. Autorii nu au luat însă
în calcul influența factorilor mecanici asupra angiogenezei și a producției de
factori de creștere26. Studiile ulterioare au încercat să ia în considerare acest
aspect, în special în ceea ce privește producția de proteinele morfogenetice
osoase BMP-229.
Tabel 1. Factori biologici implicați în regenerarea osoasă, după 17

Molecula de Etapa în care Celulele
Sursa Funcția
semnalizare se exprimă țintă
Citokine (IL- Niveluri înalte Macrofage Celule ►Efect chemotactic la nivelul altor
1,IL-6, TNF-α) între zilele 1-3
Celule inflamatorii mezenchimale celule inflamatorii
și pe parcursulCelule de origine și inflamatorii ►Stimularea sintezei de matrice
remodelării mezenchimală extracelulară, angiogenezei,
osoase recrutarea de celule endogene
fibrogenice în zona defectului osos și
resorbție osoasă în etapele târzii
Factorul de Se exprimă din Trombocite de Celule ►Potențează valența mitogenică și
creștere etapele degranulare stromale chemotactică a celulelelor
TGF-β incipiente, pe Celule inflamatorii, multipotente precursoare osoase și cea
tot parcursul matrice (MSC), chemotactică a macrofagelor
vindecării extracelulară. celule osteo-
osoase Condrocite, progenitoare,
osteoblaste osteoblaste,
condrocite
7
Molecula de Etapa în care Celulele

Sursa Funcția
semnalizare se exprimă țintă
Factorul de Se eliberează în Trombocite de Celule ►Efect mitogenic pentru celulele
creștere etapele degranulare mezenchimale mezenchimale și osteoblaste
derivat din incipiente Macrofage , celule ►Efect chemotactic pentru celulelele
trombocite Monocite (în inflamatorii, inflamatorii și mezenchimale
PDGF timpul etapei de osteoblaste
granulare)
Celule endoteliale,
osteoblaste (în
etapele ulterioare)
Proteina Numeroase Celule Celule Diferențierea celulelor mezechimale
morfogenetic patternuri de mezenchimale și mezenchimale nediferențiate în condrocite și
ă osoasă eliberare pe osteoprogenitoare și osteoblaste și a osteoprogenitorilor în
BMP parcursul , osteoblaste, osteoprogenit osteoblaste.
vindecării matrice osoasă oare,
extracelulară și osteoblaste
condrocite
Factorul de Se eliberează Monocite, Celule Efect angiogenic și mitogenic pentru
creștere din etapele macrofage, celule mezenchimalecelulele mezenchimale și epiteliale,
fibroblastic incipiente, până mezenchimale, și epiteliale,
osteoblaste, condrocite
FGF la formarea osteoblaste, osteoblaste,α-FGF au rol esențial în proliferarea
osteoblastelor condrocite condrocite condrocitară
β-FGF au rol în maturarea
condrocitelor și resorbția osoasă
Factorul de Se exprimă de- Matrice osoasă, Celule IGF-I: recrutarea și proliferarea
creștere a lungul celule endoteliale stromale celulelor mezenchimale și
insulin-like perioadei de și mezenchimale multipotente osteoprogenitoare
IGF vindecare (în etapa de (MSC), celule IGF-II: proliferare celulară și sinteza
osoasă și pe granulare), endoteliale, proteinelor
durata formării osteoblaste și osteoblaste,
osoase condrocite non- condrocite
encondrale hipertrofice (în
formarea de
cartilaj și os)
Factorul de Se exprimă pe Matrice osoasă, Celule Potențează stimulatorii de proliferarea
creștere perioada celule endoteliale endoteliale a celulelor endoteliale
vasculară formării osoase și mezenchimale progenitoare
endotelial encondrale
VEGF
Angiopoietin Se exprimă din Celule Celule Formarea de structuri ale vaselor
a I și II etapele inițiale, extravasculare endoteliale sanguine mari, dezvoltarea de ramuri
pe tot parcursul progenitoare colaterale din cele existente
vindecării
osoase
8
1.1.4. PARTICULARITĂȚI ALE OSULUI ALVEOLAR

Osul alveolar reprezintă partea scheletului cranian specializat în a oferi
suportul primar dinților. Osul alveolar este compus din straturi osoase
orientate paralel cu direcția corono-apicală a dintelui, având o densitate mai
mare în zona mandibulară frontală și o densitate mult mai scăzută în zona
maxilară posterioară. Defectele osoase de la nivelul mandibulei și maxilei pot
rezulta în urma acțiunii mai multor factori, dintre care cei mai comuni sunt
extracția dentară, traumele, boala parodontală, rezecțiile în cazul tumorilor
orale, anomalii congeniale14. Cel mai adesea însă, țesutul osos suferă
modificări în urma unei manopere de rutină, care constă în extracția unui dinte
de pe arcadă. Dimensiunea alveolei dentare influențează timpul de vindecare,
o alveolă de dimensiuni mari cerând un timp de vindecare mai lung, în timp ce
înălțimea și lățimea acesteia vor suferi pierderi dimensionale, cu modificarea
reliefului osos spre oral, comparativ cu forma sa inițială. Tiparul de resorbție
osoasă consecutiv unei extracții dentare este unul predictibil: principalul sit de
resorbție este corticala vestibulară, cu o predispoziție inițială de a pierde în
lățime și ulterior, în înălțime14. Modificările locale pot fi sintetizate, pentru o mai
bună înțelegere, în intra-alveolare și extra-alveolare.
Procesele intra-alveolare consecutive extracției dentare sunt
următoarele30:
- Alveola dentară postextracțională este ocupată în 24h de un cheag de
sânge;
- În 2-3 zile, cheagul suferă modificări de contracție și distrugere sub
forma țesutului de granulație;
- După 4-5 zile, țesutul de granulație acoperă osul alveolar și epiteliul
începe să prolifereze de la marginile țesutului moale, cu tendința de a
acoperi țesutul de granulație;
- La finalul primei săptămâni, țesutul osteoid este evident în zona
apicală a alveolei postextracționale, împreună cu o rețea vasculară și
țesut conjunctiv tânăr;
- După 3 săptămâni, alveola este ocupată în întregime de țesut
conjunctiv, țesutul osteoid începe mineralizarea și suprafala alveolei
este epitelizată;
- După 6 săptămâni se observă formarea de trabecule osoase, formarea
de os fiind evidentă după aproximativ 2 luni;
- Depunerea osoasă scade în intensitate după 4-6 luni, dar continuă, în
ritm mai lent, pentru câteva luni.
9
La nivel extralveolar, mecanismul de vindecare osoasă implică câteva

procese30 :
- În săptămâna consecutivă extracției unui dinte cu decolarea
concomitentă a unui lambou mucoperiostal, se observă o creștere
semnificativă în cantitatea de osteoclaste de pe pereții interni și externi
ai alveolei dentare postextracționale;
- Două săptămâni mai târziu, osteoclastele sunt prezente, alături de
țesutul conjunctiv tânăr, și de țesut osos imatur, care va fi înlocuit în
săptămânile 4-8 de țesut osos trabecular;
- După 8 săptămâni osul cortical acoperă alveola postextracțională, însă
pereții externi încă suferă procese de resorbție osoasă;
- Lățimea crestei osoase scade la 50%, două treime din această
remodelare având loc pe parcursul primelor 3 luni;
- Înălțimea alveolei scade cu 0.7-1.8 mm, mai accentuat pe versantul
bucal decât pe cel oral;
- Rata de resorbție osoasă în primul an după extracție este de 10 ori mai
rapidă decât în anii care urmează.
Datele prezentate anterior sunt confirmate și de către un studiu

exhaustiv de review de literatură, realizat de Weijden31 în 2009, în care au fost
incluse peste 1000 de lucrări de specialitate. Studiul arată că piederea osoasă
medie în ceea ce privește lățimea crestei osoase postextracționale este de
3.87 mm. Pierderea osoasă medie, în înălțime, măsurată la mijlocul alveolei
postextracționale, este de 1.67 mm. Această modificare în înălțime, măsurată
radiologic, are o valoare medie de 1.53 mm. Vindecarea alveolei
postextracționale prin formarea de țesut osos, în termeni de înălțime, se ridică,
în medie, la 2.57 mm de la podeaua alveolei.
Majoritatea studiilor care s-au concentrat pe această problemă au
concluzionat că 40-60% din pierderea osoasă consecutivă extracției dentare
apare în primii trei ani, după care rata de resorbție scade la 0,25-0,5% anual.
În cazul dentiției temporare, dacă se va extrage un molar temporar care nu
are succesor permanent, pierderea grosimii osoase este de 25% în primii trei
ani după extracție, urmată de 4% în următorii trei ani14.
10
1.2. PREVENIREA RESORBȚIEI ALVEOLARE ȘI CONCEPTUL DE

REGENERARE OSOASĂ GHIDATĂ
Numeroasele modificări intra- și extra-alveolare prezentate anterior

evidențiază importanța pregătirii și executării corecte a acestei manopere
dentare considerată de rutină, extracția dentară. Înainte de momentul
extracției, o examinare clinică și radiologică corectă și completă aduce
informații importante, care pot modifica parcursul și prognosticul manoperei.
Aceasta trebuie executată cât mai atraumatic posibil, atât în ceea ce privește
țesuturile dure, cât și pe cele moi. Pentru rezultate optime, se recomandă
proceduri de menținere a osului alveolar postextracțional, prin utilizarea de
substituenți osoși, membrane de colagen, sau chiar plasarea imediată a
implanturilor dentare. Este cunoscut și unanim acceptat faptul că un implant
dentar are nevoie, pentru o stabilitate în timp, de o grosime de 2 mm de os de
jur-împrejurul său. Dacă dimensiunea pereților osoși înconjurători este mai
mică, cel mai probabil, rezorbția osoasă va apărea32. La aceasta se adaugă
cantitatea și calitatea țesuturilor moi acoperitoare și biotipul gingival33.
Atitudinea terapeutică de la momentul extracției dentare poate, așadar, să
modifice radical parcursul vindecării osoase, arătându-se, în urmă cu mulți
ani34,35, beneficii evidente chiar și după plasarea unei membrane de colagen
capabile să împiedice creșterea epitelială, fără a adăuga subsituente osoase și
a folosi tehnici de regenerare osoase complexe. Cea mai simplă strategie în
menținerea osului alveolar se dovedește a fi prevenirea resorbției osoase
consecutivă unei extracții. În acest sens, s-au imaginat metode care nu
utilizează materiale de adiție, ci implică, spre exemplu, menținerea rădăcinilor
dentare la nivelul osului alveolar36,37, autotransplantarea dinților38 sau
închiderea ortodontică a spațiului edentat39, toate aceste tehnici fiind deja
documentate de peste 20 sau 30 ani.
În cazul în care metodele de prevenire a resorbției osului alveolar nu au
fost instituite, consecințele sunt reprezentate de defecte osoase a căror
reconstrucție reprezintă o provocare curentă. Opțiunea de reconstrucție a
defectelor osoase cranio-maxilo-faciale are la bază câteva procese fiziologice
fundamentale, care trebuie cunoscute și însușite de către operator14:
- Osteoinducția reprezintă un proces prin care are loc producția de os
nou într-o regiune unde acesta lipsește, prin diferențierea unui țesut
nediferențiat în țesut osos. Fenomenul a fost inițial descris de către
Urist în lucrările sale40-42. Ulterior, în 1982, rolul esențial al proteinei
morfogenetice osoase (BMP) a fost descoperit și explicat ca fiind cauza
acestui fenomen43.
11
- Osteoconducția reprezintă procesul de formare osoasă prin dezvoltarea

capilarelor și a celulelor osteoprogenitoare din situl receptor către, în jurul și
printr-o grefă. Grefa acționează, așadar, ca o schelă în construcția osoasă
viitoare. Spre deosebire de osteoinducție, osteoconducția poate avea loc
doar într-o regiune în care există deja țesut osos. Grefele utilizate în acest
scop pot fi autologe, alogene sau aloplastice.
Conceptul regenerării tisulare ghidate este unul relativ vechi, primele

noțiuni fiind datate în jurul anului 1940 și făcând referire la regenerarea
neurală44. În anul 1957, conceptul se extinde în sfera regenerării osoase, o
dată cu experimentul lui Murray45, care demonstrează capacitatea
organismului de a repara defecte osoase realizate în osul iliac al câinilor, cu
ajutorul unor menținătoare de spațiu din plastic. Murray arată chiar posibilitatea
de a crea un volum de os mai mare decât cel existent natural, dacă
menținătorul de spațiu este prevăzut ca atare, procedeu adus în discuție și în
studii de dată recentă46. În 1959, tehnica era deja implementată pe subiecți
umani, de către Hurley și colegii săi47, punând bazele tehnicilor de regenerare
osoasă ghidată, care se folosesc și astăzi în implantologie. În următorii 20 de
ani conceptul compartimentării pentru a asigura regenerarea diferitelor tipuri de
țesuturi a fost intens studiat46. În domeniul medicinei dentare și al chirurgiei
orale în mod special, Philip Boyne a fost printre primii cercetători care a pus
bazele regenerării tisulare ghidate (GTR), în anii 1960, testând împreună cu
Bassett filtre de acetat de celuloză cu microporozități pe post de bariere în
cursul vindecării osoase a defectelor mandibulare46,48-49. Necesitatea utilizării
unei bariere în cursul procesului de regenerare osoasă a fost evidențiată
ulterior studiilor lui Linghorne și O'Connell50 din 1950, care au grefat defecte
parodontale, fără utilizarea niciunei membrane și au observat ca și condiție
esențială pentru o vindecare osoasă favorabilă, poziționarea coronară a
atașamentului epitelial față de defectul osos, pentru a preveni invazia celulelor
epiteliale de la nivelul gingiei atașate. Astfel a luat naștere criteriul excluderii
epiteliale, care stă la baza tehnicilor actuale de regenerare osoasă ghidată. O
altă concluzie în sprijinul aceleiași idei a fost formulată de către Karring51 și
Nyman52 în anii 1980, care au utilizat membrane barieră în cursul tehnicilor de
regenerare parodontală și au observat că primele celule care populează
defectul osos sunt cele care vor determina tipul țesutului care va ocupa spațiul
respectiv, iar viteza de migrare a celulelor epiteliale este dovedită a fi de 15 ori
mai mare decât a celulelor precursoare osoase53. Dahlin54 și grupul său de
cercetători au publicat rezultate consistente în acest sens: în 1988 au studiat
vindecarea defectelor osoase la șoareci Sprague-Dawley comparativ, cu și
12
fără acoperirea defectelor cu membrane ramforsate cu titan de tip PTFE și au

concluzionat o creștere semnificativă în regenerarea osoasă a defectelor
acoperite. Doi ani mai târziu55, aceștia au aplicat principiile regenerării tisulare
ghidate în cazul adițiilor osoase în jurul spirelor expuse ale implanturilor
inserate în tibiile iepurilor testați, acoperind augumentarea cu membrane PTFE
sau nu, în funcție de grupul de studiu. Perioadele de vindecare incluse în
studiu au fost de 6, 9 și 15 săptămâni, iar evaluarea histologică a evidențiat o
vindecare superioară în cazul utilizării membranelor ramforsate, cantitatea de
nou os format fiind în legătură directă cu spațiul asigurat prin conformarea
membranei la nivelul defectului.
Având în vedere complexitatea procesului de vindecare osoasă și
varietatea biomaterialelor și a membranelor utilizate în tehnicile de regenerare
osoasă ghidată, cu rezultate și efecte diferite, particularitățile acestora vor fi
dezvoltate în subcapitolele următoare.
1.3. MATERIALE DE SUBSTITUȚIE OSOASĂ ȘI MEMBRANE

UTILIZATE ÎN TEHNICILE DE REGENERARE OSOASĂ GHIDATĂ
În prezent, augumentarea osoasă este utilizată pe scară largă, având la

dispoziție numeroase alternative de materiale folosite ca subsituent al osului
natural al pacientului. Dintre cele mai frecvente tehnici utilizate, enumerăm:
augumentările cu blocuri osoase, augumentările cu grefe aloplastice (materiale
sintetice) sau cu xenogrefe (materiale de proveniența animală), regenerarea
osoasă ghidată, osteodistracția.
Din punct de vedere al poziționării la nivelul zonei receptoare, grefele pot fi56:
 de adiție sau grefe onlay (se poziționează peste zona receptoare, în
vederea creșterii înălțimii sau a lățimii),
 de augumentare sau grefe inlay (grefa se insera într-un defect osos)
 de interpoziție (în procedeele de bone-splitting).
1.3.1. AUTOGREFELE OSOASE

Între materialele de adiție osoasă disponibile, standardul de aur rămâne
osul autolog, datorită proprietăților sale osteoinductive, osteoconductive și
osteogenice deosebite57. Există însă și numeroase dezavantaje ale utilizării
grefei autologe, între care enumerăm: disponibilitatea intraorală limitată
cantitativ, nevoia de anestezie generală în cazul prelevării de grefă din situri
extraorale, morbiditatea sitului donor, timpul operator prelungit, necesitatea a
13
două plăgi operatorii, eventuala resorbție a grefei, precum și complicațiile

intraoperatorii și postoperatorii posibile57.
Grefele osoase libere îndeplinesc rolul de suport pentru viitorul țesut
osos, având așadar proprietăți osteoconductive mai pronunțate decât cele
osteoinductive, deși potențialul osteogenic există în partea spongioasă a grefei
recoltate58. Există două tipuri de grefe libere autologe: corticale și medulare.
Buchardt58 a sintetizat în urmă cu mulți ani diferențele esențiale dintre acestea:
- grefele de medulară se vascularizează mai rapid și complet, comparativ
cu grefele corticale;
- mecanismul de înlocuire a unei grefe medulare implică inițial o fază de
apoziție osoasă, urmată de una de resorbție, în timp ce grefele corticale
urmează un proces invers;
- grefele medulare tind să se vindece complet pe parcursul timpului, în
vreme ce grefele corticale persistă sub forma unui amestec de os viabil
și os necrotic.
Există însă și alte diferențe importante care trebuie luate în considerare

în momentul realizării planului terapeutic, între care menționăm capacitatea
grefelor corticale de a rezista mai devreme forțelor mecanice, deși se
vascularizează mult mai greu59. Autogrefele corticale sunt de preferat în
situațiile în care este necesară reconstituirea conturului natural osos, acolo
unde există defecte osoase cu pierderea grosimii și/sau a înălțimii crestei
osoase. Acestea pot fi incluse în planul terapeutic sub formă de inlay sau onlay
care să redea conturul osos necesar. Situsurile cele mai indicate pentru
recoltarea grefelor autologe libere sunt următoarele: bolta craniană, coastele și
fața medială sau laterală a părții anterioare a crestei iliace, creasta iliacă
posterioară, precum și regiunile intraorale - simfiza mandibulară, ramul
mandibular și zona retromolară, procesul coronoid, tuberozitatea maxilară,
torusurile maxilare palatinale sau cele mandibulare, osul zigomatic 60-64.
Alegerea sitului donor este condiționată, de foarte multe ori, de cantitatea /
volumul de grefă necesar: în cazul grefelor de mici dimensiuni, sunt preferate
sursele intraorale, pentru care anestezia locală este suficientă și morbiditatea
postoperatorie mai scăzută. Dacă este necesar un volum mai mare de grefă
osoasă, se va alege sursa extraorală, dintre care creasta iliacă rămâne o sursă
optimă, pentru care s-au dezvoltat tehnici de recoltare a unei cantități mari, cu
minim de disconfort și comorbiditate: cu ajutorul unui trepan utilizat transcutan,
printr-o incizie de 1 cm, se pot recolta până la 7 grefe osoase de 4 până la 30
mm, iar dacă se folosesc ambele creste iliace, cantitatea se poate dubla14.
14
1.3.2. XENOGREFELE OSOASE

Dezavantajele utilizării autogrefelor osoase au condus la nevoia
dezvoltării de materiale și tehnici alternative. Xenogrefele osoase se constituie
în țesut recoltat de la o specie și utilizat în situl receptor al altei specii. Cele mai
des folosite surse în acest sens sunt oasele provenite de la mamifere și
scheletele de corali14, acestea urmând un proces riguros de deproteinizare și
de îndepărtare a componentei organice, responsabilă de antigenitatea
declanșată în țesutul gazdă.
Dintre xenogrefele studiate, osul anorganic de proveniență bovină este
materialul cel mai îndelung cercetat și utilizat, datorită asemănării sale cu osos
uman și a avantajelor legate de disponibilitate și de ușurința tehnicii operatorii.
Studiile anterioare au demonstrat asemănarea osului bovin anorganic cu
matricea mineralizată a osului uman, iar proprietățile osteoconductoare ale
acestui tip de material de subsituție osoasă au condus in vivo, la formarea de
os nou pe termen lung. Porozitatea materialului mărește aria de contact,
favorizând migrarea unui număr mare de celule în jurul particulelor de grefă și
acționâd ca un suport pentru formarea de os nou. Studiile asupra acestui tip de
material 65-68 au arătat o reacție de corp străin cu prezențe moderate de celule
gigante, care acționează ca macrofage fagocitare, curățând suprafața grefei și
favorizând aderarea celulelor și formarea de os nou. Resorbția acestui tip de
material este foarte lentă, fiind aparent în legătură cu cantitatea de os nou
format65.
Un material xenogen interesant (Biocoral) a fost dezvoltat din scheletul
coralilor din recifele apelor nepoluate din New Caledonia, produsul rezultat
după prelucrare având în componența sa carbonat de calciu și exercitând
proprietăți oesteoconductive. Atât forma particulată, cât și cea de bloc osos
sunt incorporate în masa osoasă și înlocuite de os nou format, cu ajutorul
enzimei anhidrază carbonică, secretată de către osteoclaste și responsabilă de
distrugerea acestui material. Timpul raportat necesar acestei înlocuiri, cu
regenerarea osoasă concomitentă, este de 18 luni 69.
1.3.3. ALOGREFELE OSOASE

Alogrefele osoase reprezintă țesut osos recoltat de la un individ și
transplantat la un alt individ, în cadrul aceleiași specii. Există trei forme
principale de os alogenic: proaspăt congelat, uscat congelat și matrice osoasă
demineralizată. Prima formă este extrem de rar folosită, datorită posibilității
transmiterii bolilor virale. Riscul calculat de transmitere a HIV prin intermediul
unei grefe osoase uscate demineralizate este de 1 la 2.8 miliarde70.
15
Osul alogenic obținut prin uscare și congelare prezintă rezistență

mecanică și osteoconductivitate, însă nu are proprietăți osteoinductive și
osteogenice, motiv pentru care este necesară asocierea cu celule
osteocompetente. Acest deziderat se obține, în reconstrucția defectelor mari
cranio-faciale, prin asocierea grefelor autologe cu cele alogene14.
Procesul de demineralizare a osului alogen uscat și înghețat conduce
la obținerea unei grefe (DBM) care și-a pierdut proprietățile mecanice inițiale,
dar care mai poate prezenta calități osteoinductive. Prin îndepărtarea
componentei minerale de la nivelul matricei osoase, se pot expune proteine
precum BMP, cu rol esențial în regenerarea osoasă. Grefe de tipul DBM se
prezintă și în asociere cu diverși carrieri precum colagen sau polimeri, sub
formă de burete sau putty (chitoasă), deci cu o manevrabilitate mult
îmbunătățită și cu o retenție și stabilitate superioare la nivelul sitului receptor14.
1.3.4. GREFELE SINTETICE/ALOPLASTICE

Materialele sintetice au tendința de a fi utilizate ca grefe osoase din
cauza unor avantaje, cum ar fi, de exemplu lipsa de contaminare,
biodisponibilitatea bună, ușurință în manevrare și o bună acceptare de către
pacient. O altă proprietate importantă este capacitatea de a adăuga
medicamente, celule și molecule într-o manieră controlată. Cele mai utilizate
grefe sintetice sunt hidoxiapatita, alte ceramici și polimeri5.
Hidroxiapatita este un material ceramic, cu diverse forme în funcție de
dimensiunea porilor, precum și de timpul de resorbție. Structura sa poroasă
permite dezvoltarea rapidă a țesutului fibro-vascular, ceea ce ajută la
stabilizarea grefei împotriva mișcărilor. Aplicațiile sale clinice sunt largi,
cuprinzând grefarea defectelor osoase, menținerea dimensiunii procesului
alveolar consecutiv extracției dentare și procedee de regenerare osoasă
ghidată, în asociere cu grefele autologe. Deși elimină disconfortul creat de
morbiditatea sitului donor în cazul grefelor autologe, hidroxiapatita a arătat
probleme legate de insuficienta resorbție pe termen lung14. Numeroase
cercetări au încercat să îmbunătățească proprietățile hidroxiapatitei, prin
adăugarea de co-produși, dintre care colagenul și-a demonstrat numeroasele
avantaje, biomaterialele obținute prin alăturarea celor doi compuși având o mai
bună adaptare spațială, o adeziune crescută la pereții defectului, precum și
capacitatea de a forma și stabiliza cheagul de sânge71. Același deziderat a stat
și la baza activității științifice a unui grup de cercetători irlandezi 72, care au
adăugat hidroxiapatită unei structuri de colagen înalt poros, în scopul obținerii
unei matrici pentru regenerarea osoasă. O atenție deosebită a fost acordată de
către aceștia obținerii unei hidroxiapatite cu puritate și cristalinitate înaltă,
16
acestea fiind caracterisitici esențiale în ceea ce privește capacitatea

materialului de a induce formarea de os nou. Echipa are experiență, de
asemenea, în crearea de matrici de colagen biocompatibile, cu porozitate
crescută, cu densitate și arhitectură optime pentru adeziunea și prolifererarea
celulară. În ciuda tuturor acestor proprietăți, matricea de colagen nu deține
calități mecanice, care sunt indispensabile atunci când vorbim despre
materiale destinate ingineriei tisulare ortopedice. Prin alăturarea celor două
componente în cadrul unui singur produs biomimetic destinat regenerării
osoase, se obține un material ferm, rigid, biocompatibil, care are în
componență doar constituente naturale osoase și care prezintă un proces de
degradare fără produși toxici, derulat în paralel cu procesul de neoformare
osoasă.
Anumite studii raportează efecte favorabile în cazul utilizării altor
materiale ceramice sintetice, precum fosfatul tricalcic, dovedind potențial
osteogenic73. β-tricalciu fosfat este un material obținut prin prelucrarea
fosfatului tricalcic la temperatură scăzută, pentru creșterea stabilității în mediu
apos. Rezultă un material care posedă proprietăți radioopace, osteoconductive
și are resorbție progresivă, pe măsură ce se formează os nou74 și care poate
exista sub formă granulată, de pastă sau de bloc. Există însă studii care pun la
îndoială capacitatea acestui material de a induce formare de os nou, întrucât
defectele parietale în calvaria șobolanilor Wistar, evaluate comparativ la 7, 15
și 30 zile nu au arătat diferențe semnificative între defectele lăsate goale
pentru vindecare și cele umplute cu β-tricalciu fosfat74.
O altă xenogrefă ceramică este reprezentată de sticla bioactivă, un
material cu proprietăți osteoinductive, testat pe animale și pe subiecți umani, în
cazul defectelor parodontale și care, deși promite să mențină înălțimea și
lățimea crestei alveolare, poate interfera ulterior cu alte tratamente de tipul
inserării implanturilor, datorită unei incomplete resorbții75. Același inconvenient
este revelat și în cazul polimerilor utilizați ca și material de augumentare
osoasă. Aceștia, având la bază un acid polilactic, au fost imaginați sub forma
unei rădăcini dentare care menține forma crestei alveolare după extracție, însă
nu prezintă resorbție integrală, ceea ce constituie un dezavantaj76.
Materialul de adiție osoasă ideal nu există, însă este acceptat faptul că
ar trebui să fie de proveniență sintetică, cu un ritm de degradare predictibil și
cu proprietăți osteocompetente, pentru a servi în mod adecvat tehnicilor de
inginerie tisulară. Un studiu interesant în această direcție77 a încercat să
înțeleagă răspunsul gazdei la diferite materiale utilizate în reconstrucțiile
osoase, astfel: s-a realizat o comparație între 2 produse care au la bază
colagenul, și anume colagen-glizozaminoglican (CG) și colagen-fosfat de
17
calciu biomimetic (CCP), adăugate cu și fără celule mezenchimale (MSC) în

cultură, în defecte de 7 mm, create la nivelul calvariei șobolanilor. După 4 sau
8 săptămâni, probele au fost analizate cu ajutorul microCT, histologie,
histomorfometrie și imunohistochimie. Rezultatele obținute conturează câteva
concluzii importante:
- Faza minerală din componența CCP favorizează vindecarea,
comparativ cu CG, însă ambele materiale reprezintă o infrastructură
propice vindecării osoase; superioritatea CCP se poate datora structurii
sale de o porozitate crescută, care asigură infiltrarea celulară și
vasculară, precum și rezistenței sale mecanice superioare, care
menține această configurație interioară a materialului. De asemenea,
fosfatul de calciu contribuie, prin proprietățile sale osteogenice, la
mineralizarea mai rapidă a țesutului osteoid.
- Răspunsul gazdei la adăugarea MSC în construcția ingineriei tisulare
este predominant unul inflamator de tip M-1 mediat de macrofage,
comparativ cu răspunsul în cazul materialelor fără adaos celular, unde
se regăsesc preponderent macrofage M-2 pro-remodelatoare;
mecanismul mai puțin favorabil în cazul adaosului celulelor
mezenchimale a fost explicat histologic: se crează o barieră împotriva
activității macrofagelor, ceea ce reduce remodelarea osoasă locală și
neoformarea de țesut osos, împiedicând inclusiv vascularizația, ceea
ce rezultă în arii de necroză în centrul grefei, mai evidente în cazul
CCP.
- În toate probele analizate a fost evidențiat un răspuns macrofagic,
acesta fiind abundent și situat la periferia probelor cu conținut celular
MSC adăugat și slab și omogen distribuit, în probele fără MSC.
- Deși literatura de specialitate înclină preponderent spre utilizarea
celulelor stem și a factorilor de creștere adăugați materialelor
cunoscute de adiție osoasă, supra-ingineria tisulară poate avea efecte
nedorite, adverse, la nivelul țesutului țintă.
1.3.5. ROLUL MEMBRANELOR ÎN TEHNICILE DE REGENERARE OSOASĂ

Studiile existente până în prezent confirmă faptul că tehnicile de
regenerare osoasă ghidată utilizând grefele particulate împreună cu
membranele resorbabile de colagen reprezintă metode de încredere în tratarea
defectelor osoase78. Rolul membranelor resorbabile interpuse între defectul
osos grefat și lamboul mucoperiostal a fost de asemenea studiat, pentru a se
stabili cu exactitate necesitatea acesteia în stabilirea unui prognostic pozitiv al
vindecării osoase. Suprafața rugoasă a membranei de colagen este de ajutor
18
în atașamentul celuleor osteoblastice, constituind un suport pentru formarea

osteoidului și stabilizarea grefei osoase. Un grup de cercetători sârbi 79 a
condus un studiu interesant, în care a demonstrat rolul utilizării unei membrane
umane demineralizate resorbabile, de grosime 200µ, în acoperirea unor
defecte osoase mandibulare la câini. Evaluarea vindecării la 2, 4 și 6 luni a
arătat o superioritate în gradul de regenerare osoasă în toate cazurile tratate
cu membrane resorbabile, versus cazurile în care defectele osoase au fost
grefate cu material de substituție osoasă, fără a utiliza membrane de
acoperire. Același grup de cercetători a arătat, în cadrul unui alt studiu 80,
importanța grosimii membranelor resorbabile. În urma extracției premolarilor
mandibulari la câinii incluși în studiu, defectele osoase rezultate au fost
acoperite cu membrane resorbabile de 100 µ, 200 µ, respectiv neacoperite. În
urma analizei histopatologice, rezultatele la 2, 4 și 6 luni au arătat o vindecare
osoasă superioară în cazul membranelor de 200 µ, în special comparativ cu
defectele lăsate neacoperite. Autorii subliniază astfel rolul membranelor
resorbabile de a ajuta în stabilizarea cheagului de vindecare și de a împiedica
infiltrarea celulelor epiteliale dinspre lamboul mucoperiostal către defectul
osos, favorizând astfel dezvoltarea celulelor precursoare de os la nivelul
defectului existent. Un alt studiu81 recent a investigat diferențele în regenerarea
osoasă ghidată periimplantară în cazul utilizării osului demineralizat bovin în
asociere cu o membrană resorbabilă, respectiv o membrană ramforsată cu
titan, neresorbabilă.
Cunoștințele dobândite în cursul multor ani de cercetări în domeniul
regenerării tisulare ghidate au condus la stabilirea unor principii de respectat,
dacă se dorește exploatarea potențialului biologic al gazdei. Astfel, în privința
membranelor utilizate, acestea trebuie să îndeplinească următoarele funcții:
- Excludere celulară: membranele utilizate trebuie să împiedice accesul
fibroblaștilor sau celulelor epiteliale de la nivelul gingiei în defectul osos82;
- Rolul de menținător de spațiu: membrana se croiește și se adaptează
defectului osos în așa fel încât să asigure un spațiu între aceasta și
defect, izolând complet defectul de țesuturile moi supriacente și
depășind marginile acestuia cu 2-3 mm în toate direcțiile82;
- Rolul de suport al vindecării, prin susținerea formării cheagului de
vindecare la nivelul spațiului delimitat subiacent, care reprezintă
precursorul celulelor progenitoare osoase;
- Rol stabilizator: membrana trebuie să protejeze cheagul format de
mișcările țesuturilor moi acoperitoare, această condiție fiind frecvent
îndeplinită prin fixarea membranei cu pini, suturi sau șuruburi
intraosoase miniaturale82.
19
Condițiile care se impun membranelor utilizate în cursul procedurilor de

regenerare osoasă ghidată includ: biocompatibilitate, ocluzie celulară,
menținătoare de spațiu, integrare tisulară și bună manipulare clinică82. Aceste
condiții sunt îndeplinite de câteva tipuri de membrane, grupate în două mari
categorii principale: membrane neresorbabile și membrane resorbabile.
Avantajele și dezavantajele celor două tipuri de membrane sunt bine
cunoscute, atât în literatura de specialitate, cât și în practica clinică:
membranele resorbabile de colagen au multiple avantaje, însă nu mențin
dimensiunea și forma grefei inițiale, în timp ce membranele neresorbabile
ramforsate cu titan, deși asigură o stabilitate crescută a grefei pe toată
perioada vindecării, necesită reintervenție pentru îndepărtarea lor, pot conduce
adesea la dehiscențe pe perioada vindecării și prezintă riscuri legate de
infecția grefei și pierderea acesteia. Studiul citat anterior81 a evaluat rezultatele
tehnicilor de regenerare osoasă ghidată in vivo, la 6 luni de la intervenția
chirurgicală. Ambele grupuri de studiu au prezentat o reducere semnificativă a
defectului osos, cu diferențe în grosimea orizontală obținută, în favoarea
membranelor neresorbabile ramforsate cu titan.
În cadrul tehnicilor de inginerie tisulară, biomaterialele sunt considerate
un element crucial, întrucât asigură mediul formării osoase și totodată joacă un
rol important în creșterea, adeziunea și diferențierea celulară. Pe lângă
acestea, eforturile cercetărilor au fost îndreptate în ultimii ani și spre procesul
de angionegeză, ca fiind un alt element cheie în procesele de reparație
osoasă, întrucât vasele de sânge noi asigură nutrienți, oxigen și migrarea
celulelor osoase precursoare. Așadar, numeroase studii au aplicat factori de
creștere a angiogenezei, precum factorul de creștere vascular endotelial
(VEGF) și factorul de creștere fibroblastic (FGF). Beom-Su Kim83 a realizat un
studiu în această direcție, având la bază conceptul grefei de os poroase, care
să permită infiltrarea celulară, creșterea vasculară și circulația nutrienților.
Autorii au dezvoltat un amestec de pudră de os bovin și fibrină, care conține
angiogenină, al căror efect a fost urmărit in vivo, în vindecarea unor defecte de
calvarie la iepuri. Cu ajutorul microscopiei electronice și a microtomografiei
computerizate, autorii au concluzionat că tehnica propusă îmbunătățeste
vascularizația și regenerarea osoasă la nivelul defectelor calvariei, grupul de
studiu prezentând os nou format nu doar la periferia defectelor, ca și în cazul
probelor de control, ci și în centrul defectului, fiind însoțit de numeroase vase
de sânge nou formate.
20
1.3.6. VASCULARIZAȚIA ȘI ANGIOGENEZA ÎN PROCESELE DE

REGENERARE OSOASĂ
Lipsa unei microvascularități conectate la sistemul circulator al gazdei
este recunoscută ca fiind una din cauzele majore de eșec a grefelor osoase și
a tehnicilor de inginerie tisulară84-86, având în vedere faptul că țesutul osos este
unul metabolic activ, cu o rețea vasculară intraosoasă și cu osteocite situate la
100 µm de un capilar intact. În absența unei vascularizații, transportul
nutrienților se realizează prin difuziune, acest mecanism fiind eficient doar
pentru distanțe scurte și pentru țesuturi cu o rată metabolică mult mai scăzută,
precum cartilajul86.
Consecutiv unei implantări de grefă osoasă, formarea de vase noi din
cele preexistente, fenomen numit angiogeneză, are loc în mod spontan. Acest
răspuns vascular este indus de către procesul inflamator și reprezintă un
răspuns din partea gazdei la agresiunea de tip ischemie-reperfuzie vasculară,
care are loc în cursul intervenției chirurgicale. Capilarele rezultate prin inducție
inflamatorie sunt însă tranzitorii și vor regresa în câteva săptămâni, fiind foarte
importantă neovascularizația grefei, care este un proces mult mai lent și mai
îndelungat. Importanța vascularizației sitului grefat rezidă și din nevoia
înlăturării compușilor biodegradabili de la nivelul grefei, care, dacă nu sunt
eliminați, determină prin acumulare, un răpuns local de tip inflamator87.
Stimularea angiogenezei este așadar un punct de interes maxim în
ceea ce privește tehnicile și materialele utilizate în ingineria tisulară, pentru
atingerea acestui deziderat fiind dezvoltate câteva strategii pe care le
enumerăm în continuare87:
- Designul și arhitectura grefelor sunt două aspecte critice în formarea
rețelei vasculare noi. Arhitectura grefelor trebuie să asigure o porozitate
optimă proliferării osteoblastice, depunerii matricei osoase, procesului
de mineralizare și penetrării vasculare. Studiile in vitro88 conduse în
acest sens au arătat că dimensiunea mai mică a porilor (5-20µ) și
distanțele reduse între aceștia au facilitat creșterea și agregarea
celulară. Cercetările in vivo89 au obținut însă rezultate contrare,
explicația rezidă din faptul că grefele cu porozitate mică au tendință
spre hipoxie și condrogeneză, în timp ce grefele cu pori largi permit o
mai bună diferențiere a celulelor mezenchimale în osteoblaste,
favorizând osteogeneza și vascularizația.
- S-a propus varianta includerii unei microrețele cu geometrie vasculară
în cadrul unui material polimeric de adiție osoasă90,91, deziderat obținut,
în mod ideal, printr-o tehnică CAD/CAM cu o rezoluție de 100nm92.
21
- Datorită legăturii strânse care există între procesele de angiogeneză și

cele de osteogeneză, factorii de creștere angiogeni sunt implicați atât în
osificarea de tip encondral, cât și în mecanismele de neovascularizație.
Cel mai important factor de creștere implicat în angiogeneză este
VEGF, motiv pentru care cercetările axate pe ingineria tisulară au
încercat să dezvolte produși care să elibereze cantități crescute de
VEGF la nivelul sitului receptor: s-au folosit produși naturali, sintetici
sau compoziți în acest scop93-98 care au dat rezultate promițătoare, însă
au adus în discuție și eventualele dezavantaje, legate spre exemplu, de
utilizarea factorilor de creștere în cazul defectelor osoase consecutive
rezecțiilor tumorale maligne, precum și instabilitatea produsului și prețul
de cost ridicat al acestuia. În cazul utilizării factorilor de creștere, doza
utilizată rămâne un factor cheie, întrucât doze necorespunzător de mari
au generat malformații vasculare, dezvoltare tumorală, retinopatii și
ateroscleroză99.
- Unele studii au propus de asemenea, utilizarea celulelor endoteliale, al
căror rol în angiogeneză este esențial, în cadrul proceselor de
regenerare tisulară100, demonstrându-se ulterior necesitatea asocierii
acestora cu celule perivasculare, pentru a obține o rețea vasculară
stabilă și durabilă86. Disponibilitatea celulelor endoteliale rămâne totuși
o problemă, alături de generarea de răspunsuri diferite din partea
țesuturilor țintă, datorită heterogenității fenotipice și genotipice a
acestora. O îmbunătățire a răspunsului gazdei a fost observată prin
asocierea celulelor endoteliale cu osteoblaste, aceste culturi eliberând
o cantitate crescută de VEGF, factorul de creștere proangiogenic101-103.
1.4. METODE DE EVALUARE A CANTITĂȚII ȘI A CALITĂȚII

SUBSTRATULUI OSOS
Măsurările cantitative osoase au fost utilizate pe scară largă pentru

diagnosticarea bolilor osoase. Procesele de modelare și remodelare osoasă
sunt activate în diferite momente de timp. Remodelarea osoasă activă este
stimulată în special, de boli osoase și de complicații precum deficiența de
estrogen în osteoporoza postmenopauză, osteoartrita, vindecarea fracturilor și
chirurgia de implantare104-107. Ca urmare, eterogenitatea densității minerale a
țesutului osos (TMD) crește108. Densitatea minerală osoasă (BMD)
caracterizează țesutul osos în ceea ce privește conținutul de minerale într-un
volum aparent de os, care include porozitatea, măduva osoasă, precum și
22
matricea osoasă. Pe de altă parte, TMD reprezintă conținutul de minerale

măsurat exclusiv în matricea osoasă109,110.
Spre exemplu, în conformitate cu criteriile Organizației Mondiale a
Sănătății (OMS), osteoporoza este definită ca fiind cu 2,5 abateri standard (sau
mai mult) sub valoarea medie pentru femeile tinere sănătoase111,112. Cu toate
acestea, evaluările cantitative ale țesutului osos nu pot explica în totalitate
fragilitatea osoasă111, motiv pentru care sunt necesare evaluări calitative, spre
exemplu prin morfologia și distribuția TMD113,114. Proprietățile mecanice ale
osului trabecular sunt explicate folosind parametrii morfologici tridimensionali
(3D) ai osului trabecular cum ar fi numărul trabecular, grosimea și raportul de
anisotropie115-117. Multe studii au indicat, de asemenea, că TMD este
responsabil pentru controlul proprietăților mecanice elastice, plastice și
vâscoelastice la nivelul țesutului osos118-121. Ca atare, s-au făcut eforturi pentru
dezvoltarea unei noi tehnologii imagistice care să poată evalua non-invaziv din
punct de vedere calitativ, țesutul osos108.
Cele mai frecvent utilizate metode de evaluare a vindecării osoase, a
proprietăților cantitative și calitative ale țesutului osos în general, sunt
reprezentate de analiza densitometrică122, analiza histopatologică și
histomorfologică123, microscopia electronică, radiografiile și analiză
biomecanică.
1.4.1. OSTEODENSITOMETRIA DEXA (DUAL-ENERGY X-RAY

ABSORPTIOMETRY - DXA)
Osteodensitometria DEXA este cea mai comună tehnică imagistică
pentru măsurarea și diagnosticarea densității osoase, precum și pentru
evaluarea riscului de fractură pentru un individ124. Cu ajutorul acestei metode
se cuantifică densitatea minerală osoasă (BMD) în zona osoasă specifică,
măsurată în g/cm². O examinare DEXA poate oferi informații despre conținutul
de minerale osoase (BMC), în g, în zona măsurată. Acesta este o tehnică
neinvazivă, bidimensională (2D), care utilizează radiații ionizante pentru
măsurarea conținutului mineral osos. Energia duală se referă la faptul că tubul
cu raze X furnizează fotoni cu două energii niveluri, de ex. de 70 kV și 140 kV.
Raportul de atenuare a acestor energii cu un nivel scăzut, respectiv crescut de
energie permite identificarea și separarea osului de țesutul moale, pe baza
densității fiecărui pixel. În acest mod, în regiunile de interes (ROI) selectate,
pot fi făcute calculate atât BMD (bone mineral density), cât și BMC (bone
mineral content).
Limitele metodei se datorează rezoluției spațiale restrânse și tehnicii
2D, care nu permit distincția între osul cortical și cel trabecular și nici evaluarea
23
micro-structurii oaselor trabeculare. Rezoluția acestei tehnologii este de

aproximativ 500 µm, nivelul necesar aprecierii densității trabeculare fiind de 50-
200 µm108. O altă limitare își are originea în faptul că algoritmul matematic
utilizat pentru măsurarea densității minerale presupune omogenitatea țesutului
moale, această presupunere fiind o sursă de eroare125. Părțile corpului care
sunt cel mai adesea scanate cu ajutorul acestei metode sunt șoldul și coloana
lombară (vertebre L1-L4).
Osteodensitometria DEXA este considerată o tehnică de radiație cu
doze mici, o doză eficientă pentru examinarea șoldului și a coloanei vertebrale
variind între 1 și 20 μSv126, având totodată un cost economic scăzut127.
1.4.2. TOMOGRAFIA COMPUTERIZATĂ (CT)

Tomografia computerizată este o tehnică imagistică de diagnostic în
care razele X generate de către o sursă care se rotește în timpul examinării
oferă, la trecerea printr-un obiect studiat, imagini la scară gri a secțiunii
obiectului. Razele X care traversează secțiunea obiectului vor fi măsurate de
un detector, existând mai multe proiecții pentru fiecare rotație. Valorile digitale
trimise de la detector, care descriu cantitatea de radiații care trece prin țesut și
ajunge la nivelul detectorului, sunt analizate prin algoritmi complecși de
reconstrucție, care necesită sisteme informatice avansate. Semnalele
prelevate de la detectoare sunt analizate algoritmic și apoi sunt transferate la
unitatea de computer. Imaginile sunt înregistrate în unitatea computerului în
format DICOM (Digital Imaging and Communications in Medicine), acesta fiind
dezvoltat pentru comunicarea imaginilor medicale și a datelor referitoare la
aceste imagini128. Datorită diferențelor de atenuare a țesuturilor, aceste calcule
matematice complexe oferă posibilitatea de a diferenția țesuturile între ele și
de a le atribui diferite valori CT sau valori ale unităților Hounsfield (HU)129.
Valorile HU sunt obținute prin transformarea lineară a coeficienților măsurați de
atenuare.
Tomografia computerizată multistrat (MSCT) folosește un dispozitiv
care permite pacientului trecerea printr-un scaner CT, la nivelul unei deschideri
circulare care se rotește și captează un volum de imagini ale corpului, fiind
astfel posibilă imaginarea obiectelor în 3D. Reconstrucția imaginilor cu grosime
diferită și cu rezoluție plană diferită face ca tehnica să fie utilă pentru imagistica
medicală de diagnostic. Unul din avantajele MSCT în diagnosticarea și
identificarea persoanelor cu risc pentru eventuale fracturi ale oaselor
osteoporotice, îl reprezintă rezoluția mai mare și tehnica 3D, ceea ce face mai
ușoară identificarea fracturilor suferite în antecedente. Deși rezoluția este
înaltă, cu voxeli de aproximativ 0,2 mm, reprezentarea structurală a osului
24
trabecular și cortical are nevoie de rezoluții de 0,1 mm sau mai puțin 130, ceea
ce face ca MSCT să fie promițător pentru moment, dar nu este ideal131,132. Un
dezavantaj al MSCT este doza de radiație mult mai mare în comparație cu
DEXA.
1.4.3. TOMOGRAFIA CALCULATĂ CANTITATIVĂ PERIFERICĂ DE ÎNALTĂ

REZOLUȚIE - HR-PQCT
Investigațiile imagistice in vivo ale micro-structurii osoase sunt posibile
cu ajutorul HR-pQCT, în ceea ce privește oasele scheletului periferic, cum ar fi
încheietura mâinii și călcâiul. Un precursor al HR-pQCT a fost pQCT, introdus
în anii 1990133,134. HR-pQCT a fost introdus la începutul acestui secol135. Cu
ajutorul acestei tehnici, este posibilă măsurarea densității minerale osoase de
la nivelul unui volum, precum și morfologia micro-arhitecturală și anumite
proprietăți mecanice ale osului investigat136-140. Rezoluția izotropă a voxelului
pentru majoritatea dispozitivelor HR-pQCT scade la 82 μm, permițând
vizualizarea trabeculelor osoase în mod corespunzător. Există o concordanță
bună între HR-pQCT și standardul de aur micro-CT în ceea ce privește
parametrii oaselor trabeculare precum: Tb.N, Tb.Th și Tb.Sp135. Studii in vivo
au arătat că fracția volumului osos trabecular derivat din datele HR-pQCT este
independent asociat cu fracturi prevalente. Alți factori de ordin calitativ ai
țesutului osos pot fi urmăriți, cum ar fi porozitatea corticală, aceasta fiind
imaginată și măsurată cu ajutorul HR-pQCT, însă având în vedere că 60%
dintre pori au diametru mai mic de 100 μm, metoda poate conduce la o
subestimare a porozităților141,142. Cercetările mai recente utilizează un dispozitiv
nou introdus, care lucrează cu voxeli izotropi de 61 μm143,144. Deși această
modalitate de investigație imagistică are o rezoluție spațială sub 100 μm, nu
este potrivită pentru scanarea oaselor capului și expune pacienții la o doză
mare de radiații145.
1.4.4. MICROTOMOGRAFIA COMPUTERIZATĂ - MICRO-CT SAU ΜCT

Tomografia computerizată oferă imagini biologice cu rezoluții izotrope
variind de la câțiva milimetri în aparatele clinice de tomografie computerizată,
până la câțiva zeci de micrometri în aparatele de micro-CT din laboratoarele de
cercetare, și în cele din urmă în aparate cu radiație de tip sincrotron, rezoluția
poate să coboare până mai jos de 100 nm. Micro-tomografia computerizata
(Micro-CT), ca și alte tehnici CT, folosește raze X pentru producerea imaginilor
unui obiect, primul dispozitiv de acest fel146 fiind introdus în anii 1980. Voxelii
acestor dispozitive sunt izotropi și este posibilă crearea de volume 3D din
datele obținute. Dimensiunile imaginii voxel în dispozitivele moderne pot fi sub
25
10 μm sau chiar 1 μm108, metoda fiind utilizată atât în imagistică medicală, cât
și în scopuri industriale. Deschiderea rotundă, din interior, între sursa de raze
X și detector, este mică, cu diametrul de aproximativ 50-80 mm, permițând
imagini in vivo numai pentru animale mici. Timpul imagistic este considerabil
lung, deseori ore, iar doza de radiație mare147. Micro-CT și-a dovedit
aplicabilitatea extrem de importantă în imagistica probelor de țesut în
proiectele de cercetare, fiind considerat standardul de aur pentru imagistica
microarhitecturii osoase148, însă nu este la fel de potrivit pentru imagistica
medicală a pacienților, datorită particularităților tehnice descrise anterior.
În prezent, s-au produs multe îmbunătățiri în achiziționarea și
analizarea de imagini de micro-CT pentru structura osoasă trabeculară și a
biomaterialelor utilizate în regenerare osoasă. Micro-tomografia computerizata
a fost efectuată pentru a observa regenerarea osoasă la nivelul tuturor sit-
usurilor defectului. Folosind un program de calculator pentru a converti imagini
de micro-CT în imagini de formă tridimensională, poate fi observat și analizat
întreg osul regenerat la nivelul defectelor create anterior10. Deși nu poate
furniza toate datele din cadrul unei analize histologice, micro-CT are un avantaj
substanțial în determinarea caracteristicilor structurale și a parametrilor de
creștere osoasă în cele trei dimensiuni10,149.
Utilizarea radiației synchorotron (SR) în relație cu micro-CT, în locul
radiațiilor X convenționale, a adus numeroase avantaje în ceea ce privește
calitatea imaginii și raportul dintre semnal și zgomot. Datorită proprietăților radiației
synchorotron, această metodă ne permite studierea simultană a microstructurii și
a mineralizării osoase, nu doar prin intermediul furnizării de imagini, ci și prin
tehnici de cuantificare și de măsurare a parametrilor ce țin de geometria și
topologia arhitecturii și a structurii osoase10. Prima utilizare a synchorotron micro-
CT a fost in direcția evaluării eficienței unui tratament medicamentos folosit în
cazul bolnavilor de osteoporoză, care au fost supuși biopsiei înainte de tratament
și la unul sau doi ani după tratament. Rezultatul studiului a arătat o creștere a
mineralizării sub tratament, fără modificarea semnificativă a micro-arhitecturii
osoase, ceea ce a fost în concordanță cu rezultatele așteptate prin utilizarea
bifosfonaților în tratamentul bolnavilor de osteoporoză150. Dezvoltarea diferitelor
modele animale în vederea cercetărilor, în special a șoarecilor, a conturat o nouă
arie de utilizare cu succes a SR micro-CT, întrucât această tehnologie poate
furniza imagini de o înaltă rezoluție.
Numeroase studii149,151 au arătat că micro-CT este un instrument util
pentru a obține imagini tridimensionale de înaltă rezoluție în vederea evaluării
vindecării osoase, a interfeței cu materialul și a biocompatibilității substituentelor
osoase. Imaginile obținute pot fi utilizate pentru analiza morfometrică neinvazivă
26
cantitativă a regenerării osoase, lăsând ca adjuvant la intervale stabilite, opțiunea

de histologie convențională. Caracterizarea temporală a mineralizării osoase are
un rol potențial important în înțelegerea dinamicii de mineralizare a oaselor în
procesul de vindecare, în special pentru produse farmaceutice degradabile și
bioactive care acționează asupra materialelor osoase.
1.4.5. TOMOGRAFIA COMPUTERIZATĂ CU FASCICUL DE CON - CBCT

Tomografia computerizată cu fascicul de con CBCT este o tehnică
imagistică care folosește un fascicul de raze X în formă de con, care
înlocuiește fasciculul utilizat în modalitățile convenționale MSCT. CT cu
fascicul de con (CBCT), cunoscut și sub denumirea de tomografie volumetrică
dentară, sau con rază de rază CT, este un scaner de imagine extra-oral care
poate crea o imagine 3D. CBCT a fost dezvoltat în 1998, ca o alternativă la CT
convențional pentru regiunea capului și gâtului. Prima unitate CBCT folosită a
fost Tom 9000 (Quantitative Radiology, Verona, Italia). Examinarea CBCT se
efectuează folosind o sursă de lumină cu raze X care înconjoară pacientul și
detectoare de suprafață bidimensionale. Din sursa de raze X un singur fascicul
se deplasează cu 360 de grade în jurul pacientului, iar detectoarele formează
multe imagini pentru fiecare grad de mișcare (> 150–600). Țesuturile sunt
identificate diferit în funcție de densitățile acestora, care au rate diferite de
absorbție a razelor X152. Începând de atunci, au fost puse la dispoziție
scannere CBCT mai rapide și mai dedicate scopului țintit, datorită îmbunătățirii
tehnologiei de detectare și a software-ului de procesare. Au fost propuse
numeroase denumiri pentru această tehnică în literatura de specialitate, cum
ar fi: volumul cu fascicul de scanare conic (CBVS), tomografie volumetrică
calculată, tomografie dentară, dentar 3D-CT, Tomografia digitală volumetrică
(DVT) și imagistica volumetrică cu fascicul conic (CBVI)153. Declarația
Asociației Americane de Radiologie Orală și a Maxilo-Facială, care a sugerat
utilizarea secțiunilor transversale pentru planificarea implantului dentar 154, a
condus la utilizarea pe scară largă și rapidă a CBCT în implantologia dentară.
Precizia geometrică a fost raportată a fi mare pentru măsurători liniare, ceea
ce înseamnă că înălțimea și lățimea oaselor, precum și proximitatea structurilor
anatomice relevante pot fi măsurate cu exactitate155-157.
Introducerea tehnicii cone beam CT în medicina dentară a înregistrat
rezultate promițătoare: studiile au arătat o capacitate de detectare a defectelor
osoase de 80-100% în cazul CBCT, comparativ cu doar 63-67%, în cazul
radiografiilor convenționale, 2D, având și avantajele eliminării fenomenelor de
distorsiune și de suprapunere. Un studiu condus în acest sens a demonstrat că
nu există diferențe semnificative statistic între dimensiunile osoase măsurate
27
pe CBCT și cele măsurate in vivo, în cursul intervențiilor chirurgicale158. În

ceea ce privește capacitatea CBCT de a măsura densitatea oaselor maxilare,
studiile recente159 au relevat, în cazul pacienților cu osteoporoză, eficiența
acestui instrument în detectarea ariilor cu slabă mineralizare. În ciuda
acurateții imaginilor obținute, calitatea rezultatelor este dependentă de
mărimea câmpului de vizualizare, a voxelilor utilizați, precum și de alți
parametri tehnici. În evaluarea calității osoase bazată pe densitate, este
cunoscut faptul că prin intermediul investigațiilor CBCT se poate determina o
valoare a nuanțelor de gri cuantificată ca unități voxel și nu ca unități
Hounsfield (HU)160. Scara Hounsfield unit (HU) este o transformare liniară a
atenuării liniare originale a coeficientului în unu, în care densitatea radio a apei
distilate la presiune și temperatură standard este definită ca zero, în timp ce
densitatea radio a aerului la la presiune și temperatură standard este definită
ca -1000 HU. Unitățile Hounsfield sunt utilizate în imagistică medicală pentru a
descrie cantitatea de atenuare radiologică a fiecărui „voxel” din imaginea 3D 161.
În esență, acest parametru utilizat pe scară largă pentru descrierea calității
osoase, se bazează pe atenuarea liniară a radiodensității materialelor în raport
cu apa (HU = 0)162. Există studii163-166 care au demonstrat o corelație lineară
între scala de nuanțe de gri ale CBCT și unitățile HU, în timp ce altele167- 170 au
arătat o relație directă între unitățile voxel, torque-ul de inserție a implantului și
stabilitatea primară a acestuia. González-Garc´ıa a demonstrat însă, în
studiul171 său, relația directă existentă între densitatea osoasă măsurată pe
CBCT și cea măsurată pe micro-CT, considerat standardul de aur în evaluarea
morfologiei osoase114,148, concluzionând, de asemenea, utilitatea acestui
instrument în pregătirea pre-operatorie din domeniul implantologiei orale.
CBCT este adesea menționată ca fiind o tehnică cu doze mici în
comparație cu MSCT172 (tabel 2). De exemplu, un studiu care are ca scop
compararea dozelor de radiații de la CBCT și MSCT demonstrează că doza de
radiație eficientă pentru imaginarea unui molar de minte mandibular cu ajutorul
CBCT este de 29 μSv. Când se investighează aceeași regiune prin tehnica
MSCT, doza este de 474 μSv173. Cu toate acestea, din cauza numeroaselor
schimbări în ceea ce privește parametrii imagistici posibili atât pentru MSCT,
cât și pentru CBCT, dozele de radiație pot prezenta diferențe semnificative. Un
fapt incontestabil este faptul că CBCT permite imaginea FOV-urilor mici în
formă de con, de exemplu 4x4 cm, ceea ce reduce doza comparativ cu
MSCT174-176.
Un dezavantaj major al CBCT în comparație cu MSCT este că
dispozitivele CBCT actuale nu produc valori calibrate ale nuanțelor de gri. Prin
urmare, nu este posibilă obținerea valorilor HU pentru diferențierea corectă
28
între țesuturi. Unele studii sugerează că aceste valori ale nuanțelor de gri
măsurate pe tomografia computerizată cu fascicul de con CBCT pot fi
fiabile171,177, dar valorile diferă între dispozitive, precum și în funcție de plasarea
obiectului în imaginea FOV178-182.
Tabel 2. Descriere sumară a tehnologiilor bazate pe raze X, după 108, 183-185
Metoda de Mărime voxel Doza de iradiere Timpul de scanare

investigare (µm) efectivă (µSv) (sec)
DEXA 500 1-20 -120
MDCT 156-500 100-8000 <30
10-40 (Rotație)
CBCT 130-400 6.3-2100
1.92-7.2 (Expunere)
Micro-CT 0.3-100 NA >600
*DEXA - Osteodensitometria; MDCT- Tomografie computerizată multidetector; CBCT - Tomografie

computerizată cu fascicul de con; Micro-CT - Tomografie microcomputerizată
1.4.6. TOMOGRAFIA ÎN COERENȚĂ OPTICĂ (OCT)

În ultimii 20 ani, tomografia în coerență optică (OCT) a evoluat într-o
tehnică valoroasă de imagistică a structurilor transparente și translucente. OCT
este o tehnică atractivă, non-invazivă prin care se pot obține imagini de rezoluții
înalte, bazându-se pe interferometria în coerență joasă (LCI), prin intermediul
căreia se pot obține secțiuni la scala micrometrică11. Tomografia în coerență
optică extinde capacitățile razelor X, păstrându-și caracterul de metodă
neinvazivă, cu aplicabilitate atât în practica medicinei dentare, cât și în domeniul
cercetării științifice. Majoritatea studiilor realizate până în prezent utilizând această
tehnologie includ atât imagini ale structurilor dentare dure normale și patologice,
cât și investigații ale calității diverselor tratamente dentare. În acest sens, s-au
evaluat defecte ale materialelor de obturație, microinfiltrațiile de la nivelul interfeței
dinte-obturație dentară, calitatea adeziunii bracket-ului la țesutul dur dentar,
restaurările protetice și microinfiltrațiile de la nivelul dinte-restaurare protetică.
OCT-ul se mai folosește pentru redarea imaginilor de la nivelul canalelor și a
dentinei radiculare, pentru prezența sau absența microinfiltrațiilor periapicale și
pentru evaluarea osteointegrării implantelor. Această metodă imagistică prezintă o
sensibilitate crescută comparativ cu alte metode de investigare în acest sens12,13,
motiv pentru care este justificată integrarea sa ca parte componentă a prezentei
cercetări.
29
Capitolul 2.
MECANISMUL, ROLUL ȘI BENEFICIILE
FOTOBIOMODULĂRII ÎN CADRUL PROCEDURILOR
DE AUGUMENTARE ȘI REGENERARE OSOASĂ
2.1. GENERALITĂȚI CU PRIVIRE LA FOTOBIOMODULARE ÎN

SFERA MEDICINEI DENTARE
Istoria terapiei de biomodulare laser își are originile în experimentul dr.

Endre Mester186, desfășurat în cadrul Universității Semmelweis Medical University
din Ungaria, în 1967. Experimentul, urmând unuia similar, dezvoltat de McGuff în
Boston187, a intenționat vindecarea unor tumori implantate în tegumentul
animalelor de laborator, cu ajutorul radiației laserului cu rubin de 694 nm.
Rezultatele experimentului, deși nu au arătat vindecarea tumorală, au prezentat
un efect surprinzător, de stimulare a creșterii părului animalelor tratate, comparativ
cu cele netratate186, acest proces fiind denumit ”biostimulare laser”.
Având deci, o istorie de mai bine de 50 ani (de la descoperirea sa din anii
1960), în ultimii 30 ani, terapia laser cu nivel energetic scăzut (LLLT) a fost
utilizată preponderent în cursul vindecării plăgilor, aplicațiile în domeniul medicinei
regenerative și a medicinei dentare dovedindu-și efectele pozitive ulterior.
Denumirea de terapie cu nivel energetic scăzut provine de la utilizarea unei
densități de radiație inferioară altor tipuri de tratamente cu laser, fiind cunoscut
faptul că se utilizează lungimi de undă cuprinse între 600 și 1100nm, cu o energie
de 1-500 mW, în mod continuu sau pulsat, fără generare de căldură secundară
sau vibrații, la nivelul țesutului țintă188. Anumite reacții biologice pot fi însă,
modulate de către reacții fotochimice datorate unor lungimi de undă aflate în afara
ferestrei optice de 600-1100 nm, spre exemplu: radiația albastră (400-520 nm),
radiația verde (520-560 nm), radiația galbenă (560-600 nm), radiația de spectru
roșu mijlociu (1100-3000 nm) și îndepărtat (>3000 nm). Această observație ridică
problema găsirii cromoforilor implicați în reacțiile biologice, întrucât este greu de
crezut că citocromul c-oxidaza este singurul implicat în acest proces de absorbție
a fotonilor189. Lungimile de undă situate în intervalul 700-780 nm sunt considerate
ineficiente din punct de vedere terapeutic, întrucât nu se găsesc în spectrul de
absorbție al citocromului c oxidază190.
Fluența (densitatea de energie) folosită este în general între 1 și 20 J/cm2
în timp ce doza laser poate varia foarte mult în funcție de sursa radiației și
dimensiunea spotului; valorile de la 5 la 50 mW / cm2 sunt comune pentru
obținerea efectelor de stimulare și vindecare, în timp ce iradieri mult mai mari
30
(până la W/cm2) pot fi utilizate pentru inhibiție neuronală și ameliorarea durerii.

Biomodularea este de obicei utilizată pentru a susține regenerarea țesuturilor,
reducerea edemului și a inflamației și ameliorarea durerii, fiind (spre deosebire de
alte proceduri medicale cu laser care funcționează printr-un mecanism ablativ /
termic), un tratament bazat pe un efect fotochimic comparabil cu fotosinteza la
plante, prin care lumina este absorbită și exercită o schimbare chimică191.
Utilizarea terapiei laser în domeniul regenerării osoase și a implantologiei
are o aplicabilitate largă, datorită efectului pozitiv pe care îl exercită radiația laser
asupra proceselor de reparație osoasă și tisulară. Datorită efectelor pozitive
asupra metabolismului osos, observate în special în cazul consolidării fracturilor,
utilizarea laserului terapeutic cu nivel energetic scăzut (LLLT) sau a
fotobiomodulării (PBM), așa cum a fost denumită recent (începând din anul 2015),
a fost încurajată în practica clinică6. În ciuda numeroaselor aplicații demonstrate
științific, rezultatele nu au fost mereu consistente, ceea ce a generat nevoia de
studii suplimentare, care să clarifice mecanismul de acțiune și să stabilească
protocoale reproductibile, cu rezultate similare. În principal, au existat două direcții
majore de cercetare, care au necesitat clarificări: complexitatea interacțiunii dintre
radiația laser și sistemele biologice țintite, respectiv înțelegerea mecanismelor
moleculare care mediază răspunsul terapeutic192,193. La începuturile acestui tip de
tratament, cercetătorii nu cunoșteau dacă efectele biomodulării se datorează
caracteristicilor radiației laser, respectiv lumină monocromă, coerentă sau dacă se
pot utiliza și alte surse de lumină pentru a obține același efecte. O dată cu
cercetările exhaustive din acest domeniu și cu lărgirea indicațiilor și a aplicațiilor
clinice, fotobiomodularea a ieșit din sfera exclusivă a aparatelor laser, momentan
folosindu-se și alte surse de lumină, necoerentă, precum lămpile LED și OLED,
care îndeplinesc condiția primordială de a avea o lungime de undă capabilă de a fi
absorbită de către molecula foto-acceptor din țesutul țintă189. Acestea nu constituie
însă, subiectul prezentei lucrări, cercetarea de față având la bază utilizarea unui
aparat laser GaAlAs, așadar o sursă de lumină monocromă, coerentă.
2.2. DOZA DE RADIAȚIE LASER
Pentru a obține efectele dorite, operatorul trebuie să stăpânească

cunoștințe solide legate de utilizarea terapiei laser, care includ: dozele de
radiație, punctele de aplicare a acesteia și specificitatea lungimii de undă
indicate în tratamentele postchirurgicale, întrucât utilizarea incorectă a radiației
laser poate provoca efecte necontrolate la nivelul țesuturilor orale. Din punct
de vedere al proprietăților optice, țesuturile de la nivelul cavității bucale nu sunt
31
foarte omogene, aspect important de luat în considerare în calculul dozei și a

modului de administrare a radiației.
Doza de radiație constituie cel mai important parametru al terapiei
laser, având limitele sale minime și maxime: dacă se utilizează o doză laser
insuficientă, efectele dorite nu vor fi obținute; dacă, dimpotrivă, dozele sunt
prea crescute, este posibil să apară efecte adverse sau un rezultat de
nestimulare. Acest fenomen este cunoscut în literatura de specialitate sub
denumirea de ”răspuns la doza bifazică” sau curba Arndt-Schulz (fig. 1) și are
drept cosecință necesitatea determinării dozei optime pentru obținerea unui
răspus favorabil din partea țesutului țintă. Tumilty194, în metaanaliza sa privind
fotobiomodularea în tendinopatii, a arătat că 11 din 20 de studii nu au obținut
efecte optime ale tratamentului, fie datorită unei densități de putere prea mari,
fie datorită timpului de iradiere mult prelungit. Un alt parametru important este
cel al penetrabilității radiației în țesutul țintă, un studiu important în acest sens
fiind condus de către Tedford și colab.195, care au comparat penetrabilitatea
lungimilor de undă 660nm, 808nm și 940 nm la nivelul țesutului cerebral al
cadavrelor, rezultatele obținute demonstrând superioritatea laserului de
808nm, a cărui lungime de undă a penetrat craniul, meningele și creierul, pe o
distanță de aprox. 40 mm. Comparația a urmărit și diferențele dintre
transmiterea în regim continuu și cel pulsat, însă nu a condus la diferențe
vizibile. O posibilă explicație pentru fenomenul de ”răspuns la doza bifazică”
este oferit de către Huang și colab.191, care introduc ipoteza producerii speciilor
de oxigen reactiv (ROS) la doza trifazică a radiației laser aplicate în culturile de
neuroni corticali, astfel: se consideră că există două tipuri de ROS, unul pozitiv,
care se produce la fluențe scăzute ale radiației laser și care inițiază căi de
semnalizare celulară benefice proliferării și supraviețuirii celulare, și unul
negativ, care apare la creșterea marcată a fluenței radiației, fiind însoțit de
inițierea apoptozei de către mitocondrie. Între cele 2 vârfuri ale producției de
specii de oxigen reactiv există o etapă intermediară, care are loc la cantități
moderate de radiație laser și care se caracterizează prin scăderea cantității de
ROS pozitiv și de ATP produs. Rămâne ca studiile ulterioare desfășurate în
această direcție să stabilească dacă cele două specii de ROS sunt fie identice,
cu diferențe doar din punct de vedere cantitativ, fie reprezintă specii diferite din
punct de vedere chimic. Huang191 presupune în studiile sale, că ROS pozitiv
are un conținut majoritar de superoxid, în timp ce ROS negativ are în
componență radicali hidroxil și peroxinitriți, cu efect distructiv cunoscut.
32
Fig. 1. Curba Arndt-Schulz. Axa orizontală prezintă creșterea dozei (de la stânga la dreapta) și
indică faptul că biostimularea apare cu doze relativ mai mici în comparație cu dozele mai mari care
provoacă bioinhibiția (adaptare după 191,196)
Deși există 4 mecanisme principale de interacțiune a radiației laser cu

țesuturile, și anume: reflexia, transmiterea, difuziunea /dispersia și absrobția,
doar ultimele dintre acestea descriu interacțiunea cu țesutul țintă. În
consecință, la nivel tisular, fasciculul incident poate fi reflectat, absorbit,
transmis sau difuzat. Absorbția luminii are loc în momentul în care un foton
interacționează cu un atom sau cu o moleculă, și întreaga energie a fotonului
este transmisă atomului sau moleculei. Așadar, eficiența fotobiomodulării
depinde de cantitatea de radiație care ajunge la țesutul țintă, sau de
penetrabilitate, acest mecanism fiind uneori greu de cuantificat. Din acest
motiv, descrierea procedurilor laser și a dozimetriei trebuie să cuprindă 2 părți:
parametrii de iradiere (lungimea de undă, puterea, diametrul fascicolului,
structura impulsului) și modul în care este distribuită radiația, sau doza
(energia, densitatea de energie, repetitivitatea tratamentului, timpul și aria de
iradiere)189.
Hamblin și colab.189 revizuie foarte explicit proprietățile și parametrii
esențiali în cadrul procedurilor de fotobiomodulare cu ajutorul radiației laser:
- Lungimea de undă (nm): lumina este formată din energie
electromagnetică, care are și proprietăți de undă. Lungimea de undă
este exprimată în nm, fiind vizibilă între 400-750 nm, invizibilă peste
33
750 nm și în spectrul infraroșu, între 750-1500 nm. Laserele utilizate

pentru tratatamente de biomodulare au, de obicei, lungimi de undă
cuprinse între 600-1000nm, în intervalul acesta absorbția de către
citocromul c oxidaza fiind maximă, iar penetrabilitatea țesuturilor este
mai mare decât pentru alte lungimi de undă (fig. 2). Lungimile de undă
de peste 900 nm sunt absorbite și de către apă și se speculează o
absorbție și la nivelul fosfolipidelor, cu consecințe în perturbarea
canalelor de ioni și a funcțiilor celulare. Pentru o penetrabilitate mai
mare la nivelul țesutului țintă, de 1-5 cm, lungimile de undă de 690-850
nm și-au demonstrat superioritatea198,199.
- Puterea (W): energie (J) per secundă (s)
- Suprafața fasciculului luminos (cm2): această proprietate este frecvent
raportată greșit, datorită confuziei cu aria orificiului prin care se livrează
energia laser. În mod corect, ea se calculează de către fizician sau de
către inginerul laser, cu ajutorul unui profiler de rază luminoasă
- Iradierea (densitatea de putere, W/cm2): reprezintă puterea divizată la
suprafața fasciculului luminos
- Fascicul luminos pulsat: dacă fasciculul utilizat este în regim pulsat,
puterea raportată trebuie să fie una medie, calculată cu ajutorul
formulei: puterea de vârf (W) x lățimea impulsului (s) x frecvența
impulsului (Hz). Literatura de specialitate nu a ajuns încă la un consens
în ceea ce privește diferențe de eficiență între fasciculul luminos pulsat
și modul de funcționare continuu (cw), anumite aparate laser destinate
procedurilor de biomodulare având exclusiv funcția cw.
- Coerența: lumina coerentă produce o pată laser, care este considerată
a juca un rol în interacțiunea biomodulării cu celulele și componentele
subcelulare, aceasta având dimensiunea egală cu cea a mitocondriei.
- Polarizarea: lumina polarizată poate avea efecte diferite față de lumina
asemănătoare, dar nepolarizată, datorită unei amestecări rapide la
nivelul țesutului țintă; în structuri precum colagenul, însă, transmiterea
luminii polarizate va depinde de orientarea sa.
- Energia (J): este calculată cu ajutorul formulei putere (W) x timp (s).
Utilizarea unităților J ca măsură a dozei laser se poate dovedi nesigură,
întrucât presupune o relație inversă între putere și timp, fără a lua în
calcul iradierea.
- Fluența (densitatea de energie): se calculează cu formula putere (W) x
timp (s) / suprafața fasciculului luminos (cm2); nici utilizarea acestui
parametru în exprimarea dozei laser nu este sigur, deoarece
presupune o relație inversă între putere, timp și iradiere. Pentru o
34
replicare fidelă a unui tratament laser, trebuie respectați aceeași

parametri de putere, suprafață a fasciculului luminos și timp.
- Timpul de iradiere (s, min): este un parametru important de specificat în
cadrul tratamentelor de biomodulare, alături de celelalte caracteristici
ale iradierii.
- Intervalul de timp alocat tratamentului (ore, săptămâni, luni): cu
excepția unor tratamente de biomodulare în plăgi acute, de obicei,
tratamentul presupune 2-3 aplicații săptămânale, timp de mai multe
săptămâni, pentru a obține un rezultat clinic vizibil200.
Fig. 2. Fereastra terapeutică în funcție de lungimea de undă (adaptare după 197)
2.3. MECANISMUL DE ACȚIUNE AL FOTOBIOMODULĂRII LASER
Conform primei legi a fotochimiei, fotonii radiației luminoase trebuie să

fie absorbiți de către anumiți fotoacceptori moleculari sau cromofori pentru ca
fotochimia să aibă loc. Mecanismul fotobiomodulării la nivel celular a fost
atribuit absorbției radiației vizibile monocromatice și infraroșii apropiate (NIR)
de către componentele celulare ale lanțului respirator. Astfel, fototerapia se
caracterizează prin capacitatea de a induce procese fotobiologice în celule.
Penetrarea eficientă în țesut a radiației și lungimea de undă specifică a
35
radiației absorbite de către fotoacceptori sunt doi dintre parametrii principali

care trebuie luați în considerare în tratamentele de acest fel191.
Rezultatele clinice sunt explicabile prin intermediul unei reacții în lanț,
atunci când discutăm despre aplicații cu efecte în profunzime de milimetri-
centimetri. Radiația laser monocromatică determină absorbția selectivă de
către cromofori, care răspund uneia sau mai multor lungimi de undă, fenomen
cunoscut sub denumirea de rezonanță la o anumită frecvență.
avem o densitate de putere mai mare, observând reacții diverse în zona
aplicării radiației laser. Existența acestor fotoreceptori nespecifici, care prezintă
sensibilitate pentru o anumită lungime de undă, a fost demonstrată încă din
secolul 20, în special în ceea ce privește lungimile de undă albastră și roșie 201.
Literatura de specialitate acceptă, în majoritatea studiilor, citocromul c oxidază
(CCO, unitatea a 4-a în lanțul mitocodrial) drept cromoforul celular pentru
fotobiomodulare202. Această enzimă complexă are 2 centre hem diferite și 2
centre de cupru diferite, fiecare din acestea putând fi reduse sau oxidate (un
total de 16 izoformi), ceea ce afectează spectrul de absorbție. Cea mai larg
acceptată teorie care explică creșterea activității CCO după absorbția de fotoni
este reprezentată de către procesul de foto-disociere a oxidului nitric (NO),
care are rol de inhibiție a transportului de electroni prin legarea de CCO. În
afară de CCO, o serie de alte molecule au fost propuse pentru rolul de
cromofori, în funcție de lungimea de undă de excitație, la care pot absorbi
lumina și consecutiv pot media reacții fotochimice și fotobiologice: flavine și
flavoproteine, porfirine, hemoglobina și mioglobina, apa nanostructurată 203.
Este cunoscut și general acceptat faptul că mitocondria răspunde la lumină
prin creșterea transportului de electroni, a consumului de oxigen, a
potențialului de membrană moticondrial și prin sinteza de ATP (fig. 3). Dozele
excesive de radiație pot avea însă efecte contrare la nivelul proceselor
mitocondriale. Deși activitatea mitocondrială crescută și o cantitate mai mare
de ATP exercită efecte benefice la nivelul țesuturilor hipoxice și stresate,
biologia modernă subliniază nevoia de efecte de lungă durată la nivelul
țesuturilor, pentru susținerea vindecării chiar și după ce sursa de lumină a fost
oprită, ceea ce ar implica activarea unor factori de transcripție care să susțină
aceste efecte în timp7.
36
Fig. 3. Principalele mecanisme de acțiune ale fotobiomodulării (adaptare după 196)
Karu203 a propus încă din anul 1988, una dintre cele mai acceptate teorii
cu privire la interacțiunea dintre radiația laser și celulă, aceasta bazându-se pe
mecanismul de semnalizare mitocondrială retrogradă care are loc sub influența
luminii laser din spectrul vizibil și din cel infraroșu: primul pas este reprezentat
de absorbția unui foton cu energie hv de către cromoforul Cox, urmat de
creșterea potențialului de membrană mitocondrial, creșterea sintezei de ATP și
modificări în concentrațiile speciilor reactive de oxigen, Ca2+ și NO. Apare, de
asemenea, o comunicare între mitocondrie și nucleu, datorită modificărilor de
ultrastructură mitocondrială. Aceste modificări determină și schimbări ale
sintezei ATP, ale potentialului redox intracelular, ale ph-ului și ale nivelului de
adenozin monofosfat ciclic (cAMP)190.
S-a propus, de asemenea, ipoteza efectelor biologice ale
fotobiomodulării asupra canalelor de ioni, întrucât s-a observat eficiența unor
lungimi de undă mult mai mari decât cele absorbite de CCO, precum și un
influx rapid de calciu la nivelul celulelor expuse fotobiomodulării și capacitatea
acesteia de a reduce durerea, care nu pot fi explicate prin fenomenul de
suprastimulare mitocondrială7. Studiile recente au demonstrat existența unui
grup mare de canale de ioni numite canale de potențial tranzitor al receptorilor
(TRP), în componența cărora intră 6 subgrupuri, între care și TRPV (V-
vaniloid). Aceștia din urmă sunt implicați în numeroase funcții fiziologice,
precum intermedierea văzului la insecte (deci sensibilitatea pentru lumină),
fiind sensibil la căldură, presiune și o gamă de produse naturale și liganzi
37
fiziologici204. TRPV a arătat răspunsuri pozitive la lumina laser de culoare

verde205 și la radiația din spectrul infraroșu206.
Freitas și Hamblin190 trec în revistă într-un mod foarte structurat
principalele molecule la nivelul cărora efectele biomodulării laser sunt vizibile și
demonstrate în literatura de specialitate, acestea fiind prezentate în Tabelul 3.
Tabel 3. Efectele PBM asupra principalelor molecule, după 190

Tipul Molecula Efectul PBM
moleculei
Moleculă de Adenozin trifosfat -creșterea cantității intracelulare de ATP, prin stimularea de către lumină a
semnalizare (ATP) activității Cox
AMP ciclic -Creșterea cantității de adenozin-3,5-ciclic-monofostază (cAMP), care a fost
(cAMP) asociată cu o scădere a procesului inflamator
Specii de oxigen -producerea ROS mitocondrial, care conduce mai departe la activarea
reactive (ROS) transcripției factorului nuclear kappa B, care acționează ca senzor redox
Calciu (Ca2+) -modificările în ultrastructura mitocondrială pot conduce la schimbări ale
concentrațiilor de Ca2+, prin creșterea influxului din spațiul extracelular;
alcalinizarea citosolică facilitează consecutiv, deschiderea canalelor de
TRPV, așadar și acest efect poate fi atribuit terapiei PBM
-în cazul în care creșterea intracelulară a Ca2+ este artificială, PBM poate
acționa în sensul scăderii acestui nivel, oferind protecție neuronală
-căile de semnalizare ale Ca2+ sunt foarte numeroase pentru a fi dezvoltate
în acest material
Oxidul nitric (NO) -se regăsește frecvent în cantități mari după terapia PBM, fiind un
vasodilatator bine cunoscut și având alte numeroase căi de semnalizare
Activarea Factorul nucelar -Creșterea NFkB după iradierea laser conduce la transcripția de gene, cu
factorilor de kappa B (NFkB) multiple efecte pozitive: reducerea morții celulare, creșterea proliferării și a
transcripție migrării celulare, îmbunătățirea funcției neurologice
-dacă densitatea de energie totată este însă mult crescută, rezultă o creștere
exagerată a NFkB și a stressului oxidativ, cu efecte negative la nivelul
țesutului țintă.
-răspunsul bifazic al dozei PBM este atribuit unei generări exagerate de
ROS, NO, NFkB și activării unor căi citotoxice
RANKL-receptor -unele studii au arătat un efect al PBM de creștere a raportului RANKL/OPG
activator al (osteoprotegerin), acest fapt influențând regenerarea și remodelarea osoasă,
ligantului de prin diferențierea și activarea osteoclastelor
factor nuclear
kapp-B
Factorul de -PBM are efect pro-angiogenic, prin intermediul creșterii HIF-1α și a expresiei
inducere a VEGF; HIF-1α este o proteină cu rol în adaptarea celulei la hipoxie, prin
hipoxiei (HIF-1α) activarea factorului vascular endotelial de creștere (VEGF) a receptorilor
VEGF, a carrier-ului de glucoză (GLUT-1).
Calea -PBM poate exercita un rol în supraviețuirea celulară, prin activarea căii
Akt/GSK3β/β- Akt/GSK3β/β-catenină, aceasta reprezentând o posibilă soluție de tratament
catenină în cazul bolilor neurodegenerative precum Alzheimer
Calea -calea Akt/mTOR/CyclinD1 deține un rol semnificativ în diferențierea
Akt/mTOR/Cyclin fenotipală, cu implicație directă în dezvoltarea cancerelor orale; efectele PBM
D1 asupra celulelor displazice și tumorale poate fi nedorit, întrucât post-iradiere
laser, crește viabilitatea acestor celule, precum și expresia proteinelor cu rol
în migrarea și invazia tumorală
ERK/FOXM1 -studiile conduse în acest sens au arătat că PBM produce o translocare
nucleară a ERK, cu acumularea de FOXM1 în nucleu și transactivarea
expresiilor c-Myc și p21, acestea având implicații în procesul de îmbătrânire
a organismului
38
Tipul Molecula Efectul PBM

moleculei
PPARy -PBM acționează ca și facilitator al homeostaziei, prin creșterea expresiei
mRNA a PPAR, un receptor nucleic cu rol în reglarea expresiei genelor.
RUNX2 -studiile au arătat o creștere a factorului de transcripție RUNX2 după
iradierea laser, acesta având rol în diferențierea osteoblastică și
morfogeneza scheletală, prin mecanismul de reglare a expresiei genelor în
relație cu componentele matricei extracelulare din timpul proliferării celulelor
osoase
Molecule TGF-β -studiile au arătat o creștere a TGF-β ulterior PBM, ceea ce se traduce prin
efector stimularea producției de colagen, inducerea expresiei componentelor
matricei extracelulare și inhibarea distrugerii acesteia, toate aceste
fenomene fiind caracteristice fazelor inițiale ale procesului inflamator
Stressul oxidativ -efectul PBM asupra stressului oxidativ este unul de inhibiție, conform
studiilor efectuate; procesul inflamator implică o creștere a ROS și RNS,
alături de o reducere a activității antioxidanților de apărare, acest stress
oxidativ conducând la activarea NF-κB, cu efecte consecutive în exprimarea
genelor citokinelor pro-inflamatorii, a factorilor de creștere, a chemokinelor și
a moleculelor de adeziune
Citokinele pro- și -nivelurile a numeroase citokine și mediatori ai inflamației sunt modificate cu
anti-inflamatoare ajutorul terapiei PBM: TNF, interleukine, histamine, TGF-β, prostaglandine
-studiile efectuate până în prezent au arătat că, în situația în care inflamația
este deja prezentă la nivelul țesutului țintă, PBM exercită o acțiune
antiinflamatoare; în cazul în care inflamația este absentă, PBM crește
cantitatea de mediatori pro-inflamatori, care pot ajuta în remodelarea tisulară
și în medierea funcțiilor celulare
BDNF (factorul -efectul PBM în acest sens are loc prin descreșterea BDNF, ceea ce se
neurotrofic traduce pritr-un rol neuroprotector și cu implicații în ceea ce privește
derivat din creier) morfogeneza dendritică, ceea ce ar putea constitui avantaje în tratamentul
bolilor neurodegenerative
Factorul de -PBM crește expresia mRNA VEGF, acesta fiind un factor esențial în
creștere vascular procesul de neoformare vasculară; aceasta are loc printr-un mecanism
endotelial complex, care implică mai multe tipuri celulare, mediatori și căi de
(VEGF) semnalizare.
Factorul de -PBM a arătat, în studiile efectuate la animalele hepatomizate, creșterea
creștere HGF, acesta fiind o citokină care reglează proliferarea celulară, motilitatea și
hepatocitară morfogeneza, având funcții anti-apoptotice și antiinflamatoare în cursul
(HGF) regenerării hepatice
Factorul de -PBM realizată cu ajutorul luminii roșii și din spectrul infraroșu a determinat
creștere creșterea producției de bFGF și KGF, aceștia fiind factori de creștere cu rol
fibroblastică în vindecarea rănilor, mediind transferul de semnal între epiteliu și țesutul
(bFGF) și conjunctiv;
factorul de -bFGF este recunoscut pentru potențialul său mitogen, de chemoatracție
creștere pentru celulele epiteliale și fibroblaști, precum și pentru accelerarea formării
keratinocitar țesutului de granulație și inducerea re-epitelizării
(KGF) -KGF are o acțiune paracrină asupra keratocitelor, fiind responsabil de
proliferarea și migrarea celulelor epiteliale, precum și de menținerea unei
structuri normale epiteliale
Proteinele de șoc -PBM produce creșterea HSP, un mecanism interesant fiind demonstrat
termic (HSP) științific în ceea ce privește reducerea ROS: s-a arătat că, în lipsa HSP, PBM
nu are capacitatea de a scădea ROS, acesta fiind un mecanism important în
cadrul proceselor inflamatorii.
-stimularea HSP90 poate fi utilă în procesele de vindecare, dar nu este de
dorit în cazul afecțiunilor tumorale maligne, acesta având potențial
oncogenic.
39
Recent, într-un review cuprinzător pe această temă, Passarella și

Karu207 subliniază câteva concluzii și perpective esențiale pentru înțelegerea
tratamentelor de fotobiomodulare: scenariul principal rămâne fotoexcitația care
induce modificări în activitatea CCO, consecutiv crescând sinteza de ATP,
modificări redox și o cascadă de reacții biochimice. Acest lanț de semnalizare
celulară și de amplificare este presupus a conduce la un efect fotobiologic de
nivel macro, cum este proliferarea celulară. Pe de altă parte, există la nivel
mitocondrial și alte molecule, despre a căror sensibilitate la radiația luminoasă
nu s-au cunoscut foarte multe, dar care au demonstrat potențial de mediatori la
nivel biochimic celular: enzime, nuceli acizi, nucleotide, metaboliți. Deși
mitcondria, prin intermediul citocromului C oxidază (CCO), rămâne cel mai
important fotoreceptor, s-au descoperit efecte biologice și la nivelul altor tipuri
de receptori. Astfel, iradierea eritrocitelor determină modificări în activitatea
acetilcolinesterazei, îmbunătățiri în activitatea eritrocitelor afectate și
revitalizarea rapidă a membranei acestora, în cazul agresiunilor fizice și
biochimice, precum și modulări ale funcției de membrană prin activitatea
pompelor de ioni. Mai mult decât atât, autorii subliniază faptul că, în cazul
lungimilor de undă care se află în afara ariei de absorbție a radiației LED de
către COX, există cromofori, cel mai probabil o formă nanostructurată a apei
din membranele biologice, care pot exercita funcții biologice, fără încălzirea
țesuturilor. Acest mecanism a fost demonstrat într-un studiu208 pe celule
canceroase iradiate cu 670 nm, în care s-a obținut un efect de creștere a
difuziunii transmembranare, ceea ce ar facilita mecanismul de difuziune
transmembranară a medicației citostatice, cu efecte benefice în cazul
rezistenței medicamentoase. O altă direcție importantă de cercetare este
reprezentată, conform lui Parassella și Karu207, de aplicațiile în bolile
neurodegenerative și în cele care sunt dependente de mecanismele
mitocondriale, cum ar fi boala Alzheimer și neuroblastomul.
2.4. EFECTELE RADIAȚIEI LASER LA NIVELUL ȚESUTULUI OSOS
Așa cum am arătat anterior privitor la modul de acțiune a radiației laser

cu nivel energetic scăzut sau a fotobiomodulării, se consideră că efectul
principal are loc la nivel mitocondrial, efectele putând fi pe termen scurt sau pe
termen lung. Efectele pe termen scurt (minute, ore) se datorează în principal
eliberării de oxid nitric și includ vasodilatație, creșterea circulației sanguine,
îmbunătățirea oxigenării țesuturilor și analgezie. Pe termen lung (zile,
săptămâni), mecanismul de producere a efectelor fotobiomodulării este mai
complex și mai puțin înțeles, considerându-se adesea că percepția celulară
40
datorată efectelor mitocondriale este modificată, sub forma unui stress celular,
cu răspuns în reglarea supraviețuirii celulare și în regenerarea țesuturilor.
Aceste efecte pe termen lung se traduc clinic în vindecarea rănilor, reducerea
inflamației, regenerarea țesuturilor degradate, stimularea și mobilizarea
celulelor stem etc7. Rolul fotobiomodulării în cadrul proceselor de vindecare,
reparare și regenerare osoasă au avut la bază studiile anterioare, care au
demonstrat faptul că fibroblaștii iradiați prin fotobiomodulare au produs o
cantitate mai mare de colagen. Pe același raționament, s-a mers mai departe,
considerându-se că osteoblaștii iradiați cu laser vor fi stimulați în vederea
formării matricei osteoide. Indiferent de factorul care a cauzat defectul osos,
procesele de reparare de la acest nivel urmează aceeași succesiune de etape,
descrise detaliat anterior, în subcapitolul 1.1.3. De asemenea, s-a observat că
procesele care apar în vindecarea țesuturilor moi, au loc și la acest nivel:
inflamație, fibroplazie, remodelare. Spre deosebire de procesele de vindecare
a țesuturilor moi, la nivel osos, odontoblaștii și osteoclastele acționează prin
reconstrucția și remodelarea țesutului osos lezat. Formarea de os depinde de
două condiții preexistente: vascularizația zonei și suportul mecanic, la nivelul
căruia se va depune matricea osteoidă, care se va mineraliza ulterior. Prima
fază în formarea osoasă este rapidă, însă constă în organizarea unui țesut
bogat celularizat, cu mineralizare slabă, având fibre orientate aleatoriu și
rezistență scăzută. Ulterior, acesta va fi înlocuit de osul lamelar matur, capabil
să suporte presiuni mecanice de tipul celor existente în implantologie. Studiile
experimentale au indicat efectul laserului la acest nivel, prin creșterea fibrelor
de colagen, obținerea unui aranjament lamelar mai compact și cu o mai bună
vascularizație. Microcirculația este de asemenea îmbunătățită, ceea ce asigură
un transport mai bun al oxigenului, al nutrienților și al factorilor de creștere,
toate cu beneficii în cadrul proceselor de reparație. Din punct de vedere clinic,
aceste procese se traduc printr-un depozit osos matur, cantitativ și calitativ
superior201, care să asigure necesitățile restaurărilor protetice pe implante.
Renno8 și Stein9 au arătat o creștere semnificativă în proliferarea
osteoblastelor după iradierea cu energie laser de la o diodă de 830 nm la 20
J/cm2. În plus, laserul pare să accelereze procesul de reparare a fracturilor și
produce o creștere a volumului calusului format și o creștere a densității
minerale osoase. Efectele legate de utilizarea fotobiomodulării includ
vascularizație crescută, creșterea activității osteoblastice, organizarea de fibre
de colagen și schimbări în nivelul mitocondrial și intracelular de adenozin
trifosfat. Este o metodă neinvazivă de a stimula osteogeneza și de a accelera
vindecarea defectelor osoase209-213.
41
Silva și Pinheiro realizează, în 2002, un studiu animal, în care compară

efectele a două protocoale de fotobiomodulare (12 aplicări de 4,8J/cm2, pe
parcursul a 28 zile și 3 aplicări de 4,8J/cm2, pe parcursul a 7 zile) cu grupele
de control omologe, neiradiate, reprezentate de defecte în tibia șobolanilor
incluși în studiu. Pentru terapia laser s-a utilizat o diodă de 830 nm, în mod
continuu, 40mw, tratamentul aplicându-se prin repetări la 72h. Rezultatele
morfometrice au arătat diferențe statistice semnificative între grupul iradiat la 7
zile și cel omolog, de control, concluzionând beneficiile biomodulării laser în
etapele inițiale ale procesului de vindecare osoasă. Rezultate similare s-au
obținut și prin utilizarea altor diode, de 790nm214, respectiv 632 nm215,
investigând aceeași perioadă de 7 zile imediat postoperator.
Freitas analizează, într-un studiu foarte interesant216, efectele
fotobiomodulării asupra defectelor osoase supuse procedurilor de regenerare
osoasă ghidată. După ce a realizat defecte de 5 mm în calvaria șobolanilor
incluși in studiu, a comparat cele 8 grupe de studiu în ceea ce privește
cantitatea de os nou format: grupul de control, defect lăsat liber în vederea
vindecării, grupul care a primit membrană de colagen, grupul cu terapie PBM,
grupul cu grefă autologă, grupul grefă autologă+PBM, grupul grefă
autologă+membrană colagen, grupul PBM+membrană colagen și grupul grefă
autologă+membrană colagen+PBM. După 30 de zile, toate grupele de studiu
au arătat o vindecare superioară grupului de control, în ceea ce privește
cantitatea de os nou format, însă diferențele cele mai pronunțate au fost
înregistrate în cazul grupului PBM+membrană colagen, urmat de PBM, și de
grupul membrană colagen. Procotolul de iradiere laser a presupus utilizarea
unei radiații în spectrul infraroșu, GaAlAs, lungime de undă 808nm, putere
100mW, densitate de energie de 210J/cm2/punct, timp de 60 sec, cu o aplicare
centrală și 4 radiale, în jurul defectului, o singură dată, intraoperator, cumulând
o energie de 30J (6J/punct). Autorii consideră că aplicarea acestei terapii mai
târziu de primele 15 zile postoperator nu va exercita efecte benefice, întrucât
cea mai mare proliferare și divizie celulară are loc imediat după actul operator,
mai târziu celulele găsindu-se în stadii evolutive diferite. Rămâne totuși
întrebarea dacă terapia unidoză are aceleași efecte cu terapia prin aplicări
multiple, în prima perioadă a vindecării osoase.
În ciuda numărului tot mai mare de utilizări cu succes ale laserului
terapeutic în numeroase domenii, există relativ puține rapoarte cu privire la
efectul lor asupra reparării osoase care sunt bazate pe dovezi. Efectele
fotobiomodulării, în asociere cu biomateriale în procesele de reparare a
defectelor osoase, au nevoie de studii suplimentare, întrucât s-au constatat
răspunsuri diferite din partea organismului gazdă. Acest fapt se poate datora
42
dozelor inconstante folosite, întrucât efectele fotobiomodulării au la bază

principiul răspunsului bifazic la doză, conform căruia există o doză ideală
pentru rezultate optime, valori inferioare acesteia neputând genera efectele
așteptate, în timp ce valori mult crescute pot avea efecte adverse sau inhibitorii
la nivelul țesutului țintă7.
Cele mai multe cercetări se bazează pe studii animale, cel mai
investigat tip de animal fiind șobolanul. Mai mult decât atât, majoritatea
studiilor folosesc osul tibiei la șobolani. Pentru ingineria țesutului osos, un
număr destul de redus de modele de animale există. Studiul de față își
propune să utilizeze defecte create în calvaria animalelor de studiu, acesta
fiind un model versatil, care permite evaluarea biomaterialelor și a ingineriei
țesutului osos abordate într-un sit ortopedic reproductibil și lipsit de încărcare
cu forțe mecanice.
43
PARTE SPECIALĂ
CONTRIBUȚII PERSONALE
Capitolul 3.
DATE PRELIMINARE NECESARE REALIZĂRII
CERCETĂRII PERSONALE ȘI STABILIREA
MODELULUI EXPERIMENTAL
3.1. DATE PRELIMINARE NECESARE REALIZĂRII CERCETĂRII

PERSONALE ȘI SCOPUL STUDIULUI
Cercetarea prezentă urmărește o evaluare complexă a efectelor

fotobiomodulării în domeniul regenerării osoase. Studiul își propune
investigarea efectelor unor doze de tratament laser standardizate, aplicabile în
practica curentă de chirurgie orală a țesuturilor dure și regenerare osoasă
ghidată. Obținerea acestui obiectiv general se intenționează a fi realizată
integrând în prezentul studiu mai multe tehnologii cu specificitate și
aplicabilitate în domeniul nostru de interes, și anume micro-CT utilizând
radiația Synchrotron, tomografia în coerență optică, tomografia computerizată
cu fasicul conic și standardul în ceea ce privește evaluarea reparării osoase –
analiza histologică. În felul acesta, urmărim să evaluăm procesul de reparare
osoasă în complexitatea sa, nu doar din punct de vedere cantitativ sau al
microarhitecturii osoase, ci si din punct de vedere calitativ, al componenței și al
gradului de mineralizare, pentru a obține o vedere de ansamblu asupra
efectelor fotobiomodulării la nivelul țesutului osos. Integrarea în cercetare a 4
metode de investigare cu specificitate înaltă pentru domeniul nostru de interes,
în vederea obținerii unor rezultate cât mai concludente și lipsite de erori,
reprezintă o abordare nouă în cercetarea amănunțită a proceselor de reparare
și regenerare osoasă. La acestea, se adaugă nevoia realizării unor investigații
suplimentare în ceea ce privește efectele fotobiomodulării în domeniul
regenerării osoase ghidate, modul de interacțiune cu diferitele materiale de
44
substituție osoasă și sistematizarea unui protocol de lucru versatil și

reproductibil.
În cadrul acestei teme de cercetare au fost luate în considerare mai
multe obiective, pe baza cărora s-a întocmit graficul de realizare a cercetării,
conform etapelor și a activităților planificate. S-au încheiat protocoale de
colaborare cu institute de cercetare internaționale în domeniile vizate de
direcțiile de cercetare ale proiectului, în vederea conlucrării pentru definitivarea
activităților propuse, precum și a confirmării și validării rezultatelor obținute.
Definirea obiectivelor specifice a fost realizată ținând cont de evaluarea
situației existente atât pe plan național, cât și internațional, controlul și
acoperirea riscurilor legate de utilizarea tehnologiei laser în medicina dentară,
estimarea aportului cercetării în ceea ce privește integrarea în practica
medicală curentă a unor tehnici noninvazive, lipsite de durere și cu grad mare
de acceptabilitate din partea pacientului, care să îmbunătățească prognosticul
tehnicilor medicale și chirugicale curente.
Primul obiectiv a constat în realizarea unui model experimental care

să permită reproducerea studiului pe un număr suficient de subiecți, astfel
încât rezultatele să poată fi evaluate din punct de vedere statistic. Cele mai
multe cercetări realizate în direcția reparării și regenerării osoase se bazează
pe studii animale, cel mai investigat tip de animal fiind șobolanul. Pentru
ingineria țesutului osos, există un număr destul de redus de modele de
animale, majoritatea studiilor folosind în prezent osul tibiei de la șobolani.
Studiul de față își propune să utilizeze defecte create în calvaria animalelor de
studiu, acesta fiind un model versatil, care permite evaluarea biomaterialelor și
a ingineriei țesutului osos abordate într-un sit ortopedic reproductibil și lipsit de
încărcare cu forțe mecanice. Acest tip de model experimental aduce un aport
substantial în direcția reproducerii condițiilor necesare studiului mecanismului
biologic al regenerării osoase.
Cel de-al doilea obiectiv face referire la cunoașterea rolului și a

beneficiilor terapiei laser în cadrul procedurilor de augumentare și regenerare
osoasă. Utilizarea terapiei laser în domeniul implantologiei are o aplicabilitate
largă, datorită efectului pozitiv pe care îl exercită radiația laser asupra
proceselor de reparație tisulară. Pentru a obține efectele dorite, operatorul
trebuie să stăpânească cunoștințe solide legate de utilizarea terapiei laser,
45
care includ: dozele de radiație, punctele de aplicare a acesteia, specificitatea

lungimii de undă indicate în tratamentele postchirurgicale, întrucât utilizarea
incorectă a radiației laser poate provoca efecte necontrolate la nivelul
țesuturilor orale. Din punct de vedere al proprietăților optice, țesuturile de la
nivelul cavității bucale nu sunt foarte omogene, aspect important de luat în
considerare în calculul dozei și a modului de administrare a radiației. Doza de
radiație sau densitatea de energie constituie cel mai important parametru al
terapiei laser, având limitele sale minime și maxime. Dacă se utilizează o doză
laser insuficientă, efectele dorite nu vor fi obținute; dacă, dimpotrivă, dozele
sunt prea crescute, este posibil să apară efecte negative sau un rezultat
contrar. Rezultatele clinice sunt explicabile prin intermediul unei reacții în lanț,
atunci când discutăm despre aplicații cu efecte în profunzime de milimetri-
centimetri. Radiația laser monocromatică determină absorbția selectivă de
către cromofori, care răspund uneia sau mai multor lungimi de undă, fenomen
cunoscut sub denumirea de rezonanță la o anumită frecvență.
avem o mai mare densitate de putere, observând reacții diverse în zona
aplicării radiației laser. În ciuda numărului tot mai mare de utilizări cu succes
ale laserului terapeutic cu nivel energetic scăzut în numeroase domenii, există
relativ puține rapoarte cu privire la efectul lor asupra reparării osoase care sunt
bazate pe dovezi. Efectele biomodulării, în asociere cu biomateriale în
procesele de reparare a defectelor osoase, au nevoie de studii suplimentare,
întrucât s-au constatat răspunsuri diferite din partea organismului gazdă.
Cel de-al treilea obiectiv îl constituie analiza proceselor de vindecare

osoasă integrând 4 metode de investigare cu caracteristici deosebite pentru
imaginarea țesutului osos. Pentru a obține o analiză cât mai completă și
complexă a procesului de vindecare osoasă în prezența radiației laser și a
tehnicilor de regenerare osoasă ghidată, rezultatele au fost obținute prin 4
metode de analiză de mare precizie și aplicabilitate în sfera orală: examinarea
cu ajutorul OCT, a micro CT Syncrothron, a tomografiei computerizate cu
fascicul conic CBCT și a examinării histologice.
Un aspect important al acestei cercetări, cel de-al patrulea obiectiv, îl

constituie stimularea colaborării interdisciplinare cu centre internaționale dotate
cu aparatură și echipamente de investigare performante, care sunt co-
46
interesate să-și aducă contribuții în aceste direcții de interes medical. Se va

obține astfel, o permanentă informare în acest domeniu de vârf din medicina
dentară și un feed-back pentru rezultatele obținute, publicarea studiilor
multicenter având un rol determinant în implementarea eficientă a acestor
metode de tratament. Acest obiectiv are la bază scopul final al activității de
cercetare fundamentală și aplicativă de mare complexitate desfășurată în
colaborare interdisciplinară, și anume acela de a obține o creștere a calității
actului medical, datorită încorporării tehnologiei laser ca și terapie dedicată în
cabinetul de medicină dentară și în centrele medicale care se ocupă de
această latură foarte sensibilă a vindecării osoase prin regenerare ososă
ghidată.
3.2. DATE PRELIMINARE NECESARE STABILIRII MODELULUI

EXPERIMENTAL
Nu există un consens general asupra celui mai fidel model animal

utilizat pentru a demonstra particularitățile vindecării osoase. Aproape fiecare
grup de cercetare își folosește propriul model și, prin urmare, rezultatele sunt
imposibil de comparat în mod direct. O condiție prealabilă pentru un astfel de
model este aceea că în timpul vieții animalelor să nu aibă loc regenerarea
osoasă completă spontană a defectelor create. Defectul critic este definit drept
cea mai mică rană osoasă care nu se vindecă spontan pe o perioadă lungă de
timp. Practic, se consideră că, dacă după 52 de săptămâni de la crearea
defectului osos, nu există o suprafață mineralizată de 30%, regenerarea
osoasă nu va fi completă217,218. Dimensiunea minimă acceptată pentru
defectele critice în femurul șoarecilor de laborator este de 3 mm, iar în ceea ce
privește osul parietal (calvaria), diametrul minim, care să împiedice o vindecare
spontană completă, este de 4 mm.
Rozătoarele utilizate ca model experiemental au avantaje anatomice,
deoarece au dimensiuni mici și sunt ușor de utilizat. Acest tip de model animal
este ales în studiile preclinice pentru testarea biomaterialelor și sunt
considerate modelele de primă alegere pentru studiul in vivo al regenerării
osoase219. Limitarea majoră a acestui model animal este reprezentată de faptul
că nu prezintă o remodelare osoasă de tip haversian, comparativ cu speciile
mai mari. Oasele lor sunt mici, cu corticale fragile220.
47
La șoareci, regiunea calvariei este cel mai frecvent sit utilizat221, deși
poate răspunde diferit față de oasele maxilare sau mandibulare, deoarece
deține aspecte anatomice distincte, are o vascularizație abundentă și comportă
riscul mortalității animale secundară leziunilor cerebrale intraoperatorii. Pe de
altă parte, defectele mandibulei sunt create frecvent în regiunea ramului, o
structură foarte subțire, care îngreunează crearea unui defect de grosime
monocorticală, caracteristică fundamentală pentru menținerea substanței
testate în contact și sprijinită exclusiv de țesutul dur222-224. Femurul șobolanilor
Wistar este de asemenea posibil să fie utilizat225, dar centrul său este
preponderent medular și, dacă se intenționează aplicarea biomaterialului în
mandibula umană, acest tip de model de studiu trebuie descurajat. Rata
metabolică a șobolanului Wistar trebuie, de asemenea, luată în considerare; cu
cât animalul este mai mic, cu atât rata metabolică este mai mare în comparație
cu cea a unui om: 30 de zile de viață ale omului corespund unei zile de viață a
șoarecelui226. Rata metabolică crescută a acestui model animal presupune o
perioadă de observare mai scurtă pentru obținerea eșantionării datelor.
Perioade lungi de observații ar putea arăta atât grupuri de testare, cât și de
control, cu defectele avansate / vindecate complet, fără a evidenția potențialul
benefic real al unui biomaterial222,227.
Având toate aceste cunoștințe referitoare la posibilitățile alegerii
modelului animal228, în prima fază a cercetării, s-a decis utilizarea șobolanului
de laborator, rasa Wistar. Șobolanul de laborator Wistar este o rasă outbread,
fiind cea mai utilizată în cercetarea pe animale, în diverse modele
experimentale pentru: domenii chirugicale, testări de siguranță și eficacitate,
nutriție, obezitate indusă prin dietă, oncologie. Înainte de ȋnceperea unui
experiment care necesitǎ anestezia unui șobolan de laborator sunt o serie de
factori care trebuie luați ȋn considerare. Animalele noi venite ȋn biobazǎ trebuie
aclimatizate pentru aproximativ 3 zile ȋnainte de a fi utilizate în cadrul
modelelor experimentale. Vȃrsta animalelor și greutatea lor trebuie, de
asemenea, luate ȋn considerare. Am stabilit ca regiunea supusă cercetării să
fie calvaria (osul parietal), datorită avantajelor expuse anterior, iar dimensiunea
defectului critic a fost stabilită la 5 mm.
48
3.3. MATERIAL ȘI METODĂ
3.3.1. STABILIREA MODELULUI ANIMAL ȘI A GRUPELOR DE STUDIU

Întregul procedeu experimental pe model animal a obținut acordului
Comisiei de Etică din cadrul Universității de Medicină și Farmacie ”Victor
Babeș” din Timișoara și a Centrului de Laparoscopie și Microchirurgie ”Pius
Brânzeu” din Timișoara(Anexa I).
În prima parte a studiului, s-a decis utilizarea șobolanului de laborator,
rasa Wistar. Am stabilit ca regiunea supusă cercetării să fie calvaria (osul
parietal), datorită avantajelor expuse anterior, iar dimensiunea defectului critic
a fost stabilită la 5 mm. Studiul a inclus 24 de șobolani Wistar cu o greutate
medie de 287 g (interval 247-312 g). Animalele au fost împărțite în 3 grupe de
studiu, fiecare dintre acestea având 3 perioade de timp diferite, pe parcursul
cărora s-a observat procesul de vindecare osoasă (tabel 4):
- grupul control negativ (NC), la care se vor crea defecte critice de 5
mm în regiunea calvariei, după care animalele vor fi suturate și lăsate să se
vindece spontan, pentru o perioadă de 14, 21, respectiv 30 zile
- grupul de control pozitiv (PC) la care se vor crea defecte critice de 5
mm în regiunea calvariei, se va realiza adiția defectelor cu xenogrefă și
membrană de colagen, după care animalele vor fi suturate și lăsate să se
vindece pentru o perioadă de 14, 21, respectiv 30 zile
- grupul de studiu (+LLLT), la care se vor crea defecte critice de 5 mm
în regiunea calvariei, se va realiza adiția defectelor cu xenogrefă și membrană
de colagen și se va aplica tratament de fotobiomodulare imediat postoperator
și ulterior, în zile alternative, pentru o perioadă de 14, 21, respectiv 30 zile
(conform protocolului detaliat la 3.3.2.)
49
Tabel 4. Grupele de studiu în funcție de tratamentul aplicat și de perioada de vindecare
Tip Perioada de
Nr proba Tratament efectuat
proba vindecare
Control Defect creat și lăsat să se vindece spontan, timp de
1.1, 1.2
negativ 30 zile
Control Defect creat și umplut cu biomateriale, timp de vindecare
2.1, 2.2, 2.3 30 zile
pozitiv 30 zile
Tratament Defect creat și umplut cu biomateriale, căruia i s-a aplicat
3.1, 3.2, 3.3
laser tratament laser pe parcursul celor 30 zile
4.1, 4.2
negativ 21 zile
5.1, 5.2, 5.3 21 zile
pozitiv 21 zile
6.1, 6.2, 6.3
7.1, 7.2
negativ 14 zile
8.1, 8.2, 8.3 14 zile
pozitiv 14 zile
9.1, 9.2, 9.3
3.3.2. INTERVENȚIA CHIRURGICALĂ PE MODELUL ANIMAL

În etapa chirurgicală, animalele sunt anesteziate (5% Isofluran și O2 l
1L / min, pentru inducție în camera de anestezie și, după aceea, prin
intermediul unei măști faciale, 1% Isofluran și O2 1L / min), iar zona
corespunzătoare scalpului este rasă și dezinfectată cu betadină. Tegumentul
din zona calvariei este incizat longitudinal și se realizează decolarea
subperiostală. Defectul osos este realizat cu o freză trepan de 5 mm, montată
la piesa de mână, sub irigație continuă cu soluție salină. Pentru a obține o
poziție precisă a defectui raportat la reperele pielii, care să faciliteze aceeași
poziționare precisă a fibrei optice a laserului, am folosit un ghid chirurgical din
plastic. După ce a fost creat defectul osos, fiecare animal a fost tratat
corespunzător grupului de studiu din care face parte:
50
- un grup rămâne de control negativ, urmând a se sutura lamboul

respectând planurile periostal și tegumentar, folosind fire de sutură 6/0
Prolene, respectiv 5/0 Prolene.
- Celelalte două grupuri, cel de control pozitiv și cel de studiu, urmează

adiția osoasă cu xenogrefă (NuOss® natural cancellous, cortical bone
matrix, ACE Surgical Supply, USA), acoperirea defectului cu membrană
resorbabilă de colagen (ACE RCM6® Resorbable Collagen Membrane,
ACE Surgical Supply, USA) și sutura lamboului respectând planurile
periostal și tegumentar, folosind fire de sutură 6/0 Prolene, respectiv
5/0 Prolene (Fig. 4,5)
Fig. 4. Schema defectului creat la nivelul osului parietal al animalului studiat

51
Fig. 5. Etapele din cadrul intervenției chirurgicale: reflectarea lamboului (a), realizarea defectului
parietal cu ajutorul frezei burghiu de diametru 5 mm (b), aspectul circumferinței defectului în
timpul îndepărtării capacului osos (c, d, e), augumentarea defectului cu xenogrefă (f), plasarea
membranei de colagen (g), sutura plăgii în 2 planuri, profund (h) și superficial (i)
Postoperator, animalele vor primi tratament medicamentos (Cefazolin

15mg/kg + Gentamicin 1.5 mg/kg), apă și hrană specifică și li se va asigura un
mediu de creștere la o temperatură de 22±5° C și umiditate 55±5%, cu un ciclu
luminos-întunecat de 12 ore pe tot parcursul protocolului experimental. Zilnic,
se evaluează starea clinică generală a animalelor, cu aprecierea ritmului
cardiac, a celui respirator, a temperaturii corporale, aspectul rănilor,
vindecarea inciziei, postura și locomoția. Toate animalele supraviețuiesc pe
întreaga perioadă a studiului și evoluția lor este pozitivă, favorabilă.
52
3.3.3. EXPUNEREA LA RADIAȚIA LASER

Grupul de studiu este expus radiației laser cu nivel energetic scăzut,
utilizând un echipament Galiu-Aluminiu-Arseniu (IRRADIA Mid-Laser
Stockholm, Suedia) (Fig. 6.c, tabel 5), cu lungime de lucru 808 nm, urmând un
protocol stabilit de colectivul nostru de cercetare: 2J/cm2 în prima, a doua și a
treia zi după intervenția chirurgicală, apoi alternativ (1 zi iradiere, 1 zi pauză) în
următoarele 14, 21, respectiv 30 zile, în funcție de grupul de studiu din care
subiectul animal face parte. Protocolul de biomodulare a presupus utilizarea
ghidului de plastic realizat intraoperator, pentru a replica aceeași poziție
precisă, în cele 5 puncte de livrare a energiei luminoase (fig. 6. a,b):
- un punct situat central, în mijlocul defectului
- patru puncte situate diametral opus, pe marginile defectului de 5 mm
Fig. 6. Aspectul ghidului de plastic realizat intraoperator, cu repere craniene pentru poziționare
corectă a fibrei laser (a), aspect în timpul biomodulării laser (b), aparatul laser utilizat, IRRADIA
Mid-Laser® (c)
53
Tabel 5. Specificațiile tehnice ale echipamentului laser utilizat în studiu
Producător IRRADIA Mid-Laser® Stockholm, Sweden

Model MID-laser; Serial no 8110131-4
Anul fabricației 2007
Tip laser / emițător Gallium-Aluminum–Arsenide laser (GaAlAs)
Lungime de undă 808 nm
Mod de funcționare Undă continuă
Diametrul fasciculului 1 cm2
Iradierea la nivelul țesutului țintă 450 mW/ cm2
Durata expunerii 17 sec/punct, 85 sec per sesiune
Energia radiantă 18,9 J
Numărul punctelor tratate 5
Numărul și frecvența aplicării Imediat postoperator și în zile alternative, timp de 14, 21,
tratamentului respectiv 30 zile
Un punct situat central, în mijlocul defectului și 4 puncte situate
Modul aplicării tratamentului diametral opus, pe marginile defectului de 5 mm. Se folosește
ghidul de plastic pentru poziționare corectă.
151.2 J pentru grupul de 14 zile;
Energia totală aplicată pe toată
durata tratamentului
3.3.4. RECOLTAREA ȘI PREGĂTIREA PROBELOR

Protocolul de cercetare elaborat presupune eutanasierea animalelor la
14, 21, respectiv 30 zile ulterior intervenției chirurgicale, urmând să se
preleveze și să se pregătească probele pentru analizele propuse: OCT, Micro-
CT și examinare histologică. Specimenele recoltate au fost standardizate la
dimensiuni de 1x 0,6 x 0,2 cm2 și au fost fixate în de 9 ori propriul volum soluție
de 10% formalină (fig.7). După recoltarea probelor, șobolanii au fost
eutanasiați folosind o supradoză de Thiopental.
54
Fig. 7. Aspectul diferilor tipuri de probe recoltate: grup control negativ, cu defect neaugumentat,
lăsat pentru vindecare spontană (A), grup control pozitiv, cu defect augumentat cu xenogrefă (B),
grup de studiu cu defect augumentat și supus biomodulării laser (C)
55
Capitolul 4.
STUDIUL EȘANTIOANELOR PRELEVATE CU
AJUTORUL MASTER SLAVE OCT
4.1. SCANAREA EȘANTIOANELOR RECOLTATE
Sistemul dezvoltat intern CMS / SS OCT utilizat în investigații, descris

în detaliu de către Podoleanu A. și Bradu A.229 este prezentat în figura 8 (a, b),
în timp ce exemple de două probe de os analizate cu ajutorul acestuia sunt
prezentate în figura 8 (c, d). Imaginile 8 e,f prezintă un detaliu asupra
poziționării probei în timpul scanării și a montării unui element marcator, care
circumscrie defectul și ajută la orientarea probei în timpul scanării și în etapele
următoare, de post-procesare a datelor obținute.
(e) (f)
Fig. 8 a-f. Scanarea eșantioanelor cu ajutorul sistemului dezvoltat intern CMS / SS OCT
56
Scanerele galvanometrice sunt acționate cu o semnal de intrare de tip

triunghiular de 2V de la vârf până la vârf, care corespunde unei scanări liniare
de 2,8 mm pe proba analizată (având în vedere distanța până la masa de
poziționare a probei). Prin urmare, câmpul scanat, câmpul vizual (FOV) al
sistemului OCT, este setat la limita superioară posibilă pentru a evita
distorsionarea imaginii atunci când scannerul rapid este condus la o frecvență
de 250 Hz 230. Datorită acestui fapt, pentru a acoperi defectul cilindric de 5 mm
în diametru, situat pe partea superioară a eșantionului osos, sunt colectate
patru imagini OCT individuale, fiecare cu o suprafață pătrată de 2,8 × 2,8 mm 2,
așa cum se arată în figura 9A. Pentru a studia formarea de țesut osos nou în
interiorul defectului - cu sau fără materialul de adiție - fiecare dintre cele patru
cadrane ale defectelor este imaginat separat. Interfața cu marginile defectului,
respectiv cu osul nativ, este de interes special, pentru a studia procesul de
neoformare osoasă, care, cel mai adesea, este inițiat de la periferia defectului
osos.
Defect Os nativ imagini xy en face
(upper part)
Xenogrefă
(alb)
Os nou (ii) (i)
format □5.6
(gri)
(iii) (iv)
(A)
Φ5
12
yz B-scan
2.8
(B) y
x
xz B-scan
z
2.8
Imagine confocală (xy) (C)
Fig. 9. Schița defectului analizat (A), schița celor 4 cadrane analizate (B), imaginile obținute cu
ajutorul sistemului dezvoltat intern CMS / SS OCT
57
Schița din figura 9B ilustrează poziționarea celor patru cadrane.

Exemple de imagini OCT produse în timpul investigațiilor sunt prezentate în
figura 9C. O scanare raster este obținută prin scanarea galvanometrică de-a
lungul direcțiilor x și y, cu axa z orientată spre adâncimea probei. După cum se
poate observa în figura 9C, trei categorii de imagini pot fi analizate simultan
folosind sistemul OCT și software-ul dezvoltat.
(I) O imagine globală (similară unei imagini confocale de ansamblu), în
planul xy preluat din partea superioară a eșantionului (situată în partea
de jos stânga a ecranului), care servește pentru poziționarea zonei de
interes;
(II) În acest caz, interfața dintre osul original și cel nou format în interiorul
defectului cilindric (așa cum este detaliat în secțiunea următoare) din
FOV-ul instrumentului imagistic;
(III) Secțiuni B-scan / transversale în eșantion în planurile yz și xz (marcate
cu linii punctate albastru și roșu); pot fi selectate și mutate folosind cele
două linii afișate (cu albastru și respectiv roșu) în imaginea confocală
xy în colțul din stânga jos;
(IV) Nouă imagini en-face xy simultane (C-scan), luate în planurile xy, din
diferite poziții axiale reglabile echidistante din eșantion. Adâncimile
axiale ale celor nouă imagini en-face sunt prezentate pe ambele
imagini B-scan (între liniile punctate).
4.2. EVALUAREA CANTITATIVĂ A OSULUI NOU FORMAT
Pentru a utiliza sistemul multimodal CMS / SS OCT în evaluarea

cantitativă a vindecării osoase, diferitele tipuri de țesut osos trebuie să fie
percepute distinct pe fiecare imagine en-face obținută în timpul procesului
imagistic. Pragurile de luminozitate trebuie, prin urmare, să fie alocate fiecărui
tip de țesut osos, luând în calcul diferențele de mineralizare dintre acestea, așa
cum se arată în figura 10. Acest lucru este relativ facil de stabilit pentru
particulele de xenogrefă introduse în defect, întrucât acestea sunt foarte
mineralizate, deci ușor de distins ca fiind zonele cele mai strălucitoare din toate
imaginile. Alocarea mai dificilă a pragurilor de luminozitate se dovedește a fi
cea pentru țesutul osos nou format, găsit la marginea defectelor din grupul de
58
control negativ A, precum și la periferie și în jurul particulelor de xenogrefă,

pentru celelalte două grupuri de studiu. Se poate obiecta faptul că un simplu
prag de intensitate este propus și aplicat imaginilor OCT en-face, luând în
calcul faptul că acestea arată țesutul la diferite adâncimi. Se consideră o
limitare inerentă a metodei. Cu toate acestea, din cunoștințele noastre, nu
există altă modalitate de a evalua țesutul osos utilizând tomografia în coerență
optică decât aceasta, de a presupune că nivelul de luminozitate este
reprezentativ pentru mineralizarea osoasă, așa cum a fost deja acceptat în
studiile OCT despre demineralizare. OCT prezintă variații ale semnalului în
țesutul osos. Considerăm că acestea sunt diferențe de mineralizare ale
trabeculelor, rezultând indici de refracție diferiți care provoacă zone mai
luminoase și mai întunecate în imaginile de țesut osos. Aceste informații permit
calculul mineralizării trabeculare medii și indică direcția și viteza creșterii
osoase trecute, în analogie cu inelele de creștere ale plantelor231.
Fig. 10. Pragurile de luminozitate stabilite pentru analiză
4.3. REZULTATE
Deși în timp real sunt afișate pe ecran doar nouă imagini en-face, 600
de astfel de imagini pe un interval axial de 1,6 mm sunt produse de software-ul
CMS pentru reconstrucția 3D / volumetrică a probei, așa cum se arată în
exemplele din figura 11, pentru toate cele patru cadrane marcate în figura 9A.
Astfel, figura 11 arată cele 12 imagini din grupul de control negativ (Grupul A), la cel
59
mai scurt interval de timp considerat (adică 14 zile), respectiv cele 12 imagini
pentru defectele tratate cu xenogrefă și biomodulare laser (Grupul C), după cel
mai lung interval considerat, 30 de zile, pentru a se evidenția diferențele dintre o
probă cu cea mai mică și respectiv cea mai mare cantitate de os nou format.
Contrastul dintre cantitățile de os nou formate în aceste două situații extreme
poate fi observat clar atunci când se compară cele două seturi de imagini.
Formarea de țesut osos nou, slab sau în curs de mineralizare, este comparată
între cele trei grupuri, efectuate în trei momente ale timpului: (I) t1 = 14 zile, (II) t2
= 21 zile și (III) t3 = 30 zile (figura 12). Astfel, rezultă afișarea cu 12 imagini
obținută de pe suprafața de 2,8 × 2,8 mm2 a unui cadran - pentru fiecare dintre
probele luate în considerare. Pentru claritate, este prezentat un singur eșantion
pentru fiecare grup și în fiecare moment ti, i = 1,2,3.
60
Fig.11. Vizualizare în 12 imagini pentru o pereche de imagini formate din grupul A și grupul C.
Imaginile grupului A au fost înregistrate după cel mai scurt interval de timp considerat (14 zile) și
imaginile din grupul C au fost înregistrate după cel mai lung interval de timp considerat (30 de
zile). Diferențele dintre un eșantion cu cel mai mic și cea mai mare cantitate de os nou format este
evidențiată. Se arată perechea de imagini pentru fiecare din cele patru cadrane (i) - (iv) conform
notației din figura 9A. Fiecare imagine OCT en-face are o suprafață pătrată (în planul xy) de 2,8 ×
2,8 mm2. Imaginea este cea a perechii de 12 imagini pentru cadran (iii). Prima imagine en-face este
colectată la o adâncime z = 0,4 mm, în timp ce distanța dintre imaginile en-face afișate este de
42,56 µm. Raza axială a celor două imagini cu B-scan este de 1,6 mm. Toate distanțele sunt
măsurate în aer.
61
Conform imaginilor B-scan precum cele prezentate în figura 12, din

partea centrală a defectului nu se colectează reflexia (în special în partea
superioară a eșantionului), în timp ce spre periferia sa un număr semnificativ
de fotoni provine din suprafaţa țesutului. Cu cât ne situăm mai mult spre
periferia imaginii en-face, cu atât mai adânc se situează structura
corespunzătoare. Aceasta depinde de structura suprafeței eșantionului, dar
efectul poate fi destul de pronunțat. Prin urmare, se poate sublinia faptul că
puterile variabile ale semnalului ar trebui să fie luate în considerare, adică un
număr mare de fotoni împrăștiați înapoi de la suprafață, semnal mai slab (~
descompunere exponențială) din straturile mai adânci. Acestea pot depinde,
de asemenea, de poziția focalizării și de gradul de atenuare a semnalului de
către straturile superioare, ceea ce poate influența o separare bazată pe
intensitatea semnalului tipurilor de țesut.
Investigațiile, precum și statisticile efectuate asupra datelor obținute au
inclus toate cele patru cadrane și, astfel, întreaga zonă de interes, inclusiv
periferia defectului, ca o modalitate de a reduce erorile cu privire la întreaga
curbură a eșantionului și la cantitatea de os nativ inclus în anumite imagini.
Aceeași reprezentare din figura 12 este reprodusă în figura 13, având în
vedere reconstrucțiile 3D ale acelorași probe osoase din figura 12. Imaginile
arată un aspect diferit al probelor osoase, în funcție de tratamentul aplicat și de
timpul de vindecare care a fost stabilit pentru fiecare grup de studiu. În grupul
de control, marginile defectului sunt evidente, fiind formate din os nativ; centrul
defectului este gol sau mai puțin reprezentativ în țesut osos. În cel de-al doilea
grup, centrul defectului este umplut cu material de adiție (xenogrefă), în
porozitățile acestuia existând un aspect de țesut osos nou format. Aceeași
aparență, dar mai omogenă, se regăsește în grupul C, unde defectele umplute
cu xenogrefă au fost supuse tratamentului de biomodulare. Fig. 12 redă
aspectul de detaliu al probelor investigate, comparativ, în funcție de grupul de
studiu din care fac parte:
62
Grup A
Grup B
Grup C
(1) (2) (3)
Fig.12. Monitorizarea procesului de formare a osului nou pentru cele trei grupuri A, B și C - după
(1) t1 = 14 zile, (2) t2 = 21 zile și (3) t3 = 30 zile. Au fost luate în considerare cadranul din stânga sus
(ii) al fiecărui eșantion (a se vedea fig. 9 (a)). Fiecare imagine OCT en-face are o suprafață pătrată
(în planul xy, a se vedea fig. 9) de 2,8 × 2,8 mm2. Prima imagine en-face afișată este colectată la
adâncimea z = 0,4 mm, în timp ce distanța dintre imaginile afișate este de 42,56 µm. Domeniul axial
(în profunzimea probei) din imaginile B-scan este de 1,6 mm.
63
Grup A
Grup B
Grup C
(1) (2) (3)

Fig. 13. Același studiu ca în fig. 11, care arată reconstrucțiile 3D-OCT ale cadranului din stânga sus
a probelor pentru fiecare grup, A, B și C după (1) t1 = 14 zile, (2) t2 = 21 zile și (3) t3 = 30 zile.
Am cuantificat cantitatea de os nou format, folosind schema prezentată în

figura 4 pentru vindecarea defectului creat artificial. Corespondența dintre tipurile de
oase prezentate schematic în schița din figura 4 și o imagine OCT en-face, pentru
un control pozitiv și negativ al probei este prezentată în figura 14.
64
Fig. 14. Corespondența dintre schema defectului osos prezentată anterior (în fig. 4) și diferite tipuri
de os din interiorul defectului, folosind imagini OCT.
Pentru a cuantifica osul nou format, a fost dezvoltat un software

dedicat. Principalul său rol este de a stabili valori pentru luminozitatea
diferitelor tipuri de os și de a genera procentul specific pentru fiecare categorie.
Utilizarea acestui program este exemplificată în figura 15.
Fig. 15. Aspect din timpul prelucrării imaginilor obținute, cu ajutorul software-ului dedicat
dezvoltat in-house
65
Acest tip de țesut osos nou - care este ținta întregului studiu - apare pe
toată perioada celor 30 de zile. Cu toate acestea, atunci când este doar format,
este mai închis (adică mai puțin mineralizat), în timp ce cu trecerea timpului
devine mai luminos - cu cât este din ce în ce mai mineralizat. Prin urmare
trebuie definit un interval de luminozitate (Mmin, Mmax), cu două praguri (Figura
10): limita inferioară Mmin corespunde țesutului osos nou format după 14 zile
(adică t1, cel mai scurt timp considerat), în timp ce limita superioară Mmax
corespunde țesutului osos format după 30 de zile (adică t3, cel mai lung
interval de timp) - iar acest ultim tip are luminozitatea mai mică decât osul nativ
și, de asemenea, decât xenogrefa adăugată în defecte. Folosind pragurile
indicate în figura 10 și programul dezvoltat, fiecare dintre cele N imagini OCT
în față obținute este analizată și produce zona Aj, j = 1 ... N a osului nou
format. Deoarece fiecare imagine en-face are o grosime h ~ 5 μm în probă,
volumul osului nou format poate fi estimat ca:
N
V  h   Aj
j 1
Cu pragurile stabilite, pentru toate probele, programul generează astfel

procentele fiecărui tip de os, așa cu se observă în figura 16. Pragurile utilizate
sunt identice sau aproape identice pentru toate grupurile considerate. Variațiile
lor față de volumul eșantionului au fost mici și au fost mai degrabă excepția
decât regula. Astfel de variații au fost luate în considerare numai pentru a
elimina artefactele din eșantioane. În nicio situație, astfel de variații nu au
condus la eliminarea completă a structurilor esențiale ale țesutului osos din
analiza grafică.
66
Fig. 16. Colaj de imagini en-face care prezintă structura osoasă diferită în imaginile obținute cu scanări
OCT: reprezentarea vindecării osoase pentru grupul de control negativ A (a) (la 14 zile, 21 de zile, 30 de
zile), pentru grupul de control pozitiv B (b) (la 14 zile, 21 de zile, 30 de zile) și pentru grupul experimental C
(c) (la 14 zile, 21 de zile, 30 de zile). Procentul fiecărui tip de os este indicat pe fiecare imagine OCT.
67
În ceea ce privește ușoara curbură a eșantioanelor, evidențiată în

aspectul din figura 12, pentru a minimiza astfel de erori, am luat în considerare
faptul că nu a fost utilizată nicio segmentare. În timp ce comparăm imaginile
en-face de la o adâncime selectată, dacă suprafața este curbată, substanța
selectată nu este din aceeași adâncime măsurată de sus. Din această cauză,
referirea la țesutul os este relativă la tăiere. Pentru a rezolva această
problemă, am luat în considerare mai multe imagini en-face din fiecare sfert al
fiecărui eșantion și am făcut suma pentru reflectivitate. Software-ul pe care l-
am dezvoltat permite vizualizarea a 196 de poziții en-face pentru fiecare sfert
din probă. Am exclus din analiza noastră statistică periferia defectului, care
conține doar os parietal natural al animalului, pentru a nu influența rezultatele
studiului. În acest fel, începem analiza la marginea defectului, luând în
considerare fiecare 10 pași-poziție, ceea ce înseamnă o medie de 20 de poziții
pentru fiecare eșantion. Aceasta a generat aproximativ 60 procente de tipuri
osoase diferite pentru fiecare probă. S-au adăugat cele patru rezultate, pentru
cele patru sferturi din fiecare probă și am obținut un număr final pentru fiecare
tip de os.
4.4. DISCUȚII
Trebuie să subliniem faptul că metoda OCT propusă nu ia în

considerare variațiile de intensitate datorate atenuării, absorbției și împrăștierii.
Răspândirea și absorbția se schimbă cu adâncimea, dar pe parcursul studiului
nu am încercat să comparăm luminozitatea de la diferite adâncimi. Dacă
această comparație ar fi fost făcută în B-scan, schimbarea contrastului cu
profunzimea ar fi trebuit să fie luată în considerare.
Ca un dezavantaj al instrumentului curent, datorită curburii suprafeței
analizate, informațiile en-face nu pot fi colectate de la aceeași adâncime în toți
pixelii laterali ai imaginii en-face. Nu am corectat această dependență de
adâncime suplimentară datorită variațiilor de suprafață, deoarece efectuarea
de comparații în interiorul imaginii interioare asigură o anumită consistență: toți
pixelii de la adâncimea respectivă au fost afectați în mod similar de straturile
intermediare din partea de sus (atât timp cât suprafața este suficient de plană).
De asemenea, pentru a reduce erorile, proba osoasă a fost poziționată așa
cum se arată în figura 8c, d și împărțită în 4 cadrane, care au generat imagini
OCT cu o suprafață de 2,8 × 2,8 mm2 fiecare. Acesta a fost un mod de a
68
aborda problema curburii menționate mai sus. Astfel de imagini includ, în

anumite situații, o cantitate mai mare de os nativ, ceea ce poate fi observat la
periferia defectului creat artificial. Aceasta înseamnă că un alt cadran include o
parte mai mare a defectului.
Din punct de vedere al intensității, există diferențe semnificative între
imaginile din primul rând din figura 16 în ceea ce privește omogenitatea
diferitelor intensități. Probele din grupul de control A prezintă intensități ridicate
la periferia defectului și intensități slabe sau inexistente în centrul defectului,
așa cum se remarcă din imaginile de en-face. Grupul de control pozitiv B și
grupul de studiu C prezintă o distribuție mai omogenă a intensităților, deoarece
toate probele au defecte cu diferite tipuri de țesut osos în interior.
Țesut osos nou format poate fi detectat în zone unde se așteaptă să fie
vizibil osul nativ. În ceea ce privește acest aspect, trebuie să considerăm că
pentru a susține și a menține vindecarea osoasă, vascularizația și distribuția
celulelor specifice acestui proces, este necesară existența unei structuri
topografice care să ghideze regenerarea și mineralizarea. Acesta este motivul
pentru care, în defectele lăsate goale pentru vindecare, acest proces pornește
de la periferie spre centrul defectului. Prin urmare, țesutul osos nou este
produs în vecinătatea celui nativ, bine mineralizat. În defectele în care
regenerarea ghidată este realizată prin diferite tipuri de particule osoase,
aceste particule acționează ca suport pentru inițierea formării osoase. În acest
caz, țesutul osos nou format poate fi observat nu numai la periferia defectelor,
ci și în partea centrală a acestora, în conexiune cu particulele osoase de
xenogrefă.
În ceea ce privește suprapunerea particulelor osoase artificiale cu osul
nativ, trebuie să se țină seama de două aspecte:
(I) defectele create în zona calvariei a animalelor au fost lăsate să fie
vindecate in vivo, caz în care este evidentă o dinamică, deoarece pot
apărea diferite mișcări locale ale xenogrefei (așa cum este și cazul
subiecților umani); totuși, modelul animal ales reduce la minim aceste
mișcări, calvaria fiind zona predilectă din acest punct de vedere.
(II) din cauza proceselor de remodelare și resorbție osoasă care au loc
întotdeauna în etapa inițială a vindecării, xenogrefa trebuie plasată în
exces în defect. Prin urmare, este posibil ca particulele osoase
artificiale din interiorul defectului să ajungă la periferia defectului, acolo
unde există os nativ. În figura 16 se poate observa că pe toate
69
imaginile luate în considerare sunt prezente toate cele trei tipuri de os:
nativ, artificial și os nou format (mai puțin mineralizat). Acest lucru
poate fi observat și din figura 12, dar numai analiza din figura 16
evidențiază diferitele tipuri de os, după utilizarea programului dezvoltat.
Un alt aspect luat în calcul se referă la efectul speckles (interferențe

parazit ale semnalului laser reflectat de țesut) care modulează semnalul de
intensitate al OCT. Acestea nu au fost evaluate prin medierea spațială din
figura 16, pentru a se evita reducerea clarității. Cu toate acestea, evaluările în
sine au implicat un proces de mediere. Nu am analizat un singur punct en-
face, unde efectul speckles poate fi atenuat doar prin media ponderată a mai
multor imagini en-face produse în diferite momente, ci am adăugat
luminozitatea unei colecții de puncte.
Utilizând datele obținute, a fost efectuată o analiză statistică a
rezultatelor, folosind testele ANOVA și Tukey. Rezultatele analizei sunt
prezentate în figurile 17,18. Analiza statistică evidențiază informațiile obținute
cu privire la curba de vindecare a țesutului osos: prin efectuarea unei
comparații între cele trei grupuri de studiu rezultatele au arătat diferențe
semnificative în procesul de vindecare, în funcție de momentul vindecării și de
tratamentul aplicat. Calculele statistice au inclus toate valorile obținute pentru a
atenua pe cât posibil erorile. Din 600 de imagini en-face obținute, am selectat
40 de imagini pentru fiecare eșantion, poziționate ținând cont de adâncimea
specifică a fiecărui eșantion, așa cum s-a remarcat din scanarea B furnizată de
sistem. În acest fel, a fost oferită o acoperire completă a întregii adâncimi a
defectului.
După cum se poate concluziona din figura 17, s-au constatat diferențe
cu semnificație statistică între cele două grupuri de control, pozitiv B și negativ
A. Procentul osului nou format a fost mai mare pentru perioada de vindecare
de 30 de zile decât pentru 21 sau 14 zile, ambele pentru control negativ,
Grupul A (în care defectele s-au vindecat spontan) și pentru controlul pozitiv,
Grupul B (în care s-a adăugat grefă de os bovin la nivelul defectului osos).
70
71
Fig. 17 Valori medii și abateri standard pentru reprezentarea (A) a osului nativ, (B) xenogrefă (os
bovin), (C) țesut osos nou format în grupele studiate, numerotate de la I la IX, în funcție de timpul
de vindecare și de tipul a tratamentului aplicat:
(I) control negativ Grupul A, timp de vindecare 30 de zile (defect vindecat spontan);
(II) control pozitiv Grupul B, timp de vindecare 30 de zile (defect umplut cu xenogrefă de os bovin);
(III) grupul de studiu C, timp de vindecare 30 de zile (defect umplut cu xenogrefă; s-a aplicat radiație laser);
(IV) control negativ Grupul A, timp de vindecare 21 de zile (defect vindecat spontan);
(V) control pozitiv Grupul B, timp de vindecare 21 de zile (defect umplut cu xenogrefă);
(VI) grupul de studiu C, timp de vindecare 21 de zile (defect completat cu xenogrefă; s-a aplicat radiație laser);
(VII) control negativ Grupul A, timp de vindecare 14 zile (defect vindecat spontan);
(VIII) control pozitiv Grupul B, timp de vindecare 14 zile (defect umplut cu xenogrefă);
(IX) grupul de studiu C, timp de vindecare 14 zile (defect umplut cu xenogrefă; radiație laser aplicată).
Fig. 18 Comparație între cele trei grupuri de studiu privind osul nou format, cu semnificație din
punct de vedere statistic (P <0,05).
72
Cea mai importantă variație a fost găsită prin efectuarea unei

comparații între grupurile B și C, evaluând astfel efectul fotobiomodulării
asupra procesului de vindecare a țesutului osos, în cazul aplicării tehnicilor de
regenerare tisulară ghidată. Diferențe semnificative au fost constatate de-a
lungul analizei statistice pentru perioada de vindecare de 21 de zile, unde s-a
observat că radiația laser a avut cel mai mare efect, prin inducerea formării
celei mai mari cantități de os nou (a se vedea rezultatele V și VI din figurile 17
,18). De asemenea, ar trebui să luăm în considerare faptul că efectul de
fotobiomodulare nu se produce imediat, fiind un efect cumulat, prin urmare
poate apărea până la sfârșitul perioadei de evaluare. Rezultatele obținute cu
OCT au fost confirmate la efectuarea examinării histologice a probelor, așa
cum se arată în exemplele din figura 19 A, B.
Rezultatele obținute prin analiza histologică demonstrează că imaginile
prezentate în figura 16 reprezintă tipurile de țesut indicate în analizele
anterioare. Proximitatea particulelor de os artificial de osul nativ sau nou format
reprezintă un proces normal de vindecare, care este bine cunoscut și
demonstrat în literatura de specialitate. Acest fenomen provine de la faptul că
particulele de xenogrefă sunt utilizate nu doar pentru a compensa pierderea
țesutului osos, ci în mod predilect pentru a forma o structură topografică care
să faciliteze procesul de creștere osoasă; acest lucru este esențial în
vindecarea defectelor de dimensiuni mari. Rezultatele obținute în cadrul
studiului prezent sugerează că efectele pozitive ale fotobiomodulării asupra
proceselor de reparație osoasă depind de timp, având un impact mai mare în
timpul fazelor inițiale ale vindecării (figurile 17,18). Această concluzie este
susținută de rezultatele altor grupuri de cercetare, care au utilizat alte metode
de investigare decât OCT201,232,233. Analiza histologică calitativă și analiza
histometrică au arătat că fotobiomodularea poate îmbunătăți procesul de
formare a osului în defectele osoase umplute sau nu cu grefă osoasă bovină,
dar fără a accelera resorbția particulelor din acest material în interiorul
defectului osos234.
73
B
Fig. 19. Colorația tricromă Masson 10 ×, care demonstrează rezultate diferite pentru (A) grup V
(grup pozitiv de control B, timp de vindecare 21 de zile, defect umplut cu grefă de os bovin) și (B)
grupa VI (studiu de grup C, timp de vindecare 21 de zile, defect umplut cu grefă osoasă bovină; s-a
aplicat radiație laser). Câteva elemente celulare inflamatorii, material eozinofilic omogen încrucișat
cu țesut fibros într-o cantitate mică (aproximativ 2:1) și granuloame din materialul de sutură este
prezentat în (A). Lamele osteoide care tind să lege țesutul osos de materialul eozinofil (care este
reprezentat de grefa osoasă bovină) sunt prezentate în (B), unde unele dintre lamele osoase sunt
delimitate focal de osteoblaste. *, lamele osteoide.
74
4.5. CONCLUZII
O analiză cantitativă a procesului de vindecare a defectelor osoase de

la nivelul calvariei rasei Witsar a fost realizată folosind tomografia în coerență
optică. Astfel de studii sunt esențiale pentru a evalua eficiența diferitelor tehnici
care pot fi utilizate în regenerarea osoasă, luând în considerare, în special,
complexitatea procesului de vindecare și numărul mare de factori care îl
influențează. Multimodal CMS / SS OCT a fost aplicat pentru a reda imagini și
a analiza diferite grupuri luate în considerare în evaluarea procesului de
vindecare și regenerare osoasă: grupul A control negativ, grupul B control
pozitiv (cu biomaterial) și grupul C, de studiu (cu biomaterial și biomodulare).
Imaginând defectul osos și folosind C-scan / imagini en-face (precum și B-scan
și imagini confocale), au fost conturate concluzii statistice consistente în cadrul
studiului. În esență, rezultatele obținute se pot sintetiza astfel: cantitatea cea
mai mare de țesut osos nou format se regăsește în grupul de studiu C, urmat
de grupul B și ulterior, de grupul A. Analizând evoluția cantității de os nou
format în timp (prin efectuarea eutanasiei specimenelor după 14, 21 și 30 de
zile), cea mai semnificativă diferență a fost înregistrată după 21 de zile, deci
după aproximativ două treimi din intervalul de timp total analizat. După mai
mult timp luat în considerare, cantitățile de os tind să se apropie, cu tendința
de a umple defectul disponibil. În studiu au fost incluse imagini histologice,
pentru a demonstra validitatea ipotezelor făcute cu privire la diferitele tipuri de
os identificate în studiu229,235-237.
Din cunoștințele deținute până în prezent, aceasta este prima dată
când OCT a fost folosit ca instrument pentru a evalua efectele fotobiomodulării
cu laser asupra regenerării osoase. În ciuda limitărilor inerente ale metodei,
rezultatele obținute și statisticile efectuate utilizând OCT au fost în acord cu
studiile anterioare care au abordat vindecarea osoasă folosind alte metode,
inclusiv standardul de aur al evaluării calitative a țesutului osos, examinarea
histologică.
Ca atare, consider că această cercetare reprezintă un progres în ceea
ce privește imagistica en-face ca metodă de evaluare a regenerării osoase.
Avantajul major al metodei este că poate fi aplicată pentru evaluări in vivo,
folosind probe de mână cu scanare laser în cavitatea orală238 .
75
Capitolul 5.
STUDIUL HISTOLOGIC AL EȘANTIOANELOR
PRELEVATE
5.1. EXAMINAREA HISTOLOGICĂ A PROBELOR
Deși invaziv și sensibil ca tehnică de lucru, standardul de aur în ceea

ce privește procesele de vindecare tisulară rămâne examinarea histologică,
motiv pentru care studiul experimental condus include realizarea și
interpretarea secțiunilor histologice. O serie de parametri biologici trebuie să fie
evaluați în repararea defectelor osoase, de exemplu, cantitatea de os nou
format, resturile de biomateriale, celulele prezente, vascularizația și porozitatea
biomaterialului, reacția inflamatorie sau cea de corp străin. Determinarea
acestor caracteristici structurale ce influențează creșterea osoasă a
reprezentat o provocare majoră pentru analizele histologice convenționale,
deoarece ele depind de interpretarea anatomică tridimensională. Este nevoie
de un număr mare de secțiuni histologice pe eșantion pentru a determina orice
caracteristică tridimensională de regenerare osoasă, fiind o operațiune foarte
complicată și consumatoare de timp.
În cazul de față, probele obținute în urma experimentului animal au fost
fixate în soluție de formol 10%, urmată de un agent de decalcifiere moderat.
Blocurile de parafină rezultate în urma prelucrării au fost folosite pentru a
realiza secțiuni suplimentare (grosime de 4 μm, Thermo Scientific ™ HM 355S
Automatic Microtome, SUA), care au fost colorate cu hematoxilină și eozină
(HE) și au fost examinate în continuare la un microscop Leica DM750 (Leica
Microsystems, Wetzlar, Germania).
5.2. REZULTATE ANALIZĂ HISTOLOGICĂ
Examenul histologic, așa cum se arată în Fig. 20-22, a evidențiat

aspecte interesante, diferite pentru grupele NC (control negativ), PC (control
pozitiv) și +LLLT (grup de studiu, care a urmat tratament de fotobiomodulare),
în funcție de perioada de vindecare.
Pe fragmentele examinate recoltate în ziua a 14-a, au fost identificate
zone extinse de necroză și de extravazat hematic în grupul supus vindecării
76
spontane (grup NC, Fig. 20a). Celelalte două grupuri (PC și + LLLT, Fig. 20b
și, respectiv, Fig. 20c) au arătat un material eozinofil omogen, un „corp străin”
cu formare de granulom focal. Fragmentele grupului +LLLT au evidențiat țesut
conjunctiv fibros (tânăr) bine reprezentat și infiltrat inflamator scăzut,
comparativ cu restul grupelor.
Fig. 20(a). Probele după 14 zile de vindecare: grup NC. N- necroză; EM-material eozinofil; CT-țesut
conjunctiv; G-granuloame; Ob-osteoblaste; OT-țesut osos. Colorare HE (stânga), mărire originală:
10x, Tricromă Masson (dreapta), mărire originală: 10x
77
Fig. 20(b). Probele după 14 zile de vindecare: grup PC. N- necroză; EM-material eozinofil; CT-țesut
conjunctiv; G-granuloame; Ob-osteoblaste; OT-țesut osos. Colorare HE, mărire originală: 10x,
Tricromă Masson (dreapta), mărire originală: 20x. Bogat infiltrat inflamator polimorf predominat
granulocitar, arii extinse de necroză fibrinoidă (N), țesut conjunctiv cu benzi subtiri de colagen,
”corp străin” în periferie.
78
Fig. 20(c). Probele după 14 zile de vindecare: grup +LLLT. N- necroză; EM-material eozinofil; CT-
țesut conjunctiv; G-granuloame; Ob-osteoblaste; OT-țesut osos. Colorare HE, mărire originală:
10x, Tricroma Masson (dreapta), mărire originală: 10x. Țesut conjunctiv fibros (CT) ce înglobează
material eozinofil omogen, prezente celule gigante multinucleate (CGM) și infiltrat inflamator.
79
Fragmentele recoltate la 21 de zile după intervenția chirurgicală au arătat o

reducere a infiltratului inflamator și a granuloamelor de corp străin (Fig. 21 a-c).
Acestea au fost localizate cu precădere la periferie, țesutul conjunctiv fibros
cuprinzând material eozinofil. Grupul NC a dezvăluit țesut conjunctiv fibrotic care a
inclus zone opace optic și mai mult infiltrat inflamator (Fig. 21 a). Grupul +LLLT
prezintă țesut osos nou format, cu zone bogate în osteoblaste (Fig. 21 c).
Fig. 21(a). Probele după 21 zile de vindecare: grup NC. N- necroză; EM-material eozinofil; CT-țesut
Tricromă Masson (dreapta), mărire originală: 10x. Bogat țesut conjunctiv fibros (CT), arii de
osteoid (Ob), extravazate hematice
80
Fig. 21(b). Probele după 21 zile de vindecare: grup PC. N- necroză; EM-material eozinofil; CT-țesut
Tricromă Masson (dreapta), mărire originală: 10x. Material eozinofil abundent care este disecat de
tesut fibros, prezente celule gigante multinucleate.
81
82
10x, Tricromă Masson (dreapta), mărire originală: 10x. Lamele osteoide care tind să facă legătura
între țesutul osos (OT) și materialul eozinofil, unele lamele osoase sunt delimitate focal de
osteoblaste (Ob).
După 30 de zile de vindecare, s-a arătat că țesutul conjunctiv fibros

încorporează material eozinofil omogen și lamelele osoase nou formate (Fig.
22 a-c), osteoblastele fiind în număr mare în jurul lamelelor osoase, iar
procesul inflamator a fost prezent, după cum a fost evidențiat de celulele
multinucleare gigant.
83
Fig. 22(a). Probele după 30 zile de vindecare: grup +LLLT. N- necroză; EM-material eozinofil; CT-
10x, Tricromă Masson (dreapta), mărire originală: 10x. Lamele de țesut osos în diferite stadii de
maturare cu țesut conjunctiv fibros (CT) în cantitate scăzută
84
Fig. 22(b). Probele după 30 zile de vindecare: grup +LLLT. N- necroză; EM-material eozinofil; CT-
10x, Tricromă Masson (dreapta), mărire originală: 4x. Țesut conjunctiv fibros (CT) ce înglobează
țesut osos (OT) nou format și material eozinofil. Lamele de țesut osos tapetate de osteoblaste,
bogat infiltrat inflamator polimorf cu celule gigante multinucleate (CGM) dispus difuz.
85
10x, Tricromă Masson (dreapta), mărire originală: 10x. Țesutul conjunctiv fibros(CT) înglobează
materialul omogen eozinofil, se identifică fragment de tesut osos (OT), bogat infiltrat inflamator
dispus difuz, celule gigante multinucleate.
86
5.3. DISCUȚII ȘI CONCLUZII
Evaluarea histologică reprezintă în continuare ”standardul de aur”,

fiind relevantă în evaluarea infiltratului inflamator, a matricei osoase
trabeculare, a periostului și a formării osoase noi 240. În cazul studiului
nostru experimental animal, examinarea histologică a relevat diferențe
semnificative cu privire la prezența infiltratului inflamator în diferite grupuri
de studiu: la 14 zile, cantitatea redusă de infiltrat inflamator în grupul
+LLLT permite organizarea țesutului conjunctiv tânăr, care acționează ca
un precursor al țesutului osos nou format. Atunci când analizăm perioada
de vindecare de 21 de zile, reducerea procesului inflamator este mai
evidentă în grupele PC și +LLLT. În același timp, pe măsură ce se
formează țesutul osos, grupul +LLLT prezintă zone bogate în osteoblaste.
Pe măsură ce perioada de vindecare crește, diferențele dintre grupurile
analizate în ceea ce privește inflamația sunt reduse, dar celule
multinucleare gigant pot fi încă detectate. Într-un studiu similar, evaluarea
histologică a arătat o creștere statistică semnificativă a formării osoase în
grupul LLLT în raport cu grupul de control (p <0,05). În plus, inflamația a
fost redusă semnificativ în grupul LLLT comparativ cu grupul de control 241.
În concluzie, se pare că efectele maxime ale fotobiomodulării apar
în stadiile incipiente ale vindecării osoase, atunci când o cantitate mai
mică de infiltrat inflamator este asociată cu formarea crescută de țesut
osos tânăr. Deși are o importanță semnificativă, evaluarea histologică este
invazivă, ceea ce nu permite examinări suplimentare la nivelul acelorași
probe.
87
Capitolul 6.
STUDIUL EȘANTIOANELOR PRELEVATE CU
AJUTORUL MICROTOMOGRAFIEI SYNCHROTRON
6.1. SCANAREA EȘANTIOANELOR RECOLTATE
Microtomografia cu raze X (micro-CT) a probelor a fost efectuată la

SYRMEP, în cadrul bazei de cercetare synchrotron ELETTRA (Basovizza
(TS), Italia). Pe toată perioada investigației, probele au fost conservate în
formalină tamponată 4%, pH 7.0. Pentru ca pe toată perioada scanării, probele
să rămână nemișcate, acestea sunt fixate în ceara de înregistrare a ocluziei tip
Kerr. Datorită faptului că scanarea durează timp îndelungat, probele sunt
învelite în folie tip Parafilm ce prezintă proprietăți plastice, coezive, ductile și
rezistență la apă, ceea ce conferă țesuturilor pe toată perioada examinării,
aceleași proprietăți și caracteristici, evitând desicarea prin evaporare a
formalinei în care au fost conservate (Fig. 23, a,b).
Fig. 23. Fixarea eșantionului în ceară tip Kerr (a) și scanarea cu ajutorul Microtomografiei
Synchrotron (B)
88
Probele au fost investigate folosind următoarele setări: voxeli izometrici

cu dimensiunea marginii de 9 μm; timp de expunere de 1 s/proiecție; energia
fasciculului de raze X322 de 19 keV. Distanța de detectare a probelor a fost
setată la 300 mm, ceea ce permite măsurarea semnalului de contrast de fază.
Configurația contrastului de fază diferă de imaginea tomografică
convențională, care se bazează exclusiv pe contrastul de atenuare. Refracția
fasciculului de raze X care trece prin fiecare țesut este descrisă de indicele de
refracție, n(r)=1-δ(r)+iβ (r), unde δ este decrementul indicelui de refracție și β
este atenuarea index. Deoarece δ este sensibil mai mare decât β, abordarea
contrastului de fază este mult mai precisă decât abordarea de absorbție.
Descreșterea indicelui de refracție δ este proporțională cu densitatea medie a
electronilor, care la rândul său este aproape proporțională cu densitatea de
masă  (exprimată în mg/cm3).
În unele cazuri, în special în probe cu absorbție slabă sau în probe
constând în principal dintr-o singură fază, părțile reale și imaginare ale indicelui
de refracție sunt proporționale între ele, adică δ(r)=∙β (r), unde  nu depinde
242,243
de coordonatele spațiale . Întrucât eșantioanele noastre sunt constituite în
principal din os mineralizat, adică dintr-o singură fază cu o densitate spațială
variabilă și având în vedere distanța detector-eșantion în regimul de câmp
apropiat226, aproximarea anterioară este valabilă și raportul δ / β, care a fost
setat la 200.
6.2. EVALUAREA CANTITATIVĂ A OSULUI NOU FORMAT
Reconstrucția tomografică completă a fost realizată folosind software-ul

open source SYRMEP Tomo Project (STP)244. Ulterior, software-ul VG Studio
MAX 1.2 (Volume Graphics, Heidelberg, Germania) a fost utilizat pentru a
genera imagini 3D, unde nivelurile de gri sunt proporționale cu densitatea de
masă . Algoritmul Scatter HQ cu un factor de suprapunere de 5.0 a fost
utilizat pentru a imagina secțiunile 2D și reconstrucțiile 3D. Vârfuri diferite în
scala nivelelor de gri reprezintă faze diferite în cadrul eșantioanelor; volumul
fiecărei faze este obținut prin înmulțirea volumului unui voxel (~ 730 μm 3) cu
numărul de voxeli care stau la baza vârfului asociat cu faza relevantă. Un prag
setat manual a fost aplicat histogramelor pentru a separa osul aflat în curs de
remodelare de osul matur și acesta, la rândul său, de faza biomaterialului
89
utilizat. Pragurile au fost stabilite la 108, respectiv 147. O analiză morfometrică

a fost realizată pentru a evalua procentele de volum (vol.%) din următoarele
faze în ceea ce privește volumul total mineralizat: os sub remodelare, os matur
și biomaterial. Mai mult, a fost exploatat semnalul de refracție n, proporțional
liniar cu densitatea de masă, pentru a calcula distribuția densității de masă
osoasă relativă (MDDr) a fiecărei probe.
Așa cum s-a procedat recent în alte studii245, parametrii MDDr au fost
calculați cu referire strictă la porțiunea osoasă mineralizată a histogramelor, cu
intensitățile normalizate, pentru fiecare eșantion, de zona de sub curbă.
Valorile absolute ale densității masei osoase (concentrații de calciu -
greutate%) nu au putut fi obținute: de fapt, n ar putea fi părtinitor datorită
raportului constant δ / β utilizat în recuperarea fazei Paganin 246. Cu toate
acestea, întrucât eșantioanele sunt comparabile din punct de vedere al mărimii
și compoziției, diferențele relative în distribuția densității masei dintre ele pot fi
evaluate.
Astfel, exponentul r a fost utilizat pentru a indica valori relative pentru
toți parametrii de distribuție a densității masei osoase. Bazându-se pe
abordarea lui Roschger247, au fost extrași următorii parametri: MDDrmean
(densitatea relativă de masă medie), MDDrpeak (cea mai frecventă densitate
relativă de masă), MDDrlow (0,5 %) și MDDrhigh (99,5th %) și MDDrfwhm (lățimea
completă la jumătatea distribuției maxime). Am selectat în mod arbitrar pragul
P = 0,005, considerându-l un compromis bun între menținerea unei sensibilități
bune pentru valorile scăzute și ridicate în MDDr și reducerea posibilelor
artefacte provenite din efectul volumului parțial (la evaluarea MDDrlow). Acest
calcul post-procesare a parametrilor MDDr a fost făcut folosind software-ul
PeakFit (Systat Software, San Jose, CA).
6.3. REZULTATE
Imaginile micro-CT ale defectelor investigate din probele prelevate sunt

prezentate în Fig. 24. Toate țesuturile, cu excepția osului mineralizat și a
biomaterialului utilizat în grefarea defectelor au fost făcute transparente.
Reconstituirile 3D ale eșantioanelor reprezentative sunt prezentate în Fig. 24a-
c, Fig. 24g-i, și Fig. 24m-o, pentru probe recoltate la 14, 21, respectiv 30 de
zile după intervenția chirurgicală. De asemenea, sunt raportate secțiuni
90
transversale reprezentative, pentru aceleași grupe de studiu, în Fig. 24d-f, Fig.

24j-l și Fig. 24p-r.
Două aspecte sunt evidente în reconstrucțiile 3D ale eșantioanelor
reprezentate: în primul rând, osul nou format (țesutul reprezentat în roșu în fig.
24, a-c, g-i, m-o) se formează în principal pe margini și nu în centrul defectului,
iar acest lucru apare nu numai în grupul NC, ci și în grupurile PC și +LLLT
(adică acolo unde este prezentă xenogrefa); în al doilea rând, cu excepția
grupului +LLLT, este evidentă o creștere a volumului osului nou format în
perioada cuprinsă între a 14-a și a 21-a zi de la intervenția chirurgicală. Mai
mult, chiar dacă prezența masivă a biomaterialului împiedică o evaluare pe
deplin fiabilă, se pare că după 14 zile de la operație, grosimea osului nou
format pe marginile defectului este mai mare în grupul + LLLT decât în grupul
PC, după cum este indicat cu săgeți galbene în Fig. 24b, c. Acest tip de
vindecare nu este la fel de evident pentru o perioadă mai lungă de timp. Cu
toate acestea, din simplele reconstrucții 3D și din secțiunile transversale
reprezentative ale defectelor osoase, nu au putut fi evaluate volumele exacte
în ceea ce privește cantitatea de țesut osos în curs de remodelare; astfel, am
procedat la o analiză cantitativă volumetrică.
91
Fig. 24. Imagini micro-CT ale defectelor în stadii diferite de vindecare, în eșantioane prelevate
reprezentativ. (a-f) Grupa I: probe recoltate după 14 zile: (a-c) Reconstituiri 3D: (a) control negativ (NC);
(b) control pozitiv (PC); (c) tratat cu LLLT; (d-f) secțiuni transversale ale defectului: (d) NC; (e) PC; (f)
tratat cu LLLT. (g-l) Grupa II: probe recoltate după 21 de zile: (g-i) Reconstituiri 3D: (g) NC; (h) PC; (i)
tratat cu LLLT; (j-l) secțiuni transversale ale defectului: (j) NC; (k) PC; (l) tratat cu LLLT. (m-r) Grupul III:
probe recoltate după 30 de zile: (m-o) Reconstrucții 3D: (m) NC; (n) control PC; (o) tratat cu LLLT; (p-r)
secțiuni transversale ale defectului: (p) NC; (q) PC; (r) tratat cu LLLT. În reconstrucțiile 3D țesutul cenușiu
este osul matur; țesutul roșu este osul în curs de remodelare; țesutul alb este biomaterialul adăugat;
săgețile galbene indică osul nou format, la periferia defectelor. În secțiunile transversale ale defectului:
țesutul alb este biomaterial; culorile reprezintă mineralizarea osului proporțional cu harta din partea de jos
(albastru înseamnă densitate de masă scăzută; roșu înseamnă densitate de masă mare).
92
Prima etapă a studiului a fost concentrată pe investigarea

microarhitecturii osoase și pe evaluarea procentelor de volum (vol.%) ale
diferitelor faze mineralizate (țesut osos în curs de remodelare, țesut osos
matur și biomaterial), în raport cu volumul osos mineralizat total. În fiecare
probă recoltată, a fost selectat un sub-volum care circumscrie complet
defectul, rezultând datele morfometrice raportate în fig. 25. Așa cum se arată
în fig. 25a-c, procentele de volum ale țesutului osos în curs de remodelare în
raport cu cantitatea de țesut osos matur a crescut în timp. Această tendință a
fost observată la toate grupurile, cu excepția celei tratate cu laser (+ LLLT),
unde s-a constatat că la 14 zile de la intervenția chirurgicală, țesutul osos nou
format se găsește deja în cantitate mai mare.
Așa cum s-a observat, luând în considerare faza roșie în reconstrucțiile
3D din fig. 24a, g, m și pe baza cuantificării raportate în fig. 25, eșantioanele
din grupul NC prezintă procente mai mari de os sub remodelare decât în
celelalte grupuri, cu excepția celor de perioadă mai scurtă, adică la 14 zile
după operație, când cantitatea de os sub remodelare a fost observată crescută
prin utilizarea fotobiomodulării (LLLT), cu 50% în raport cu grupa NC și cu 45%
în raport cu grupa PC. Mai mult, așa cum s-a raportat și în fig. 25, pentru
perioadele mai lungi de 14 zile de la operație, cantitatea de os aflat în curs de
remodelare a fost crescută prin utilizarea fotobiomodulării cu doar 10% în
comparație cu grupul PC. Se poate observa în acest sens o creștere aproape
notabilă a reconstrucțiilor 3D din fig. 24.
93
Fig. 25. Analiza morfometrică cantitativă. (a-c) Procentele medii de volum (vol.%) ale diferitelor
faze mineralizate (osul în curs de remodelare, osul matur și biomaterial) raportat la volumul total
mineralizat: (a) grup NC; (b) grup PC; (c) + grup LLLT. (d-f) Analiza volumetrică cantitativă a
țesutului osos în fază de remodelare, după (d) 14 zile, (e) 21 de zile și (f) 30 de zile de la operație.
Barele de eroare sunt indicate.
A doua etapă a studiului a fost concentrată pe investigarea distribuției

relative a densității minerale osoase (MDDr), adică asupra evaluării
concentrației și distribuției calciului (% în greutate) în diferitele grupuri de
studiu. Astfel, aceleași sub-volume investigate anterior pentru calcularea
procentelor de volum au fost, de asemenea, investigate pentru cartografierea
MDDr. Conceptul și rezultatele care se referă la setul complet de indici sunt
prezentate în fig. 26. Un sector al histogramei nivelurilor de gri pentru un
eșantion este prezentat în fig. 26 a, vârful spre stânga referindu-se la osul
mineralizat și vârful spre dreapta referindu-se la biomaterialul utilizat. Acest
studiu efectuat folosind abordarea Roschger247 s-a concentrat pe faza osoasă
mineralizată.
Parametrii investigați sunt indicați în fig. 26b, iar rezultatele, obținute
din montarea profilului, sunt enumerate în fig. 26c. În grupurile NC și PC, vârful
și valorile medii au urmat o tendință similară, care scade în timp, spre
94
deosebire de grupul +LLLT, care nu prezintă o tendință specifică.

Comportamentul opus a fost evidențiat luându-se în considerare valorile
FWHM: o tendință specifică în timp nu a fost prezentă în grupurile NC și PC, ci
în grupul +LLLT, unde a existat o tendință de scădere clară în timp, cu referință
specială de la 14 la 21 zile după intervenția chirurgicală. În cele din urmă,
valoarea crescută analizată a scăzut, în timp, în toate grupurile analizate.
Totuși, după 14 zile, a fost detectată tendința opusă luând în considerare
valorile FWHM, în timp ce vârful, media și valorile mici au fost maxime în
grupul NC și minime în grupul +LLLT.
Fig. 26. Studiul distribuției densității de masă relativă (MDDr). (a) Fragment din histograma unei
probe: vârful din stânga se referă la osul mineralizat total, vârful din dreapta se referă la
biomaterialul (xenogrefă) utilizat pentru umplerea defectului; (b) studiul osului mineralizat: sunt
indicați parametrii investigați cu abordarea Roschger247. Pragul de p = 0.005 a fost selectat, ca un
bun compromis de a menține o sensibilitate bună și de a reduce în același timp potențiale
artefacte datorate efectelor parțiale de volum în evaluarea MDDrlow; (c) parametrii care derivă din
profil sunt indicați.
95
6.4. DISCUȚII
Deși neinvaziv și cu o mare fidelitate în analizele efectuate, metoda de

analiză și cuantificare cu ajutorul OCT pe țesut osos a fost realizată, din
cunoștințele avute până în prezent, pentru prima dată, cu ocazia studiului
descris în capitolul anterior. Rezultă, așadar, nevoia de verificare, comparație
și rigurozitate științifică înainte de a formula niște concluzii pertinente și
susținute. Astfel, știind că încă din anul 2004, Micro-CT a fost recomandat ca
„standard de aur‟ pentru analiza micro-structurii osoase, datorită în principal,
rezoluției mari (se apropie de 10 μm)248, în studiul de față s-a considerat
necesară includerea sa ca și metodă de imagistică și analiză detaliată a
vindecării osoase.
Rezultatele obținute arată o vindecare superioară în cazul grupelor în
care s-a aplicat tratament biomodulator, decât în cazul grupului tratat cu
xenogrefă. Acest efect a fost observat în mod clar pentru tratamente de timp
scurt, adică la 14 zile după intervenția chirurgicală. Pentru perioade mai lungi
de tratament, volumele osoase nou formate au devenit comparabile în
defectele grefate, cu sau fără tratament cu laser. Într-adevăr, așa cum se arată
în fig. 25d-f, cantitatea de os sub remodelare în defectele vindecate cu suport
de xenogrefă a crescut sensibil în procente de volum după fotobiomodulare
numai în grupul de 14 zile, deci nu pentru perioade mai lungi de timp. Prezența
unor cantități mai mari de volume osoase aflate în curs de remodelare în
grupul + LLLT a indicat cantități mai mari de formare osoasă, așa cum s-a
observat deja în studiile in vitro anterioare. Nicolau și colab.249 și Freitas211 au
arătat o activitate celulară mai mare atunci când iradiază defectele femurului
de șobolan și tibie cu lasere de 660 nm și 633 nm. Khadra250 a iradiat defecte
calvariene cu un laser de 830 nm și a obținut o creștere a țesuturilor moi și
osoase în grupul de studiu. Weber251 a arătat că vindecarea grefei osoase
autologe în defectele osoase a fost îmbunătățită prin fotobiomodulare.
Mai mult, așa cum s-a demonstrat folosind analiza distribuției densității
de masă relativă (MDDr), după 14 zile de la intervenția chirurgicală, vârful,
media și valorile mici au fost minime în grupul + LLLT și maxime în grupul NC,
în timp ce s-a observat tendința opusă pentru valorile FWHM. Aceste date,
luate în considerare colectiv, indică o distribuție mai largă a densității masei
după tratamentul de fotobiomodulare, cu o prezență proeminentă a zonelor cu
mineralizare scăzută, deci a țesutui osos aflat în curs de remodelare.
96
Pentru perioade de timp mai lungi de 14 zile (21, respectiv 30 de zile de

la intervenția chirurgicală), în comparație cu probele NC (în care defectele au
fost lăsate goale pentru vindecare spontană), defecte umplute cu xenografe,
adică atât în grupele de control pozitiv PC, cât și în grupele de studiu + LLLT,
eșantioanele au prezentat procente de volum mai mici sau similare de os în
curs de remodelare (adică os nou format mai puțin). Această observație este
evidențiată în fig. 24a-c, g-i, m-o, precum și în Fig.25a-c. De asemenea, este
confirmată de studiile anterioare252,253. De exemplu, Takauti252 a studiat
procesul de regenerare osoasă la calvariile de șoareci, cu defecte umplute cu
trei tipuri diferite de biomateriale: două xenografe (os bovin deproteinizat) și un
tip de alogrefă (fosfat de calciu bifazic). După opt săptămâni de vindecare, a
găsit o cantitate mai mare de os nou format atunci când a utilizat materiale
aloplastice, în timp ce cavitățile umplute cu os bovin deproteinizat au prezentat
o cantitate mai mare de grefă reziduală, probabil datorită resorbției sale lente.
Atunci când s-au comparat cu cavitățile de control, care au fost lăsate goale
pentru vindecarea spontană, au ajuns la concluzia că defectele umplute doar
cu cheag de sânge prezentau mai mult os nou format decât cavitățile umplute
cu xenogrefă și o cantitate similară cu defectele umplute cu material aloplastic.
Rezultatele lor au fost confirmate și de Rokn253.
Dovada că defectele lăsate pentru vindecarea spontană au prezentat
deja după trei săptămâni de vindecare (grup de 21 de zile) mai mult os nou
format decât cavitățile umplute cu xenogrefă ar putea fi cauzate de o anumită
întârziere a procesului de vindecare, care are loc în prezența biomaterialelor.
Am observat această întârziere în unele studii anterioare; în mod specific, am
observat că cinetica regenerativă din culturile in vitro pe diferite biomateriale a
arătat că bioresorbția grefei este mai accentuată până la a doua săptămână de
cultură, în timp ce regenerarea osoasă este întârziată în timp, cel mai probabil
deoarece celulele care cresc pe suportul oferit de grefă au nevoie de mai mult
timp să adere și apoi să înceapă să prolifereze242,243,254.
Mai mult, în studiul de față, biomaterialul ar fi putut exercita o acțiune
de limitare în ceea ce privește efectele fotobiomodulării asupra celulelor,
inhibând aceeași acțiune regenerativă a tratamentului cu laser, așa cum se
arată în fig. 27. În studiul realizat de Rokn253, analiza 3D bazată pe tomografia
cu fascicul conic nu a arătat nicio umplere în centrul cavităților vindecate
spontan, dezvăluind că osul nou format a fost format doar la marginile
defectului. Prin urmare, devine important să favorizăm osteo-conducția și
97
migrarea celulelor de la periferia defectului, folosind ca umplutură un

biomaterial care aderă la pereții defectului, fără să efectueze nicio acțiune de
barieră și de protecție, nici în ceea ce privește migrarea celulelor, nici posibila
acțiune de regenerare cu ajutorul fotobiomodulării.
Fig. 27. Imagini micro-CT ale defectelor regenerate în eșantion prelevat reprezentativ, evaluat la 30
de zile postoperator. Periferia defectului nu au fost acoperită cu xenogrefă, fiind astfel expusă
direct radiației laser. O mare cantitate de os nou format poate fi observată la periferia defectului,
așa cum este indicat cu săgețile galbene. A: reconstrucție 3D; B: secțiune transversală. Țesutul gri
este osul matur; țesutul roșu este osul în curs de remodelare; țesutul alb este biomaterial .
Cu toate acestea, în acest studiu, analiza volumetrică cantitativă a

osului aflat în proces de remodelare la cele trei momente de timp (14, 21 și 30
de zile de la intervenția chirurgicală) a arătat o vindecare mai bună atunci când
fotobiomodularea a fost aplicată pe defectul grefat decât în cazurile în care
defectul grefat nu a primit tratament cu laser. Acest efect a fost deosebit de
evident pentru cea mai scurtă perioadă de timp considerată, adică după 14 zile
de la intervenția chirurgicală. Aceste observații obținute folosind protocolul
inovativ de analiză descris anterior, evidențiază așadar, efectele pozitive ale
fotobiomodulării asupra procesului de regenerare osoasă, cu creșterea
consecutivă a cantității de os nou format. De asemenea, sugerează posibile
interacțiuni cu biomaterialele utilizate, care ar putea influența viitoarele
cercetări experimentale.
98
În studiul de față am selectat 14, 21 și 30 de zile de la intervenția

chirurgicală ca repere temporale pentru analiză, datorită faptului că, la
stabilirea perioadelor de urmărire a vindecării osoase în defectele calvariene
ale șobolanului, trebuie să se ia în considerare rata metabolică a șobolanului
Wistar. Cu cât animalul este mai mic, cu atât rata metabolică este mai mare în
comparație cu cea a omului: 30 de zile de viață ale omului corespund unei zile
de viață a șobolanului de laborator226. Aceasta înseamnă că o perioadă mai
scurtă de observare pentru obținerea eșantionării datelor este de obicei
necesară atunci când se folosesc animale mici în locul celor mai mari,
deoarece se vindecă mai repede. Perioade lungi de observații ar demonstra
potențial că atât grupurile de test, cât și cele de control ating o vindecare
avansată / completă a defectului, nereușind să dezvăluie potențialul benefic al
unui biomaterial222,227.
6.5. CONCLUZII
În studiul pe care l-am efectuat255, micro-CT a condus la obținerea de

informații noi și relevante despre un număr limitat de animale, care au fost
incluse în studiu. Relevanța protocolului de evaluare se bazează pe natura 3D
a analizei micro-CT, bazată la rândul său, pe stivuirea a 1000 de secțiuni 2D
succesive (fiecare cu o grosime de aproximativ 9 μm), mapând întregul
eșantion. Aceasta este de o importanță majoră, permițând reducerea la
minimum a numărului de animale sacificate, cu respectarea deplină a normelor
etice internaționale. Studiile noastre anterioare folosind aceeași metodă de
evaluare au arătat, de asemenea, capacitatea tehnicii micro-CT de a juca un
rol fundamental în caracterizarea avansată a siturilor tratate cu laser 256. Mai
mult, în studiile efectuate anterior s-a constatat o concordonță între OCT și
analizele micro-CT235,257.
99
Capitolul 7.
STUDIUL RETROSPECTIV AL TOMOGRAFIEI
COMPUTERIZATE CU FASCICUL CONIC ÎN CAZUL
PACIENȚILOR CARE AU URMAT TRATAMENT DE
FOTOBIOMODULARE
7.1. INTRODUCERE ȘI SCOPUL STUDIULUI
Eșecul chirurgical al implantelor dentare a fost evaluat în multe

studii și apreciat ca variind de la 3,2% până la 5% în cazul unui țesut osos
receptor de bună calitate și de la 1,9% la 20% în cazurile cu o calitate
osoasă slabă, majoritatea rapoartelor indicând o rată de eșec mai mare
(până la 65%) în osul moale 258. Densitatea osului are așadar impact
asupra succesului implantelor dentare, o densitate osoasă redusă
crescând riscul de eșec. În plus, calitatea și cantitatea slabă a țesuturilor
osoase sunt raportate ca factori de risc asociați cu resorbția excesivă și
afectarea procesului de vindecare după plasarea implantelor 259-262.
Densitatea minerală osoasă (BMD) este cel mai important
parametru obiectiv în diagnosticul și urmărirea unor boli osoase sistemice,
cum ar fi osteoporoza. De asemenea, BMD poate oferi informații despre
calitatea țesutului osos, oferind medicilor oportunitatea pentru a revizui
opțiunile de tratament. Fragilitatea și rezistența oaselor sunt direct
proporționale cu cantitatea și organizarea de substanță minerală, calciu și
fosfat din os 152.
CT este o metodă imagistică în care imaginile obținute ca secțiuni
din corp prin colimarea razelor X sunt transferate la un computer 263.
Detectoarele măsoară valoarea absorbției razelor X care trec prin
țesut 128,264 . MSCT, care este modalitatea de elecție pentru măsurările
densității osoase, are limitări în ceea ce privește măsurările numărului de
trabecule (Tb.N), grosimea medie a trabeculelor (Tb.Th) și distanța dintre
trabecule (Tb.Sp) datorită rezoluției (150-300 μm în plan și 300-500 μm
între planuri) mai mari decât dimensiunile trabeculare (50-200 μm) 145.
CBCT oferă câteva avantaje față de MSCT, cum ar fi accesibilitatea
crescută, costuri mai mici, confort mai mare pentru pacienți și o iradiere mai
mică. Deși doza mai mică de radiații în regiunea capului și gâtului a fost
citată drept cel mai important avantaj al CBCT față de CT, este
100
binecunoscut faptul că doza de iradiere CBCT depinde foarte mult de tipul

echipamentului și de setările de scanare 175. Volumul digital CBCT are formă
cilindrică și este compus din voxeli 265. Voxelii izotropi de dimensiuni mici, cu
o gamă largă de valori de gri îmbunătățesc calitatea imaginii și precizia
măsurărilor dimensionale, precum și vizualizarea ulterioară a structurilor
anatomice265. Volumul digital cilindric obținut prin rotirea unui fascicul de
raze X în formă de con în jurul capului pacientului se numește câmp vizual
(FOV). Mărimea FOV rămâne cel mai important factor de scanare în ceea
ce privește limitarea dozei de radiații și îmbunătățirea calității imaginii 266.
Spre deosebire de CT, voxelii imaginilor CBCT nu reprezintă valori absolute
de gri (Unitatea Hounsfield sau HU) 155. Au fost făcute diverse cercetări
pentru a evalua fiabilitatea acestui instrument imagistic în măsurările
densității osoase. Cantitățile mari de raze X împrăștiate și artefactele sunt
menționate ca fiind principalele cauze pentru fiabilitatea mai scăzută a
CBCT în evaluarea densității minerale osoase 267. Scanerele CBCT sunt
acționate la un kVp și mA mai mici decât MSCT, rezultând un raport
semnal-zgomot redus268. Nivelul de zgomot mai ridicat va provoca mai
multe neconcordanțe și o abatere standard mai mare a valorilor de gri
voxel269,270. În plus, întrucât fasciculul de raze de volum în CBCT este
proporțional mai mare decât cel colimat în MSCT, efectul acestor artefacte
este mai mare 268,180. Cu toate acestea, alte studii au arătat o corelație
ridicată între valorile CT și CBCT în ceea ce privește nuanțele de gri; prin
urmare, este sugerat că valorile voxel ale CBCT pot fi utilizate, în anumite
limite, pentru a estima densitatea minerală osoasă 271-275.
Scopul studiului este, așadar, de a obține o analiză cantitativă a
densității minerale osoase în cazul pacienților care au urmat tratamente
de fotobiomodulare, efectuând măsurători specifice tomografiei
computerizate cu fascicul conic, înainte și după aplicarea tratamentului
laser fiecărui caz. Obiectivele studiului vizează pe de o parte, analiza
efectelor tratamentului de fotobiomodulare la nivelul oaselor maxilare și,
pe de altă parte, evaluarea aplicabilității și a acurateței tomografiei
computerizate cu fascicul conic în aprecierea densității minerale osoase.
101
7.2. MATERIAL ȘI METODĂ DE LUCRU
Pentru a realiza o comparație între rezultatele obținute în cadrul

studiului experimental și particularitățile clinice ale aplicațiilor fotobiomodulării
în vindecarea osoasă la subiecții umani, studiul a inclus analiza retrospectivă a
tomografiei computerizate cu fascicul conic maxilare a 14 pacienți, 8 femei și 6
bărbați, cu vârste cuprinse între 24 și 74 ani, fără patologie asociată cu
influență în sfera orală și fără medicație cunoscută a afecta metabolismul osos
sau proprietățile calitative și cantitative ale acestuia. Pacienții selectați din baza
de date pusă la dispoziție în acest sens au avut investigație CBCT inițială,
anterior unei intervenții chirurgicale din sfera orală, care a fost urmată de
tratament prin fotobiomodulare și, de asemenea, au avut, după 8-12 luni, o
nouă investigație CBCT, fie pentru evaluarea calitativă și cantitativă a țesutului
osos în vederea inserării implanturilor dentare, fie pentru controlul implantelor
anterior inserate și protezarea acestora. Menționăm că toate aceste investigații
au fost realizate anterior studiului prezent, cu indicații medicale clare și fără
implicații științifice, pacienții semnând acord informat privitor la tratamentul cu
radiație laser instituit, acesta fiind protocolul de rutină în astfel de cazuri.
Toți pacienții au urmat același protocol de tratament cu laser după
finalizarea intervenției: imediat după efectuarea suturii, s-a aplicat proba
intraorală a laserului Gallium-Aluminum–Arsenide laser (GaAlAs) (MID-laser;
Serial no 8110131-4) de 808nm, 450 mW, în regim pulsat, administrându-se o
energie de 2 J în 3 puncte corespunzătoare fiecărui implant dentar inserat:
mezial, distal și apical, cumulând 6J / implant (fig. 28). Ședințele de tratament
s-au efectuat imediat postoperator și la o distanța ulterioară de 48h, timp de 2
săptămâni (un total de 8 ședințe), cu respectarea tuturor precauțiilor de
siguranță laser (atât pacientul, cât și echipa medicală au purtat ochelari de
protecție corespunzători lungimii de undă utilizată).
102
Fig. 28. Schema de reprezentare a celor 3 puncte de aplicare a radiației laser: mezial, distal și
apical, în dreptul fiecărui implant dentar inserat
Pentru a reduce la minim factorii care ar putea influența rezultatele

măsurătorilor și pentru consecvență180, analizăm datele înregistrate cu un
singur tip de echipament (ProMax 3D CBCT (Planmeca, Finlanda)), folosind
aceeași parametri de achiziție a imaginii (tensiune, intensitatea curentului,
dimensiunea voxelului și câmpul vizual): tensiune de 89 kV, intensitate a
curentului de 4-8 mA, câmp vizual cilindric (FOV) de 80 mm atât în diametru
cât și în înălțime, dimensiunea voxelului de 120µm. Toate imaginile obținute au
fost înregistrate folosind formatul de imagistică digitală și comunicații în
medicină (DICOM). În vederea analizei numărului CT, exprimat în HU, a fost
utilizat software-ul Romexis 4.5.1.R (Planmeca, Finlanda). Pentru fiecare
pacient, s-a analizat densitatea osoasă înainte și după aplicarea tratamentului
de fotobiomodulare, în aceleași arii de interes, cu aceeași dimensiune pentru
fiecare pacient. Aria zonelor de interes și poziționarea acestora a variat de la
un pacient la altul, în funcție de tratamentul pe care acesta l-a primit, scopul
fiind analiza cât mai multor sit-uri osoase care au urmat același tratament.
Măsurările se concentrează asupra osului trabecular, fiind cea mai omogenă
parte a țesutului osos și având avantajul de a fi fost descris și caracterizat în
ceea ce privește valorile HU măsurate, cu ajutorul CT convențional276. De
asemenea, osul trabecular reprezintă zona predilectă pentru plasarea
implantelor endoosoase, așadar modificările de la acest nivel pot influența
103
planul de tratament, evoluția și prognosticul cazului. Pentru o parte dintre

pacienți, am realizat și măsurători la nivelul corticalei vestibulare, acolo unde
aria de interes nu a primit nici un alt tip de tratament (spre exemplu adiții
osoase) decât cel de fotobiomodulare.
Pentru localizarea sit-urile țintă și înregistrarea numărului CT mediu,
precum și a abaterii standard, am folosit software-ul Romexis 4.5.1.R
(Planmeca, Finlanda). În fiecare sit, regiunea de interes este un volum
dreptunghiular de os, cu o arie medie de 38,43 mm2 pentru zona corticalei
vestibulare și o arie medie de 19,23 mm2 pentru volumul trabecular situat în
creasta alveolară. În total, au rezultat un număr de 18 sit-uri corticale
vestibulare analizate și 79 sit-uri de os medular. Fiecare voxel din acest volum
este caracterizat printr-un număr CT, exprimat în HU. Software-ul afișează
valoarea medie a numerelor CT, abaterea standard a acestora, precum și
intervalul de valori HU (cele mai mici și cele mai mari valori HU întâlnite în
volumul analizat) (fig. 29).
Toate măsurările realizate au fost analizate din punct de vedere
statistic, rezultatele fiind prezentate în secțiunea dedicată. S-a realizat, de
asemenea, o comparație între rezultatele obținute pentru zona anterioară
maxilară și pentru cea posterioară maxilară, limita dintre acestea fiind fața
distală a caninului maxilar de fiecare parte, respectiv fața mezială a primului
premolar de fiecare parte.
104
Fig. 29. Aspect CBCT inițial, cu delimitarea zonelor de interes (a); aspect CBCT post-chirurgical și
după tratamentul de fotobiomodulare, la aprox. 12 luni, în aceleași arii de interes anterior definite
(b)
7.3. REZULTATE
Fiecare voxel din volumul de tomografie computerizată cu fascicul

conic este caracterizat printr-un număr CT, exprimat în HU. Software-ul
afișează valoarea medie a numerelor CT, abaterea standard a acestora,
precum și intervalul de valori HU (cele mai mici și cele mai mari valori HU
întâlnite în volumul analizat). Exemplificăm, în cele ce urmează, rezultatele
densității minerale osoase măsurate având la bază unitățile Hounsfield:
Pacient T.B., sex masculin, 74 ani, nefumător, patologie cardiacă
asociată, nesemnificativă pentru sfera orală: evoluția densității minerale
osoase, cuantificată prin HU, în diferite regiuni supuse fotobiomodulării (fig. 30,
31).
105
Fig. 30. Densitatea minerală osoasă medie, măsurată la nivel cortical, în unități Hounsfield, înainte
de intervenția chirurgicală (albastru) și la aproximativ 1 an după intervenția chirurgicală și
tratamentul de fotobiomodulare laser (portocaliu)
Fig. 31. Densitatea minerală osoasă medie, măsurată la nivel medular, în unități Hounsfield, înainte
Pacient B.M., sex feminin, 69 ani, nefumătoare, patologie cardiacă asociată,

nesemnificativă pentru sfera orală: evoluția densității minerale osoase, cuantificată
prin HU, în diferite regiuni supuse fotobiomodulării (fig. 32).
106
de intervenția chirurgicală (albastru) și la aproximativ 1 an dupa intervenția chirurgicală și
Pacient G.I., sex masculin, 74 ani, nefumător, patologie cardiacă

asociată, nesemnificativă pentru sfera orală: evoluția densității minerale
osoase, cuantificată prin HU, în diferite regiuni supuse fotobiomodulării (fig.
33).
107
Evoluția comparativă a densității minerale osoase, cuantificată prin HU,

la nivelul corticalei maxilare, precum și a medularei, înainte și după tratament,
pentru toți pacienții incluși în studiu, sunt reprezentate în fig. 34 și 35.
Fig. 34. Densitatea minerală osoasă medie, măsurată la nivel cortical, în unități Hounsfield, înainte
de intervenția chirurgicală și la aproximativ 1 an după intervenția chirurgicală și tratamentul de
fotobiomodulare laser
de intervenția chirurgicală și la aproximativ 1 an după intervenția chirurgicală și tratamentul de
fotobiomodulare laser
108
Analiza statistică aplicată valorilor măsurate (test ANOVA) a urmărit

câteva comparații:
- Atât la sexul feminin, cât și la cel masculin, diferențele între mediile
unităților Hounsfield măsurate la nivelul corticalei vestibulare, înainte și
după tratament, comparativ, prezintă diferențe semnificative din punct
de vedere statistic (test Anova tabel 6, 7, testul Tukey fig. 36)
Tabel 6. Test Anova aplicat indicilor HU măsurați la nivel cortical, înainte și după tratamentul de
fotobiomodulare, pentru grupul de femei
Diferenţa Media erorii

P
Grup 1 – F – cortical mediilor standard
378.4 114.4 0.011 < 0.05
Tabel 7. Test Anova aplicat indicilor HU măsurați la nivel cortical, înainte și după tratamentul de
fotobiomodulare, pentru grupul de bărbați

P
mediilor standard
Grup 2 – M – cortical
245.6 102.4 0.025 < 0.05
Boxplot of Mas_C
1600
1400
1200
1000
Mas_C
800
600
400
200
0
După PBM_c Înainte PBM_c
Gr_C
Fig. 36. Test Tukey aplicat indicilor HU măsurați la nivel cortical, înainte și după tratamentul de
fotobiomodulare, p=3,6%
109
- Mediile unităților Hounsfield măsurate la nivelul osului medular maxilar,

înainte și după tratament, comparativ, prezintă diferențe semnificative
din punct de vedere statistic, atât pentru femei, cât și pentru bărbați
(test Anova tabel 8, 9, testul Tukey fig. 37)
Tabel 8. Test Anova aplicat indicilor HU măsurați la nivel medular, înainte și după tratamentul de
fotobiomodulare, pentru grupul de femei

P
Grup 3 – F – medular mediilor standard
254.1 75.8 1.2810-3 < 0.05
Tabel 9. Test Anova aplicat indicilor HU măsurați la nivel medular, înainte și după tratamentul de
fotobiomodulare, pentru grupul de bărbați
P
mediilor standard
Grup 4 – M – medular
284.5 70.0 1.5610-4 < 0.05
Boxplot of Mas_M
1500
1000
Mas_M
500
După PBM_m Înainte PBM_m

Gr_M
Fig. 37. Test Tukey aplicat indicilor HU măsurați la nivel medular, înainte și după tratamentul de
fotobiomodulare, p=0%
110
- Comparația zonelor anterioară și a celei posterioare în ceea ce privește

mediile unităților Hounsfield măsurate la nivelul osului cortical, respectiv
medular maxilar, nu prezintă diferențe semnificative din punct de
vedere statistic
- Independent de sexul pacientului, atât la nivelul corticalei vestibulare,
cât și la nivelul osului trabecular maxilar, există diferențe statistic
semnificative înainte și după tratamentul efectuat. (fig. 38)
Boxplot of Mas_MixtFMm
1500
1000
Mas_MixtFMm
500
DupPBM_Bm DupPBM_Fm ÎntPBM_Fm ÎntPBM_Mm

Gr_MixtFMm
Fig. 38. Test Tukey aplicat indicilor HU măsurați la nivel medular, înainte și după tratamentul de
fotobiomodulare, atât în cazul grupului de pacienți de sex feminin, cât și în cel de sex masculin
7.4. DISCUȚII
În vederea interpretării obiective a densității osoase, se ia în calcul

faptul că fiecare imagine CT axială este formată din 260.000 de pixeli și
fiecare pixel are un număr CT Hounsfield (unitate Hounsfield HU), aferent la
densitatea țesutului. O valoare mare HU indică o densitate osoasă ridicată.
Structuri precum calcifierea și osul, care absorb razele X, sunt văzute ca
fiind albe și au o valoare ridicată a HU (80–100 HU). Intervalul de scară
include apa reflectată la un nivel moderat (0 HU), grăsimi sub zero (–80
HU) și aer la cele mai mici valori (–1000 HU)277.
111
Seturile de imagini obținute prin CBCT au fost utilizate în studii

anterioare în scopul realizării unor predicții în ceea ce privește evolutia
osteoporozei prin investigarea potențială a osului mandibular, folosind spre
exemplu indici radiomorfometrici CBCT mandibulari 278-280, densitatea
radiografică 281, și valorile CT 282. Multe studii 278-280 au arătat diferențe
semnificative între grupurile de control și cele de studiu, în ceea ce privește
indexul mandibular, cel mentonier și cel cortical măsurate pe imagini CBCT,
fiind așadar un factor predictiv în aprecierea densității osoase.
Un alt studiu asemănător 283, condus pe 202 pacienți, utilizează
nuanțele de gri din imaginile CBCT pentru a trasa o corelație între vârsta
pacientului și densitatea osoasă măsurată la nivelul corticalei mandibulare,
în regiunea găurii mentoniere. Studiul concluzionează, cu ajutorul testului
de corelație Pearson, că metoda este aplicabilă în vederea evaluării
densității osoase, chiar dacă nu se pot corela cu precizie nivelurile de gri cu
unitățile Hounsefield, asa cum este specificat și în alte studii similare 267.
Un alt studiu realizat în aceeași direcție 284 a inclus 24 de pacienți cu
diabet zaharat tip 2, pentru care s-a realizat comparația densității osoase
măsurate pe CBCT cu cea rezultată prin osteodensitometrie Dexa
(Osteodensitometria prin raze X -DEXA este considerată standardul de aur
în evaluarea non invazivă a densității osoase în ortopedie, endocrinologie și
traumatologie 285, acestea fiind coroborate cu nivelul hemoglobinei
glicozilate (HbA1c). Acest studiu a demonstrat că CBCT este un instrument
eficient în diagnosticul osteoporozei, fiind stabilită o corelație pozitivă între
valorile scorului T DEXA și valorile de gri măsurate pe imaginile de CBCT
ale arcadelor mandibulare edentate, în cazul pacienților diabetici. Aceste
rezultate sunt conforme cu cele ale lui Barngkgei 281 și Güngör282, care au
comparat scanările DEXA și CBCT și au ajuns la concluzia că osteoporoza
poate fi prevăzută cu o precizie ridicată din valoarea densității radiografice
a corpului mandibular.
Mai mult, Guerra și colab. 159 au analizat în mod sistematic literatura
de specialitate cu privire la capacitatea imaginilor CBCT de a identifica
indivizi cu densitate osoasă scăzută. Ei au ajuns la concluzia că densitatea
radiografică derivată din CBCT este un instrument promițător pentru
diferențierea indivizilor cu osteoporoză de indivizii cu o densitate osoasă
normală. Pe de altă parte, într-un studiu in vitro, Hua și colab. 267 au
comparat valorile densității osoase derivate din analiza DEXA și densitatea
112
derivată din valorile de gri ale CBCT pentru mandibulă și nu au găsit nicio
corelație. Cu toate acestea, aceste studii selectate au folosit diferite
dispozitive CBCT și diferite dimensiuni ale voxelilor, fapt care ne conduce
spre ipoteza deja cunoscută, conform căreia măsurătorile osoase
trabeculare și, în consecință, calitatea imaginii, sunt afectate de parametrii
tehnici, precum dimensiunea Voxel, unitatea în sine, tensiunea și amperajul
tubului și selecția FOV 286. Un studiu similar 152, dar vizând o altă patologie cu
implicații la nivelul țesutului osos, a utilizat CBCT pentru a determina
densitatea osoasă în cazul pacienților cu displazie ectodermală. Aceștia au
considerat ca scală de evaluare unitățile Hounsfield. Studiul raportează
diferențe semnificative din punct de vedere statistic între densitățile osoase
măsurate cu ajutorul unităților Hounsfield în cazul pacienților cu displazie
ectodermală, comparativ cu grupul de control, considerând CBCT un
instrument adecvat pentru aprecierea densității osoase, în vederea realizării
unui plan de tratament adecvat.
În studiul prezentat în această teză, rezultatele obținute confirmă
aceeași ipoteză, demonstrând faptul că CBCT este un instrument util și
adecvat în vederea măsurării densității minerale osoase la nivelul oaselor
maxilare. Mai mult decât atât, în ceea ce privește capacitatea de a detecta
diferențe semnificative din punct de vedere statistic, în cazul pacienților
care au urmat tratament de fotobiomodulare laser după intervențiile
chirurgicale din sfera orală, s-a dovedit că terapia laser a crescut densitatea
osoasă, atât la nivelul osului cortical vestibular, cât și la nivelul osului
medular, independent de sexul pacientului. Acest efect pozitiv a fost
observat și cuantificat atât la nivelul osului maxilar anterior, cât și la nivelul
zonelor laterale, linia de demarcație dintre acestea fiind considerată
tangenta la fața distală a caninilor de fiecare parte. Cuantificarea, cu
ajutorul tomografiei computerizate cu fascicul conic, a efectului radiației
laser asupra densității minerale osoase a permis formularea unor concluzii
clinice, în acord cu cele experimentale, obținute în studiile pe care le-am
efectuat anterior. 235,255
113
7.5. CONCLUZII
Conform studiilor disponibile până în prezent, indicația computer

tomografiei cu fascicul conic ca examinare de elecție pentru determinarea
densității minerale a țesuturilor osoase, în special atunci când valorile
obținute sunt comparate cu valorile standard prestabilite, a fost îndelung
discutată. Studiul de față, având la bază o comparație între două momente
diferite în timp, ale acelorași pacienți, vizează cuantificarea unor modificări
ale țesutului osos dependente de timp și de tratamentul efectuat, dar
supusă acelorași surse de erori în ceea ce privește echipamentul CBCT
utilizat. În acest fel, utilitatea tomografiei computerizate cu fascicul conic
este evidentă, demonstrându-se a fi un factor predictiv valoros în
aprecierea densității osoase. Studiul realizat a demonstrat rezultate cu
semnificație statistică, în ceea ce privește îmbunătățirea densității minerale
osoase a pacienților care au urmat tratament de fotobiomodulare laser.
114
CONCLUZII FINALE ȘI CONTRIBUȚII PROPRII
În ciuda succesului din ce în ce mai mare al utilizării fotobiomodulării în

diferite domenii de interes, există relativ puține rapoarte asupra efectului lor în
cursul proceselor de reparația osoasă. Cu toate acestea, datorită efectelor
pozitive asupra metabolismului osos, utilizarea fotobiomodulării a fost
încurajată în practica clinică6. Radiația laser pare să accelereze procesul de
reparare a fracturilor și produce o creștere a volumului calusului format și o
creștere a densității minerale osoase. Efectele legate de fotobiomodulare
includ vascularizația crescută, creșterea activității osteoblastice, organizarea
fibrelor de colagen și modificările nivelurilor mitocondriale și intracelulare ale
adenozin trifosfat. În acest context, numeroase studii au fost realizate și pe
modele animale, asupra proprietăților osteogene ale diferitelor biomateriale, cu
rezultate diferite252,253,287-289. Cu toate acestea, efectele fotobiomodulării, în
combinație cu biomaterialele din procesele de reparare a defectelor osoase
necesită studii suplimentare, deoarece au fost găsite răspunsuri diferite din
partea gazdei. Majoritatea cercetărilor s-au bazat pe studii efectuate pe
animale, cel mai investigat model animal fiind șobolanul, în principal în osul
tibiei211-213.
Studii in vitro precum cele efectuate de Soleimani290 și Saygun291 au
arătat proliferarea, stimularea și diferențierea celulelor stem mezenchimale
umane în celulele osteoblastice din grupele de studiu biomodulate. În primul
caz a fost administrată o doză de 4 J/cm2 (utilizând un laser de 810 nm), în
timp ce în cel de-al doilea studiu, doza a fost redusă la jumătate, 2 J/cm2 (685
nm). Efectele obținute asupra țesuturilor țintă au fost, de asemenea, confirmate
de Dortbudak292. Deoarece osul are variații biologice limitate pentru a reacționa
la stimuli, rezultatele pot fi false sau suprainterpretate. De exemplu, fibroza și
resorbția osoasă pot fi rezultatul instabilității biomecanice, precum și a lipsei
proprietăților osteoconductive ale unui material folosit ca grefă osoasă. Ele pot
fi, de asemenea, produse de o degradare rapidă a materialului, în timp ce
biocompatibilitatea este încă păstrată. Problemele de biocompatibilitate a
diferitelor grefe osoase ar trebui clarificate folosind modele de studiu care să
nu fie supuse niciunei solicitări din punct de vedere biomecanic 293, urmând ca
utilitatea acelui material să fie testată într-un defect mecanic, după ce
biocompatibilitatea a fost deja evaluată în experimentele anterioare. Pentru
115
ambele, reacția celulară (de exemplu, prezența celulelor mono- și polinucleare

inflamatorii), precum și noua formare osoasă la suprafață și în interiorul
materialului sunt importante, împreună cu resorbția materialului însuși294.
Reducerea inflamației datorată fotobiomodulării este unul dintre cele mai larg
acceptate efecte295, mecanismul acesteia fiind evidențiat printr-o scădere a
mediatorilor inflamatori chimici (prostaglandină E2, leucocite, factorul de
necroză tumorală TNFα). PBM poate exercita atât un efect antiinflamator, cât
și unul pro-inflamator, crescând expresia ARNm și concentrația proteică a
mediatorilor antiinflamatori (IL-10, HSP72), similară cu steroizii
189
antiinflamatori . A fost evidențiată o contradicție aparentă între efectul pro-
inflamator al PBM în studiile in vitro și efectul antiinflamator găsit în majoritatea
studiilor clinice296.
Pornind de la aceste premise deja cunoscute și investigate în literatura
de specialitate, cercetarea de față și-a propus o analiză calitativă și cantitativă
a procesului de vindecare, reparare și regenerare osoasă fotobiomodulată,
folosind tomografia în coerență optică, microtomografia computerizată, studiul
histologic al eșantioanelor și, nu în ultimul rând, măsurarea densității osoase
cu ajutorul tomografiei computerizate cu fascicul conic. Astfel de studii sunt
esențiale pentru a evalua eficiența diferitelor tehnici care pot fi utilizate în
regenerarea osoasă, luând în considerare în special, complexitatea procesului
de vindecare și numărul mare de factori care îl influențează.
Multimodal CMS / SS OCT a fost aplicat pentru a reda imagini și a
analiza diferite grupuri luate în considerare în evaluarea procesului de
vindecare și regenerare osoasă: control negativ Grupul A, control pozitiv Grup
B (cu biomaterial) și Grupul C, de studiu (cu biomaterial și biomodulare).
Imaginând defectul osos și folosind C-scan / imagini en-face (precum și B-scan
și imagini confocale), au fost conturate concluzii statistice consistente în cadrul
studiului. În esență, rezultatele obținute se pot sintetiza astfel: cantitatea cea
mai mare de țesut osos nou format se regăsește în grupul de studiu C, urmat
de grupul B și ulterior, de grupul A. Analizând evoluția cantității de os nou
format în timp (prin efectuarea eutanasiei specimenelor după 14, 21 și 30 de
zile), cea mai semnificativă diferență a fost evidențiată după 21 de zile, deci
după aproximativ două treimi din intervalul de timp total analizat. După mai
mult timp luat în considerare, cantitățile de os tind să se apropie, cu tendință
de a umple defectul disponibil. În studiu au fost incluse imagini histologice,
pentru a demonstra validitatea ipotezelor formulate cu privire la diferitele tipuri
116
de os identificate în studiu229,235-237. Din cunoștințele actuale, aceasta este

prima dată când OCT a fost folosit ca instrument pentru a evalua efectele
fotobiomodulării cu laser asupra regenerării osoase. În ciuda limitărilor inerente
ale metodei, rezultatele obținute și statisticile efectuate utilizând OCT au fost în
acord cu studiile anterioare care au abordat vindecarea osoasă folosind alte
metode, inclusiv histologia. Avantajul major al OCT este că poate fi aplicat
pentru evaluări in vivo, folosind probe de scanare manuale, în cavitatea
orală238,239. Ca atare, consider că această lucrare reprezintă un progres în ceea
ce privește imagistica en-face ca metodă de evaluare a regenerării osoase.
Microtomografia computerizată a completat cunoștințele dobândite
anterior, demonstrând că terapia de fotobiomodulare este eficientă în perioade
scurte; dozele de laser administrate mai târziu de 2-3 săptămâni de la
intervenția chirurgicală par să nu fie foarte eficiente. În studiul realizat, analiza
volumetrică cantitativă a osului aflat în curs de remodelare la cele trei
momente de timp (14, 21 și 30 de zile de la intervenția chirurgicală) a arătat o
vindecare mai bună atunci când fotobiomodularea a fost aplicată pe defectul
grefat decât în cazurile în care defectul grefat nu a primit tratament cu laser.
Acest efect a fost deosebit de evident pentru cea mai scurtă perioadă de timp
considerată, adică după 14 zile de la operație. Astfel, aceste observații
obținute folosind protocolul inovativ de analiză prezentat anterior, evidențiază
efectele pozitive ale fotobiomodulării asupra procesului de regenerare osoasă,
cu creșterea consecutivă a cantității de os nou format. De asemenea,
sugerează posibile interacțiuni cu biomaterialele utilizate, care ar putea
influența viitoarele noastre monitorizări experimentale. Am ipotezat o posibilă
acțiune de ecranare a xenografei în ceea ce privește acțiunea laser asupra
celulelor și îmi propun să verific această supoziție prin studiile viitoare. Acest
efect poate fi combinat cu o întârziere a regenerării osoase în prezența
biomaterialelor, așa cum a fost deja documentat în studiile anterioare. Astfel, în
sprijinul acestei ipoteze, mai mulți autori au sugerat aceleași concluzii 297,298,
constatând că efectele pozitive ale fotobiomodulării asupra vindecării osoase
sunt mai evidente atunci când sunt aplicate intraoperator, direct la defectul
osos, înainte de procedura de augumentare osoasă297.
În studiul prezentat în teză255, micro-CT a condus la obținerea de
informații noi și relevante despre un număr limitat de animale, care au fost
incluse în studiu. Relevanța protocolului de evaluare se bazează pe natura 3D
a analizei micro-CT, bazată la rândul său, pe stivuirea a 1000 de secțiuni 2D
117
succesive (fiecare cu o grosime de aproximativ 9 μm), mapând întregul

eșantion. Aceasta este de o importanță majoră, permițând reducerea la
minimum a numărului de animale sacrificate, cu respectarea deplină a
normelor etice internaționale. Studiile noastre anterioare folosind aceeași
metodă de evaluare au arătat, de asemenea, capacitatea tehnicii micro-CT de
a juca un rol fundamental în caracterizarea avansată a siturilor tratate cu
laser256. Mai mult, în studiile anterioare, s-a constatat o concordonță între OCT
și analizele micro-CT 257, 235-237,229.
Conform studiilor disponibile până în prezent, indicația computer
tomografiei cu fascicul conic ca examinarea de elecție pentru determinarea
densității minerale a țesuturilor osoase, în special atunci când valorile obținute
sunt comparate cu valorile standard prestabilite, a fost contestată. Studiul de
față, având la bază o comparație între două momente diferite în timp, ale
acelorași pacienți, vizează cuantificarea unor modificări ale țesutului osos
dependente de timp și de tratamentul efectuat, dar supusă acelorași surse de
erori în ceea ce privește limitările metodei. Mai mult decât atât, în ceea ce
privește capacitatea de a detecta diferențe semnificative din punct de vedere
statistic, în cazul pacienților care au urmat tratament de fotobiomodulare laser
după intervențiile chirurgicale din sfera orală, s-a dovedit că terapia laser a
crescut densitatea osoasă, atât la nivelul osului cortical vestibular, cât și la
nivelul osului medular, independent de sexul pacientului. Acest efect pozitiv a
fost observat și cuantificat atât la nivelul osului maxilar anterior, cât și la nivelul
zonelor laterale. Cuantificarea, cu ajutorul tomografiei computerizate cu
fascicul conic, a efectului radiației laser asupra densității minerale osoase a
permis formularea unor concluzii clinice, în acord cu cele experimentale,
obținute în studiile pe care le-am efectuat anterior.235,255 În acest fel, utilitatea
tomografiei computerizate cu fascicul conic este evidentă, demonstrându-se a
fi un factor predictiv valoros în aprecierea densității osoase.
În general, interacțiunea dintre radiațiile laser și diferitele tipuri de
țesuturi in vivo rămâne o preocupare majoră atunci când se stabilesc
protocoale clinice. Deși au fost efectuate numeroase studii privind efectele
fotobiomodulării, compararea acestora este dificilă din cauza diferitelor
biomateriale, a variațiilor energiei laser, a dozei și a duratei. Consider că
studiul de față, corelând rezultatele experimentale cu cele clinice retrospective,
aduce informații valoroase în domenii de interes actual larg, precum sunt
regenerarea osoasă și fotobiomodularea în sfera medicinei dentare, clarificând
118
totodată utilitatea diverselor metode de investigare științifică și paraclinică în

ceea ce privește procesul de vindecare osoasă.
Lucrările viitoare vor include aplicarea terapiei de biomodulare pentru
îmbunătățirea regenerării osoase folosind protocoale și parametri diferiți. Toate
datele disponibile în literatura de specialitate dezvăluie că eficiența terapiei
este afectată de dozare, timpul și modul de iradiere. În ceea ce privește
efectele cuantificabile, se pare că biomodularea este mai eficientă atunci când
este aplicată în primele etape ale vindecării defectelor osoase, probabil
datorită ratei mari de proliferare celulară. Creșterea vascularității și răspunsul
osteoblastelor rămân aspecte importante care trebuie luate în considerare la
evaluarea efectelor biomodulării laser. Studiile viitoare similare pot viza, de
asemenea, efectul biomodulării laser asupra diferențierii și creșterii celulare, în
special în ceea ce privește celulele stem mezenchimale și terapiile cu celule
stromale mezenchimale.
119
BIBLIOGRAFIE
1. Toscano N, Shumaker N, Holzclaw D. The art of block grafting – A review of the

surgical protocol for reconstruction of alveolar ridge deficiency. The journal of implant
and advanced clinical dentistry, vol. 2, No. 2, March 2010:45-66
2. Ashman A. Postextraction ridge preservation using synthetic alloplast. Implant Dent
2000;9:168-76
3. Chiapasco M, Zaniboni M. Bone augmentation procedures in implant dentistry. The
International Journal of Oral and Maxillofacial Implants 2009;24 (suppl): 237-259).
4. Sjostrom M, On healing of titanium implants in iliac crest bone grafts. Odontological
Dissertations, Umea University, Department of Biomaterials, Institute for Clinical
Sciences, Sahlgrenska Academy, Gothenburg 2006; 10-5
5. Fernandez de Grado G, Keller L, Idoux-Gillet Y, Wagner Q, Musset AM, Benkirane-
Jessel N, Bornert F, Offner D. Bone substitutes: a review of their characteristics, clinical
use, and perspectives for large bone defects management. J Tissue Eng 2018 Jun
4;9:2041731418776819. doi: 10.1177/2041731418776819
6. Oliveira P, Sperandio E, Fernandes KR, Pastor FAC, Nonaka KO, Renno ACM.
Comparison of the effects of low-level laser therapy and low-intensity pulsed ultrasound
on the process of bone repair in the rat tibia. Rev Bras Fisioter 2011;15(3):200-5.
7. Hamblin M, Sousa M, Arany P, Carroll J, Patthoff D. Low level laser (light) therapy and
photobiomodulation: The path forward. Progress in Biomedical Optics and Imaging -
Proceedings of SPIE 2015, 9309. 10.1117/12.2084049.
8. Renno ACM, McDonnell PA, Parizotto NA, Laakso EL. The effects of laser irradiation
on osteoblast and osteosarcoma cell proliferation and differentiation in vitro. Photomed
Laser Surg 2007;25(4):275-80.
9. Stein A, Benayahu D, Maltz L, Oron U. Low-level laser irradiation promotes proliferation
and differentiation of human osteoblasts in vitro. Photomed Laser Surg 2005;23(2):161-
6.
10. Homma N, Peter ZA, Peyrin F. Synchrotron Radiation Micro-CT Imaging of Bone
Tissue, Theory and Applications of CT Imaging and Analysis. In Tech 2011, ISBN: 978-
953-307-234-0
11. Drexler W, Fujimoto JG. Optical Coherence Tomography. Springer Verlag Berlin
Heidelberg 2008;1166-1168
12. Todea C, Negrutiu M, Balabuc C, Sinescu C, Topală F, Mărcăuțeanu C, Cânjău S,
Semez G, Podoleanu A. Optical Coherence Tomography applications in dentistry. TMJ
2010, vol.60, no.1
13. Sinescu C, Negrutiu M, Todea C, Balabuc C, Filip L, Rominu R, Bradu A, Hughes M,
Podoleanu A. Quality assesement of dental treatments using en-face optical coherence
120
tomography. Journal of Biomedical Optics 2008 Sep-Oct:13(5):054065. ISSN 1083-

3668
14. Sàndor GKB, Lindholm TC, Clokie CML. Bone regeneration of the cranio-maxillofacial
and dento-alveolar skeletons in the framework of tissue engineering. In : Ashmmakhi N,
Ferretti P, editors. Topics in Tissue Engineering 2003. p. 5-6, 24-5.
15. Oryan A, Monazzah HS, Bigham SA. Bone Injury and Fracture Healing Biology.
Biomedical and environmental sciences 2015: BES. 28. 57-71. 10.3967/bes2015.006.
16. Setiawati R, Rahardjo P. Bone Development and Growth. 2018
10.5772/intechopen.82452.
17. Chaparro O, Linero I. Regenerative Medicine: A New Paradigm in Bone Regeneration
2016, 10.5772/62523.
18. Ratanavaraporn J, Furuya H, Tabata Y. Local suppression of pro-
inflammatorycytokines and the effects in BMP-2-induced bone regeneration.
Biomaterials 2012;33(1):304-16.
19. Shrivats AR, Mc Dermott MC, Hollinger JO. Bone tissue engineering: state of the
union.Drug Discov Today 2014;19(6):781-6
20. Shrivats AR, Alvarez P, Schutte L, Hollinger JO. Bone Regeneration. In: Lanza
R,Vacanti J, Langer R, editors. Principles of Tissue Engineering. 4th ed. San
Diego:Elseiver 2014. p. 1201-1221. DOI: 10.1016/B978-0-12-398358-9.00055-0).
21. Greenstein G, Caton JG. Biodegradable barriers and guided tissue regeneration.
Periodontol 2000 1993; 1: 36-45.
22. Dimitriou R, Tsiridis E, Giannoudis PV. Current concepts of molecular aspects of bone
healing. Injury 2005;36(12):1392-404.
23. Oryan A, Alidadi S, Moshiri A. Current concerns regarding healing of bone defects.Hard
Tissue 2013;2(2):1-12
24. Lindahl A, Brittberg M, Gibbs D, Dawson JI, Kanczler J, Black C, Tare R, Oreffo
ROC.Cartilage and bone regeneration. In: Van Blitterswijk CA, De Boer J, editors.
TissueEngineering. 2nd ed. San Diego: Elseiver 2015. p. 529-582. DOI: 10.1016/B978-
0-12-420145-3.00016-X
25. Schmidt-Bleek K, Petersen A, Dienelt A, Schwarz C, Duda GN Initiation and early
control of tissue regeneration - bone healing as a model system for tissue regeneration.
Expert Opin. Biol. Ther 2014; 14, 247–259. doi: 10.1517/14712598.2014.857653
26. Borgiani E, Duda GN, Checa S. Multiscale Modeling of Bone Healing: Toward a
Systems Biology Approach. Front Physiol 2017;8:287. Published 2017 May 8.
doi:10.3389/fphys.2017.00287
27. Bailón-Plaza A, van der Meulen M. A Mathematical Framework to Study the Effects of
Growth Factor Influences on Fracture Healing. Journal of theoretical biology 2001; 212.
191-209. 10.1006/jtbi.2001.2372.
121
28. Geris L, Gerisch A, Vander SJ, Weiner R, Oosterwyck H. Angiogenesis in bone fracture
healing: A bioregulatory model. Journal of theoretical biology 2008; 251. 137-58.
10.1016/j.jtbi.2007.11.008.
29. Moore SR, Saidel GM, Knothe U, Knothe Tate ML. Mechanistic, Mathematical Model to
Predict the Dynamics of Tissue Genesis in Bone Defects via Mechanical Feedback and
Mediation of Biochemical Factors 2014; PLoS Comput Biol 10(6): e1003604.
https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003604
30. Kubilius M, Kubilius R, Gleiznys A. The preservation of alveolar bone ridge during tooth
extraction. Stomatologija / issued by public institution "Odontologijos studija" ... [et al.]
2012; 14. 3-11.
31. Weijden F, Dell'Acqua F, Slot D. Alveolar bone dimensional changes of post-extraction
sockets in humans: A systematic review. Journal of clinical periodontology 2009; 36.
1048-58. 10.1111/j.1600-051X.2009.01482.x.
32. John V, De Poi R, Blanchard S. Socket preservation as a precursor of future implant
placement: review of the literature and case reports. Compend Contin Educ Dent
2007;28:646-53, 654, 671.
33. Sclar AG. Strategies for management of single-tooth extraction sites in aesthetic
implant therapy. J Oral Maxillofac Surg 2004;62(9 Suppl 2):90-105.
34. Lekovic V, Camargo PM, Klokkevold PR, Weinlaender M, Kenney EB, Dimitrijevic B, et
al. Preservation of alveolar bone in extraction sockets using bioabsorbable membranes.
J Periodontol 1998;69:1044-49.
35. Lekovic V, Kenney EB, Weinlaender M, Han T, Klokkevold P, Nedic M, et al. A bone
regenerative approach to alveolar ridge maintenance following tooth extraction. Report
of 10 cases. J Periodontol 1997;68:563-70.
36. Malmgren B, Cvek M, Lundberg M, Frykholm A. Surgical treatment of ankylosed and
infrapositioned reimplanted incisors in adolescents. Scand J Dent Res 1984; 92:391-
399.
37. Filippi A, Pohl Y, von Arx T. Decoronation of an ankylosed tooth for preservation of
alveolar bone prior to dental implant placement. Dental Traumatol 2001; 17:93-95.
38. Clokie CM, Yau DM, Chano L. Autogenous tooth transplantation: An alternative to
dental implant placement? J Can Dent Assoc 2001; 67:92-96.
39. Ostler M, Kokich V. Alveolar ridge changes in patients congenitally missing mandibular
second premolars. J. Prosth Dent 1994; 71:144-149.
40. Urist MR, McLean F. Osteogenic potency and new bone formation by induction in
transplants to the anterior chamber of the eye. J Bone Joint Surg 1952; 34A:443.
41. Urist MR, Mikulski AJ, Nakagawa M, Yen K. A bone matrix calcification-initiator
noncollagenous protein. Am J Physiol 1977; 232:C115-127.
42. Urist MR, Mikulski A, Lietze A. Solubilized and insolubilized bone morphogenetic
protein. Proc Nat Acad Sci USA 1979; 76:1828-1832.
122
43. Mizutani H, Urist MR. The nature of bone morphogenetic protein (BMP) fractions
derived from bovine bone matrix gelatin. Clin Orthop 1982; 171:213-223.
44. Weiss PA, Taylor AC. The technology of nerve regeneration. A review. Sutureless
tubulation and related methods of nerve repair, J Neurosurg 1944;1:400–450
45. Murray G, Holden R, Roachlau W: Experimental and clinical study of new growth of
bone in a cavity, Am J Surg 1957;93:385–387.
46. Le B, Nielsen B. Guided Tissue Regeneration in Implant Dentistry, 2018; chapter 31.
https://www.researchgate.net/publication/323693137_Guided_Tissue_Regeneration_in
_Implant_Dentistry#fullTextFileContent.
47. Hurley L, Stinchfeld F, Bassett A, Lyon W. The role of soft tissues in osteogenesis. An
experimental study of canine spinal fusions. J Bone Joint Surg 41(A):1243–1254, 1959.
48. Boyne P. Regeneration of alveolar bone beneath cellulose ace-tate flter implants. J
Dent Res 1964; 43:827,
49. Boyne P: Osseous grafts and implants in the restoration of large oral defects. J
Periodontol 1974;45(5):378–384,
50. Linghorne W, O’Connell D. Studies in the regeneration and reattachment of supporting
structures of the teeth. I. Soft tissue attachment, J Dent Res 1950;29(4):419–428.
51. Karring T, Nyman S, Lindhe J. Healing following implantation of periodontitis affected
roots into bone tissue. J Clin Periodontol 1980;7:96–105.
52. Nyman S, Karring T, Lindhe J, Planten S. Healing following implantation of periodontitis
affected roots into gingival con-nective tissue. J Clin Periodontol 1980;7:394–401.
53. El Helow K, El Askary AS. Regenerative barriers in immediate implant placement: a
literature review. Implant Dent 2008;17:360–371.
54. Dahlin C, Linde A, Gottlow J, Nyman S. Healing of bone defects by guided tissue
regeneration. Plast Reconstr Surg 1988; 81(5): 672-6.
55. Dahlin C, Gottlow J, Linde A, Nyman S. Healing of maxillary and mandibular bone
defects using a membrane technique. An experimental study in monkeys. Scand J
Plast Reconstr Surg Hand Surg 1990; 24(1): 13-9.
56. Louis J.P. Bone grafting the mandible. Oral Maxillofacial Surg Clin N Am
2011;23(2):209-27
57. La Monaca G, Iezzi G, Cristalli MP, Pranno N, Sfasciotti GL, Vozza I. Comparative
Histological and Histomorphometric Results of Six Biomaterials Used in Two-Stage
Maxillary Sinus Augmentation Model after 6-Month Healing. Biomed Res Int.
2018;2018:9430989. Published 2018 Jun 27. doi:10.1155/2018/9430989
58. Buchardt H. The biology of bone graft repair. Clinical Orthop 1983; 174:28-42.
59. Boyne PJ. Osseous Reconstruction of the Maxilla and Mandible. Chicago:
Quintessence Publishing 1997:52-67.
123
60. Kainulainen VT, Sàndor GKB, Caminiti MF, Clokie CML, Oikarinen KS. Extraoral bone
harvesting sites for oral and maxillofacial surgery. Suomen Hammaslääkärilehti
(Finnish Dental Journal) 2002b; 10-11:570-576.
61. Kainulainen VT, Sàndor GKB, Oikarinen KS, Clokie CML. The Intraoral bone harvesting
sites for osseous reconstruction in oral and maxillofacial surgery. Oral Health 2003a;
93(5):10-24.
62. Kainulainen VT, Sàndor GKB, Caminiti MF, Oikarinen KS, Clokie CML. The Extraoral
bone harvesting sites for osseous reconstruction in oral and maxillofacial surgery. Oral
Health 2003b; 93(5):29-39.
63. Oikarinen KS, KainulainenVT, Kainulainen T. A method of harvesting corticocancellous
bone chips for reconstructive maxillofacial surgery. Int J Oral Maxillofac Surg 1997;
27:103-105.
64. Kainulainen VT, Sàndor GKB, Clokie ML, Oikarinen KS. Zygomatic bone- an additional
site for intra-oral graft harvesting: A technical note. Int J Oral Maxillofac Impl 2002c;
17:723-728.
65. Soares RF, Ramos L, Dantas BJ, Zanetta-Barbosa D, Ferro E, Dechichi P. Bovine
Anorganic Bone Graft Associated with Platelet-Rich Plasma: Histologic Analysis in
Rabbit Calvaria. The Journal of oral implantology. 2011; 37. 511-8. 10.1563/AAID-JOI-
D-09-00091.1.
66. Norton MR, Odell EW, Thompson ID, Cook RJ.Efficacy of bovine bone mineral for
alveolar augmen-tation: a human histologic study. Clin Oral Implants Res 2003;14:775–
783.
67. Xu H, Shimizu Y, Asai S, Ooya K. Experimentalsinus grafting with the use of
deproteinized boneparticles of different sizes. Clin Oral Implants Res 2003;14:548–555.
68. Jensen SS, Broggini N, Hjørting-Hansen E,Schenk R, Buser D. Bone healing and graft
resorptionof autograft, anorganic bovine bone and beta-trical-cium phosphate. A
histologic and histomorphometricstudy in the mandibles of minipigs. Clin Oral Implants
Res 2006;17:237–243.
69. Guillemin G, Patat JL, Fournie J, Chétail M. The use of coral as a bone graft substitute.
J Biomed Mater Res 1987; 21:557-567.
70. Russo R, Scarborough N. Inactivation of viruses in demineralized bone matrix. FDA
Workshop on Tissue for Transplantation and Reproductive Tissue, Bethesda, MD,
USA, 1995; 20-21.
71. Scabbia A, Trombelli L. A comparative study on the use of a HA/collagen/chondroitin
sulphate biomaterial (Biostite®) and a bovine-derived HA xenograft (Bio-Oss®)
in the treatment of deep intraosseous defects. J Clin Periodontol 2004; 31: 348-355.
72. Gleeson JP, Niamh AP, Fergal J.O. Addition of hydroxyapatite improves stiffness,
interconnectivity and osteogenic potential of a highly porous collagen-based scaffold for
bone tissue regeneration. European cells & materials 20 (2010): 218-30
124
73. Handa T, Anada T, Honda Y, Yamazaki H, Kobayashi K, Kanda N, Kamakura S,

Echigo S, Suzuki O. The effect of an octacalcium phosphate co-precipitated gelatin
composite on the repair of critical-sized rat calvarial defects. Acta Biomaterialia 2012; v.
8, p. 1190-1200,
74. Frota R, Silva V,Teixeira M, Sobral A, Oliveira e Silva ED, Da Silveira, MMF, Aragão-
Neto AC. Histological evaluation of bone repair using beta-Tricalcium Phosphate.
Medicina oral, patología oral y cirugía bucal 2011; 16. e190-4.
10.4317/medoral.16.e190.
75. Yukna RA, Evans GH, Aichelmann-Reddy MB, Mayer ET. Clinical comparison of
bioactive glass bone replacement graft material and expanded polytetraflouroethylene
barrier membrane in treating human mandibular molar class II furcations. J Periodontol
2001; 72:125-133.
76. Suhonen J, Meyer B. Polylactic acid (PLA) root replica in ridge maintenance after loss
of a vertically fractured incisor. Endod Dent Traumatol 1996; 12:155-160.
77. Lyons F, Al-Munajjed A, Kieran S, Toner M, Murphy C, Duffy G, O’Brien F. The healing
of bony defects by cell-free collagen-based scaffolds compared to stem cell-seeded
tissue engineered constructs. Biomaterials 2010; 31. 9232-43.
10.1016/j.biomaterials.2010.08.056.
78. Al-Hezaimi K, Ramalingam S, Al-Askar M, ArRejaie A, Nooh N, Jawad F, Aldahmash A,
Atteya M, Wang CY. Real-time-guided bone regeneration around standardized critical
size calvarial defects using bone marrow-derived mesenchymal stem cells and collagen
membrane with and without using tricalcium phosphate: An in vivo micro-computed
tomographic and histologic experiment in rats. International Journal of Oral Science
2015; 8. 10.1038/ijos.2015.34.
79. Tatić Z, Stamatović N, Bubalo M, Jancić S, Racić A, Miković N, Tatić N, Rakic M.
Histopathological evaluation of bone regeneration using human resorbable
demineralized membrane. Vojnosanitetski pregled. Military-medical and pharmaceutical
review 2010; 67. 480-6. 10.2298/VSP1006480T.
80. Bubalo M, Lazić Z, Matić S, Tatić Z, Milović R, Petkovic-Curcin A, Djurdjević D,
Loncarević S. The impact of thickness of resorbable membrane of human origin on the
ossification of bone defects: A pathohistologic study. Vojnosanitetski pregled. Military-
medical and pharmaceutical review. 2012, 69. 1076-83. 10.2298/VSP1212076B.
81. Naenni N, Schneider D, Jung RE, Hüsler J, Hämmerle CHF, Thoma DS. Randomized
clinical study assessing two membranes for guided bone regeneration of peri-implant
bone defects: clinical and histological outcomes at 6 months., Clin Oral Implants Res
2017 Oct;28(10):1309-1317. doi: 10.1111/clr.12977.
82. Farzad M, Mohammadi M. Guided bone regeneration: A literature review. Journal of
Oral Health and Oral Epidemiology 2012; 1. 10.22122/joh.v1i1.6.
83. Kim BS, Kim JS, Yang SS, Kim HW, Lim HJ, Lee J. Angiogenin-loaded fibrin/bone
powder composite scaffold for vascularized bone regeneration. Biomater Res.
2015;19:18. Published 2015 Aug 25. doi:10.1186/s40824-015-0040-4
125
84. Nomi M, Atala A, Coppi PD, Soker S. Principals of neovascularization for tissue
engineering. Mol Aspects Med. 2002;23(6):463-483. doi:10.1016/s0098-
2997(02)00008-0
85. Yu H, VandeVord PJ, Mao L, Matthew HW, Wooley PH, Yang SY. Improved tissue-
engineered bone regeneration by endothelial cell mediated vascularization.
Biomaterials. 2009;30(4):508-517. doi:10.1016/j.biomaterials.2008.09.047
86. Koike N, Fukumura D, Gralla O, Au P, Schechner JS, Jain RK. Tissue engineering:
creation of long-lasting blood vessels. Nature. 2004;428(6979):138-139.
doi:10.1038/428138a
87. Santos MI, Reis RL. Vascularization in bone tissue engineering: physiology, current
strategies, major hurdles and future challenges. Macromolecular Bioscience 2010;vol.
10, no. 1, pp. 12–27.
88. Narayan D, Venkatraman SS. Effect of pore size and interpore distance on endothelial
cell growth on polymers. J. Biomed. Mater. Res. A 2008;
https://doi.org/10.1002/jbm.a.31749
89. Karageorgiou V, Kaplan D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis.
Biomaterials. 2005; 26(27):5474-5491. doi:10.1016/j.biomaterials.2005.02.002
90. Borenstein JT, Weinberg EJ, Orrick BK, Sundback C, Kaazempur-Mofrad MR, Vacanti
JP 2007 Microfabrication of three-dimensional engineered scaffolds. Tissue Eng 13:
1837–1844
91. Shin M, Matsuda K, Ishii O, Terai H, Kaazempur-Mofrad M, Borenstein J, Detmar M,
Vacanti JP. Endothelialized Networks with a Vascular Geometry in Microfabricated
Poly(dimethyl siloxane). Biomedical Microdevices 2004; 6, 269–278.
https://doi.org/10.1023/B:BMMD.0000048559.29932.27
92. Ovsianikov A, Ostendorf A, Chichkov BN. Three-dimensional photofabrication with
femtosecond lasers for applications in photonics and biomedicine. Appl. Surf. Sci.
2007, 253, 6599.
93. Tanihara M, Suzuki Y, Yamamoto E, Noguchi A, Mizush-ima Y. Sustained release of
basic fibroblast growth factor and angiogenesis in a novel covalently crosslinked gel of
heparin and alginate. J. Biomed. Mater. Res. 2001, 56, 216.
94. Lee JY, Nam SH, Im SY, Park YJ, Lee YM, Seol YJ, Chung CP, Lee S J. Enhanced
bone formation by controlled growth factor delivery from chitosan-based biomaterials. J.
Controlled Release 2002; 78, 187.
95. Silva GA, Coutinho OP, Ducheyne P, Shapiro IM, Reis RL. Starch-Based Microparticles
as Vehicles for the Delivery of Active Platelet-Derived Growth Factor. Tissue Eng.
2007, 13, 1259.
96. Malafaya PB, Silva GA, Reis RL. Natural–origin polymers as carriers and scaffolds for
biomolecules and cell delivery in tissue engineering applications. Adv. Drug Delivery
Rev 2007, 59, 207.
126
97. Kaigler D, Wang Z, Horger K, Mooney DJ, Krebsbach PH. VEGF scaffolds enhance
angiogenesis and bone regeneration in irradiated osseous defects. J Bone Miner Res.
2006;21(5):735-744. doi:10.1359/jbmr.060120
98. Murphy WL, Simmons CA, Kaigler D, Mooney DJ. Bone regeneration via a mineral
substrate and induced angiogenesis. J Dent Res. 2004;83(3):204-210.
doi:10.1177/154405910408300304
99. Moldovan NI, Ferrari M. Prospects for Microtechnology and Nanotechnology in
Bioengineering of Replacement Microvessels, Arch. Pathol. Lab. Med. 2002,126, 320.
100. Santos MI, Fuchs S, Gomes ME, Unger RE, Reis RL, Kirkpatrick CJ. Response of
micro- and macrovascular endothelial cells to starch-based fiber meshes for bone
tissue engineering. Biomaterials 2007, 28, 240.
101. Santos M.I. Unger R.E. Sousa R.A. Reis R.L. Kirkpatrick C.J. Crosstalk between
osteoblasts and endothelial celsl co-cultured on a polycaprolactone-starch scaffold and
the in vitro development of vascularization. Biomaterials. 2009;30:4407.
102. Unger R.E. Sartoris A. Peters K. Motta A. Migliaresi C. Kunkel M. Bulnheim U. Rychly
J. Kirkpatrick C.J. Tissue-like self-assembly in cocultures of endothelial cells and
osteoblasts and the formation of microcapillary-like structures on three-dimensional
porous biomaterials. Biomaterials. 2007;28:3965.
103. Kaigler D, Krebsbach PH, Polverini PJ, Mooney DJ. Role of vascular endothelial
growth factor in bone marrow stromal cell modulation of endothelial cells. Tissue Eng.
2003, 9, 95.
104. Parfitt AM. The physiologic and clinical significance of bone histomorphometric data. In:
Recker R, editor. Bone histomorphometry: techniques and interpretations. Boca Raton,
FL: CRC Press 1983. p.143–223.
105. Turner RT, Riggs BL, Spelsberg TC. Skeletal effects of estrogen. Endocr Rev
1994;15:275-300.
106. Lerner UH. Bone remodeling in post-menopausal osteoporosis. J Dent Res
2006;85:584-95.
107. Lee BC, Yeo IS, Kim DJ, et al. Bone formation around zirconia implants combined with
rhBMP-2 gel in the canine mandible. Clin Oral Implants Res 2013;24:1332-8.
108. Kim, Do-Gyoon. Can Dental Cone Beam Computed Tomography Assess Bone Mineral
Density? Journal of bone metabolism 2014; 21. 117-26. 10.11005/jbm.2014.21.2.117.
109. Kim DG, Navalgund AR, Tee BC, et al. Increased variability of bone tissue mineral
density resulting from estrogen deficiency influences creep behavior in a rat vertebral
body. Bone 2012;51:868-75.
110. Renders GA, Mulder L, van Ruijven LJ, et al. Degree and distribution of mineralization
in the human mandibular condyle. Calcif Tissue Int 2006;79:190-6.
111. McCreadie BR, Goldstein SA. Biomechanics of fracture: is bone mineral density
sufficient to assess risk? J Bone Miner Res 2000;15:2305-8.
127
112. Genant HK, Cooper C, Poor G, et al. Interim report and recommendations of the World
Health Organization Task-Force for Osteoporosis. Osteoporos Int 1999;10:259-64.
113. Hernandez CJ, Keaveny TM. A biomechanical perspective on bone quality. Bone
2006;39:1173-81.
114. Donnelly E. Methods for assessing bone quality: a review. Clin Orthop Relat Res
2011;469:2128-38.
115. Kim DG, Christopherson GT, Dong XN, et al. The effect of microcomputed tomography
scanning and reconstruction voxel size on the accuracy of stereological measurements
in human cancellous bone. Bone 2004;35:1375-82.
116. Hou FJ, Lang SM, Hoshaw SJ, et al. Human vertebral body apparent and hard tissue
stiffness. J Biomech 1998;31:1009-15.
117. Morgan EF, Keaveny TM. Dependence of yield strain of human trabecular bone on
anatomic site. J Biomech 2001;34:569-77.
118. Kim DG, Huja SS, Lee HR, et al. Relationships of viscosity with contact hardness and
modulus of bone matrix measured by nanoindentation. J Biomech Eng
2010;132:024502.
119. Kim DG, Huja SS, Navalgund A, et al. Effect of estrogen deficiency on regional
variation of a viscoelastic tissue property of bone. J Biomech 2013;46:110-5.
120. Isaksson H, Nagao S, Małkiewicz M, et al. Precision of nanoindentation protocols for
measurement of viscoelasticity in cortical and trabecular bone. J Biomech
2010;43:2410-7.
121. Isaksson H, Malkiewicz M, Nowak R, et al. Rabbit cortical bone tissue increases its
elastic stiffness but becomes less viscoelastic with age. Bone 2010;47:1030-8.
122. Ribeiro TP, Nascimento SB, Cardoso CA, Hage R, Almeida JD, Loschiavo Arisawa EA.
Low-Level Laser Therapy and Calcitonin in Bone Repair: Densitometric Analysis
International Journal of Photoenergy Volume 2012 (2012), Article ID 829587, 5
pageshttp://dx.doi.org/10.1155/2012/829587
123. Deniza E, Arslana A, Dikerb N, Olgacc V, Kilicd E. Evaluation of light-emitting diode
photobiomodulation on bone healing of rat calvarial defects. Biotechnology &
Biotechnological Equipment, 2015 Vol. 29, No. 4, 758_765,
http://dx.doi.org/10.1080/13102818.2015.1036774
124. Chun KJ. Bone densitometry. Semin Nucl Med. 2011;41(3):220-8. doi:
10.1053/j.semnuclmed.2010.12.002. PubMed PMID: 21440697.
125. Blake GM, Fogelman I. How important are BMD accuracy errors for the clinical
interpretation of DXA scans? Journal of bone and mineral research: the official journal
of the American Society for Bone and Mineral Research. 2008; 23(4):457-62. doi:
10.1359/jbmr.071119. PubMed PMID: 18052754.
128
126. Blake GM, Naeem M, Boutros M. Comparison of effective dose to children and adults
from dual X-ray absorptiometry examinations. Bone. 2006; 38(6):935-42. doi:
10.1016/j.bone.2005.11.007. PubMed PMID: 16376161.
127. Griffith JF, Genant HK. Bone mass and architecture determination: state of the art. Best
practice & research Clinical endocrinology & metabolism. 2008; 22(5):737-64. doi:
10.1016/j.beem.2008.07.003. PubMed PMID: 19028355
128. Harorli A, Akgül M, Dağistan S. Diş hekimliği radyolojisi. 1.Ed., Eser Ofset Matbaacilik,
Erzurum, 2006; 48–64 [in Turkish]
129. Hounsfield GN. The E.M.I. scanner. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 1977;195(1119):281-
9. PubMed PMID: 13396.
130. Diederichs G, Link TM, Kentenich M, Schwieger K, Huber MB, Burghardt AJ, et al.
Assessment of trabecular bone structure of the calcaneus using multi-detector CT:
Correlation with microCT and biomechanical testing. Bone. 2009; 44(5):976-83. doi:
10.1016/j.bone.2009.01.372. PubMed PMID: WOS:000265436000034.
131. Bauer JS, Link TM, Burghardt A, Henning TD, Mueller D, Majumdar S, et al. Analysis of
trabecular bone structure with multidetector spiral computed tomography in a simulated
softtissue environment. Calcified tissue international. 2007; 80(6):366-73. doi:
10.1007/s00223- 007-9021-5. PubMed PMID: WOS:000247412700004.
132. Issever AS, Link TM, Kentenich M, Rogalla P, Burghardt AJ, Kazakia GJ, et al.
Assessment of trabecular bone structure using MDCT: comparison of 64-and 320-slice
CT using HR-pQCT as the reference standard. European Radiology. 2010; 20(2):458-
68. doi: 10.1007/s00330-009- 1571-7. PubMed PMID: WOS:000274109700022.
133. Sievanen H, Koskue V, Rauhio A, Kannus P, Heinonen A, Vuori I. Peripheral
quantitative computed tomography in human long bones: evaluation of in vitro and in
vivo precision. Journal of bone and mineral research: the official journal of the
American Society for Bone and Mineral Research. 1998; 13(5):871-82. doi:
10.1359/jbmr.1998.13.5.871. PubMed PMID: 9610752.
134. Laib A, Rüegsegger P. Calibration of trabecular bone structure measurements of in vivo
threedimensional peripheral quantitative computed tomography with 28-μm-resolution
microcomputed tomography. Bone. 1999;24(1):35-9.
135. MacNeil JA, Boyd SK. Accuracy of high-resolution peripheral quantitative computed
tomography for measurement of bone quality. Medical engineering & physics.
2007;29(10):1096-105. doi: 10.1016/j.medengphy.2006.11.002. PubMed PMID:
17229586.
136. Burrows M, Liu D, Perdios A, Moore S, Mulpuri K, McKay H. Assessing bone
microstructure at the distal radius in children and adolescents using HR-pQCT: a
methodological pilot study. Journal of clinical densitometry: the official journal of the
International Society for Clinical Densitometry. 2010;13(4):451-5. doi:
10.1016/j.jocd.2010.02.003. PubMed PMID: 20663697. )
129
137. Burrows M, Liu D, McKay H. High-resolution peripheral QCT imaging of bone micro-
structure in adolescents. Osteoporosis international: a journal established as result of
cooperation between the European Foundation for Osteoporosis and the National
Osteoporosis Foundation of the USA. 2010;21(3):515-20. doi: 10.1007/s00198-009-
0913-2. PubMed PMID: 19322507.
138. Boutroy S, Bouxsein ML, Munoz F, Delmas PD. In vivo assessment of trabecular bone
microarchitecture by high-resolution peripheral quantitative computed tomography. The
Journal of clinical endocrinology and metabolism. 2005;90(12):6508-15. doi:
10.1210/jc.2005- 1258. PubMed PMID: 16189253
139. Liu XS, Cohen A, Shane E, Stein E, Rogers H, Kokolus SL, et al. Individual trabeculae
segmentation (ITS)-based morphological analysis of high-resolution peripheral
quantitative computed tomography images detects abnormal trabecular plate and rod
microarchitecture in premenopausal women with idiopathic osteoporosis. Journal of
bone and mineral research: the official journal of the American Society for Bone and
Mineral Research. 2010;25(7):1496- 505. doi: 10.1002/jbmr.50. PubMed PMID:
20200967; PubMed Central PMCID: PMC3131618.
140. Boutry N, Cortet B, Chappard D, Dubois P, Demondion X, Marchandise X, et al. Bone
structure of the calcaneus: analysis with magnetic resonance imaging and correlation
with histomorphometric study. Osteoporosis international: a journal established as
result of cooperation between the European Foundation for Osteoporosis and the
National Osteoporosis Foundation of the USA. 2004;15(10):827-33. doi:
10.1007/s00198-004-1619-0. PubMed PMID: 15042283.
141. Tjong W, Nirody J, Burghardt AJ, Carballido-Gamio J, Kazakia GJ. Structural analysis
of cortical porosity applied to HR-pQCT data. Medical physics. 2014;41(1):013701. doi:
10.1118/1.4851575. PubMed PMID: 24387533; PubMed Central PMCID:
PMCPMC3895089.
142. Burghardt AJ, Pialat JB, Kazakia GJ, Boutroy S, Engelke K, Patsch JM, et al.
Multicenter precision of cortical and trabecular bone quality measures assessed by
high-resolution peripheral quantitative computed tomography. Journal of bone and
mineral research: the official journal of the American Society for Bone and Mineral
Research. 2013;28(3):524-36. doi: 10.1002/jbmr.1795. PubMed PMID: 23074145;
PubMed Central PMCID: PMC3577969.
143. Hosseini HS, Maquer G, Zysset PK. muCT-based trabecular anisotropy can be
reproducibly computed from HR-pQCT scans using the triangulated bone surface.
Bone. 2017;97:114-20.doi: 10.1016/j.bone.2017.01.016. PubMed PMID: 28109918.
144. Klintström E, Klintström B, Moreno R, Brismar TB, Pahr DH, Smedby Ö. Predicting
trabecular bone stiffness from clinical cone-beam CT and HR-pQCT data; an in vitro
study using finite element analysis PloS one 2016; 11(8), e 0161101.
doi:10.1371/journal.pone 0161101
145. Burghardt AJ, Link TM, Majumdar S. High-resolution computed tomography for clinical
imaging of bone microarchitecture. Clin Orthop Relat Res 2011; 469: 2179–93.)
130
146. Elliott JC, Dover SD. X-ray microtomography. J Microsc. 1982;126(Pt 2):211-3.
PubMed PMID: 7086891.
147. Ford NL, Thornton MM, Holdsworth DW. Fundamental image quality limits for
microcomputed tomography in small animals. Medical physics. 2003;30(11):2869-77.
doi: 10.1118/1.1617353. PubMed PMID: 14655933
148. Bouxsein ML, Boyd SK, Christiansen BA, Guldberg RE, Jepsen KJ, Muller R.
Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed
tomography. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American
Society for Bone and Mineral Research. 2010;25(7):1468-86. doi: 10.1002/jbmr.141.
149. Swain MV, Xue J. State of the Art of Micro-CT Applications in Dental Research.
International Journal of Oral Science. 2009; 1(4): 177–188.
150. Meunier PJ, Boivin G. Bone Mineral Density Reflects bone mass but also the degree of
mineralization of bone: therapeutic implications. Bone. 1997; Vol. 21, p. 373-377.
151. Wang C, Wang X, Xu X-l, Yuan X-l, Gou W-l, et al. Bone Microstructure and Regional
Distribution of Osteoblast and Osteoclast Activity in the Osteonecrotic Femoral Head.
PLoS ONE 2014; 9(5): e96361. doi:10.1371/journal.pone.0096361
152. Çolak M. An Evaluation of Bone Mineral Density Using Cone Beam Computed
Tomography in Patients with Ectodermal Dysplasia: A Retrospective Study at a Single
Center in Turkey. Medical Science Monitor. 2019; 25. 3503-3509.
10.12659/MSM.914405.
153. De Vos W, Casselman J, Swennen GR. Cone-beam computerized tomography (CBCT)
imaging of the oral and maxillofacial region: a systematic review of the literature. Int J
Oral Maxillofac Surg 2009; 38: 609–25.
154. Tyndall DA, Brooks SL. Selection criteria for dental implant site imaging: a position
paper of the American Academy of Oral and Maxillofacial radiology. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2000; 89: 630–7.
155. Naitoh M, Katsumata A, Mitsuya S, Kamemoto H, Ariji E. Measurement of mandibles
with microfocus x-ray computerized tomography and compact computerized
tomography for dental use. Int J Oral Maxillofac Implants 2004; 19: 239-46.
156. Lagravère MO, Carey J, Toogood RW, Major PW. Three-dimensional accuracy of
measurements made with software on cone-beam computed tomography images. Am J
Orthod and Dentofacial Orthop 2008; 134: 112–6.
157. Lou L, Lagravere MO, Compton S, Major PW, Flores-Mir C. Accuracy of
measurements and reliability of landmark identification with computed tomography (CT)
techniques in the maxillofacial area: a systematic review. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol Oral Radiol Endod 2007; 104: 402–11.
158. Pour, Daryoush & Romoozi, Elham & Shayesteh, Yadollah. Accuracy of Cone Beam
Computed Tomography for Detection of Bone Loss. Journal of dentistry (Tehran, Iran).
2016;12. 513-23.
131
159. Guerra ENS, Almeida FT, Bezerra FV, Figueiredo PTDS, Silva MAG, De Luca Canto
G, et al. Capability of CBCT to identify patients with low bone mineral density:a
systematic review. Dentomaxillofac Radiol 2017; 46: 20160475.
160. Cristache C. Case Report Presurgical Cone Beam Computed Tomography Bone
Quality Evaluation for Predictable Immediate Implant Placement and Restoration in
Esthetic Zone. Case Reports in Dentistry. 2017; 10.1155/2017/1096365.
161. Celenk C, Celenk P. Bone Density Measurement Using Computed Tomography. 2012;
10.13140/2.1.1956.1924.
162. Yekaterina BE, Pilo R, Shpack N, Geron S. Can cone beam CT predict the hardness of
interradicular cortical bone?. Head & Face Medicine 2014; Head & Face Medicine
10(1):12
163. Bujtár P, Simonovics J, Zombori G et al. Internal or inscan validation: a method to
assess CBCT and MSCT gray scales using a human cadaver. Oral Surgery,Oral
Medicine,Oral Pathology and Oral Radiology, 2014;vol. 117, no. 6, pp. 768–779.
164. Razi T, Niknami M, Alavi Ghazani F. Relationship between hounsfield unit in CT scan
and gray scale in CBCT. Journal of Dental Research, Dental Clinics, Dental Prospects
2014; vol. 8, no. 2, pp. 107–110.
165. Seriwatanachai D, Kiattavorncharoen S, Suriyan N, Boonsiriseth K, Wongsirichat N.
Reference and techniques used in alveolar bone classification. Journal of
Interdisciplinary Medicine and Dental Science 2015;vol. 3, no. 2, article 172.
166. Cassetta M, Stefanelli LV, Pacifici A, Pacifici L,Barbato E. How accurate is CBCT in
measuring bone density? A comparative CBCT-CT in vitro study. Clinical Implant
Dentistry and Related Research, 2014;vol. 16, no. 4, pp. 471–478.
167. Fuster-Torres MA, Peñarrocha-Diago M, Peñarrocha- Oltra D, Peñarrocha-Diago M.
Relationships between bone density values from cone beam computed tomography,
maximum insertion torque, and resonance frequency analysis at implant placement: a
pilot study. The International Journal of Oral&Maxillofacial Implants, 2011; vol. 26, no.
5, pp. 1051–1056.
168. Isoda K, Ayukawa Y, Tsukiyama Y, Sogo M, Matsushita Y, Koyano K. Relationship
between the bone density estimated by cone-beam computed tomography and the
primary stability of dental implants. Clinical Oral Implants Research 2012;vol. 23, no. 7,
pp. 832–836.
169. Lee S, Gantes B, Riggs M, Crigger M. Bone density assessments of dental implant
sites: 3. Bone quality evaluation during osteotomy and implant placement. International
Journal of Oral andMaxillofacial Implants, 2007; vol. 22, no. 2, pp. 208– 212.
170. Salimov F, Tatli U, Kürkçü M, Akoglan M, Oztunc H, Kurtoglu C. Evaluation of
relationship between preoperative bone density values derived from cone beam
computed tomography and implant stability parameters: a clinical study. Clinical Oral
Implants Research 2014; vol. 25, no. 9, pp. 1016–1021.
132
171. González-Garc´ıa R,. Monje F. The reliability of conebeam computed tomography to

assess bone density at dental implant recipient sites: a histomorphometric analysis by
micro- CT. Clinical Oral Implants Research 2013;vol. 24, no. 8, pp. 871–879.
172. Klintström E, Smedby Ö, Moreno R, Brismar TB. Trabecular bone structure parameters
from 3D image processing of clinical multislice and cone-beam computed tomography
data. Skeletal radiology 2014; 43 (2), 197-204. doi: 10.1007/s00256-013-1766-5
173. Loubele M, Bogaerts R, Van Dijck E, Pauwels R, Vanheusden S, Suetens P, et al.
Comparison between effective radiation dose of CBCT and MSCT scanners for
dentomaxillofacial applications. European journal of radiology. 2009;71(3):461-8. doi:
10.1016/j.ejrad.2008.06.002. PubMed PMID: 18639404.
174. Ludlow JB, Ivanovic M. Comparative dosimetry of dental CBCT devices and 64-slice
CT for oral and maxillofacial radiology. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral
radiology, and endodontics. 2008;106(1):106-14. doi: 10.1016/j.tripleo.2008.03.018.
PubMed PMID: 18504152.)
175. Pauwels R, Beinsberger J, Collaert B, Theodorakou C, Rogers J, Walker A, et al.
Effective dose range for dental cone beam computed tomography scanners. European
journal of radiology. 2012;81(2):267-71. doi: 10.1016/j.ejrad.2010.11.028. PubMed
PMID: 21196094.
176. Helmrot E, Thilander-Klang A. Methods for monitoring patient dose in dental radiology.
Radiation protection dosimetry. 2010;139(1-3):303-5. doi: 10.1093/rpd/ncq095.
177. Arisan V, Karabuda ZC, Avsever H, Ozdemir T. Conventional multi-slice computed
tomography (CT) and cone-beam CT (CBCT) for computer-assisted implant placement.
Part I: relationship of radiographic gray density and implant stability. Clinical implant
dentistry and related research. 2013;15(6):893-906. doi: 10.1111/j.1708-
8208.2011.00436.x. PubMed PMID: 22251553.
178. Benavides E, Rios HF, Ganz SD, An CH, Resnik R, Reardon GT, et al. Use of cone
beam computed tomography in implant dentistry: the International Congress of Oral
Implantologists consensus report. Implant dentistry. 2012;21(2):78-86. doi:
10.1097/ID.0b013e31824885b5. PubMed PMID: 22382748.
179. Pauwels R, Jacobs R, Singer SR, Mupparapu M. CBCT-based bone quality
assessment: are Hounsfield units applicable? Dento maxillo facial radiology.
2015;44(1):20140238. doi: 10.1259/dmfr.20140238. PubMed PMID: 25315442;
PubMed Central PMCID: PMCPMC4277442.
180. Nackaerts O, Maes F, Yan H, Souza PC, Pauwels R, Jacobs R. Analysis of intensity
variability in multislice and cone beam computed tomography. Clinical oral implants
research. 2011;22(8):873-9. doi: 10.1111/j.1600-0501.2010.02076.x. PubMed PMID:
WOS:000292605600013.)
181. Oliveira ML, Tosoni GM, Lindsey DH, Mendoza K, Tetradis S, Mallya SM. Influence of
anatomical location on CT numbers in cone beam computed tomography. Oral surgery,
133
oral medicine, oral pathology and oral radiology. 2013;115(4):558-64. doi:

10.1016/j.oooo.2013.01.021. PubMed PMID: 23522649.)
182. Naitoh M, Aimiya H, Hirukawa A, Ariji E. Morphometric analysis of mandibular
trabecular bone using cone beam computed tomography: an in vitro study. The
International journal of oral & maxillofacial implants. 2010;25(6):1093-8. PubMed PMID:
21197484.)
183. Genant HK, Engelke K, Fuerst T, et al. Noninvasive assessment of bone mineral and
structure: state of the art. J Bone Miner Res 1996;11:707-30.
184. Guermazi A, Mohr A, Grigorian M, et al. Identification of vertebral fractures in
osteoporosis. Semin Musculoskelet Radiol 2002;6:241-52.
185. Ludlow JB, Davies-Ludlow LE, Brooks SL, et al. Dosimetry of 3 CBCT devices for oral
and maxillofacial radiology: CB Mercuray, NewTom 3G and i-CAT. Dentomaxillofac
Radiol 2006;35:219-26.
186. Mester E, Szende B, Gärtner P. The effect of laser beams on the growth of hair in mice.
Radiobiol. Radiother. (Berl). 1968; 9(5):621–626. [PubMed: 5732466]
187. McGuff PE, Deterling RA, Gottlieb LS. Tumoricidal effect of laser energy on
experimental and human malignant tumors. N. Engl. J. Med. 1965; 273(9):490–492.
[PubMed: 5318702]
188. Pinheiro C, Bueno D. Alternative Strategies for Stem Cell Osteogenic Differentiation.
2018; 10.5772/intechopen.82333.
189. Hamblin MR, Ferraresi C, Huang MDYY, de Freitas LF, Carroll JD. SPIE PRESS
BOOK, Low-Level Light Therapy: Photobiomodulation, January 2018, P. 388, ISBN:
9781510614154, Volume: TT115
190. Freitas L, Hamblin M. Proposed Mechanisms of Photobiomodulation or Low Level Light
Therapy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics 2016; 22. 1-1.
10.1109/JSTQE.2016.2561201.
191. Huang YY, Sharma S, Carroll J, Hamblin M. Biphasic Dose Response in Low Level
Light Therapy - An Update. Dose-response : a publication of International Hormesis
Society. 9. 602-18. 10.2203/dose-response.11-009.Hamblin. Dose-Response, 9:602–
618, 2011 Formerly Nonlinearity in Biology, Toxicology, and Medicine,2011 University
of Massachusetts ISSN: 1559-3258 DOI: 10.2203/dose-response.11-009.Hamblin
192. Arany PR. Craniofacial Wound Healing with Photobiomodulation Therapy: New Insights
and Current Challenges. J Dent Res 2016; Aug;95(9):977-84. doi:
10.1177/0022034516648939. Epub 2016 May 9.
193. Khan I, Arany PR. Dosimetry for photobiomodulation therapy: response to Sommers et
al. Ann Transl Med 2016;4(10):208. doi: 10.21037/atm.2016.05.34
194. Tumilty S, Munn J, McDonough S, Hurley DA, Basford JR, Baxter GD. Low level laser
treatment of tendinopathy: a systematic review with meta-analysis. Photomed Laser
Surg. 2010;28(1):3-16. doi:10.1089/pho.2008.2470
134
195. Tedford CE, DeLapp S, Jacques S, Anders J. Quantitative analysis of transcranial and
intraparenchymal light penetration in human cadaver brain tissue [published correction
appears in Lasers Surg Med. 2015 Jul;47(5):466]. Lasers Surg Med. 2015;47(4):312-
322. doi:10.1002/lsm.22343
196. Gerald R, Alana R. Photobiomodulation: An Invaluable Tool for All Dental Specialties,
Tottenham, Ontario, Canada, J Laser Dent 2009;17(3):117-124
197. Keiser G. Optical Fibers for Biomedical Applications. In: Peng GD. (eds) Handbook of
Optical Fibers. Springer, Singapore. 2019; https://doi.org/10.1007/978-981-10-7087-
7_35
198. Smith KC. The Photobiological Basis of Low Level Laser Radiation Therapy. Laser
Therapy 1991;3(1), 6.
199. Smith KC, The Science of Photobiology, Plenum Press, New York 1977.
200. Hashmi JT, Huang YY, Sharma SK, et al. Effect of pulsing in low-level light therapy.
Lasers Surg Med. 2010;42(6):450-466. doi:10.1002/lsm.20950.
201. Brugnera A Jr, dos Santos AECG, Bologna ED, Ladalardo TCCGP. Atlas of laser
therapy applied to clinical dentistry, Prospects in the use of therapeutic laser, 2006,
ISBN:978-85-87425-69-0, 9788587425690.
202. Wong-Riley MT, Liang HL, Eells JT, et al. Photobiomodulation directly benefits primary
neurons functionally inactivated by toxins: role of cytochrome c oxidase. J Biol Chem.
2005;280(6):4761-4771. doi:10.1074/jbc.M409650200.
203. Karu TI. Mitochondrial signaling in mammalian cells activated by red and near-IR
radiation. Photochem. Photobiol. 2008; 84(5):1091–1099. [PubMed: 18651871].
204. Kaneko Y, Szallasi A. Transient receptor potential (TRP) channels: a clinical
perspective. Br J Pharmacol. 2014;171, 2474-2507.
205. Gu Q, Wang L, Huang F, Schwarz W. Stimulation of TRPV1 by Green Laser Light. Evid
Based Complement Alternat Med. 2012, 857123 (2012)
206. Albert ES, Bec JM, Desmadryl G, et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-
evoked response in sensory neurons. J Neurophysiol. 2012;107(12):3227-3234.
doi:10.1152/jn.00424.2011
207. Passarella S, Karu T. Absorption of monochromatic and narrow band radiation in the
visible and near IR by both mitochondrial and non-mitochondrial photoacceptors results
in photobiomodulation. J Photochem Photobiol B. 2014;140:344-358.
doi:10.1016/j.jphotobiol.2014.07.021
208. Sommer AP, Zhu D, Scharnweber T. Laser modulated transmembrane convection:
Implementation in cancer chemotherapy, J. Control. Release 148 2010; 131–134.
209. Benedicenti A, Verrando M, Cherlone F, Brunetti O. [Effect of a 904 nm laser on
microcirculation and arteriovenous circulation as evaluated using telethermographic
imaging]. Parodontol Stomatol (Nuova). 1984 May;23(2):167-78.
135
210. Dortbudak O, Haas R, Mallath-Pokorny G. Biostimulation of bone marrow cells with a

diode soft laser. Clin Oral Implants Res. 2000 Dec;11(6):540-5.
211. Garavello-Freitas I, Baranauskas V, Joazeiro PP, Padovani CR, Dal Pai-Silva M, da
Cruz-Hofling MA. Low-power laser irradiation improves histomorphometrical
parameters and bone matrix organization during tibia wound healing in rats. J
Photochem Photobiol B. 2003 May-Jun;70(2):81-9.
212. Campana V, Moya M, Gavotto A, Juri H, Palma JA. Effects of diclofenac sodium and
He:Ne laser irradiation on plasmatic fibrinogen levels in inflammatory processes. J Clin
Laser Med Surg. 1998 Dec;16(6):317-20.
213. Hall G, Anneroth G, Schennings T, Zetterqvist L, Ryden H. Effect of low level energy
laser irradiation on wound healing. An experimental study in rats. Swed Dent J.
1994;18(1-2):29-34.
214. Lizarelli, RFZ, Lamano-Carvalho TL, Brenttegnani LG. Histometrical evaluation of the
healing of the dental alveolusin rats after irradiation with a low-powered GaAlAs laser,
in:Lasers Dentistry V. Proceedings of SPIE. 1999. pp. 49–56.
215. Freitas IGF, Baranaukas V, Cruz-Hofling MA. Laser effects on osteogenesis. Appl.
Surface Sci. 2000; 154/155: 548–554.
216. Freitas N, Guerrini L, Esper L, Sbrana M, Dalben G, Soares S, Almeida AL. Evaluation
of photobiomodulation therapy associated with guided bone regeneration in critical size
defects. In vivo study. Journal of Applied Oral Science. 2018; 26. 10.1590/1678-7757-
2017-0244.
217. Lindsey RW, Gugala Z, Milne E, Sun M, Gannon FH, Latta LL. The efficacy of
cylindrical titanium mesh cage for the reconstruction of a critical-size canine segmental
femoral diaphyseal defect. J Orthop Res 2006;24:1438e53.
218. Gugala Z, Lindsey RW, Gogolewski s. New Approaches in the treatment of critical-size
segmental defects in long bones. Macromol Symp 2007;253:147e61.
219. Brigitte von Rechenberg, Animal models in bone repair, Drug Discovery Today:
Disease Models | Bone biology in animal models, including testing of bone biomaterials
2014;Vol. 13.
220. Li Y, Chen SK, Li L, Qin L, Wang XL, Lai YX. Bone defect animal models for testing
efficacy of bone substitute biomaterials. J Orthop Translat. 2015;3(3):95-104. Published
2015 Jun 16. doi:10.1016/j.jot.2015.05.002
221. Honma T, Itagaki T, Nakamura M, et al. Bone formation in rat calvaria ceases within a
limited period regardless of completion of defect repair. Oral Dis. 2008;14(5):457-464.
doi:10.1111/j.1601-0825.2007.01401.x
222. Stavropoulos A, Sculean A, Bosshardt DD, Buser D, Klinge B. Pre-clinical in vivo
models for the screening of bone biomaterials for oral/craniofacial indications: focus on
small-animal models. Periodontol 2000. 2015 Jun;68(1):55-65. doi: 10.1111/prd.12065.
136
223. Saadeh PB, Khosla RK, Mehrara BJ, et al. Repair of a critical size defect in the rat
mandible using allogenic type I collagen. J Craniofac Surg. 2001;12(6):573-579.
doi:10.1097/00001665-200111000-00015
224. Chin VK, Shinagawa A, Naclério-Homem Mda G. Bone healing of mandibular critical-
size defects in spontaneously hypertensive rats. Braz Oral Res. 2013 Sep-
Oct;27(5):423-30. doi: 10.1590/S1806-83242013000500006.
225. Hoerth RM, Seidt BM, Shah M, et al. Mechanical and structural properties of bone in
non-critical and critical healing in rat. Acta Biomater. 2014;10(9):4009-4019.
doi:10.1016/j.actbio.2014.06.003
226. Andreollo NA, Santos EF, Araújo MR, Lopes LR. Rat's age versus human's age: what
is the relationship Arq Bras Cir Dig. 2012 Jan-Mar;25(1):49-51.
227. Silva YS, Deboni MCZ, Arana-Chaves VE, Naclério-Homem MG. Novel Model of Mono
Cortical Bone Defect in Rat Mandible: An Interesting Tool for Osseous Investigations.
International Journal of Health Sciences, Vol. 4(2), June 2016 IJHS, 2016, 4, 47–54.
228. Luca R, Todea CD, Constantin GD, Mocuta D, Munteanu R. Animal models in guided
bone regeneration using photobiomodulation: general aspects and particularities
influencing the studies outcome - a review. Proc. SPIE 10831, Seventh International
Conference on Lasers in Medicine, 2018,108310A doi: 10.1117/12.2285172.
229. Podoleanu AG, Bradu A. Master-slave interferometry for parallel spectral domain
interferometry sensing and versatile 3D optical coherence tomography Opt Express
2013;21:19324-38.
230. Duma VF. Laser scanners with oscillatory elements:Design and optimization of 1D and
2D scanning functions. Appl Mathematical Modelling 2019;67:456-76.
231. Kasseck C, Kratz M, Torcasio A, Gerhardt NC, van Lenthe H, Gambichler T, Hoffmann
K, Jones D, Hofmann MR. Comparison of optical coherence tomography,
microcomputed tomography, and histology at a three-dimensionally imaged trabecular
bone sample. J Biomed Opt 2010;15:046019.
232. Pinheiro AL, Gerbi ME. Photoengineering of bone repair processes. Photomed Laser
Surg 2006;24:169-78.
233. Vladimirov YA, Osipov AN, Klebanov GI. Photobiological principles of therapeutic
applications of laser radiation. Biochemistry 2004;69:81-90.
234. Bosco AF, Faleiros PL, Carmona LR, Garcia VG, Theodoro LH, de Araujo NJ, Nagata
MJ, de Almeida JM. Effects of low-level laser therapy on bone healing of critical-size
defects treated with bovine bone graft. J Photochem Photobiol B 2016;163:303-10.
235. Luca R, Todea CD, Duma VF, Bradu A, Podoleanu A. Quantitative assessment of rat
bone regeneration using complex master–slave optical coherence tomography, Quant.
Imaging Med. Surg. 2019, 9, 782–798.
137
236. Huang D, Swanson EA, Lin CP, Schuman JS, Stinson WG, Chang W, Hee MR, Flotte
T, Gregory K, Puliafito CA. Optical coherence tomography. Science 1991, 254, 1178–
1181.
237. Drexler W, Liu M, Kumar A, Kamali T, Unterhuber A, Leitgeb RA. Optical coherence
tomography today: Speed, contrast, and multimodality. J. Biomed. Opt. 2014, 19,
071412.)
238. Monroy GL, Won J, Spillman DR, Dsouza R, Boppart SA. Clinical translation of
handheld optical coherence tomography: Practical considerations and recent
advancements. J. Biomed. Opt. 2017, 22, 121715.)
239. Duma VF, Dobre G, Demian D, Cernat R, Sinescu C, Topala FI, Negrutiu ML, Hutiu G,
Bradu A, Podoleanu AG. Handheld scanning probes for optical coherence tomography.
Rom. Rep. Phys. 2015, 67, 1346–1358.
240. Sella VRG, Bomfim FRCD, Machado PCD, Morsoleto MJ, Chohfi M, Plaple H. Effect of
low-level laser therapy on bone repair: a randomized controlled experimental study.
Lasers Med Sci 2015;30:1061-8.
241. Fekrazad R, Sadeghi Ghuchani M, Eslaminejad MB, Taghiyar L, Kalhori KAM, Pedram
MS, Shayan AM, Aghdami N, Abrahamse H. The effects of combined low level laser
therapy and mesenchymal stem cells on bone regeneration in rabbit calvarial defects. J
Photochem Photobiol B 2015;151:180-5.
242. Manescu A, Giuliani A, Mazzoni S, Mohammadi S, Tromba G, Diomede F et al.
Osteogenic potential of Dual-blocks cultured with periodontal ligament stem cells: in-
vitro and synchrotron microtomography study. J Periodontal Res. 2016, 51(1), 112-24.
243. Mazzoni S, Mohammadi S, Tromba G, Diomede F, Piattelli A, Trubiani O et al. Role of
cortico-cancellous heterologous bone in human periodontal ligament stem cell xeno-
free culture studied by Synchrotron radiation phase-contrast microtomography. Int. J.
Mol. Sci. 2017, 18(2), 364.
244. Brun F, Massimi L, Fratini M et al. SYRMEP Tomo Project: a graphical user interface
for customizing CT reconstruction workflows. Adv Struct Chem Imaging 2017, 3(1), 4
245. Giuliani A, Iezzi G, Mozzati M, Gallesio G, Mazzoni S, Tromba G et al.
Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Human Jaw: a combined 3D assessment
of Bone Descriptors by Histology and Synchrotron Radiation-based Microtomography.
Oral Oncology 2018, 82, 200-202. https://doi.org/10.1016/j.oraloncology.2018.04.026
246. Weitkamp T, Haas D, Wegrzynek D, Rack A. ANKAphase: software for single-distance
phase retrieval from inline X-ray phase-contrast radiographs. J Synchrotron Radiat
2011, 18(4), 617–29.
247. Roschger P, Paschalis EP, Fratzl P, Klaushofer K. Bone mineralization density
distribution in health and disease. Bone 2008, 42(3), 456–66.
248. Yip G, Schneider P, Roberts EW. Micro-computed tomography: high resolution imaging
of bone and implants in three dimensions. Semin Orthod 2004; 10: 174–87.
138
249. Nicolau RA, Martinez MS, Rigau J, Tomas J. Effect of low power 655 nm diode laser
irradiation on the neuromuscular junctions of the mouse diaphragm. Lasers Surg. Med.
2004, 34, 277–284.
250. Khadra M, Kasem N, Haanaes HR, Ellingsen JE, Lyngstadaas SP. Enhancement of
bone formation in rat calvarial bone defects using low-level laser therapy. Oral Surg
Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2004;97(6):693-700.
doi:10.1016/j.tripleo.2003.11.008
251. Weber JB, Pinheiro AL, de Oliveira MG, Oliveira FA, Ramalho LM. Laser therapy
improves healing of bone defects submitted to autologous bone graft. Photomed. Laser
Surg. 2006, 24, 38–44.
252. Takauti CA, Futema F, Brito Junior RB, Abrahão AC, Costa C, Queiroz CS.
Assessment of bone healing in rabbit calvaria grafted with three different biomaterials.
Braz. Dent. J. 2014, 25, 379–384. doi: 10.1590/0103-6440201302383.
253. Rokn AR, Khodadoostan MA, Ghahroudi AARR, Aar R, Motahhary P, Javad M, Fard K,
Bruyn D, Afzalifar R, Soolari E, Soolari A. Bone formation with two types of grafting
materials: A histologic and histomorphometric study. Open Dent. J. 2011, 5, 96–104.
254. Giuliani A, Moroncini F, Mazzoni S, Belicchi ML, Villa C, Erratico S, Colombo E,
Calcaterra F, Brambilla L, Torrente Y, Albertini G, Della Bella S. Polyglycolic Acid–
Polylactic Acid scaffold response to different progenitor cell in vitro cultures: A
demonstrative and comparative X-Ray Synchrotron Radiation Phase-Contrast
Microtomography study. Tissue Eng. Part C: Methods 2014, 20, 308–316. doi:
10.1089/ten.TEC.2013.0213.)
255. Luca RE, Giuliani A, Mănescu A, Heredea R, Hoinoiu B, Constantin GD, Duma VF,
Todea CD. Osteogenic Potential of Bovine Bone Graft in Combination with Laser
Photobiomodulation: An Ex Vivo Demonstrative Study in Wistar Rats by Cross-Linked
Studies Based on Synchrotron Microtomography and Histology. Int. J. Mol.
Sci. 2020, 21, 778.
256. Manescu A, Oancea R, Todea C, Rusu LC, Mazzoni S, Negrutiu ML, Sinescu C,
Giuliani A. On Long Term Effects of Low Power Laser Therapy on Bone Repair: A
Demonstrative Study by Synchrotron Radiation-based Phase-Contrast
Microtomography. Int. J. Radiol. Imaging Technol. 2016, 2, 010.
257. Rominu M, Manescu A, Sinescu C, Negrutiu ML, Topala F, Rominu RO, Bradu A,
Jackson DA, Giuliani A, Podoleanu AG. Zirconia enriched dental adhesive: A solution
for OCT contrast enhancement. Demonstrative study by synchrotron radiation
microtomography. Dent. Mater. 2014, 30, 417–423.
258. Misch CE. Bone density: a key determinant for treatment planning. Contemporary
Implant Dentistry. St. Louis: Mosby Elsevier; 2008;130–147.
259. Friberg B, Jemt T, Lekholm U. Early failures in 4,641 consecutively placed Branemark
dental implants: a study from stage 1 surgery to the connection of completed
prostheses. Int J Oral Maxillofac Implants 1991;6:142–146.
139
260. Jaffin RA, Berman CL. The excessive loss of Branemark fixtures in type IV bone: a 5-
year analysis. J Periodontol 1991;62:2–4.
261. Tolstunov L. Dental implant success-failure analysis: a concept of implant vulnerability.
Implant Dent 2006;15:341–346.
262. Linetskiy I, Demenko V, Linetska L, et al. Impact of annual bone loss and different bone
quality on dental implant success—A finite element study. Comput Biol Med
2017;91:318–325.
263. Erselcan T ve ark: Kemik mineral yoğunluğu ölçümü ve uygulama klavuzu. Turk J Nucl
Med, 2009; 18(1): 31–40 [in Turkish].
264. Orhan K: Diş Hekimliğinde konik işinli komputerize tomografinin (KIBT) yeri ve önemi.
Yeditepe J Dent, 2012; 3: 6–17 [in Turkish].
265. Hatcher DC. Operational principles for cone-beam computed tomography. J Am Dent
Assoc 2010; 141 Suppl 3: 3S–6S.
266. Farman AG. Field of view. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2009;
108: 477–8.
267. Hua Y, Nackaerts O, Duyck J, Maes F, Jacobs R. Bone quality assessment based on
cone beam computed tomography imaging. Clin Oral Implants Res 2009; 20: 767–71.
268. Schulze R, Heil U, Gross D, Bruellmann DD, Dranischnikow E, Schwanecke U, et al.
Artifacts in CBCT: a review. Dentomaxillofac Radiol 2011; 40: 265-73.
269. Araki K, Okano T. The effect of surrounding conditions on pixel value of cone beam
computed tomography. Clin Oral Implants Res 2013; 24: 862-5. doi: 10.1111/j.1600-
0501.2011.02373.x
270. Maes F, Collignon A, Vandermeulen D, Marchal G, Suetens P. Multimodality image
registration by maximization of mutual information. IEEE Trans Med Imaging 1997; 16:
187–98.
271. Aranyarachkul P, Caruso J, Gantes B, Schulz E, Riggs M, Dus I, et al. Bone density
assessments of dental implant sites: 2. Quantitative cone-beam computerized
tomography. Int J Oral Maxillofac Implants 2005; 20: 416-24.
272. Naitoh M, Hirukawa A, Katsumata A, Ariji E. Evaluation of voxel values in mandibular
cancellous bone: relationship between cone-beam computed tomography and
multislice helical computed tomography. Clin Oral Implants Res 2009; 20: 503–6.
273. Naitoh M, Hirukawa A, Katsumata A, Ariji E. Prospective study to estimate mandibular
cancellous bone density using large-volume cone-beam computed tomography. Clin
Oral Implants Res 2010; 21: 1309-13.
274. Nomura Y, Watanabe H, Honda E, Kurabayashi T. Reliability of voxel values from
cone-beam computed tomography for dental use in evaluating bone mineral density.
Clin Oral Implants Res 2010; 21: 558-62
140
275. Lagravère MO, Fang Y, Carey J, Toogood RW, Packota GV, Major PW. Density
conversion factor determined using a cone-beam computed tomography unit NewTom
QR-DVT 9000. Dentomaxillofac Radiol 2006; 35: 407-9.
276. De Oliveira RCG, Leles CR, Normanha LM, Lindh C, Ribeirorotta RF. Assessments of
trabecular bone density at implant sites on CT images. Oral Surgery Oral Medicine Oral
Pathology Oral Radiology and Endodontology, 2008, 105, 231–238.
277. Bilhan H, Arat S, Geçkili O. Hekimin implant cerrahisi sirasinda hissettiği kemik direnci
ile radyografiden elde edilen hounsfield ünitesi değerlerinin karşilaştirilmasi: Bir pilot
çalişma. Gazi Üniversitesi Dişhekimliği Fakültesi Derg, 2012; 29(1): 19–24 [in Turkish]
278. Koh KJ, Kim KA. Utility of the computed tomography indices on cone beam computed
tomography images in the diagnosis of osteoporosis in women. Imaging Sci Dent.
2011; 41: 101-106. PMid:22010066. https://doi.org/10.5624/isd.2011.41.3.101
279. Mostafa RA, Arnout EA, Abo EI-Fotouh MM. Feasibility of cone beam computed
tomography radiomorphometric analysis and fractal dimension in assessment of
postmenopausal osteoporosis in correlation with dual X-ray absorptiometry.
Dentomaxillofac Radiol. 2016; 45: 20160212. PMid:27418348.
https://doi.org/10.1259/dm fr.20160212
280. Brasileiro CB, Chalub LLFH, Abreu MHNG, et al. Use of cone beam computed
tomography in identifying postmenopausal women with osteoporosis. Arch Osteoporos.
2017; 12: 26. PMid:28265896. https://doi.org/10.1007/s11657-017-0314-7
281. Barngkgei I, AI Haffar I, Khattab R. Osteoporosis prediction from the mandible using
cone-beam computed tomography. Imaging Sci Dent. 2014; 44: 263-271.
PMid:25473633. https://doi.org/10 .5624/isd.2014.44.4.263
282. Güngör E, Yildirim D, Cevik R. Evaluation of osteoporosis in jaw bones using cone
beam CT and dual-energy X-ray absorptiometry. J Oral Sci. 2016; 58: 185-194.
PMid:27349539. https: //doi.org/10.2334/josnusd.15-0609
283. Ogura I, Sasaki Y, Sue M, Oda T, Kameta A, Hayama K. Aging and cortical bone
density of mandible with CBCT, International Journal of Diagnostic Imaging 2018, Vol.
5, No. 2, 10.5430/ijdi.v5n2p23
284. Saadawy L, Fahmy R, Matrawy K, Zeitoun M, Gaweesh Y. Relation of cone beam
computed tomography assessment of mandibular bone density to dual energy x-ray
absorptiometry in type 2 diabetes mellitus patients. Alexandria Dental Journal 2019; 44.
87-92. 10.21608/adjalexu.2019.57591.
285. Marquezan M, Lau TCL, Mattos CT, Cunha ACd, Nojima LI, Sant'Anna EF, et al. Bone
mineral density. Angle Orthod. 2012;82:62-6.
286. Ibrahim N, Parsa A, Hassan B, van der Stelt P, Aartman IH, Nambiar P. Influence of
object location in different FOVs on trabecular bone microstructure measurements of
human mandible: a cone beam CT study. Dentomaxillofac Radiol. 2014;43:20130329.
287. Turri A, Dahlin C. Comparative maxillary bone-defect healing by calcium-sulphate or
deproteinized bovine bone particles and extra cellular matrix membranes in a guided
141
bone regeneration setting: An experimental study in rabbits. Clin. Oral. Implant. Res.
2015, 26, 501–506. doi: 10.1111/clr.12425.
288. Carter DR, Loboa EG, Polefka EG, Beaupre GS. Mechanical Influences on Skeletal
Regeneration. In Human Biomechanics and Injury Prevention. Kajzer, J.; Tanaka, E.;
Yamada, H. (eds); Tokyo: Springer, 2000, pp. 129-136.
289. Lakey LA, Akella R, Ranieru JP. Angiogenesis: Implications for tissue repair. In Bone
Engineering, Davies, J.E. (ed); Toronto: EM Squared Incorporated. 2000, pp.137–142
290. Soleimani M, Abbasnia E, Fathi M, Sahraei H, Fathi Y, Kaka G. The effects of low-level
laser irradiation on differentiation and proliferation of human bone marrow
mesenchymal stem cells into neurons and osteoblasts--an in vitro study. Lasers Med.
Sci. 2012, 27, 423–430.
291. Saygun I, Nizam N, Ural AU, Serdar MA, Avcu F, Tozum TF. Low-level laser irradiation
affects the release of basic fibroblast growth factor (bFGF), insulin-like growth factor-I
(IGF-I), and receptor of IGF-I (IGFBP3) from osteoblasts. Photomed. Laser Surg. 2012,
30, 149–154.
292. Dörtbudak O, Haas R, Mallath-Pokorny G. Biostimulation of bone marrow cells with a
diode soft laser. Clin. Oral. Implants Res. 2000,11, 540–545.
293. Weber JBB. Avaliação do efeito da laserterapia (GaAlAs) nos enxertos ósseos
autógenos em ratos: Estudo morfológico [Doctoral dissertation]. 2003, Porto Alegre,
Brazil: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.
294. Rechenberg B. Animal models in bone repair. Drug Discov. Today 2014, 13, 23–27.
295. Lopes-Martins R. Low level laser therapy [LLLT] in inflammatory and rheumatic diseases: A
review of therapeutic mechanisms, Curr. Rheumatol. Rev. 2007, 3, 147–154.
296. Hamblin M. Mechanisms and applications of the anti-inflammatory effects of
photobiomodulation. AIMS Biophysics. 2017, 4. 337-361
297. Pinheiro ALB, Limeira Júnior FA, Gerbi MEMM, Ramalho LM, Marzola C, Ponzi EA,
Soares AO, De Carvalho LC, Lima HC, Gonçalves TO. Effect of 830-nm laser light on
the repair of bone defects grafted with inorganic bovine bone and decalcified cortical
oss osseous membrane. J. Clin. Laser Med. Surg. 2003, 21, 383–388.
298. Torres CS, dos Santos JN, Monteiro JS, Amorim PG, Pinheiro AL. Does the Use of
Laser Photobiomodulation, Bone Morphogenetic Proteins, and Guided Bone
Regeneration Improve the Outcome of Autologous Bone Grafts? An in Vivo Study in a
Rodent Model. Photomed. Laser Surg. 2008, 26, 371–377. doi:
10.1089/pho.2007.2172
142
I
II
International Journal of
Molecular Sciences
Article
Osteogenic Potential of Bovine Bone Graft in
Combination with Laser Photobiomodulation:
An Ex Vivo Demonstrative Study in Wistar Rats by
Cross-Linked Studies Based on Synchrotron
Microtomography and Histology
Ruxandra Elena Luca 1 , Alessandra Giuliani 2, * , Adrian Mănescu 2 , Rodica Heredea 3,4 ,
Bogdan Hoinoiu 5 , George Dumitru Constantin 1 , Virgil-Florin Duma 6,7 and
Carmen Darinca Todea 1
1 Department of Oral Rehabilitation and Dental Emergencies, School of Dental Medicine, “Victor Babeş”
University of Medicine and Pharmacy, 300041 Timisoara, Romania; luca.ruxandra@umft.ro (R.E.L.);
george.dctin@gmail.com (G.D.C.); todea.darinca@umft.ro (G.C.T.)
2 Department of Clinical Science, Polytechnic University of Marche, 60131 Ancona, Italy;
a.manescu@univpm.it
3 Department of Microscopic Morphology/Histology, “Victor Babes” University of Medicine and Pharmacy,
300041 Timisoara, Romania; heredea.rodica@yahoo.com
4 Department of Pathology, “Louis Turcanu” Children’s Clinical Emergency Hospital,
300041 Timisoara, Romania
5 Division of Clinical Practical Skills, “Victor Babes” University of Medicine and Pharmacy, 300041 Timisoara,
Romania; hoinoiu@umft.ro
6 3OM Optomechatronics Group, Faculty of Engineering, “Aurel Vlaicu” University of Arad, 310132 Arad,
Romania; duma.virgil@osamember.org
7 Doctoral School, Polytechnic University of Timisoara, 300006 Timisoara, Romania
* Correspondence: a.giuliani@univpm.it; Tel.: +39-071-220-4603
��
Received: 21 December 2019; Accepted: 23 January 2020; Published: 25 January 2020 ��
Abstract: Background: Alveolar bone defects are usually the main concern when planning implant
treatments for the appropriate oral rehabilitation of patients. To improve local conditions and achieve
implant treatments, there are several methods used for increasing bone volume, among which one
of the most successful, versatile, and effective is considered to be guided bone regeneration. The
aim of this demonstrative study was to propose an innovative analysis protocol for the evaluation
of the effect of photobiomodulation on the bone regeneration process, using rat calvarial defects of
5 mm in diameter, filled with xenograft, covered with collagen membrane, and then exposed to laser
radiation. Methods: The animals were sacrificed at different points in time (i.e., after 14, 21, and
30 days). Samples of identical dimensions were harvested in order to compare the results obtained
after different periods of healing. The analysis was performed by cross-linking the information
obtained using histology and high-resolution synchrotron-based tomography on the same samples.
A comparison was made with both the negative control (NC) group (with a bone defect which
was left for spontaneous healing), and the positive control (PC) group (in which the bone defects
were filled with xenografts and collagen membrane without receiving laser treatment). Results: We
demonstrated that using photobiomodulation provides a better healing effect than when receiving
only the support of the biomaterial. This effect has been evident for short times treatments, i.e., during
the first 14 days after surgery. Conclusion: The proposed analysis protocol was effective in detecting
the presence of higher quantities of bone volumes under remodeling after photobiomodulation with
respect to the exclusive bone regeneration guided by the xenograft.
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778; doi:10.3390/ijms21030778 www.mdpi.com/journal/ijms

III
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 2 of 17
Keywords: Photobiomodulation; bone regeneration; xenograft; collage membrane; synchrotron

radiation-based X-ray microtomography; histology
1. Introduction
Nowadays, dental medicine is confronted with the challenge of solving large edentations
complicated with severe bone loss through the usage of implant prosthetic restorations. To make such
treatments successful and predictable, specific pre-requisites regarding the bone quantity and quality
are required. Alveolar bone defects are usually caused by infections, surgical trauma due to aggressive
extraction, periodontal diseases, or accidental trauma [1–3]. To improve local conditions and to give the
patient the possibility to receive an appropriate implant treatment, several methods and biomaterials
for increasing the bone volume have been tested. Bone grafting is the second most frequent tissue
transplantation after blood, with over two million procedures reported annually worldwide [4].
One of the most successful bone reconstruction methods is guided bone regeneration. This is
considered the most versatile and effective method for alveolar ridge augmentation [5–7], offering the
possibility of over 5 mm bone gain in the vertical and horizontal aspect [5,8–12]. There are publications
that report an increase of even 8.5 mm in height [5,13] by the appropriate usage of this technique.
Regarding the bone graft materials, to harvest autogenous bone graft from the patient donor site is still
considered the gold standard, even though it has clear limitations regarding the possibility of donor
site complications and of subsequent morbidity [1–3]. The need to replace autogenous bone with other
materials led to the development of allografts, xenografts, and alloplasts [14,15].
Independently of the utilized technique and materials, bone augmentation with a biomaterial and
its simultaneous covering with a barrier membrane involve a series of regular biological process of
osteo-induction and osteo-conduction. They also involve several cell types and signaling with specific
timing [16,17], thus combining the potential of the materials used and their mechanical properties [18].
Hitti and Kerns [19] extensively described the need for a barrier membrane, which enhances new bone
formation by preventing the rapid ingrowth of fibroblasts into a bony defect. An important condition
for the migration of the osteogenic cells from the bone edges to the defect is sealing the intrabony
defect with a membrane. In this case, the rate of osteogenesis exceeds the rate of fibrogenesis [20].
Increased interest is nowadays focused not only on biomaterials but also on the development
of methods with stimulatory effects on bone cell proliferation. In this respect, photobiomodulation
has shown promising results in stimulating cell proliferation, especially fibroblasts, macrophages and
lymphocytes. It also promotes angiogenesis and synthesis of collagen [21–24]. Specifically, the use
of low-level laser therapy (LLLT) for wound healing, nerve injury repair, as well as the reduction of
inflammation and pain, was tested shortly after the invention of lasers [25]. Photobiomodulation using
laser technology is often referred to as LLLT because the energy delivered to the tissue is much lower
than for other laser treatments and it does not produce heating of tissue [25]. In this context, Pinheiro
et al. [23] demonstrated that bone irradiated with low-level lasers showed increased osteoblastic and
collagen proliferation, as well as new bone formation in comparison with non-irradiated groups. Bone
cell and tissue sensitivity to laser irradiation were also reviewed by Barber at al. [26], concluding
that laser properties must be carefully chosen to obtain the desired effects. Initially, several in vitro
studies were performed with laser radiation on bone cells in culture; different wavelengths were
used (690, 830, and 632 nm), with different protocols regarding the duration, the frequency and the
dose of radiation [27–30]. Nevertheless, they all concluded that laser therapy increases the number of
more differentiated osteoblastic cells [27,31]. It stimulates cell proliferation, bone nodule formation,
followed by osteogenic markers: alkaline phosphatase (ALP) gene expression [28], osteopontin, and
bone sialoprotein [23,29]. Another similar study concluded that after 96 h the cell proliferation was
obvious, together with higher levels of transforming growth factor-B1, and osteocalcin, whilst ALP
levels were not significantly different between different study groups [30]. The same aspects have
IV
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 3 of 17
been investigated throughout many in vivo studies, using different animal models, wavelengths, and
irradiation protocols. Most of these studies presented improvements during the early stages of the
healing period [32], with significant differences in the calcium hydroxyapatite concentration, as well as
in the quantity of newly formed bone and of collagen fibers [33]. Other studies [34] observed increased
mineralization in the laser-treated groups and increased levels of calcium, phosphorus, and proteins in
comparison to the untreated groups [30].
As the effect of photobiomodulation on empty defects has been well documented in the literature,
our interest was focused on the biological interaction between photobiomodulation and the guided
bone regeneration technique. In this respect, the Brazilian research group of Pinheiro investigated
protocols for improving the bone repair process using photobiomodulation. They used an infrared
laser (wavelength 830 nm) on bone defects of rats and rabbits, which were treated following different
protocols and using different biomaterials. One of their studies [35] reported an increased amount of
newly formed bone after laser usage in rats’ bone defects. Another study revealed that in the early stages
of the healing period, differences in bone organization and vascularization were detectable, but after
45 days the differences between the irradiated and the non-irradiated groups became insignificant [36].
Later studies of the same research group [37] investigated the concentration of calcium hydroxyapatite
(CHA) around dental implants placed in rabbits’ tibia and concluded that LLLT improved the bone
healing, increasing the CHA concentration. However, photobiomodulation in combination with guided
bone regeneration needs further study, because of different responses from the hosting tissues.
Thus, the aim of this demonstrative study was to test the effectiveness of an innovative protocol
to evaluate the effect of photobiomodulation on bone regeneration process, using rat calvarial defects
filled with xenograft, covered with collagen membrane, and then exposed to laser irradiation. The
analysis was performed by cross-linking the information obtained by histology and high-resolution
synchrotron-based tomography (micro-CT) on the same samples. Comparisons with both the negative
control (NC) group (having a bone defect which was left for spontaneous healing), and positive control
(PC) group (in which the bone defects were filled with xenografts and collage membrane, without
receiving any laser treatment) were made.
2. Results
2.1. Synchrotron Radiation-Based Micro-Tomography

Micro-CT images of repaired sites in retrieved samples are shown in Figure 1. All tissues, except for
mineralized bone and residual biomaterials, have been made virtually transparent. Three-dimensional
reconstructions of representative samples are shown in Figure 1a–c, Figure 1g–i, and Figure 1m–o, for
biopsies harvested 14, 21, and 30 days after surgery, respectively. Moreover, representative transversal
sections are respectively reported in Figure 1d–f, Figure 1j–l, and Figure 1p–r, for the same groups
of study.
Two aspects are evident in the 3D reconstructions of the represented samples: first, the
newly-formed bone (tissue represented in red in Figure 1a–c,g–i,m–o) mainly forms on the borders
and not in the center of the defect, and this occurs not only in the NC group, but also in the PC and
+LLLT groups (i.e., where the xenograft is present); secondly, with the exception of the +LLLT group,
an increase in the volume of newly-formed bone is evident in the period between the 14th and the 21st
day after surgery. Moreover, even if the massive presence of the biomaterial prevents a fully reliable
evaluation of the observation, it appears that after 14 days from surgery, the thickness of newly-formed
bone on the defect borders is higher in the +LLLT group than in the PC group, as indicated with yellow
arrows in Figure 1b,c. This event is not as evident for longer amounts of time.
However, from the simple 3D reconstructions and from the representative transversal sections of
the repaired defects, volume mismatches in terms of amount of bone under remodeling could not be
fully assessed; thus, we proceeded to a volumetric quantitative analysis.
V
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 4 of 17
Figure 1. Micro-CT images of repaired sites in representative retrieved samples. (a–f) Group I: samples
harvested after 14 days: (a–c) 3D reconstructions: (a) negative control (NC); (b) positive control (PC);
(c) treated with low-level laser therapy (LLLT); (d–f) transversal sections of the defect: (d) NC; (e) PC;
(f) treated with LLLT. (g–l) Group II: samples harvested after 21 days: (g–i) 3D reconstructions: (g) NC;
(h) PC; (i) treated with LLLT; (j–l) transversal sections of the defect: (j) NC; (k) PC; (l) treated with
LLLT. (m–r) Group III: samples harvested after 30 days: (m–o) 3D reconstructions: (m) NC; (n) PC
control; (o) treated with LLLT; (p–r) transversal sections of the defect: (p) NC; (q) PC; (r) treated with
LLLT. In 3D reconstructions grey tissue is mature bone; red tissue is bone under remodeling; white
tissue is xenograft biomaterial; yellow arrows point to newly formed bone on defect border. In the
transversal sections of the defect: white tissue is xenograft biomaterial; colors represent mineralization
of the bone proportional to the color map in the bottom. Color map: blue stands for low mass density;
red stands for high mass density.
Indeed, the first step of the study was focused on the investigation of bone microarchitecture
and on the evaluation of volume percentages (vol.%) of the different mineralized phases (bone under
VI
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 5 of 17
remodeling, mature bone, and xenograft biomaterial) with respect to the overall mineralized volume.
In each harvested sample, a sub-volume fully circumscribing the defect hole was selected, producing
the morphometric data reported in Figure 2. As shown in Figure 2a–c, the volume percentages of
bone under remodeling with respect to the amount of mature bone increased in time. This trend was
observed in all groups except for the laser treated one (+LLLT), where the amount of bone under
remodeling was found to be already quite high after 14 days from the surgery.
Figure 2. Quantitative morphometric analysis. (a–c) Mean volume percentages (vol.%) of the different
mineralized phases (bone under remodeling, mature bone, and xenograft biomaterial) with respect
to the overall mineralized volume: (a) NC group; (b) PC group; (c) +LLLT group. (d–f) Quantitative
volumetric analysis of bone under remodeling portion, after (d) 14 days, (e) 21 days, and (f) 30 days
from the surgery. Error bars are indicated.
As observed considering the red phase in the 3D reconstructions of Figure 1a,g,m and based on
the quantification reported in Figure 2, samples of the NC group present higher percentages of bone
under remodeling than in the other groups, except at the shortest time-point, i.e., 14 days after surgery,
when the amount of bone under remodeling was increased by using LLLT by 50% with respect to
the NC group and by 45% with respect to the PC group. Moreover, as reported in Figure 2 as well,
for more than 14 days from surgery the amount of bone under remodeling was increased by using
LLLT by only 10% in comparison to the PC group. One can see, in this respect, an almost unnoticeable
increase in the 3D reconstructions of Figure 1.
The second step of study was focused on the investigation of the relative bone mineral density
distribution (MDDr ), i.e., on the evaluation of the calcium concentration and distribution (weight%) in
the different groups of study. Thus, the same sub-volumes previously investigated for the calculation of
volume percentages were also investigated for the MDDr mapping. The concept and results referring
to the complete set of indices, derived from the profile fitting, are shown in Figure 3. A sector of the
grey-level histogram for a sampling biopsy is shown in Figure 3 Panel a, with the peak on the left
referring to the mineralized bone and the peak on the right referring to the xenograft filling the defect.
This study was carried out using the Roschger approach [38], which was focused on the mineralized
bone portion. The parameters investigated are indicated in Figure 3b. The results, derived from the
profile fitting, are listed in Figure 3c. In the NC and PC groups, the peak and the mean values followed
a similar trend, which decreases over time. This was not the case for the +LLLT group, where a specific
trend was not present. The opposite behavior was detected when considering the FWHM values—a
specific trend in time was not present in the NC and PC groups, but in the +LLLT group, where there
was a clear decreasing trend over time, with special reference from 14 to 21 days after surgery. Finally,
VII
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 6 of 17
the high value decreased over time in all the groups. Interestingly, after 14 days, the opposite trend
was detected considering the FWHM values, while the peak, the mean and the low values were at their
maximum in the NC group and minimum in the +LLLT group.
Figure 3. Study of the relative mass density distribution (MDDr ). (a) Portion of the histogram of a
sampling biopsy: the peak on the left refers to the overall mineralized bone, the peak on the right refers
to the biomaterial (xenograft) used to fill the defect; (b) study of the mineralized bone: the parameters
investigated with the Roschger approach [38] are indicated. The threshold of p = 0.005 has been selected,
as a good compromise to maintain a good sensitivity and minimize at the same time potential artifacts
due to partial volume effects in the evaluation of MDDr low ; (c) parameters that derive from the profile
fitting are indicated.
2.2. Histology
The histological examination, as shown in Figure 4, revealed interesting evidence, with different
aspects for groups NC, PC, and +LLLT, depending on the period of healing.
On the examined fragments harvested on Day 14, extensive areas of necrosis and hematic
extravasation were identified in the group left for spontaneous healing (NC group, Figure 4a). The
other two groups (PC and +LLLT, Figure 4b,c, respectively) showed homogeneous eosinophilic
material, a “foreign body” with focal granuloma formation. The +LLLT group fragments revealed
well-represented fibrous (young) connective tissue and low inflammatory infiltration compared to the
rest of the groups.
Fragments harvested at 21 days after surgery showed a reduction in inflammatory infiltration and
foreign body granulomas (Figure 4d–f). These were predominantly located at the periphery, with the
fibrous connective tissue embracing eosinophilic material. The NC group revealed fibrotic connective
tissue that included optically opaque areas and heavier inflammatory infiltrates (Figure 4d). The
+LLLT group showed bone tissue formation, with areas rich in osteoblasts (Figure 4f).
VIII
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 7 of 17
After 30 days of healing, fibrous connective tissue was shown to incorporate homogeneous
eosinophilic material and newly formed bone lamellas (Figure 4g–i), the osteoblasts were found in
large numbers around the bone lamellae, and the inflammatory process was present, as highlighted by
giant multinuclear cells.
Figure 4. Histologic analysis. (a–c) Samples after 14 days of healing: (a) group NC, (b) group PC,
and (c) group +LLLT. (d–f) Samples after 21 days of healing: (d) NC group, (e) PC group, and (f)
+LLLT group. (g–i) Samples after 30 days of healing: (g) NC group, (h) PC group, and (i) +LLLT
group. N-necrosis; EM-eosinophilic material; CT-connective tissue; G-granulomas; Ob-osteoblasts. HE
staining, original magnification: 10×.
3. Discussion
Despite the increasing success of the use of photobiomodulation in different areas, there are
relatively few reports on their effect on bone repair that are evidence-based. However, due to the
positive effects on bone metabolism, the use of photobiomodulation has been encouraged in clinical
practice [39]. Renno et al. [40] and Stein et al. [29] showed a significant increase in the proliferation of
osteoblasts after laser energy irradiation using an 830 nm diode generating 20 J/cm2 . In addition, the
laser radiation appears to accelerate the process of fracture repair and produce an increase in the volume
of the callus formed and an increase in bone mineral density. Effects related to photobiomodulation
include increased vascularization, increased osteoblastic activity, organization of collagen fibers, and
changes in the mitochondrial and intracellular levels of adenosine triphosphate.
In this context, numerous studies have been also conducted in animal models on the osteogenic
properties of different biomaterials, with different outcomes [41–45]. However, photobiomodulation
effects, in combination with biomaterials in bone defect repair processes, require further study, as
different responses from the host have been found. Most research has been based on animal studies,
the most investigated type of animal being the rat, mainly in the tibia bone [46–48].
IX
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 8 of 17
In the present study, as well as in a previous one [49], we evaluated the effect of photobiomodulation
on bone regeneration process, using rat calvarial defects filled with xenograft, previously coated with
collagen membrane and then exposed to laser irradiation.
In vitro studies such as those conducted by Soleimani [50] and Saygun [51] showed proliferation,
stimulation and differentiation of human mesenchymal stem cells into osteoblastic cells in the lased
groups. In the first case, a dose of 4 J/cm2 (810 nm) was delivered, while in the second study the dose
was halved to 2 J/cm2 (685 nm). The effects were also confirmed by Dortbudak [27].
Because bone has limited biological variations to react to stimuli, results may be false or
over-interpreted. For example, fibrosis and bone resorption can be the result of biomechanical instability
as well as missing osteoconductive properties of a scaffold material. They may also be produced by a
rapid material degradation, while biocompatibility is still preserved. Therefore, a step-wise approach
is preferred to answer questions of biocompatibility/suitability of a novel biomaterial. Biocompatibility
issues should be clarified using a biomechanically unchallenged situation [52], whereas the suitability of
a material can be tested in a mechanically challenged defect, modeling long bones after biocompatibility
has already been assessed in previous experiments. For both, the cellular reaction (e.g., the presence
of inflammatory mono- and poly-nuclear cells) as well as the new bone formation at the surface and
within the material are important along with the resorption of the material itself [53]. Reduction of
inflammation due to photobiomodulation is one of the most well-accepted effects of light therapy [54],
its mechanism being evidenced by a decrease in chemical inflammatory mediators, (prostaglandin E2,
leucocytes, tumor necrosis factor TNFα). Photobiomodulation can exert both an anti-inflammatory
effect and a pro-inflammatory one, increasing mRNA expression and the protein concentration of
anti-inflammatory mediators (IL-10, HSP72), similar to anti-inflammatory steroids [55]. An apparent
contradiction has been highlighted between the pro-inflammatory effect of photobiomodulation in
in vitro studies and the anti-inflammatory effect found in most of the clinical studies [56].
In our case, the positive effects of photobiomodulation therapy in the initial stages of the bone
defect healing were also evidenced by histological examination, which revealed significant differences
regarding the presence of inflammatory infiltrate in different study groups: at 14 days, the small
amount of inflammatory infiltrate in +LLLT group permits the organization of the young connective
tissue, which acts as a precursor of the newly formed bone tissue. When analyzing the 21 days healing
period, the reduction of the inflammatory process is more obvious in PC and +LLLT groups. At the
same time, as the formation of bone tissue occurs, the +LLLT group shows areas rich in osteoblasts. As
the healing period increases, the differences between the analyzed groups in terms of inflammation are
reduced, but giant multinuclear cells can still be detected. As a conclusion, it seems that the maximum
effects of photobiomodulation appear in the early stages of the bone injury, when a smaller amount of
inflammatory infiltrate is associated with increased bone formation.
Our present demonstrative study also showed that photobiomodulation healed the defect better
than when only the support of the biomaterial was present. This effect was clearly observed for
short-term treatments, i.e., 14 days after the surgery. For longer periods of treatment, the newly formed
bone volumes became comparable in grafted defects, with or without laser treatment. Indeed, as
shown in Figure 2d–f, the amount of bone under remodeling in defects healed with the xenograft
support sensibly increased in volume percentages after the photobiomodulation only in the 14 days
group, therefore not for longer periods of time. The presence of higher quantities of bone volume
under remodeling in the +LLLT group indicated higher quantities of bone formation, as already
seen in previous in vitro studies. Nicolau et al. [57] and Freitas [46] thus showed higher bone cell
activity when irradiating rat femur and tibiae defects with 660 and 633 nm lasers. Khadra irradiated
calvarial defects with an 830 nm laser and found increased soft and bone tissue in the study group [58].
Weber showed that the healing of autologous bone graft in bone defects was improved through
photobiomodulation [59].
Moreover, as demonstrated using the relative mass density distribution (MDDr ) analysis, after
14 days from surgery the peak, the mean and the low values were at their minimum in the +LLLT group
X
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 9 of 17
and maximum in the NC group, while the opposite trend was observed for the FWHM values. These
data, collectively considered, indicate a wider distribution of mass density after the laser treatment,
with a preeminent presence of areas with low mineralization, i.e., with a majority of newly formed
bone clusters.
For longer time-points than 14 days (i.e., 21 and 30 days from surgery), when compared with the NC
samples (in which the cavities were left empty for spontaneous healing), defects filled with xenografts,
i.e., both the PC and the +LLLT samples, presented lower or similar volume percentages of bone under
remodeling (i.e., less newly formed bone). This evidence was observed in Figure 1a–c,g–i,m–o, as
well as in Figure 2a–c. This was also confirmed by previous studies [41,42]. For example, Takauti [31]
studied the bone regeneration process in rat calvariae, with defects filled with three different types
of biomaterials: two xenografts (deproteinized bovine bone) and one allograft (biphasic calcium
phosphate). After eight weeks of healing, they found a greater amount of newly formed bone when
using alloplastic materials, while cavities filled with deproteinized bovine bone presented higher
amounts of residual graft, probably due to its slow resorption. When compared with control cavities,
which were left empty for spontaneous healing, they concluded that defects filled only with blood clot
presented more newly formed bone than cavities filled with xenograft, and a similar amount to the
defects filled with alloplastic material. Their results were also confirmed by Rokn [42].
The evidence that defects left for spontaneous healing presented already after three weeks of
healing (21 days group) more newly-formed bone than cavities filled with xenograft could most likely
be caused by a certain delay of the healing process in the presence of biomaterials. We observed this
delay in several of our previous studies; specifically, we observed that regenerative kinetics in in vitro
cultures on different biomaterials showed that the bioresorption of the scaffold is more accentuated up
to the second week of culture, while bone regeneration is delayed in time, most likely because cells
growing onto the scaffold took longer time to adhere and then to begin proliferating [60–62].
Moreover, in the present study, the biomaterial may have exerted a shielding action in respect to
photobiomodulation effects on cells, inhibiting the same regenerative action of the laser treatment,
as shown in Figure 5. In the study carried out by Rokn [42], the 3D analysis based on cone-beam
tomography showed no filling in the center of the spontaneously healed cavities, revealing that newly
formed bone was concentrated only at the edges of the defect. Therefore, it becomes important to favor
osteo-conduction and the migration of cells from the defect border, using as filler a biomaterial that
adheres to the defect walls without carrying out any barrier and shielding action to cell migration or to
the possible regenerating action of laser treatments.
Figure 5. Micro-CT images of repaired sites in representative retrieved sample, evaluated at 30 days
postoperatively. The borders of the defect have not been covered with bovine bone graft, thus being
directly exposed to laser radiation. A great amount of newly-formed bone can be observed at the
periphery of the defect, as indicated with yellow arrows. (A): 3D reconstruction; (B): transversal section.
Grey tissue is mature bone; red tissue is bone under remodeling; white tissue is xenograft biomaterial.
However, in our study, the quantitative volumetric analysis of bone under remodeling at the three
time-points (14, 21 and 30 days from surgery) showed better healing when photobiomodulation was
applied on the grafted defect than in cases where the grafted defect did not receive laser treatment.
XI
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 10 of 17
This effect was particularly evident for the shortest considered period of time, i.e., 14 days after surgery.
Thus, these observations obtained using our innovative protocol of analysis highlight the positive
effects of laser therapy on bone regeneration process, which increase the quantity of newly formed
bone. It also suggests possible interactions with the grafting materials that could influence our future
experimental follow-ups.
In the present study, we selected 14, 21, and 30 days from surgery as time-points for the analysis.
The rationale behind this choice was motivated by the fact that, when establishing follow-up periods
of bone regeneration in rat calvarial defects, the metabolic rate of the Wistar rat must be considered:
the smaller the animal, the higher the metabolic rate compared to that of a human: 30 days of a man’s
life correspond to one day of rat’s life [63]. This means that shorter observation periods to obtain
data sampling are usually required when small animals are used instead of larger ones, because they
heal faster. Long periods of observation would potentially demonstrate that both test and control
groups reach an advanced/complete healing of the defect, failing to disclose the beneficial potential of
a biomaterial [64,65].
Therefore, considering the short-term laser treatment benefits shown in the present study, we plan
to proceed in future experiments by stopping the +LLLT after 14 days and allowing the regeneration to
occur beyond this period in the absence of +LLLT, checking the results with our experimental protocol.
Moreover, another experimental follow-up will be based on additional +LLLT doses at periods of time
shorter than 14 days, examining bone regeneration beyond this period.
4. Materials and Methods
4.1. Animal Model and Groups of Study

The experimental protocol was approved by the Ethics Committee of the “Victor Babes” University
of Medicine and Pharmacy of Timisoara (No. 129 of the 8th December 2016). The study, in order to
minimize the number of sacrifices, included 24 Wistar rats with an average weight of 287 g (range
247–312 g), which were randomly divided into 3 study groups: (1) the negative control (NC) group,
having a bone defect which was left for spontaneous healing; (2) the positive control (PC) group, in
which the bone defects were filled with xenografts and collage membrane, without receiving any laser
treatment; and (3) the test (+LLLT) group, with bone defects filled with xenografts, with collagen
membrane and receiving low level laser irradiation every 48 h. The Animal Facility of the “Victor
Babes” University of Medicine and Pharmacy of Timisoara provided and housed all the animals in a
temperature-controlled environment. The rats received water and standard laboratory animal chow
ad libitum. A 12 h light–dark cycle was maintained throughout the experimental protocol.
4.2. Surgical Procedure

In the first session, the animals were anesthetized (5% Isofluran and O2 at 1 L/min, for induction
in the anesthesia chamber, and after that, a facemask of 1% Isofluran and O2 at 1 L/min was delivered),
the region around the scalp was shaved and antisepticised with betadine in order to perform the
surgical procedure. This consisted of creating a calvarial circular defect of 5 mm in diameter, using a
trephine bur and continuous irrigation with saline solution. To obtain the precise position of the defect
related to skin landmarks, a surgical plastic guide was used. After the defect was created, each animal
was treated corresponding to the study group to which it was assigned. The animals from the NC
group were sutured and received no other treatment, to be able to observe the spontaneous healing of
the bone defect. The animals from the PC and +LLLT groups received bovine bone graft (NuOss®
natural cancellous and cortical bone matrix, ACE Surgical Supply, USA) into the defect and collagen
membrane (ACE RCM6® Resorbable Collagen Membrane, ACE Surgical Supply, USA) covering the
defect, thus ensuring the proper conditions for guided bone regeneration to take place. All animals
were sutured in a two layers manner and were kept postoperatively in the same conditions: 22 ± 5 ◦ C
temperature and at a 50% ± 5 humidity, following an antibiotic prophylaxis treatment (Cefazolin
XII
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 11 of 17
15mg/kg + Gentamicin 1.5 mg/kg) and daily clinical examination with evaluation of the general clinical
status (heart rate, respiratory rate, body temperature, wound appearance and healing of the incision,
posture and locomotion).
4.3. Photobiomodulation Protocol

Photobiomodulation using laser irradiation was performed every 48 h to animals from the +LLLT
group, with a gallium-aluminum–arsenide laser (GaAlAs) (IRRADIA Mid-Laser® , Stockholm, Sweden,
center wavelength of 808 nm, optical power of 450 mW). Laser irradiation was applied in four peripheral
opposite points and in one central point of the defect, with the help of the surgical guide, with a
frequency of 3800 Hz, 450 mW, 17 s per point, 18.9 J per treatment session. The photobiomodulation
parameters are provided in Table 1.
Table 1. Photobiomodulation parameters in the experimental protocol.
Manufacturer IRRADIA Mid-Laser® Stockholm, Sweden

Model Identifier MID-laser; Serial no 8110131-4
Year Produced 2007
Number and type of emitters Gallium-Aluminum–Arsenide laser (GaAlAs) laser
Wavelength and bandwidth 808 nm
Pulse mode CW
Beam spot size at target 1 cm2
Irradiance at target 450 mW/cm2
If pulsed peak irradiance 450 mW/cm2
Exposure duration 17 s per point, 85 s per session
Radiant exposure 24.075 J/cm2
Radiant energy 18.9 J
Number of points irradiated 5
Area irradiated 1 cm2
Photobiomodulation was applied to the skin covering the
surgical defect in four peripheral opposite points and in
Application technique
one central point of the defect (the size of the defect was
5 mm in diameter), using a plastic surgical guide
Surgery day and every 48 h after the surgery, for 14 days,
Number and frequency of treatment sessions
21 days, and 30 days respectively
151.2 J for the 14 days group; 226.8 J for the 21 days
Total radiant energy over entire treatment course
group; 302.4 J for the 30 days group
4.4. Samples Collection

The results of the study were assessed by harvesting bone samples from the animals at three
different time points: after 14 days, 21 days, and 30 days from the surgery, in order to evaluate
the regeneration process versus time. The specimens were all standardized at the 1 × 0.6 × 0.2 cm3
dimensions and were fixed in no less than 9 times their own volume of 10% formalin. After harvesting the
samples, the rats were euthanized using a Thiopental overdose. All samples were kept in formalin and
then investigated with high-resolution X-ray tomographic (micro-CT) and histological examinations.
In order to obtain objective results, the samples were randomly numbered with the aim to be
identified only by the scientists involved in the analyses of the results. Although it was obvious which
were the negative control samples (empty defects), the healing period was unknown. For the rest
of the samples, the aspect was similar, all containing grafting material and the numbering did not
XIII
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 12 of 17
permit the assessors to know neither if the sample received photobiomodulation treatment, nor the
healing period.
4.5. Synchrotron Radiation-Based Micro-Tomography

X-ray microtomography (micro-CT) of the samples was performed at the SYRMEP beamline of
the ELETTRA synchrotron facility (Basovizza (TS), Italy). The samples were investigated using the
following settings: isometric voxels with an edge size of 9 µm; exposure time of 1 s/projection; and
X-ray beam energy of 19 keV. The sample–detector distance was set to 300 mm, enabling us to measure
the phase-contrast signal. The phase-contrast configuration differs from conventional tomographic
imaging that is based solely on attenuation contrast. Indeed, the refraction of the X-ray beam passing
through each tissue is described by the refractive index, n(r) = 1 − δ(r) + iβ(r), where δ is the refractive
index decrement and β is the attenuation index. As δ is sensibly larger than β, the phase-contrast
approach is much more sensitive than the absorption approach. The refractive index decrement δ is
proportional to the mean electron density, which in turn is nearly proportional to the mass density ρ
(expressed as mg/cm3 ).
In some cases, specifically in weakly absorbing samples or in samples consisting predominantly
of a single phase, the real and imaginary parts of the refractive index are proportional to each other,
i.e., δ(r) = ε·β(r), where ε does not depend on the spatial coordinates [61,62]. As our samples consisted
mainly of mineralized bone, i.e., a single phase with a spatially varying density, and considering the
sample-detector distance in the near field regime [66], the previous approximation is valid, and the δ/β
ratio has been set to 200. The complete tomographic reconstruction was performed using the SYRMEP
Tomo Project (STP) open source software [67].
Afterwards, the VG Studio MAX 1.2 software (Volume Graphics, Heidelberg, Germany) was
used to generate 3D images, where grey levels were proportional to the mass density ρ. The Scatter
HQ algorithm with an oversampling factor of 5.0 was used to image the 2D sections and the 3D
reconstructions. Different peaks in the gray level scale represent different phases within the samples;
the volume of each phase was obtained by multiplying the volume of a voxel (~730 µm3 ) by the
number of voxels underlying the peak associated with the relevant phase. A manually set threshold
was applied to the histograms to separate the bone under remodeling from the mature bone, and the
mature bone from the scaffold phase. The thresholds were set to 108 and 147, respectively.
A morphometric analysis was performed to evaluate the volume percentages (vol.%) of the
following phases with respect to the overall mineralized volume: bone under remodeling, mature
bone, and scaffold.
Moreover, the refractive index n signal, linearly proportional to the mass density, was exploited to
compute the relative bone mass density distribution (MDDr ) of each sample. As we recently proceeded
in other studies [68], the MDDr parameters were calculated with strict reference to the mineralized
bone portion of the histograms, with the intensities normalized, for each sample, by the area under the
curve. The absolute values of bone mass density (calcium concentrations – weight%) could not be
retrieved: in fact, n might be biased due to the constant ratio δ/β used in the Paganin phase retrieval [69].
However, as the samples were comparable in terms of size and composition, the relative differences
in mass density distribution between them could be evaluated. Thus, the superscript r was used to
indicate relative values for all bone mass density distribution parameters. Based on the Roschger
approach [38], the following parameters were extracted: MDDr mean (mean relative mass density),
MDDr peak (most frequent relative mass density), MDDrlow (0.5th percentile) and MDDr high (99.5th
percentile), and MDDr fwhm (full width at half maxima of the distribution). We arbitrarily selected the
threshold of P = 0.005 as a good compromise between maintaining a good sensitivity for low and high
values in the MDDr and reducing possible artifacts originating from the partial volume effect (when
evaluating the MDDr low ). This post-processing calculation of the MDDr parameters was done using
the PeakFit software (Systat Software, San Jose, CA, USA).
XIV
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 13 of 17
4.6. Histology
The tissues obtained were fixed in 10% formalin solution, followed by a moderate descaling agent.
The paraffin blocks resulting from the processing were used to make additional sections (thickness of
4 µm, Thermo Scientific™ HM 355S Automatic Microtome, Waltham, MA 02451 USA ) that were stained
with hematoxylin and eosin (HE) and were further on examined under a Leica DM750 microscope
(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).
5. Conclusions
We demonstrated that photobiomodulation therapy is effective in short periods; laser doses
administrated to the defects beyond 2 weeks after surgery appeared to be not very effective. A possible
shielding action of the xenograft on the laser action on cells was hypothesized and will be verified
through future studies. This effect may be combined with a bone regeneration delay in the presence of
biomaterials, as already documented in previous studies. Thus, in support of this hypothesis, several
authors suggested the same conclusions [33,70], finding that the positive effects of photobiomodulation
on bone healing are more obvious when applied intraoperatively, directly to the bone defect, prior to
the grafting procedure [33].
In our demonstrative study, micro-CT allowed us to achieve new and relevant information,
although a limited number of rats was included in the study. This sample size would have most
likely not been sufficient in other experimental protocols, exclusively based on histology. The power
of our protocol lies in the 3D nature of micro-CT analysis, based on the stacking of 1000 successive
2D sections (each with a thickness of about 9 µm), mapping the entire sample. This is of paramount
importance, allowing us to minimize the number of rat sacrifices, in full respect to ethical international
rules. Our previous studies, using the same method of evaluation, also showed the capacity of
micro-CT technique to play a fundamental role in the advanced characterization of laser-treated
sites [71]. Another technique which can be successful for such a research strategy is optical coherence
tomography (OCT) [49,72–74]: its advantage is that it can be applied for in vivo assessments, using
handheld scanning probes in the oral cavity [75,76]. Moreover, good agreement between OCT and
micro-CT analyses was found in our previous studies [77].
In general, the interaction between laser radiation and different types of tissues remains a major
concern when establishing clinical protocols. Although numerous studies have been conducted on the
effects of photobiomodulation, their comparison is difficult because of the different biomaterials, the
variations in laser energy, dose, and duration.
Author Contributions: Conceptualization, R.E.L., A.G. and C.D.T.; Data curation, R.E.L. and A.G.; Formal
analysis, R.E.L. and A.G.; Funding acquisition, V.-F.D. and C.D.T.; Investigation, R.E.L., A.G., A.M., R.H. and
G.D.C.; Methodology, R.E.L., A.G. and C.D.T.; Resources, R.E.L., R.H. and B.H.; Supervision, V.-F.D. and C.D.T.;
Writing – original draft, R.E.L., A.G., B.H. and G.D.C.; Writing – review and editing, R.E.L., A.G., A.M., R.H., B.H.,
G.D.C.,V.-F.D. and C.D.T. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.
Funding: The experiments No. 20155147 were funded by the Program “Support to the Italian Users of ELETTRA”.
V-F. Duma acknowledges the support of the Romanian National Authority for Scientific Research, through
CNDI–UEFISCDI project PN-III-P2-2.1-PTE-2016-0181. No other sources of study funding were used.
Acknowledgments: Authors thank the ELETTRA Synchrotron Facility for allocated beamtime at the SYRMEP
beamline and Giuliana Tromba for technical support during the experiments.
Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest.
Abbreviations
LLLT Low level laser therapy
3D Three-dimensional
MDDr Relative bone mineral density distribution
Micro-CT Microtomography
XV
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 14 of 17
References
1. Paknejad, M.; Rokn, A.; Rouzmeh, N.; Heidari, M.; Titidej, A.; Kharazifard, M.J.; Mehrfard, A. Histologic
evaluation of bone healing capacity following application of inorganic bovine bone and a new allograft
material in rabbit calvaria. J. Dent. (Tehran) 2015, 12, 31–38.
2. Clokie, C.M.; Moghadam, H.; Jackson, M.T.; Sandor, G.K. Closure of critical sized defects with allogenic and
alloplastic bone substitutes. J. Craniofac. Surg. 2002, 13, 111–121, discussion 122–123. [CrossRef] [PubMed]
3. Barboza, E.P.; Duarte, M.E.; Geolas, L.; Sorensen, R.G.; Riedel, G.E.; Wikesjo, U.M. Ridge augmentation
following implantation of recombinant human bone morphogenetic protein-2 in the dog. J. Periodontol. 2000,
71, 488–496. [CrossRef]
4. Wang, W.; Yeung, K.W.K. Bone grafts and biomaterials substitutes for bone defect repair: A review. Bioact.
Mater. 2017, 2, 224–247. [CrossRef] [PubMed]
5. Yamada, M.; Egusa, H. Current bone substitutes for implant dentistry. J. Prosthodont. Res. 2018, 62, 152–161.
[CrossRef]
6. Aghaloo, T.L.; Moy, P.K. Which hard tissue augmentation techniques are the most successful in furnishing
bony support for implant placement? Int. J. Oral. Maxillofac. Implant. 2007, 22, 49–70.
7. Rakhmatia, Y.D.; Ayukawa, Y.; Furuhashi, A.; Koyano, K. Current barrier membranes: Titanium mesh and
other membranes for guided bone regeneration in dental applications. J. Prosthodont. Res. 2013, 57, 3–14.
[CrossRef]
8. Simion, M.; Trisi, P.; Piattelli, A. Vertical ridge augmentation using a membrane technique associated with
osseointegrated implants. Int. J. Periodontics. Restor. Dent. 1994, 14, 496–511.
9. Tinti, C.; Parma-Benfenati, S.; Polizzi, G. Vertical ridge augmentation: What is the limit? Int. J. Periodontics.
Restor. Dent. 1996, 16, 220–229.
10. Simion, M.; Jovanovic, S.A.; Trisi, P.; Scarano, A.; Piattelli, A. Vertical ridge augmentation around dental
implants using a membrane technique and autogenous bone or allografts in humans. Int. J. Periodontics.
Restor. Dent. 1998, 18, 8–23.
11. Buser, D.; Bragger, U.; Lang, N.P.; Nyman, S. Regeneration and enlargement of jaw bone using guided tissue
regeneration. Clin. Oral. Implant. Res. 1990, 1, 22–32. [CrossRef] [PubMed]
12. Buser, D.; Dula, K.; Hirt, H.P.; Schenk, R.K. Lateral ridge augmentation using autografts and barrier
membranes: A clinical study with 40 partially edentulous patients. J. Oral. Maxillofac. Surg. 1996, 54, 420–432.
[CrossRef]
13. Funato, A.; Ishikawa, T.; Kitajima, H.; Yamada, M.; Moroi, H. A novel combined surgical approach to vertical
alveolar ridge augmentation with titanium mesh, resorbable membrane, and rhPDGF-BB: A retrospective
consecutive case series. Int. J. Periodontics. Restor. Dent. 2013, 33, 437–445. [CrossRef] [PubMed]
14. Jo, S.H.; Kim, Y.K.; Choi, Y.H. Histological Evaluation of the Healing Process of Various Bone Graft Materials
after Engraftment into the Human Body. Materials 2018, 11, 714. [CrossRef]
15. Iezzi, G.; Piattelli, A.; Giuliani, A.; Mangano, C.; Barone, A.; Manzon, L.; Degidi, M.; Scarano, A.; Filippone, A.;
Perrotti, V. Molecular, Cellular and Pharmaceutical Aspects of Bone Grafting Materials and Membranes
During Maxillary Sinus-lift Procedures. Part 2: Detailed Characteristics of the Materials. Curr. Pharm.
Biotechnol. 2017, 18, 33–44. [CrossRef]
16. Behnia, H.; Khoshzaban, A.; Zarinfar, M.; Mashhadi Abbas, F.; Bahraminasab, H.; Khojasteh, A. Histological
Evaluation of regeneration in rabbit calvarial bone defects using demineralized bone matrix, mesenchymal
stem cells and platelet rich in growth factors. J. Dent. Sch. 2012, 30, 143–154.
17. Schroeder, J.E.; Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: Concepts and evidence. Injury
2011, 42, 609–613. [CrossRef]
18. Lysiak-Drwal, K.; Dominiak, M.; Solski, L.; Zywicka, B.; Pielka, S.; Konopka, T.; Gerber, H. Early histological
evaluation of bone defect healing with and without guided bone regeneration techniques: Experimental
animal studies. Postepy. Hig. Med. Dosw. 2008, 62, 282–288.
19. Hitti, R.A.; Kerns, D.G. Guided Bone Regeneration in the Oral Cavity: A Review. Open Pathol. J. 2011, 511,
33–45. [CrossRef]
20. Urist, M.R.; McLean, F.C. Recent advances in physiology of bone. I. J. Bone Jt. Surg. Am. 1963, 45, 1305–1313.
[CrossRef]
XVI
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 15 of 17
21. Deniz, E.; Arslan, A.; Diker, N.; Olgac, V.; Kilic, E. Evaluation of light-emitting diode photobiomodulation on
bone healing of rat calvarial defects. Biotechnol. Biotechnol. Equip. 2015, 29, 1–8. [CrossRef]
22. Soares, L.G.; Marques, A.M.; Barbosa, A.F.; Santos, N.R.; Aciole, J.M.; Souza, C.M.; Pinheiro, A.L.; Silveira, L., Jr.
Raman study of the repair of surgical bone defects grafted with biphasic synthetic microgranular HA +
β-calcium triphosphate and irradiated or not with λ780 nm laser. Lasers Med. Sci. 2014, 29, 1575–1584.
[CrossRef] [PubMed]
23. Pinheiro, A.L.; Gerbi, M.E. Photoengineering of bone repair processes. Photomed. Laser Surg. 2006, 24,
169–178. [CrossRef] [PubMed]
24. Karu, T.I.; Pyatibrat, L.V.; Afanasyeva, N.I. A novel mitochondrial signaling pathway activated by
visibleto-near infrared radiation. Photochem. Photobiol. 2004, 80, 366–372. [CrossRef]
25. Ahmed, S.; Bewsh, G.; Bhat, S.; Babu, R. Low level laser therapy: Healing at the speed of light. J. Evol. Med.
Dent. Sci. 2013, 2, 7441–7463. [CrossRef]
26. Barber, A.; Luger, J.E.; Karpf, A.; Salame, K.; Shlomi, B.; Kogan, G.; Nissan, M.; Alon, M.; Rochkind, S.
Advances in Laser Therapy for Bone Repair. Laser Ther. 2001, 13, 80–85. [CrossRef]
27. Dörtbudak, O.; Haas, R.; Mallath-Pokorny, G. Biostimulation of bone marrow cells with a diode soft laser.
Clin. Oral. Implants Res. 2000, 11, 540–545. [CrossRef]
28. Ueda, Y.; Shimizu, N. Effects of pulse frequency of low-level laser therapy (LLLT) on bone nodule formation
in rat calvarial cells. J. Clin. Laser Med. Surg. 2003, 21, 271–277. [CrossRef]
29. Stein, A.; Benayahu, D.; Maltz, L.; Oron, U. Low-level laser irradiation promotes proliferation and
differentiation of human osteoblasts in vitro. Photomed. Laser Surg. 2005, 23, 161–166. [CrossRef]
30. Kandra, M.; Lyngstadaas, S.P.; Haanaes, H.R.; Mustafa, K. Effect of laser therapy on attachment, proliferation
and differentiation on human osteoblast-like cells cultured on titanium implant material. Biomaterials 2005,
26, 3503–3509.
31. Ozawa, Y.; Shimizu, N.; Mishima, H.; Yamaguchi, M.; Takiguchi, H.; Iwasawa, T.; Abiko, Y. Stimulatory
effects of low-power laser irradiation on bone formation in vitro. SPIE 1984, 1995, 281–288.
32. Guzzardella, G.A.; Fini, M.; Torricelli, P.; Giavaresi, G.; Giardino, R. Laser stimulation on bone defect healing:
An in vitro study. Lasers Med. Sci. 2002, 17, 216–220. [CrossRef] [PubMed]
33. Pinheiro, A.L.B.; Limeira Júnior, F.A.; Gerbi, M.E.M.M.; Ramalho, L.M.; Marzola, C.; Ponzi, E.A.; Soares, A.O.;
De Carvalho, L.C.; Lima, H.C.; Gonçalves, T.O. Effect of 830-nm laser light on the repair of bone defects
grafted with inorganic bovine bone and decalcified cortical oss osseous membrane. J. Clin. Laser Med. Surg.
2003, 21, 383–388. [CrossRef] [PubMed]
34. Rochkind, S.; Kogan, G.; Luger, E.G.; Salame, K.; Karp, E.; Graif, M.; Weiss, J. Molecular structure of the bony
tissue after experimental trauma to the mandibular region followed by laser therapy. Photomed. Laser Surg.
2004, 22, 249–253. [CrossRef] [PubMed]
35. Silva Júnior, A.N.; Pinheiro, A.L.B.; Oliveira, M.G.; Weismann, R.; Ramalho, L.M.; Nicolau, R.A. Computerized
morphometric assessment of the effect of low-level laser therapy on bone repair. J. Clin. Laser Med. Surg.
2002, 20, 83–87. [CrossRef]
36. Pinheiro, A.L.B.; Oliveira, M.A.M.; Martins, P.P.M. Biomodulação da cicatrização óssea pós-implantar com
o uso da laserterapia não-cirúrgica: Estudo por microscopia eletrônica de varredura. Rev. Foufba 2001, 22,
12–19.
37. Lopes, C.B.; Pinheiro, A.L.B.; Sathaiah, S.; Duarte, J.; Cristinamartins, M. Infrared laser light reduces loading
time of dental implants: A Raman sapectroscopic study. Photomed. Laser Surg. 2005, 23, 27–31. [CrossRef]
38. Roschger, P.; Paschalis, E.P.; Fratzl, P.; Klaushofer, K. Bone mineralization density distribution in health and
disease. Bone 2008, 42, 456–466. [CrossRef]
39. Oliveira, P.; Sperandio, E.; Fernandes, K.R.; Pastor, F.A.; Nonaka, K.O.; Renno, A.C. Comparison of the effects
of low-level laser therapy and low-intensity pulsed ultrasound on the process of bone repair in the rat tibia.
Rev. Bras. Fisioter. 2011, 15, 200–205. [CrossRef]
40. Renno, A.C.M.; McDonnell, P.A.; Parizotto, N.A.; Laakso, E.L. The effects of laser irradiation on osteoblast
and osteosarcoma cell proliferation and differentiation in vitro. Photomed. Laser Surg. 2007, 25, 275–280.
[CrossRef]
41. Takauti, C.A.; Futema, F.; Brito Junior, R.B.; Abrahão, A.C.; Costa, C.; Queiroz, C.S. Assessment of bone
healing in rabbit calvaria grafted with three different biomaterials. Braz. Dent. J. 2014, 25, 379–384. [CrossRef]
[PubMed]
XVII
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 16 of 17
42. Rokn, A.R.; Khodadoostan, M.A.; Ghahroudi, A.A.R.R.; Aar, R.; Motahhary, P.; Javad, M.; Fard, K.; Bruyn, D.;
Afzalifar, R.; Soolari, E.; et al. Bone formation with two types of grafting materials: A histologic and
histomorphometric study. Open Dent. J. 2011, 5, 96–104. [CrossRef] [PubMed]
43. Turri, A.; Dahlin, C. Comparative maxillary bone-defect healing by calcium-sulphate or deproteinized bovine
bone particles and extra cellular matrix membranes in a guided bone regeneration setting: An experimental
study in rabbits. Clin. Oral. Implant. Res. 2015, 26, 501–506. [CrossRef] [PubMed]
44. Carter, D.R.; Loboa, E.G.; Polefka, E.G.; Beaupre, G.S. Mechanical Influences on Skeletal Regeneration. In
Human Biomechanics and Injury Prevention; Kajzer, J., Tanaka, E., Yamada, H., Eds.; Springer: Tokyo, Japan,
2000; pp. 129–136.
45. Lakey, L.A.; Akella, R.; Ranieru, J.P. Angiogenesis: Implications for tissue repair. In Bone Engineering;
Davies, J.E., Ed.; EM Squared Incorporated: Toronto, ON, Canada, 2000; pp. 137–142.
46. Garavello-Freitas, I.; Baranauskas, V.; Joazeiro, P.P.; Padovani, C.R.; Dal Pai-Silva, M.; da Cruz-Hofling, M.A.
Low-power laser irradiation improves histomorphometrical parameters and bone matrix organization during
tibia wound healing in rats. J. Photochem. Photobiol. B. 2003, 70, 81–89. [CrossRef]
47. Campana, V.; Moya, M.; Gavotto, A.; Juri, H.; Palma, J.A. Effects of diclofenac sodium and He:Ne laser
irradiation on plasmatic fibrinogen levels in inflammatory processes. J. Clin. Laser Med. Surg. 1998, 16,
317–320. [CrossRef]
48. Hall, G.; Anneroth, G.; Schennings, T.; Zetterqvist, L.; Ryden, H. Effect of low level energy laser irradiation
on wound healing. An experimental study in rats. Swed. Dent. J. 1994, 18, 29–34.
49. Luca, R.; Todea, C.D.; Duma, V.-F.; Bradu, A.; Podoleanu, A. Quantitative assessment of rat bone regeneration
using complex master–slave optical coherence tomography. Quant. Imaging Med. Surg. 2019, 9, 782–798.
[CrossRef] [PubMed]
50. Soleimani, M.; Abbasnia, E.; Fathi, M.; Sahraei, H.; Fathi, Y.; Kaka, G. The effects of low-level laser irradiation
on differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells into neurons and
osteoblasts–an in vitro study. Lasers Med. Sci. 2012, 27, 423–430. [CrossRef]
51. Saygun, I.; Nizam, N.; Ural, A.U.; Serdar, M.A.; Avcu, F.; Tozum, T.F. Low-level laser irradiation affects the
release of basic fibroblast growth factor (bFGF), insulin-like growth factor-I (IGF-I), and receptor of IGF-I
(IGFBP3) from osteoblasts. Photomed. Laser Surg. 2012, 30, 149–154. [CrossRef]
52. Weber, J.B.B. Avaliação do Efeito da Laserterapia (GaAlAs) Nos Enxertos ósseos Autógenos em Ratos: Estudo
Morfológico [Doctoral dissertation]. Ph.D. Thesis, Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre,
Brazil, 2003. Available online: http://tede2.pucrs.br/tede2/bitstream/tede/1118/1/431499.pdf.
53. Rechenberg B, Animal models in bone repair. Drug Discov. Today 2014, 13, 23–27.
54. Lopes-Martins, R. Low level laser therapy [LLLT] in inflammatory and rheumatic diseases: A review of
therapeutic mechanisms. Curr. Rheumatol. Rev. 2007, 3, 147–154. [CrossRef]
55. Hamblin, M.R.; Ferraresi, C.; Huang, Y.Y.M.D.; Freitas, L.F.; Carroll, J.D. Low-Level Light Therapy:
Photobiomodulation; SPIE Press Book: Bellingham, WA, USA, 2018; Volume TT115, Available online:
https://spie.org/Publications/Book/2295637?SSO=1.
56. Hamblin, M. Mechanisms and applications of the anti-inflammatory effects of photobiomodulation. AIMS
Biophys. 2017, 4, 337–361. [CrossRef] [PubMed]
57. Nicolau, R.A.; Martinez, M.S.; Rigau, J.; Tomas, J. Effect of low power 655 nm diode laser irradiation on the
neuromuscular junctions of the mouse diaphragm. Lasers Surg. Med. 2004, 34, 277–284. [CrossRef]
58. Khadra, M.; Kasem, N.; Haanaes, H.R.; Ellingsen, J.E.; Lyngstadaas, S.P. Enhancement of bone formation in
rat calvarial bone defects using low-level laser therapy. Oral. Surg. Oral. Med. Oral. Pathol. Oral. Radiol.
Endod. 2004, 97, 693–700. [CrossRef]
59. Weber, J.B.; Pinheiro, A.L.; de Oliveira, M.G.; Oliveira, F.A.; Ramalho, L.M. Laser therapy improves healing
of bone defects submitted to autologous bone graft. Photomed. Laser Surg. 2006, 24, 38–44. [CrossRef]
60. Giuliani, A.; Moroncini, F.; Mazzoni, S.; Belicchi, M.L.; Villa, C.; Erratico, S.; Colombo, E.; Calcaterra, F.;
Brambilla, L.; Torrente, Y.; et al. Polyglycolic Acid–Polylactic Acid scaffold response to different progenitor
cell in vitro cultures: A demonstrative and comparative X-Ray Synchrotron Radiation Phase-Contrast
Microtomography study. Tissue Eng. Part C Methods 2014, 20, 308–316. [CrossRef] [PubMed]
61. Manescu, A.; Giuliani, A.; Mazzoni, S.; Mohammadi, S.; Tromba, G.; Diomede, F.; Zini, N.; Piattelli, A.;
Trubiani, O. Osteogenic potential of Dual-blocks cultured with periodontal ligament stem cells: In-vitro and
synchrotron microtomography study. J. Periodontal Res. 2016, 51, 112–124. [CrossRef] [PubMed]
XVIII
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 778 17 of 17
62. Mazzoni, S.; Mohammadi, S.; Tromba, G.; Diomede, F.; Piattelli, A.; Trubiani, O.; Giuliani, A. Role of
cortico-cancellous heterologous bone in human periodontal ligament stem cell xeno-free culture studied by
Synchrotron radiation phase-contrast microtomography. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 364. [CrossRef] [PubMed]
63. Andreollo, N.A.; Santos, E.F.; Araújo, M.R.; Lopes, L.R. Rat’s age versus human’s age: What is the relationship.
Arq. Bras. Cir. Dig. 2012, 25, 49–51. [CrossRef]
64. Stavropoulos, A.; Sculean, A.; Bosshardt, D.D.; Buser, D.; Klinge, B. Pre-clinical in vivo models for the
screening of bone biomaterials for oral/craniofacial indications: Focus on small-animal models. Periodontol.
2000 2015, 68, 55–65. [CrossRef]
65. Silva, Y.S.; Deboni, M.C.Z.; Arana-Chaves, V.E.; Naclério-Homem, M.G. Novel Model of Mono Cortical Bone
Defect in Rat Mandible: An Interesting Tool for Osseous Investigations. IJHS 2016, 4, 47–54.
66. Paganin, D.; Mayo, S.C.; Gureyev, T.E.; Miller, P.R.; Wilkins, S.W. Simultaneous phase and amplitude
extraction from a single defocused image of a homogeneous object. J. Microsc. 2002, 206, 33–40. [CrossRef]
[PubMed]
67. Brun, F.; Massimi, L.; Fratini, M.; Dreossi, D.; Billé, F.; Accardo, A.; Pugliese, R.; Cedola, A. SYRMEP Tomo
Project: A graphical user interface for customizing CT reconstruction workflows. Adv. Struct. Chem. Imaging
2017, 3, 4. [CrossRef] [PubMed]
68. Giuliani, A.; Iezzi, G.; Mozzati, M.; Gallesio, G.; Mazzoni, S.; Tromba, G.; Zanini, F.; Piattelli, A.; Mortellaro, C.
Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Human Jaw: A combined 3D assessment of Bone Descriptors
by Histology and Synchrotron Radiation-based Microtomography. Oral. Oncol. 2018, 82, 200–202. [CrossRef]
[PubMed]
69. Weitkamp, T.; Haas, D.; Wegrzynek, D.; Rack, A. ANKAphase: Software for single-distance phase retrieval
from inline X-ray phase-contrast radiographs. J. Synchrotron. Radiat. 2011, 18, 617–629. [CrossRef] [PubMed]
70. Torres, C.S.; dos Santos, J.N.; Monteiro, J.S.; Amorim, P.G.; Pinheiro, A.L. Does the Use of Laser
Photobiomodulation, Bone Morphogenetic Proteins, and Guided Bone Regeneration Improve the Outcome
of Autologous Bone Grafts? An in Vivo Study in a Rodent Model. Photomed. Laser Surg. 2008, 26, 371–377.
[CrossRef] [PubMed]
71. Manescu, A.; Oancea, R.; Todea, C.; Rusu, L.C.; Mazzoni, S.; Negrutiu, M.L.; Sinescu, C.; Giuliani, A. On
Long Term Effects of Low Power Laser Therapy on Bone Repair: A Demonstrative Study by Synchrotron
Radiation-based Phase-Contrast Microtomography. Int. J. Radiol. Imaging Technol. 2016, 2, 10. [CrossRef]
72. Huang, D.; Swanson, E.A.; Lin, C.P.; Schuman, J.S.; Stinson, W.G.; Chang, W.; Hee, M.R.; Flotte, T.; Gregory, K.;
Puliafito, C.A.; et al. Optical coherence tomography. Science 1991, 254, 1178–1181. [CrossRef]
73. Drexler, W.; Liu, M.; Kumar, A.; Kamali, T.; Unterhuber, A.; Leitgeb, R.A. Optical coherence tomography
today: Speed, contrast, and multimodality. J. Biomed. Opt. 2014, 19, 071412. [CrossRef]
74. Podoleanu, A.; Bradu, A. Master–slave interferometry for parallel spectral domain interferometry sensing
and versatile 3D optical coherence tomography. Opt. Express. 2013, 21, 19324–19338. [CrossRef]
75. Monroy, G.L.; Won, J.; Spillman, D.R.; Dsouza, R.; Boppart, S.A. Clinical translation of handheld optical
coherence tomography: Practical considerations and recent advancements. J. Biomed. Opt. 2017, 22, 121715.
[CrossRef] [PubMed]
76. Duma, V.F.; Dobre, G.; Demian, D.; Cernat, R.; Dobre, G.; Negrutiu, M.L.; Topala, F.I.; Hutiu, G.; Bradu, A.;
Podoleanu, A.G. Handheld scanning probes for optical coherence tomography. Rom. Rep. Phys. 2015, 67,
1346–1358.
77. Rominu, M.; Manescu, A.; Sinescu, C.; Negrutiu, M.L.; Topala, F.; Rominu, R.O.; Bradu, A.; Jackson, D.A.;
Giuliani, A.; Podoleanu, A.G. Zirconia enriched dental adhesive: A solution for OCT contrast enhancement.
Demonstrative study by synchrotron radiation microtomography. Dent. Mater. 2014, 30, 417–423. [CrossRef]
[PubMed]
© 2020 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access
article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution
(CC BY) license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
798
XIX
Original Article
Quantitative assessment of rat bone regeneration using complex

master-slave optical coherence tomography
Ruxandra Elena Luca1, Carmen Darinca Todea1, Virgil-Florin Duma2,3, Adrian Bradu4,
Adrian Gh. Podoleanu4
1
School of Dental Medicine, Victor Babeú University of Medicine and Pharmacy, Timisoara, Romania; 23OM Optomechatronics Group, Faculty of
Engineering, Aurel Vlaicu University of Arad, Arad, Romania; 3Doctoral School, Polytechnic University of Timisoara, Timisoara, Romania; 4School
of Physical Sciences, University of Kent, Canterbury, UK
Correspondence to: Prof. Dr. Virgil-Florin Duma. 3OM Optomechatronics Group, Faculty of Engineering, Aurel Vlaicu University of Arad, 77
Revolutiei Ave., Arad 310130, Romania. Email: duma.virgil@osamember.org; Prof. Dr. Carmen Darinca Todea, MD. School of Dental Medicine,
Victor Babeú University of Medicine and Pharmacy, 2 Eftimie Murgu Place, Timisoara 300041, Romania. Email: todea.darinca@umft.ro.
Background: The need for hard and soft tissues in oral implantology determined the development of
methods and techniques to increase bone volume and their quality with different alternative materials used
as substituents of patient’s natural bone. In addition, laser radiation can be used to accelerate the repair of
fractures and to produce an increased volume of formed callus, as well as an increased bone mineral density.
Methods: The aim of this work is to evaluate the capability of an in-house developed multimodal complex
master slave (CMS) enhanced swept source (SS) optical coherence tomography (OCT) imaging instrument
to analyze the increase in the quantity and the improvement of the quality of newly-formed bone using low
level laser therapy (LLLT). Bone formation is quantitatively assessed in 5 mm cylindrical defects made in the
calvaria part of the skull of living rats. Samples are divided in three study groups: A, a negative control group,
for which the natural healing process of the defect is investigated; B, a positive control group, for which
bovine graft is used to stimulate bone formation, and C, a study group, in which bovine graft is added to the
DSFBUFEEFGFDUTBOE---5JTBQQMJFEUISPVHIPVUUIFFOUJSFIFBMJOHQFSJPE5IFBOJNBMTBSFTBDSJòDFEBGUFS
14, 21, and 30 days, and the samples are imaged using the multimodal CMS/SS-OCT instrument.
Results: The method allows for the simultaneous monitoring of the bone tissue via two perpendicular
cross-sections and nine en-face images taken at adjustable depths into the sample. A global image with course
BYJBMSFTPMVUJPOBMMPXTGPSUIFQPTJUJPOJOHPGUIFòFMEPGWJFXPGUIFTZTUFNPOUIFBSFBPGJOUFSFTUPOUIF
tissue. The quantitative assessment of the process of bone formation is completed using the differences in
CSJHIUOFTTCFUXFFOUIFOBUJWFCPOF UIFBSUJòDJBMCPOFHSBGU BOEUIFOFXMZGPSNFECPOF
Conclusions: Group C is demonstrated to have a higher volume of newly-formed bone than Group B,
which is better from this point of view than Group A. By analyzing the evolution of this volume of new bone
JOUJNF UIFNPTUTJHOJòDBOUEJGGFSFODFXBTBGUFSEBZT UIFSFGPSFBQQSPYJNBUFMZBGUFSUXPUIJSETPGUIF
UPUBMUJNFJOUFSWBMBOBMZ[FE"GUFSEBZT UIFWPMVNFTPGCPOFUFOEUPNPWFDMPTFS BTUIFZCFHJOUPòMMUIF
available gap. The study demonstrates that OCT can assess quantitatively the positive impact of LLLT on
bone regeneration.
Keywords: Optical coherence tomography (OCT); complex master slave (CMS); oral implantology; bone
formation; low level laser therapy (LLLT); bovine graft; en-face imaging
Submitted Feb 16, 2019. Accepted for publication Apr 25, 2019.
doi: 10.21037/qims.2019.05.03
View this article at: http://dx.doi.org/10.21037/qims.2019.05.03
© Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. All rights reserved. Quant Imaging Med Surg 2019;9(5):782-798 | http://dx.doi.org/10.21037/qims.2019.05.03
XX
Quantitative Imaging in Medicine and Surgery, Vol 9, No 5 May 2019 783
Introduction formed bone tissue (6). Due to its similarity to human

bone and its benefits related to availability and ease of
Alveolar ridge resorption subsequent to the loss of tooth is
surgical technique (7,8), this scaffold shows osteoconductive
a common phenomenon. Immediately after the extraction
properties when it is in close contact with the newly formed
of a tooth, alveolar ridge width and height decrease rapidly,
bone (9).
XJUIBMPTTPGBCPVUUPPGUIFJSWBMVFTJOUIFòSTU
Due to the positive effects of laser radiation on bone
three years after extraction. Then, this percentage drops
metabolism, as observed especially in the consolidation of
by 0.25% to 0.5% per year. The decrease in blood supply,
fractures, laser photobiomodulation [i.e., low level laser
UIFMPDBMJ[FEJOóBNNBUPSZQSPDFTT BOEUIFQSFTTVSFGSPN
therapy (LLLT)] has been extended to clinical practice (3).
various types of prosthetic restorations can lead to alveolar
Renno et al. (10) and Stein et al.
TIPXFEBTJHOJòDBOU
bone resorption (1).
increase in the proliferation of osteoblasts after irradiation
The requirements to provide the patient with a complex
with energy from a diode laser emitting 20 J/cm 2 at a
implant treatment increased considerably over the last few
wavelength of 830 nm. In addition, laser radiation seems to
years, therefore the development of bone augmentation accelerate the repair of fractures and produces an increased
techniques to increase the bone volume prior to placing volume of formed callus, as well as an increased bone
implants and prosthetic restorations has become a hot mineral density. Other effects related to the use of LLLT
topic in dentistry (2). Oral rehabilitation of partial or include an increased blood supply, the enhancement of the
total edentulous patients with dental implants has become activity of osteoblasts, the organization of collagen fibers,
a routine treatment in recent decades, with long-term and changes in the intracellular mitochondrial adenosine
sustainable results. However, local unfavorable conditions triphosphate. LLLT is a noninvasive method that stimulates
pertaining to the bone atrophy, periodontal disease, or bone formation and accelerates the healing of bone defects
TFRVFMBFBGUFSUSBVNBQSPWJEFJOTVGòDJFOUCPOFWPMVNFPS (12-14). LLLT can stimulate bone cellular proliferation (15),
unfavorable vertical, horizontal, and sagittal inter-maxillary reflected in osteoblastic activity, and can also increase
relationships, hence difficulties to place implants. An intracellular calcium level (16).
incorrect placement from a functional and aesthetical point Although a significant number of research papers on
of view can also occur (3). LLLT have been published, its mechanism is not enough
The need for hard and soft tissues in the oral understood (17). Studies have suggested a positive effect of
JNQMBOUPMPHZòFMEIBTMFEUPUIFEFWFMPQNFOUPGNFUIPET LLLT on bone healing either in vivo (18) or in vitro (19),
and techniques to increase bone volumes and their quality. BMUIPVHIUIFZEJEOPUòOEBOFGGFDUPG---5POUIFSFQBJS
Bone graft is the second most common transplantable of soft or mineralized tissues (20). First, these inconsistent
tissue, with blood being by far the most common (4,5). The reports may be attributed to the wide variety of laser types
gold standard of bone grafting is harvesting autologous and setups that have been utilized in different studies.
cortical and cancellous bone from the iliac crest (i.e., auto- Second, the true mechanism that leads to a positive effect
grafting). Although it provides optimal osteoconductive, of laser light on different tissues is not fully understood
osteoinductive, and osteogenetic properties, autografting because of the diversity of techniques, methods, and
has its limitations, as it can lead to complications. experimental models, as well because of the variety of
Therefore, currently, other available alternative materials treatment protocols reported (21). These aspects make the
are utilized during common procedures (such as guided DPNQBSBUJWFBOBMZTJTPGUIFSFTVMUTPCUBJOFETPGBSEJGòDVMU
bone regeneration and osteodistraction) as a substituent 4FWFSBMIZQPUIFTFTIBWFCFFOTVHHFTUFE5IFDPOóJDUJOH
of the patient’s natural bone, including alloplastic grafts results of LLLT on bio-modulation are considered to be
(synthetic) or xenograft (animal origin materials). Synthetic mainly related to the diversity of radiation parameters:
materials tend to be used as bone grafts more often, because treatment dose, power density, number of applications,
of their advantages, including the absence of contamination, method of applying, and laser wavelength (22). For the latter
good bioavailability, ease of handling, and good patient parameter, it has been shown that tissue response is altered
acceptance. with regard to the wavelength used as follows: the radiation
The strategy used in bone tissue engineering involves corresponding to red wavelengths shows an activation of
using a suitable scaffold, which can act as a template for cell the mitochondrial respiratory chain components, resulting
interactions, providing a structural support for the newly in the initiation of a cascade of cellular reactions, whereas
XXI
784 Luca et al. Quantitative assessment of rat bone regeneration using complex master-slave OCT
in the region of infrared light, there is an activation of capability of a multimodal complex master slave (CMS)
chromophores located in the cellular membrane (23). enhanced swept source (SS) OCT imaging instrument
It is considered that the main effect of LLLT occurs in to provide reliable information on the bone regeneration
mitochondria. Previous studies demonstrated that irradiated process. Due to the importance and potential impact of
fibroblasts produce a greater amount of collagen. On the bone regeneration, as pointed out above, we approach
same reasoning, other studies considered that osteoblasts ex vivo samples of rat calvarial defects which underwent
irradiated with laser are stimulated to osteoid matrix different protocols of bone augmentation, as well as bone
formation. From a clinical point of view, these events augmentation due to LLLT.
USBOTMBUFJOUPNBUVSF NPSFCPOFEFQPTJU
UIBUTBUJTòFT The remaining of this paper is structured as follows:
the needs of prosthetic implant restorations. Section 2 describes the protocols of bone preparation and
The most frequent methods utilized to evaluate bone the in-house developed CMS/SS OCT instrument. Results
remodeling after LLLT are represented by densitometric are discussed in Section 3, while Section 4 concludes the
analysis (25), histopathological and histomorphometrical study and provides directions of future work, from both
analysis (26), scanning electron microscopy (SEM), plain points of view, of bone regeneration and of the OCT
radiography, and biomechanical analysis. Recently, micro- technique employed for this study.
computed tomography (micro-CT) has been performed to
observe the bone regeneration over an entire defect site.
Using a computer program to convert micro-CT images Methods
to three-dimensional (3D)/volumetric reconstructions, the Preparation of bone samples
entire bone regenerated in the defects can be observed (27).
Despite the variety of instruments listed above, there is The ethical approval for the preparation of bone samples
BOFFEGPSBUPPMTJNVMUBOFPVTMZFGòDJFOUBOEOPOJOWBTJWF was obtained from the International Animal Care and
and that can present sufficient resolution to evaluate the Use Committee on Ethics at the Experimental Research
bone healing process. Optical coherence tomography Institute of the Victor Babeú University of Medicine and
(OCT) (28,29) is such an investigation technique that is Pharmacy of Timisoara, Romania. Twenty-four Wistar rats
more and more applied in dentistry as a promising tool (30), were randomly distributed into the following three groups:
after being initially developed for ophthalmology (I) Group A (negative control group);
(28,31). Nowadays, OCT has a multitude of biomedical (II) Group B—to be used with bovine graft material
applications, that have expanded to skin (32), oral cavity (positive control group);
(33-36), and endoscopy (37). Whilst in dental medicine (III) Group C—to be used with bovine graft material,
OCT has been used to study both soft and hard tissue, as after the application of LLLT.
well as different dental constructs (35,38), a few studies exist The surgical procedure was preceded by an anesthesia
only, to our knowledge, on using OCT for assessment of with Ketamine (100 mg/kg, Intervet, USA) and Rumpun
bone regeneration. These studies include: (I) evaluation of (10 mg/kg, Bayer, Germany) and the preparation of the
the effects of sterilization through ionizing radiation on the surgical site (i.e., the region around the scalp was shaved
bone matrix from the tissue banks used as allograft (39,40); and antisepticised with betadine). A semilunar incision was
(II) imaging early osteoarthritis, identifying changes prior to performed and a full thickness flap was reflected in the
cartilage thinning both in vitro and in vivo in patients and in anterior direction (Figure 1). To prevent spontaneous bone
osteoarthritis animal models, identifying early rheumatoid healing, a 5 mm calvarial defect was created, by using a
arthritis and guiding tendon repair (41); (III) 3D imaging of trephine burr and a surgical hand piece, under a continuous
the tissue at the implant sites for in vitro investigations, for sterile saline irrigation. To establish the same position of the
XIJDI0$5JNBHFTPCUBJOFEBU ONTIPXFETJHOJòDBOU defect in the calvarial region of all rats, a plastic positioning
contrast and spatial resolution to study osseointegration of matrix with a circular gap of 5 mm was created; this was
implants in the maxilla at a 200 µm depth inside the bone used as a surgical guide. Special attention was needed to
(42,43). In bone regeneration assessment, we have utilized avoid damaging in any way the dura mater during the
both the capability of OCT and micro-CT to evaluate the surgical procedure.
bone grafting material/bone interface (44). After creating the surgical calvarial defect, Groups B
The aim of the present study is to evaluate the and C received bovine grafting material, whilst Group A
XXII
A B C
D E F
G H I
Figure 1 Steps taken during the surgery phase. (A) Full thickness flap elevated; (B,C,D,E) creation of a 5 mm diameter defect under
continuous cooling; insertion of the (F) bovine bone grafting material and of the (G) collagen membrane; (H,J) suture in two layers manner
VTJOHBCTPSCBCMF GPSUIFòSTUMBZFS
BOEOPOBCTPSCBCMFTVUVSF GPSUIFTFDPOEMBZFS

remained the negative control group, without any grafting of 3,800 Hz, 450 MW, 17 s per point, 18.9 J per treatment
material. Periosteum and scalp were sutured in a two session), which were established and reproduced each time
layers manner using 6/0 Prolene and 5/0 Prolene for the using a plastic positioning matrix manufactured in our
skin. Cefazoline (100 mg) was given to the animals by group. The animals were distributed into groups according
intramuscular injections immediately after the surgery for to three healing periods applied after the surgical procedure.
2 days. After the surgery, the animals were continuously *OUIFòSTUHSPVQ POFUIJSEPGUIFSBUT FVUIBOBUJ[FEBGUFS
kept at a 22±5 Ԩ temperature and at a 50%±5% humidity. 14 days were included; another third, euthanatized after 21
Group C was exposed to LLLT with an own developed days were included in the second group, and the rest of rats,
protocol, using a gallium-aluminum-arsenide laser (GaAlAs) euthanatized after 30 days were included in the third group.
(IRRADIA Mid-Laser ® Stockholm, Sweden) emitting at Bone samples were harvested and prepared in such a way
a central wavelength of 808 nm, with an optical power of that they included the defect along with the surrounding
450 MW (Figure 2). tissues.
An energy of 2 J/cm2 was applied immediately after the A first limitation of the study comes from the fact that
intervention, as well as every other day until the established the volume of bone assessed originate from different rats,
TBDSJòDFEBZXBTSFBDIFE---5XBTQFSGPSNFEJOQPJOUT UIFSFGPSFBWBSJBUJPOHJWFOCZUIFTQFDJòDJUZPGUIFIFBMJOH
around the defect and in a central point (with a frequency process of each animal is unavoidable. Considering several
XXIII
B C D
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
cm
Figure 2 Example of LLLT procedure and harvested samples. (A) Group C is exposed to LLLT, using a GaAlAs laser (IRRADIA Mid-
Laser® Stockholm, Sweden), in 4 points around the defect as well as in a central point, which were established and reproduced each time
using a plastic positioning matrix. Examples of harvested samples: (B) control group, (C) negative study group, and (D) positive study group.
LLLT, low level laser therapy; GaAlAs, gallium-aluminum-arsenide laser.
rats in each group and performing an average of the possible limit to avoid distortions of the image when the
results has been a method to decrease errors produced by fast scanner is driven at 250 Hz (46). Therefore, to cover
individual variations. the 5 mm in diameter cylindrical defect situated on the
upper part of the bone sample, four individual OCT images
are collected, each with a square surface of 2.8×2.8 mm2,
OCT system
as shown in Figure 4A. To study the formation of the new
The in-house developed CMS/SS OCT system utilized in bone inside it—with or without the bovine grafting material
the investigations, described in detail in (45) is presented added to the defect, each of the four quadrants of the
in Figure 3A,B, while examples of two rat bone samples defects is imaged separately. The interface with the original
imaged with it are shown in Figure 3C,D. The galvanometer bone is of special interest, in order to study the process of
scanners are driven with a triangular waveform of 2 V formation of new bone in time.
voltage peak-to-peak, which corresponds to a 2.8 mm The sketch in Figure 4B illustrates the positioning of the
MJOFBSTDBOPOUIFTBNQMF5IFTDBOOFEòFME<UIFSFGPSF UIF four quadrants. Examples of OCT images produced during
òFMEPGWJFX '07
PGUIF0$5TZTUFN>JTTFUBUUIFVQQFS the investigations are presented in Figure 4C. A raster
XXIV
A M2 B C D
Digitizer
MO3
DC2 MO2 M1
BPD
DC1 MO1
Processor
SS GXY
CMS
SL
Sample
Figure 3 OCT investigations of rat calvaria bone samples. (A) Schematic of the in-house developed multimodal CMS/SS OCT system
centered at 1,300 nm; (B) photo of the OCT set-up; (C,D) metal frame for location of the area investigated on the sample. CMS, complex
NBTUFSTMBWF44 TXFQUTPVSDF#1% CBMBODFEQIPUPEFUFDUPS%$ EJSFDUJPOBMDPVQMFS.0 NJDSPTDPQFPCKFDUJWFT. óBUNJSSPST(9:
galvo-scanning head; SL, telecentric scanning lens; OCT, optical coherence tomography.
A Defect
Original C xy en face images
(Upper part)
Bone
Additional bone
(Bright)
New (ii) (i)
Bone
5.6
(Gray)
(iii) (iv)
ĭ5
12
yz B-scan
2.8
B y
xz B-scan
Z
2.8
Confocal image (xy)
Figure 4 CMS SS-OCT procedure. (A) Sample to be imaged (i.e., upper part of the skull fragment of the rat—with cylindrical defect)
showing the same notations for the four quadrants considered as in Figure 4; (B) dimensions and orientation of the volumetric OCT
reconstruction; (C) 12-image display of delivered by the CMS SS-OCT software. The size of each en face OCT image and of the confocal
one is 2.8×2.8 mm2. The size of the two orthogonal B-scan images is 1.6×2.8 mm2. The en-face OCT images are separated by 42.56 µm. The
òSTUen-face OCT image corresponds to z=0.4 mm within the specimen. All distances are measured in air. CMS, complex master slave; SS,
swept source; OCT, optical coherence tomography.
scan is obtained by scanning the galvanometers along x- CMS developed system and software:
and y-directions, with the z-axis oriented along the depth (I) A global image (similar to a coarse confocal image),
axis. As it can be observed in Figure 4C, three categories of in the plane xy taken from the top of the sample
images could be analyzed simultaneously using the in-house (situated in the bottom left part of the screen),
XXV
Brightness Ma of the additional bone particles White
M (Highest level of M in the OCT images) (Conventional)
t3 =30 days
Brightness Mmax of the new formed bone
Gray
(Interval of
interest)
t1 =14 days Brightness Mmin of the new formed bone
Brightness M0 of the original bone of the skull Gray

(Conventional)
(Lowest level of M in the OCT images)
Figure 5 Thresholds of the brightness M of the different types of bone tissue—considered in order to evaluate the quantity Q of new formed
bone. OCT, optical coherence tomography.
which serves to position the area of interest; images, as they show the tissue at different depths. This is
(II) In this case the interface between the original and another inherent limitation of the method; however, to our
the newly formed bone inside the cylindrical defect knowledge there is no other way to do the assessment using
(as detailed in the following section) in the FOV of OCT, but to involve the assumption that the brightness
the imaging instrument; level is indicative to the bone strength, as already accepted
(III) B-scan/transversal sections into the sample in the in OCT studies of demineralization. OCT shows signal
yz and xz planes (marked with blue and red dashed variations within the bone tissue. We interpret these
lines); they can be selected and moved using the as mineralization differences of trabeculae resulting in
two lines shown (with blue and red, respectively) in different refractive indices causing brighter and darker
the xy confocal image in the bottom left corner; areas in the imaged bone tissue. This information enables
(IV) Nine simultaneously produced xy en-face images a calculation of the average trabecular mineralization and
(C-scans), taken in the xy planes, from different indicates the direction and velocity of past bone growth in
equidistant adjustable axial positions from within analogy to growth rings of plants (47).
the sample. The axial depths of the nine en-face
images are shown on both B-scan images (between
Results
the dashed lines).
Although in real time only nine en-face images are currently
displayed on the screen, 600 such images over an axial
Assessment of bone quantities
range of 1.6 mm are produced by the CMS software for the
To utilize the multimodal CMS/SS OCT system for 3D/volumetric reconstruction of the sample, as shown in
quantitative assessment, the different types of tissue bones the examples in Figure 6. for all the four quadrants marked
have to be distinguished on each en-face slide obtained in Figure 4A. Thus, Figure 6 shows the 12-image display
during the imaging process. Brightness thresholds therefore from the control group (i.e., from Group A) taken after
must be assigned to each type of bones, as shown in Figure 5. the shortest time interval considered (i.e., 14 days) and the
This is easy for the bovine bone particles introduced in 12-image display for the additional bone particles in the
the defect for Group B—as these are highly mineralized, defect and LLLT throughout the healing period (i.e., from
therefore easy to distinguish by the brightest zones in all Group C), after the longest interval considered (i.e., 30 days)
the images. The more difficult assignment of brightness in order to highlight the differences between a sample with
thresholds is for new bone, formed at the margins of the the lowest and the highest quantity of new bone formed,
defect zone for Group A, as well as at the margins and respectively. The contrast between the quantities of the new
around the additional bone particles, for Group B. bone formed in these two extreme situations can be clearly
One may object to the fact that a simple intensity seen when comparing the two sets of images.
threshold is proposed and applied to the en-face OCT The newly bone formation is evaluated by comparison
XXVI
separation of tissue types.

In this respect we must emphasize that the method
proposed here does not take into account variations of
intensity due to attenuation, absorption and scattering.
Video 1. Twelve-image view for a pair of Scattering and absorption change with depth, but
images formed from Group A and Group C throughout the study we have not attempted to compare
Ÿ
brightness from different depths. If comparison would have

Ruxandra Luca, Carmen Darinca Todea*, Virgil-Florin been done in B-scans, then the contrast change with depth
Duma*, Adrian Bradu, Adrian Gh. Podoleanu
should have been taken into consideration.
School of Dental Medicine, Victor Babeş University of As a drawback of the current instrument, due to the
Medicine and Pharmacy, Timisoara, Romania
surface curvature, the en-face information may not be
Figure 6 Twelve-image view for a pair of images formed from collected from the same depth in all lateral pixels within
Group A and Group C (48). Imagines of Group A were taken after the en-face image. Indeed, we have not corrected for that
the shortest time interval considered (i.e., 14 days) and imagines extra depth dependence due to surface variations, because
of Group C were taken after the longest time interval considered doing comparisons inside the en-face image secures a certain
(i.e., 30 days). The differences between a sample with the lowest consistency: all pixels at that depth have been affected
and the highest quantity of newly-formed bone are highlighted. similarly by the intermediate layers on top (as long as the
The video shows the pair of images for each of the 4 quadrants (i) TVSGBDFJTTVGòDJFOUMZóBU

to (iv) according to notation in Figure 4A. Each en-face OCT image Also, to minimize errors, the bone sample removed from
has a square surface (in the xy plane) of 2.8×2.8 mm2. The image a rat’s calvarial area was positioned as shown in Figure 3C,D
frozen here is that of the pair of 12-image view for quadrant (iii). and divided into 4 quadrants, which generated OCT images
5IFòSTUen-face displayed is collected at a depth z=0.4 mm, while with a surface of only 2.8×2.8 mm2 each. This has been
the distance between the displayed en-face images is 42.56 µm. The a way of addressing the issue of the curvature mentioned
axial range of the two B-scan images is 1.6 mm. All distances are above. Such images included, in certain situations, a larger
measured in air. quantity of native bone, which could be noticed by the
Available online: http://www.asvide.com/article/view/31954 QFSJQIFSZPGUIFBSUJòDJBMMZDSFBUFEEFGFDU5IJTNFBOTUIBU
another quadrant has included a larger part of the defect.
The investigations, as well as the statistics performed on
between the three groups, performed at three moments of the data obtained included all four quadrants, and thus, the
time: (I) t1=14, (II) t2=21, and (III) t3=30 days (Figure 7). This entire area of interest, including the periphery of the defect,
shows the 12-image display acquired from the 2.8×2.8 mm2 as a way to reduce the errors with regard to the entire
surface of a quadrant—for each of the samples considered. sample curvature (as mentioned above) and to the amount
For clarity, a single sample is shown for each group and at of native bone included in certain images.
each time moment ti, i=1,2,3. The same panel presented in Figure 7 is replicated in
According to B-scan images such as those presented Figure 8, considering the 3D reconstructions of the same
in Figure 7, from the central part of the defect no back- bone samples as in Figure 7. Images show a different
scattered light is collected (especially in the upper part of appearance of the bone samples, depending on the
the sample), whereas towards its periphery a significant treatment applied and on the healing time which was
number of photons originates from the tissue surface. established for each animal group. In the control group, the
The further to the periphery of the en-face image the margins of the defect are obvious, being formed of native
deeper the corresponding structure lies. This depends on bone; meanwhile the center of the defect is empty or less
the surface structure of the sample, but the effect can be representative in bone tissue. In the second group, the
quite pronounced. One may therefore point out that the DFOUFSPGUIFEFGFDUJTòMMFEXJUICPWJOFHSBGUNBUFSJBM JO
varying signal strengths should be considered, i.e., large between of which there is an appearance of newly formed
number of back-scattered photons from the surface, weaker bone tissue. The same appearance, but more homogenous,
signal (~exponential decay) from deeper layers. These may is found in the Group C, where laser radiation was applied
also depend on the focus position and shadowing from UPUIFEFGFDUòMMFEXJUIHSBGUJOHNBUFSJBM
VQQFSMBZFST XIJDINBZJOóVFODFBTJHOBMJOUFOTJUZCBTFE 8FRVBOUJòFEUIFBNPVOUPGOFXMZGPSNFECPOF VTJOH
XXVII
Group A
Group B
Group C
(I) (II) (III)
Figure 7 Monitoring the process of new bone formation for the three Groups A, B, and C—after (I) t1=14 days; (II) t2=21 days and
(III) t3=30 days. The upper left quadrant (ii) of each sample has been considered (Figure 4A). Each en-face OCT image has a square surface
(in the xy plane, see Figure 4) of 2.8×2.8 mm25IFòSTUen-face displayed is collected at a depth z=0.4 mm, while the distance between the
displayed en-face images is 42.56 µm. The axial range in the B-scan images is 1.6 mm. OCT,optical coherence tomography.
the scheme presented in Figure 9A for the healing of the images in the second row has the brightness within the
artificially created defect. The correspondence between range of values adjustable via the two cursors at the top of
the types of bones schematically presented in the sketch in each image.
Figure 9A and a real en-face OCT image, for a positive and This new bone—which is the target of the entire study—
negative control of the sample is shown in Figure 9B. appears throughout the entire 30 days period. However,
To quantify the newly-formed bone, a dedicated software when it is just formed it is darker (i.e., less mineralized),
was developed. Its main attribute is to establish ranges for while as time passes it becomes brighter—as it is more
the brightness of different types of bone, and to generate and more mineralized. A brightness interval (Mmin, Mmax)
the specific percentage for every category. The use of UIFSFGPSFIBTUPCFEFòOFE XJUIUXPUISFTIPMET Figure 5):
this program is exemplified in the supplemental material the lower limit Mmin corresponds to the new bone formed
(Figure 10). The cursor on the top left image selects an en-face after 14 days (i.e., t1, the shortest time considered), while
OCT image from a specific axial position. Each of the 4 the upper limit Mmax corresponds to the new bone formed
XXVIII
Group A
Group B
Group C
(I) (II) (III)
Figure 8 The same study as in Figure 7, showing OCT 3D reconstructions of the upper left quadrant of the samples for each group, A, B
and C after (I) t1=14 days, (II) t2=21 days, and (III) t3=30 days. OCT, optical coherence tomography; 3D, three-dimensional.
A
Calvaria, the native bone
Newly formed bone
ii i
iii iv Artificial bone particles
The defect which was created
B For a negative control sample: For a positive control sample:
Native bone Native bone

Newly formed bone
The defect which was created Artificial bone particles
Newly formed bone
Figure 9 2VBOUJòDBUJPOPGUIFEJGGFSFOUUZQFTPGCPOFT "

4DIFNFPGUIFCPOFEFGFDU #
EJGGFSFOUUZQFTPGCPOFJOTJEFUIFEFGFDU VTJOH
OCT imaging. OCT, optical coherence tomography.
XXIX
New Native Artificial

C-scan Bone Bone Bone
14
Video 2. Example of the use of the software 23.78 18.65 00.00

developed to quantify the newly-formed bone,
establishing ranges for the brightness of
Ÿ
different types of bone, and generating specific Group A 21

percentages for every category
17.93 21.61 00.00
Ruxandra Luca, Carmen Darinca Todea*, Virgil-Florin
Duma*, Adrian Bradu, Adrian Gh. Podoleanu
30
School of Dental Medicine, Victor Babeş University of
14.76 41.06 00.00 t (days)
Medicine and Pharmacy, Timisoara, Romania
Figure 10 Example of the use of the software developed to 14

quantify the newly-formed bone, establishing ranges for the 25.57 10.06 20.63
brightness of different types of bone, and generating specific
percentages for every category (49). Group B 21
Available online: http://www.asvide.com/article/view/31955 08.99 32.76 09.73
30
after 30 days (i.e., t2, the longest time interval)—and this 20.63 20.07 31.31 t (days)
latter tissue has the brightness lower than the native bone
and also than the bovine bone grafting material. 14
Using the thresholds pointed out in Figure 5 and the 32.08 13.39 13.16
program developed, each of the N en-face OCT image

obtained is analyzed and produces the area Aj, j=1...N of the Group C 21
new formed bone. As each en-face image has a thickness h~5 25.02 19.25 10.36
µm into the sample, the volume of the newly formed bone

30
can be estimated as:
N 27.11 25.65 13.59 t (days)
V h ¦ Aj
j 1 Figure 11 Collage of en-face images showing different bone
With the established thresholds, for all samples, the structure in the images obtained using OCT scans: bone healing
program thus generates the percentages of every type representation for the negative control Group A (at 14, 21,
of bone. 30 days), for the positive control Group B (at 14, 21, 30 days) and
The thresholds utilized are identical or almost identical for experimental Group C (at 14, 21, 30 days). The percentage of
for all the considered groups. Their variations over the each type of bone is indicated on each en-face OCT each image.
sample volume were small and they were the exception
rather than the rule. Such variations were considered only
in order to eliminate artefacts in the samples. In no situation from each quarter of each sample and made the sum for
such variations led to complete elimination of essential the reflectivity. The software we have developed allows
structures of bone tissue from the graphical analysis. visualization of 196 en-face positions for each quarter of
Regarding the curvature of the samples pointed out the sample. We excluded from our statistical analysis the
in the discussion in Figure 7, in order to minimize such periphery of the defect, containing only calvaria bone, in
errors, we took into consideration that no segmentation PSEFSOPUUPJOóVFODFUIFSFTVMUTPGUIFTUVEZ*OUIJTXBZ
was used. As we compare en-face images from a selected we begin the analysis at the margins of the defect, taking
depth, if the surface is curved, the substance selected is into consideration every 10 steps-position, meaning an
not from the same depth measured from the top. Because average of 20 positions for every sample. This generated
of that, reference to the bone is relative to the cut. To approximately 60 percentages of different bone types for
tackle with this issue, we considered several en-face images every sample. The four results, for the four quarters of each
XXX
TBNQMFXFSFBEEFEBOEXFPCUBJOFEBòOBMOVNCFSGPSFBDI An additional aspect refers to the speckles that fully

type of bone. modulate the OCT intensity signal. These have not been
accounted for by spatial averaging in Figure 11 in order to
avoid reducing the sharpness. However, the evaluations
Discussion
themselves involved some average process. We did not
We exemplify in Figure 11 the results obtained in this way. look at a single point in the en-face, where the effect of the
'SPNUIFQPJOUPGWJFXPGUIFJOUFOTJUZUIFSFBSFTJHOJòDBOU speckle may only be mitigated by weighed averaging of
differences between the images from the first row of multiple en-face images produced at different moments, but
Figure 11 with regard to the homogeneity of the different we added up the brightness of a collection of points.
intensities. Samples in the control Group A present high Using the data obtained, a statistical analysis of the
intensities at the periphery of the defect and weak or no results was performed, using ANOVA and Tukey tests. The
intensities in the center of the defect, as remarked from the results of the analysis are presented in Figures 12,13.
en-face images. The positive control Group B and the study The statistical analysis highlights the information
Group C exhibit a more homogeneous distribution of the obtained regarding the healing curve of the bone tissue: by
intensities, because all samples have defects with (different performing a comparison between the three study groups,
types of) bone tissue inside. the results showed significant differences in the healing
New bone can be detected at locations where one process depending on the time of healing and also on the
would expect to see native bone. Regarding this aspect, treatment applied. The statistics calculations have included
one must consider that to sustain and maintain bone all the values obtained in order to improve the errors as
healing, vascularity, and cell distribution specific to this much as possible. Out of 600 en-face images produced we
process, the existence of a topographic structure to guide selected 40 images for each sample, positioned taking into
the regeneration and mineralization is necessary. This is BDDPVOUUIFTQFDJòDEFQUIPGFBDITBNQMF BTSFNBSLFEGSPN
the reason why in the defects left empty for healing, this the B-scan provided by the system. A full coverage of the
process starts from the periphery towards the center of the entire depth of the defect was provided this way.
defect. The new bone is therefore produced in the vicinity As it can be concluded from Figure 12, differences with
of the native, well-mineralized one. In defects where the TUBUJTUJDBMTJHOJòDBODFXFSFGPVOECFUXFFOUIFUXPDPOUSPM
guided regeneration is conducted via different types of bone groups, positive B and negative A. The percentage of newly
particles, these particles act as a support to initiate the bone formed bone was higher for the healing period of 30 days
formation. In this case new bone can be noticed not only than for 21 or 14 days, both for negative control Group A
at the periphery of the defects, but also in the central part (in which defects healed spontaneously) and for the positive
of the bone formation placed in connection with additional control Group B (in which bovine bone graft was added to
CPOFQBSUJDMFT3FHBSEJOHUIFTVQFSQPTJUJPOPGUIFBSUJòDJBM the defect).
bone particles with the native bone, two aspects must be Moreover, the most important variation was found by
taken into account: (I) the defects created in the animals’ performing a comparison between Groups B and C, thus
calvarial area were left to be healed in vivo, in which case evaluating the effect of LLLT on the healing process of the
some dynamics is evident, as different local movements CPOFUJTTVF4JHOJòDBOUEJGGFSFODFTXFSFGPVOEUISPVHIPVU
PGUIFBSUJòDJBMCPOFPDDVS BTJUJTBMTPUIFDBTFPGIVNBO the statistical analysis for the healing period of 21 days,
subjects); (II) because of the bone reshaping and resorption where it seems that the laser radiation had the highest
processes that always take place in the initial step of the effect, by inducing the formation of the highest quantity
IFBMJOH BSUJòDJBMCPOFIBTUPCFVTFEJOFYDFTTJOUIFEFGFDU of new bone (see the results for V and VI in Figures 12,13).
*UJTUIFSFGPSFQPTTJCMFGPSBSUJòDJBMCPOFQBSUJDMFTGSPNUIF We should also take into consideration that laser photo-
interior of the defect to reach the periphery of the defect, biomodulation effect does not happen immediately, as it is
where native bone exists. One can notice in Figure 11 that known to be a cumulated effect, therefore it may appear by
on all images taken into consideration all three types of the end of the assessment period. The results obtained using
CPOFBSFQSFTFOUOBUJWF BSUJòDJBM BOEOFXMZGPSNFE MFTT OCT were confirmed when performing the histological
mineralized) bone. This can also be noticed from Figure 7, examination of the samples, as shown in the examples in
but only the analyze in Figure 11 highlights the different Figure 14A,B.
types of bone, after using the programme developed. The ground truth obtained by histology demonstrates
XXXI
A Native bone representation B Bovine bone graft representation

50
40
40
30
30
20 Mean 20
Mean
10 10
0 0
I II III IV V VI VII VIII IX I II III IV V VI VII VIII IX
C Newly formed bone

35
30
25
20
15 Mean
10
5
0
I II III IV V VI VII VIII IX
Figure 12 Mean values and standard deviations for the (A) representation of native bone, (B) bovine bone, (C) newly formed bone graft in
UIFTUVEJFEHSPVQT OVNCFSFEGSPN*UP*9 EFQFOEJOHPOUIFIFBMJOHUJNFBOEPOUIFUZQFPGUSFBUNFOUBQQMJFE *
OFHBUJWFDPOUSPM(SPVQ
" UJNFPGIFBMJOHEBZT EFGFDUIFBMFETQPOUBOFPVTMZ
**
QPTJUJWFDPOUSPM(SPVQ# UJNFPGIFBMJOHEBZT EFGFDUòMMFEXJUICPWJOF
CPOFHSBGU
***
TUVEZ(SPVQ$ UJNFPGIFBMJOHEBZT EFGFDUòMMFEXJUICPWJOFCPOFHSBGUMBTFSSBEJBUJPOXBTBQQMJFE
*7
OFHBUJWF
DPOUSPM(SPVQ" UJNFPGIFBMJOHEBZT EFGFDUIFBMFETQPOUBOFPVTMZ
7
QPTJUJWFDPOUSPM(SPVQ# UJNFPGIFBMJOHEBZT EFGFDUòMMFE
XJUICPWJOFCPOFHSBGU
7*
TUVEZ(SPVQ$ UJNFPGIFBMJOHEBZT EFGFDUòMMFEXJUICPWJOFCPOFHSBGUMBTFSSBEJBUJPOXBTBQQMJFE

(VII) negative control Group A, time of healing 14 days (defect healed spontaneously); (VIII) positive control Group B, time of healing
EBZT EFGFDUGJMMFEXJUICPWJOFCPOFHSBGU
*9
TUVEZ(SPVQ$ UJNFPGIFBMJOHEBZT EFGFDUGJMMFEXJUICPWJOFCPOFHSBGUMBTFS
radiation applied).
Comparison between study groups regarding that the images shown in Figure 11 represent the claimed
the newly formed bone where P<0.05
tissue types. Proximity of particles of artificial bone to
18 native bone or newly formed bone represents a normal
16 healing process, which is well-known and demonstrated
14 in the literature. This comes from the fact that particles of
12 BSUJòDJBMCPOFBSFVUJMJ[FEJOCPOFBVHNFOUBUJPO OPUPOMZ
10 to compensate for the loss of bone tissue, but also in order
8
to form a topographic structure on which the process of
bone growth can occur; this is essential for large defects.
6
The results obtained in our study suggest that positive
4
effects of LLLT on the bone repair processes are time
2
dependent, having a higher impact during the initial
0
phases of the healing (Figures 12,13). This conclusion is
VI vs. V IV vs. I VII vs. I VIII vs. I VIII vs. V VI vs. III IX vs. III
also supported by the findings of other research groups,
Mean difference (%) which have used other investigation methods than OCT
Figure 13 Comparison between the three study groups regarding (22-24). Qualitative histological analysis and histometric
UIFOFXMZGPSNFECPOF XJUITJHOJòDBODFGSPNBTUBUJTUJDBMQPJOUPG analysis showed that LLLT can improve bone formation
view (P<0.05). QSPDFTTJOSBUDBMWBSJBMEFGFDUTòMMFEPSOPUXJUICPWJOFCPOF
XXXII
A B
Figure 14 Masson trichrome staining 10×, demonstrating different results for (A) group V (positive control Group B, time of healing
EBZT EFGFDUòMMFEXJUICPWJOFCPOFHSBGU
BOE #
HSPVQ7* TUVEZ(SPVQ$ UJNFPGIFBMJOHEBZT EFGFDUòMMFEXJUICPWJOFCPOFHSBGU
MBTFSSBEJBUJPOXBTBQQMJFE
"GFXJOóBNNBUPSZDFMMVMBSFMFNFOUT IPNPHFOFPVTFPTJOPQIJMJDNBUFSJBMDSPTTFEXJUIòCSPVTUJTTVFJOBTNBMM
amount (about 2:1 ratio) and suture material granulomas is presented in (A). Osteoid lamellae that tend to bind bone tissue to eosinophilic
material (which is represented by the bovine bone graft) are presented in (B), where some of the bone lamellae are focally delimited by
osteoblasts. *, osteoid lamellae.
graft, but it is not able to accelerate particles resorption of Multimodal CMS/SS OCT was applied to image and
this material in the interior of bone defect (50). Levels of analyze the different groups considered in order to assess
calcium, phosphorus, and protein can also be determined the new bone formation process: negative control Group A,
by using atomic absorption spectrometry, colorimetry, and positive control Group B (with additional bone), and Group
photometry when investigating possible effects of LLLT on C (with additional bone and LLLT). Imaging the bone
bone formation (51). defect on quadrants and using C-scans/en-face images (as
In another study, the histological evaluation showed a well as B-scans and confocal images), statistically consistent
statistically significant increase in new bone formation of conclusions were extracted from the study. Essentially,
LLLT group relative to the control (P<0.05). In addition, Group C was demonstrated to have more new formed bone
JOóBNNBUJPOXBTTJHOJòDBOUMZSFEVDFEJOUIF---5HSPVQ than Group B, which has more new bone than Group A. By
compared to the control (52). The histological evaluation analyzing the evolution of the quantity of new bone in time
still represents the gold standard, being relevant in assessing (by performing the euthanasia of the rats after three-time
JOóBNNBUPSZJOòMUSBUJPO USBCFDVMBSCPOFNBUSJY QFSJPTUFBM JOUFSWBMT JF BGUFS BOEEBZT
UIFNPTUTJHOJòDBOU
BOEOFXCPOFGPSNBUJPO
"MUIPVHIJUIBTBTJHOJòDBOU difference between these quantities of new bone was after
importance, the histological assessment is invasive, which 21 days, therefore approximately after two thirds of the total
does not allow any further examinations on the same time interval analyzed. After the longer time considered,
samples. In contrast to using these other methods, the the quantities of bone tend to move closer, which is logical,
present study demonstrates the capability of OCT to assess BTUIFZCFHJOUPòMMUIFBWBJMBCMFHBQ)JTUPMPHJDBMJNBHFT
newly formed bone, both qualitatively and quantitatively, were included in the study, to demonstrate the validity of
while the histological analysis has confirmed the findings the assumptions made regarding the different types of bone
obtained using OCT. JEFOUJòFEJOUIFTUVEZ
5PPVSLOPXMFEHF UIJTJTUIFòSTUUJNFXIFO0$5IBT
been employed as a tool to assess the effects of laser photo-
Conclusions
biomodulation on bone regeneration. Despite inherent
A quantitative analysis of the process of bone formation limitations of the method, the results obtained and the
in rat calvaria was achieved using OCT. Such studies are statistics performed using OCT were in good agreement
FTTFOUJBMUPBTTFTTUIFFGòDJFODZPGEJGGFSFOUUFDIOJRVFTUIBU with previous studies that approached new bone formation
can be used in bone regeneration, especially taking into using other methods, including histology. As such, we
consideration the complexity of the wound healing process believe that this work represents a progress towards bone
BOEUIFMBSHFOVNCFSPGGBDUPSTJOóVFODJOHJU formation studies using en-face imaging.
XXXIII
Future work includes the application of LLLT to 2. Toscano N, Shumaker N, Holzclaw D. The art of
enhance the bone regeneration using different protocols block grafting - A review of the surgical protocol for
and parameters. All the data available in the literature reveal SFDPOTUSVDUJPOPGBMWFPMBSSJEHFEFòDJFODZ+*NQMBOU"EW
UIBUUIFFGòDJFODZPGUIFUIFSBQZJTBGGFDUFECZUIFEPTBHF Clin Dent 2010;2:45-66.
irradiation time, and mode. Regarding measurable effects, 3. Chiapasco M, Zaniboni M. Bone augmentation procedures
it seems that LLLT is more effective when applied in the in implant dentistry. Int J Oral Maxillofac Implants
early stages of the wound healing, probably due to the high 2009;24:237-59.
cellular proliferation rate. The increase in vascularity and 4. Boyce T, Edwards J, Scarborough N. Allograft bone:the
the response of the osteoblasts remain important aspects to JOóVFODFPGQSPDFTTJOHPOTBGFUZBOEQFSGPSNBODF0SUIPQ
be taken into consideration when assessing LLLT effects. Clin North Am 1999;30:571-81.
Similar future studies may be considered to target the effect 5. Giannoudis PV, Dinopoulos H, Tsiridis E. Bone
of LLLT on cellular differentiation and growth, especially substitutes: an update. Injury 2005;36 Suppl 3:S20-7.
regarding mesenchymal stem cells and mesenchymal 6. Karageorgiou V and Kaplan D. Porosity of 3D biomaterial
stromal cells therapies, during what nowadays is known as scaffolds and osteogenesis. Biomaterials 2005;26:5474-91.
regenerative medicine. 7. Thaller SR, Hoyt J, Dart A, Borjeson K, Tesluk H. Repair
of experimental calvarial defects with Bio-Oss particles
and colagen sponges in a rabbit model. J Craniofac Surg
Acknowledgments
1994;5:242-6.
Funding: Romanian National Authority for Scientific 8. Accorsi-Mendonça T, Conz MB, Barros TC, de Sena
Research (CNDI–UEFISCDI) (PN-III-P2-2.1- LA, Soares Gde A, Granjeiro JM. Physicochemical
BG-2016-0297, http://3om-group-optomechatronics. characterization of two deproteinized bovine xenografts.
ro/); European Union through the European Regional Braz Oral Res 2008;22:5-10.
Development Fund, the Competitiveness Operational 9. Simion M, Fontana F, Rasperini G, Maiorana C. Vertical
Program (BioCell-NanoART, Grant POC-A1-A1.1.4-E nr. SJEHFBVHNFOUBUJPOCZFYQBOEFEQPMZUFUSBóVPSPFUIZMFOF
30/2016). A Bradu and AG Podoleanu also acknowledge the membrane and a combination of intraoral autogenous
support of the Engineering and Physical Sciences Research bone graft and deproteinized anorganic bovine bone (Bio
Council (EPSRC) (‘REBOT’, EP/N019229/1). Oss). Clin Oral Implants Res 2007;18:620-9.
10. Renno ACM, McDonnell PA, Parizotto NA, Laakso
EL. The effects of laser irradiation on osteoblast and
Footnote
osteosarcoma cell proliferation and differentiation in vitro.
Conflicts of Interest: AG Podoleanu is supported by the Photomed Laser Surg 2007;25:275-80.
National Institute for Health Research Biomedical Research 11. Stein A, Benayahu D, Maltz L, Oron U. Low-level laser
$FOUSFBU.PPSòFMET&ZF)PTQJUBM/)4'PVOEBUJPO5SVTU irradiation promotes proliferation and differentiation
(NIHR) and UCL Institute of Ophthalmology, University of human osteoblasts in vitro. Photomed Laser Surg
College London, the Royal Society Wolfson Research Merit 2005;23:161-6.
Award. The other authors have no conflicts of interest to #BSCPTB% EF4PV[B3" 9BWJFS. EB4JMWB'' "SJTBXB
declare. EA, Villaverde AGJB. Effects of low-level laser therapy
(LLLT) on bone repair in rats:optical densitometry
Ethical Statement: The ethical approval for the preparation analysis. Lasers Med Sci 2013;28:651-6.
of bone samples was obtained from the International Animal 13. Cunha MJ, Esper LA, Sbrana MC, de Oliveira PG, do
Care and Use Committee on Ethics at the Experimental Valle AL, de Almeida AL. Effect of low-level laser on
Research Institute of the Victor Babeú University of bone defects treated with bovine or autogenous bone
Medicine and Pharmacy of Timisoara, Romania. grafts: in vivo study in rat calvaria. Biomed Res Int
2014;2014:104230.
14. da Silva RV, Camilli JA. Repair of bone defects treated with
References
autogenous bone graft and low-power laser. J Craniofac
1. Ashman A. Postextraction ridge preservation using Surg 2006;17:297-301.
synthetic alloplast. Implant Dent 2000;9:168-76. 6FEB: 4IJNJ[V/&GGFDUTPGQVMTFGSFRVFODZPGMPXMFWFM
XXXIV
laser therapy (LLLT) on bone nodule formation in rat histomorphometric analysis and micro-computed
calvarial cells. J Clin Laser Med Surg 2003;21:271-77. tomography analysis in AdBMP-2 induced bone
16. Coombe AR, Ho CTG, Darendeliler MA, Hunter N, regeneration in rat calvarial defects. J Periodontal Implant
1IJMJQT+3 $IBQQMF$$ :VN-85IFFGGFDUTPGMPXMFWFM Sci 2011;41:218-26.
laser irradiation on osteoblastic cells. Clin Orthod Res 28. Huang D, Swanson EA, Lin CP, Schuman JS, Stinson
2001;4:3-14. 8( $IBOH8 )FF.3 'MPUUF5 (SFHPSZ, 1VMJBòUP
17. Garcia VG, da Conceição JM, Fernandes LA, de Almeida CA, Fujimoto JG. Optical coherence tomography. Science
JM, Nagata MJH, Bosco AF, Theodoro LH. Effects of 1991;254:1178-81.
LLLT in combination with bisphosphonate on bone 29. Drexler W, Liu M, Kumar A, Kamali T, Unterhuber
healing in critical size defects:a histological and histometric A, Leitgeb RA. Optical coherence tomography
study in rat calvaria. Lasers Med Sci 2013;28:407-14. today:speed, contrast, and multimodality. J Biomed Opt
18. Silva Júnior AN, Pinheiro AL, Oliveira MG, Weismann R, 2014;19:071412.
Ramalho LM, Nicolau RA. Computerized morphometric 30. Feldchtein F, Gelikonov V, Iksanov R, Gelikonov G,
assessment of the effect of LLLT on bone repair:an Kuranov R, Sergeev A, Gladkova N, Ourutina M, Reitze D,
experimental animal study. J Clin Laser Med Surg Warren J. In vivo OCT imaging of hard and soft tissue of
2002;20:83-7. the oral cavity. Opt Express 1998;3:239-50.
19. Kipshidze N, Nikolaychic V, Keelan MH, Shankar LR, 31. Podoleanu AG, Rosen RB. Combinations of techniques in
Khanna A, Kornowski R, Leon M, Moses J Low power imaging the retina with high resolution. Prog Retin Eye
helium:neon laser irradiation enhances production Res 2008;27:464-99.
of vascular endothelial growth factor and promotes 32. Lee KS, Zhao H, Ibrahim SF, Meemon N, Khoudeir L,
growth of endothelial cells in vitro. Lasers Surg Med Rolland JP. Three-dimensional imaging of normal skin and
2001;28:355-64. nonmelanoma skin cancer with cellular resolution using
-VHFS&+ 3PDILJOE4 8PMMNBO: ,PHBO( %FLFM4 Gabor domain optical coherence microscopy. J Biomed
Effect of low power laser irradiation on the mechanical Opt 2012;17:126006.
properties of bone fracture healing in rats. Lasers Surg +POFT34 4UBOJOFD. 'SJFE%*NBHJOHBSUJòDJBMDBSJFT
Med 1998;22:97-102. under composite sealants and restorations. J Biomed Opt
21. Pyczek M, Sopala M, Dabrowski Z. Effect of low energy 2004;9:1297-304.
laser power on the bone marrow of the rat. Folia Biol 34. Queiroz de Melo Monteiro G, Montesa MAJR, Gomes
(Krakow) 1994;42:151-6. ASL, Motac CBO, Sérgio L, Freitas AZ. Marginal analysis
22. Pinheiro AL, Gerbi ME. Photoengineering of bone repair of resin composite restorative systems using optical
processes. Photomed Laser Surg 2006;24:169-78. coherence tomography. Dent Mat 2011;27:213-23.
7MBEJNJSPW:" 0TJQPW"/ ,MFCBOPW(*1IPUPCJPMPHJDBM 35. Canjau S, Todea C, Negrutiu ML, Sinescu C, Topala
principles of therapeutic applications of laser radiation. FI, Marcauteanu C, Manescu A, Duma VF, Bradu A,
Biochemistry 2004;69:81-90. Podoleanu AG. Optical Coherence Tomography for Non-
24. Brugnera A, dos Santos A, Bologna E, Ladalardo T. Atlas Invasive ex vivo Investigations in Dental Medicine - a Joint
of Applied laser therapy to clinical dentistry. São Paulo: Group Experience (Review). Sovrem Tekhnologii Med
Quintessence Editoria LTDA, 2006. 2015;7:97-114.
25. Ribeiro TP, Nascimento SB, Cardoso CA, Hage 36. Oancea R, Bradu A, Sinescu C, Negru RM, Negrutiu
R, Almeida JD, Loschiavo Arisawa EA. Low- ML, Antoniac I, Duma VF, Podoleanu AG. Assessment
Level Laser Therapy and Calcitonin in Bone of the sealant/tooth interface using optical coherence
Repair:Densitometric Analysis. Int J Photoenergy 2012. tomography. J Adhes Sci Technol 2015;29:49-58.
doi: 10.1155/2012/829587. "EMFS%$ $IFO: )VCFS3 4DINJUU+ $POOPMMZ+
26. Deniz E, Arslan A, Diker N, Olgac V, Kilic E. Evaluation Fujimoto JG. Three-dimensional endomicroscopy
of light-emitting diode photobiomodulation on bone using optical coherence tomography. Nat Photonics
healing of rat calvarial defects. Biotechnol Biotechnol 2007;1:709-16.
Equip 2015;29:758-65. 38. Dsouza R, Subhash H, Neuhaus K, Kantamneni R,
1BSL4: ,JN,) ,PP,5 -FF,8 -FF:. $IVOH McNamara PM, Hogan J, Wilson C, Leahy M. Assessment
$1 4FPM:+5IFFWBMVBUJPOPGUIFDPSSFMBUJPOCFUXFFO of curing behavior of light-activated dental composites
XXXV
using intensity correlation based multiple reference optical tomography, microcomputed tomography, and histology
coherence tomography. Lasers Surg Med 2016;48 77-82. at a three-dimensionally imaged trabecular bone sample. J
39. Dikshit S, Grover HS, Bhardwaj A, Saini R. Optical Biomed Opt 2010;15:046019.
Coherence Tomography - A Boon for Dental Diagnostics. 48. Luca R, Todea CD, Duma VF, Bradu A, Podoleanu AG.
BBB 2015;3:239-52. Twelve-image view for a pair of images formed from
40. Santin SP, Ubirajara Santos LA, Freitas AZ, Martinho J, Group A and Group C. Asvide 2019;6:144. Available
Dias DB, Soares FAN, Pino ES, Noronha Veloso MN, online: http://www.asvide.com/article/view/31954
Mathor MB. Comparison between optical coherence 49. Luca R, Todea CD, Duma VF, Bradu A, Podoleanu
tomography technique and mechanical compression assay to AG. Example of the use of the software developed to
evaluate ionizing radiation effects in frozen and lyophilized quantify the newly-formed bone, establishing ranges for
bone tissue. Brazil. November 24-29. INAC 2013. the brightness of different types of bone, and generating
41. Rashidifard C, Vercollone C, Martin S, Liu B, Brezinski TQFDJòDQFSDFOUBHFTGPSFWFSZDBUFHPSZ"TWJEF
ME. The application of optical coherence tomography in Available online: http://www.asvide.com/article/
musculoskeletal disease. Arthritis 2013;2013:563268. view/31955
42. Ionita I. Optical coherent tomography imaging usefulness 50. Bosco AF, Faleiros PL, Carmona LR, Garcia VG,
in implant tissue study. Rom Rep Phys 2009;61:575-80. Theodoro LH, de Araujo NJ, Nagata MJ, de Almeida
43. Sanda M, Shiota M, Imakita C, Sakuyama A, Kasugai JM. Effects of low-level laser therapy on bone healing
4 4VNJ:5IFFGGFDUJWFOFTTPGPQUJDBMDPIFSFODF of critical-size defects treated with bovine bone graft. J
tomography for evaluating peri-implant tissue:A pilot Photochem Photobiol B 2016;163:303-10.
study. Imaging Sci Dent 2016;46:173-8. 51. Khadra M, Kasem N, Haanaes HR, Ellingsen JE,
44. NegruĠiu ML, Sinescu C, Canjau S, Manescu A, Topala FI, Lyngstadaas SP. Enhancement of bone formation in
Hoinoiu B, Romînu M, MarcauĠeanu C, Duma V-F, Bradu rat calvarial bone defects using low-level laser therapy.
A, Podoleanu A Gh. Bone regeneration assessment by Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod
optical coherence tomography and MicroCT synchrotron 2004;97;693-700.
radiation. Proc SPIE 2013;8802:880204. 52. Fekrazad R, Sadeghi Ghuchani M, Eslaminejad MB,
45. Podoleanu AG, Bradu A Master-slave interferometry Taghiyar L, Kalhori KAM, Pedram MS, Shayan AM,
for parallel spectral domain interferometry sensing and Aghdami N, Abrahamse H. The effects of combined low
versatile 3D optical coherence tomography Opt Express level laser therapy and mesenchymal stem cells on bone
2013;21:19324-38. regeneration in rabbit calvarial defects. J Photochem
46. Duma VF. Laser scanners with oscillatory elements:Design Photobiol B 2015;151:180-5.
and optimization of 1D and 2D scanning functions. Appl 4FMMB73( #PNòN'3$% .BDIBEP1$% .PSTPMFUP
Mathematical Modelling 2019;67:456-76. .+ $IPIò. 1MBQMF)&GGFDUPGMPXMFWFMMBTFSUIFSBQZ
47. Kasseck C, Kratz M, Torcasio A, Gerhardt NC, van on bone repair: a randomized controlled experimental
Lenthe H, Gambichler T, Hoffmann K, Jones D, study. Lasers Med Sci 2015;30:1061-8.
Hofmann MR. Comparison of optical coherence
Cite this article as: Luca RE, Todea CD, Duma VF, Bradu
A, Podoleanu AG. Quantitative assessment of rat bone
regeneration using complex master-slave optical coherence
tomography. Quant Imaging Med Surg 2019;9(5):782-798.
10.21037/qims.2019.05.03
XXXVI
PROCEEDINGS OF SPIE
SPIEDigitalLibrary.org/conference-proceedings-of-spie
)URQW0DWWHU9ROXPH
)URQW0DWWHU9ROXPH3URF63,(6HYHQWK,QWHUQDWLRQDO
&RQIHUHQFHRQ/DVHUVLQ0HGLFLQH$XJXVWGRL

(YHQW6HYHQWK,QWHUQDWLRQDO&RQIHUHQFHRQ/DVHUVLQ0HGLFLQH
7LPLVRDUD5RPDQLD
'RZQORDGHG)URPKWWSVZZZVSLHGLJLWDOOLEUDU\RUJFRQIHUHQFHSURFHHGLQJVRIVSLHRQ7HUPVRI8VHKWWSVZZZVSLHGLJLWDOOLEUDU\RUJWHUPVRIXVH
XXXVII
PROGRESS IN BIOMEDICAL OPTICS AND IMAGING

Vol. 19 No. 59

Seventh International Conference

on Lasers in Medicine

Darinca Carmen Todea
Adrian Gh. Podoleanu
Virgil-Florin Duma
Editors
13–15 July 2017

Timisoara, Romania
Organized by
Romanian Society for Lasers in Dentistry (Romania)
University of Medicine and Pharmacy Victor Babes Timisoara (Romania)
Sponsored by
Romanian Society for Lasers in Dentistry (Romania)
Published by
SPIE
Volume 10831

Proceedings of SPIE, 1605-7422, V. 10831
SPIE is an international society advancing an interdisciplinary approach to the science and application of light.
6HYHQWK,QWHUQDWLRQDO&RQIHUHQFHRQ/DVHUVLQ0HGLFLQHHGLWHGE\'DULQFD&DUPHQ7RGHD
$GULDQ*K3RGROHDQX9LUJLO)ORULQ'XPD3URFRI63,(9RO
63,(ā&&&FRGHāGRL
3URFRI63,(9RO
'RZQORDGHG)URPKWWSVZZZVSLHGLJLWDOOLEUDU\RUJFRQIHUHQFHSURFHHGLQJVRIVSLHRQ
7HUPVRI8VHKWWSVZZZVSLHGLJLWDOOLEUDU\RUJWHUPVRIXVH
XXXVIII
The papers in this volume were part of the technical conference cited on the cover and title page.
Papers were selected and subject to review by the editors and conference program committee.
Some conference presentations may not be available for publication. Additional papers and
presentation recordings may be available online in the SPIE Digital Library at SPIEDigitalLibrary.org.
The papers reflect the work and thoughts of the authors and are published herein as submitted. The
publisher is not responsible for the validity of the information or for any outcomes resulting from
reliance thereon.
Please use the following format to cite material from these proceedings:
Author(s), "Title of Paper," in Seventh International Conference on Lasers in Medicine, edited by
Darinca Carmen Todea, Adrian Gh. Podoleanu, Virgil-Florin Duma, Proceedings of SPIE Vol. 10831
(SPIE, Bellingham, WA, 2018) Seven-digit Article CID Number.
ISSN: 1605-7422
ISSN: 2410-9045 (electronic)
ISBN: 9781510622876
ISBN: 9781510622883 (electronic)
Published by
SPIE
P.O. Box 10, Bellingham, Washington 98227-0010 USA
Telephone +1 360 676 3290 (Pacific Time)· Fax +1 360 647 1445
SPIE.org
Copyright © 2018, Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers.
Copying of material in this book for internal or personal use, or for the internal or personal use of
specific clients, beyond the fair use provisions granted by the U.S. Copyright Law is authorized by
SPIE subject to payment of copying fees. The Transactional Reporting Service base fee for this
volume is $18.00 per article (or portion thereof), which should be paid directly to the Copyright
Clearance Center (CCC), 222 Rosewood Drive, Danvers, MA 01923. Payment may also be made
electronically through CCC Online at copyright.com. Other copying for republication, resale,
advertising or promotion, or any form of systematic or multiple reproduction of any material in this
book is prohibited except with permission in writing from the publisher. The CCC fee code is 1605-
7422/18/$18.00.
Printed in the United States of America.
Publication of record for individual papers is online in the SPIE Digital Library.
SPIEDigitalLibrary.org
Paper Numbering: Proceedings of SPIE follow an e-First publication model. A unique citation
identifier (CID) number is assigned to each article at the time of publication. Utilization of CIDs
allows articles to be fully citable as soon as they are published online, and connects the same
identifier to all online and print versions of the publication. SPIE uses a seven-digit CID article
numbering system structured as follows:
The first five digits correspond to the SPIE volume number.
The last two digits indicate publication order within the volume using a Base 36 numbering
system employing both numerals and letters. These two-number sets start with 00, 01, 02, 03, 04,
05, 06, 07, 08, 09, 0A, 0B … 0Z, followed by 10-1Z, 20-2Z, etc. The CID Number appears on each
page of the manuscript.

3URFRI63,(9RO
RZQORDGHG)URPKWWSVZZZVSLHGLJLWDOOLEUDU\RUJFRQIHUHQFHSURFHHGLQJVRIVSLHRQ
HUPVRI8VHKWWSVZZZVSLHGLJLWDOOLEUDU\RUJWHUPVRIXVH
XXXIX
Contents
v Authors
vii Conference Committee
ix Introduction

SESSION 1 LASERS IN DENTISTRY
10831 04 Day by day usage of lasers in dental offices [10831-5]
10831 05 Marginal fit of CAD CAM all ceramic inlays: preliminary study [10831-6]
10831 06 The effect of the abutment occlusal convergence angles on the accuracy of digital and
conventional impressions [10831-7]
10831 07 Mechanical approach of metal-ceramic crowns obtained with laser-based additive

manufacturing methods [10831-9]
10831 08 Corrosion behavior of dental alloys processed by laser-based additive manufacturing

procedures [10831-10]
10831 09 Fluorescence influence on screening decisions for oral cancer [10831-37]
10831 0A Animal models in guided bone regeneration using photobiomodulation: general aspects and
particularities influencing the studies outcome - a review [10831-33]
10831 0B Photodynamic therapy in periodontology: a systematic review [10831-36]
10831 0C Comparative study of the efficiency of optical diagnostics in residual caries determination: in
vivo study [10831-39]
SYSTEMS, DEVICES, AND APPLICATIONS OF OPTICAL COHERENCE TOMOGRAPHY FOR

SESSION 2
BIOMEDICAL IMAGING
10831 0D From Doppler to speckle variance measurements in optical coherence tomography

(Invited Paper) [10831-30]
10831 0E Current capabilities and challenges for optical coherence tomography as a high impact non-
destructive imaging modality (Invited Paper) [10831-11]
10831 0F Design considerations for ease of access and maneuverability of OCT imaging platforms in the
oral cavity (Invited Paper) [10831-22]
LLL
3URFRI63,(9RO
XL
10831 0I Photonic techniques for brain imaging (Invited Paper) [10831-26]
10831 0J Two-dimensional OCT-relaxography of collagenous tissues [10831-2]
10831 0K Quantitative compressional OCE: obviating pitfalls in using pre-calibrated compliant layers
and some other practical obstacles [10831-8]
10831 0L Aspects of vignetting in a polygon mirror-based spectral filter for swept source optical
coherence tomography (SS-OCT) [10831-17]
10831 0M Biomimetic Tizian 'table tops' analyzed with swept source optical coherence tomography
[10831-18]
10831 0N Confocal laser scanning microscopy versus digital microscopy in the analysis of the marginal
adaptation of Tizian overlays [10831-19]
10831 0O Optoelectronic evaluation of indirect dental veneers interfaces [10831-23]
10831 0P Optical coherence tomography study regarding the enamel structure before and after
debonding [10831-24]
10831 0Q Evaluation of biodentine: tooth structures interfaces using laser scanning confocal microscopy
[10831-25]
10831 0R Fundamentals and biomedical applications of photonic crystals: an overview [10831-15]
10831 0S Roughness measurements using optical coherence tomography: a preliminary study

[10831-27]
10831 0T Modern evaluation of the quality of the techniques of root canal dental obturation [10831-47]
LY
3URFRI63,(9RO
XLI
Authors
Numbers in the index correspond to the last two digits of the seven-digit citation identifier (CID) article
numbering system used in Proceedings of SPIE. The first five digits reflect the volume number. Base 36
numbering is employed for the last two digits and indicates the order of articles within the volume.
Numbers start with 00, 01, 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 0A, 0B...0Z, followed by 10-1Z, 20-2Z, etc.
Abuabboud, Lina, 0T Pricop, Cristiana, 06

Beiu, Roxana-Mariana, 0R Pricop, Marius, 09
Beiu, Valeriu, 0I, 0R Puscu, Simona, 0T
Bîrdeanu, Mihaela, 08 Rajendram, Ranjan, 0D
Boariu, Marius, 0Q Rivet, Sylvain, 0E
Boloü, Adrian, 07 Romînu, Mihai, 0O, 0P, 0Q
Bradu, Adrian, 0D, 0E, 0M, 0O, 0P, 0S Rotar, Raul, 06
Canjau, Silvana, 09 Rusu, Lucian, 07
Caujolle, Sophie, 0D Savencu, Cristina E., 07, 08
Cernat, Ramona, 0D Shabanov, Dmitry V., 0J
Cirligeriu, Laura Elena, 0Q Sinescu, Cosmin, 09, 0M, 0N, 0O, 0P, 0Q, 0T
Constantin, George D., 0A Sirotkina, Marina A., 0J, 0K
Demian, Dorin, 0S Sovetsky, Alexandr A., 0J, 0K
Dimb, Alexandru-Lucian, 0S Stan, Adrian Tudor, 0N, 0Q
Dobre, George, 0F, 0L Stoica, Eniko Tunde, 0M, 0N
Doda, Adina, 0C Szuhanek, Camelia, 0P
Druzhkova, Irina N., 0J Toader, Marius, 0M
Duma, Virgil-Florin, 09, 0L, 0M, 0N, 0O, 0P, 0Q, 0R, Todea, Carmen Darinca, 09, 0A, 0B, 0C, 0P
0S Topala, Florin, 05, 0M, 0N, 0O, 0P
Everson, Michael, 0L Tudor, Anca, 0C
Gavrilovici, Andrei-Mihai, 04, 05, 06 Vaduva, Adrian, 0N, 0Q
Gelikonov, Grigory V., 0J, 0K Vitkin, Alex, 0J, 0K
Gelikonov, Valentin M., 0J Zagaynova, Elena V., 0J, 0K
Gladkova, Natalia D., 0J, 0K Zaitsev, Vladimir Yu., 0J, 0K
Goguta, Luciana, 05, 06
Gubarkova, Ekaterina V., 0J, 0K
HaĦegan, Simona, 04
Hutiu, Gheorghe, 0S
Jivanescu, Anca, 04, 05, 06
Karashtin, Dmitry A., 0J
Luca, Ruxandra-Elena, 0A, 0B, 0C
Marcauteanu, Corina, 0M, 0N
Marinescu, Adrian, 0Q
MĆroiu, A.-C., 0O
Marques, Manuel, 0D, 0E
Matveev, Lev A., 0J, 0K
Matveyev, Alexander L., 0J, 0K
Mitroi, Felicia Elena, 0M, 0N
Mocuta, Daliana Emanuela, 0A, 0B, 0C
Muntean, Danina, 0N
Munteanu, Ioana-Roxana, 0A, 0B

NegruĦiu, Meda-Lavinia, 04, 0M, 0N, 0O, 0P, 0Q,

0T
Nica, Luminita, 0Q, 0T
Orel, Laura, 0T
Podoleanu, Adrian Gh., 0D, 0E, 0M, 0O, 0P, 0S, 0T
Pop, Oana, 0P
Porojan, Liliana, 07, 08
Porojan, Sorin D., 07, 08
3URFRI63,(9RO
XLII
!"#$!%&$'()%*&#"&+,#()(&-'")&.)+)").!/#'"&,*#"+&01'/'-#'$'(,%!/#'"2&
+)").!%&!*0)3/*&!"(&0!./#3,%!.#/#)*&#"4%,)"3#"+&/1)&*/,(#)*&',/3'$)2&
!&.)5#)6&
#$%&'()&"*$+&!,"-&)./'"0&)1'+&"23(/&!,"4/3)5/"0"-3'67&'71'!,"
0&81&'&"93+$7&!","#3%&'&"9$'7/&'$!"
!
:1+73)";&</6"='1>?"3@"9/(1+1'/"&'("AB&).&+C"3@"21.163&)&,"#3.&'1&"
"
789:;<=>?&&'1.&8".3(/8,"+)171+&8"61D/"(/@/+7,"<3'/")/5/'/)&713',"EB373<13.3($8&713'&
#@A<;=BCAD;@&
2B/"B/&81'5"E)3+/66"3@"<3'/"(/@/+76"16"71./"+3'6$.1'5,"&'("'/F"<3'/"5/'/)&713'"7&G/6"E8&+/"683F8C"
</+&$6/"3@"(/+)/&6/("<833("6$EE8C"73"7B/"@)&+7$)/"617/"&'("1'6$@@1+1/'+C"3@"+&8+1$."&'("EB36EB3)$6"73"
67)/'57B/'"&'("B&)(/'"'/F"<3'/?"H'"&((1713',"8&)5/"(/@/+76,"&863"G'3F'"&6"+)171+&8"<3'/"(/@/+76,".&C"
'37" B/&8" 6E3'7&'/3$68C" &'(" 8/&(" 73" '3'$'13'" E)35'3616" ($/" 73" 7B/" 61D/" 3@" (/@/+76" 3)" $'67&<8/"
<13./+B&'1+&8"E)3E/)71/6,"$'@&>3)&<8/"F3$'("/'>1)3'./'7,"6$<3E71.&8"6$)51+&8"7/+B'1I$/,"./7&<381+"
@&+73)6,"B3).3'/6,"'$7)1713',"&'("&EE81/("67)/66"J!,KL?"
93(/)'"(/'7167)C"16"@&+1'5"7B/"+B&88/'5/"3@")/+3>/)1'5"7B/"<3'/"8366"($/"73">&)13$6"@&+73)6,"FB1+B"8/("
73" &'" /%B&$671>/" )/6/&)+B" 1'" 7B/" @1/8(" 3@" <3'/" &$5./'7&713'" E)3+/($)/6," /6E/+1&88C" 5)&@71'5" &'("
EB373<13/'51'//)1'5?""
2B/" 1(/&8" <3'/" 5)&@7" 6$<6717$7/6" 6B3$8(" </" <13+3.E&71<8/," <13)/63)<&<8/," 367/3+3'($+71>/,"
367/31'($+71>/,"67)$+7$)&88C"61.18&)"73"'&7$)/"<3'/,"&'("/&6C"3)")/&(C"73"$6/?J!L"
2B/"(/>/83E./'7"3@">&)13$6"<3'/"&$5./'7&713'".&7/)1&86"&'("E)373+386"@3)"3)&8"6$)5/)C"B&6"<)3$5B7"
'/F"+B&88/'5/6,"&'("/%E/)1./'7&8".3(/86"'//("73")/6E3'("1..$'38351+&88C"&'("+/88$8&)".3)/"+836/8C"
73" B$.&'" 6$<M/+76?" 93)/3>/)," 7B/" $6/" 3@" 83F" 1'7/'617C" 815B7" 7B/)&EC" B&6" <//'" E)3>/'" 73" .3($8&7/"
(1@@/)/'7"+/88$8&)"@$'+713'6,"1'@8$/'+1'5"7B/"E)3+/66"3@"<3'/")/E&1)?"AB373<13.3($8&713'"7B/)&EC"B&6"
<//'"6B3F'"73"671.$8&7/"+/88"E)381@/)&713',"&'5135/'/616,"&'("7B/"6C'7B/616"3@"+388&5/'"&'("73"671.$8&7/"
.&+)3EB&5/6" &'(" 8C.EB3+C7/6" @3).&713'," &++/8/)&71'5" &'(" 1.E)3>1'5" 7B/" <3'/" B/&81'5" E)3+/66,"
/6E/+1&88C"1'"7B/"1'@8&..&73)C"EB&6/?"N7$(1/6"1'>/6715&71'5"7B/")38/"3@"EB373<13.3($8&713'"1'"<3'/"
)/5/'/)&713'" B&>/" (1@@/)/'7" )/6$876," (/E/'(1'5" 3'" 7B/" (36/," 71./" &'(" .3(/" 3@" 1))&(1&713'," 3'" 7B/"
.&7/)1&86"&'("7/+B'1I$/6"FB1+B"&)/"</1'5"$6/("&'("'37"8/&67,"3'"7B/"&'1.&8".3(/8"E&)71+$8&)171/6?"2B16"
+3.E8/%" 67$(1/6" +&$6/(" 7B/" '//(" @3)" &'1.&8" .3(/86" 7B&7" F3$8(" </" &<8/" 73" .//7" 7B/" 1.E36/("
)/I$1)/./'76?"
H'171&88C,"7B/)/"F/)/"!"#$!%&'"67$(1/6")/5&)(1'5"7B/"8&6/)")&(1&713'"FB1+B"F/)/"+3'($+7/("3'"<3'/"+/886"
1'" +$87$)/O" (1@@/)/'7" F&>/8/'57B6" F/)/" $6/(" PQRS" '.," TUS'.," QUK'.V," F17B" (1@@/)/'7" E)373+386"
)/5&)(1'5"7B/"71./,"7B/"E/)13("&'("7B/"(36/"3@"1))&(1&713'"JU,W,XL?"Y/>/)7B/8/66,"7B/C"&88"+3'+8$(/("7B&7"
8&6/)" 7B/)&EC" 1'+)/&6/6" 7B/" '$.</)" 3@" .3)/" (1@@/)/'71&7/(" 367/3<8&671+" +/886" JQ,ZL" 671.$8&71'5" +/88"
6HYHQWK,QWHUQDWLRQDO&RQIHUHQFHRQ/DVHUVLQ0HGLFLQHHGLWHGE\'DULQFD&DUPHQ7RGHD
$GULDQ*K3RGROHDQX9LUJLO)ORULQ'XPD3URFRI63,(9RO$
63,(ā&&&FRGHāGRL
3URFRI63,(9RO$
"
XLIII
E)381@/)&713'," <3'/" '3($8/" @3).&713'," @3883F/(" <C" 367/35/'1+" .&)G/)6[" \*A" 5/'/" /%E)/6613'" JTL,"
367/3E3'71'" &'(" <3'/" 61&83E)37/1'" JW,RL?" \'37B/)" 61.18&)" 67$(C" +3'+8$(/(" 7B&7" &@7/)" RQB" 7B/" +/88"
E)381@/)&713'" F&6" 3<>13$6," 735/7B/)" F17B" B15B/)" 8/>/86" 3@" 7)&'6@3).1'5" 5)3F7B" @&+73)];!," &'("
367/3+&8+1',"FB1867"\*A"8/>/86"F/)/"'37"615'1@1+&'78C"(1@@/)/'7"</7F//'"7B/"67$(C"5)3$E6"JX,RL?""
2B/"6&./"&6E/+76"F/)/"1'>/6715&7/("7B)3$5B3$7".&'C"!"#$!$'"67$(1/6,"$61'5"(1@@/)/'7"&'1.&8".3(/86,"
F&>/8/'57B6"&'("1))&(1&713'"E)373+386?"2B/".&M3)17C"3@"7B/"67$(1/6"+3'+8$(/("1.E)3>/./'7"1'"7B/"/&)8C"
67&5/6" 3@" 7B/" B/&81'5" E/)13(" J!SL," F17B" 615'1@1+&'7" (1@@/)/'+/6" 1'" 7B/" +&8+1$." BC()3%C&E&717/"
+3'+/'7)&713',"1'"7B/"'/F8C"@3)./("<3'/"I$&'717C"&'("&863"1'"7B/"I$&'717C"3@"7B/"+388&5/'"@1</)6"J!!L"
^7B/)"67$(1/6"J!KL"3<6/)>/("1'+)/&6/(".1'/)&81D&713'"1'"7B/"8&6/)"7)/&7/("5)3$E6"&'("1'+)/&6/("8/>/86"
3@"+&8+1$.,"EB36E3)$6"&'("E)37/1'6"+3.E&)/("73"7B/"$'7)/&7/("5)3$E6?""J!UL?""
2B/";)&D181&'")/6/&)+B"5)3$E"3@"A1'B/1)3"J!WL"B&6"+3'($+7/("(1@@/)/'7"67$(1/6"1'>/6715&71'5"E)373+386"
@3)" 1.E)3>1'5" 7B/" <3'/" )/E&1)" E)3+/66" $61'5" EB373<13.3($8&713'?" 2B/C" $6/(" &'" TUS'." 1'@)&)/("
F&>/8/'57B"8&6/)"3'")&76"&'(")&<<176"<3'/"(/@/+76,"FB1+B"F/)/"7)/&7/("@3883F1'5"(1@@/)/'7"E)373+386"
&'(" $61'5" (1@@/)/'7" .&7/)1&86?" ^'/" 3@" 7B/1)" 67$(1/6" )/E3)7/(" &'" 1'+)/&6/(" &.3$'7" 3@" '/F8C" @3)./("
<3'/"&@7/)"8&6/)"$6&5/"1'")&76"<3'/"(/@/+76"J!XL,"FB1867"&'37B/)"67$(C")/>/&8/("7B&7"1'"7B/"/&)8C"67&5/6"
3@"7B/"B/&81'5"E/)13("(1@@/)/'+/6"1'"<3'/"3)5&'1D&713'"&'(">&6+$8&)1D&713'"F/)/"(/7/+7&<8/,"<$7"&@7/)"
WX"(&C6"7B/"(1@@/)/'+/6"</7F//'"7B/"1))&(1&7/("&'("7B/"'3']1))&(1&7/("5)3$E6"F/)/"1'615'1@1+&'7?"J!QL"
*&7/)" 67$(1/6" 3@" 7B/" 6&./" )/6/&)+B" 5)3$E" 1'>/6715&7/(" 7B/" +3'+/'7)&713'" 3@" +&8+1$." BC()3%C&E&717/"
&)3$'("(/'7&8"1.E8&'76"E8&+/("1'")&<<176"71<1&"&'("+3'+8$(/("7B&7"***2"1.E)3>/("7B/"<3'/"B/&81'5,"
1'+)/&61'5"7B/"-_\"+3'+/'7)&713'?"J!ZL?"2B/C"B&>/"&863"&66/66/("7B/"/@@/+7"3@"TUS"'."8&6/)")&(1&713'"
3'"<3'/"(/@/+76"FB1+B"F/)/"5)&@7/("F17B"(1@@/)/'7".&7/)1&86["3'"&")&7".3(/8"7B/C"B&>/"$6/("1'3)5&'1+"
<3>1'/"<3'/"&'("7B/C"+3'+8$(/("7B&7"7B/"1))&(1&7/("5)3$E"E)/6/'7/("<37B"1'+)/&6/("<3'/"@3).&713'"
&'("+388&5/'"@1</)6"J!TL?"2B/6/")/6$87/("F/)/")/E)3($+/("1'"&"67$(C"$61'5"1'3)5&'1+"<3>1'/"<3'/"5)&@7"
&663+1&7/(" F17B" (/+&8+1@1/(" <3>1'/" +3)71+&8" <3'/" ./.<)&'/" J!!L" `B/'" 7B/" 5)&@71'5" .&7/)1&86" F&6"
+B&'5/(,"$61'5"BC()3%C&E&717/"1'67/&("3@"<3>1'/"<3'/,"7B/")/6$876"6$55/67/("1.E)3>/("B/&81'5"&7"!X"
&'("K!"(&C6,"F17B"'3"615'1@1+&'7"(1@@/)/'+/6"&7"US"(&C6"J!RL?"2B/C"B&>/"&863"1'>/6715&7/("7B/"</B&>13)"
3@" <3'/" .3)EB3./7)1+" E)37/1'," 3)5&'1+" <3>1'/" <3'/" &'(" 5$1(/(" <3'/" )/5/'/)&713'" 1'" &" )&7" .3(/8"
FB1+B"F&6"1))&(1&7/("$61'5"***2?"2B/")/6$876"6B3F/("B16738351+&8"/>1(/'+/"3@"1'+)/&6/("(/E361713'"3@"
+388&5/'"@1</)6"P!X"&'("K!"(&C6V"&6"F/88"&6"&'"1'+)/&6/("&.3$'7"3@"F/88]3)5&'1D/("<3'/"7)&</+$81"&7"7B/"
/'("3@"7B/"/%E/)1./'7&8"E/)13("PUS"(&C6V"1'"1))&(1&7/("&'1.&86"+3.E&)/("73"'3'1))&(1&7/("+3'7)386?"H7"
F&6"+3'+8$(/("7B&7"7B/"&663+1&713'"3@"8&6/)"7B/)&EC"F17B";9A6,"3)5&'1+"<3>1'/"<3'/"5)&@76,"&'("4;#"
1'+)/&6/6"7B/"E36171>/"<13.3($8&71>/"/@@/+76"3@"8&6/)"815B7"JKSL?"a>/'"FB/'"1'>/6715&71'5"7B/"&$738353$6"
5)&@71'5"3@"7B/"<3'/"(/@/+76"1'"&")&7".3(/8,"7B/")/6$876")/5&)(1'5"7B/"8&6/)"7B/)&EC"6B3F/("&'"1.E)3>/("
<3'/" )/.3(/81'5" <37B" I$&'717&71>/8C" &'(" I$&817&71>/8C," 1'(1+&71'5" 7B&7" 7B/" $6/" 3@" 8&6/)" 7B/)&EC"
7)&'63E/)&71>/8C")/6$87/("1'"&"E36171>/"<13.3($8&71>/"/@@/+7"3'"7B/"B/&81'5"3@"<3'/"(/@/+76"&663+1&7/("
F17B"&$738353$6"<3'/"5)&@76?"JK!L"
\'1.&8" .3(/86" B&>/" 83'5" <//'" $6/(" 1'" 7B/" @1/8(" 3@" <3'/" B/&81'5" &'(" )/E&1)," 3)7B3E/(1+6" F3)G1'5"
/%7/'61>/8C"3'">&)13$6"@)&+7$)/"E&77/)'6"+)/&7/("1'"&'1.&86,"1'">1>3?"b3)"7B/6/"E$)E36/6"73"</"&+B1/>/(,"
7B/".367"+3..3'8C"$6/("&'1.&86"F/)/".1+/,")&76,"E156,"6B//E,"(356,"/&+B"E)/6/'71'5"61.18&)171/6"&'("
(1@@/)/'+/6" F17B" 7B/" B$.&'" )&+/?" 01)/+7" +3.E&)163'" </7F//'" &88" 7B/6/" 6E/+1/6" 16" '37" E3661<8/?" 2B/"
+B31+/"B&6"73"</".&(/"&@7/)"/67&<816B1'5"63./"5$1(/81'/6"&'("&">/)C"E)/+16/"&1."@3)"/&+B"67$(C,"B&>1'5"
1'".1'("<37B"61.18&)171/6"&'("(16+)/E&'+1/6"</7F//'"7B/"&'1.&8".3(/8"&'("7B/"B$.&'")/6E3'6/"73"7B/"
3URFRI63,(9RO$
"
XLIV
67$(1/(".&7/)1&86"3)"E)373+386?"JKKL"2B/)/@3)/,"17"16">/)C"1.E3)7&'7"73"B&>/"&88"7B/"1'@3).&713'"1'"3)(/)"
73"/67&<816B"&">/)C"&++$)&7/"6/8/+713'"3@"&'1.&8".3(/86?"
0B<E;>8&
2B16")/>1/F"&1.6"73"(16+$66"7B/".367"6$17&<8/"1'">1>3"<3'/"(/@/+7"&'1.&8".3(/86"FB1+B"+&'"</"$6/("1'"
E)/+81'1+&8"67$(1/6,"F17B"(1@@/)/'7"./7B3(38351/6"&'("E)373+386"@3)"5$1(/("<3'/")/5/'/)&713'"1'>38>1'5"
8&6/)")&(1&713'?"
$FA8<DFG>&F@=&H8AI;=&&
`/")/>1/F/("3>/)"XS")/+/'7"&)71+8/6"P@)3."7B/"8&67"T]!S"C/&)6V,")/5&)(1'5"7B/"$6/"3@"&'1.&8".3(/8"1'"
7B/")/6/&)+B"@1/8("3@"<3'/")/5/'/)&713'"&'("5$1(/("B/&81'5?"b&+73)6"@3)"+3'61(/)&713'"FB/'"+B3361'5"
&'"&'1.&8".3(/8"&)/"(16+$66/(?"
(D>CB>>D;@>&
2B/"+3'+/E7"3@"<13671.$8&713'"3@"F3$'(6"<C"83F]8/>/8"8&6/)"7B/)&EC"P***2V"16"&77)&+71'5"+3'61(/)&<8/"
&77/'713'?"H'".&'C"/%E/)1./'7&8"67$(1/6"F&6")/E3)7/("7B&7"***2"/'B&'+/("7B/"&+71>17C"3@")/("<833("
+/886,".&+)3EB&5/6,"@1<)3<8&676,"+B3'()3+C7/6,"&'("367/3+8&676"F17B1'"7B/"@)&+7$)/"&)/&?"***2".&C"&863"
1'+)/&6/" 0Y\" &'(" #Y\" 6C'7B/616," 1'(1+&71'5" &'" /@@/+7" 3'" +/88" 5)3F7B" &'(" E)37/1'" 6C'7B/616?" H7" 16"
6$55/67/("7B&7"83F]8/>/8"8&6/)"1))&(1&713'")/6$876"1'"&"6.&88"&.3$'7"3@"61'58/7"3%C5/',"FB1+B"&+76"&6"&"
@)//")&(1+&8"7B&7"1'@8$/'+/6"7B/"@3).&713'"3@"&(/'361'/"7)1EB36EB&7/"P\2AV,"FB1+B"B&6"&'"1.E3)7&'7"
)38/" 1'" ./7&<3816.?" b$)7B/).3)/," 8&6/)" 1))&(1&713'" 16" &66$./(" 73" 1'7/'61@C" 7B/" @3).&713'" 3@"
7)&'6./.<)&'/"/8/+7)3+B/.1+&8"E)373'"5)&(1/'76"1'".173+B3'()1&?"2B$6,"7B/"/@@1+1/'+C"3@"7B/"E)373']
.371>/" @3)+/" 16" 1'+)/&6/(" &'(" .3)/" +&8+1$." 16" )/8/&6/(" @)3." 7B/" .173+B3'()1&" <C" &'" cc&'71E3)7dd"
E)3+/66?"2B/"&((1713'&8"+&8+1$."7)&'6E3)7/("1'73"7B/"+C73E8&6."16"</81/>/("73"7)155/)".173616"&'(e3)"
/'B&'+/"+/88"E)381@/)&713'?"\"'$.</)"3@"(1@@/)/'7"8&6/)6"F17B"(1@@/)/'7"F&>/8/'57B6,"1'+8$(1'5"B/81$.]
'/3'"PQUK?T"'.V,"5&881$.]&8$.1'$.]&)6/'1(/"PTSX"Q"KX"'.V,"&'("5&881$.&)6/'1(/"PRSW"'.V"B&>/"<//'"
$6/("1'"(1@@/)/'7"(36/6"&'("7)/&7./'7"6+B/($8/6?"2B/"$6/"3@"5&881$.]&8$.1'$.&)6/'1(/"P4&\8\6V"(13(/"
8&6/),"&6"1'"7B/"E)/6/'7"67$(C,"G1'("3@"8&6/)"16"G'3F'"73"B&>/"&"B15B"(/E7B"3@"E/'/7)&713'"1'"+3.E&)163'"
73"37B/)"7CE/6"&'("7B$6"3@@/)6"7B/"+81'1+1&'"&"E/'/7)&71>/"7338"3@"5)/&7"/@@1+1/'+C?"_1673+B/.1+&8"&'&8C616"
(16+836/(" 7B&7" ***2" 615'1@1+&'78C" 671.$8&7/(" 7B/" (/E361713'" 3@" +&8+1$.," EB36EB3)$6," &'(" 1'638$<8/"
E)37/1'" &7" <37B" !W" &'(" KT" (&C6" E3673E/)&71>/8C?" Y37&<8C," +&8+1$." &'(" EB36EB3)$6" (/E36176" 1'" 7B/"
B/&81'5"7166$/"1'"7B/"/%E/)1./'7&8"5)3$E"F/)/"B15B/)"!W"(&C6"E3673E/)&71>/8C"7B&'"1'"7B/"6B&.]7)/&7/("
5)3$E" KT" (&C6" E3673E/)&71>/8C?" 2B16" 67)3'58C" 1'(1+&7/6" 7B&7" &EE81+&713'" 3@" ***2" &++/8/)&7/6" 7B/"
.&7$)&713'"3@"'/F"<3'/"7166$/?"_16738351+&8"/%&.1'&713'"(16+836/("7B&7"&'5135/'/616"&'("5)3F7B"3@"
@1<)3<8&676" &'(" <3'/" F/)/" .3)/" E)3'3$'+/(" 1'" 7B/" 1))&(1&7/(" 5)3$E?" 2B$6," <37B" B1673+B/.1+&8" &'("
B16738351+&8"/>1(/'+/"1'(1+&7/"7B&7"***2"/'B&'+/6"./7&<3816."&'(e3)".1'/)&81D&713'"($)1'5"/&)8C"<3'/"
B/&81'5?"JKUL"
Y3"3>/)&88"+3'6/'6$6"/%1676"3@"FB&7"&)/">&8$&<8/"&'1.&8".3(/86"73"E)3>/"/'B&'+/./'7"3@"<3'/")/E&1)?"
\8.367" /&+B" )/6/&)+B" 5)3$E" $6/6" 176" 3F'" .3(/8" &'(," 7B/)/@3)/," )/6$876" &)/" 1.E3661<8/" 73" +3.E&)/"
(1)/+78C?";/+&$6/"<3'/"B&6"81.17/("<138351+&8">&)1&713'6"73")/&+7"73"671.$81,")/6$876".&C"</"@&86/8C"3)"
3>/)]1'7/)E)/7/(?" b3)" /%&.E8/," @1<)3616" &'(" <3'/" )/63)E713'" +&'" </" 7B/" )/6$87" 3@" <13./+B&'1+&8"
1'67&<1817C"&6"F/88"&6".1661'5"367/3+3'($+71>/"E)3E/)71/6"3@"&"6+&@@38(".&7/)1&8?"H7".&C"&863"</"($/"73"&"
3URFRI63,(9RO$
"
XLV
)&E1(".&7/)1&8"(/5)&(&713',"FB18/"<13+3.E&71<1817C"16"67188"E)/6/)>/(?"2B/)/@3)/,"&"67/E]F16/"&EE)3&+B"
16"E)/@/))/("73"&'6F/)"I$/6713'6"3@"<13+3.E&71<1817Ce6$17&<1817C"3@"&"'3>/8"<13.&7/)1&8?"";13+3.E&71<1817C"
166$/6" 6B3$8(" </" +8&)1@1/(" $61'5" &" <13./+B&'1+&88C" $'+B&88/'5/(" 617$&713'" JKK," KWL," FB/)/&6" 7B/"
6$17&<1817C"3@"&".&7/)1&8"+&'"</"7/67/("1'"&"./+B&'1+&88C"+B&88/'5/("(/@/+7".3(/81'5"83'5"<3'/6"&@7/)"
<13+3.E&71<1817C" B&6" <//'" &8)/&(C" &66/66/(" 1'" E)/>13$6" /%E/)1./'76" JKK,KX" L?" b3)" <37B," 7B/" +/88$8&)"
)/&+713'"P/?5?"E)/6/'+/"3@"1'@8&..&73)C".3'3]"&'("E38C'$+8/&)"+/886V,"7B/"'/F"<3'/"@3).&713'"&7"7B/"
6$)@&+/"&'("F17B1'"7B/".&7/)1&8"&)/"1.E3)7&'7"&83'5"F17B"7B/")/63)E713'"3@"7B/".&7/)1&8"176/8@?"JKKL"
\"E)/)/I$1617/"@3)"6$+B"&".3(/8"16"7B&7"'3"6E3'7&'/3$6"+3.E8/7/"366/3$6")/5/'/)&713'"3@"7B/"+)/&7/("
(/@/+76" 3++$)6" ($)1'5" 7B/" 81@/71./" 3@" 7B/" &'1.&86?" 2B/" +)171+&8" 61D/" (/@/+7" 16" (/@1'/(" &6" 7B/" 6.&88/67"
366/3$6"F3$'("7B&7"(3/6"'37"B/&8"6E3'7&'/3$68C"3>/)"&"83'5"E/)13("3@"71./?"b3)"E)&+71+&8"E$)E36/6,"1@"
7B/)/"16"'3".1'/)&816/("&)/&"3@"USf"&@7/)"XK"F//G6,"7B/)/"F3$8("'/>/)"</"+3.E8/7/"<3'C")/5/'/)&713'?"
JKQ,KZL""
#^0aY2N"
#3(/'76"B&>/"&'&73.1+&8"&(>&'7&5/6,"&6"7B/C"&)/"6.&88"1'"61D/"&'("/&6C"73"$6/?"2B/C"&)/"/8/+7/("1'"
E)/+81'1+&8"67$(1/6"@3)"7/671'5"<13.&7/)1&86"&'("7B/C"&)/"+3'61(/)/("7B/"@1)67"+B31+/".3(/86"@3)"1']>1>3"
67$(C"3@"<3'/")/5/'/)&713'?JKKL"2B/".&M3)"81.17&713'6"3@"7B16"7B16"&'1.&8".3(/8"16"7B/"@&+7"7B&7"7B/C"(3"
'37"6B3F"_&>/)61&'"7CE/"<3'/")/.3(/81'5,"+3.E&)1'5"F17B"8&)5/)"6E/+1/6?"2B/1)"<3'/6"&)/"6.&88,"F17B"
@)&518/"+3)71+/6"J!L"H'"'$(/".1+/,"&"+)171+&8"(/@/+7"3@"U".."@3)"7B/"71<1&8"<3'/"&'("W".."@3)"7B/"+&8>&)1&"
&)/"</1'5"&++/E7/(?"Pb15$)/"!V"
b15$)/"!?"-)171+&8"61D/"(/@/+76"1'")&76"+&8>&)1&,"($)1'5"3$)")/6/&)+B"3'"5$1(/("<3'/")/5/'/)&713'"$61'5"
EB373<13.3($8&713'"
H'")&76,"+&8>&)1&6")/513'"16"7B/".367"+3..3'"$6/("617/"JKTL,"<$7"17".&C")/6E3'("(1@@/)/'7"73".&%188&"3)"
.&'(1<8/" </+&$6/" (1671'+7" &'&73.1+" &6E/+76," &<$'(&'7" >&6+$8&)1D&713'" @)3." E/)1+&)(1$." &'("
1'+)/&6/("&'1.&8".3)7&817C"6/+3'(&)C"73"1'7)&3E/)&71>/"<)&1'"1'M$)1/6?"^'"7B/"37B/)"B&'(,".&'(1<8/"
(/@/+76"&)/"@)/I$/'78C"+)/&7/("1'")&.$6")/513',"&">/)C"7B1'"67)$+7$)/"7B&7".&G/"(1@@1+$87"7B/"+)/&713'"3@"
&" .3'3+3)71+&8" 7B1+G'/66" (/@/+7," &" @$'(&./'7&8" +B&)&+7/)1671+" 73" .&1'7&1'" 7B/" 7/67/(" 6$<67&'+/" 1'"
3URFRI63,(9RO$
"
XLVI
+3'7&+7"&'("6$EE3)7/("638/8C"<C"B&)("7166$/"JKR,US,U!L?"b/.$)"3@"`167&)")&76"16"&863"E3661<8/"73"</"$6/("
JUKL"<$7"176"+3)/"16">/)C"./($88&)"&'("1@"<13.&7/)1&8"16"E)3E36/("73"</"&EE81/("1'"B$.&'".&'(1<8/,"@/.$)"
6B3$8("</"(16+3$)&5/(?"9/7&<381+")&7/"3@"`167&)")&7".$67"&863"</"+3'61(/)/(O"7B/"6.&88/)"7B/"&'1.&8,"
7B/"B15B/)"7B/"./7&<381+")&7/"+3.E&)/("F17B"7B&7"3@"&"B$.&'["US"(&C6"3@".&'d6"81@/"+3))/6E3'("73"3'/"
(&C" 3@" )&7d6" 81@/" JUUL?" H7" ./&'6" 7B&7" 6B3)7/)" 3<6/)>&713'" E/)13(" 73" 3<7&1'" (&7&" 6&.E81'5" &)/" $6$&88C"
)/I$1)/("FB/'"6.&88"&'1.&86"&)/"$6/("1'67/&("3@"8&)5/)"3'/6,"61.E8C"</+&$6/"7B/C"B/&8"@&67/)?"*3'5"
E/)13(6"3@"3<6/)>&713'6"F3$8("E37/'71&88C"(/.3'67)&7/"<37B"7/67"&'("+3'7)38"5)3$E6"F17B"7B/"(/@/+76"
&(>&'+/(e+3.E8/7/"B/&8/(,"@&181'5"73"(16+836/"7B/"</'/@1+1&8"E37/'71&8"3@"&"<13.&7/)1&8"JKR,UWL?"
AH4N"
H6"16"5/'/)&88C"&++/E7/("7B&7"E156"&)/"7B/".367"61.18&)"&'1.&8".3(/8"73"B$.&'6,")/5&)(1'5"7B/"<3'/"
B/&81'5"E)3+/66,"<3'/"&'&73.C,"(/'617C"&'("8&./88&)"67)$+7$)/?"2B/1)"<3'/")/5/'/)&713'")&7/"16"!?Kg
!?X"h.e(,"+3.E&)&<8/"73"7B&7"3@"B$.&'6"P!?S"i!?X"h.e(V"JUXL?"2B/1)".&M3)"(16&(>&'7&5/6"1'+8$(/"61D/"
&'("(1@@1+$87"B&'(81'5,"<$7"7B16"166$/6"B&>/"@3$'("&"638$713'"7B)3$5B3$7"7B/"(/>/83E./'7"3@".1'1&7$)/"
E156"&'(".1+)3E156?"2B/"+)171+&8"61D/"(/@/+7"$6/("1'"E156"16"3@"!S"..,"&'("@3)".1'1"E156"16"W"..?"
N_aaA"
\87B3$5B"7B/".367"6$17&<8/"&'1.&8".3(/8"FB/'")/@/))1'5"73"61.18&)171/6"&)/"E156,"7B/1)"6B3)7"<3'/6"&'("
7B/1)"(1@@1+$87"B&'(81'5"B&>/"+3'($+7/("73"7B/"'//("@3)"&"(1@@/)/'7"&'1.&8".3(/8?"NB//E"16"61.18&)"73"
B$.&'6"@)3."7B/"F/15B7"E31'7"3@">1/F"&'("&863"</+&$6/"7B/C"B&>/"83'5"<3'/6,"6$17&<8/"@3)"7/671'5"
B$.&'" 1.E8&'76" &'(" E)367B/616" J!,UQL?" 2B/" .&+)367)$+7$)/" 16" >/)C" 61.18&)" 73" B$.&'6," <$7" @)3." 7B/"
B16738351+&8"E31'7"3@">1/F"7B/)/"&)/".&'C"(16+)/E&'+1/6?"2B/"<155/67"166$/"16"7B&7"6B//E"(3"'37"B&>/"
6/+3'(&)C"<3'/")/.3(/81'5"$'718"&'"&>/)&5/"&5/"3@"Z]R"C/&)6"J!,UQL"&'("7B/1)"7)&</+$88&)"<3'/"(/'617C"
16"5)/&7/)"7B&'"1'"B$.&'6?"
#\;;H2N"
#&<<176"&)/"+3..3'8C"$6/("&6"&'1.&8".3(/86"1'"<3'/")/6/&)+B"@1/8(,"</+&$6/"3@"7B/1)"6.&88"61D/6"&'("
&863" </+&$6/" 7B/C" B&>/" .1'/)&8" (/'617C" &'(" @)&+7$)/" 73$5B'/66" 61.18&)" 73" B$.&'6" J!L?" 2B/C" F/)/"
+3'($+7/(".&'C"67$(1/6")/5&)(1'5"<3'/"6$<6717$713'".&7/)1&86"3'")&<<176,"$61'5"&"Z".."+)171+&8"61D/"
(/@/+7?""\6"A/&)+/")/>1/F/(,"/%+/E7"@3)")3(/'76,"7B/")&<<17"16"7B/"6E/+1/6"F17B"7B/"8/&67"61.18&)17C"73"
B$.&'6"FB/'"17"+3./6"73"B16738351+&8"<3'/"67)$+7$)/"&'(")/.3(/881'5?"JUZL"2B/")/&63'"</C3'("7B16"16"
7B&7")&<<17"83'5"<3'/6"&)/"5/'/)&88C".&(/"3@"E)1.&)C"<3'/"7166$/"+3.E&)/("73"7B/"6/+3'(&)C"<3'/6"1'"
B$.&'6"JUTL?"
H7"16"7B/)/@3)/"3<>13$6"7B/"'//("@3)"+/)7&1'"5$1(/81'/6")/5&)(1'5"7B/"$6/"3@"&'1.&8".3(/8"1'"7B/"6+1/'71@1+"
)/6/&)+B?" ;)15177/" >3'" #/+B/'</)5" B15B815B7/(" 1'" B/)" 67$(C" JKKL" 7B/" '//(" @3)" &" )/8/>&'7" )/6/&)+B"
I$/6713'," FB1+B" F188" /&6/" 7B/" /67&<816B./'7" 3@" 7B/" 6/8/+713'" +)17/)1&," </+&$6/" &" (1)/+7" +3.E&)163'"
</7F//'"(1@@/)/'7"&'1.&8".3(/86"16"'37"E3661<8/?"NB/"7B/)/@3)/"+3'+8$(/6"7B&7"/&+B"6E/+1/6"6B3F6"176"
&(>&'7&5/6"&'("(16&(>&'7&5/6"@3)"&'6F/)1'5"6E/+1@1+"I$/6713'6?"N7$(1/6")/5&)(1'5"6C67/.1+&88C"&EE81/("
EB&).&+/$71+&86"&)/"6$++/66@$88C"+3'($+7/("3'")&76,"<$7")/5&)(1'5"7B/"83+&88C"&EE81/("&5/'76"6$+B"&6"
<3'/" .3)EB35/'/71+" E)37/1'6," )&76" &)/" '37" 7B/" </67" &'1.&8" .3(/8" 73" +B336/," ($/" 73" 7B/" >/)C" @&67"
7$)'3>/)?"H'"7B/6/"+&6/6,"B15B/)"&'1.&8"6E/+1/6,"F17B"&"683F/)"<3'/"./7&<3816.,"+&'"</"6$++/66@$88C"
+B36/'"@3)"7B/"E)3E36/("67$(C?"
3URFRI63,(9RO$
"
XLVII
3;@CGB>D;@&
\'1.&8".3(/86"E8&C"&'"1'(16E/'6&<8/")38/"1'"$'(/)67&'(1'5"7B/"<3'/"</B&>13)"&'("1'7/)&+713'"F17B"
(1@@/)/'7" .&7/)1&86" &'(" E)3+/($)/6" 1'" >1>3?" \87B3$5B" '3" &'1.&8" .3(/8" 16" E/)@/+7," 7B/C" '//(" 73" </"
+B36/'"<&6/("3'"+81'1+&8"1'(1+&713'6"&'("73"&(&E7"73"7B/"3)151'&8")/6/&)+B"I$/6713'?"H'"7B16"+3'7/%7,"7B/"
+3'+/E7" 3@" <13671.$8&713'" 3@" F3$'(6" <C" 83F]8/>/8" 8&6/)" 7B/)&EC" P***2V" 16" &77)&+71'5" +3'61(/)&<8/"
&77/'713'?"\87B3$5B"176"/@@/+7"3'"FB38/"7166$/6"B&6"<//'"67$(1/("I$17/"/%7/'61>/8C,"7B/"<138351+&8"&'("
+/88$8&)"./+B&'16.6"$'(/)8C1'5"***2"B&>/"'37"<//'"+8&)1@1/("&'("7B/"'//("@3)"@$)7B/)"1'">1>3"67$(1/6"
$61'5"&'1.&8".3(/86"16"3<>13$6?"
.)4).)"3)*&
J!?L!j/"*1,"NB$]k$1"-B/',"*3'5"*1,"*1'5"l1',"m1']*$&'"`&'5,""j$]m1&3"*&1,";3'/"(/@/+7"&'1.&8".3(/86"
@3)"7/671'5"/@@1+&+C"3@"<3'/"6$<6717$7/"<13.&7/)1&86,"n3$)'&8"3@"^)7B3E&/(1+"2)&'68&713'"U,"RX]
!SW,"KS!X"
JK?L!-8/./'76"n#,"-&)E/'7/)";;,"A3$)+1&$"nk?"2)/&71'5"6/5./'7&8"<3'/"(/@/+76["&"'/F"7/+B'1I$/?"n"
b337"\'G8/"N$)5"WZ["UXS/Q,"KSST"
JU?L!0o)7<$(&G,"^?,"_&&6,"#?,"&'("9&88&7B]A3G3)'C,"4?";13671.$8&713'"3@"<3'/".&))3F"+/886"F17B"&"
(13(/" 63@7" 8&6/)?" -81'?" ^)&8" H.E8&'76" #/6?" !!," XWSiXWXV?" P" =/(&," j?," &'(" NB1.1D$," Y?" PKSSUV?"
a@@/+76"3@"E$86/"@)/I$/'+C"3@"83F]8/>/8"8&6/)"7B/)&EC"P***2V"3'"<3'/"'3($8/"@3).&713'"1'")&7"
+&8>&)1&8"+/886?"n?"-81'?"*&6/)"9/(?"N$)5?"K!,"KZ!iKZZ,"KSSS"
JW?L!N7/1',"\?,";/'&C&B$,"0?,"9&87D,"*?,"/7"&8?"*3F]8/>/8"8&6/)"1))&(1&713'"E)3.37/6"E)381@/)&713'"&'("
(1@@/)/'71&713'"3@"B$.&'"367/3<8&676"1'">17)3?"AB373./(?"*&6/)"N$)5?"KU,"!Q!i!QQ,"KSSX"
JX?L!k&'()&," 9?," *C'567&(&&6," N?A?," _&&'&/6," _?#?," /7" &8?" a@@/+7" 3@" 8&6/)" 7B/)&EC" 3'" &77&+B./'7,"
E)381@/)&713'"&'("(1@@/)/'71&713'"3'"B$.&'"367/3<8&67]81G/"+/886"+$87$)/("3'"717&'1$."1.E8&'7"
.&7/)1&8?";13.&7/)1&86"KQ,"UXSUiUXSR,"KSSX"
JQ?L!^D&F&,"j?,"NB1.1D$,"Y?,"916B1.&,"_?,"/7"&8?"N71.$8&73)C"/@@/+76"3@"83F]E3F/)"8&6/)"1))&(1&713'"3'"
<3'/"@3).&713'"1'">17)3?"NAHa"!RTW,"KT!iKTT,"!RRX"
JZ?L!0o)7<$(&G,"^?,"_&&6,"#?,"&'("9&88&7B]A3G3)'C,"4?";13671.$8&713'"3@"<3'/".&))3F"+/886"F17B"&"
(13(/"63@7"8&6/)?"-81'?"^)&8"H.E8&'76"#/6?"!!,"XWSiXWX,"KSSS"
JT?L!=/(&,"j?,"&'("NB1.1D$,"Y?"a@@/+76"3@"E$86/"@)/I$/'+C"3@"83F]8/>/8"8&6/)"7B/)&EC"P***2V"3'"<3'/"
'3($8/"@3).&713'"1'")&7"+&8>&)1&8"+/886?"n?"-81'?"*&6/)"9/(?"N$)5?"K!,"KZ!iKZZ,"KSSU"
JR?L!\'73'1&"*$1D";?"A1'B/1)3,"9&)8/'>C"a81D&</7B"9?9?"4/)<1,"AB373/'51'//)1'5""3@";3'/"#/E&1)"
A)3+/66/6,"AB373./(1+1'/"&'("*&6/)"N$)5/)C,":38$./"KW,"Y$.</)"K,"KSSQ""
J!S?L! 4$DD&)(/88&,"4?\?,"b1'1,"9?,"23))1+/881,"A?,"/7"&8?"*&6/)"671.$8&713'"3'"<3'/"(/@/+7"B/&81'5["
&'"1'">17)3"67$(C?"*&6/)6"9/(?"N+1?"!Z,"K!QiKKS,"KSSK"
J!!?L! A1'B/1)3,"\?*?;?,"*1./1)&"np'13),"b?\?,"4/)<1,"9?a?9?9?,"/7"&8?"a@@/+7"3@"TUS]'."8&6/)"815B7"
3'"7B/")/E&1)"3@"<3'/"(/@/+76"5)&@7/("F17B"1'3)5&'1+"<3>1'/"<3'/"&'("(/+&8+1@1/("+3)71+&8"366"
366/3$6"./.<)&'/?"n?"-81'?"*&6/)"9/(?"N$)5?"K!,"UTUiUTT,"KSSU"
J!K?L! #3+BG1'(,"N?,"k35&',"4?,"*$5/),"a?4?,"/7"&8?"938/+$8&)"67)$+7$)/"3@"7B/"<3'C"7166$/"&@7/)"
/%E/)1./'7&8" 7)&$.&" 73" 7B/" .&'(1<$8&)" )/513'" @3883F/(" <C" 8&6/)" 7B/)&EC?" AB373./(?" *&6/)"
N$)5?"KK,"KWRiKXU,"KSSW"
J!U?L! k&'()&," 9?," *C'567&(&&6," N?A?," _&&'&/6," _?#?," /7" &8?" a@@/+7" 3@" 8&6/)" 7B/)&EC" 3'"
&77&+B./'7," E)381@/)&713'" &'(" (1@@/)/'71&713'" 3'" B$.&'" 367/3<8&67]81G/" +/886" +$87$)/(" 3'"
3URFRI63,(9RO$
"
XLVIII
717&'1$." 1.E8&'7" .&7/)1&8?" ;13.&7/)1&86" KQ," UXSUiUXSR?/3$6" ./.<)&'/?" n?" -81'?" *&6/)" 9/(?"
N$)5?"K!,"UTUiUTT,"KSSX"
J!W?L! \'73'13" *$1D" ;?" A1'B/1)3," 9&)8/'C" a81D&</7B" 9?9?" 4/)<1," AB373/'51'//)1'5" 3@" ;3'/"
#/E&1)"A)3+/66/6,"AB373./(1+1'/"&'("*&6/)"N$)5/)C,":38$./"KW,"Y$.</)"K,"KSSQ"
J!X?L! N18>&"np'13),"\?Y?,"A1'B/1)3,"\?*?;?,"^81>/1)&,"9?4?,"/7"&8?"-3.E$7/)1D/(".3)EB3./7)1+"
&66/66./'7"3@"7B/"/@@/+7"3@"83F]8/>/8"8&6/)"7B/)&EC"3'"<3'/")/E&1)?"n?"-81'?"*&6/)"9/(?"N$)5?"KS,"
TUiTZ,"KSSK"
J!Q?L! A1'B/1)3,"\?*?;?,"^81>/1)&,"9?\?9?,"&'("9&)71'6,"A?A?9?";13.3($8&qr3"(&"+1+&7)1D&qr3"
s66/&" Es6]1.E8&'7&)" +3." 3" $63" (&" 8&6/)7/)&E1&" 'r3]+1)p)51+&[" /67$(3" E3)" .1+)36+3E1&"
/8/7)t'1+&"(/">&))/($)&?"#/>?"b^=b;\"KK,"!Ki!R,"KSS!"
J!Z?L! *3E/6,"-?;?,"A1'B/1)3,"\?*?;?,"N&7B&1&B,"N?,"/7"&8?"H'@)&)/("8&6/)"815B7")/($+/6"83&(1'5"71./"
3@"(/'7&8"1.E8&'76["&"#&.&'"6&E/+7)36+3E1+"67$(C?"AB373./(?"*&6/)"N$)5?"KU,"KZiU!,"KSSX"
J!T?L! A1'B/1)3,"\?*?;?,"*1./1)&"np'13),"b?\?,"4/)<1,"9?a?9?9?,"/7"&8?"a@@/+7"3@"83F]8/>/8"8&6/)"
7B/)&EC"3'"7B/")/E&1)"3@"<3'/"(/@/+76"5)&@7/("F17B"1'3)5&'1+"<3>1'/"<3'/?";)&D?"0/'7?"n?"!W,"
!ZZi!T!,"KSSU"
J!R?L! *1./1)&" n$'13)," b?\?" a67$(3" (3" )/E&)3" s66/3" &Es6" 1))&(1&qr3" +3." 8&6/)" TUS]'."
&663+1&(3"&"1.E8&'7/"(/"B1()3%1&E&717&"/"./.<)&'&"(/"3663"J03+73)&8"(166/)7&713'L?"N&8>&(3),"
;\,";)&D18["='1>/)61(&(/"b/(/)&8"(&";&B1&,"KSSW"
JKS?L! 4/)<1,"9?a?9?9?"\>&81&qr3"(&"/@1+u+1&"(3"8&6/)"(/"TUS]'."'3")/E&)3"s66/3"(/"@/)1(&6"
+1)p)51+&6" &663+1&(&6" 3$" 'r3" &" 1.E8&'7/" (/" E)37/1'&6" .3)@35/'v71+&6" s66/&6" /" ./.<)&'&"
<138s51+&"J03+73)&8"(166/)7&713'L?"N&8>&(3),";\,";)&D18["='1>/)61(&(/"b/(/)&8"(&";&B1&,"KSSW"
JK!?L! `/</)," n?;?;??" \>&81&qr3" (3" /@/173" (&" 8&6/)7/)&E1&" P4&\8\6V" '36" /'%/)736" s66/36"
&$7s5/'36"/.")&736["/67$(3".3)@38s51+3"J03+73)&8"(166/)7&713'L?"A3)73"\8/5)/,";)&D18["A3'71@w+1&"
='1>/)61(&(/"-&7s81+&"(3"#13"4)&'(/"(3"N$8,"KSSU"
JKK?L! ;)15177/">3'"#/+B/'</)5,"\'1.&8".3(/86"1'"<3'/")/E&1),"0)$5"016+3>/)C"23(&C["016/&6/"
93(/86"x";3'/"<13835C"1'"&'1.&8".3(/86,"1'+8$(1'5"7/671'5"3@"<3'/"<13.&7/)1&86":38?"!U,"KS!W"
JKU?L! 9&&F&'"kB&()&,"Y/6)1'"k&6/.,"_&'6"#?"_&&'y6"n&'"a?"a881'56/',"N7&z8/"A?"*C'567&(&&6,"
a'B&'+/./'7" 3@" <3'/" @3).&713'" 1'" )&7" +&8>&)1&8" <3'/" (/@/+76" $61'5" 83F]8/>/8" 8&6/)" 7B/)&EC,"
N$)5"^)&8"9/("^)&8"A&7B38"^)&8"#&(138"a'(3(,RZ[QRU]ZSS,"KSSW"
JKW?L! Y$66" k9," \$/)" n\," ;336" \," >3'" #/+B/'</)5" ;?" \'" &'1.&8" .3(/8" 1'" 6B//E" @3)"
<13+3.E&71<1817C"7/671'5"3@"<13.&7/)1&86"1'"+&'+/883$6"<3'/6?";9-"9$6+$836G/8/7"0163)(,Z[QZ,"
KSSQ?"
JKX?L! 9/1'/8"*,"{31(16"a,"{&E@"n,"_&66&"A,"_37715/)"9^,"\$/)"n\,"/7"&8?"*3+&81D/("1'6$81']81G/"
5)3F7B"@&+73)"H"(/81>/)C"73"/'B&'+/"'/F"<3'/"@3).&713'?";3'/","UUPWV[QQSiZK,"KSSQ"
JKQ?L! *1'(6/C"#`,"4$5&8&"{,"918'/"a,"N$'"9,"4&''3'"b_,"*&77&"**?"2B/"/@@1+&+C"3@"+C81'()1+&8"
717&'1$." ./6B" +&5/" @3)" 7B/" )/+3'67)$+713'" 3@" &" +)171+&8]61D/" +&'1'/" 6/5./'7&8" @/.3)&8"
(1&EBC6/&8"(/@/+7?"n"^)7B3E"#/6,KW[!WUT/XU,"KSSQ"
JKZ?L! 4$5&8&"{,"*1'(6/C"#`,"43538/F6G1"6?"Y/F"\EE)3&+B/6"1'"7B/"7)/&7./'7"3@"+)171+&8]61D/"
6/5./'7&8"(/@/+76"1'"83'5"<3'/6?"9&+)3.38"NC.E,"KXU[!WZ/Q!,"KSSZ"
JKT?L! _3'.&"2"/7"&8?";3'/"@3).&713'"1'")&7"+&8>&)1&"+/&6/6"F17B1'"&"81.17/("E/)13(")/5&)(8/66"
3@"+3.E8/713'"3@"(/@/+7")/E&1)?"^)&8"016?"n$8O!WPXV[WXZ]QW,"KSST"
3URFRI63,(9RO$
"
XLIX
JKR?L! N7&>)3E3$836"\,"N+$8/&'"\,";366B&)(7"00,";$6/)"0,"k81'5/";?"A)/]+81'1+&8"1'">1>3".3(/86"
@3)"7B/"6+)//'1'5"3@"<3'/"<13.&7/)1&86"@3)"3)&8e+)&'13@&+1&8"1'(1+&713'6["@3+$6"3'"6.&88]&'1.&8"
.3(/86?"A/)13(3'738"KSSS?""n$'OQTP!V[XX]QX?"(31["!S?!!!!eE)(?!KSQX,"KS!X"
JUS?L! N&&(/B"A;"/7"&8?"#/E&1)"3@"&"+)171+&8"61D/"(/@/+7"1'"7B/")&7".&'(1<8/"$61'5"&8835/'1+"7CE/"
H"+388&5/'?"n"-)&'13@&+"N$)5?"O!KPQV[XZU]R,"KSS!"
JU!?L! -B1'":k,"NB1'&5&F&"\,"Y&+8v)13]_3./."9(&"4?";3'/"B/&81'5"3@".&'(1<$8&)"+)171+&8]
61D/" (/@/+76" 1'" 6E3'7&'/3$68C" BCE/)7/'61>/" )&76?" ;)&D" ^)&8" #/6OKZPXV[WKU]US?" (31["
!S?!XRSeN!TSQ]TUKWKS!USSSXSSSSQ,"KS!U"
JUK?L! _3/)7B" #9" /7" &8?" 9/+B&'1+&8" &'(" 67)$+7$)&8" E)3E/)71/6" 3@" <3'/" 1'" '3']+)171+&8" &'("
+)171+&8"B/&81'5"1'")&7?"\+7&";13.&7/),"!SPRV[WSSR]!R?"(31["!S?!S!QeM?&+7<13?KS!W?SQ?SSU,"KS!W"
JUU?L! \'()/3883"Y\,"N&'736"ab,"\)&pM3"9#,"*3E/6"*#?"#&7|6"&5/">/)6$6"B$.&'|6"&5/["FB&7"16"
7B/")/8&713'6B1E"\)I";)&6"-1)"015,"KXP!V[WR]X!,"KS!K?"
JUW?L! j$)1"N8$6&)/'G3"(&"N18>&,"9&)1&"-)1671'&"{1'(/8"0/<3'1,":1+73)"a81&6"\)&'&]-B&>/6,"9&)1&"
(&"4)&q&"Y&+8v)13]_3./.,"Y3>/8"93(/8"3@"93'3"-3)71+&8";3'/"0/@/+7"1'"#&7"9&'(1<8/["\'"
H'7/)/671'5"2338"@3)"^66/3$6"H'>/6715&713'6,","H'7/)'&713'&8"n3$)'&8"3@"_/&87B"N+1/'+/6,":38?"WPKV,"
KS!Q"
JUX?L! N+B8/5/8"k\,"*&'5"bn,"03'&7B"k,"k$83F"n2,"`187@&'5"n?"2B/".3'3+3)71+&8"+)171+&8"61D/"<3'/"
(/@/+7"&6"&'"&87/)'&71>/" /%E/)1./'7&8" .3(/8" 1'" 7/671'5" <3'/" 6$<6717$7/" .&7/)1&86?" ^)&8" N$)5"
^)&8"9/("^)&8"A&7B38"^)&8"#&(138"a'(3(","!SK[Z/!U,"KSSQ"
JUQ?L! Y&81',"*3>16&,2B/")&<<17"&6"&'"&'1.&8".3(/8"1'"(/'7&8"1.E8&'7")/6/&)+B"["F17B"6E/+1&8"
)/@/)/'+/"73"<3'/"&$5./'71'5".&7/)1&86?""\Ka?"=EE6&8&["N*=,"0/E7?"3@"-81'1+&8"N+1/'+/6,"KS!U"
JUZ?L! A/&)+/,"\?"H?,"#1+B&)(6,"#?"4?,"918D,"N?,"N+B'/1(/),"a?"}"A/&)+/,"N?"4?"\'1.&8".3(/86"@3)"
1.E8&'7"<13.&7/)1&8")/6/&)+B"1'"<3'/["&")/>1/F?"a$)"-/88"9&7/)"!U,"!]!S,"KSSZ"
JUT?L! ;&(/)" k$)/C." \8D&)/&," N/8/+713'" 3@" &'1.&8" .3(/86" 1'" (/'7167)C[" 67&7/" 3@" &)7," )/>1/F"
&)71+8/,"n?\'1.?:/7?\(>?!UP!TV[!STS]!STX,KS!W"
"
3URFRI63,(9RO$
"

22 - DR Ruxandra Luca - Teza de Doctorat

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

22 - DR Ruxandra Luca - Teza de Doctorat

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Ramona-Emanuela Maghet Digitally signed by Ramona-Emanuela Maghet

Date: 2020.11.12 15:01:45 +02'00'

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

LUCA RUXANDRA ELENA

Lista lucrărilor publicate .................................................................................... VI

PARTE GENERALĂ - Stadiul actual al cunoaşterii

1.4.2. Tomografie computerizată (CT).................................................. 23

PARTE SPECIALĂ – Contribuții personale

Capitolul 5. Studiul histologic al eșantioanelor prelevate ................................. 75

LISTA LUCRĂRILOR PUBLICATE

1. Luca RE, Giuliani A, Mănescu A, Heredea R, Hoinoiu B, Constantin

2. Luca R, Todea CD, Duma VF, Bradu A, Podoleanu A. Quantitative

3. Luca R, Todea CD, Constantin GD, Mocuta D, Munteanu R. Animal

+LLLT - grup de studiu

GTR - regenerare tisulară ghidată

PTFE - politetrafluoroetilena (teflon)

Colorare HE, mărire originală: 10x, Tricromă Masson (dreapta), mărire

Tabel 1. Factori biologici implicați în regenerarea osoasă, după 17 ................................................ 6

Tabel 3. Efectele PBM asupra principalelor molecule, după 190 ................................................... 37

Tabel 4. Grupele de studiu în funcție de tratamentul aplicat și de perioada de vindecare ........... 49

Tabel 5. Specificațiile tehnice ale echipamentului laser utilizat în studiu ..................................... 53

Dedic această lucrare părinților mei, pe al căror

În elaborarea acestei lucrări m-am bucurat de colaborarea unor

Mulțumirile și întreaga mea recunoștință sunt îndreptate, în primul

Mulţumesc distinşilor referenţi oficiali, Prof. Univ. Dr. Băciuț

Totodată, doresc să mulțumesc colectivului de cercetare alături de

De asemenea, doresc să le mulțumesc doamnelor doctor Romanița

Mulțumesc de asemenea, colectivului Disciplinei de Reabilitare

activitatea didactică, în special dr. George Constantin, pentru sprijinul

În final, recunoștința mea este îndreptată către familia mea, care a

Destul de frecvent în practica medicii dentare curente, pierderea unui dinte

acestuia. În prezent, augumentarea osoasă este utilizată pe scară largă, având la

colagen și schimbări în nivelul mitocondrial si intracelular de adenozin trifosfat.

cercetări realizate în direcția reparării și regenerării osoase se bazează pe studii

1.1. FIZIOLOGIA ȚESUTULUI OSOS ȘI MECANISMUL BIOLOGIC AL

1.1.1. GENERALITĂȚI REFERITOARE LA ȚESUTUL OSOS

1.1.2. PROCESUL FIZIOLOGIC DE FORMARE OSOASĂ

Acest proces complex de formare osoasă encondrală este determinat

1.1.3. PROCESUL DE VINDECARE OSOASĂ

creștere fibroblastic FGF, factorii de creștere insulin-like IGF-1 și IGF-2.

Schmidt-Bleek25 a sintetizat, în 2014, acest proces complex complex și

computerizate care să simuleze comportamentul și rezultatele obținute prin

Tabel 1. Factori biologici implicați în regenerarea osoasă, după 17

Molecula de Etapa în care Celulele

1.1.4. PARTICULARITĂȚI ALE OSULUI ALVEOLAR

La nivel extralveolar, mecanismul de vindecare osoasă implică câteva

Datele prezentate anterior sunt confirmate și de către un studiu

1.2. PREVENIREA RESORBȚIEI ALVEOLARE ȘI CONCEPTUL DE

Numeroasele modificări intra- și extra-alveolare prezentate anterior

- Osteoconducția reprezintă procesul de formare osoasă prin dezvoltarea

Conceptul regenerării tisulare ghidate este unul relativ vechi, primele

fără acoperirea defectelor cu membrane ramforsate cu titan de tip PTFE și au

1.3. MATERIALE DE SUBSTITUȚIE OSOASĂ ȘI MEMBRANE

În prezent, augumentarea osoasă este utilizată pe scară largă, având la

1.3.1. AUTOGREFELE OSOASE

două plăgi operatorii, eventuala resorbție a grefei, precum și complicațiile

Există însă și alte diferențe importante care trebuie luate în considerare

1.3.2. XENOGREFELE OSOASE

1.3.3. ALOGREFELE OSOASE

Osul alogenic obținut prin uscare și congelare prezintă rezistență

1.3.4. GREFELE SINTETICE/ALOPLASTICE

acestea fiind caracterisitici esențiale în ceea ce privește capacitatea

calciu biomimetic (CCP), adăugate cu și fără celule mezenchimale (MSC) în