1

1. INTRODUÇÃO

A tecnologia do DNA recombinante (DNArec), nos últimos 10

anos, tem gerado novos genótipos microbianos cujo valor não se restringe

apenas às áreas de pesquisa básica e aplicada, mas abrange também a

exploração econômica. As aplicações possíveis destes produtos

biotecnológicos são praticamente ilimitadas, na medida em que o

conhecimento sobre o código genético dos diversos organismos for se

acumulando e novas técnicas de manipulação forem sendo desenvolvidas.

Atualmente, um número crescente de microorganismos geneticamente

modificados (MGMs) vêm sendo testados ou mesmo utilizados para

diversas finalidades, como por exemplo: processos industriais (produção de

insulina humana, linfotoxina, agentes anticancerígenos, etc), limpeza

ambiental (microrganismos capazes de degradar compostos aromáticos

halogenados, hidrocarbonetos, pesticidas persistentes, etc) e melhoria da

produção agrícola (desenvolvimento de bactérias "ice-minus", aumento da

eficiência da fixação do nitrogênio e o desenvolvimento de pesticidas

microbianos).

Nos EUA a participação dos pesticidas microbianos, até 1994, era de

cerca de 1-2% do mercado de pesticidas, correspondendo a um valor anual

de aproximadamente 20 bilhões de dólares (Levin, 1994). É previsível,

 2

entretanto, como decorrência, por um lado, da crescente preocupação com a

contaminação ambiental e dos alimentos, pelo uso de pesticidas químicos

e, por outro lado da maior seletividade dos pesticidas microbianos, que haja

uma tendência de crescimento na sua utilização. Um dos principais agentes

destes produtos é Bacillus thuringiensis, que produz toxinas ativas contra

determinadas pragas agrícolas. Atualmente, diversos pesticidas

microbianos existentes no mercado, naturais ou geneticamente

modificados, contém B. thuringiensis ou seus genes.

Embora a utilização destes MGMs possa representar um grande

avanço em vários processos produtivos e mesmo na recuperação de

áreas degradadas, o seu emprego gerou uma saudável discussão sobre a

relação entre os benefícios e os possíveis riscos envolvidos nos processos

biotecnológicos. Tal questionamento é decorrente de um histórico de

"novas tecnologias", desenvolvidas especialmente pela física e química,

que embora tenham contribuído para a melhoria da qualidade de vida do

homem, geraram uma série de efeitos colaterais indesejáveis e cujas

conseqüências sofremos até hoje (Keeler,1988).

Uma das principais questões relativas ao uso dos MGMs está

relacionada à sua liberação acidental ou proposital no ambiente. A

necessidade de se conhecer o impacto destes microrganismos e do seu

DNArec no ambiente levou a adoção dos "Estudos de Avaliação de

 3

Risco" como critério para autorização legal da sua utilização. Os inúmeros

estudos realizados, especialmente nos países desenvolvidos, elegeram

alguns itens relevantes cuja abordagem é recomendável nestes estudos

(Tabela 1.1). Estes itens também compõem, basicamente, a normatização

proposta pela UNEP, para estudos desta natureza, cuja adoção foi aprovada

pela reunião das partes (COP-3) da Convenção de Biodiversidade em

novembro de 1996 (UNEP, 1996). Todavia a abordagem a ser adotada num

determinado estudo de risco é estabelecida em função do tipo de organismo

e da finalidade a que se destina. Considerando a especificidade deste tipo

de análise, os resultados obtidos para um MGM, num determinado tipo de

ambiente, não podem ser extrapolados para outro tipo de MGM, ainda que

se trate da mesma estirpe, no mesmo ambiente, ou então, para o mesmo

organismo em um outro ambiente, ainda que semelhante ao estudado

anteriormente. Por isso, estes estudos devem ser desenvolvidos, passo a

passo e caso a caso, buscando fornecer a maior quantidade possível de

informações relevantes para subsidiar as decisões legais pelos órgãos

competentes.

De um modo geral, existem dois tipos básicos de riscos envolvidos

na introdução de MGMs no ambiente: (1) as células hospedeiras contendo

o DNArec podem demonstrar patogenicidade previamente desconhecida,

apresentando risco de infecção para plantas e animais, e (2) os MGMs

 4

ou os hospedeiros subseqüentes do DNArec podem ter efeitos prejudiciais

sobre os ecossistemas naturais, apresentando uma vantagem seletiva que

possa alterar a microbiota autóctone e potencialmente o ciclo de

nutrientes, o fluxo de energia e as propriedades do ecossistema (Jain et al.,

1988). No caso de países tropicais, uma outra questão importante a ser

considerada é o possível efeito que a liberação destes organismos possa

exercer sobre a biodiversidade, ainda desconhecida, das comunidades

microbianas autóctones.

Na maioria dos casos, os fatores que determinam o sucesso da

introdução de um MGM no ambiente são os próprios fatores de risco.

Estes incluem: sobrevivência, crescimento, competitividade, e

espalhamento (transporte) do organismo introduzido no ambiente natural e

a persistência, espalhamento e proliferação das seqüências do DNA

heterólogo presente no organismo. Além disso, a extensão esperada da

expressão do gene introduzido no ambiente é um outro fator determinante,

tanto de efeito quanto de risco (Van Elsas & Trevors, 1991). Por esta

razão, os estudos acadêmicos de avaliação de risco têm enfocado

basicamente estes fatores e têm sido realizados utilizando modelos

visando o desenvolvimento de técnicas cada vez mais acuradas para o

acompanhamento do destino do organismo hospedeiro (MGM) e do seu

DNArec no ambiente. Como visam determinar o risco associado à

 5

liberação de MGMs no ambiente, estes estudos não podem, obviamente,

ser realizados em campo. Para esta finalidade, portanto, são utilizados

sistemas controlados de laboratório - microcosmos - que visam simular

o mais aproximadamente possível as condições ambientais.

Um microcosmo é definido como: "um sistema de laboratório que

tenta simular o mais realisticamente possível as condições predominantes

no ambiente ou na parte dele que é estudada” (Wimpenny, 1988). Uma vez

que são sistemas de laboratório, torna-se possível a introdução de

substâncias químicas tóxicas, substâncias radioativas e/ou MGMs.

Microcosmos, bem planejados, devem eliminar problemas técnicos

inerentes aos experimentos de campo, porém, mantendo a maior parte da

complexidade ambiental (Wagner-Döbler et al., 1992). Vários autores têm

utilizado, com sucesso, microcosmos para estudar o destino e os efeitos de

microrganismos geneticamente modificados no ambiente (Awong et al.,

1990; Dwyer et al, 1988; McClure et al., 1989; Orvos et al., 1990; Pipke et

al., 1992; Trevors et al., 1989; Trevors et al., 1990a e 1990b; van Elsas et

al., 1991a e 1991b). Algumas questões, no entanto, têm sido levantadas em

relação à possibilidade de extrapolação destes dados para o ambiente. Por

isso, alguns estudos têm sido realizados com o objetivo de verificar a

validade dos dados experimentais obtidos. Wagner-Döbler et al. (1992), em

sua comparação entre microcosmos aquáticos com sedimento e o ambiente

 6

natural do qual eles foram coletados, constataram que os parâmetros

ambientais monitorados não variavam significativamente por um período

de até 4 semanas. Este fato levou-os a concluir que os microcosmos,

durante este período, retratavam fielmente o ambiente estudado.

O solo, entretanto, difere dos ecossistemas aquáticos pela presença e

distribuição heterogênea, em distâncias muito pequenas (micrômetros), de

sólidos, água e gases. Esta heterogeneidade afeta os processos metabólicos

das células individuais, exercendo efeitos sobre a disponibilidade de

substratos e as condições físicas e químicas que as cercam (van Elsas & van

Overbeek, 1993). Ela também afeta a ecologia dos microrganismos, em

termos das interações tróficas com outros microrganismos do solo.

Diversos estudos, utilizando microcosmos de solo (Araújo et al.

1993; van Elsas & Trevors, 1990; van Elsas et al., 1991d), têm

demonstrado que estes fornecem dados extremamente úteis e bastante

próximos dos obtidos nos microplots de campo, embora ainda haja dúvidas

sobre a sua representatividade. Vários fatores podem influir na

significância de um microcosmo de solo, devendo ser considerados: o uso

de solo intacto ou peneirado, a idade do sistema, o período de aclimatação

e a densidade do inóculo da estirpe introduzida e a densidade da

população natural. No entanto, a falta de padronização de métodos para

estudos utilizando microcosmos, aliado ao fato de que estes experimentos

 7

são, em geral, de curta duração, dificulta a extrapolação dos dados obtidos

( van Elsas & Trevors, 1991). Apesar destas restrições, os microcosmos de

solo continuam sendo um instrumento indispensável para os estudos de

avaliação de risco, na medida em que estes, pelo menos inicialmente, só

podem ser realizados em laboratório.

Os estudos de avaliação de risco têm sido realizados utilizando-se,

basicamente, modelos de hospedeiros e de vetores, visando determinar o

seu comportamento no ambiente. O modelo de hospedeiro a ser

selecionado depende da sua finalidade e do ambiente em que se dará a sua

liberação. Por exemplo, um microrganismo que será utilizado num

processo industrial, sendo artificialmente cultivado, dificilmente poderia ser

utilizado, com sucesso, para colonização de uma raiz ou mesmo para a

biodegradação de um composto tóxico em um corpo d'água. Por estas

razões, surgiu o conceito de microrganismo ecologicamente adaptado, ou

seja, os hospedeiros do DNArec deveriam ser selecionados

preferencialmente dos ambientes aos quais deveriam ser aplicados,

aumentando desta forma a sua sobrevivência e conseqüentemente a sua

eficiência. Um dos modelos de hospedeiro que tem sido bastante estudado

é constituído por estirpes de Pseudomonas fluorescens ecologicamente

adaptadas a diversos habitats e modificadas geneticamente com genes

variados.
 8

As populações de MGMs introduzidas no ambiente apresentam, de

um modo geral, 2 padrões de comportamento: 1) o organismo introduzido

tem uma vantagem ecológica em relação a população nativa ou ocupa um

nicho específico sem competidores; 2) o organismo introduzido não tem

nenhuma vantagem ecológica ou mesmo está em desvantagem em relação à

população nativa do solo. Os microrganismos manipulados para utilizarem

certos substratos xenobióticos ou bactérias que vivem em simbiose com um

hospedeiro específico, tal como rizóbios ou bactérias fitopatogênicas, são

um exemplo do primeiro padrão. Nestes casos, não são necessários

números extremamente elevados de microrganismos sobrevivendo por

longos períodos de tempo para se obter o efeito desejado. Por exemplo,

apenas 102 - 103 células de Rhizobium por grama de solo são necessárias

para nodular eficientemente plantas leguminosas. Os outros MGMs,

como os pesticidas microbianos, reagem, em geral, de acordo com o

segundo padrão de comportamento. Portanto, para estes, seriam

provavelmente necessários números bastante elevados de bactérias

introduzidas para que estas sobrevivessem o tempo necessário para tornar

efetiva a sua aplicação (van Elsas et al.,1991d). Diversos estudos realizados

com Pseudomonas fluorescentes, em diferentes sistemas (microcosmos e

microplots) e diferentes tipos de solo, revelaram que independentemente

do seu marcador genético, todas apresentaram um comportamento

 9

semelhante após a introdução, ou seja, um declínio progressivo em

intervalos de tempo que variavam de semanas a meses. (Araújo et al., 1993;

Compeau et al.,1988; Dupler & Baker, 1984; van Elsas et al., 1986; van

Elsas & Trevors, 1990). Respostas semelhantes foram obtidas para outras

bactérias introduzidas, como, por exemplo, Salmonella typhimurium,

Klebsiella pneumoniae (Liang et al., 1982), Flavobacterium e Alcaligenes

spp. (Thompsom et al., 1990).

No entanto, a introdução destes organismos nos ambientes naturais,

em elevadas densidades, aumenta o risco associado a sua dispersão para

outras áreas a partir do ponto de inoculação. Portanto, a realização de

estudos, visando determinar a probabilidade e a extensão da sua

disseminação no ambiente, é extremamente importante.

A presença dominante de sólidos torna o solo praticamente estático

e não permite muita mistura ou mobilidade microbiana. Assim, o transporte

e movimento das bactérias no solo é principalmente passivo, sendo a água e

os animais do solo como os nematódeos, microartrópodes e oligoquetas, os

seus principais vetores (Clegg et al., 1995; Madsen & Alexander, 1982;

Trevors et al., 1990b). Inicialmente, as células introduzidas no solo não se

encontram estreita ou irreversivelmente ligadas às partículas de solo e

podem ser deslocadas e transportadas com relativa facilidade pela

percolação da água (Trevors et al., 1990b). Em vários estudos, demonstrou-

 10

se que bactérias adicionadas ao solo para propósitos agrícolas são

transportadas verticalmente pela percolação da água, tanto no campo (van

Elsas et al., 1986) quanto em microcosmos de 10 - 60 cm de comprimento

(Fredrickson et al., 1989; Hekman et al., 1994 e 1995; Madsen &

Alexander, 1982; Trevors et al., 1990b; van Elsas et al., 1991c). O grau

de transporte de um microorganismo através do solo é afetado tanto pelas

características do solo, como teor de matéria orgânica, textura e teor de

umidade quanto pelas suas próprias características, como hidrofobicidade

celular, capacidade de adesão e produção de polímeros extracelulares,

sendo portanto um fenômeno bastante particularizado (van Elsas & van

Overbeek, 1993). De um modo geral, o solo exerce um efeito restritivo ao

transporte, funcionando como um filtro na retenção de partículas. No

entanto, a presença de heterogeneidades, como por exemplo, rachaduras,

canais de raízes e túneis da mesofauna que constituem vias preferências de

fluxo, facilitam o transporte de microorganismos (Yates & Yates,1991). O

transporte de MGMs pela água é importante na medida em que estas

bactérias podem contaminar águas subterrâneas, ou mesmo, no caso de

regiões com regime de chuvas abundantes e torrenciais, como as regiões

tropicais e subtropicais, elas podem também contaminar corpos d'água

próximos como rios e lagos via "run off".

 11

Um estudo realizado por van Overbeek et al. (1990) revelou que

após um ano ainda era possível detectar a presença de Pseudomonas

fluorescens, geneticamente modificada, em água de drenagem agrícola e

que esta se apresentava, na maioria das vezes, sob a forma não cultivável.

Tal fato pode ser atribuído à privação de nutrientes sofrida pela população

neste ambiente oligotrófico (Morita, 1988).

A introdução, proposital ou incidental, de microorganismos

geneticamente modificados em ambientes naturais oligotróficos, como os

ambientes aquáticos, por exemplo, apresenta outros aspectos importantes

que abrangem os mecanismos adaptativos ao estresse ambiental e que

podem afetar não apenas o seu desempenho esperado no ambiente como

também a eficiência do seu monitoramento.

As bactérias, geralmente, necessitam expressar apenas parte do seu

genoma para se tornarem unidades estruturais e funcionais do seu ambiente.

As contínuas mudanças nas condições ambientais podem ser suportadas por

mecanismos complexos, porém eficientes, de alteração no padrão de

expressão gênica. Dentre os parâmetros ambientais, que comumente

modulam as propriedades das células bacterianas na natureza, a

concentração de macronutrientes é particularmente importante (Nyström,

1993). Os ambientes naturais apresentam freqüentemente escassez de

alguns ou de vários nutrientes essenciais, e os microorganismos encontram-

 12

se, em geral, expostos à privação de macronutrientes (Moriarty & Bell,

1993; Morita, 1993; van Elsas & van Overbeek, 1993). Enquanto a

exaustão de um determinado composto requer a indução de certos óperons,

a limitação dos macronutrientes constitui um estresse mais complexo,

envolvendo sistemas globais de controle, cuja regulação ocorre acima do

nível de óperon. Os sistemas globais de controle consistem de mútiplos

genes e óperons não ligados entre si e controlados de forma coordenada por

um sinal ou gene regulatório comum (Nyström, 1993). Vários destes

sistemas são ativados em resposta a uma variedade de tipos de estresse,

como por exemplo, mudanças de temperatura, exposição à irradiação,

danos físicos, substâncias químicas e privação nutricional. Exemplos destas

redes regulatórias globais incluem a resposta SOS (controlada pelo gene

lexA), a resposta ao estresse oxidativo (controlada pelo gene oxiR) e a

resposta ao choque por aquecimento (controlada pelo gene rpoH)

(Nyström, 1993).

O mecanismo de adaptação de bactérias copiotróficas não

esporulantes é um processo que envolve mudanças seqüenciadas na

fisiologia celular (Morita, 1993) e alterações menores na sua ultraestrutura

(Kjelleberg et al., 1987; Morita, 1988, 1993). As alterações fisiológicas

características das bactérias em privação nutricional dependem do

organismo, da taxa de crescimento das células, da qualidade nutricional do

 13

meio, da densidade populacional das células e da natureza do ambiente em

que estão submetidas à privação nutricional.

As alterações fisiológicas e bioquímicas sofridas por estes

organismos incluem: redução na síntese de todas as macromoléculas,

inclusive proteínas, e ácidos nucleicos (Oliver,1993), aumento súbito da

taxa respiratória imediatamente após o início do estresse, seguido de uma

redução brusca (Barcina et al., 1989), alterações na peptidoglicana

(Nyström & Kjelleberg, 1989) e alteração qualitativa na composição

lipídica da membrana celular. Além destas, ocorrem também alterações

morfológicas resultantes de um processo de redução das dimensões

celulares, possivelmente, direcionado à otimização da concentração interna

de nutrientes (Gottschal, 1992).

Uma das conseqüências destes mecanismos adaptativos, apresentada

por alguns grupos de bactérias, é a perda da capacidade de crescimento nos

meios de cultivo, seletivos ou não, normalmente empregados para a sua

detecção, o que caracteriza a sua entrada num estado, comumente

designado, viável porém não cultivável (VNC). Este estado é de

considerável interesse para a compreensão da ecologia microbiana em geral

e é especialmente preocupante em relação à liberação de microorganismos

geneticamente modificados no ambiente. A possível transformação destes

organismos em formas não cultiváveis não apenas dificulta sua detecção,

 14

mas, principalmente, a determinação de suas interações com a biota e os

seus efeitos a longo prazo sobre os ecossistemas.

Neste sentido, torna-se importante a utilização de métodos mais

acurados para detecção destes microrganismos ou mesmo do seu DNArec.

Todavia as técnicas disponíveis ainda não possuem a sensibilidade

desejável. O uso de técnicas de imunofluorescência, baseadas em antissoros

produzidos contra células bacterianas cultivadas em laboratório, pode não

apresentar a mesma especificidade contra células adaptadas ao ambiente,

devido às alterações que ocorrem na superfície destes organismos

(Lugtenberg & Van Alphen, 1983). As técnicas de hibridização com sonda

específica de DNA também apresentam limitações quanto a sua

sensibilidade, sendo capazes de detectar o DNA heterólogo apenas

3 4
quando a densidade de MGMs for da ordem de 10 a 10 células/g para

solos e cerca de 102 células/ml para ambientes aquáticos. O

desenvolvimento da técnica de PCR (polymerase chain reaction) (Saiki et

al., 1988), que consiste na amplificação enzimática de uma seqüência alvo

específica de DNA, permite teoricamente uma substancial redução no

limite de até cerca de uma cópia de DNA por amostra. Esta técnica foi

utilizada com sucesso para detecção de seqüências específicas de DNA

presentes em Burkholderia cepacea, introduzida em amostras de

sedimentos (Steffan & Atlas, 1988). Entretanto, a sua aplicação em

 15

amostras de solo é ainda prejudicada pela presença de impurezas nos

extratos de DNA total de solo que inibem a reação. A baixa eficiência dos

métodos de extração de DNA total das amostras para amplificação, in vitro,

que requerem um grande número de etapas de purificação e que resultam

em elevadas perdas na quantidade de DNA extraído, é um outro fator que

pode dificultar a detecção de organismos não cultiváveis e/ou presentes em

baixas densidades. As modificações adaptativas sofridas pelos organismos

não cultiváveis parecem também influir sobre a sensibilidade da detecção

pela técnica do PCR. Brauns et al. (1991) relatam que para amplificar o

DNA de Vibrio vulnificus, em estado não cultivável, era necessária a

extração de cerca de 400 vezes mais DNA do que a requerida para as

formas cultiváveis deste organismo. Bej & Mahbubani (1992) e Steffan &

Atlas (1992) também apontam, em suas revisões, a necessidade de alto grau

de pureza dos ácidos nucleicos para o sucesso da amplificação do DNA de

microorganismos presentes em amostras ambientais. Os métodos mais

recentes envolvendo diversas rodadas repetidas de amplificação, aumentam

a sensibilidade da técnica, porém, assim como as demais técnicas

moleculares, apenas detectam a presença do DNA recombinante sem

informar se ele está presente no hospedeiro original, num outro organismo

da biota ou mesmo sob a forma de DNA livre. Por isso, a utilização de

 16

diversas técnicas combinadas de detecção é o procedimento mais

aconselhável para o monitoramento dos MGMs no ambiente.

As modificações globais no padrão de expressão gênica, decorrentes

da exposição aos fatores de estresse ambiental, também podem acarretar

modificações no padrão de expressão gênica do gene introduzido. Tal fato

pode, na melhor das hipóteses, anular o efeito ecológico projetado para o

MGM e dificultar a sua detecção, devido a não expressão do caráter

introduzido e dos genes marcadores seletivos ou eletivos. Porém, em alguns

casos como nos dos pesticidas microbianos, a expressão reduzida do gene

pode apresentar efeitos bastante prejudiciais, como a indução de resistência

às toxinas utilizadas nas populações alvo. No entanto, nenhum estudo ainda

foi desenvolvido enfocando especificamente esta questão.

A exposição à privação nutricional, além das conseqüências

descritas anteriormente, pode também gerar, em algumas bactérias, o

desenvolvimento de proteção cruzada a outros tipos de estresse. Este

mecanismo torna estas células muito mais resistentes as situações de

estresse, que de outra forma, lhes poderiam ser letais. As células de Vibrio

sp.S14 submetidas à privação de carbono e de múltiplos nutrientes

(carbono, nitrogênio e fósforo) são mais resistentes à autólise induzida pela

ampicilina, ao tratamento por ultrasom (Nyström & Kjelleberg, 1989), ao

aquecimento, à irradiação UV e a exposição as altas concentrações de

 17

cloreto de cádmio (Nyström et al., 1992). O mesmo mecanismo tem sido

observado em estirpes de E. coli (Jenkins et al., 1988 e 1990; Matin, 1991),

de P. putida (Givskov et al., 1994) e de P. fluorescens (van Overbeek et al.,

1995). A ocorrência deste mecanismo em um MGM pode alterar

significativamente a sua sobrevivência no ambiente, assim como os

procedimentos previstos para o seu extermínio. O conhecimento da

resposta do organismo geneticamente modificado ao estresse ambiental é

também de fundamental importância para o planejamento das medidas a

serem adotadas para a sua contenção biológica.

O efeito conjugado destes mecanismos adaptativos de resistência ao

estresse nutricional, associado ao uso continuado dos MGMs em áreas

agrícolas, pode resultar numa contaminação persistente dos ambientes

aquáticos adjacentes. Esta contaminação, além de indesejável, traz também

a possibilidade de transferência do DNA recombinante para a microbiota

nativa destes ambientes.

Um dos tópicos mais importantes enfocados pelos estudos de

avaliação do risco envolvido na liberação, acidental ou proposital, de um

microorganismo geneticamente modificado, no ambiente, é a determinação

da probabilidade de ocorrência de transferência gênica horizontal do DNA

recombinante para as comunidades microbianas nativas.

 18

Atualmente, é um fato conhecido que a transferência gênica

horizontal, entre bactérias, desempenha um importante papel na

manutenção da plasticidade genética das populações, através dos

mecanismos de recombinação, contribuindo para a sua adaptação às

mudanças ambientais (Lorenz & Wackernagel, 1994).

A probabilidade de ocorrência dos diferentes mecanismos de

transferência gênica, conjugação, transdução ou transformação, é

determinada pelo conjunto das características apresentadas pelo ambiente

estudado, uma vez que cada mecanismo apresenta determinados pré-

requisitos ecológicos.

A conjugação requer que a célula doadora contenha o elemento

conjugativo, plamídio ou transposon, e que estabeleça com a receptora um

contato físico suficientemente estável para permitir a transferência do

DNA. Ambas precisam ainda apresentar atividade metabólica que permita a

síntese de DNA e outras atividades correlatas (Ippen-Ihler, 1989). A

probabilidade de ocorrência de transferência gênica por conjugação, entre

microorganismos geneticamente modificados e componentes das

comunidades microbianas naturais, vem sendo também minimizada pela

utilização de vetores que permitam a inserção do DNA heterólogo no

cromossomo bacteriano.
 19

A transdução também requer uma célula doadora metabolicamente

ativa, na qual as partículas transdutoras do fago possam ser produzidas

durante a replicação viral. As células doadoras podem estar separadas

espacial e temporalmente das receptoras, porque a informação contida na

partícula transdutora pode persistir no ambiente (Kokjohn, 1989). Porém,

estas devem estar relacionadas por uma sensibilidade em comum ao

bacteriófago.

A transformação, comparativamente, é um dos mecanismos menos

exigentes. A célula doadora não precisa sequer estar viva, porque o DNA

livre, liberado pela sua morte e lise, é suficiente para promover a

transformação. Não há necessidade de contato entre doadora e receptora,

sendo a distância máxima, espacial e temporal, existente entre elas

determinada pela persistência e disseminação do DNA no ambiente (Leff et

al., 1992). A receptora deve apresentar uma atividade metabólica que lhe

permita absorver e incorporar o DNA transformante. Finalizando, a

transferência gênica por transformação pode ocorrer entre organismos

pertencentes a diferentes grupos taxonômicos (Smith et al., 1981). Estas

características permitem que a transformação natural ocorra mesmo em

populações e comunidades submetidas à variações ambientais extremas ou

que apresentem grandes flutuações na sua dinâmica populacional (Lorenz

& Wackernagel, 1994).

 20

A possibilidade de ocorrência de transferência gênica, por

transformação, nos ambientes aquáticos, é enfatizada pela presença ubíqua,

nestes ambientes, de DNA extracelular em quantidades apreciáveis (De

Flaun et al., 1989; Karl & Bailiff, 1989; Paul et al., 1987, 1988 e 1989) e

teoricamente disponível para transformação. A origem deste DNA livre não

está apenas relacionada à morte e lise das células, mas também aos

processos de excreção ativa apresentados por microorganismos presentes

no ambiente. A existência destes processos naturais, de excreção ativa de

DNA, tem sido demonstrada para diversas bactérias (Catlin, 1956 e 1960;

Dorward et al., 1989; Dorward & Garon, 1990; Lorenz et al., 1991; Paul et

al., 1987; Sinha & Iyer, 1971; Takahashi & Gibbons, 1957).

Paul & David (1989) demonstraram, em seu estudo realizado em

microcosmos de água do mar, que estirpes geneticamente modificadas de E.

coli, P. aeruginosa, B. cepacea e Bradyrhizobium japonicum também

excretavam DNA extracelular e que a comunidade microbiana nativa podia

utilizá-lo prontamente. Porém, devido à metodologia empregada, não foi

possível distinguir se o DNA extracelular produzido pelas estirpes foi

transformado ou simplesmente utilizado como nutriente. Estes resultados,

entretanto, são relevantes na medida em que demonstram que as bactérias

geneticamente modificadas, introduzidas nos ambientes aquáticos, podem

 21

contribuir para o “pool” de DNA potencialmente transformável destes

ambientes numa escala maior do que a esperada.

Alguns estudos têm sido realizados com o objetivo de verificar a

ocorrência de transferência gênica, por transformação, de seqüências de

DNA recombinante em microcosmos aquáticos (Chamier et al., 1993;

Frischer et al., 1990; Jeffrey et al., 1990; Leff et al., 1992; Lorenz et al.,

1988; Lorenz & Wakernagel, 1990; Paul et al., 1991 e 1992; Romanowski

et al., 1993; Stewart & Sinigalliano, 1990; Stewart et al., 1991), porém, a

maioria deles não enfoca a transferência para a microbiota nativa, havendo

neste aspecto uma relativa escassez de informações.

Atualmente, em decorrência dos interesses econômicos envolvidos

nesta área, os estudos de avaliação de risco ou impacto, relacionado à

liberação de microorganismos geneticamente modificados no ambiente, não

são mais realizados apenas academicamente, não sendo portanto divulgados

os seus resultados. A visão política focalizada nas perspectivas econômicas

e o interesse neste mercado nascente, e de grande potencial, têm levado os

países desenvolvidos, principais produtores dos produtos biotecnológicos, a

flexibilizarem cada vez mais as regras e pré-requisitos exigidos para a

liberação de MGMs no ambiente. Esta flexibilização, porém, não decorre

de um acervo sólido de informações sobre a biossegurança da utilização

destes organismos, até porque, neste tipo de estudo, cada caso deve ser
 22

analisado individualmente. Um exemplo disto é a liberação para a

comercialização, concedida pela Environmental Protection Agency (EPA),

nos Estados Unidos, de uma estirpe geneticamente modificada de

Rhizobium meliloti, que contém, além de outros genes, diversos

marcadores de resistência a antibióticos (PEER, 1995). Desde o início dos

estudos que enfocam a utilização de MGMs com propósitos ambientais, a

liberação, em escala comercial, de microorganismos contendo marcadores

de resistência a antibióticos, no ambiente, era considerada tabu, em função

dos riscos inerentes à transferência destas características através de

mecanismos bem conhecidos e estudados. Outro fato que ressalta esta

tendência é uma regulamentação propondo que todas as formas

geneticamente modificadas de Rhyzobium e Bradyrhizobium sejam

consideradas seguras, quanto à sua liberação ambiental, independentemente

do tipo de modificação sofrida e da origem e tipo de genes introduzidos,

estando também incluídos aqueles que possam lhes conferir patogenicidade

(PEER, 1995). Neste contexto, os órgãos responsáveis pela biossegurança

destes produtos estão se tornando meramente burocráticos, expedindo

apenas licenças de comercialização dos produtos biotecnológicos, sem uma

análise criteriosa da sua biossegurança.

No Brasil, embora a indústria biotecnológica ainda esteja nos seus

primórdios, a recente aprovação da lei de patentes, incluindo o

 23

patenteamento de microorganismos geneticamente modificados, servirá

provavelmente como estímulo para a introdução de produtos

biotecnológicos importados no mercado interno. A legislação brasileira de

Biossegurança, aprovada em 1995 (D.O.U. de 6/1/1995 e 21/12/1995),

prevê que a permissão para liberação de microorganismos geneticamente

modificados no ambiente requer a análise por órgãos competentes de

estudos de avaliação dos riscos e impacto envolvidos nesta liberação, sem

porém definir que instituições deveriam realizá-los. Presume-se que a

exigência prevista na lei destes estudos, como pré-requisito, deva partir da

premissa destes serem realizados por instituições insuspeitas. Neste

aspecto, algumas dificuldades quanto à implementação da Lei tornam-se

evidentes. A maioria das instituições públicas, responsáveis pelo controle

ambiental, não estão preparadas, ou seja, não possuem recursos,

equipamentos ou pessoal qualificado, para a realização deste tipo de análise

cara e especializada.

A quase totalidade dos dados disponíveis sobre o destino e

efeito de microrganismos modificados no ambiente é proveniente de

experimentos realizados em regiões de clima temperado ou frio, com

tipos de solo, ambientes aquáticos e linhagens de microrganismos

característicos destas regiões e, portanto, a sua extrapolação, ainda que

teórica, para as condições brasileiras é bastante discutível. No Brasil, no

 24

entanto, pouquíssimos dados encontram-se disponíveis em relação ao

possível risco associado à utilização ambiental de MGMs.

O presente estudo faz parte de um projeto desenvolvido pelo

Laboratório de Ecologia e Taxonomia Microbiana, em colaboração com o

Institute for Soil Fertility Research (IPO-DLO) da Holanda e financiado

pela U.E., com o objetivo de avaliar o potencial biotecnológico de estirpes

de microorganismos isoladas de solo brasileiro, enfocando os possíveis

riscos envolvidos na sua liberação no ambiente. A bactéria selecionada foi

uma estirpe (BR5) de Pseudomonas fluorescens que é a espécie

predominante em rizosfera de milho cultivado em latossolo vermelho-

amarelo no Estado do Rio de Janeiro. Mutantes naturais desta estirpe,

resistentes à rifampicina, foram modificados geneticamente pela

introdução, no cromossomo, do transposon Tn5 contendo o gene cryIVB,

que codifica uma endotoxina de Bacillus thuringiensis, e o gene nptII como

marcador de resistência à canamicina. Dentre os mutantes geneticamente

modificados, foi selecionado o que apresentou uma maior capacidade de

crescimento, sendo denominado BR12, e posteriormente utilizado como

modelo de MGM nos estudos desenvolvidos (Araújo et al., 1996). Estudos

prévios realizados por Araújo et al. (1993, 1995 e 1996) já analisaram

alguns aspectos relativos à introdução deste MGM no ambiente, como por

exemplo, a sua sobrevivência em solos argilosos e arenosos e como ela é

 25

influenciada por fatores bióticos e abióticos, a sua capacidade de colonizar

a rizosfera de milho e o seu desempenho competitivo em relação à estirpe

parental. A expressão gênica do gene cryIVB pela estirpe BR12, assim

como a possível transferência gênica do DNA recombinante, por

conjugação, em solos, também foram estudadas, porém os resultados ainda

não foram publicados (Araújo, 1994).

O presente trabalho investigou a possibilidade de dispersão e

espalhamento deste MGM no ambiente a partir do ponto de inoculação no

solo, através das chuvas, causando contaminações em lençóis d'água

subterrâneos ou em corpos d’água adjacentes e algumas de suas possíveis

conseqüências. Foram estudados: o transporte vertical do MGM e de sua

estirpe parental através do solo; a sobrevivência do MGM e a persistência

do seu DNA recombinante em ambientes aquáticos oligotróficos; a

aquisição de resistência aos fatores de estresse decorrentes da sua

introdução nestes ambientes; a transferência gênica, por transformação, do

DNA recombinante para a comunidade microbiana autóctone destes

ambientes.
 26

Tabela 1.1. Resumo dos pontos principais para o “Estudo de Avaliação de

Risco” da introdução de um MGM no ambiente, pelas regulamentações da
Austrália, Canadá, E.U.A. (EPA, USDA), Nova Zelândia e União Européia,
(Levin, 1994).

I - Resumo:
♦ Objetivo
♦ Possibilidades
♦ Benefícios e Riscos
♦ Justificativa
II - Características genéticas dos organismos - Parental e Receptor.
Identificação
♦ Descrição taxonômica
♦ Métodos utilizados para taxonomia
Genótipo
♦ Caracterização do material genético: cromossomo, transposon,
plasmídio.
Potencial de transferência gênica
♦ Capacidade de transformação, conjugação e transdução
♦ Evidência de transferência na natureza
 27

Tabela 1.1. Continuação.

II - Características genéticas dos organismos - Parental e Receptor

(cont.).
Fenótipo
♦ Motivo da seleção
♦ Modificações antecipadamente esperadas no hospedeiro
♦ Requerimentos para cultivo, ciclo de vida, habitat
♦ Dados sobre a patogenicidade (tipo, virulência)
♦ Resistência à e produção de antibióticos
♦ Dados sobre a sobrevivência e persistência
Mecanismos de controle: agentes naturais, desinfetantes eficientes
III - Introdução do material genético
Como foi modificado
♦ Origem e função do DNA inserido
♦ Métodos utilizados para identificação, isolamento e inserção do DNA
Vetor
♦ Identificação
♦ Sítio de inserção do gene
♦ Método de introdução no hospedeiro
♦ Caracterização dos genes inseridos:
Localização, quantidade, estabilidade, persistência do DNA vetor
Comparação com a estirpe parental
♦ Dados laboratoriais descrevendo sobrevivência, persistência,
multiplicação e disseminação
 28

Tabela 1.1. Continuação.

IV - Considerações ambientais - Parental e Receptor

Organismo
♦ Habitat
♦ Fatores de sobrevivência: dados obtidos em microcosmos, condições
experimentais favoráveis e desfavoráveis ao crescimento e à
sobrevivência
♦ Dados descrevendo a sobrevivência, replicação, disseminação e o
potencial de interação biológica
♦ Identificação do potencial de gerar efeitos adversos
Tentativa de liberação
♦ Condições da tentativa
♦ Local
♦ Características do local
Probabilidade de disseminação, descrição das populações alvo e não
alvo presentes
♦ Contenção
♦ Procedimentos a serem adotados:
Procedimentos de contenção (física e biológica) no local de aplicação,
procedimentos para o transporte, treinamento de pessoal, procedimentos
de segurança
 29

Tabela 1.1. Continuação.

IV - Considerações ambientais - Parental e Receptor (cont.)

Monitoramento
♦ Descrição das técnicas (discussão de sensibilidade e confiabilidade)
♦ Discussão dos dados disponíveis sobre o resgate no ambiente,
sensibilidade e confiabilidade das técnicas para o MGM e a estirpe
parental
Procedimentos de mitigação
♦ Procedimentos de extermínio
♦ Procedimentos de descarte
♦ Procedimentos de desinfecção
 30

2. OBJETIVOS:

1. Verificar a ocorrência do transporte vertical pela água de P. fluorescens

BR12, em microcosmos contendo perfis inalterados de solo, comparando o

seu comportamento com a estirpe parental e analisando a influência das

características do solo, de fatores climáticos e também da sobrevivência

destes organismos nos percolados sobre a sua dispersão no ambiente;

2. Verificar a sobrevivência de P. fluorescens BR12 e a persistência do seu

DNA rec em ambientes aquáticos oligotróficos, utilizando microcosmos de

água de nascente, e enfocando os seguintes aspectos: cultivabilidade,

viabilidade, alterações morfológicas e a influência da microbiota autóctone

sobre a sobrevivência da estirpe;

3. Verificar a resposta de P. fluorescens BR12 à privação nutricional, em

meios minerais e em microcosmos aquáticos oligotróficos, e o

desenvolvimento de resistência aos outros tipos de estresse em decorrência

da privação nutricional;
 31

4. Verificar a ocorrência de transferência gênica, por transformação, entre a

bactéria geneticamente modificada e as populações naturais da água de

nascente, em filtro e em microcosmos.

 32

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Estirpe selecionada como modelo de MGM:

Nos experimentos foi utilizada uma estirpe de Pseudomonas

fluorescens, oriunda de rizosfera de milho (Araújo,1994). Esta estirpe foi

selecionada por pertencer à espécie predominante neste habitat e, a partir

dela, foi selecionada uma mutante portadora de resistência natural a

rifampicina, que foi designada BR5. A mutante BR5 foi modificada

geneticamente, no Institute for Soil Fertility - ITAL (Holanda), pelos Profs.

Allen N. Hagler e Leda C. S. Mendonça, passando a ser designada BR12.

A modificação consistiu na introdução do DNArec, correspondente ao gene

"cry IVB", que codifica a delta toxina em Bacillus thuringiensis var.

morrisoni. O vetor utilizado foi o transposon Tn5 que contém o gene nptII,

um marcador de resistência à canamicina (50μg/ml). O transposon

Tn5::cryIVB foi clonado no plasmídio suicida pSUP de uma estirpe de

Escherichia coli doadora (S 17.1) e transferido para a estirpe selecionada

de P. fluorescens por conjugação em filtro. Os recombinantes dessa

conjugação foram detectados por características fenotípicas (crescimento

em meio seletivo contendo canamicina) e confirmados por detecção

direta do gene, através da técnica de hibridização em colônias utilizando

 33

32
sonda específica de DNA marcada com P. A utilização do tranposon

(Tn5) como vetor, associado ao plasmídio suicida (pSUP), teve como

objetivo restringir a possibilidade de transferência do gene por

conjugação.

Nos experimentos de transporte através do solo foram utilizadas a

estirpe geneticamente modificada de P. fluorescens (BR12) e a estirpe

parental (BR5), visando determinar e comparar a sua sobrevivência e

transporte pela água em microcosmos de solo e na água percolada do solo.

Os experimentos de sobrevivência e transferência gênica por transformação

em água de nascente e de resistência cruzada ao estresse foram realizados

apenas com o MGM.

3.1.1. Manutenção das culturas e preparo dos inóculos para os

microcosmos

As culturas das estirpes de P. fluorescens BR5 e BR12 foram

mantidas em meio estoque semi-sólido de Luria Bertani (Sambrook et al..,

1989) com 30% de glicerol e com os antibióticos específicos para cada

estirpe, ou seja, rifampicina (50μg/ml) para a BR5 e rifampicina e

canamicina (50μg/ml) para a BR12. As culturas estoque foram mantidas

em freezer a -200C. Os inóculos, utilizados nos experimentos, foram

preparados em caldo Luria Bertani (LB), acrescido dos antibióticos

 34

específicos. Para os experimentos com microcosmos de solo, que

requeriam inóculos com alta densidade de células, foram preparados pré-

inóculos, a partir das culturas estoque, em 50 ml de caldo LB, que foram

incubados, por uma noite, em banho-maria, a 280C com agitação. Os pré-

inóculos foram, então, adicionados à 450 ml de caldo LB e novamente

incubados nas mesmas condições descritas para o pré-inóculo.

Nos experimentos com microcosmos de água de nascente, que

requeriam uma menor quantidade de células, os inóculos foram obtidos

através do mesmo procedimento descrito para a preparação dos pré-

inóculos e incubadas por um período de 24 h. As células foram colhidas por

centrifugação a 4.000 x g por 15 minutos a 200C, ressuspensas e lavadas em

solução salina (0,85%) (4.000 x g/15min a 200C). As células lavadas

foram ressuspensas em solução salina (NaCl 0,85%) e preparadas as

diluições seriadas para a realização das contagens de bactérias totais

e cultiváveis. A contagem de bactérias totais foi realizada em câmara de

Neubauer, a partir de alíquotas das diluições fixadas com formalina. A

contagem de bactérias cultiváveis foi realizada através de

espalhamento de alíquotas das diluições seriadas em placas de ágar LB,

contendo os respectivos antibióticos. A partir das contagens, foram

realizados os cálculos para determinar o volume do inóculo necessário para

que se obtivesse uma população que variou de 106 a 109 unidades

 35

formadoras de colônias (ufc) por grama ou ml dos microcosmos e meios de

cultura analisados nos diferentes experimentos.

3.2 . Dispersão e transporte passivo pela água em microcosmos de

solo.

3.2.1. Solos analisados

Foram analisados 2 tipos diferentes de solo: um solo argiloso, do

tipo latossolo vermelho amarelo, e um solo arenoso. Os tipos de solo foram

selecionados por apresentarem características bastante diversas entre si,

permitindo, dessa forma, observar o comportamento das bactérias

introduzidas em situações bem diferenciadas. Ambos os tipos de solo

foram coletados de uma fazenda em Pinheiral, no Estado do Rio de

Janeiro. Os solos contidos nos microcosmos foram analisados quanto a sua

granulometria, pH, capacidade de retenção de água (CRA) e teor de

matéria orgânica, que são fatores abióticos importantes para os estudos

realizados (Tabela 4.1). Os latossolos dos tipos I e II e o solo arenoso foram

coletados de hortas em funcionamento. O tratamento destes solos, para o

plantio, consistiu na correção do pH, pela adição de CaCO3 (calação), e na

adubação com estrume. O latossolo do tipo III foi coletado de uma área

controle, próxima à horta, onde foram coletados os outros tipos de

 36

latossolo, e recebeu o mesmo tratamento que os demais, exceto pela

adubação.

A coleta dos solos foi realizada durante a estação seca (maio a julho)

e na estação chuvosa (março), com o objetivo de verificar a influência das

condições climáticas sobre o transporte.

3.2.2 . Coleta do solo e montagem dos microcosmos:

Nestes experimentos foram utilizados colunas de PVC de 30 cm de

comprimento por 15 cm de diâmetro para coleta dos solos selecionados.

Antes da coleta, as colunas foram desinfectadas com álcool iodado, álcool

70% e, posteriormente, lavadas com água destilada estéril. As colunas

desinfectadas foram mantidas em sacos plásticos fechados até o momento

da coleta.

Após a remoção da vegetação superficial, os solos foram coletados

introduzindo-se neles as colunas de PVC, de modo que se obtivesse um

perfil inalterado. Tal método foi selecionado por permitir uma maior

aproximação das condições naturais. As colunas de solo foram, então,

transportadas ao laboratório e realizado o inóculo com a estirpe

modificada (BR12) e sua estirpe parental (BR5).

 37

3.2.3 . Inoculação dos microcosmos e irrigação:

Cada experimento consistiu de microcosmos inoculados, em

duplicata, com cada estirpe e um microcosmo não inoculado. O

microcosmo não inoculado teve como objetivo detectar a presença de

substâncias tóxicas no solo, que pudessem inibir a microbiota, bem como,

verificar a influência da introdução das estirpes sobre as populações de

bactérias heterotróficas e de Pseudomonas fluorescentes presentes nos

solos. Os experimentos, para cada tipo de solo analisado, foram repetidos,

pelo menos, duas vezes e as réplicas validadas estatísticamente. Somente

foram considerados os experimentos cujas réplicas não apresentaram

variações significativas, (p< 0,05) pelo teste de análise de variância.

A inoculação foi realizada misturando o inóculo na camada

superficial (2,5 cm) de solo, de modo a se obter uma densidade de

aproximadamente 109 ufc/g, no microcosmo. Após 24h da realização do

inóculo, os microcosmos foram irrigados com 600ml de água destilada,

através de uma tela (1 mm de abertura), durante uma hora. O volume de

água, utilizado, foi determinado a partir dos registros pluviométricos

mantidos pela fazenda e correspondia a aproximadamente a metade do

volume (56,6 mm) da chuva mais intensa registrada no ano anterior ao da

realização das coletas. O intervalo de tempo entre a inoculação e a irrigação

visou permitir um certo grau de adesão das bactérias introduzidas às

 38

partículas do solo. Foram também realizados experimentos de controle

para verificar a ocorrência de transporte das estirpes em microcosmos não

irrigados. Os solos utilizados para estes experimentos foram o latossolo do

tipo III (2% de matéria orgânica -MO) e o solo arenoso. Estes microcosmos

foram montados e inoculados segundo as técnicas descritas para os demais.

3.2.4 . Transporte vertical das estirpes nos microcosmos:

Vinte e um dias após a irrigação, os microcosmos foram divididos

em seções de 10 cm de altura. O solo obtido para cada seção foi

homogenizado utilizando-se espátula estéril. Portanto para cada

microcosmo foram analisadas 3 seções; de 0 a 10 cm, de 10 a 20 cm e de

20 a 30 cm, permitindo dessa forma avaliar o movimento vertical das

bactérias inoculadas nos microcosmos. A presença das bactérias

inoculadas foi detectada através de contagem de cultiváveis em meio

seletivo. Foram retiradas de cada uma das seções 10g de solo que foram

adicionadas a 90ml de uma solução estéril de pirofosfato de sódio (NaPP)

1% e Tween 80 0,1%. A mistura foi então agitada em liquidificador

(Blender) por 3 minutos em potência baixa. Este procedimento visa liberar

as bactérias aderidas às partículas de solo, permitindo melhores

contagens. A partir da mistura homogenizada, foram realizadas diluições

seriadas, utilizando solução de Ringer 25% (cloreto de sódio 2,25g;

 39

cloreto de potássio 0,105g; cloreto de cálcio 0,12g; bicarbonato de sódio

0,05g e água 1000 ml). Alíquotas das diluições foram espalhadas, em

triplicata, em placas contendo ágar S1 (sacarose 1%; glicerol 1%;

casaminoácidos 0,5%; bicarbonato de sódio 0,1%; sulfato de magnésio

0,1%; fosfato bibásico de potássio 0,225%; sarcosinato 0,12%;

trimetoprim 0,002%; ágar 1,8% em água destilada e cicloheximida

100mg/ml), seletivo para Pseudomonas fluorescentes, acrescido dos

antibióticos marcadores, nas devidas concentrações, para contagem das

bactérias inoculadas. Nos microcosmos inoculados e nos não inoculados,

também, foram realizadas contagens das bactérias heterotróficas totais do

solo, através da técnica de “pour plate” com meio “Trypticase Soy Agar”

(TSA) a 10%, e contagens das Pseudomonas fluorescentes do solo através

de espalhamento de alíquotas das diluições em placas de ágar S1 sem

antibióticos. As placas foram incubadas em estufa a 280C por 24 a 48h.

Após esse período, as placas, cujo número de colônias se apresentaram

na faixa de 30 a 300, foram contadas e calculadas as contagens médias

totais para cada seção dos microcosmos analisados.

3.2.5 . Sobrevivência na água percolada através dos microcosmos:

Os percolados dos microcosmos, obtidos por gravidade,

aproximadamente duas horas após a irrigação, tiveram seus volumes

 40

determinados e foram recolhidos em erlenmeyers estéreis. Os erlenmeyers

contendo os percolados foram incubados a 280C por um período de 21

dias para observar a presença das bactérias inoculadas e a taxa de

sobrevivência da população. As contagens nos percolados de solo foram

realizadas imediatamente após a sua coleta (To) e a 2, 3, 7, 14 e 21 dias de

incubação. Alíquotas dos percolados foram diluídas seriadamente e

realizadas contagens de heterotróficos totais e das estirpes BR5 e BR12,

segundo metodologia descrita para contagem de bactérias nas seções de

solo ( item 3.2.4)

3.3 . Sobrevivência em microcosmos aquáticos.

Nestes experimentos, foi utilizada uma água limpa de nascente para

determinar a capacidade de sobrevivência da estirpe BR12 em ambientes

aquáticos oligotróficos. O local selecionado para coleta foi a nascente de

um riacho, situada próxima ao Bom Retiro, na Floresta da Tijuca. A água

foi coletada em recipientes estéreis, acondicionada a 40C, e trazida

imediatamente para o laboratório para a montagem dos microcosmos. A

água foi analisada quanto às suas características microbiológicas e

concentrações dos principais macronutrientes: carbono, nitrogênio e

fosfato.
 41

2.3.1. Sobrevivência em microcosmos de água de nascente estéril

Estes experimentos tiveram como objetivo verificar a capacidade

intrínseca de sobrevivência da estirpe BR12 nas condições oligotróficas

dos ambientes aquáticos, acompanhando o surgimento de formas não

cultiváveis e as modificações morfológicas decorrentes. A água coletada

foi filtrada seqëncialmente em membranas Millipore, 0,80μm e 0,45μm e

autoclavada antes da montagem dos microcosmos. Os microcosmos

foram montados em erlenmeyers, de 250 ml, inoculados, em duplicata,

com a estirpe BR12, numa densidade de 10 8 células/ml, e incubados por

180 dias a 280 C. As amostragens foram realizadas diariamente até a

primeira semana e depois aos 9, 12, 15, 19, 22, 30, 45, 60, 75, 90, 105,

120, 135, 150, 165 e 180 dias. Em cada amostragem, foram enumeradas

as populações cultivável, viável, não viável e total e, também, registrados

os comprimentos, diâmetros e biovolumes das células.

3.3.1.1 . Enumeração de bactérias cultiváveis:

As bactérias cultiváveis foram enumeradas através do

espalhamento de alíquotas, de diluições seriadas, dos microcosmos em

placas de “Plate Count Agar” (PCA), na concentração normal e diluído

 42

10 vezes, contendo os antibióticos marcadores, nas concentrações

adequadas e sem antibióticos. As placas foram incubadas a 280C por 24

a 48 h. A partir das contagens das placas, foi calculada a população

cultivável média, por amostragem.

3.3.1.2 . Enumeração de bactérias totais:

A enumeração das bactérias totais foi realizada por microscopia

de epifluorescência, através da técnica de coloração com laranja de

acridina. Alíquotas de 5 ml dos microcosmos foram coletadas em tubos

de ensaio estéreis, a cada amostragem, fixadas com formalina PA a 2%,

e mantidas a 40C até o momento do processamento. As amostras fixadas

foram coradas com solução de laranja de acridina (0,01g/ l), na

concentração de 0,1% durante 5 minutos. Alíquotas de 2 ml das

amostras coradas foram filtradas em membrana Nuclepore preta com

25mm de diâmetro e 0,22μm de poro. As membranas foram lavadas

com igual volume de diluente estéril (água destilada filtrada em

membrana Millipore 0,22μm), transferidas para lâminas e recobertas

com óleo de imersão não fluorescente. As amostras foram contadas no

microscópio ótico invertido Zeiss Axiovert 10 equipado com os filtros

FT510, LP520 e lâmpada de mercúrio HBO 50W. As contagens foram

realizadas num aumento de 1.600x utilizando um retículo adaptado à

 43

lente ocular. Foram contadas 250 células ou 50 campos por amostra. O

cálculo da densidade de bactérias totais, por amostra, foram realizados

através da seguinte fórmula:

D = (z/x).A.d / a.v, onde:

D = densidade de bactérias totais por ml;

z = número médio de bactérias por campo;

x = número de quadrados do retículo contados por campo;

A = área de filtração da membrana em mm2;

d = diluição da amostra;

a = área de um quadrado do reticulo em mm2;

v = volume filtrado em ml.

A partir das contagens de bactérias totais das amostras, foram

calculadas as médias de bactérias totais, por amostragem.

3.3.1.3 . Enumeração das bactérias viáveis e não viáveis.

A enumeração das bactérias viáveis e não viáveis foi realizada

utilizando-se o método descrito por Kogure et al. (1979). Neste método,

as células metabolicamente ativas (viáveis) são diferenciadas das

demais. Alíquotas de 5 ml dos microcosmos foram coletadas em tubos

de ensaio estéreis, e acrescidas de soluções de extrato de levedura

(2,5%) e ácido nalidíxico (2%), numa concentração final de 0,1%

 44

respectivamente. As amostras foram, então, incubadas por 6 h a 280C.

Este tratamento tem como objetivo permitir que as células

metabolicamente ativas utilizem o extrato de levedura, para a produção

de componentes celulares, tornando-se, assim, maiores que as demais,

uma vez que a divisão celular é inibida pela presença do ácido

nalidíxico. As amostras tratadas, após o período de incubação, foram

fixadas com formalina PA, a 2%, e mantidas a 40C até o processamento.

As amostras fixadas foram coradas, com laranja de acridina, e

preparadas para observação, ao microscópio de epifluorescência,

conforme técnica descrita no item precedente. Foram realizadas

contagens das bactérias viáveis e não viáveis a cada campo analisado,

tendo sido contadas no total 250 bactérias ou 50 campos por amostra. O

comprimento, a partir do qual as células foram consideradas viáveis, foi

determinado considerando o tamanho médio das células, registrado para

cada amostra, e determinado conforme técnica descrita no item a seguir.

3.3.1.4 . Análise da morfologia celular:

A análise da morfologia celular foi realizada a partir das

amostras preparadas para enumeração das bactérias totais. Após a

contagem, foram realizadas medições de 50 células, por amostra,

utilizando uma régua milimetrada, acoplada a uma das oculares do

 45

microscópio. Foram registrados o comprimento e o diâmetro, de cada

célula, e, a partir destes valores, calculado o biovolume celular

utilizando-se a seguinte fórmula:

V = (π. D 2.L) / 4, onde:

V = biovolume celular expresso em μm 3;

D = diâmetro da célula em μm;

L = comprimento da célula em μm.

As medições foram utilizadas para o cálculo do tamanho e

biovolume médios das células a cada amostragem.

3.3.2 . Sobrevivência em microcosmos de água de nascente contendo a

microbiota nativa:

Os experimentos com água, contendo a microbiota autóctone,

serviram para determinar a capacidade de sobrevivência da estirpe, em

face às interações que ocorrem dentro da comunidade microbiana,

nesses ambientes. Os microcosmos foram montados em erlenmeyers de 250

ml, com a água de nascente. Após a montagem foi realizado o inóculo

dos microcosmos, em duplicata, com a bactéria modificada (BR12), de

modo a se obter uma densidade de aproximadamente 108 ufc/ml. Após a

inoculação, os erlenmeyers foram mantidos em estufa, a 280C, e amostrados

após 1, 2, 3, 7, 15, 21, 30, 45 e 60 dias, para enumeração de bactérias

 46

heterotróficas totais e da estirpe bacteriana introduzida. A população

cultivável de P. fluorescens BR12 foi enumerada conforme técnica descrita

no item 3.3.1.1. As bactérias heterotróficas totais foram enumeradas por

espalhamento de alíquotas, das diluições seriadas, em placas de PCA. As

placas foram incubadas a 280C por 24 a 48h, antes da realização das

contagens.

3.3.2.1 . Detecção do DNA rec nos microcosmos de água de nascente

A detecção do gene “cry IVB” nos microcosmos, contendo a

microbiota nativa, teve como objetivo avaliar a persistência do DNA

rec, e serviu, também, como um método indireto de detectar a presença

de formas incultiváveis da estirpe estudada. A persistência do DNA rec

foi determinada através da hibridização em membrana - “dot blot”- do

DNA total, extraído de amostras dos microcosmos, com a sonda

específica contendo o gene. A metodologia utilizada é descrita a seguir.

3.3.2.1.1. Extração do DNA total da água dos microcosmos

Após a última amostragem, alíquotas de 10 ml dos microcosmos

foram filtradas em membranas Millipore, 0,45μm, que foram lavadas

com tampão SET estéril (sacarose 20%, EDTA 50mM, Tris-HCl 50mM

em água destilada, pH 7,8), e mantidas a 40C até o momento do

 47

processamento. Os filtros foram utilizados para extração do DNA total,

segundo técnica descrita em Sommerville et al. (1989). A técnica

compreende as etapas de lise celular, extração dos ácidos nucleicos,

purificação e concentração. Neste experimento, no entanto, devido à

baixa concentração de DNA total e a perda de material decorrente das

etapas de purificação foram realizadas apenas as etapas de lise celular

e extração do DNA bruto. As membranas foram submetidas ao

seguinte tratamento para obtenção do extrato bruto de DNA:

- Nos tubos contendo as membranas foram acrescentados 1,8ml de

tampão SET e 62μl de solução recente de lisozima (5mg / ml de tampão

da lisozima, 1mM EDTA, 10mM NaCl, Tris-HCl 10mM em água

MilliQ, pH 8,0). Os conteúdos foram misturados por inversão, e os

tubos mantidos em gelo por 15 minutos.

- Após este período, foram adicionados 20μl de uma solução de SDS

(dodecil sulfato de sódio) 20% em água destilada e os tubos incubados

por 1h à temperatura ambiente, em agitação constante.

- Foram, então, adicionados 50μl de solução de proteinase K (20mg de

proteinase K/ ml de água MilliQ) aos tubos que foram incubados por

mais 3h, à temperatura ambiente, em agitação constante.

- Ao final deste período, os lisados foram transferidos para outro tubo e

a membrana lavada com 1ml de tampão SET, por 5 minutos, em

 48

rotação constante. O tampão foi, então, removido e reunido ao lisado

previamente coletado.

Estes lisados, contendo o extrato bruto de DNA total ,foram

então aplicados sobre membrana de nylon (Hybond) utilizando-se um

“blotter”. Os extratos foram aplicados sobre a membrana, concentrados

e diluídos seriadamente até 10-3, juntamente com os controles positivo

(sonda Tn5::cryIVB) e negativo (DNA de esperma de salmão). Os

DNAs foram fixados à membrana por exposição ao UV, por 5 minutos.

3.3.2.1.2. Obtenção e marcação da sonda específica

A sonda foi obtida a partir da extração do plasmídio pUC12 -

Tn5::cryIVB da estirpe de Escherichia coli JM101. A bactéria foi

cultivada, em 10ml de caldo LB, incubada a 370 C por 24h, e submetida

aos procedimentos de extração de plasmídios, segundo técnica descrita

em Sambrook et al. (1989). A técnica consiste das seguintes etapas:

- Lise celular - solução I (NaOH 0,2N e SDS 1% em água destilada) e

solução II (acetato de potássio 5M 60% e ácido acético glacial 11,5%

em água destilada);

- Extração e desproteinização - fenol: clorofórmio: álcool isoamílico

(25:24:1);

- Precipitação do DNA - isopropanol;

 49

- Lavagem com etanol 70%.

O plasmídio extraído foi digerido com as enzimas de restrição

Eco RI e Hind III (370 C por 2h) para obtenção do fragmento

correspondente à sonda (3,7 Kb). A separação da sonda, do plasmídio,

após a digestão, foi realizada por eletroforese em gel de agarose “low

melting”, (1%) em tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA) (Sambrook et

al.., 1989), a 40V a 40C por 2 - 3h. O marcador de peso molecular

utilizado na eletroforese foi o 1Kb DNA ladder (Gibco BRL). O gel foi

corado em solução de brometo de etídio (2μM/ml), por 15 minutos, e

então observado ao transiluminador. As bandas correspondentes a 3,7

Kb foram recortadas do gel utilizando-se uma espátula de alumínio,

revestida de teflon, transferidas para tubos eppendorf estéreis e

submetidas às etapas de purificação e concentração do DNA, descritas

a seguir:

- Foram acrescentados 200μl de água MilliQ às bandas de agarose “low

melting”, nos tubos, para se obter um volume final de 500μl e os tubos

incubados a 700C, por 5 a 10 minutos, para fundir a agarose.

- Após a fusão, foram adicionados 200μl de fenol, equilibrado com

tampão TE (Tris-EDTA) (Sambrook, et al. 1989) pH 7,8, aos tubos que

foram agitados e esfriados, em banho de água fria, por 10 minutos.

Após este período, os tubos foram centrifugados, a 12.000 x g, por 10

 50

minutos. Os sobrenadantes foram transferidos, para outros tubos, e

novamente extraídos com fenol repetindo-se o mesmo procedimento.

Os sobrenadantes obtidos foram extraídos com 200 μl de clorofórmio

por centrifugação, a 12.000 x g, por 3 minutos.

- Os sobrenadantes, obtidos das etapas de extração, foram precipitados

com acetato de sódio 8M (0,1 vol) e etanol 96% até completar o volume

do eppendorf (1,5 ml), a -200 C por 1h, e depois centrifugados, a 12.000

x g, por 15 minutos.

- Os precipitados obtidos foram lavados, com etanol 70% (12.000 x g /

15 min), secos, a vácuo, e ressuspensos em TE pH 7,8.

Alíquotas da sonda purificada foram submetidas à eletroforese

em gel de agarose, (1%) em TAE, a 40mA, 120V, por 30 minutos, para

verificação da presença do plasmídio.

A sonda foi, então, marcada com α CTP 32 pela técnica de “nick

translation”, descrita em Sambrook et al. (1989), utilizando-se o kit

“Nick Translation” da Boehringer Mannheim Biochemica. Após a

reação de marcação, a sonda marcada foi separada dos α CTP 32, não

incorporados, através de cromatografia em microcolunas de Sephadex

G50. O Sephadex G50 foi lavado com água destilada, várias vezes,

para remoção da dextrana solúvel, equilibrado com TE pH 7,6, e

autoclavado, antes do empacotamento das colunas. O eluente utilizado

 51

foi o tampão TEN (Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0, NaCl

100mM em água destilada). Foram coletadas frações, de 200 μl, do

eluato, em tubos eppendorf de 500 μl, para a dosagem da emissão de

radioatividade, com um contador Geiger manual. As frações

correspondentes à sonda marcada consistiram no primeiro pico de

radioatividade obtido. A sonda marcada foi, então, armazenada em

castelo de chumbo a - 200 C até o momento da sua utilização.

3.3.2.1.3. Hibridização do DNA total dos microcosmos com a sonda

específica marcada.

As membranas, contendo os extratos de DNA total da água dos

microcosmos, foram hibridizados com a sonda Tn5::cryIVB, segundo a

técnica descrita em Sambrook et al. (1989). As membranas foram pré-

hibridizadas (solução salina citrato de sódio (SSC) 6x, solução

Denhardts 5x, 0,01M EDTA, 100μg/ml de DNA de esperma de salmão

desnaturado), por 4 h a 680 C. Após este período, a sonda desnaturada

foi acrescentada à mistura de pré-hibridização e a membrana incubada

por uma noite, a 680 C. Após a hibridização, a membrana foi submetida,

por duas vezes, à cada uma das seguintes etapas de lavagem: SSC 2x

por 5 minutos, à temperatura ambiente; SSC 2x e SDS 1% por 30

minutos, a 680 C; SSC 0,1x e SDS 1% por 30 minutos, a 680 C. A

 52

membrana foi, então, deixada secar naturalmente. A membrana

hibridizada foi acondicionada em um cassete, recoberta com filme de

PVC e superposta com filme de raio X (Kodak X-OMAT AR), para

confecção da autorradiografia. O filme foi exposto a -200 C e revelado

após 1 semana.

3.4 . Resposta de estirpe P. fluorescens BR12 à privação nutricional

Estes experimentos tiveram como objetivo, determinar os efeitos

da privação nutricional total e de nutrientes individuais como carbono,

nitrogênio, fósforo e enxofre sobre a sobrevivência e a cultivabilidade da

estirpe analisada. As condições de privação nutricional foram

estabelecidas por exaustão de nutrientes, nos seguintes meios minerais

definidos:

Tabela 3.1. Composição dos meios minerais definidos de privação

nutricional (concentrações em solução salina 0,85%).

Componentes carbonoa nitrogênioa fósforoa enxofrea múltiplos

nutrientesb
glicose 0,02% 0,4% 0,4% 0,4% 0
NH4Cl 1,5mM 0,15mM 1,5mM 1,5mM 0
Na2PO4 40mM 40mM 4mM 40mM 0
Na2SO4 20mM 20mM 20mM 2mM 0
a
- nutriente do qual a estirpe foi privada.
b
- a privação múltipla foi obtida inoculando a estirpe em solução salina
(NaCl 0,85%).
 53

Os meios, em triplicata, foram inoculados com P. fluorescens BR12,

em fase log tardia, numa densidade de aproximadamente 107 células/ ml e

incubados a 280 C, por 40 dias. Os meios foram amostrados após 2, 3, 7,

15, 21, 30 e 40 dias para enumeração de bactérias cultiváveis, por

plaqueamento de alíquotas das diluições seriadas dos meios em PCA. Ao

final do experimento, para verificar o surgimento de formas não

cultiváveis, foram realizadas contagens de bactérias totais, conforme

metodologia previamente descrita.

3.5 . Desenvolvimento de resistência cruzada aos outros tipos de

estresse decorrente da privação nutricional.

O desenvolvimento de resistência cruzada aos outros tipos de

estresse foi testado nas bactérias privadas de nutrientes, nos meios minerais

definidos e, também, no inóculo crescido em meio rico (caldo LB), que

constituiu o controle negativo para a privação nutricional. As culturas

testadas foram submetidas aos protocolos de estresse que consistiram na

exposição ao etanol 20%, peróxido de hidrogênio 2μM, NaCl 3M e às

temperaturas de 0 0C e 47 0C, para determinar a sua resistência aos estresses

químico, oxidativo, osmótico e térmico respectivamente. Alíquotas das

culturas privadas de nutrientes foram adicionadas, em triplicata, aos tubos

contendo os mesmos meios em que se encontravam incubadas, para evitar a

 54

introdução de um fator adicional de estresse, e expostas às condições de

estresse por um período de 6 h. As culturas expostas aos estresses químico,

oxidativo e osmótico foram incubadas a 28 0C. Os protocolos de estresse

foram aplicados às culturas em privação nutricional simultaneamente às

amostragens descritas no item 3.4. A resistência, aos fatores de estresse

analisados, foi determinada por enumeração de bactérias cultiváveis. Na

última amostragem realizada para as culturas de P. fluorescens BR12,

submetidas à privação nutricional em meios minerais, foram realizadas

contagens de bactérias totais, nos protocolos de estresse, para verificar o

grau de resistência apresentado pela população total.

3.5.1. Desenvolvimento de resistência cruzada aos outros tipos de estresse

em P. fluorescens BR12 inoculadas em microcosmos de água de

nascente.

O desenvolvimento de resistência aos outros tipos de estresse foi,

também, testado para a estirpe inoculada em microcosmos estéreis de água

de nascente. Os protocolos de estresse, descritos no item anterior, foram,

igualmente, aplicados à alíquotas dos microcosmos após 15, 30 e 45 dias de

incubação.
 55

3.6 . Transferência gênica por transformação do DNA recombinante de

P. fluorescens BR12

A ocorrência de transferência gênica do DNA rec, da estirpe P.

fluorescens BR12, por transformação, para a microbiota autóctone da água

de nascente foi testada, em filtro, representando a situação mais favorável, e

em microcosmos. Os transformantes foram detectados fenotípicamente, por

crescimento em meio contendo o antibiótico marcador da estirpe estudada

(canamicina 50μg/ml), e confirmados pela detecção direta do DNA rec,

através de hibridização com a sonda específica.

3.6.1. Transferência gênica por transformação, em filtro, do DNA rec de

P. fluorescens BR12 para a microbiota autóctone da água de nascente.

Neste experimento foi utilizada a mesma água de nascente citada no

item 3.3. Imediatamente após a coleta, alíquotas de 10 ml da água foram

filtradas em membrana Millipore 0,45μm, utilizando aparato de filtração

Millipore estéril. Um inóculo da estirpe BR12, com a mesma densidade de

bactérias totais do volume filtrado da água de nascente, aproximadamente

107 células/ml, foi morto em banho-maria, a 1000C, por 15 minutos e

adicionado ao filtro, constituindo o controle positivo. O controle negativo

foi preparado acrescentando-se ao filtro, contendo a microbiota, o mesmo

volume de água destilada estéril. Os filtros foram transferidos para placas

 56

de PCA e incubados por 24h a 28 0C. Após a incubação, os filtros foram

transferidos para tubos contendo solução salina (NaCl 0,85%) estéril. Os

tubos foram agitados em vortex, por 1 minuto, para remoção das bactérias

aderidas às membranas, e a suspensão obtida diluída seriadamente para

detecção de transformantes. Os possíveis transformantes foram

enumerados, por espalhamento de alíquotas das diluições, em placas de

PCA acrescidas de canamicina (50μg/ml).

3.6.1.1 . Confirmação dos transformantes por detecção direta do DNA rec.

As colônias de possíveis transformantes obtidas foram repicadas,

para novas placas de PCA, contendo canamicina (50μg/ml), utilizando

palitos estéreis, e após 24h de incubação a 28 0C, transferidas para

membranas de hibridização Colony/Plaque Screen Hybridization Transfer

Membrane (NEF-978, DU PONT NEN Research Products). Os controles

positivo e negativo de hibridização, representados respectivamente por

colônias da estirpe BR12 e da estirpe parental BR5, foram introduzidos em

todas as membranas, contendo os possíveis transformantes. As membranas

foram submetidas a um tratamento composto das seguintes etapas

sucessivas:
 57

- Lise das células: as membranas foram mantidas, por 20 minutos, sobre

papel de filtro saturado com solução de lisozima (6mg/ml TE) e depois,

por10 minutos, sobre papel de filtro saturado com solução de SDS 10%.

- Desnaturação: as membranas foram mantidas, por 20 minutos, sobre papel

de filtro saturado com solução de desnaturação (NaOH 0,5M e NaCl 1,5M).

- Neutralização: as membranas foram mantidas, por 10 minutos, sobre

papel de filtro saturado com solução de neutralização (Tris-HCl 0,5M, pH

7,4 e NaCl 1,5M).

Após este tratamento, as membranas foram deixadas secar

naturalmente e expostas ao UV, por 5 minutos, para fixação das moléculas

de DNA. As membranas foram embaladas em sacos plásticos individuais e

submetidas à hibridização com a sonda específica, segundo metodologia

descrita no item 3.3.2.1.3.

3.6.2. Transferência gênica por transformação do DNA rec de P.

fluorescens BR12 para a microbiota autóctone em microcosmos de

água de nascente.

Neste experimento os microcosmos, montados conforme

metodologia previamente descrita, foram inoculados com P. fluorescens

BR12 mortas por aquecimento a 1000C, durante 15 minutos. O inóculo foi

realizado na mesma densidade da população bacteriana autóctone da água,

 58

que era de aproximadamente 106 células/ml. Os microcosmos foram

incubados a 28 0C e amostrados após 2, 7 e 15 dias. As amostragens

consistiram na enumeração das bactérias heterotróficas totais e na

enumeração e isolamento de colônias de possíveis transformantes. A

enumeração, isolamento e confirmação dos transformantes foi realizada

conforme metodologia descrita nos itens 3.6.1 e 3.6.1.1.

3.7 . Tratamento Estatístico dos Dados

Os principais testes estatísticos utilizados foram o teste de análise de

variância (ANOVA) e o teste t para comparação de médias, para detecção

de variações significativas entre as médias dos resultados obtidos nos

experimentos. Nos experimentos de transporte vertical, devido às

características heterogêneas do solo, foram apenas considerados os

resultados, dos experimentos, em que não houve variação significativa

entre as réplicas dos microcosmos. Além dos testes supracitados, foram

também calculadas as regressões, entre alguns parâmetros, para

determinação de tendências. Os testes estatísticos foram realizados num

nível de significância igual ou maior a 95%, utilizando-se o “software”

Excel 5,0.
 59

4. RESULTADOS:

4.1. Características dos solos analisados:

As características físico-químicas e granulométricas dos solos

analisados estão descritas na Tabela 4.1. Dois tipos de solos foram

estudados: um solo argiloso, classificado como latossolo vermelho-

amarelo, e um solo arenoso. O latossolo vermelho-amarelo, entretanto, foi

subdividido em três tipos de acordo com o teor de matéria orgânica

presente. O teor de matéria orgânica variou em função do momento e do

local escolhidos para a coleta. O latossolo do tipo I, que apresentou o maior

teor de matéria orgânica, foi coletado logo após a sua adubação com

estrume e antes da realização do plantio. O latossolo do tipo II foi coletado

imediatamente após a colheita, e num período de chuvas intensas,

apresentando coerentemente um teor menor de matéria orgânica. O

latossolo do tipo III foi coletado de uma área controle, onde não houve

adubação, apresentando portanto o teor de matéria orgânica característico

deste tipo de solo. O solo arenoso foi coletado em uma outra horta, logo

após a colheita, e apresentou um menor teor de matéria orgânica em relação

ao solo argiloso.

O pH variou pouco entre os solos analisados, ficando próximo da

neutralidade, exceto para o latossolo do tipo I, cujo pH apresentou-se

 60

consideravelmente mais elevado que os demais, provavelmente em

decorrência dos processos de decomposição da matéria orgânica. Os

valores de pH obtidos foram resultantes do processo de calagem destes

solos, cujo pH natural de aproximadamente 4,5 é incompatível com o

cultivo de hortaliças e da macadamia, que representa a principal produção

da fazenda.

A densidade dos solos, nos microcosmos, foi calculada dividindo-se

o peso em gramas do solo, contido em seu interior, pela sua capacidade

volumétrica. Os valores apresentados correspondem às médias obtidas para

os microcosmos dos diferentes tipos de solos analisados. Considerando o

fato dos microcosmos conterem porções intactas de solo e, portanto,

bastante heterogêneas, estes valores representam apenas uma estimativa.

A umidade relativa (U.R.) dos solos e a sua granulometria, também,

variaram em função do período em que as coletas foram realizadas. Os

solos (latossolo do tipo II) coletados em março, durante a estação chuvosa,

apresentaram-se encharcados, com uma U.R. (48,5%) muito próxima da

sua capacidade máxima de retenção de água (49%). Estes solos também

apresentaram uma composição granulométrica diferenciada, com teores

mais elevados de partículas finas (silte), provavelmente em decorrência dos

processos de lixiviação ocasionados pelas chuvas. Os demais solos,

coletados na estação seca (de maio a julho), apresentaram, em média, uma

 61

U.R. de aproximadamente 30%, exceto o solo arenoso, cuja U.R. foi de

aproximadamente 20%.

4.2 . Transporte vertical das estirpes através dos microcosmos intactos

de solo.

As estirpes de P. fluorescens foram transportadas pela água, através

dos microcosmos de solo, em todos os experimentos, não tendo sido

observado transporte nos microcosmos não irrigados. Na Figura 4.1, onde

se encontram representados os histogramas da densidade média dos

microorganismos introduzidos, em relação à profundidade dos

microcosmos, a presença das estirpes pode ser observada nas camadas

inferiores dos microcosmos contendo os diferentes tipos de latossolo (Fig.

4.1 A, B e C). Porém, a ausência, destas, nas camadas inferiores dos

microcosmos de solo arenoso (fig 4.1 D), não significa que não tenha

ocorrido o transporte através destes microcosmos, como pode ser

constatado na Figura 4.2. Nesta Figura, representativa da sobrevivência das

estirpes na água percolada dos microcosmos, o T0 corresponde à densidade

média destes microorganismos, nos percolados, no momento em que foram

coletados, fornecendo um indicador quantitativo da ocorrência do

transporte. A presença das estirpes introduzidas em T0, comprova a

ocorrência do transporte através dos microcosmos estudados. A ausência

das estirpes introduzidas, nas camadas inferiores do solo arenoso, é

 62

decorrente da incapacidade destas estirpes de sobreviver neste tipo de solo.

Os resultados da distribuição das estirpes, nas camadas dos microcosmos,

foram influenciados pela capacidade de sobrevivência destes organismos

nas condições estudadas, uma vez que os microcosmos foram analisados 21

dias após a sua inoculação.

4.2.1. Influência das características do solo sobre o transporte vertical

das estirpes introduzidas.

O teor de matéria orgânica (MO) do solo apresentou uma forte

correlação inversa (R2 = 0,99, p < 0,05) em relação ao transporte. Ambas

as estirpes foram detectadas em densidades menores na água percolada

dos microcosmos contendo o latossolo suplementado com estrume a 6%

MO (Fig. 4.2 A), do que na água percolada dos microcosmos contendo

solos com menor teor de matéria orgânica.

A textura do solo não apresentou influência significativa

(p < 0,05) sobre o transporte. Nos microcosmos contendo latossolo do

tipo III (Fig. 4.2 B), o grau de transporte foi comparável ao observado

nos microcosmos de solo arenoso (Fig. 4.2 C). Este fato confirma a

influência marcante do teor de MO do solo sobre o transporte, uma vez

que estes solos apresentavam teores similares de MO. Porém, a textura

do solo influiu significativamente (p < 0,05) sobre a sobrevivência das

 63

estirpes, como pode ser observado na Figura 4.1. A estirpe BR12 não

conseguiu sobreviver nos microcosmos de solo arenoso, embora tenha

sobrevivido no latossolo do tipo III (Fig. 4.1 C e D).

A densidade do solo é, em geral, um fator que exerce uma

influência importante sobre o transporte. Solos com altas densidades, ou

seja, solos mais compactos, com poros menores, tendem a apresentar

taxas menores de transporte e vice versa. Nas condições experimentais, a

densidade do solo (Tabela 4.1) não apresentou uma relação coerente

com o transporte vertical. As maiores e as menores taxas de transporte

foram verificadas nos microcosmos, cujos solos apresentaram as maiores

e as menores densidades, respectivamente (Fig. 4.2 A e C).

Outro fator que desempenhou um papel importante no transporte

foi o teor inicial de água do solo. Nos microcosmos coletados durante a

estação seca (latossolos tipo I e III e solo arenoso), a água de irrigação

percolou facilmente, sendo obtidos, ao final, aproximadamente 200ml de

percolado. Dos microcosmos coletados na estação chuvosa, porém, não

se obteve percolado, a água de irrigação ficou retida no seu interior, e

estes permaneceram alagados até o final do experimento. Este fato

estabeleceu no interior destes microcosmos, condições seletivas de

anaerobiose relativa, uma vez que os poros do solo encontravam-se

repletos de água. Nestes microcosmos, o transporte pode apenas ser

 64

avaliado pela distribuição das estirpes em relação à profundidade do

solo, apesar do fato destes dados estarem também relacionados à

sobrevivência.

4.2.2. Comparação entre as estirpes em relação ao transporte e

sobrevivência nos microcosmos de solo.

A comparação entre a estirpe de P. fluorescens geneticamente

modificada (BR12) e sua estirpe parental (BR5), em relação ao

transporte e sobrevivência nos microcosmos de solo, foi realizada através

do cálculo de regressão, revelador das tendências de dispersão e

persistência das estirpes, nos microcosmos (Tabela 4.2), e, também, pela

análise dos resultados pelo teste de ANOVA. A regressão entre a

densidade média de células introduzidas (log10 ufc / g de solo seco) e a

profundidade da camada de solo nos microcosmos, revelou que há uma

tendência de declínio no número de células em relação à profundidade

(Tabela 4.2 e Fig. 4.1). A estirpe BR12 apresentou, em geral, uma

distribuição mais homogênea nas camadas dos microcosmos contendo

solo argiloso do que a sua estirpe parental, sendo detectada em

densidades mais elevadas do que esta, nas camadas mais profundas dos

microcosmos contendo latossolo dos tipos I e III, cujas condições foram

mais favoráveis à sua sobrevivência (Fig. 4.1 A e C). As constantes

 65

angulares (a) das regressões (Tabela 4.2) sugerem que a estirpe BR12

apresentou uma maior tendência de ser transportada através dos

microcosmos de solo, sendo detectada em densidades maiores nas

camadas mais profundas do que a estirpe BR5, em todas as condições

experimentais. Porém, esta tendência foi confirmada apenas para os

latossolos do tipo I e III, nos quais, a estirpe BR12 apresentou uma taxa

de transporte significativamente maior (p< 0,05) do que a sua

estirpe parental. A estirpe BR5 permaneceu retida na camada superficial,

onde foi detectada em números mais elevados, que declinavam mais

acentuadamente, com o aumento da profundidade. A tendência de

declínio da estirpe BR5 em relação à profundidade do solo, nos

microcosmos, foi quase constante e não variou significativamente

(p< 0,05) em relação à textura do solo, teor de MO do solo, falta de

oxigênio, etc. A estirpe BR12 apresentou uma maior sensibilidade às

condições experimentais, tendo sido registrada diferenças significativas

(p< 0,05) no seu comportamento, em relação aos microcosmos

analisados.

As constantes lineares (b) das regressões (Tabela 4.2) expressam o

número esperado de células introduzidas, na superfície dos microcosmos.

Estes resultados refletem, também, a capacidade de sobrevivência das

estirpes nas condições experimentais, permitindo estabelecer

 66

comparações entre elas. As estirpes introduzidas demonstraram

capacidades diferentes de sobrevivência, em condições desfavoráveis,

representadas pelos microcosmos de solo arenoso e pelos de latossolo

alagados, onde a estirpe parental apresentou uma maior sobrevivência

(Fig. 4.1 B e D) e, também nas mais favoráveis, representadas pelos

microcosmos de solo argiloso rico em matéria orgânica, onde se

verificou o oposto. Neste último caso, embora não tenha havido uma

grande diferença na densidade das estirpes na superfície dos

microcosmos, a estirpe BR12 apresentou uma tendência menor de

declínio no número de células em relação à profundidade. A

sobrevivência da estirpe parental não variou significativamente (p< 0,05)

em relação ao teor de matéria orgânica do solo argiloso. O mesmo,

porém, não se verificou para a estirpe modificada que apresentou uma

maior sobrevivência no latossolo rico em matéria orgânica (6% OM).

Nos microcosmos de solo arenoso foram registradas as menores taxas de

sobrevivência de ambas as estirpes, mas principalmente da BR12 que

não foi recuperada das amostras deste tipo de solo.

4.2.3. Transporte e sobrevivência das populações nativas do solo.

As características do solo, tais como o teor de matéria orgânica e

textura, não influenciaram o transporte das bactérias heterotróficas

 67

totais. A sua densidade na água percolada, no momento da coleta, foi

similar para todos os microcosmos analisados e permaneceu quase

constante até o final das amostragens (Fig. 4.2). No entanto, as

características do solo exerceram uma influência importante sobre a sua

densidade nos microcosmos. Como era esperado, os microcosmos

contendo latossolo rico em matéria orgânica apresentaram as maiores

contagens de bactérias heterotróficas totais, provavelmente, devido à

presença de bactérias fecais que foram introduzidas neste solo

juntamente com o estrume (Tabela 4.3). As menores contagens deste

grupo de microorganismos foi obtida nos microcosmos alagados

(latossolo do tipo II), provavelmente, devido às condições seletivas, de

anaerobiose relativa, presentes nestes microcosmos. A densidade das

populações de Pseudomonas fluorescentes totais (PFT) apresentou uma

correlação direta (p< 0,05) com o conteúdo da matéria orgânica do solo,

nos solos argilosos. A textura do solo influiu, também,

significativamente na densidade das populações de PFT. Nos

microcosmos de solo arenoso, as PFT foram detectadas em densidades

muito menores, que nos demais microcosmos (Tabela 4.3).

4.2.4. Influência das estirpes introduzidas sobre as populações

naturais dos solos.

 68

Não foi detectada influência significativa (p < 0,05) da

introdução das estirpes de Pseudomonas estudadas sobre as populações

naturais dos solos, representadas pelos grupos das bactérias

heterotróficas totais e de Pseudomonas fluorescentes totais. A

introdução das estirpes não alterou a densidade das bactérias

heterotróficas totais nas camadas de solo dos microcosmos, embora um

ligeiro aumento nas contagens e uma tendência mais acentuada de

declínio da densidade em relação à profundidade do solo tenha sido

registrada nos microcosmos experimentais (Tabela 4.3). As populações

das PFT, por outro lado, apresentaram uma densidade ligeiramente

reduzida em relação aos microcosmos não inoculados, assim como uma

maior tendência de declínio da densidade em relação à profundidade do

solo, nos microcosmos experimentais (Tabela 4.3).

4.2.5. Sobrevivência das estirpes introduzidas na água percolada dos

microcosmos.

A sobrevivência das estirpes nos percolados foi influenciada pelos

solos a partir dos quais estes foram obtidos. As maiores taxas de

sobrevivência, para ambas as estirpes, foram registradas na água

percolada do solo suplementado com estrume (6% MO) (Fig. 4.2 A). A

estirpe BR12 apresentou taxas decrescentes de sobrevivência na água

 69

percolada do latossolo do tipo III (2% MO) e no solo arenoso (Fig 4.2 B

e C). Em geral, não houve diferenças significativas (p < 0,05) entre a

sobrevivência das estirpes na água percolada dos microcosmos conforme

revelado pelas tendências de declínio nas densidades das populações,

expressa pelos parâmetros angulares das regressões entre a densidade

média de células (log10 ufc/ml) e o tempo (Tabela 4.4). Entretanto, a

estirpe geneticamente modificada foi detectada nos percolados em

maiores números do que a estirpe parental, provavelmente, devido a sua

maior capacidade de dispersão.

Embora não se tenha obtido percolado dos microcosmos alagados,

a água acumulada na sua superfície foi amostrada após 21 dias. As

estirpes introduzidas, BR5 e BR12, foram detectadas em densidades

elevadas, de aproximadamente 4,1 e 4,8 log10 ufc/ml, respectivamente,

representando uma taxa maior de sobrevivência do que a obtida nos

percolados.

4.3. Características da água de nascente:

Nas Tabelas 4.5 e 4.6, encontram-se discriminadas as características

físico-químicas e as características microbiológicas da água de nascente

utilizada na montagem dos microcosmos estudados. As características

físico-químicas analisadas correspondem aos teores dos principais

 70

macronutrientes presentes na água, antes e após a filtração, visando

determinar a quantidade de nutrientes disponível para os microorganismos

ao longo dos experimentos. A água apresentou, em seu estado natural,

baixos teores para os nutrientes analisados, podendo ser caracterizada como

oligotrófica. Este oligotrofismo é ainda mais acentuado na água filtrada,

utilizada para a montagem dos microcosmos estéreis (Tabela 4.5).

As características microbiológicas (Tabela 4.6) concordam com os

dados apresentados na Tabela 4.5, indicando tratar-se de uma água limpa. A

ausência de coliformes fecais e o número reduzido de coliformes totais

revelam a ausência de poluição de origem antropogênica e animal. As

contagens de bactérias heterotróficas apresentam-se um pouco acima do

esperado neste tipo de água, provavelmente em decorrência do fato da

nascente estar localizada numa floresta, e receber dela eventuais aportes de

matéria orgânica. As contagens de Pseudomonas fluorescentes totais estão,

também, dentro da média registrada para águas doces oligotróficas tropicais

(Guimarães et al., 1993). Não foram detectadas bactérias resistentes a

ambos os marcadores de resistência a antibióticos presentes na estirpe

estudada, porém foi verificada a presença de 2,7 log10 ufc/ml de bactérias

resistentes a canamicina, que é o marcador do DNA recombinante.

 71

4.4. Sobrevivência em microcosmos aquáticos

4.4.1. Sobrevivência em microcosmos de água de nascente estéril

Na Figura 4.3, estão representados os valores médios das contagens

obtidas pelos diferentes métodos de monitoramento, empregados para a

avaliação da sobrevivência da estirpe de P. fluorescens BR12 nos

microcosmos. As bactérias introduzidas mantiveram-se presentes nos

microcosmos até 180 dias. A população total apresentou um alto índice

de sobrevivência sofrendo, em média, uma redução de apenas 1,6 log10

células/ml enquanto a redução média registrada para as populações

viáveis e não viáveis foi de 2,4 e 1,2 log10 células/ml, respectivamente,

ao longo do experimento. A população cultivável não foi mais detectada

após 60 dias. A concentração do meio, assim como a presença dos

antibióticos marcadores não influíram sobre as contagens de bactérias

cultiváveis, não tendo sido observada variação significativa (p < 0,05)

entre os meios testados. As contagens de bactérias cultiváveis e viáveis

apresentaram uma tendência de declínio ao longo do tempo (R2 = 0,86 e

R2 = 0,77, respectivamente), enquanto as contagens de bactérias não

viáveis e totais não variaram significativamente ao longo do tempo. As

contagens de bactérias totais e não viáveis sofreram, como as demais,

uma redução de uma ordem de magnitude nas primeiras 24h, porém

 72

mantiveram-se praticamente constantes após este período. Até a primeira

quinzena, as contagens de bactérias totais, não viáveis, viáveis e

cultiváveis mantiveram-se muito próximas. A partir deste período, a

porção cultivável da população começou a declinar, suavemente, até os

45 dias, quando foi registrada uma queda abrupta, de aproximadamente 2

ordens de magnitude nas contagens, tornando-se indetectável aos 75 dias

(Figura 4.3). A proporção entre bactérias viáveis e não viáveis, em

relação à população total, também variou ao longo do tempo, embora

estas variáveis não apresentem correlação entre si (Figura 4.4). Durante

os 3 primeiros dias, aproximadamente 70% da população era constituída

por bactérias viáveis, a partir de então, devido ao declínio nas contagens,

a distância entre as proporções foi se reduzindo até se igualar por volta

de 15 dias. Após este período, as bactérias não viáveis passaram, então, a

constituir a maior parte da população total, atingindo ao final do

experimento 92,6% desta.

As contagens de bactérias viáveis apresentaram correlação com

as bactérias cultiváveis (R2 = 0,67) e totais (R2 = 0,58), embora as

últimas não tenham correlação entre si. As bactérias não viáveis

apresentaram correlação apenas com as bactérias totais (R2 = 0,63).

A eficiência dos métodos, empregados para o monitoramento das

populações metabolicamente ativas, também variou em relação ao

 73

tempo. Nas amostragens realizadas até os 2 primeiros dias, as contagens

em placa foram tão quanto ou mais representativas, do que o método de

Kogure, na detecção das populações em atividade metabólica (Figura

4.4). Porém, a partir deste período, e até o final do experimento, as

contagens em microcospia foram muito mais representativas.

4.4.1.1. Análise das dimensões celulares

Na Figura 4.5 estão representados os valores médios das

dimensões celulares ao longo do experimento. As variáveis

comprimento (R2 = 0,70), diâmetro (R2 = 0,82) e conseqüentemente

biovolume (R2 = 0,68) apresentaram uma relação linear com o tempo

revelando uma tendência de declínio nas dimensões celulares. A

estirpe que no início do experimento apresentava, em média, células

com 2,53 μm de comprimento, 0,86 μm de diâmetro e um biovolume

de 1,47 μm 3 sofreu uma redução de 62% no comprimento, 38% no

diâmetro e 84% no biovolume (Figura 4.6), chegando ao final do

experimento com 0,96 μm de comprimento, 0,55 μm de diâmetro e

um biovolume de 0,23 μm3. Porém, esta redução nas dimensões

resultou de uma distribuição heterogênea de células, com diferentes

diâmetros, por diferentes classes de tamanho. Na Figura 4.7, encontra-

se detalhada a distribuição da freqüência das células, pelas classes de

 74

tamanho (comprimento), e também em relação ao diâmetro. Nos

primeiros 9 dias, a população apresentou-se homogênea em relação ao

diâmetro, com 100% dos indivíduos com 0,86μm de diâmetro e 80%

deles em classes de tamanho menores que 2,5 μm, resultando numa

redução de cerca de 39% do comprimento médio inicial. No 12° dia,

começaram a surgir células com diâmetro igual a 0,645 μm e a partir

do 15° dia, surgiu um outro grupo de células com um diâmetro, ainda

menor, de 0,45μm, correspondendo a 50% do diâmetro inicial

registrado. O surgimento de células com diâmetros reduzidos

coincidiu com a diminuição observada na tendência de redução no

comprimento das células (Figura 4.6), provavelmente em decorrência

do espalhamento da distribuição, destes grupos de células pelas

classes de tamanho maiores. A tendência de redução no diâmetro

médio celular observada nas Figuras 4.5 e 4.6, resultou do aumento da

freqüência das células de menor diâmetro, ao longo do tempo. Até 45

dias, as células com 0,86 μm foram predominantes, representando

46,5% da população total, porém a partir dos 60 dias, as células com

diâmetro de 0,43μm passaram a predominar, permanecendo assim até

180 dias. Ao final do experimento, as células de diâmetro reduzido

representavam 91% da população total.

 75

As classes de tamanho de maior freqüência foram as de 1,1 a

1,7 μm, durante os primeiros 15 dias, e de 0,4 a 1,0 μm, a partir de

então. Porém, a freqüência nas classes de tamanho maiores, de 2,5 a

5,2 μm, variou ao longo do tempo. A análise da distribuição da

freqüência pelas classes de tamanho e, também, dos comprimentos

médios ao longo do experimento, sugere que esta variável apresenta

um comportamento cíclico, alternando períodos de redução e de

aumento nos seus valores ao longo do tempo, embora a tendência

geral predominante seja de declínio.

4.4.1.2 Análise da morfologia celular

O declínio nas dimensões celulares ocasionou alterações na

morfologia celular. Após a primeira semana, foi registrado o

surgimento das primeiras formas cocoides com 0,86μm de diâmetro,

como pode ser observado na Figura 4.8. As formas cocoides com

0,645 μm e 0,43 μm de diâmetro surgiram após 12 e 15 dias,

respectivamente. A estirpe apresentou, de um modo geral, uma

tendência de conservação da sua morfologia celular original,

apresentando-se majoritariamente sob a forma de bastonetes durante

todo o experimento. A proporção entre cocos e bastonetes variou ao

longo do tempo, de forma semelhante ao comprimento, alternando

 76

períodos de aumento e redução na proporção entre estas formas

celulares.

4.4.2 Sobrevivência e persistência do DNA recombinante em

microcosmos de água de nascente contendo a microbiota nativa:

Na Figura 4.9 encontram-se expressos, em log10 cfu/ml, os

valores médios das contagens da estirpe BR12 e da comunidade

bacteriana heterotrófica da água de nascente, e o número de cópias do

DNA recombinante, da estirpe BR12, presentes nos microcosmos ao

final do experimento. As contagens da BR12 apresentaram uma forte

correlação inversa (R2 = 0,88) com o tempo, expressa por uma reta de

coeficiente angular igual a - 0,14. Porém, a tendência de declínio nas

contagens não foi homogênea ao longo do tempo, permitindo a

decomposição da curva em 4 diferentes etapas de redução das contagens,

expressas por retas de regressão (y = -ax + b) com diferentes coeficientes

angulares (a). Nos 15 dias iniciais, houve um declínio suave nas

contagens de cerca de 1,5 log10 ufc/ml (R2 = 0,97 e a = -0,09). Entre 15

e 22 dias, houve uma redução abrupta de cerca de 4,2 log10 ufc/ml nas

contagens (R2 = 1 e a = -0,7), seguido por um período de estabilização

(R2 = 0,87 e a = 0,015). Após os 45 dias, a estirpe retomou sua tendência

 77

de declínio nas contagens (R2 = 1 e a = -0,19), tornando-se indetectável

após 60 dias.

A detecção da presença do DNA recombinante, na densidade de

cerca de 3,0 log10 cópias/ml (Figura 4.10), sugere a possível presença de

células da estirpe após os 60 dias, embora como foi observado nos

experimentos com microcosmos estéreis, estas tenham perdido a sua

cultivabilidade, não sendo mais detectadas através de contagem em

placas (Figura 4.9) .

Conforme esperado, a estirpe BR12 apresentou uma

sobrevivência, nestes microcosmos (R2 = 0,88 e a = -0,14), inferior à

registrada nos microcosmos estéreis (R2 = 0,86 e a = -0,04),

provavelmente em decorrência das interações com a microbiota presente

na água. Porém, a perda de cultivabilidade, sugerida pelos resultados,

aparentemente não foi influenciada pela presença de microbiota, tendo

ocorrido aproximadamente no mesmo período observado nos

experimentos estéreis.

A densidade da comunidade microbiana heterotrófica refletiu a

introdução da estirpe BR12, dentro da qual se encontrava incluída, em

todas as amostragens realizadas após o T0. Inicialmente, houve um

aumento nas contagens, de aproximadamente 3,0 log10 ufc/ml, devido à

introdução da BR12, porém a partir do 3° dia, a densidade da

 78

comunidade começou a declinar, chegando no final do experimento, a

um valor muito próximo do inicial.

4.5 Resposta à privação nutricional em meios minerais definidos

A resposta de P. fluorescens BR12 à privação de nutrientes

individualizados (carbono, nitrogênio, fósforo e enxofre) e de todos os

nutrientes, avaliada pela contagem de células cultiváveis, está descrita na

Figura 4.11. As culturas expostas à privação de nutrientes individualizados,

apresentaram uma tendência acentuada de declínio, ao longo do

experimento, não mais sendo detectadas a partir dos 15 dias (fósforo e

enxôfre) e 21 dias (carbono e nitrogênio), em decorrência da perda da sua

cultivabilidade, como foi comprovado pelas contagens de bactérias totais,

realizadas ao final do experimento (Tabela 4.8). As culturas privadas de

todos os nutrientes, também apresentaram uma tendência de declínio nas

contagens até 15 dias porém, a partir de então, estabilizaram sua densidade

em aproximadamente 3,0 log10 ufc/ml mantendo-se, assim, até o final do

experimento (Figuras 4.11 e 4.12 E). Não foi registrada variação

significativa (p < 0,05) entre as culturas expostas às diferentes condições de

privação nutricional.
 79

4.6 Desenvolvimento de resistência cruzada aos outros tipos de estresse

em P. fluorescens em condições de privação nutricional

4.6.1 Desenvolvimento de resistência cruzada aos outros tipos de

estresse em P. fluorescens privados de nutrientes em meios minerais

definidos.

Na Figura 4.12, estão expressas, em log10 ufc/ml, as densidades

das populações cultiváveis resistentes aos tipos de estresse testados, para

as diferentes situações de privação nutricional. Os valores plotados em

T0, correspondem às densidades das populações cultiváveis resistentes

aos estresses testados registradas para o inóculo e, portanto, se repetem

em todos os gráficos. Estes valores foram considerados como controle do

experimento, tendo servido como base para as comparações efetuadas.

Visando facilitar a análise dos resultados, estes valores foram

transformados em índices de resistência (Tabela 4.7), através do cálculo

das porcentagens de bactérias cultiváveis resistentes em relação à

população cultivável total, a cada amostragem.

Houve o desenvolvimento de proteção cruzada a todos os tipos de

estresse testados, exceto ao etanol, em todas as culturas expostas às

diferentes condições de privação nutricional, em relação ao inóculo

cultivado em meio rico. A influência da privação nutricional sobre a

 80

resistência ao estresse, somente foi observada a partir do 3° dia,

provavelmente o tempo necessário para a exaustão dos nutrientes

presentes nos meios. Os padrões de resistência, avaliados pelas

contagens de bactérias cultiváveis, apresentaram, de um modo geral, uma

distribuição próxima da normal, atingindo um máximo e depois

declinando, provavelmente devido à perda de cultivabilidade das células

em decorrência da privação nutricional. Nas culturas privadas de

nutrientes individualizados, a maior resistência aos estresses osmótico e

térmico - 0°C e 47°C - foi registrada no 3° dia, exceto para as culturas

privadas de carbono, que apresentaram a maior resistência ao estresse

térmico a 0°C no 7° dia (Tabela 4.7). O desenvolvimento de resistência

ao estresse oxidativo também apresentou variações, as culturas privadas

de carbono atingiram sua maior resistência no 3° dia, enquanto que as

demais atingiram a sua posteriormente, aos 7 dias. As culturas privadas

de todos os nutrientes apresentaram um padrão de desenvolvimento de

resistência, aos tipos de estresse testados, diferente do observado para as

culturas privadas de nutrientes individualizados. A resistência ao

estresse, registrada para estas culturas, foi maior e se desenvolveu mais

lentamente, atingindo seu máximo aos 15 dias, e depois declinando,

exceto pelo estresse osmótico, cuja resistência apresentou valores

crescentes até o final do experimento. O estresse oxidativo foi o único

 81

tipo de estresse, para o qual foi registrado o desenvolvimento de 100%

de resistência, por parte das culturas privadas de todos os nutrientes.

Na Tabela 4.8, encontram-se descritos os valores das contagens

das populações totais das culturas de P. fluorescens BR12, submetidas

por 40 dias aos diferentes tipos de privação nutricional e a população

total de células, nestas culturas, resistentes aos tipos de estresse testados.

Na Tabela 4.9, encontram-se descritos os índices de resistência ao

estresse da população total. Os índices de resistência, das populações

totais aos tipos de estresse testados, foram muito superiores aos obtidos

para as populações cultiváveis. A resistência ao etanol, não detectada,

nas populações cultiváveis, apresentou índices significativos nas culturas

privadas de fósforo, enxofre e de todos os nutrientes. Os resultados

indicam que os maiores índices de resistência ao estresse são

apresentados pela porção não cultivável das populações analisadas.

Assim como foi observado para a população cultivável, as culturas

submetidas à privação nutricional total apresentaram uma resistência

significativamente maior (p < 0,05) aos tipos de estresse testados.

4.6.2 Desenvolvimento de resistência cruzada aos outros tipos de

estresse em P. fluorescens inoculados em microcosmos estéreis de água

de nascente
 82

Na Tabela 4.10, estão registradas as porcentagens de bactérias

resistentes aos tipos de estresse testados da população cultivável total.

Nas culturas mantidas nos microcosmos, também foi detectado o

desenvolvimento de resistência a todos os tipos de estresse analisados em

relação ao inóculo crescido em meio rico. Porém, o padrão de resistência

adquirido foi diferente do observado para as culturas privadas de

nutrientes em meios de cultura. Apenas para os estresses térmico a 47°C

e osmótico, foi observada uma distribuição aproximadamente normal,

enquanto os demais apresentaram valores crescentes até o final do

experimento. Os valores máximos de resistência, exibidos pela estirpe

nos microcosmos, foram inferiores aos observados em meios de cultura,

exceto pelo etanol, que apresentou o maior índice de resistência

registrado em todos os experimentos.

4.7 Transferência gênica por transformação do DNA recombinante de

P. fluorescens BR12 para a comunidade bacteriana da água de

nascente

Nas Tabelas 4.11 e 4.12, encontram-se descritos os dados obtidos

dos experimentos de transformação do DNA recombinante, de P.

fluorescens BR12, para a comunidade bacteriana da água de nascente,

em filtro e em microcosmos. Nos experimentos em filtro, apenas 1

 83

colônia transformante foi confirmada por detecção direta do DNA rec

(Figura 4.13). Nestes experimentos, foi registrada uma taxa de

transformação da ordem de 3,8.10 -8 em relação à doadora, e de 1,8.10 -8

em relação à comunidade receptora. Nos experimentos realizados em

microcosmos, as contagens de transformantes presumidos estiveram

muito próximas, no início do experimento, da densidade de bactérias

resistentes à canamicina, naturalmente presentes na água de nascente,

apresentando depois um ligeiro aumento, provavelmente em decorrência

do aumento na disponibilidade de nutrientes ocasionado pela introdução

do inóculo morto. No total foram isoladas aproximadamente 1.500

colônias de transformantes presuntivos, porém nenhuma delas foi

confirmada quanto à presença do gene cryIVB, pela hibridização com a

sonda.
 84

Tabela 4.1 Características dos solos estudados.

Tipo de solo Argilaa Siltea Areiaa CRAb MOc pH(H2O) Densidaded

I. Latossolo 52 2 46 50.0 6.14 8.7 1.14
II. Latossolo 44 16 40 49.0 3.21 6.9 1.30
III. Latossolo 39 15 46 49.5 2.18 6.8 1.23
Solo arenoso 18 12 70 30.0 1.82 6.7 1.47
a - valores em % (v/v); b -capacidade de retenção de água em % (v/p);
c - conteúdo de matéria orgânica em % (v/v); d- valores médios em
g/cm3.
 85

A 6

log10 of ufc/ g solo sêco

5

1
0-10cm 10-20cm 20-30cm
Br5 Br12 profundidade dos microcosmos

B
6
log10 of ufc / g solo sêco

1
0-10cm 10-20cm 20-30cm

Br5 Br12 profundidade dos microcosmos

Figura 4.1 - Transporte vertical das estirpes de P. fluorescens através de

microcosmos de solo intacto: A - latossolo tipo I e B - latossolo tipo II.
 86

C 6

log10 ufc / g solo sêco

5

1
0-10cm 10-20cm 20-30cm

Br5 Br12 profundidade do microcosmo

D 6
log10 of ufc / g solo sêco

1
0-10cm 10-20cm 20-30cm
Br5 Br12 profundidade do microcosmo

Figura 4.1 (cont.)- Transporte vertical das estirpes de P. fluorescens

através de microcosmos de solo intacto: C - latossolo tipo III e D - solo
arenoso.
 87

HT BR5 BR12
A
10

8
log10 ufc/ml

0
0 3 6 9 12 15 18 21
Dias

B 10

8
log10 ufc/ml

0
0 3 6 9 Dias 12 15 18 21

C 10

8
log10 ufc/ml

0
0 3 6 9 Dias 12 15 18 21

Figura 4.2 - Sobrevivência das estirpes de P. fluorescens na água

percolada dos microcosmos de solo intacto: A - latossolo tipo I, B -
latossolo tipo III e C - solo arenoso
 88

Tabela 4.2. Parâmetros da regressão entre a densidade média de

células (log10 ufc/g de solo seco) das estirpes de P. fluorescens
introduzidas e a profundidade da coluna de solo em cm.

BR5 BR12
2
a b R a b R2
Latossolo tipo I 0.12 6.4 1.0 0.03 6.1 1.0
Latossolo tipo II 0.12 6.0 0.9 0.06 4.0 0.7
Latossolo tipo 0.16 6.1 1.0 0.07 5.1 1.0
III
Solo arenoso 0.12 4.3 0.7 -a -a -a
Regressão expressa pela reta y = ax - b (p< 0,05)
a
- A estirpe BR12 não sobreviveu nestes microcosmos.
 89

Tabela 4.3. Transporte vertical das bactérias heterotróficas totais e

Pseudomonas fluorescentes totais (expressas em log10 ufc/g solo seco) através
de microcosmos de solo intacto.

Tipo de solo Profundidad Microcosmos Microcosmos

e do não inoculados Experimentaisa
microcosmo
HTb PFTc HTb PFTc
I. Latossolo 0 - 10 cm 8,5 6,3 9,6 6,1
(6% m.o.)
10 - 20 cm 8,0 6,1 9,3 5,8

20 - 30 cm 8,2 5,5 8,1 4,9

II. Latossolo 0 - 10 cm 6,7 4,9 5,7 5,1

(3% m.o.)
10 - 20 cm 6,8 4,6 5,7 5,4

20 - 30 cm 5,8 3,3 5,4 5,1

III. Latossolo 0 - 10 cm 6,4 4,0 6,4 4,6

(2% m.o.)
10 - 20 cm 5,7 4,2 5,9 3,7

20 - 30 cm 5,9 3,2 5,3 2,0

Solo arenoso 0 - 10 cm 6,9 2,7 7,4 3,5

(1,8% m.o.)
10 - 20 cm 7,3 3,5 7,2 3,1

20 - 30 cm 7,3 1,7 7,1 3,3

a
- Microcosmos inoculados com as estirpes BR5 e BR12;
b
- Médias das contagens de bactérias heterotróficas totais;
c
- Médias das contagens de Pseudomonas fluorescentes totais.
 90

Tabela 4.4. Parâmetros da regressão da sobrevivência das estirpes de

P. fluorescens na água percolada dos microcosmos de solo.

BR5 BR12
2
a b R a b R2
Latossolo tipo I 0.03 2.7 0.5 0.05 4.7 0.8
Latossolo tipo III 0.33 4.7 0.8 0.21 5.0 0.7
Solo arenoso 0.27 6.3 0.9 0.29 6.6 0.9
Regressão expressa pela reta y = ax - b (p< 0,05)
 91

Tabela 4.5. Características físico-químicas da água de nascente

Natural Filtrada
a
Carbono (COT) 15,3mg/l 11,5mg/l
Nitrogênio total 5,18±0,15 μmol/l 1,89± 0,24 μmol/l
Fosfato 0,39 μmol/l 0,19 μmol/l
a
- Carbono orgânico total

Tabela 4.6. Características microbiológicas da água de nascente.

Bactérias HT b PFT c RC d RCRe CTf CFg

totaisa

6,4 5,4 3,3 2,7 0 1,0 ☯0,3

a
- Contagem em microscopia de epifluorescência expressa em log10
células/ml;
b
- Bactérias heterotróficas totais em log10 ufc/ml;
c
- Pseudomonas fluorescentes totais em log10 ufc/ml;
d
- Bactérias resistentes à canamicina (50 μg/ml) em log10 ufc/ml;
e
- Bactérias resistentes à canamicina e rifampicina (50 μg/ml) em log10
ufc/ml;
f
- Coliformes totais em log10 NMP/100ml;
g
- Coliformes fecais em log10 NMP/100ml.
 92

6
log10 ufc/ml

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Dias

cultiváveis viáveis não viáveis total

9

6
log10 ufc/ml

0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180
Dias

Figura 4.3 - Sobrevivência de P. fluorescens BR12 em microcosmos de

água de nascente estéril.
 93

100
90
80
70
60
%

50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Dias

cultiváveis viáveis não viáveis

100

90

80

70

60
%

50

40

30

20

10

0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180
Dias

Figura 4.4 - Proporção entre as contagens de bactérias cultiváveis, viáveis e

não viáveis e a população total de P. fluorescens BR12 em microcosmos de
água de nascente estéril.
 94

2.5

2
* / **

1.5

0.5

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Dias

comprimento* diâmetro* biovolume**

2.5

2
*/ **

1.5

0.5

0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180
Dias

* Comprimento e diâmetro expressos em μm

** Biovolume expresso em μm 3.

Figura 4.5 - Dimensões celulares médias de P. fluorescens BR12 em

microcosmos de água de nascente estéril.
 95

100
90
80
70
60
% 50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Dias

comprimento diâmetro biovolume

100
90
80
70
60
% 50
40
30
20
10
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180
Dias

Figura 4.6 - Redução média nas dimensões celulares de P. fluorescens

BR12 em microcosmos de água de nascente estéril
 96

Inóculo

90

75
60
%
45

30
15
0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

1 dia

90
75

60
%
45
30

15
0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

2 dias

90

75

60
%
45

30

15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

3 dias 0.86*

90

75

60
%
45

30

15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

classes de comprimento em micrômetros

* - diâmetro expresso em μm

Figura 4.7. Distribuição das classes de tamanho e diâmetro de P.

fluorescens em microcosmos estéreis com água oligotrófica de nascente.
 97

4 dias

90

75

60
%
45
30

15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,4-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

5 dias

90
75

60
%
45
30

15
0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

6 dias

90
75
60
%
45
30
15
0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

7 dias 0.645* 0.86*

90

75

60
%
45

30

15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

classes de comprimento em micrômetros

* - diâmetro em μm.

Figura 4.7. Distribuição das classes de tamanho e diâmetro de P.

fluorescens em microcosmos estéreis com água oligotrófica de nascente.
 98

9 dias

90

75

60
%
45

30

15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

12 dias

90
75
60
%
45
30
15
0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

15 dias

90
75
60
%
45
30
15
0
0,4-1,1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

19 dias 0.43* 0.645* 0.86*

90

75

60
%
45

30

15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

classes de comprimento em micrômetros

* - diâmetro expresso em μm

Figura 4.7 - Distribuição das classes de tamanho e diâmetro de P.

fluorescens em microcosmos estéreis com água oligotrófica de nascente.
 99

22 dias

90

75

60
%
45

30

15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

30 dias

90

75

60
%
45

30

15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

45 dias
90

75

60
%
45

30

15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

60 dias 0.43* 0.645* 0.86*

90

75

60
%
45

30

15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

classes de comprimento em micrômetros

* - diâmetro expresso em μm.

Figura 4.7 - Distribuição das classes de tamanho e diâmetro de P.

fluorescens em microcosmos estéreis com água oligotrófica de nascente.
 100

75 dias

90

75
60
%
45

30
15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

90 dias

90
75
60
%
45
30
15
0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

105 dias

90

75

60
%
45

30

15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

120 dias 0.43* 0.645* 0.86*

90

75

60
%
45

30

15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

classes de comprimento em micrômetros

* - diâmetro expresso em μm

Figura 4.7 - Distribuição das classes de tamanho e diâmetro de P.

fluorescens em microcosmos estéreis com água oligotrófica de nascente.
 101

135 dias
90

75
60
%
45
30
15
0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

150 dias
90

75

60
%
45

30

15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

165 dias
90
75
60
%
45
30

15
0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

180 dias 0.43* 0.645* 0.86*

90

75

60
%
45

30

15

0
0,4-1 1,1-1,7 1,8-2,4 2,5-3,1 3,2-3,8 3,9-4,5 4,6-5,2

classes de comprimento em micrômetros

* - diâmetro expresso em μm

Figura 4.7 - Distribuição das classes de tamanho e diâmetro de P.

fluorescens em microcosmos estéreis com água oligotrófica de nascente.
 102

cocos bastonetes
100
90
80
70
60
%

50
40
30
20
10
0
0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180
Dias

Figura 4.8 - Proporção entre formas celulares em P. fluorescens BR12 em

microcosmos de água de nascente estéril
 103

HT BR12 Tn5::cry IVB*

9

7
log 10 ufc/ml ou cópias / ml*

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Dias

Figura 4.9 - Sobrevivência de P. fluorescens BR12 e persistência do DNA

recombinante em água oligotrófica natural de nascente.
 104

1 - controle positivo (sonda Tn5::cryIVB)

2 - controle negativo (DNA de esperma de salmão)
3 - DNA total da água dos microcosmos
4 - DNA total da água dos microcosmos diluído de 1:10.

Figura 4.10. Hibridização em membrana do DNA total de água de nascente

dos microcosmos inoculados com P. fluorescens BR12 após 60 dias de
incubação, com a sonda radioativa específica para o gene cryIVB.
 105

carbono nitrogênio fósforo enxofre todos*

6
log10 ufc/ml

0
0 5 10 15 Dias 20 25 30 35 40

Figura 4.11 - Resposta de Pseudomonas fluorescens BR12 à privação de

nutrientes individuais e de múltiplos nutrientes.
 106

A carbono etanol H202 NaCl 0C 47 C

6
log10 ufc/ml

0
0 5 10 15 Dias 20 25 30 35 40

B nitrogênio etanol H202 NaCl 0C 47 C

8

6
log10ufc/ml

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Dias

C fósforo etanol H202 NaCl 0C 47 C

6
log10 ufc/ml

0
0 5 10 15 Dias 20 25 30 35 40

Figura 4.12 - Densidade média de P. fluorescens resistentes aos outros tipos

de estresse em condições de privação nutricional: A - carbono,
B - nitrogênio e C - fósforo.
 107

D enxôfre etanol H202 NaCl 0C 47 C

8

6
log10 ufc/ml

0
0 5 10 15 Dias 20 25 30 35 40

E todos* etanol H202 NaCl 0C 47 C

8

6
log10 ufc/ml

0
0 5 10 15 Dias 20 25 30 35 40

*- privação de todos os nutrientes.

Figura 4.12 - Densidade média de P. fluorescens resistentes aos outros tipos

de estresse em condições de privação nutricional: D - enxofre e E - todos
os nutrientes.

TABELA 4.7. Resistência ao estresse químico, oxidativo, osmótico e

térmico em culturas de P. fluorescens BR12 crescidas em meio rico e
 108

privadas de nutrientes, expressa como % da população cultivável total.

DIAS
a
0 1 3 7 15 21 30 40
Etanol
todos 0 0 0,003 0,03 0 0 0 0
enxofre 0 0 0 0 0 0 0 0
fósforo 0 0 0 0 0 0 0 0
nitrogênio 0 0 0 0,0002 0 0 0 0
carbono 0 0,006 0,09 0,6 0 0 0 0
H2O2
todos 0,002 0,03 4,7* 18,18* 100* 55 34,9 62,5
enxofre 0,002 0,009 1,6* 22* 0* 0 0 0
fósforo 0,002 0 0,1* 0,9* 0* 0 0 0
nitrogênio 0,002 0 0,0002* 15,5* 0* 0 0 0
carbono 0,002 0 0,05* 0,003* 0* 0 0 0
NaCl
todos 0,0006 0,003 0,4* 0,1* 5,5 2,5 7,9 12,1
enxofre 0,0006 0,0006 0,02* 0* 0 0 0 0
fósforo 0,0006 0,001 0,02* 0,002* 0 0 0 0
nitrogênio 0,0006 0,002 0,7* 0,005* 0 0 0 0
carbono 0,0006 0 0,04* 0,0003* 0 0 0 0
0
0 C
todos 0,003 0,2 3,7* 5,9* 87,5* 72,5 30 50
enxofre 0,003 0,1 4* 1,2* 0 0 0 0
fósforo 0,003 0,0003 16,25* 0,98* 0 0 0 0
nitrogênio 0,003 0,001 0,3* 0,1* 0 0 0 0
carbono 0,003 0,3 2* 8,5* 0 0 0 0
0
47 C
todos 0 0 0 0,003 0,2 0 0 0
enxofre 0 0 0,008* 0 0 0 0 0
fósforo 0 0 0,002* 0 0 0 0 0
nitrogênio 0 0 0,3* 0,002 0 0 0 0
carbono 0 0 0,0003* 0 0 0 0 0
a
- inóculo cultivado em caldo LB até fase log tardia.
* - variações significativas (p< 0,05) na resistência ao estresse em relação
ao tempo.

Tabela 4.8. Densidades médias das populações totais e das células resistentes
 109

ao estresse químico, oxidativo, osmótico e térmico (expressas em log10

células/ml) das culturas de P. fluorescens BR12, submetidas por 40 dias às
diferentes condições de privação nutricional.

Privação População População resistente aos tipos de estresse

nutricional total
Etanol H2O2 NaCl 0°C 47°C
Carbono 6,0 1,0 5,5 6,0 4,9 4,3

Nitrogênio 6,6 1,0 5,7 5,6 6,3 6,0

Fósforo 6,2 5,6 5,7 5,2 5,1 6,1

Enxôfre 5,6 4,7 5,0 5,6 5,1 1,0

Total 6,7 6,5 6,6 6,5 6,6 6,5

Tabela 4.9 . Resistência ao estresse químico, oxidativo, osmótico e térmico em

culturas de P. fluorescens privadas de nutrientes em meios minerais por 40 dias,
expressa em % da população total.

Privação Tipos de estresse

nutricional
Etanol H2O2 NaCl 0°C 47°C
Carbono 0 26,4 84,5 6,9 1,7

Nitrogênio 0 10,5 8,9 50,0 22,3

Fósforo 24,7 30,7 10,0 8,7 93,3

Enxôfre 11,0 23,2 85,4 26,8 0

Total 60,8 74,5 64,7 86,3 68,6

 110

Tabela 4.10. Resistência ao estresse químico, oxidativo, osmótico e térmico em

P. fluorescens BR12, inoculadas em microcosmos de água de nascente estéril,
expressa como % da população cultivável total.

Dias Tipos de Estresse

Etanol H2O2 NaCl 00 C 470C
0a 0 0,002 0,0006 0,003 0
15 0,5 12 1 1 0,03
30 2 35 2,9 3,1 0
45 6,7 43 1,78 25 0
a
- inóculo cultivado em caldo LB até fase log tardia.

Tabela 4.11. Transferência gênica por transformação, em filtro, entre

P. fluorescens BR12 e a comunidade bacteriana autóctone da água
de nascente.
 111

Bactérias Totais a Heterotróficas BR12 BRC b Taxa de

totais morta Transformaçãoc
log10 células/ml log10 ufc/ml

7,42 6,41 7,41 2,66 3,8.10 -8

a
- contadas em microscopia de epifluorescência.
b
- Bactérias resistentes à canamicina (50μg/ml)
c
- calculada em relação à densidade da doadora.

Tabela 4.12. Transferência gênica por transformação, em microcosmos,

entre P. fluorescens BR12 e a comunidade bacteriana autóctone da água de
nascente.

log10 ufc/ml

Dias HT a BRC b Transformantes

0 5,4 2,3

2 5,4 2,5 0

7 5,7 2,7 0

15 5,9 2,8 0
a
- Bactérias heterotróficas totais
b
- Bactérias resistentes à canamicina (50μg/ml)
 112

t - colônia transformante
c - controle positivo de hibridização (colônia de BR12).

Figura 4.13. Colônia transformante obtida por transformação em filtro e

confirmada por hibridização com a sonda específica.

5. DISCUSSÃO:
 113

5.1. Transporte vertical de P. fluorescens BR12 e de sua estirpe

parental em microcosmos de solo.

A utilização de microorganismos geneticamente modificados para

controle de pragas e outras aplicações agrícolas requer, geralmente, a sua

liberação em elevadas densidades no ambiente. A disseminação destes

organismos, além de reduzir a sua eficácia, pode causar contaminação em

lençóis subterrâneos e corpos dágua adjacentes. Este é um dos possíveis

riscos associados à este tipo de utilização de MGMs e deve ser considerado.

A ocorrência e extensão do transporte vertical, pela água, de P.

fluorescens geneticamente modificada e sua estirpe parental, em

microcosmos intactos de solo, foram estudados. A influência das

características do solo como teor de matéria orgânica, textura, densidade e

umidade relativa sobre o transporte, foi também analisada. O transporte

vertical foi avaliado considerando-se 2 parâmetros: o número de

inoculantes resgatados da água percolada dos microcosmos, no momento

da sua coleta, e a densidade das estirpes inoculantes presentes nas

diferentes profundidades dos microcosmos.

O transporte vertical foi fortemente influenciado pelo teor de matéria

orgânica do solo. Os resultados obtidos sugerem que o transporte das

estirpes ocorreu em extensão semelhante nos solos com baixos teores de

 114

matéria orgânica, apesar destes apresentarem texturas diferentes. Este fato

pode ser atribuído ao importante papel desempenhado por este fator na

adsorção das células às partículas do solo. Estes resultados estão de acordo

com estudos realizados anteriormente que revelaram que as células, no

solo, encontram-se preferencialmente adsorvidas aos complexos orgânicos

ou orgânico-argilosos (Hattori & Hattori, 1975; Hisset & Gray, 1976;

Smiles, 1988). Isto ocorre porque a matéria orgânica adere às superfícies

abióticas no solo alterando a sua carga e características de adsorção, além

de aumentar a disponibilidade de nutrientes, favorecendo a adesão e a

sobrevivência dos microorganismos (Harvey, 1991; van Elsas & van

Overbeek, 1993). No entanto, outros fatores também contribuíram para o

transporte vertical das estirpes e devem ser analisados.

A utilização de microcosmos intactos de solo é um fator importante

a ser considerado. Nestes microcosmos, a heterogeneidade da estrutura de

poros e as vias preferenciais de fluxo do solo - representadas por

rachaduras, velhos canais de raízes e túneis de oligoquetas, etc. - são

preservadas, tornando estes sistemas modelo mais próximos da realidade e

favorecendo a dispersão dos microorganismos (Yates & Yates, 1991).

Nestes sistemas experimentais, conseqüentemente, alguns fatores como a

textura do solo ou a sua densidade, podem não apresentar, como foi

observado, uma influência significativa sobre o transporte. Os resultados

 115

obtidos são coerentes pois estas duas variáveis são relacionadas entre si,

uma vez que a granulometria do solo é um fator determinante da sua

densidade. Teoricamente, um solo composto por partículas finas apresenta

poros menores e portanto uma maior densidade. Porém, nos microcosmos

intactos, a presença e a quantidade das vias preferenciais de fluxo exerce

uma maior influência sobre a extensão do transporte do que a textura e a

densidade do solo (Hekman et al., 1995; van Elsas et al., 1991c). Um

microcosmo intacto, contendo um solo com um alto teor de partículas de

argila, mas que apresente muitas rachaduras e canais, certamente,

apresentará uma taxa mais elevada de transporte dos microorganismos

introduzidos do que um outro que, embora contendo solo arenoso,

apresente uma estrutura mais homogênea de poros. A densidade do solo,

nos microcosmos intactos, representa apenas uma estimativa, sendo

calculada utilizando-se o peso total do solo contido num volume conhecido

sem considerar estas heretogeneidades.

A maioria dos estudos, que registrou a influência da densidade do

solo sobre o transporte foi realizada com microcosmos reempacotados de

solo. Estes microcosmos são montados com solo previamente seco e

peneirado apresentando portanto, uma distribuição homogênea de

partículas. Devido à sua maior homogeneidade, estes microcosmos

permitem um estudo mais preciso do efeito de fatores isolados sobre a

 116

sobrevivência e o movimento de bactérias através do solo, tendo sido por

este motivo utilizado em muitos dos estudos realizados (Araújo et al., 1993,

1995; Hekman et al., 1994; van Elsas et al., 1991a, 1991b, 1991c). No

entanto, nos estudos envolvendo transporte de microorganismos através do

solo, estes microcosmos não podem ser considerados representativos

(Smith et al., 1985). Os microcosmos intactos e os experimentos de campo

permitem uma abordagem mais realista para a previsão do destino destes

organismos após a sua liberação no ambiente.

A utilização destes sistemas experimentais, porém, impõe algumas

dificuldades práticas, com relação à análise dos resultados. A presença de

heterogeneidades, em graus variáveis, nos microcosmos determinou

variações nos resultados obtidos para as réplicas. Por este motivo, foi

adotado o conceito de réplica significativa. Este critério baseou-se na

premissa de que as réplicas, de um mesmo experimento, deveriam

apresentar resultados semelhantes e que quaisquer variações significativas

(p < 0,05) nestes resultados, seriam decorrentes das heterogeneidades

naturais dos solos contidos nos microcosmos. A adoção deste critério,

embora tenha implicado num maior número de repetições, permitiu uma

análise mais confiável dos resultados, reduzindo a níveis aceitáveis a

influência das heterogeneidades do solo, sobre os resultados das réplicas

dos microcosmos.
 117

O período do ano em que os solos foram coletados, também teve

uma forte influência sobre a dispersão dos microorganismos, afetando

simultaneamente a textura e a umidade relativa do solo. Os microcosmos

coletados em março, um período caracterizado por altos índices

pluviométricos, apresentaram uma umidade relativa muito próxima à

capacidade máxima de retenção de água do solo e também uma proporção

mais elevada de partículas finas. A granulometria alterada deveu-se

provavelmente, à intensa lixiviação das partes mais altas da fazenda em

função das chuvas. O aporte destas partículas, somado ao excesso de

umidade, alterou sensivelmente a permeabilidade do solo. Isto ocorreu

possivelmente, devido a obstrução das vias preferenciais de fluxo, que

resultou no encharcamento destes microcosmos, dos quais não se obteve

percolado, ficando a sua superfície recoberta por uma lâmina de água. No

entanto, o transporte vertical das estirpes também ocorreu nestes

microcosmos, embora não tenha sido observado um aumento significativo

deste, em função do maior teor de água do solo, como foi verificado por

outros autores (Postma et al., 1989; van Elsas et al., 1991c). A água que

acumulou-se na superfície dos microcosmos e que continha altas

densidades das estirpes introduzidas (4,1 e 4,8 log10ufc/ml para BR5 e

BR12 respectivamente), numa situação de campo representaria a água de

“runoff” que tenderia a escorrer sobre o solo, transportando

 118

horizontalmente estes microorganismos por longas distâncias, dependendo

da geografia do local.

A comparação entre as taxas de transporte obtidas e as relatadas na

literatura é dificultada pela variedade das situações experimentais, uma vez

que estes experimentos não são padronizados. O tamanho dos microcosmos

de solo utilizados, reempacotados ou intactos, variam desde 9 cm de

comprimento por 2,5 cm de diâmetro até 60 cm de comprimento por 12 cm

de diâmetro ou 50 cm de comprimento por 3 ou 20 cm de diâmetro

(Hekman et al., 1994 e 1995; Trevors et al., 1990a; van Elsas et al., 1991c).

Um possível problema, que tem sido apontado em relação à utilização de

microcosmos estreitos, é o “efeito de parede”, pelo qual a água fluiria

preferencialmente ao longo das paredes dos microcosmos. Tal efeito não

foi observado nos microcosmos utilizados (15 cm de diâmetro), uma vez

que, foram registradas diferentes taxas de percolação e transporte entre os

microcosmos, especialmente para os coletados durante o mês de março.

Estes resultados coincidem com os obtidos pelos autores supracitados, que

também não observaram uma influência significativa do diâmetro dos

microcosmos sobre o transporte.

O presente estudo, assim como a maioria dos estudos realizados

(Breitenbeck et al., 1988; Trevors et al., 1990a; van Elsas et al., 1991c), foi

concebido visando delinear o pior cenário, em termos de transporte e

 119

dispersão dos microorganismos empregando portanto, um elevado volume

de água, aplicado uma única vez e durante um curto período de tempo (1h),

com o objetivo de simular uma chuva forte. A maioria dos estudos

realizados emprega irrigações repetidas em fluxo contínuo, variando de 3

ml/h a 140 ml/h, porém, os resultados obtidos têm revelado que as maiores

taxas de transporte são verificadas imediatamente após o primeiro fluxo da

água de irrigação e que a repetição da irrigação não altera

significativamente o padrão de distribuição dos microorganismos ao longo

dos microcosmos analisados (Hekman et al., 1995; Trevors et al., 1990a;

van Elsas et al., 1991c). A utilização, portanto, de um único evento de

irrigação não deve ter influenciado negativamente os resultados. A taxa de

irrigação dos microcosmos (volume/h) porém, ao contrário dos demais, foi

bem mais elevada, de modo a simular mais realisticamente uma chuva

tropical. Este fato, provavelmente contribuiu para a obtenção de taxas mais

elevadas de transporte do que as normalmente registradas em estudos desta

natureza. Nestes tipos de estudo, no entanto, devido à grande variedade de

fatores envolvidos, torna-se difícil a comparação de resultados.

Foi observado um padrão distinto de transporte entre a estirpe

geneticamente modificada, BR12, e a sua estirpe parental. A estirpe BR12

foi significativamente mais transportada através do solo do que a BR5 pelo

menos em dois casos: nos microcosmos contendo os latossolos dos tipos I e

 120

III. A estirpe BR5, por sua vez, apresentou uma maior capacidade de

sobrevivência no solo em condições adversas, do que a geneticamente

modificada. Este resultados sugerem que a modificação genética sofrida por

esta estirpe alterou, de alguma forma, a sua capacidade de adesão ao solo e

aptidão ecológica.

Muitos fatores como a carga superficial, a hidrofobicidade celular e

a produção de exopolímeros (Harvey, 1991), interferem na adesão da célula

às partículas do solo. As observações realizadas sobre o aspecto das

colônias destas estirpes crescidas no mesmo tipo de meio de cultura, revela

que as colônias da BR5 são muito mais mucoides do que as produzidas pela

BR12, indicando uma maior produção de exopolímeros que aumentariam a

sua capacidade de adesão às partículas de solo.

O tamanho da célula pode influir sobre a sobrevivência da bactéria

no solo. Células menores tendem a ocupar poros menores e mais protegidos

sofrendo menos predação por protozoários, ocorrendo o inverso com

células de maiores dimensões. Estudos de microscopia de epifluorescência,

realizados com o objetivo de comparar as dimensões celulares das estirpes

BR5 e BR12, cultivadas em caldo LB nas mesmas condições e pelo mesmo

período de tempo, revelaram que as células da estirpe modificada são, em

média, maiores do que as da estirpe parental (Ivanéa Vasquez Cruz,

comunicação pessoal).
 121

Os resultados indicam que a modificação genética sofrida pela

estirpe BR12 afetou o seu fenótipo, produzindo alterações significativas nas

suas características originais e, conseqüentemente, no seu comportamento

no ambiente. O fato do transposon Tn5 ter sido utilizado como vetor do

DNA heterólogo, provavelmente, contribuiu para os resultados observados.

Este vetor não tem um sítio específico de inserção, inserindo-se

preferencialmente em regiões do cromossomo ricas em seqüências A-T. A

utilização de vetores inespecíficos de inserção, na criação de

microorganismos geneticamente modificados, pode aumentar o risco

envolvido na liberação destes organismos no ambiente, uma vez que pode

comprometer determinados metabolismos ou processos celulares que

somente se revelarão em circunstâncias específicas, como os mecanismos

de resistência ao estresse. Estas observações enfatizam a necessidade da

realização de estudos de avaliação de risco, completos e detalhados, para

cada microorganismo e para cada situação, onde seja planejada a sua

utilização, buscando ao máximo prever todas as circunstâncias passíveis de

serem enfrentadas pelo organismo no ambiente.

A estirpe BR12 apresentou, coerentemente, uma distribuição mais

homogênea nas camadas dos microcosmos de latossolo dos tipos I e III,

enquanto que a BR5 ocorreu em maior densidade na camada superficial, em

todos os microcosmos. Porém, nos microcosmos que apresentaram uma

 122

maior umidade relativa, como os microcosmos ricos em matéria orgânica e

obviamente os encharcados, a estirpe BR5 apresentou uma distribuição

mais homogênea. Este fato pode ser explicado por uma maior

sobrevivência destes organismos nas camadas mais profundas dos

microcosmos, em decorrência da maior difusão dos nutrientes, embora nos

microcosmos encharcados tenha se formado um ambiente seletivo de

anaerobiose relativa. Estes resultados, no entanto, sugerem que nestes casos

a estirpe BR5 foi também mais transportada. No início do experimento,

possivelmente, parte das células desta estirpe inoculadas fixou-se

reversivelmente aos agregados do solo, sofrendo conseqüentemente um

transporte retardado em relação ao primeiro fluxo de água, o que sugere

uma possível dinâmica de transporte intermitente para esta estirpe.

A capacidade de sobrevivência no solo, registrada nos experimentos,

foi ligeiramente diferente para as estirpes estudadas. A estirpe BR5, como

era esperado, provou ser mais ecologicamente adaptada, sobrevivendo

melhor em condições desfavoráveis, como os microcosmos encharcados e

de solo arenoso, do que a geneticamente modificada. Araújo et al. (1995)

demonstrou no seu estudo de competição (no qual ambas as estirpes foram

introduzidas simultaneamente em iguais densidades em microcosmos

homogenizados de solo), que a estirpe BR12 apresentava uma capacidade

de sobrevivência ligeiramente inferior à da estirpe parental no solo e em

 123

rizosfera e rizoplano de milho. Eles concluíram, neste estudo, que o efeito

da modificação genética sobre a capacidade de adaptação ecológica da

estirpe BR12 foi aparentemente inferior aos efeitos da ação dos fatores

ambientais do solo sobre a estirpe, na presença da comunidade microbiana

autóctone. O fato, porém, das células da estirpe BR12 apresentarem um

tamanho maior que a sua estirpe parental, pelo menos no momento da

inoculação, pode ter contribuído para este resultado, por torná-las mais

vulneráveis à predação pelos protozoários presentes no solo.

O teor de matéria orgânica do solo apresentou uma forte correlação

(p < 0,05) com a sobrevivência, assim como foi observado com o

transporte.

A textura do solo, embora não tenha influenciado o transporte,

provou ser um importante fator para a sobrevivência de ambas as estirpes,

como foi anteriormente demonstrado em estudos realizados com solos de

clima temperado (van Elsas et al., 1986; 1991a; 1991b). Os resultados

obtidos, quanto à sobrevivência das estirpes BR5 e BR12, estão de acordo

com os observados por Araújo et al. (1993) para as mesmas estirpes em

microcosmos homogenizados de solo. Neste estudo, foi também registrada

uma baixa sobrevivência em solo arenoso, porém as taxas obtidas para as

estirpes, no mesmo período de tempo e em solos semelhantes, foram

significativamente maiores do que as obtidas em nosso estudo. Tal fato

 124

deveu-se provavelmente à utilização, nestes experimentos, de microcosmos

homogenizados nos quais a estrutura e agregação do solo são alteradas,

resultando numa correspondente modificação da comunidade microbiana

autóctone.

A comunidade microbiana do solo, representada pelas bactérias

heterotróficas, não foi afetada significativamente pela introdução das

estirpes inoculantes. Embora fosse esperado um ligeiro aumento na

densidade da população total nos microcosmos experimentais, devido ao

aumento de nutrientes disponíveis ocasionado pela morte das bactérias

inoculadas, isto não foi observado em todos os casos.

A comparação entre as contagens do grupo de Pseudomonas

fluorescentes, nos microcosmos não inoculados e experimentais, revelou a

existência de uma tendência de se estabelecer um equilíbrio entre as

populações naturais e as introduzidas, resultando numa densidade

populacional quase constante. Esta tendência foi demonstrada por Crozat et

al. (1987), que concluíram que a concentração de células viáveis das

populações introduzidas no solo tendem a declinar até atingirem uma

concentração de sobrevivência característica. Não foi registrada nenhuma

diferença entre as estirpes introduzidas quanto ao seu efeito sobre a

comunidade de bactérias heterotróficas e Pseudomonas fluorescentes dos

solos analisados.
 125

A capacidade de sobrevivência das estirpes introduzidas na água é

outro importante parâmetro na determinação do impacto produzido pela

dispersão destas estirpes no ambiente. A sobrevivência na água percolada

foi fortemente influenciada pelas características do solo de onde foi obtida.

Conforme esperado, as maiores taxas de sobrevivência foram registradas na

água percolada dos microcosmos ricos em matéria orgânica (6% MO) e na

água acumulada sobre a superfície dos microcosmos encharcados

provavelmente, em decorrência da maior disponibilidade de nutrientes. Os

resultados obtidos estão provavelmente subestimados porque as células não

cultiváveis, destas populações, não foram quantificadas. Estas células

correspondem à maior parte das populações naturais e introduzidas e

representam uma estratégia de sobrevivência em situações de estresse

(Caldwell et al., 1989; Colwell et al., 1985; Morita, 1988; Roszak &

Colwell, 1987). van Overbeek et al. (1990) demonstraram que uma estirpe

introduzida de P. fluorescens podia ser detectada em água de drenagem

agrícola pela técnica de imunofluorescência, mesmo nas amostras onde não

se obtinha crescimento de colônias.

Os resultados obtidos demonstraram que as estirpes introduzidas se

movimentaram no solo, a partir do ponto de inoculação, transportadas pela

água. O grau de dispersão foi afetado por características do solo, como grau

de heterogeneidade, teor de matéria orgânica (que afetou o transporte

 126

diretamente) e a textura do solo (que afetou a sobrevivência). Os fatores

climáticos também desempenharam um importante papel na dispersão. Esta

foi maior durante a estação chuvosa, pois além do transporte vertical

observado, o escoamento superficial da água atuaria como um provável

agente de disseminação das estirpes transportando-as horizontalmente. O

fato da estirpe geneticamente modificada apresentar uma taxa superior de

transporte, em alguns casos, ao apresentado pela estirpe parental e também

sobreviver relativamente melhor em águas eutróficas, constitui um ponto

desfavorável para a sua possível liberação no ambiente.

5.2. Sobrevivência de Pseudomonas fluorescens BR12 em microcosmos

de água de nascente.

A possibilidade de contaminação de corpos d’água naturais, como

lençóis subterrâneos ou mesmo rios ou riachos, adjacentes ao local de

introdução da estirpe geneticamente modificada, em decorrência da sua

maior taxa de transporte e dispersão observada em solos, levou à realização

de experimentos visando verificar a sua capacidade de sobrevivência e

persistência nestes ambientes.

A estirpe estudada P. fluorescens BR12 tem como seu habitat natural

a rizosfera de milho (Araújo et al., 1996), que é um ambiente rico em

nutrientes e apresenta, como foi demonstrado em estudos anteriormente

 127

realizados (Araújo et al., 1993 e 1995), uma sobrevivência relativamente

baixa em solos com baixos teores de matéria orgânica disponível. Estas

características permitem que seja considerada como um organismo

copiotrófico, ou seja, que é capaz de se multiplicar em elevadas

concentrações de nutrientes.

A escolha de uma água de nascente como modelo para o estudo da

sobrevivência desta estirpe em ambientes aquáticos naturais, justifica-se

pelo fato deste tipo de ambiente aquático representar, em geral, uma

condição desfavorável à sobrevivência destes organismos, devido à baixa

disponibilidade de nutrientes, especialmente de carbono.

O teor de macronutrientes exibido pela água, especialmente o

carbono orgânico total (COT) dissolvido, apresentou-se muito próximo dos

valores médios registrados em ambientes de água doce de climas

temperados, que é de aproximadamente 10mgC/l (Morita, 1993) No

entanto, apenas uma pequena fração deste total encontra-se disponível ao

metabolismo bacteriano. Nos ambientes aquáticos, assim como nos solos, a

maior parte desta matéria orgânica encontra-se associada ao material

húmico, recalcitrante ao ataque microbiano (Morita,1993; Moriarty & Bell,

1993). Esta tendência é ainda mais acentuada nos corpos d’água interiores,

devido ao aporte constante de matéria orgânica procedente do solo e

vegetação adjacentes. Tal fato resulta em que as condições predominantes,

 128

nestes corpos d’água, é de oligotrofismo, desde que não haja qualquer

poluição de origem antropogênica, como é o caso da nascente estudada.

Estas características tornam o modelo escolhido representativo deste tipo de

ambiente e, portanto, adequado aos objetivos do estudo desenvolvido.

A utilização de microcosmos permitiu o estudo e avaliação dos

efeitos de fatores individualizados, como a relativa privação nutricional e a

presença da comunidade microbiana, sobre o comportamento da estirpe.

Embora os resultados obtidos neste tipo de experimentos sejam limitados

quanto à previsão do comportamento real destes organismos nos

ecossistemas, eles fornecem dados valiosos e são o primeiro passo para o

planejamento de estudos posteriores (McFeters & Terzieva, 1991;

Winstanley et al., 1991).

Apesar das condições aparentemente desfavoráveis, a estirpe

apresentou uma elevada taxa de sobrevivência e persistência da sua

população total. Após 6 meses nos microcosmos estéreis, a população total

inicial sofreu uma redução de apenas 1,6 log10 células/ml, porém a

ausência de correlação entre as contagens de bactérias totais e o tempo

sugere que não houve uma variação significativa na sua densidade. A

maioria dos estudos de sobrevivência de bactérias, geneticamente

modificadas ou não, realizados em microcosmos aquáticos, é de curta

duração, havendo apenas umas poucas exceções, como o estudo

 129

desenvolvido por van Overbeek et al. (1990). Neste estudo, a capacidade de

sobrevivência, em água de drenagem agrícola de estirpes geneticamente

modificadas de Klebsiella aerogenes, Pseudomonas putida e Pseudomonas

fluorescens foi determinada pelo período de 1 ano. Nos experimentos

estéreis também foram registradas altas taxas de sobrevivência para todas

as estirpes, sendo que a estirpe de P. fluorescens testada apresentou uma

redução na densidade da sua população total inferior à observada para a

estirpe BR12 (de aproximadamente 0,4 log10 células/ml). As características

de sobrevivência, embora variem de acordo com as estirpes estudadas e as

condições em que os estudos são realizados, apresentam algumas

tendências gerais relacionadas às características do organismo estudado.

Em geral, em experimentos com microcosmos aquáticos estéreis, P.

fluorescens, Burkholderia cepacia, K. aerogenes e E. coli (Fish &

Pettibone, 1995; van Overbeek et al.,1 1990; Winkler et al., 1995) ou

mantém densidades estáveis ou exibem uma tendência de redução variável

na sua densidade ao longo do tempo, enquanto que estirpes de P. putida e

Vibrio tendem a sofrer um aumento inicial na sua população e manterem, a

partir disto, uma densidade estável (Brettar et al., 1994; van Overbeek et

al., 1990).
 130

A utilização de microcosmos estéreis e de diferentes métodos de

monitoramento permitiu verificar a capacidade da estirpe de adaptar-se às

condições de relativa escassez de nutrientes característica da água estudada.

Embora a densidade da população total não tenha representado um

bom índice da adversidade ambiental, a densidade da população cultivável

refletiu o nível de estresse nutricional ao qual a estirpe foi submetida. A

partir de 60 dias, as bactérias introduzidas não mais puderam ser detectadas

pelos métodos de contagem em placa, embora estivessem presentes em

altas densidades. A perda de representatividade destas contagens, no

entanto, foi detectada muito mais cedo, a partir do 2° dia do experimento. A

ausência de variações significativas nos resultados das contagens, nos

meios com diferentes concentrações empregados na amostragem, revelou

que, neste caso, a ausência de cultivabilidade não estaria associada à

excessiva concentração de nutrientes presentes no meio, conforme

observado por alguns autores (Amy & Morita, 1983; Dawes, 1985;

Poindexter, 1981). Estes resultados estão de acordo com os obtidos por

Amy & Hyatt (1989), em seu estudo de sobrevivência de E. coli HB101

(geneticamente modificada) em microcosmos de água de rio, no qual se

verificou que a utilização de meio dez vezes menos concentrado não

resultava em um aumento da cultivabilidade.

 131

Outro fator que poderia interferir na detecção das células cultiváveis

seria a ausência ou redução da expressão do gene marcador de resistência à

canamicina (nptII), em decorrência da privação nutricional. Diversos

estudos têm relatado a perda ou ausência de expressão fenotípica do DNA

heterólogo introduzido em microorganismos recombinantes. van Overbeek

et al. (1990) relata a obtenção de maiores contagens de células cultiváveis

em meios não seletivos do que nos meios contendo os antibióticos

marcadores das estirpes de P. fluorescens, P. putida e K. aerogenes,

portadoras de plasmídios introduzidos, após incubação prolongada em

microcosmos aquáticos. Embora a perda de DNA recombinante introduzido

no cromossomo da bactéria seja pouco provável, a sua não expressão ou

mesmo a alteração na intensidade da sua expressão resultaria numa

alteração do fenótipo, prejudicando a eficiência do monitoramento. Leung

et al. (1995) relatam que a expressão do gene lacZ inserido no cromossomo

de estirpes de Pseudomonas, introduzidas em microcosmos de água de rio,

foi cerca de 24 vezes menor nos microcosmos em que não foram

adicionados nutrientes. Este fato não foi observado em P. fluorescens

BR12, cujas contagens em meio seletivo e não seletivo não apresentaram

variações significativas, revelando que a expressão de gene nptII não foi

afetada pelas condições de privação nutricional.

 132

O surgimento da subpopulação de células VNC resultou das

adaptações sofridas pela estirpe à privação nutricional, resultando num

estado normalmente denominado de sobrevivência à privação nutricional

(“starvation survival state”). Este estado é normalmente caracterizado por

baixas taxas de metabolismo e alterações na morfologia e composição

celulares, como foi dito anteriormente. O tempo requerido para a

transformação das células em não cultiváveis apresenta uma grande

variabilidade entre espécies ou mesmo dentro de uma determinada espécie.

O tempo para entrada no estado não cultivável pode variar de 13h, relatado

para E. coli incubada em água do mar (Grimes & Colwell, 1986), até 40

dias para Vibrio vulnificus (Wolf & Oliver, 1992). Diferentes estirpes da

mesma espécie podem se tornar incultiváveis em tempos diferentes ou

mesmo não se tornarem incultiváveis. Xu et al. (1982) relataram que não

houve quase nenhuma redução na cultivabilidade da estirpe de E. coli

ATCC 25922 incubada em água do mar a 5°C ou 10°C, enquanto Byrd &

Colwell (1990) observaram que a estirpe de E. coli JM83 levou apenas 6

dias para se tornar incultivável sob condições semelhantes. Estes resultados

indicam que a adoção do estado VNC é uma característica da estirpe e que

varia em função das condições de incubação a que é submetida. A

eficiência, portanto, dos métodos microbiológicos convencionais para o

monitoramento destes organismos vai variar na mesma proporção, sendo

 133

altamente recomendável a utilização simultânea de outros métodos que não

envolvam o cultivo, especialmente no caso de microorganismos

geneticamente modificados. Apesar destes fatos serem bastante conhecidos

já há alguns anos, diversos estudos de sobrevivência são realizados somente

com base em contagens de células cultiváveis (Amy & Hiatt, 1989; Cruz-

Cruz et al. 1988; Leung et al. 1995; Pipke et al., 1992; Wagner-Döbler et

al., 1992 ) e, em geral, por curtos períodos de tempo, variando de algumas

horas até 30 dias.

Existem vários métodos para quantificação da células VNC

envolvendo, entre outras características, a inibição da divisão celular

(Kogure et al., 1979; Peele & Colwell, 1981; Roszak et al., 1984; Valentine

& Bradfield, 1954), a dosagem da respiração celular (Dutton et al., 1983;

Sedar & Burde, 1965, Weibull, 1953; Zimmerman et al., 1978), e a

incorporação de substâncias marcadas com elementos radioativos, revelada

por microautorradiografia (Fliermans & Schmidt, 1975; Hope, 1976 e

1978; Meyer-Reil, 1978; Munro & Brock, 1968; Tabor & Neihof, 1984).

No entanto, a facilidade e o baixo custo da técnica direta de contagem de

bactérias viáveis, desenvolvida por Kogure et al. (1979), faz com que ela

seja uma das mais utilizadas nos estudos de sobrevivência de

microorganismos. As desvantagens desta técnica residem basicamente na

sua inespecificidade, devido à utilização do corante laranja de acridina para

 134

visualização das células, e também no fato de ser aplicável apenas às

bactérias sensíveis ao ácido nalidíxico. A falta de especificidade pode ser

superada pela utilização de anticorpos monoclonais específicos para a

estirpe estudada, marcados com fluorocromos. Esta modificação da técnica

tem sido utilizada em diversos estudos ( Brayton et al., 1987; Grimes &

Colwell, 1986; Paszko-Kolva et al., 1991; Roszak et al., 1984; Xu et al.,

1982). Um possível problema relacionado a este método, assim como a

qualquer técnica envolvendo detecção por imunofluorescência, provém do

fato de que todos os anticorpos monoclonais, ou não, empregados até o

momento na detecção de células VNC, foram produzidos contra células

bacterianas crescidas em laboratório (Oliver, 1993). Considerando a

ocorrência de alterações na superfície celular quando a célula entra no

estado VNC (Lugtenberg & van Alpen, 1983), seria natural supor uma

conseqüente redução da especificidade desta técnica na detecção destas

células bacterianas.

As contagens de células viáveis pelo método de Kogure, nos

microcosmos estéreis, revelou um declínio ao longo do tempo da porção

metabolicamente ativa da população de P. fluorescens BR12, que após 6

meses representava apenas aproximadamente 7,4% da população total. No

entanto, é interessante notar que no inóculo, composto de células na fase

log tardia e cultivadas em meio rico, a proporção de células viáveis não

 135

ultrapassou 62,5% da população total. Entre o primeiro e o terceiro dia, foi

detectada uma ligeira elevação na proporção de células viáveis, revelando a

ocorrência de um maior número de células em divisão celular. Porém, neste

período, a elevada taxa declínio da população total predominou resultando

na diminuição das contagens absolutas. Em estudos desenvolvidos sobre o

assunto, três tipos básicos de padrões de sobrevivência foram relatados para

estirpes ambientais submetidas à privação nutricional em condições de

laboratório (Amy & Morita, 1983; Morita, 1993). No primeiro caso, a

população viável se mantém constante ao longo do tempo e as células não

sofrem divisão redutiva, nem redução no tamanho (Jones & Morita, 1985);

no segundo, o mais comum, há um aumento inicial do número de células,

que pode variar de 100 a 800% da população inicial, seguido por um

período de declínio na contagem de células viáveis até atingir um estado de

equilíbrio caracterizado por contagens constantes (Novitsky & Morita,

1977, 1978). No terceiro e menos estudado, a densidade da população

viável diminui a partir do momento inicial até atingir uma densidade

constante (Kurath & Morita, 1983). O comportamento exibido pelas

contagens de bactérias viáveis de P. fluorescens BR12 sugere que esta

estirpe esteja incluída no terceiro grupo descrito, embora até o final do

experimento não tenha sido observada a esperada estabilização das

contagens prevista pelo modelo. Porém, como foi visto em relação ao

 136

surgimento de VNC, o tempo decorrido entre a etapa de declínio e a de

estabilização varia em função da estirpe analisada e das condições a que se

encontra submetida. Kurath & Morita (1983) relataram que a estabilização

do número de células viáveis de uma estirpe de Pseudomonas sp. levou de

18 a 25 dias para ocorrer, enquanto que para Vibrio sp. ANT300 (Moyer &

Morita, 1989) a estabilização só foi registrada a partir de 70 dias.

A quase totalidade dos estudos de sobrevivência, realizados com

MGMs em microcosmos, não utiliza técnicas de contagem de células

viáveis, sendo o surgimento de células VNC apenas presumido através de

comparações entre as contagens totais e em placa (Byrd & Colwell, 1990;

Fish & Pettibone, 1995; Trevors et al., 1989; van Overbeek et al., 1990;

Winkler et al., 1995). Os resultados obtidos para P. fluorescens BR12, no

entanto, revelaram que somente a partir do terceiro dia foi detectado o

surgimento de VNC, embora as discrepâncias entre as contagens de

bactérias totais e cultiváveis tenham sido detectadas desde o inóculo. Nos

dois primeiros dias, as contagens de bactérias cultiváveis excederam as de

bactérias viáveis, embora fosse registrada uma diferença, na faixa de 16 a

30%, entre as contagens de bactérias cultiváveis e totais. Estes resultados

demonstram que uma parte da população considerada como não viável foi

capaz de crescer nos meios de cultura neste período inicial. Este resultado

aponta uma limitação no método utilizado, sugerindo a ocorrência de

 137

células “viáveis” cuja atividade metabólica não pode ser detectada pelo

método de enumeração utilizado. O conceito de célula viável definido

como a atividade metabólica, avaliada pelos métodos citados anteriormente,

tem sido questionado na medida em que pressupõe inviáveis as demais

células, além de refletir a sensibilidade dos métodos empregados.

Teoricamente, a não viabilidade, caracterizada pela ausência de

metabolismo, representaria a morte celular, o que na realidade não ocorre,

uma vez que a porção da população, caracterizada como não viável,

apresentou densidades crescentes ao longo do experimento, representando

ao final, dele, 93% da população total. A hipótese de crescimento críptico

(Koch, 1959) pode ser descartada neste caso. Morgan et al. (1993) obteve

resultados semelhantes para uma estirpe de Aeromonas salmonicida,

incubada em microcosmos contendo água de lago, cuja proporção de

células viáveis, após 21 dias, foi de apenas 30% da população total.

González et al. (1992) sugerem que seja considerada morta apenas a

bactéria que tenha perdido a sua integridade morfológica, e conclui que a

única maneira de se detectar a morte celular é através da observação da

redução nas contagens de bactérias totais ao longo do tempo. Este conceito

de morte parece mais adequado aos mecanismos adaptativos apresentados

pelos microorganismos expostos às condições de estresse presentes nos

ambientes naturais. Entretanto, o significado ecológico destas populações

 138

silenciosas permanece uma incógnita, constituindo um dos grandes desafios

da ecologia microbiana e, também, um fator complicador para análise do

risco envolvido na liberação de MGMs no ambiente.

Outro indicador importante da adoção de um estado de

“dormência”, como estratégia de sobrevivência de bactérias submetidas ao

estresse nutricional, é a redução das dimensões celulares (Morita, 1993;

Oliver, 1993; Roszak et al. 1984). Neste aspecto, os resultados obtidos para

P. fluorescens BR12, confirmam a tendência revelada pelas diferentes

contagens. As células sofreram uma redução significativa nas suas

dimensões, resultando num biovolume celular médio aproximadamente 6,4

vezes menor que o inicial. O comprimento sofreu, em média, uma maior

redução (62%) e uma maior variabilidade do que o diâmetro (50%). As

maiores variações no tamanho foram observadas a partir do 9° dia,

coincidindo o aumento do número das células de dimensões reduzidas com

a redução na proporção entre as células viáveis e totais. Esta correlação foi

apontada por Roszak et al. (1984) que demonstraram que estas células de

dimensões reduzidas apresentavam, também, uma atividade metabólica

reduzida. Brettar et al. (1994), em seus estudos sobre a estirpe

geneticamente modificada de Pseudomonas putida DSM 3931 introduzidas

em microcosmos estéreis e mesocosmos de água de rio, também

observaram uma redução na dimensão das células, em ambas as situações.

 139

Nos microcosmos estéreis, porém, a redução observada foi menor (de

1,4μm x 0,8μm para 1,0μm x 0,6μm após 16 dias) do que a registrada nos

mesocosmos na presença da biota (3,5μm x 1,0μm para 0,99μm x 0,7μm

após 22 dias), o que sugere a sua influência sobre este processo. Nos

mesocosmos não acrescidos de nutrientes, o comprimento das células

apresentou pouca variação durante a primeira semana embora, no geral,

tenha apresentado uma maior variação do que a registrada para o diâmetro.

Estes resultados, ressalvadas as diferenças de metodologia, estão de acordo

com os obtidos para P. fluorescens BR12, embora esta tenha sofrido uma

maior redução nas suas dimensões do que P. putida DSM 3931 nos

microcosmos estéreis. A tendência a adoção de formas cocoides, descrita na

literatura (Baker et al., 1983; Dawson et al., 1981; Guelin et al., 1979;

Kennedy et al., 1970) durante o processo de redução das dimensões

celulares, também foi registrada em P. fluorescens BR12. A presença de

formas cocoides pôde ser verificada a partir da 1° semana de incubação,

nos microcosmos, porém, no geral, a morfologia celular foi preservada para

a maioria das células (aproximadamente 70%), que se mantiveram sob a

forma de bastonete.

Como era esperado, a sobrevivência da estirpe estudada, em

microcosmos contendo a comunidade microbiana natural da água, foi

significativamente inferior à apresentada nos microcosmos estéreis. As

 140

populações totais e viáveis não puderam ser enumeradas, nestes

experimentos, por não dispormos de antissoro monoclonal específico para

esta estirpe. No entanto, os resultados apresentados estão de acordo com os

obtidos na maioria dos estudos desta natureza, que apontam a predação por

protozoários, seguida das relações de competição e antagonismo, como os

principais fatores responsáveis pela redução na densidade das populações

introduzidas (Brettar et al., 1994, van Overbeek et al., 1990; Trevors et al.,

1989; Leung et al., 1995; Amy & Hiatt, 1989). Apesar da taxa menor de

sobrevivência registrada nos microcosmos contendo a microbiota nativa da

água, a perda da cultivabilidade da estirpe não parece ter sido afetada por

este fator, tendo ocorrido aproximadamente no mesmo período registrado

nos microcosmos estéreis.

A persistência da estirpe nestes microcosmos foi determinada

indiretamente através da detecção do seu DNA recombinante por “dot

blot”. Embora não se possa afirmar que o número de cópias detectado

(aproximadamente 103 cópias do gene cryIVB) corresponda ao número de

células da estirpe presente nos microcosmos, é razoável supor que estes

números sejam bastante aproximados devido à metodologia empregada. A

influência do DNA dissolvido, nos resultados obtidos, foi provavelmente

limitada devido à utilização de membranas Millipore com 0,45μm de

diâmetro de poro, que permitiriam a sua passagem durante filtração das

 141

amostras dos microcosmos para extração do DNA total (van Overbeek et

al., 1990; Paul & David, 1989). Os processos de lise e extração

empregados, provavelmente, resultariam na sua degradação, reduzindo

também a concentração do DNA dissolvido no extrato (Byrd & Colwell,

1990). A utilização das membranas com este diâmetro de poro pode ter

resultado numa subestimação no número de cópias do DNA recombinante,

uma vez que cerca de 11% da população de células nos microcosmos

estéreis, apresentava neste período a forma de cocos com diâmetro inferior

a 0,45μm. A predominância de células incultiváveis que apresentam, em

geral, uma única cópia do seu cromossomo, aliada às perdas decorrentes

dos processos de extração, foi outro fator que pode ter contribuído para

uma possível redução do número de cópias detectáveis do DNA

recombinante.

Um dos principais riscos associados à liberação de MGMs no

ambiente, consiste numa possível interferência destes organismos sobre a

estrutura e/ou diversidade da comunidade microbiana natural, afetando o

fluxo de carbono, nitrogênio e energia destas comunidades (Pipke et al.,

1992). No entanto, na maioria dos estudos realizados envolvendo a

liberação de MGMs em sistemas experimentais, não foi verificada nenhuma

influência significativa destes organismos sobre a comunidade microbiana

autóctone (Höfle, 1992; Jain & Sayler, 1987; Levin & Harwell, 1986; Pipke
 142

et al., 1992; Stotzky & Babich, 1986; Wagner-Döbler et al., 1992).

Conforme era esperado, a partir destas informações, a introdução de P.

fluorescens BR12, nos microcosmos não estéreis, também não apresentou

nenhuma influência significativa sobre a comunidade microbiana nativa da

água de nascente.

5.3. Resposta à privação nutricional e desenvolvimento de resistência

cruzada aos outros tipos de estresse.

A capacidade de adaptação exibida pela estirpe P. fluorescens

BR12 às condições de relativa privação nutricional, presentes nos

microcosmos aquáticos, despertou o interesse em determinar a sua resposta

à privação dos principais macronutrientes e à ausência total de nutrientes,

sob condições controladas.

A resposta da população total das culturas submetidas às diferentes

condições de privação nutricional não variou significativamente (p< 0,05),

apresentando ao final do experimento densidades muito próximas. Porém, a

população cultivável apresentou respostas diferenciadas à privação

nutricional de nutrientes individualizados e de todos os nutrientes. A perda

de cultivabilidade foi menor para as culturas em privação total de

nutrientes, indicando um nível menor de estresse nestas culturas. Este

 143

resultado sugere uma maior facilidade de adaptação metabólica global do

que de vias metabólicas individualizadas.

De um modo geral, a estirpe apresentou uma sensibilidade maior à

privação nutricional do que a registrada para outras bactérias, em estudos

desta natureza. A estirpe KT2442 de Pseudomonas putida manteve-se

totalmente cultivável, por 30 dias, quando privada de carbono ou de

nitrogênio ou de todos os nutrientes (Givskov et al., 1994). A

cultivabilidade da estirpe DF57 de P. fluorescens não foi afetada pela

privação de carbono, nitrogênio ou fósforo, por um período de 4 dias

(Kragelund & Nybroe, 1994). E. coli privada de carbono ou nitrogênio e

Vibrio sp. S14 privado de carbono ou de todos os nutrientes, também,

apresentaram uma maior cultivabilidade do que a registrada para a estirpe

BR12 (Hengge-Aronis, 1993; Reeve et al., 1984). Geralmente, a privação

de fósforo (Davis et al., 1986; Givskov et al., 1994; Hengge-Aronis, 1993;

Holmquist & Kjelleberg, 1993; Jürgens & Güde, 1990; Östling et al., 1993)

e, em alguns casos, também de enxôfre (Givskov et al., 1994), desempenha

um papel mais importante na perda da viabilidade em bactérias, porém isto

não foi observado para a estirpe testada.

Estudos recentes desenvolvidos sobre a resposta fisiológica de

bactérias não esporulantes expostas à privação nutricional têm demonstrado

que estes organismos sofrem diversas mudanças, rápidas e

 144

interrelacionadas, no padrão de expressão gênica (Nyström, 1993). Estas

mudanças são traduzidas fenotipicamente sob a forma de células mais

adaptadas e resistentes, não só ao estresse nutricional, como também aos

outros tipos de estresse. O desenvolvimento de resistência cruzada aos

outros tipos de estresse, decorrente da privação nutricional, tem sido

estudado em diversos organismos como, por exemplo, E. coli (Hengge-

Aronis, 1993; Jenkins et al., 1988 e 1990; Matin, 1991), Salmonella

typhimurium (Reeve et al., 1984; Spector et al., 1988), Vibrio sp.

(Holmquist & Kjelleberg, 1993; Jouper-Jaan et al., 1992; Nyström et al.,

1992; Östling et al., 1993), Pseudomonas putida (Givskov et al., 1994) e

Pseudomonas fluorescens (van Overbeek et al., 1995). Este mecanismo

permite que a bactéria sobreviva ou persista às condições desfavoráveis,

que em outras circunstâncias poderiam lhe ser letais. Este fato é

extremamente relevante não só para a análise de risco de um MGM, como

também para o planejamento da sua liberação no ambiente, tendo sido por

esta razão abordado no presente estudo.

O desenvolvimento de resistência cruzada aos outros tipos de

estresse, avaliado em termos da população cultivável em todas as culturas

submetidas às diferentes condições de privação nutricional, corrobora com

os resultados obtidos para E. coli (Jenkins et al., 1988 e 1990; Matin, 1991)

e P. putida KT2442 (Givskov et al., 1994), embora estas bactérias tenham

 145

apresentado uma resistência aumentada ao etanol, ao contrário da P.

fluorescens BR12. A estirpe estudada, assim como P. putida KT2442, não

apresentou resistência a temperaturas muito superiores à de crescimento,

como foi registrado para E. coli K12 que desenvolveu resistência a

temperaturas de até 57°C (Jenkins et al., 1988).

As culturas de P. fluorescens BR12 submetidas à privação total de

nutrientes apresentaram uma resistência significativamente maior aos tipos

de estresse testados, exceto ao etanol, do que as privadas de nutrientes

individualizados que não apresentaram entre si variações significativas.

Estes resultados diferem dos obtidos para Vibrio sp. S14 cujo

desenvolvimento de resistência às situações de estresse como temperaturas

elevadas, irradiação com UV e exposição ao cloreto de cádmio foi

aparentemente idêntica para culturas privadas de carbono e culturas

privadas de todos os nutrientes. Givskov et al. (1994), em seu estudo com

P. putida KT2442, também não observaram nenhuma diferença no

desenvolvimento de resistência ao estresse relacionada às diferentes

condições de privação nutricional às quais a estirpe foi submetida.

A variação do grau de resistência adquirida em relação ao tempo,

também variou entre as culturas da estirpe BR12 submetidas à privação

total de nutrientes e as demais. Nas primeiras, a resistência desenvolveu-se

mais lentamente, atingindo seus valores máximos aos 15 dias, enquanto nas
 146

outras os valores máximos foram alcançados aos 3 ou 7 dias. Estes

resultados também diferem dos relatados para P. putida KT2442 e P.

fluorescens R2f (van Overbeek et al., 1995) cuja tolerância máxima ao

estresse foi detectada, apenas algumas horas após a exposição das bactérias

às condições de privação nutricional.

A tendência aproximadamente normal no padrão de aquisição de

resistência ao estresse observado nos experimentos, pode também ser

observado para P. fluorescens R2f privadas de carbono (van Overbeek et

al., 1995).

Os estudos realizados até o momento, para determinar o

desenvolvimento de resistência cruzada ao estresse decorrente da privação

nutricional em bactérias, abordam a questão apenas enfocando a população

cultivável. Esta abordagem é justificável, pois na medida em que o

desenvolvimento de resistência ao estresse é detectado na porção da

população mais sensível aos seus efeitos, é altamente provável que a porção

não cultivável da população, por definição muito mais resistente e

adaptada, também o apresente num grau mais elevado. Esta suposição foi

confirmada pelos índices de resistência aos tipos de estresse testados,

obtidos a partir da população total das culturas privadas de nutrientes. As

populações totais das culturas submetidas à privação nutricional

apresentaram índices muito mais elevados de resistência do que os

 147

registrados para a porção cultivável destas populações, inclusive para as

culturas privadas de todos os nutrientes, que apresentaram uma maior

cultivabilidade, demonstrando que a maior parte das células resistentes

encontra-se sob a forma não cultivável. Um exemplo claro disto é a

aquisição de resistência ao etanol que não foi detectada pela análise da

população cultivável, mas que ocorreu para as culturas privadas de fósforo,

enxofre e especialmente para as privadas de todos os nutrientes. Tal fato

comprova que a determinação da aquisição de resistência ao estresse por

uma determinada estirpe, baseada apenas na porção cultivável de sua

população, pode gerar resultados subestimados, não só em relação ao nível

da resistência adquirida como, também na detecção da referida resistência.

A utilização da técnica de contagem direta de células totais, pode gerar

questionamentos em relação ao estado fisiológico das células resistentes,

sendo portanto desejável o desenvolvimento de maiores estudos sobre o

assunto, empregando técnicas que permitam a enumeração das populações

viáveis. No entanto, com base nas comparações realizadas entre estes dois

tipos de contagem, nos experimentos com microcosmos, é razoável supor

que a maior parte desta população resistente apresente-se em estado

“dormente”, com níveis de atividade metabólica indetectáveis pelos

métodos normalmente empregados para esta finalidade.

 148

As culturas de BR12 mantidas em microcosmos de água de nascente

também apresentaram uma maior resistência aos tipos de estresse testados,

avaliada em termos da população cultivável, do que as culturas crescidas

em meio rico. É comum supor-se que nas condições oligotróficas,

normalmente predominantes nos ambientes naturais, o carbono seja o

principal nutriente do qual os organismos se encontrem deficitários. van

Overbeek et al. (1995), em seus estudos comparativos entre P. fluorescens

R2f privadas de carbono, em meio mineral e introduzidas no solo,

constataram a aquisição de uma resistência semelhante ao estresse em

ambas as situações, concluindo que a privação ao carbono seria o principal

fator desencadeante da aquisição de resistência. No entanto, os resultados

obtidos para P. fluorescens BR12 não permitem as mesmas conclusões. As

culturas da estirpe privadas de carbono em meio mineral apresentaram não

só uma menor cultivabilidade como, também, uma resistência ao estresse

inferior à exibida pelas culturas mantidas nos microcosmos. O fato da

porção cultivável das culturas mantidas em microcosmos ter apresentado

uma resistência maior ao etanol, do que a das culturas testadas em meios

minerais, é também, um resultado importante, pois aponta a dificuldade de

se prever, a partir de experimentos de laboratório, o real comportamento da

estirpe no ambiente. A aquisição de resistência inespecífica ao estresse,

decorrente dos mecanismos adaptativos dos microorganismos às situações

 149

ambientais, pode favorecer a persistência dos MGMs em condições

aparentemente desfavoráveis. Este é um importante fator que deve ser

considerado nos estudos de avaliação do risco envolvido na liberação

destes organismos no ambiente. Os complexos processos de regulação,

envolvidos nos mecanismos adaptativos às situações de estresse, alteram

inúmeras características fenotípicas celulares, interferindo no seu

comportamento no ambiente. Portanto, as respostas adaptativas dos MGMs

ao estresse devem ser incluídas na sua análise de risco, uma vez que podem

alterar alguns de seus aspectos importantes, como por exemplo, a

persistência no ambiente, a expressão gênica do DNA recombinante e as

medidas de contenção e extermínio, fornecendo uma base mais realista para

a avaliação da relação risco x benefício envolvida na sua liberação no

ambiente.

5.4. Transferência gênica por transformação natural do DNA

recombinante de P. fluorecens BR12 em filtro e em microcosmos com

água de nascente.

A capacidade de sobrevivência de P. fluorescens BR12 e a

persistência do seu DNA recombinante, verificada em microcosmos

aquáticos, suscitou o interesse de determinar a possível ocorrência de

 150

transferência gênica horizontal, por transformação, do DNA recombinante

desta estirpe para a comunidade microbiana nativa da água de nascente.

A presença de células competentes, ou seja, capazes de absorver,

incorporar e expressar o DNA recombinante de P. fluorescens BR12 na

comunidade microbiana da água de nascente, revelou-se positiva nos

experimentos de transformação em filtro realizados. A transformação,

-8
nestes experimentos, ocorreu numa taxa relativamente alta de 3,8 x 10

transformantes por doador. Porém, nos experimentos em microcosmos

aquáticos, o mesmo não ocorreu. O número relativamente alto de colônias

de transformantes presumidos detectados, correspondeu, aproximadamente,

às contagens de bactérias resistentes à canamicina naturalmente presentes

na água. Porém, a presença do DNA recombinante não foi confirmada para

nenhuma delas. Este resultado era esperado, na medida em que, nos

experimento em filtro, foram estabelecidas condições extremamente

favoráveis à ocorrência da transformação e que dificilmente se repetiriam

nos microcosmos.

Vários estudos têm relatado a ocorrência de transferência gênica, por

transformação, em microcosmos aquáticos e seus sedimentos (Chamier et

al., 1993; Frischer et al., 1990; Jeffrey et al., 1990; Leff et al., 1992; Lorenz

et al., 1988; Lorenz & Wakernagel, 1990; Paul et al., 1991 e 1992;

Romanowski et al., 1993; Stewart & Sinigalliano, 1990; Stewart et al.,

 151

1991). Porém, a maioria destes estudos enfoca, principalmente, a influência

dos fatores ambientais sobre o processo de transformação, utilizando para

isto, bactérias receptoras nos experimentos. A comunidade microbiana

nativa, na grande maioria dos estudos desta natureza, é considerada como

fator biótico, cuja presença pode influir sobre a transformação. Por esta

razão, a verificação da possível ocorrência de transferência do DNA da

doadora para estes organismos é realizada, quando o é, apenas como um

controle negativo da presença da receptora (Stewart & Sinigalliano, 1990;

Paul et al., 1991 e 1992. Os resultados obtidos para P. fluorescens BR12

estão de acordo com os apresentados nestes estudos, onde também não foi

detectada a transferência gênica, por transformação, do DNA das estirpes

doadoras para a comunidade microbiana ambiental.

No entanto, alguns fatores importantes capazes de influir sobre a

eficiência da transformação, assim como algumas variáveis experimentais,

devem ser considerados na análise dos resultados.

Geralmente, as moléculas de DNA livre introduzidas nos ambientes

aquáticos e nos seus respectivos sedimentos são degradadas numa

velocidade inicial relativamente alta (Bazelyan & Ayazatulin, 1979;

Clesceri & Daze, 1975; DeFlaun & Paul, 1989; Fibi et al., 1991; Maeda &

Taga, 1973 e 1974; Novitsky, 1986; Paul et al., 1989; Phillips et al., 1989).

O tempo de residência do DNA livre varia de acordo com o ambiente

 152

considerado, ficando na faixa de 6 a 28h em ambientes aquáticos

subtropicais (DeFlaun & Paul, 1989; Paul et al., 1987 e 1989). A

degradação, mesmo parcial, do DNA pode ocasionar uma redução

substancial na sua capacidade transformante, pois cada estirpe apresenta

exigências específicas relacionadas ao comprimento da molécula (Morrison

& Guild, 1972). Estudos de transformação realizados em condições

estéreis e na presença da microbiota têm demonstrado que as nucleases,

presentes nestes organismos e dissolvidas na água, são as principais

responsáveis pela degradação do DNA transformante (Paul et al., 1987).

A prolongada duração dos experimentos, em microcosmos (15 dias)

pode ter resultado na degradação do DNA da P. fluorescens BR12,

tornando-o indisponível para a transformação. A utilização de células

mortas da estirpe, ao invés de seu DNA livre, teve como objetivo reduzir a

ação das nucleases ambientais, aumentando a persistência do DNA nos

microcosmos e, conseqüentemente, a eficiência da transformação. A

presença de impurezas agregadas ao DNA, como “debris” celulares, além

de não interferir com a eficiência da transformação, representa uma

situação mais próxima da encontrada nos ambientes naturais (Juni & Heym,

1980; Lorenz et al., 1991; Paul et al., 1991). Porém, a ausência de

superfícies sólidas, como sedimentos, pode ter influenciado não apenas a

 153

extensão da degradação do DNA introduzido, como também, a eficiência

da transformação.

A adsorção das moléculas de DNA às partículas minerais dos

sedimentos, assim como ao material particulado suspenso na coluna dágua,

tem um efeito protetor, prolongando a sua persistência nos ambientes

aquáticos. Os estudos desenvolvidos por Lorenz et al. (1988) demonstraram

que Bacillus subtilis era capaz de absorver DNA cromossômico

diretamente das partículas de areia, revelando que a adsorção do DNA às

partículas de sedimento não impede que ele atue na transformação. Outro

fato importante observado neste estudo foi a maior freqüência de

transformação registrada na interface sólido/líquido dos sistemas

experimentais, sugerindo que a presença de superfícies sólidas favoreceria

a ocorrência da transformação, por aumentar a probabilidade de contato

entre as células competentes e o DNA transformante. Esta tendência foi

também observada em estudos de transformação desenvolvidos com

estirpes de P. stutzeri tanto in vitro (Stewart & Carlson, 1986; Stewart &

Sinigalliano, 1990), como em microcosmos aquáticos, na presença ou

ausência de sedimentos (Rochelle et al., 1988; Stewart & Sinigalliano,

1990). A ausência de transformação detectável da comunidade microbiana

nativa da água de nascente pelo DNA cromossômico da estirpe P.

fluorescens BR12, nos microcosmos aquáticos, comparada à taxa

 154

relativamente alta obtida sobre os filtros, sugere que a ausência de

superfícies sólidas (sedimentos) nos sistemas experimentais, pode ter

influído negativamente sobre a eficiência da transformação.

Uma outra característica dos sedimentos que pode contribuir para o

favorecimento da transferência gênica, por transformação, é a presença de

microambientes com uma maior disponibilidade de nutrientes. As células

adsorvidas aos sedimentos, conseqüentemente, apresentam uma maior taxa

metabólica, além de apresentarem densidades populacionais mais estáveis

ao longo do tempo (Irriberi et al., 1987). A atividade metabólica tem sido

apontada como um pré-requsito para a aquisição do estado de competência

pelas células receptoras. No entanto, os estudos realizados enfocando o

efeito da limitação nutricional sobre a eficiência da transformação têm

produzido resultados contraditórios. Lorenz & Wakernagel (1991 e 1994)

observaram que a limitação de carbono, fósforo e nitrogênio inibia o

desenvolvimento do estado de competência em Bacillus subtilis, enquanto

que para P. stutzeri foi registrado um aumento na competência, a medida

em que o crescimento da estirpe era limitado pela redução na concentração

dos nutrientes presentes no meio. Os resultados obtidos em estudos desta

natureza são, entretanto, dificilmente extrapoláveis para as condições

ambientais. A utilização de estirpes receptoras crescidas em meio rico e

conseqüentemente mais vulneráveis ao estresse nutricional, impossibilita as

 155

comparações com as bactérias receptoras presentes nas comunidades

microbianas naturais.

Como foi discutido nas seções anteriores, a maior parte da

microbiota dos ambientes naturais encontra-se adaptada aos fatores de

estresse ambiental, especialmente a limitação de nutrientes (Morita, 1993;

Roszack & Colwell, 1987). A perda da capacidade de crescer em meios de

cultura é uma das características deste estado de adaptação. Atualmente,

sabe-se que apenas uma porção muito reduzida destas populações é

detectável pelos métodos microbiológicos convencionais. Esta é uma das

principais limitações dos métodos empregados para a verificação da

ocorrência de transferência gênica entre bactérias introduzidas e as

populações ambientais. Os métodos empregados para esta finalidade

baseiam-se na detecção de transformantes que expressem a característica

adquirida e que sejam capazes de crescer em meios de cultura seletivos,

fornecendo portanto, resultados pouco significativos em termos da

população total das comunidades microbianas analisadas. Alguns métodos

moleculares para a detecção da presença dos genes marcadores, como a

hibridização ou a amplificação de DNA, in vitro, têm sido empregados nos

extratos de DNA total destas populações, com o objetivo de pesquisar

também a transferência gênica para as populações não cultiváveis. Porém,

devido à presença de elevadas concentrações do DNA transformante livre,

 156

presentes nos sistemas experimentais, os resultados obtidos são pouco

conclusivos. O fato da detecção dos transformantes basear-se apenas em

genes marcadores é também um outro fator de limitação apresentado pelas

técnicas, atualmente disponíveis, subestimando os resultados obtidos nestes

experimentos, uma vez que, a ocorrência de transformação de outras

seqüencias do DNA introduzido não é detectada.

Por estas razões, a ausência de transformantes detectáveis nos

experimentos realizados, não nos permite afirmar que a transformação não

ocorra realmente nestes ambientes A ocorrência de transformação em filtro

revelou a existência de células competentes na comunidade microbiana

nativa, capazes de absorver, incorporar e expressar o DNA recombinante de

P. fluorescens BR12. Embora as condições estabelecidas para estes

experimentos, in vitro, como elevadas populações da microbiota receptora

(> 107), abundância de nutrientes e altas concentrações relativas do DNA

transformante, sejam dificilmente encontradas na coluna dágua de

ambientes aquáticos oligotróficos, elas podem ocorrer em micronichos

presentes nestes ambientes, como por exemplo, os biofilmes que ocorrem

nas interfaces da água com os sedimentos.

 157

6. CONCLUSÕES

♦ Ambas as estirpes de P. fluorescens foram transportadas, pela água,

através dos solos testados. A estirpe geneticamente modificada (BR12)

apresentou, em duas situações experimentais, uma maior taxa de

transporte do que a estirpe parental (BR5), revelando um maior

potencial de dispersão no ambiente. O transporte das estirpes foi

fortemente influenciado pelo teor de matéria orgânica do solo, que

desempenhou um importante papel na fixação dos microorganismos

introduzidos. O potencial de dispersão das estirpes, durante a estação

chuvosa, revelou-se maior do que na estação seca, devido a provável

ocorrência, também, de transporte horizontal;

♦ A estirpe parental mostrou-se mais ecológicamente adaptada, do que a

geneticamente modificada, apresentando uma maior sobrevivência em

condições desfavoráveis, como, os microcosmos encharcados ou de solo

arenoso. A sobrevivência das estirpes foi influenciada por fatores como,

a textura e o teor de matéria orgânica dos solos, sendo que o último,

também influenciou a sua sobrevivência nos percolados. A introdução

das estirpes não afetou significativamente a comunidade microbiana

nativa dos solos;

 158

♦ A população total da estirpe BR12 apresentou uma elevada taxa de

sobrevivência em água de nascente estéril, tendo sofrido, após 6 meses,

uma redução de apenas 1,6 log10 células/ml na sua densidade. A

cultivabilidade e a viabilidade destas células, porém, sofreram uma

redução, ao longo do experimento, de 100% (após 60 dias) e 92,6%

(após 6 meses) respectivamente. As células sofreram, também, uma

redução significativa no seu comprimento (62%) e diâmetro (50%),

apresentando, ao final de 6 meses, um biovolume celular médio 6,4

vezes menor que o inicial. Estes resultados revelam que a estirpe adotou,

nestas condições, um estado adaptado à sobrevivência em escassez de

nutrientes;

♦ A presença da comunidade microbiana autóctone, da água de nascente,

influenciou negativamente a sobrevivência da estirpe introduzida,

embora, aparentemente, não tenha afetado a sua cultivabilidade. A

detecção do DNA rec, numa densidade estimada de 103 cópias/ml, após

a população cultivável ter se tornado indetectável (após 60 dias), sugere

a persistência destes organismos sob a forma não cultivável;

♦ A resposta da estirpe BR12 às diferentes condições de privação

nutricional, em meios minerais definidos, não variou significativamente.

A privação nutricional de nutrientes individuais (carbono, nitrogênio,

fósforo e enxofre), porém, influenciou negativamente a sua

 159

cultivabilidade. Todas as culturas da estirpe BR12 expostas à privação

nutricional, em meios minerais ou em microcosmos aquáticos,

desenvolveram uma resistência aumentada aos outros tipos de estresse

(químico, oxidativo, osmótico e térmico), em relação às culturas

crescidas em meio rico. As culturas mantidas em microcosmos, porém,

apresentaram um índice maior de resistência ao estresse químico do que

o observado nos meios minerais. Os índices de resistência aos estresses

testados, da população total nos meios minerais, foram muito superiores

aos obtidos para a população cultivável, revelando que a maioria das

células resistentes encontra-se sob a forma não cultivável;

♦ A presença de células bacterianas competentes, na comunidade

microbiana da água de nascente, foi comprovada através dos

experimentos de transformação em filtro, porém, a transferência gênica,

por transformação, do DNA rec da estirpe BR12, para a microbiota

autóctone, não foi detectada nos microcosmos.

 160

7. BIBLIOGRAFIA:

AMY, P.S. & MORITA, R.Y. 1983. Starvation-survival patterns of sixteen

freshly isolated open-ocean bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 45:

1109-1115.

AMY, P.S. & HIATT, H.D. 1989. Survival and detection of bacteria in an

aquatic environment. Appl. Environ. Microbiol., 55: 788-793.

ARAÚJO, M.A.V.; MENDONÇA-HAGLER, L.C.S.; HAGLER, A.N. &

VAN ELSAS, J.D. 1993. Survival of genetically modified

Pseudomonas fluorescens introduced into subtropical soil microcosms.

FEMS Microb. Ecol., 13: 205-216.

ARAÚJO, M.A.V. 1994. Sobrevivência, competição e colonização de raiz

de milho por Pseudomonas fluorescens geneticamente modificada

introduzida em microcosmos com solos subtropicais. Tese de

Doutorado apresentada ao Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de

Góes da UFRJ.
 161

ARAÚJO, M.A.V.; MENDONÇA-HAGLER, L.C.S.; HAGLER, A.N. &

VAN ELSAS, J.D. 1995. Competition between a genetically modified

Pseudomonas fluorescens and its parent strain in subtropical soil

microcosms. Rev. Microbiol., 26: 6-15.

ARAÚJO, M.A.V.; MENDONÇA-HAGLER, L.C.S.; HAGLER, A.N. &

VAN ELSAS, J.D. 1996. Selection of rhizosphere-competent

Pseudomonas strains as biocontrol agents in tropical soils. World J.

Microbiol. & Biotechnol., 12: 1-5.

AWONG, J.; BITTON, G. & CHAUDRY, G.R. 1990. Microcosms for

assessing survival of genetically modified microorganisms in aquatic

environment. Appl. Environ. Microbiol., 56: 977-983.

BAKER, R.M., SINGLETON, F.L. & HOOD, M.A. 1983. The effects

of

nutrient deprivation on Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbiol., 46:

930-940.
 162

BARCINA, I.; GONZÁLEZ, J.M.; IRRIBERI, J. & EGEA, L. 1989. Effect

of visible light on progressive dormancy of Escherichia coli cells

during the survival process in natural freshwater. Appl. Environ.

Microbiol., 55: 246-251.

BAZELYAN, V.L. & AYAZATULLIN, T.A. 1979. Kinetics of enzymatic

hydrolysis of DNA in seawater. Oceanology, 19: 30-33.

BEJ, A.K.; & MAHBUBANI, M.H. 1992. Applications of the

polymerase

chain reaction in environmental microbiology. PCR Methods Appl.,

1: 151-159

BRAUNS, L.A.; HUDSON, M.C. & OLIVER, J.D. 1991. Use of

polymerase chain reaction in detection of culturable and nonculturable

Vibrio vulnificus cells. Appl. Environ. Microbiol., 57: 2651-2655.

BRAYTON, P.; TAMPLIN, M.; HUQ, A. & COLWELL, R.R. 1987.

 163

Enumeration of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh waters by

fluorescent-antibody direct viable count. Appl. Environ. Microbiol., 53:

2862-2865.

BREITENBECK, G.A.; YANG, H. & DUNIGAN, E.P. 1988. Water-

facilitated dispersal of inoculant Bradyrhizobium japonicum in soils.

Biol. Fertil. Soils, 7: 58-62.

BRETTAR, I.; RAMOS-GONZALEZ, M.I.; RAMOS, J.L. & HÖFLE,

M.G. 1994. Fate of Pseudomonas putida after release into lake water

mesocosms: different survival mechanisms in response to

environmental conditions. Microb. Ecol., 27: 99-122.

BYRD, J.J. & COLWELL, R.R. 1990. Maintenance of plasmids pBR322

and pUC8 in nonculturable Escherichia coli in the marine environment.

Appl. Environ. Microbiol., 56: 2104-2107.

CALDWELL, B.A.; YEH, C.; GRIFFITHS, R.P.; MOYER, C.L. &

MORITA, R.Y. 1989. Plasmid expression and maintenance during

long-term starvation-survival of bacteria in well water. Appl. Environ.

Microbiol., 55: 1864-1867.

 164

CATLIN, B.W. 1956. Extracellular deoxyribonucleic acid of bacteria and a

deoxyribonuclease inhibitor from cells and from culture slime. Science,

124: 441-442.

CATLIN, W. 1960. Transformation of Neisseria meningitidis by

deoxyribonucleates from cells and from culture slime. J. Bacteriol., 79:

579-590.

CHAMIER, B.; LORENZ, M.G. & WAKERNAGEL, 1993. Natural

transformation of Acinetobacter calcoaceticus by plasmid DNA

adsorbed on sand and groundwater aquifer material. Appl. Environ.

Microbiol., 59: 1662-1667.

CLEGG, C.D.; VAN ELSAS, J.D.;ANDERSON, J.M. & LAPPIN-SCOTT,

H.M. 1995. Assessment of the role of a terrestrial isopod in the survival

of a genetically modified pseudomonad and its detection using the

polymerase chain rection. FEMS Microbiol. Ecol., 15: 161-168.

CLESCERI, L.S. & DAZE, M. 1975. Relations between microbial

heterotrophic activity,organics and deoxyribonucleic acid in

oligotrophic lake sediments. Verh. Int. Verein. Limnol., 19: 974-981.

 165

COLWELL, R.R.; BRAYTON, P.R.; GRIMES, D.J.; ROSZACK, D.B.;

HUQ, S.A. & PALMER, L.M. 1985. Viable but non-culturable Vibrio

cholerae and related pathogens in the environment: implications for

release of genetically engineered microorganisms. BIO/TECHNOL., 3:

817-820.

COMPEAU, G.; AL-ACHI, J.; PLATSOUKA, E. & LEVY, S.B. 1988.

Survival of rifampin-resistant mutants of Pseudomonas fluorescens and

Pseudomonas putida in soil systems. Appl. Environ. Microbiol., 54:

2432-2438.

CROZAT, Y.; CLEYET-MARCEL, J.C. & CORMAN, A. 1987. Use of

fluorescent antibody technique to characterize equilibrium suvival

concentration of Bradyrhizobium japonicum strains in soil. Biol. Fertil.

Soils, 4: 85-90.

CRUZ-CRUZ, N.E.; TORANZOS, G.A.; AHEARN, D.G. & HAZEN,

 166

T.C. 1988. In situ survival of plasmid-bearing and plasmidless

Pseudomonas aeruginosa in pristine tropical waters. Appl. Environ.

Microbiol., 54: 2574-2577.

DAVIS, B.D.; LUGER, S.M. & TAI, P.C. 1986. Role of ribosome

degradation in death of starved Escherichia coli cells. J. Bacteriol., 166:

439-445.

DAWES, E.A. 1985. Starvation, survival and energy reserves. IN: Bacteria

in their natural environments. Fletcher, M. & Floodgate, G. (eds.).

Academic Press Inc., San Diego, pp: 43-79.

DAWSON, M.P.; HUMPHREY, B.A. & MARSHALL, K.C. 1981.

Adhesion: a tactic in the survival strategy of a merine vibrio during

starvation. Curr. Microbiol., 6: 195-199.

DeFLAUN, M.F. & PAUL, J.H. 1989. Detection of exogenous gene

sequences in dissolved DNA from aquatic environments. Microb. Ecol.,

18: 21-28.

DORWARD, D.W.; GARON, C.F. & JUDD, R.C. 1989. Export and
 167

intercellular transfer of DNA via membrane blebs of Neisseria

gonorrhoeae. J. Bacteriol., 171: 2499-2505.

DORWARD, D.W. & GARON, C.F. 1990. DNA is packaged within

membrane-derived vesicles of gram-negative but not gram-positive

bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 56: 1960-1962.

D.O.U. seção 1, nº 5, 6 de janeiro de 1995, Atos do Poder Legislativo, Lei

nº 8.974, de 5 de janeiro de 1995.

D.O.U. seção 1, nº 244, 21 de dezembro de 1995, Atos do Poder Executivo,

Decreto nº 1.752 de 20 de dezembro de 1995.

DUPLER, M. & BAKER, R. 1984. Survival of Pseudomonas putida, a

biological agent, in soil. Phytopathol., 74: 195-200.

DUTTON, R.J.; BITTON, G. & KOOPMAN, 1983. Malachite green-INT

(MINT) method for determining active bacteria in sewage. Appl.

Environ. Microbiol., 46: 1263-1267.

 168

DWYER, D.F.; ROJO, F. & TIMMIS, K.N. 1988. Bacteria with new

pathways for the degradation of pollutants and their fate in model

ecosystems. IN: Risk assessment for deliberate releases. Klingmüler,

W. (ed.). Springer-Verlag, Berlim.

FIBI, M.R.; BRÖKER, M.; SCHULTZ, R.; JOHANNSEN, R. &

ZETTLMEISSEL. 1991. Inactivation of recombinant plasmid DNA

from human erythropoietin-producing mouse cell line grown on a large

scale. Appl. Microbiol. Biotechnol., 35: 622-630.

FISH, J.T. & PETTIBONE, G.W. 1995. Influence of freshwater

sediment

on the survival of Escherichia coli e Salmonella sp. as measured by

three methods of enumeration. Lett. Appl. Microbiol., 20: 277-281.

FLIERMANS, C.B. & SCHMIDT, E.L. 1975. Autoradiography and

immunofluorescence combined for autoecological study of single cell

activity with Nitrobacter as a model system. Appl. Environ. Microbiol.,

30: 676-684.

FREDRICKSON, J.K.; BENTJEN, S.A.; BOLTON, H.; LI, S.W. & VAN
 169

VORIS, P. 1989. Fate of Tn5 mutants of root growth-inhibiting

Pseudomonas sp. in intact soil core microcosms. Can. J. Microbiol., 35:

867.

FRISCHER, M.E.; THURMOND, J.M. & PAUL, J.H. 1990. Natural

plasmid transformation in a high-frequency-of-transformation marine

Vibrio strain. Appl. Environ. Microbiol., 56: 3439-3444.

GIVSKOV, M.; EBERL, L.; MØLLER, S.; POULSEN, L.K. & MOLIN, S.

1994. Responses to nutrient starvation in Pseudomonas putida KT2442:

Analysis of general cross-protection, cell shape, and macromolecular

content. J. Bacteriol., 176: 7-14.

GONZÁLEZ, J.M.; IRIBERRI, J.; EGEA, L. & BARCINA, I. 1992.

Characterization of culturability, protistan grazing, and death of enteric

bacteria in aquatic ecosystems. Appl. Environ. Microbiol. 58: 998-

1004.

GOTTSCHAL, J.C. 1992. Substrate capturing and growth in various

 170

ecosystems. J. Appl. Bacteriol., 73: 39-48.

GRIMES, D.J. & COLWELL, R.R. 1986. Viability and virulence of

Escherichia coli suspended by membrane chamber in semitropical

ocean water. FEMS Microbiol. Lett. 34: 161-165.

GUELIN, A.M.; MISHUSTINA, I.E.; ANDREEV, L.V..; BOBYK, M.A.

& LAMBINA, V.A. 1979. Some problems of the ecology and

taxonomy of marine microvibrios. Biol. Bull. Acad. Sci. USSR, 5: 336-

340.

GUIMARÃES, V.F; ARAÚJO, M.A.V.; MENDONÇA-HAGLER, L.C.S.

& HAGLER, A.N. 1993. Pseudomonas aeruginosa and other microbial

indicators of pollution in fresh and marine waters of Rio de Janeiro,

Brazil. Environ. Toxicol. Wat. Qual., 8: 313-322.

HARVEY, R.W. 1991. Parameters involved in modeling movement of

bacteria in groundwater. IN: Modeling Environmental Fate of

Microorganisms. Chrishton, J.H. (ed.). American Society for

Microbiology, Washington DC, pp. 89-110.

 171

HATTORI, T. & HATTORI, R. 1975. The physical environment in

soil

microbiology: An attempt to extend principles of microbiology to soil

microorganisms. CRC Crit. Rev. Microbiol., 4: 423-461.

HEKMAN, W.E.; HEIJNEN, C.E.; TREVORS, J.T. & VAN ELSAS, J.D.

1994. Water flow induced transport of Pseudomonas fluorescens cells

through soil columns as affected by inoculant treatment. FEMS Microb.

Ecol., 13: 313-324.

HEKMAN, W.E.; HEIJNEN, C.E.; BURGERS, S.L.G.E.; VAN VEEN,

J.A. & VAN ELSAS, J.D. 1995. Transport of bacterial inoculants

through intact cores of two different soils as affected by water

percolation and the presence of wheat plants. FEMS Microb. Ecol., 16:

143-158.

HENGGE-ARONIS, R. 1993. The role of rpoS in early stationary phase

 172

gene regulation in Escherichia coli K12. IN: Starvation in Bacteria.

Kjelleberg, S. (ed.), Plenum Press, New York and London, pp: 171-

200.

HISSET, R. & GRAY, T.R.G. 1976. Microsites and time changes in soil

microbiology. IN: The role of terrestrial and aquatic microorganisms

in decomposition processes. Anderson, J.M. & MacFadyen, A. (eds.).

Oxford University Press, London, pp. 23-39.

HÖFLE, M.G. 1992. Bacterioplankton community structure and

dynamics

after large scale release of nonindigenous bacteria as revealed by low-

molecular-weight-RNA analysis. Appl. Environ. Microbiol., 58: 3387-

3394.

HOLMQUIST, L. & KJELLEBERG, S. 1993. The carbon

starvation

stimulon in the marine Vibrio sp. S14 (CCUG 15956) includes three

periplasmic space protein responders. J. Gen. Microbiol., 139: 209-215.

 173

HOPE, H.G. 1976. Determination and properties of actively

metabolizing

heterotrophic bacteria in the sea, investigated by means of micro

autoradiography. Mar. Biol., 36: 291-302.

HOPE, H.G. 1978. Relations between active bacteria and

heterotrophic

potencial in the sea. Neth. J. Sea Res., 12: 78-98.

IPPEN-IHLER, K. 1989. Bacterial conjugation. IN: Gene transfer in the

environment. Levy, S.B. & Miller, R.V. (eds). Mc Graw-Hill, New

York, pp: 33-72.

IRRIBERI, J., UNANUE, M.; BARCINA, I. & EGEA, L. 1987. Seasonal

variation in population density and heterotrophic activity of attached

and free-living bacteria in coastal waters. Appl. Environ. Microbiol.,

53: 2308-2314.

JAIN, R.K. & SAYLER, G.S. 1987. Problems and potencial for in situ
 174

treatment of environmental pollutants by engineered microorganisms.

Microbiol. Sci., 4: 59-63.

JAIN, R.K.; BURLAGE, R.S. & SAYLER, G.S. 1988. Methods for

detecting recombinant DNA in the environment. CRC Crit. Rev.

Biotechnol: 8: 33-84.

JEFFREY, W.H.; PAUL, J.H & STEWART, G.J. 1990. Natural

transformation of a marine Vibrio species by plasmid DNA. Microb.

Ecol., 19: 259-268.

JENKINS, D.E.; SCHULTZ, J.E. & MATIN, A. 1988. Starvation-induced

cross-protection against heat or H2O2 challenge in Escherichia coli. J.

Bacteriol., 170: 3910-3914.

JENKINS, D.E.; CHAISSON, S.A. & MATIN, A. 1990. Starvation-

induced cross-protection against osmotic challenge in Escherichia coli.

J. Bacteriol., 172: 2779-2781.

JONES, R.D. & MORITA, R.Y. 1985. Survival of a marine ammonium

 175

oxidizer under energy source deprivation. Mar. Ecol. Prog. Ser., 26:

175-179.

JOUPER-JAAN, Å; GOODMAN, A.E. & KJELLEBERG, S. 1992.

Bacteria starved for prolonged periods develop increased protection

against lethal temperatures. FEMS Microbiol. Ecol., 101: 229-236.

JUNI, E. & HEYM, G.A. 1980. Transformation assay for identification of

psychrotrophic achromobacters. Appl. Environ. Microbiol., 40: 1106-

1114.

JÜRGENS, K. & GUDE, H. 1990. Incorporation and release of

phosphorus

by planctonic bacteria and phagotrophic flagellates. Mar. Ecol. Prog.

Ser., 59: 271-284.

KARL, D. & BAILIFF, M.D. 1989. The measurement and distribution of

dissolved nucleic acids in aquatic environments. Limnol. Oceanogr.,

34: 543-558.
 176

KEELER, K.H. 1988. Can we guarantee the safety of genetically

engineered

organisms in the environment?. CRC Crit. Rev. Biotechnol: 8: 85-97.

KJELLEBERG, S.; HERMANSSON, M.; MÅRDÉN, P. & JONES, G.W.

1987. The transient phase between growth and non-growth of

heterotrophic bacteria, with emphasis on the marine environment.

Annu. Rev. Microbiol., 41: 25-49.

KENNEDY, S.F.; COLWELL, R.R. & CHAPMAN, G.B. 1970.

Ultraestructure of a psychrophilic marine vibrio. Can. J. Microbiol., 16:

1027-1032.

KOCH, A.L. 1959. Death of bacteria growing in culture. J. Bacteriol., 77:

623-651.

KOGURE, K.; SIMIDU, U. & TAGA, N. 1979. A tentative direct

microscopic method for counting living marine bacteria. Can. J.

Microbiol., 25: 415-420.

 177

KOKJOHN, T.A. 1989. Transduction: mechanism and potencial for gene

transfer in the environment. IN: Gene transfer in the environment.

Levy, S.B. & Miller, R.V. (eds). Mc Graw-Hill, New York, pp: 73-97.

KRAGELUND, L. & NYBROE, O. 1994. Culturability and expression of

outer membrane proteins during carbon, nitrogen, or phosphorus

starvation of Pseudomonas fluorescens DF57 and Pseudomonas putida

DF14. Appl. Environ. Microbiol., 60: 2944-2948

KURATH, G. & MORITA, R.Y. 1983. Starvation-survival physiological

studies of a marine Pseudomonas sp. Appl. Environ. Microbiol., 45:

1206-1211.

LEFF, L.G.; MCARTHUR, J.V. & SHIMKETS, L.J. 1992. Information

spiraling: movement of bacteria and their genes in streams. Microb.

Ecol., 24: 11-24.

LEUNG, K.; TREVORS, J.T. & LEE, H. 1995. Survival of and lacZ

expression in recombinant Pseudomonas strains introduced into river

water microcosms. Can. J. Microbiol., 41: 461-469.

 178

LEVIN, S.A. & HARWELL, M.A. 1986. Potencial ecological

consequences of genetically engineered organisms. Environ. Manage,

10: 495-513.

LEVIN, M. 1994. Microbial Pesticides: safety considerations. IN:

Genetically Modified Organisms: A Guide to Biosafety. Tzotzos, G.T.

(ed.), pp: 93-109.

LIANG, L.N.; SINCLAIR, J.L.; MALLORY, L.M. & ALEXANDER, M.

1982. Fate in model ecosystems of microbial species of potencial use in

genetic engineering. Appl. Environ. Microbiol., 44: 708-714.

LORENZ, M.G.; AARDEMA, B.W. & WACKERNAGEL, W. 1988.

Highly efficient genetic transformation of Bacillus subtilis attached to

sand grains. J. Gen. Microbiol., 134: 107-112.

LORENZ, M.G.; GERJETS, D. & WACKERNAGEL, W. 1991. Release of

transforming plasmid and chromosomal DNA from two cultured soil

bacteria. Arch. Microbiol., 156: 319-326.

 179

LORENZ, M.G. & WACKERNAGEL, W. 1990. Natural genetic

transformation of Pseudomonas stutzeri by sand-adsorbed DNA. Arch.

Microbiol., 154: 380-385.

LORENZ, M.G. & WACKERNAGEL, W. 1991. High frequency of natural

genetic transformation of Pseudomonas stutzeri in soil extract

supplemented with a carbon/energy and phosphorus source. Appl.

Environ. Microbiol., 57: 1246-1251.

LORENZ, M.G. & WACKERNAGEL, W. 1994. Bacterial gene transfer by

natural genetic transformation in the environment. Microbiol. Rev., 58:

563-602.

LUGTENBERG, B. & VAN ALPEN, L. 1983. Molecular architecture and

functioning of the outer membrane of Esherichia coli and other gram-

negative bacteria. Biochim. Biophys. Acta, 737: 51-115.

MADSEN, E.L. & ALEXANDER, M. 1982. Transport of Rhizobium and

Pseudomonas through soil. Soil Sci. Soc. Am. J., 46: 557-567.
 180

MAEDA, M. & TAGA, N. 1973. Deoxyribonuclease activity in seawater

and sediment. Mar. Biol., 20: 58-63.

MAEDA, M. & TAGA, N. 1974. Ocurrence and distribution of

deoxyribonucleic acid-hydrolysing bacteria in seawater. J. Exp. Mar.

Biol. Ecol., 14: 157-169.

MATIN, A. 1991. The molecular basis of carbon-starvation-induced

general resistance in Escherichia coli. Mol. Microbiol., 5: 3-10.

McCLURE, N.C.; WEIGHTMAN, A.J. & FRY, J.C. 1989. Survival of

Pseudomonas putida UCW1 containing cloned catabolic genes in a

model activated sludge unit. Appl. Environ. Microbiol., 55: 2627-2634.

McFETERS, G.A. & TERZIEVA, S.I. 1991. Survival of Escherichia coli e

Yersinia enterocolitica in stream water: comparison of field and

laboratory exposure. Microb. Ecol., 22: 65-74.

MEYER-REIL, L. 1978. Autoradiography and epifluorescence

microscopy
 181

combined for the determination of number and spectrum of actively

metabolizing bacteria in natural waters. Appl. Environ. Microbiol., 36:

506-512.

MORGAN, J.A.W.; RHODES, G. & PICKUP, R.W. 1993. Survival of

nonculturable Aeromonas salmonicida in lake water. Appl. Environ.

Microbiol., 59: 874-880.

MORIARTY, D.J.W. & BELL, R.T. 1993. Bacterial growth and starvation

in aquatic environments. IN: Starvation in Bacteria. Kjelleberg, S.

(ed.), Plenum Press, New York and London, pp: 25-54.

MORITA, R.Y. 1988. Bioavailability of energy and its relationships to

growth and starvation survival in nature. Can. J. Microbiol., 24: 1460-

1467.

MORITA, R.Y. 1993. Bioavailability of energy and the starvation state. IN:

Starvation in Bacteria. Kjelleberg, S. (ed.), Plenum Press, New York

and London, pp: 1-24.

MORRISON, D.A. & GUILD, W.R. 1972. Transformation and

 182

deoxyribonucleic acid size: extent of degradation on entry varies with

size of donor. J. Bacteriol., 112: 1157-1168.

MOYER, C.L. & MORITA, R.Y. 1989. Effect of growth rate and

starvation-survival on the viability and stability of a psychrophilic

marine bacterium. Appl. Environ. Microbiol., 55: 1122-1127.

MUNRO, A.L. & BROCK, T.D. 1968. Distinction between bacterial and

algal utilization of soluble substances in the sea. J. Gen. Microbiol., 51:

35-42.

NOVITSKY, J.A. & MORITA, R.Y. 1977. Survival of a psychrophilic

marine vibrio under long-term nutrient starvation. Appl. Environ.

Microbiol., 33: 635-641.

NOVITSKY, J.A. & MORITA, R.Y. 1978. Starvation induced

barotolerance as a survival mechanism of a psychrophilic marine vibrio

in the waters of the Antarctic Convergence. Mar. Biol., 49: 7-10.

NOVITSKY, J.A. 1986. Degradation of dead microbial biomass in a

 183

marine sediment. Appl. Environ. Microbiol., 52: 504-509.

NYSTRÖN, T. & KJELLEBERG, S. 1989. Role of protein synthesis in the

cell division and starvation induced resistance to autolysis of a marine

vibrio during initial phase of starvation. J. Gen. Microbiol., 135: 1599-

1606.

NYSTRÖN, T.; OLSON, R.M. & KJELLEBERG, S. 1992. Survival, stress

resistance, and alterations in protein expression in the marine Vibrio sp.

strain S14 during starvation for different individual nutrients. Appl.

Environ. Microbiol., 58: 55-65.

NYSTRÖN, T. 1993. Systems approach to the physiology of the

starved

cell. IN: Starvation in Bacteria. Kjelleberg, S. (ed.), Plenum Press, New

York and London, pp:129-150.

OLIVER, J.D. 1993. Formation of viable but nonculturable cells. IN:

Starvation in Bacteria. Kjelleberg, S. (ed.), Plenum Press, New York

and London, pp: 239-272.

ÖSTLING, J.; HOLMQUIST, L.; FLÄRDH, K.; SVENBLAD, B.

 184

JOUPER-JAAN. Å. & KJELLEBERG, S. 1993. Starvation and

recovery of Vibrio. IN: Starvation in Bacteria. Kjelleberg, S. (ed.),

Plenum Press, New York and London, pp: 103-128.

ORVOS, D.R.; LACY, G.H.; CAIRNS Jr, J. 1990. Genetically engineered

Erwinia carotovora: survival, intraespecific competition and effects

upon selected bacterial genera. Appl. Environ. Microbiol., 56: 1689-

1694.

PASKO-KOLVA, C.; SHAHAMAT, M. YAMAMOTO, H.; SAWYER, T.

VIVES-REGO, J. & COLWELL, R.R. 1991. Survival of Legionella

pneumophila in the aquatic environment. Microbiol. Ecol., 22: 75-83.

PAUL, J.H.; JEFFREY, W.H. & DeFLAUN, M.F. 1987. Dynamics of

extracellular DNA in the marine environment. Appl. Environ.

Microbiol., 53: 170-179.

PAUL, J.H.; DeFLAUN, M.F.; JEFFREY, W.H. & DAVID, A.W. 1988.
 185

Seasonal and diel variability in dissolved DNA and in microbial

biomass and activity in a subtropical estuary. Appl. Environ.

Microbiol., 54: 718-727.

PAUL, J.H. & DAVID, A.W. 1989. Production of extracellular

nucleic

acids by genetically altered bacteria in aquatic-environment

microcosms. Appl. Environ. Microbiol., 55: 1865-1869.

PAUL, J.H.; JEFFREY, W.H.; DAVID, A.W.; DEFLAUN, M.F. &

CAZARES, L.H. 1989. Turnover of extracellular DNA in eutrophic and

oligotrophic freshwater environments of southwest Florida. Appl.

Environ. Microbiol., 55: 1823-1828.

PAUL, J.H.; FRISCHER, M.E. & THURMOND, J.M. 1991. Gene transfer

in marine water column and sediment microcosms by natural plasmid

transformation. Appl. Environ. Microbiol., 57: 1509-1515.

PAUL, J.H.; THURMOND, J.M.; FRISCHER, M.E. & CANNON, J.P.

1992. Intergeneric natural plasmid transformation between E. coli and a

marine Vibrio species. Mol. Ecol., 1: 37-46.

 186

PEELE, E.R. & COLWELL, R.R. 1981. Application of a direct

microscopic

method for enumeration of substrate-responsive marine bacteria. Can. J.

Microbiol., 27: 1071-1075.

PEER WHITE PAPER. 1995. Genetic Genie. The premature

comercial

release of genetically engineered bacteria. Public Employees for

Environmental Responsability, Washington, D.C., pp: 53.

PHILLIPS, S.J.; DALGARN, D.S. & YOUNG, S.K. 1989. Recombinant

DNA in wastewater: pBR322 degradation kinetics. J. Water Pollut.

Control Fed., 61: 1588-1595.

PIPKE, R.; WAGNER-DÖBLER, I.; TIMMIS, K.N. & DWYER, D.F.

1992. Survival and function of a genetically engineered pseudomonad

in aquatic sediment microcosm. Appl. Environ. Microbiol., 58: 1259-

1265.

POINDEXTER, J.S. 1981 Oligotrophy. Feast and famine existence. Adv.

Microb. Ecol., 5: 63-89.

 187

POSTMA, J.; WALTER, S. & VAN VEEN, J.A. 1989. Influence of initial

soil moisture contents on the distribution and population dynamics of

introduced Rhizobium leguminosarum biovar trifolii. Soil. Biol.

Biochem., 21: 437-442.

REEVE, C.A.; BROCKMAN, A.T. & MATIN, A. 1984. Role of protein

degradation in the survival of carbon starved in Escherichia coli and

Salmonella typhimurium. J. Bacteriol., 157: 758-763.

ROCHELLE, P.A.; DAY, M.J. & FRY, J.C. 1988. Occurrence, transfer,

and mobilization on epilithic strains of Acinetobacter of mercury-

resistance plasmids capable of transformation. J. Gen. Microbiol., 134:

2933-2941.

ROMANOWSKI, G.; LORENZ, M.G . & WAKERNAGEL, W. 1993.

Plasmid DNA in a groundwater aquifer microcosm - adsorption,

DNAase resistance and natural genetic transformation of Bacillus

subtilis. Mol. Ecol., 2: 171-181.

 188

ROSZAK, D.B.; GRIMES, D.J. & COLWELL, R.R. 1984. Viable but non-

recoverable stage of Salmonella enteritidis in aquatic systems. Can. J.

Microbiol., 30: 334-338.

ROSZAK, D.B. & COLWELL, R.R. 1987. Survival strategies of bacteria

in

the natural environment. Microbiol. Rev., 51: 365-379.

SAIKI, R.; GELFAND, D.H.; STOFFEL, S.; SCHARF, S.J.; HIGUCHI,

R.; HORN, G.T.; MULLINS, K.B. & ERLICH, H.A. 1988. Primer-

directed enzymatic amplification with a thermostable DNA polymerase.

Science, 239: 487.

SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F. & MANIATIS, R. 1989. Molecular

Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory

Press, Cold Spring Harbor, New York.

SEDAR, A.W. & BURDE, R.M. 1965. The demonstration of the succinic
 189

dehydrogenase system in Bacillus subtilis using tetranitroblue

tetrazolium combined with techniques of electron microscopy. J. Cell

Biol., 27: 53-66.

SINHA, R.P. & IYER, V.N. 1971. Competence for genetic transformation

and release of DNA from Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Acta,

232: 61-71.

SMILES, D.E. 1988. Aspects of the physical environment of

soil

organisms. Biol. Fertil. Soils, 6: 204-215.

SMITH, H.O.; DANNER, D.B. & DEICH, R.A. 1981. Genetic

transformation. Annu. Rev. Biochem., 50: 41-68.

SMITH, M.S.; THOMAS, G.W.; WHITE, R.E. & RITONGA, D. 1985.

Transport of Escherichia coli through intact and disturbed soil columns.

J. Environ. Qual., 14: 87-91.

SOMMERVILLE, C.C.; KNIGHT, I.T.; STRAUBE, W.L. &

COLWELL,
 190

R.R. 1989. Simple, rapid method for direct isolation of nucleic acids

from aquatic environments. Appl. Environ. Microbiol., 55: 548-554.

SPECTOR, M.P.; PARK, Y.K.; TIRGARI, S. ; GONZALEZ, T. &

FOSTER, J.W. 1988. Identification and characterization of starvation-

regulated genetic loci in Salmonella typhimurium by using Mu d-

directed lacZ operon fusions. J. Bacteriol., 170: 345-351.

STEFFAN, R.J. & ATLAS, R.M. 1988. DNA amplification to enhance

detection of genetically engineered bacteria in environmental samples.

Appl. Environ. Microbiol., 54: 2185.

STEFFAN, R.J. & ATLAS, R.M. 1992. Polymerase chain reaction:

Applications in environmental microbiology. Annu. Rev. Microbiol.,

45: 137-161.

STEWART, G.J. & CARLSON, C.A. 1986. The biology of natural

transformation. Annu. Rev. Microbiol., 40: 211-235.

 191

STEWART, G.J.; & SINIGALLIANO, C.D. 1990. Detection of horizontal

gene transfer by natural transformation in native and introduced species

of bacteria in marine and synthetic sediments. Appl. Environ.

Microbiol., 56: 1818-1824.

STEWART, G.J.; SINIGALLIANO, C.D. & GARKO, K.A. 1991. Binding

of exogenous DNA to marine sediments and the effect of

DNA/sediment binding on natural transformation of Pseudomonas

stutzeri strain ZoBell in sediment columns. FEMS Microbiol. Ecol., 85:

1-8.

STOZKY, G. & BABICH, H. 1986. Survival of, and genetic transfer

by,

genetically engineered bacteria in natural environments. Adv. Appl.

Microbiol., 31: 93-138.

TABOR, P.S. & NEIHOF, R.A. 1984. Direct determination of activities for

microorganisms of Chesapeake Bay populations. Appl. Environ.

Microbiol., 48: 1012-1019.

 192

TAKAHASHI, I. & GIBBONS, N.E. 1957. Effect of salt concentration on

the extracellular nucleic acids of Micrococcus halodenitrificans. Can. J.

Microbiol., 3: 687-694.

THOMPSOM, I.P.; YOUNG, C.S.; COOK, K.A.; LETHBRIDGE, G. &

BURNS, R.G. 1990 . Survival of two ecologically distinct bacteria

(Flavobacterium and Arthrobacter) in umplanted and rhizosphere soils.

Soil Biol. Biochem., 22: 1029-1037.

TREVORS, J.T.; VAN ELSAS, J.D.; STARODOUB, M.E. & VAN

OVERBEEK, L.S. 1989. Survival of and plasmid stability in

Pseudomonas and Klebsiella spp. introduced into agricultural drainage

water. Can. J. Microbiol., 35: 675-680.

TREVORS, J.T.; VAN ELSAS, J.D.; VAN OVERBEEK, L.S. &

STARODOUB, M.E. 1990a. Transport of a genetically engineered

Pseudomonas fluorescens strain through a soil microcosm. Appl.

Environ. Microbiol., 56: 401-408.

TREVORS, J.T.; VAN ELSAS, J.D.; STARODOUB, M.E. & VAN

OVERBEEK, L.S. 1990b. Pseudomonas fluorescens survival and

plasmid RP4 transfer in agricultural water. Wat. Res., 24: 751-755.

 193

VALENTINE, R.C. & BRADFIELD, J.R.G. 1954. The urea method for

bacterial viability counts with the electron microscope and its relation

to other viability counting methods. J. Gen. Microbiol., 11: 349-357

VAN ELSAS, J.D.; DIJKSTRA, A.F.; GOVAERT, J.M. & VAN VEEN,

J.A. 1986. Survival of Pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis

introduced into two soils of different texture in field microplots. FEMS

Microb. Ecol., 38: 151- 160.

VAN ELSAS, J.D.; HEIJNEN, C.E. & VAN VEEN, J.A. 1991a. The fate

of introduced genetically engineered microorganisms (GEMs) in soil, in

microcosms, and the field: impact of soil textural aspects. IN:

Biological monitoring of genetically engineered plants and microbes.

MacKenzie, D.R. & Henry, S.C. (eds.). Agricult. Res. Inst., Maryland,

pp: 67-79.

VAN ELSAS, J.D.; HEKMAN, W.; VAN OVERBEEK, L.S. & SMIT, E.
 194

1991b. Problems and perspectives of the application of genetically

engineered microorganisms to soil. Trends in Soil Science, 1: 373-391.

VAN ELSAS, J.D. & TREVORS, J.T. 1990. Plasmid transfer to indigenous

bacteria in soil and rhizosphere: problems and perspectives. IN:

Bacterial Genetics in Natural Environments. Fry, J. & Day, M.J. (eds).

Chapman and Hall, London.

VAN ELSAS, J.D. & TREVORS, J.T. 1991. Environmental risks and fate

of genetically engineered microorganisms in soil. J. Environ. Sci.

Health, A26: 981-1001.

VAN ELSAS, J.D.; TREVORS, J.T. & VAN OVERBEEK, L.S. 1991c.

Influence of soil properties on the vertical movement of genetically-

marked Pseudomonas fluorescens through large soil microcosms. Biol.

Fertil. Soils, 10: 249-255.

VAN ELSAS, J.D.; VAN OVERBEEK, L.S.; FELDMANN, A.M.;

DULLEMANS, A.M. & DE LEEUW, O. 1991d. Survival of

genetically engineered Pseudomonas fluorescens in soil in competition

with the parent strain. FEMS Microb. Ecol., 85: 53-64.

 195

VAN ELSAS, J.D. & VAN OVERBEEK, L.S. 1993. Bacterial responses to

soil stimuli. IN: Starvation in Bacteria. Kjelleberg, S. (ed.), Plenum

Press, New York and London, pp: 55- 80.

VAN OVERBEEK, L.S.; VAN ELSAS, J.D.; TREVORS, J.T. &

STARODOUB, M.E. 1990. Long-term survival of and plasmid stability

in Pseudomonas and Klebsiella species and appearance of

nonculturable cells in agriculture drainage water. Microb. Ecol., 19:

239-249.

VAN OVERBEEK, L.S.; EBERL, L.; GIVSKOV, M.; MOLIN, S. & VAN

ELSAS, J.D. 1995. Survival of, and induced stress resistance in,

carbon-starved Pseudomonas fluorescens cells residing in soil. Appl.

Eviron. Microbiol., 61: 4202-4208.

WAGNER-DÖBLER, I.; PIPKE, R.; TIMMIS, K.N. & DWYER, D.F.

 196

1992. Evaluation of aquatic sediment microcosms and their use in

assessing possible effects of introduced microorganisms on ecosystem

parameters. Appl. Environ. Microbiol., 58: 1249-1258.

WEIBULL, C. 1953. Observations on the staining of Bacillus megaterium

with triphenyltetrazolium. J. Bacteriol., 66: 137-139.

WIMPENNY, J.W.T. 1988. Models and Microcosms. IN: Handbook of

Laboratory Model Systems for Microbial Ecosystems. CRC Press, Inc.

Boca Raton, Florida.

WINKLER, J.; TIMMIS, K.N. & SNYDER, R.A. 1995. Tracking the

response of Burkholderia cepacia G4 5223-PR1 in aquifer microcosms.

Appl. Environ. Microbiol., 61: 448-455.

WINSTANLEY, C.; MORGAN, J.A.W.; PICKUP, R.G. & SAUNDERS,

J.R. 1991. Use of a xylE marker gene to monitor survival of

recombinant Pseudomonas putida populations in lake water by culture

on nonselective media. Appl. Environ. Microbiol., 57: 1905-1913.

 197

WOLF, P.W. & OLIVER, J.D. 1992. Temperature effects on the viable but

nonculturable state of Vibrio vulnificus. FEMS Microbiol. Ecol., 101:

33-39.

XU, H.S.; ROBERTS, N.; SINGLETON, F.L.; ATWELL, R.W. GRIMES,

D.J. & COLWELL, R.R. 1982. Survival and viability of nonculturable

Escherichia coli e Vibrio cholerae in estuarine and marine

environment. Microb. Ecol., 8: 313- 323.

YATES, M.V. & YATES, S.R. 1991. Modeling microbial transport in the

subsurface: a mathematical discussion. IN: Modeling Environmental

Fate of Microorganisms. Chrishton, J.H. (ed.). American Society for

Microbiology, Washington DC, pp. 48-76.

ZIMMERMAN, R.; ITURRIAGA, R. & BECKER-BIRCK, J. 1978.

Simultaneous determination of the total number of aquatic bacteria and

the number thereof involved in respiration. Appl. Environ. Microbiol.,

36: 926-935.
198