• nucleolema sau membrana nucleară, • nucleoplasma (matricea sau sucul nuclear), • nucleolii şi • cromatina sau cromozomii. Nucleul reprezintă centrul de comandă, control şi de coordonare a celulei eucariote, funcţionând ca un computer chimic prevăzut cu un program (ADN-ul) şi o memorie (ARN-ul). • Într-o celulă umană, lungimea totală a moleculelor de ADN este de cca. 1,6 m conţinând un potenţial informaţional imens, estimat la aproximativ 9 X 1011 biţi, ce corespunde informaţiilor cuprinse într-o bibliotecă cu 180.000 volume (considerându-se că un cuvânt este evaluat în medie la 36 biţi, iar în fiecare volum se găsesc 150.000 cuvinte). Caracterele morfologice ale nucleului • Poziţia. • Număr. Ca regulă generală, o celulă prezintă un nucleu. Excepţiile sunt însă numeroase. Astfel, hepatocitele sunt binucleate în proporţie de 7-8%, osteoclastele au 30-40 nuclei, iar fibra musculară striată (rabdocitul) prezintă între 20-40 nuclei pentru fiecare centimetru. În condiţii patologice, mai mulţi nuclei apar în: - celulele gigante Langhans (prezente în tuberculoză, au câţiva zeci de nuclei, dispuşi la periferia celulei, în coroană sau potcoavă); - celulele gigante de corp străin, care apar în cazul pătrunderii în organism a unor particule străine, nedigerabile de către celule; - celulele tumorale. • Dimensiunile nucleului. Variază în limite mai strânse (între 5-15μm) decât dimensiunile celulelor, diversitatea dimensiunilor celulelor din organismul animal realizându-se pe baza variaţiei de volum a citoplasmelor. Măsurarea dimensiunilor nucleului se numeşte cariometrie şi reprezintă un domeniu de mare interes pentru biologia şi patologia celulară. Nucleii prezintă variaţii dimensionale funcţionale şi patologice. • În patologie, variaţii ale dimensiunilor nucleului se întâlnesc în toxicoze, în boala de iradiere şi în cancer. În celulele neoplazice, nucleii apar de talie mare, cu morfologie extrem de variată în acelaşi câmp microscopic, putând prezenta uneori aspect monstruos. Între volumul nucleului şi volumul citoplasmei se stabileşte un raport nucleo-citoplasmatic (N/C), a cărei valoare variază în limite foarte largi (1/3 - 1/20), de obicei situându-se între 1/7 - 1/10. Atunci când volumul citoplasmei creşte mai mult decât volumul nucleului, raportul N/C va fi refăcut fie prin diviziune celulară, fie printr-o creştere a volumului nuclear. În cazul în care volumul nu poate fi refăcut, funcţionarea normală a celulei este perturbată. În condiţii patologice, raportul N/C poate fi complet modificat, ajungându-se la inversarea raportului, în celulele tumorale. Membrana nucleară este o structură lipoproteică, cu o grosime de câţiva zeci de nanometri, caracteristică eucariotelor care împarte celula în două compartimente: - nucleul ce conţine genomul, structurile implicate în transcripţie şi în prelucrarea produsului transcriptic; - citoplasma ce cuprinde organitele celulare. În celulele vii, apare ca o peliculă fină, cu indice de refracţie şi densitate mai mare decât restul nucleului. În celulele fixate, se colorează bazofil, iar vizibilitatea cromatică se datoreşte condensării şi coagulării unor componente ale carioplasmei care se depozitează pe faţa internă a membranei. • La microscopul electronic, nucleolema apare formată din două foiţe (una internă şi alta externă), fiecare trilaminată, lipoproteică, groase de 60-100 A, separate printr-un spaţiu perinuclear sau cisterna perinucleara, de 150 – 300 A, plin cu o substanta amorfa. Membrana nucleară externă prezintă o faţă citoplasmatică, ornată cu ribozomi, are un contur mai flexibil şi zone active de formare a veziculelor. Membrana nucleară internă este lipsită de ribozomi şi aderă fie la nucleoplasmă, care poate diferenţia o lamină densă, fie adera la cromatină. Cisterna perinucleară apare ca un spaţiu tridimensional, aflat în continuitate cu spaţiul reticulului endoplasmatic. În acest spaţiu s-au pus în evidenţă proteine, enzime, Ca2+. Membrana (MN) nucleară – reprezentare tridimesională 1-MN şi relaţiile sale cu RE; 2-MN, la microscopul electronic, cu grosisment redus; 3-Trilaminaritatea celor două MN; 4-Organizarea moleculară a MN; 5-Ultrastructura MN . a-Nucleul; b-Membrana nucleară; c-Citoplasma; d-Por; e-Reticul endoplasmic; f-ribozomi. Nucleolema sau învelişul nuclear este întreruptă (fenestrată) de orificii circulare, denumite pori circulari, la nivelul cărora cele două membrane se află în raporturi de continuitate. o Numărul de pori de pe o unitate de suprafaţă este legat de intensitatea schimburilor nucleo-citoplasmatice. o Asfel, la celulele în creştere pot exista 10 pori/μm2. Se întâlnesc variaţii în numărul, frecvenţa şi distribuţia porilor de la un tip de nucleu la altul. Porii sunt în fapt "porţile" folosite de macromolecule şi de ansamblurile macromoleculare (proteine, ARNm, subunităţi ribozomale,etc.) pentru a intra sau ieşi din nucleu. Porul împreună cu structurile adiacente formează complexul porului. Complexul por cuprinde: a) două inele sau anuli, asezate pe ambele feţe ale porului (nucleară şi citoplasmatică), fiecare inel fiind compus din granule proteice sferoide cu diametrul de 10-25 nm, care sunt dispuse în formă de octogon; b) opt conuri, orientate dinspre peretele porului către lumenul său, considerate a fi agregate de fibrile; c) o particulă centrală, în formă de granulă sau bastonaş, inconstant prezentă; d) pachete de filamente nucleoplasmatice de 4-8 nm, care se inseră cu o extremitate de inelul intern, iar cu cealaltă extremitate se prinde pe formaţiuni intra nucleare (eventual pe nucleol). • Structura porului nuclear După unii autori, diferitele structuri care apar în centrul porului (diafragma porului, granula centrală, filamentele) par a fi mai curând materiale surprinse în timpul trecerii prin por decât structuri pemanente.
Schema complexului por.
1-MN externă; 2-MN-internă; 3-Spaţiu cisternal; 4-Filament intern; 5-Formaţiune conică; 6-Granulă-anulus extern; 7-Granulă-anulus intern; 8-Granulă centrală. • Funcţiile membranei nucleare sunt: 1) delimitează conţinutul nucleului de cel al citoplasmei; 2)reglează schimburile dintre nucleu şi citoplasmă; 3)formează membranele reticulului endoplasmic, reprezentând rezerva de citomembrane în celule care se divid rapid; 4)menţine şi stabilizează cromatina, care se ataşează de faţa sa internă; 5)rol mecanic în susţinerea organitelor, acestea fiind legate de faţa sa externă prin fibrile de 18 nm. Nucleoplasma reprezintă acea parte a nucleului, aparent lipsită de structuri (la microscopul optic şi la cel electronic,de grosisment redus). La nivelul molecular apare structurată, fiind mai adecvată denumirea de matrice nucleară. se prezintă ca un mediu de natură proteică în care "plutesc" nucleolii şi cromatina. are rol esenţial în organizarea nucleului, determinându-i forma, în sinteza de ADN şi ARN, în medierea semnalelor hormonale (ale steroizilor). conţine diverse enzime, ce intervin în glicoliza anaerobă şi în realizarea unor legături macroergice. Funcţiile matricei nucleare sunt: 1) menţine forma nucleului şi stabilitatea acestuia în interfază; 2)asigură flexibilitatea nucleului, fapt ce permite realizarea unor modificări structurale legate de organizarea cromatinei, replicarea ADN, transcripţia şi transportul intranuclear de ARN; 3)contractilitatea, independentă de ATP, dar influenţată de ionii bivalenţi (Ca2+,Mg2+) ce permite realizarea unor variaţii ale volumlui nuclear; 4)suport pentru depozitarea granulelor ribozomale. Cromatina
nu este o substanţă chimică, ci o noţiune biologică, fiind
reprezentată de materialul intranuclear care se evidenţiază cu coloranţi bazici. este forma de existenţă a cromozomilor în interfază, în celula aflată între două diviziuni. cromatina şi cromozomii sunt două forme de organizare ale unuia şi aceluiaşi material genetic (ADN-ul). Compoziţia chimică a cromatinei cuprinde: -ADN, -proteine histonice, -mici cantităţi de ARN şi -proteine nehistonice. Cantitatea de ADN din nucleu este constantă pentru o anumită specie şi reprezintă genomul speciei respective. este dată de numărul şi dimensiunile moleculelor de ADN. Histonele sunt proteine bazice, prezente numai în genomul eucariotelor. în funcţie de conţinutul în arginină şi lizină există cinci tipuri de histone, denumite: - H1, - H2A, - H2B, - H3, - H4. • La rândul său fiecare tip prezintă mai multe subtipuri. • Histonele prezintă mai multe particularităţi: 1) au masă moleculară mică; 2)sunt puternic bazice, datorită conţinutului mare (10-20%) de aminoacizi bazici (lizine şi arginine); 3)sunt purtătoare de sarcini electrice pozitive; 4) sunt proteine cu evoluţie filogenetică moleculară definitivă.
• Îndeplinesc un rol major în împachetarea ADN-ului în nucleu, în
realizarea organizării supramoleculare a ADN-ului sub formă de nucleozomi. În cursul ciclului celular, histonele suferă o serie de modificări chimice (acetilări, fosforilări, metilări). • În spermatozoid, histonele sunt înlocuite de protamine. Protaminele au o greutate moleculară foarte mică (4200 daltoni), o lungime medie de numai 33 aminoacizi şi sunt foarte bazice, conţinând multă arginină. Înlocuirea histonelor are loc în timpul trecerii de la spermatidă la spermatozoid, permiţând realizarea unui înalt grad de condensare şi compactare a cromatinei, pentru împachetarea ADN-ului într-un volum foarte mic, cum este cel al capului spermatozoidului. Aspectele histologice ale cromatinei Datorită conţinutului bogat în ADN, complexat cu histone, cromatina se colorează întens cu coloranţi bazici (hematoxilină, albastru de tripan), putând prezenta aspecte variate: - granule, - grămezi neregulate, - reţele de filamente, - corpusculi cromocentrici (sau cariozomi). Aspectul morfologic al cromatinei este asemănător în nucleii aparţinând aceluiaşi tip celular, dar variază în funcţie de tipul celular şi de stadiul funcţional, fiind un criteriu important pentru identificarea celulelor la microscopul optic. • Cromatina reprezintă materialul biologic intranuclear din care sunt formați cromozomii. este alcătuită din filamente răsucite de ADN, denumite cromoneme. Rasucirea determină, la nivelul cromonemei, aparitia unor zone mai dense, intense colorate bazofil (heterocromatina), care alterneaza cu zone mai putin dense, mai palid colorate bazofil (eucromatina). Eucromatina reprezintă cromatina funcţională, activă, purtătoare de gene structurale, pe care se face transcripţia mesajului genetic. Poate fi de două feluri: 1) eucromatină activă, pe care transcripţia se efectuează continuu, asigurându-se deşfăşurarea normală a vieţii celulei; 2) eucromatină permisivă, potenţial activă, devenind activă în momentul în care acţionează semnale specific modulatoare (de exemplu: hormonii). reglarea conformaţiei genetice se realizează pe eucromatină, prin intervenţia unor agenţi biochimici, în principal proteine nehistonice, ce pot acţiona ca represori sau derepresori, modulând transcriptibilitatea materialului genetic activ şi nu structura acestuia. Heterocromatina este cromatina condensată, netranscriptibilă, inactivă metabolic. Există două tipuri de heterocromatină: - constitutivă şi - facultativă. Heterocromatina constitutivă este genetic inactivă, lipsită de gene structurale. Pe ea nu se face transcripţie niciodată, rămânâd întotdeuna condensată în interfază. conţine ADN repetitiv sau satelit, un ADN în care anumite secvenţe nucleotidice sunt repetate de un număr foarte mare de ori. la mamifere, ADN-ul repetitiv reprezintă 15% din cantitatea totală de ADN. • Există două tipuri de ADN repetitiv: 1) ADN înalt repetitiv (10%), în care secvenţele se repetă de sute de mii de ori; 2)ADN mediu repetitiv (5 %), în care secvenţele se repetă de 100 ori, de 1000 ori sau de zeci de mii de ori. Pe cromozomii omologi (care formează o pereche), heterocromatina constitutivă se localizează identic, de regulă, în imediata vecinătate a centromerului, putând fi detectată prin tehnica de bandare a cromozomilor. Rolul heterocromatinei constitutive este incomplet elucidat, atribuindu-se o semnificaţie de "protecţie" sau de "suport", sugerându-se ipoteza că ea determină specificitatea centromerică, respectiv poziţia centromerului în cromozomi. Heterocromatina facultativă este o cromatină condensată, care conţine gene structurale represate (inactive) pe care nu se face transcripţia. Pe aceste gene, transcripţia s-a efectuat sau nu într-o perioadă anterioară, sau se va putea efectua, dacă se transformă în eucromatină, sub influenţa unui agent derepresor. Astfel, transformarea unei părţi din heterocromatina autozomală în eucromatină determină sinteza de imunoglobuline şi transformarea limfoblastică a limfocitelor. În funcţie de cromozomi în care se găseşte, heterocromatina poate fi: 1. autozomală, prezentă în perechile de cromozomi autozomi, sub forma porţiunilor condensate, heterocromatice, ce conţin lanţuri de gene, inactive transcripţional; 2.gonozomală, prezentă numai în cromozomii ce determină sexul, reprezentată de cromatina X, la femelă şi de corpuscululY, la mascul. • Cromatina X sau corpusculul Barr a fost descrisă de M.L.BARR şi de E.G.BERTRAM în 1949. • este folosită ca marker genetic pentru recunoaşterea sexului genetic. în mod normal este prezentă numai în nucleii celulelor somatice ale femelelor sub forma unui corpuscul cromatidian, denumit corpuscul Barr. reprezintă condensarea interfazică a unuia din cei doi gonozomi X. Prin condensare, eucromatina se transformă în heterocromatină facultativă inactivă. este prezentă şi detectabilă la toate femelele mamiferelor, cu excepţia femelei de opussum (mamifer marsupial), unde este prezentă la ambele sexe. lipseşte la toţi masculii normali. corpusculul Barr are un diametru de cca. 1µm şi poate prezenta forme diferite: - plan-convex, - convex-concav, - biconvex, - triunghiular. o Poziţia sa variază după tipul celular, apărând situat adiacent membranei nucleare interne (în celulele epidermale şi ale epiteliului mucoasei bucale) sau ataşat nucleolului (în unii neuroni). În neutrofilele femelelor este prezentă o formaţiune echivalentă corpusculului Barr, denumită, după aspectul său "băţ de tobă" (drumstick), formată dintr-un cap cu diametrul de 1,5 µm, ataşat printr-un filament cromatic extrem de subţire la unul din lobii nucleului. Frecvenţa drumstick-ului est de 7/500 neutrofile, sau chiar mai mult. Cromatina Y sau corpusculul F se poate observa în nucleii celulelor provenite de la masculii normali, examinate în lumină ultravioletă, după colorare cu fluorocrom. are aspectul unui corpuscul intens fluorescent. a fost descpoperit de PEARSON, în 1970 şi reprezintă expresia citologică a cromozomului Y. La indivizii ce prezintă doi cromozomi Y se observă doi corpusculi F. În acest mod se pot diagnostica unele anomalii cromozomiale (trisomia XYY) la masculi, care predispun la un comportament dur, înrăit. Cromozomii sunt structuri celulare cu număr, forme şi mărimi caracteristice pentru fiecare specie. devin vizibili la microscopul optic în celulele care se pregătesc pentru diviziune sub forma unor filamente lungi, cu mare afinitate pentru coloranţi bazici, de unde îşi trag denumirea, croma însemnând în limba greacă culoare, iar soma - corp. În funcţie de posibilităţile de a fi observaţi la microscopul optic, cromozomii pot fi clasificaţi în: - cromozomi interfazici, necondensaţi şi neobservabili la microscop; - cromozomi mitotici, uşor observabili la microscop, mai ales în cursul metafazei şi de aceea denumiţi cromozomi metafazici. Structura cromozomilor metafazici cuprinde: cromatidele, centromerul, kinetocorii, constricţiile secundare şi sateliţii. Cromatidele sunt cele două jumătăţi longitudinale, genetic identice ce formează fiecare cromozom metafazic. fiecare cromatidă corespunde unei molecule de ADN. extremităţile terminale ale cromatidelor se numesc telomere şi sunt absolut necesare pentru structura şi funcţionarea normală a cromozomilor, deoarece previn fuziunea şi menţin o anumită ordine a cromozomilor interfazici în interiorul nucleului prin ataşarea lor la membrana nucleară internă. Centromerul sau constricţia primară este regiunea cea mai îngustă din lungimea cromozomului, unde cele două cromatide se unesc. este slab colorat sau acromatic, având un conţinut scăzut de ADN. În vecinătatea centromerului se găseşte heterocromatina constitutivă. Cei mai mulţi cromozomi sunt monocentrici, prezentând un singur centromer. În cazul unor anomalii cromozomiale apar cromozomi dicentrici sau policentrici. Kinetocorii sunt în număr de doi pentru un cromozom şi reprezintă locul prin care fiecare cromatidă se ataşează de microtubulii fusului de diviziune. la microscopul electronic un kinetocor are forma unui oval cu dimensiunile de 5/25 nm. Constricţiile secundare sunt zone ale cromozomilor ce nu reţin colorantul bazic. servesc drept criteriu morfologic de indiviudalizare a cromozomilor. În comparaţie cu constricţiile primare, la nivelul constricţiilor secundare nu se produc deviaţii angulare ale segmentelor pe care le unesc. Unele din zonele de constricţie secundară sunt legate de formarea nucleolilor şi se numesc zone nucleolare sau organizatori nucleolari iar cromozomii care participă la formarea nucleolilor sunt denumiţi cromozomi nucleolari. Satelitul este un corpuscul sferic, cu diametrul egal cu al cromozomului sau mai mic, ataşat de restul cromozomului printr-un filament subţire de cromatină de lungime variabilă. Cromozomii ce prezintă satelit se numesc SAT-cromozomi. În funcţie de poziţia centromerului, cromozomii se clasifică în: 1. telocentrici, la care centromerul este situat la o extremitate a cromozomului, lipsindu-i braţele scurte; 2.acrocentrici, cu braţe scurte abia vizibile, centromerul fiind situat în apropierea extremităţii cromozomului; 3. submetacentrici, la care centromerul este situat în apropierea mijlocului lungimii cromozomului, prezentând un braţ scurt şi un braţ lung; 4.metacentrici, cu braţele aproximativ egale, centromerul fiind situat la mijlocul lungimii cromozomului. Schema unui cromozom.Tipuri de cromozomi. 1-Centromer: 2-Constricţie secundară; 3-Satelit; a-Cromozom telocentric; b-Cromozom acrocentric; c-Cromozom submetacentric; d-Cromozom metacentric. Dimensiunile cromozomilor sunt cuprinse între 1,5-10 µm, lungime şi 0,2-2 µm diametru, putându-se întâlni cromozomi giganţi şi cromozomi pitici. Numărul cromozomilor apare constant pentru aceiaşi specie, existând: 60 cromozomi la bovine, 54 la ovine, 38 la suine, 64 la cabaline, 38 la felide, 78 la canide şi 46 la primate. • Celulele sexuale sau gameţii sunt haploide (haplos= simplu), conţinând un singur set de cromozomi, notat cu "n",faţă de celulele somatice care sunt diploide (diplos=dublu) şi conţin două seturi (2n) de cromozomi (un set matern şi altul patern). Fiecare cromozom dintr-un set are în setul opus un cromozom complementar, identic structurat morfologic şi genetic, alcătuind o pereche de cromozomi omologi. Asfel, taurinele prezintă 58 cromozomi autozomi (29 perechi) şi 2 cromozomi de sex ( heterocromozomi sau gonozomi). • Taurinele femele au în celulele somatice doi cromozomi X, iar formula cromozomială este 60 XX. Masculii taurinelor au formula cromozomială 60 XY şi prezintă în celulele somatice un cromozom X şi altulY. În formula cromozomială, prima cifră indică numărul total de cromozomi, după virgulă fiind indicaţi cromozomii de sex (gonozomii). La taurine, fiecare din cele 29 perechi de cromozomi autosomi este formată din 2 cromozomi omologi, cu aceiaşi morfologie şi dispunere a genelor. Heterocromozomii ( gonozomii) nu sunt omologi. La taur, diferenţa de formă între cromozomul X şi cel Y este evidentă, cromozomul Y fiind un cromozom submetacentric mic. La vaci, cei doi cromozomi X submetacentrici nu sunt omologi, deoarece numai unul este activ genetic, iar celălalt este inactiv, rămâne condensat în interfază şi formează cromatina sexuală (corpusculul Barr). Diferenţierea celor doi cromozomi X în unul activ şi altul inert genetic se face într-un stadiu precoce al dezvoltării embrionare. Compoziţia chimică a cromozomilor include ADN, proteine (histonice şi nonhistonice) şi o cantitate redusă de ARN. Histonele sunt proteine cu greutate moleculară redusă (10.000- 20.000 dal), cu conţinut mare (10-20%) de aminoacizi bazici (lizină şi arginină), purtători de sarcini electrice pozitive, ce le permite să se lege de sarcinile negative ale grupărilor fosfat din ADN. la eucariote există cinci clase de histone, ce diferă după conţinutul lor în lizină şi arginină: - H1, - H2A, - H2B, - H3 şi - H4. • În timp ce histonele H2A, H2B, H3 şi H4 sunt cele mai constante din punct de vedere al secvenţei aminoacizilor la diverse specii, histonele H1 prezintă o variabilitate a secvenţelor. Proteinele nonhistonice sunt de foarte multe tipuri, de la proteine ce intră în structura cromozomilor sau care se leagă de ADN, intervenind în exprimarea genelor şi până la proteine enzime ce intervin în sinteza de ADN şi ARN sau în scindarea lor. • Proteinele ce intervin în reglarea exprimării genelor sunt rare, apărând într-un exemplar la 3000 de nucleozomi. Există, însă şi proteine nehistonice mult mai abundente, precum grupul de proteine cu mobilitate mare (HMG-higt mobility group), care fiind mici şi cu multe sarcini electrice migrează rapid în cursul electroforezei. Din acest grup, proteinele HMG14 şi HMG17 se găsesc în toate celulele de la mamifere, legându-se de nucleozomii asociaţi cu genele active. ARN-ul se găseşte în cantitate redusă în cromozomi, fiind reprezentat de ARN-ul nascent, care se formează pe matriţa de ADN în procesul de transcriere. Cariotipul este reprezentat de totalitatea caracterelor morfologice (număr, mărime, formă, poziţia centromerului, constricţiile) ale cromozomilor dintr-o celulă diploidă. grafic poate fi prezentat printr-o "hartă" numită cario- sau idiogramă, în care perechile de cromozomi omologi sunt aşezaţi în ordinea descrescândă a lungimii. Cromozomii sexuali sunt cromozomi X submetacentrici şi cromozomulY, submetacentric mic. • Cariotipul unei specii se obţine prin fotografierea cromozomilor metafazici, obţinuţi din metafazele limfocitelor din culturi, stimulate să se dividă cu fitohemaglutinine şi blocate în metafază prin adaus de colchicină, un alcaloid ce împiedică asamblarea fusului de diviziune. Din fotografiile obţinute se decupează cromozomii şi se aranjează în cariotip, putându-se identifica grupele de cromozomi, făra a se putea preciza cu certitudine perechea. • Identificarea fiecărei perechi se face prin folosirea tehnicilor de bandare, tehnici care permit punerea în evidenţă a unor benzi transversale de-a lungul cromozomilor, benzi care sunt caracteristice pentru fiecare cromozom. Se folosesc două categorii de tehnici de bandare: 1) tehnici cu fluorescenţă prin care se obţin benzile "Q" (de la quinacrină) fluorescente; 2)tehnici bazate pe tratarea cromozomilor cu diferiţi agenţi fizici şi chimici, urmate de coloraţia Giemsa prin care se evidenţiază trei feluri de benzi : - benzile G (Giemsa), care apar intens colorate şi corespund benzilor fluorescente Q; - benzile R, cu o dispunere inversă benzilor G, încât benzile R intens colorate, corespund benzilor G palide - benzile C, apar numai în regiunea centromerului sau în apropiere lui şi corespund localizării heterocromatinei constitutive. • Determinarea cariotipului are o mare importanţă în practica medicală, pentru: a.diagnosticul unor boli congenitale, precum trisomia perechiii 21, care produce boala Down (idioţia mongoloidă); b.sfatul genetic şi dirijarea împerecherilor la animale; c. aprecierea statusului genetic la populaţiile cu mare risc genetic; d.diagnosticul diferenţial al unor anomalii sexuale, cu determinare genetică, precum sindromul Turner (XO, în loc de XX), ce produce sterilitate, ovare vestigiale şi sindromul Kleinfelter (XXX, în loc de XY), ce se manifestă prin testicule atrofiate, sterilitate, ginecomastie; e.diagnosticul unor boli ale sângelui, precum leucemia mieloidă, unde apare un cromozom marker anormal (cromozomul Ph-Philadelphia); f. pentru diagnosticul de paternitate, prin măsurarea lungimii cromozomuluiY, care trebuie să fie aceiaşi la făt ca şi la presupusul tată; g. pentru diagnosticul diferenţial între unele tumori benigne şi alte maligne, ce modifică cariotipul. De asemenea stabilirea locusului pe care îl ocupă o genă într-un cromozom, permite realizarea hărţilor cromozomiale, un domeniu de cercetare de mare actualitate. Organizarea moleculară şi supramoleculară a cromozomilor la eucariote. • La microcopul electronic, cromozomii metafazici apar ca nişte gheme de cromatină, înfăşurate foarte neregulat. Fiecare cromatidă conţine o singură moleculă de ADN ce se organizează sub forma unei fibre de cromatină, cu grosimea de 10 nm, foarte sinuoasă, împachetată compact, prezentând zone de eucromatină şi heterocromatină. • Împachetarea ADN-ului şi a histonelor în cromozom este absolut necesară pentru ca o moleculă de ADN cu o greutate moleculară de 6×10¹⁰ daltoni şi o lungime de 3 cm să încapă într-un cromozom lung de 5 µm ( 0,0005 cm). Împachetarea se face cu ajutorul nucleozomilor, care sunt unităţi fundamentale repetitive de organizare a complexului ADN -histone, deci a cromatinei. Nucleozomii Conceptul de nucleozom a fost elaborat de KÖRNBERG, în anii 1975- 1977. Un nucleozom este un octamer histonic de forma unui cilindru scurt, cu un diametru de 11 nm şi o înălţime de 5,5 nm, pe care duplexul de ADN îl înconjoară de două ori. Alcătuirea nucleozomului • Octamerul histonic este format din opt molecule de histone, câte două molecule de H2A, H2B, H3 şi H4. • Tetramerul de histone (H3)x2 şi (H4)x2 - bogate în arginină formează miezul nucleozomului şi determină înfăşurarea duplexului de ADN. Cei doi dimeri de histone bogate în lizină, - (H2A)x2 şi (H2B)x2 - sunt ataşaţi miezului nucleozomului. Nucleozomul nu conţine proteine nonhistonice. • Histona H1 nu intră în structura nucleozomului, fiind situată lateral de acesta, în contact cu intrarea sau ieşirea ADN-ului din nucleozom. Histona H1 se leagă de ADN-ul linker prin forţe ionice, prezentând o porţiune C (carboxil) terminală, legată direct de ADN şi o porţiune N (amino-), ce nu se ataşează de ADN, dar oferă locusuri de legare pentru proteinele nehistonice HMG1 şi HMG2. Histona H1 este implicată în spiralizarea fibrei de cromatină. • Molecula de ADN este continuă de-a lungul cromozomului, prezentând porţiuni înfăşurate pe nucleozomi şi porţiuni ce fac legătura dintre doi nucleozomi succesivi, denumite ADN-linker sau internucleozomic. de ADN-ul linker se leagă o moleculă de histonă H1, amplasată între doi nucleozomi. Se realizează, astfel, o înşiruire a nucleozomilor unul după altul, ca mărgele pe aţă, formându-se filamentul subţire de cromatină, cu diametrul de 11 nm, care se poate observa la microscopul electronic, numai dacă cromatina este "întinsă" în mod artificial. În celula vie, fibra de cromatină are un diametru de 30 nm, răsucită într-o structură helicoidală (un solenoid sau o bobină) cu pasul elicei de 11 nm. La fiecare tur de spiră se inseră şase nucleozomi. Rata de împachetare a ADN-ului pe nucleozom este de circa 10/1 aproximativ 60 nm de ADN fiind înfăşuraţi pe un cilindru nucleozomic înalt de 5,5 nm. Apoi, dispunerea nucleozomilor sub formă de bobină (solenoid) cu diametru de 30 nm permite realizarea unui raport de împachetare de cca. 50/1. Împachetarea duplexului de ADN pe nucleozom şi a nucleozomilor în fibra de cromatină de 30 nm ar permite ca într-un cromozom ipotetic de 1 mm lungime, să încapă un ADN lung de 3 cm. La rândul ei, fibra de cromatină de 30 nm se pliază formând bucle de mărimi variabile, ce permite să se reducă lungimea "firului" de ADN de la 1 mm la 100 µm . • Pentru a "încape" în cei 5 µm lungime ai unui cromozom metafazic sunt necesare încă două ordine de condensare a cromatinei, care se realizează probabil prin împachetarea elicoidală a buclelor de cromatină, încât aglomerarea lor în anumite zone determină apariţia benzilor vizibile în cromozomul metafazic. Se pare că superspiralizarea solenoidului se realizează cu ajutorul unor proteine nehistonice. Astfel, fosforilarea proteinelor nehistonice ar declanşa superspiralizarea solenoidului, în momentul trecerii de la G2 la mitoză, iar defosforilarea lor ar induce despiralizarea, în momentul trecerii de la mitoză la G1. Alături de histone, în procesele de împachetare a nucleozomilor în fibra de cromatină, întervine ionul de Mg2+. In timpul diviziunii celulare, condensarea cromatinei corespunde împachetării compacte în spaţiu a fibrei de cromatină de 30 nm, odată cu realizarea structurii cromozomului metafazic. S-a calculat că, ADN-ul înfăşurat pe un nucleozom este prea scurt pentru a corespunde unei gene structurale, încât nu există o concordanţă între o genă, ca unitate de informaţie genetică şi un nucleozom, ca unitate de împachetare a ADN-ului. Gena este formată din aproximativ 1000 perechi de nucleotide (perechi de baze), în timp ce ADN-ul înfăşurat pe un nucleozom are 200 perechi de baze. Unele gene de la eucariote apar discontinui, prezentând secvenţele din ADN care codifică aminoacizi (exoni), separate între ele prin secvenţe de ADN care nu codifică aminoacizi (introni). Nucleolul este o componentă intranucleară, cu aspect corpuscular intranuclear, prezent în interfază, a cărei funcţie principală constă în biogeneza ribozomilor (cu excepţia ribozomilor mitocondriali). ocupă o poziţie cheie în circuitul intracelular al informaţiei, fiind sediul unui considerabil trafic de molecule. în el se desfăşoară principalele procese care au loc în nucleu (replicare, transcripţie, transport), jucând rolul unui intermediar între cromozomi şi citoplasmă. este prezent (vizibil sau nu) în toate celulele eucariote. nu există nucleu fără nucleol, iar celulele care îşi perd nucleolii nu mai sunt viabile. În timpul diviziunii celulare se dezintegrează şi reapare după terminarea acesteia. În structurarea nucleolului, un rol deosebit revine organizatorilor nucleolari, prezenţi în unii cromozomi, adiacent constricţiei secundare. Deşi a fost observat încă din 1836 de către VALENTIN, ca o granulă densă în interiorul nucleului, rolul său a fost dezlegat mult mai târziu, abia în 1960, precizându-se rolul esenţial pe care îl are în biogeneza ribozomilor. Examinat la microscop prezintă un aspect omogen, puternic bazofil, bine delimitat. Prin impregnări argentice, au fost evidenţiate două componente în structura nucleolului: 1. nucleolonema o formaţiune filamentoasă, răsucită ca un ghem; şi 2. o componentă astructurată sau amorfă. Nu este delimitat de o membrană. În celulele vii, examinate în contrast de fază, nucleolul apare ca un corpuscul puternic refringent, datorită conţinutului redus de apă, heterogen şi cu contur neregulat Numărul nucleolilor. în nucleii celulelor somatice există, în mod obişnuit doi nucleoli, câte unul pentru, fiecare set cromozomial creşte în raport direct cu gradul de poliploidie. Astfel, în hepatocite există 2 nucleoli, în celulele diploide, 4 în cele tetraploide şi 8 în cele octaploide. Dimesiunile nucleolilor sunt între 1-2 µm, ocupând circa 30% din volumul nucleului. ele variază în funcţie de implicarea celulelor în sinteza de proteine. Celulele care sintetizează cantităţi mari de proteine (neuronii, celulele embrionare, limfocitele stimulate antigenic) au nevoie de mulţi ribozomi, ceea ce face ca nucleolii să aibă dimensiuni mari. în celule în care sinteza de proteine este redusă (în spermatozoizi), nucleolii au dimensiuni mai mici. Nucleolul apare hipertrofiat în anabolism, în perioada de diferenţiere embrionară şi se reduce în catabolism şi în inaniţie. Raportul nucleolo/nuclear. Numărul şi volumul nucleolilor depind de starea funcţională a celulei. Cu cât celula este mai activă în sinteza proteinelor, cu atât raportul nucleolo/nuclear este mai mare. este folosit drept criteriu pentru aprecierea vârstei celulelor. Astfel celula tânără prezintă un nucleu mare eucromatic, cu un nucleol mare, cu o citoplasmă redusă şi bazofilă, iar o celulă adultă prezintă un nucleu mai mic, hipercrom, cu nucleoli mici şi o citoplasmă abundentă. Forma şi poziţia nucleolului A-Forma: 1-Sferoidal-ovoidală; 2-Discoidală; 3-Triunghiulară; 4-Neregulată. B-Poziţia: 1-Alipit membranei nucleolare; 2-Central; 3-Excentric. Forma nucleolilor. prezintă, de cele mai multe ori, o formă sferic-ovoidală, care pe măsura îmbătrânirii celulei devine neregulată. Densitatea nucleolilor este mare (1,35), nucleolul fiind cea mai densă structură din celulă, datorită concentraţiei ridicate în substanţă uscată şi a cantităţii foarte mici de apă. Dispunerea nucleolilor în nucleu este în majoritatea cazurilor centrală sau paracentrală, putând varia în raport cu mometul funcţional. S-au observat şi descris mişcări ale nucleolului în interiorul nucleului şi stabilirea unor contacte cu învelişul nuclear, localizare eficientă pentru descărcarea de material biologic în citoplasmă. În funcţie de criteriile ultrastructurale, există mai multe tipuri de nucleoli: - nucleoli reticulari, cei mai comuni; - nucleoli compacţi, în care nu se disting componentele; - nucleoli inelari, în care componenetele filamentoasă şi granulară formează un inel periferic, care înconjoară o lacună centrală. Compoziţia chimică a nucleolului variază în funcţie de tipul celular şi de momentul funcţional, principalele componente chimice fiind: - ADN-ul (3 %), - ARN-ul (7%) şi - proteinele (90% din greutatea uscată). La aceasta se mai adaugă cantităţi mici foarte mici de lipide şi minerale (magneziu, calciu, zinc, cobalt, etc.). ADN-ul din nucleol este reprezentat de organizatorii nucleolari ce pătrund ca nişte bucle de ADN în nucleol. ARN-ul din nucleol este în principal ARN ribozomal aflat în diverse faze de maturare. se presupune că nucleolul este o staţie intermediară obligatorie în tranzitul spre citoplasmă al ARN-ului mesager şi al celui de transfer. În nucleol există diferite tipuri de ARN, ce diferă după coeficentul lor de sedimentare (exprimat în unităţi Svedberg), precum ARN 45 S, ARN 41 S, ARN 20 S, ARN 28 S, ARN 32 S. Aceste tipuri corespund diferitelor etape de maturare a ARN-lui. Proteinele nucleolare provin din citoplasmă şi sunt repezentate în cea mai mare parte de enzime implicate în sinteza şi maturarea ARNr (ribozomal), precum ARN-polimeraza-ADN dependentă (sau ARN-polimeraza I), convertaza, metilaza,etc. Bazofilia nucleolului reprezintă principala sa caracteristică, vizibilă la microscopul optic. Biogeneza nucleolilor Nucleolul este vizibil numai în interfază, dispărând în profază şi reapărând în interfază. Un rol esenţial în biogeneza nucleolului îi revine organizatorului nucleolar, care este o zonă cromozomială distinctă, slab colarabilă (heteropicnoză negativă), situată în vecinătatea constricţiei secundare, având un grad mai redus de înfăşurare a fibrei de cromatină. Numărul cromozomilor care prezintă organizatori nucleolari este limitat şi variabil în funcţie de specie. La hominide există cinci perechi de cromozomi autozomi, purtători de organizatori nucleolari (perechile 13, 14, 15, 21 şi 22 ). Funcţiile nucleolului Nucleolul îndeplineşte funcţii legate de: - sinteza ARN r şi biogeneza ribozomilor; - reglarea sintezei de ARN r; - transferul ARNm şi ARNs în citoplasmă; - pregătirea mitozei. Implicarea nucleolului în citopatologie. Aspectul nucleolului este folosit pentru recunoaşterea celulelor canceroase, unde nucleolul prezintă modificări de volum, număr şi formă, care sunt o consecinţă a malignizării şi nu cauza acesteia. Hipertrofia nucleolară apare ca o caracteristică aproape constantă în celulele neoplazice (canceroase),iar creşterea numărului de nucleoli şi neregularităţile de formă sunt relativ frecvente. • Hipertrofia nucleolară nu este acompaniată şi de o hipertrofie proporţională a nucleului încât valoarea raportului nucleolo-nuclear este mai ridicat în celulele neoplazice faţă de cele normale (depăşind valoarea de 1/3). Numărul nucleolilor este mai mare în celulele maligne decât în celulele normale, fiind uneori proporţional cu gradul de malignitate a tumorii. Asfel, în unele adenocarcinoame din ovar, au putut fi observati 24 nucleoli într-o celulă. Forma nucleolilor este neregulată în celulele maligne, ea putând varia de la o celulă la alta în cadrul aceleiaşi tumori.