1 MOTIVAŢIA ALEGERII TEMEI ŞI OBIECTIVELE CERCETĂRILOR PERSONALE

2
3 Etefonul ( Fig. II.1) a fost descoperit în 1965 şi a fost înregistrat pentru prima oară ca pesticid în
4 S.U.A. în 1973. Agenţia USA pentru protecţia mediului (EPA) a emis un standard de înregistrare
5 pentru etefon în septembrie 1988 (PB89-109427), care evalua toxicitatea, nivelul de reziduuri şi
6 date privind efectele asupra mediului.
7 Etefonul este în prezent, unul dintre cei mai utilizaţi regulatori de creştere pentru plante,
8 datorită spectrului larg de acţiune. În pomicultură şi în legumicultură, etefonul poate fi utilizat
9 pentru a grăbi inducerea florilor, maturizarea fructelor, colorarea şi abscisarea acestora etc.
10 De asemenea, etefonul este utilizat în tratamente la cereale, pentru a creşte rezistenţa
11 mecanică prin scurtarea şi întărirea paielor, la bumbac pentru a favoriza deschiderea uniformă a
12 inflorescenţelor, la maturare şi pentru a grăbi, spori, defolierea; la obţinerea cauciucului, etefonul
13 creşte randamentul (fluxul de latex) şi reduce consumul de coajă. În unele ţări, etefonul este
14 utilizat exhaustiv pentru a acceleramaturarea post-recoltare a bananelor.
15 În practică etefonul este formulat, în principal, sub formă de soluţii cu concentraţii
16 cuprinse între 20 şi 720 g/L şi este comercializat sub mai multe denumiri, care corespund unor
17 utilizări specifice. Produsul se aplică sub formă de spray-uri foliare, cu echipament de sol sau
18 aerian. Formule care au ca substanţă activă « ethephon » sunt înregistrate în peste 60 de ţări din
19 întreaga lume.
20 Mecanismul de acţiune se bazează pe faptul că este uşor absorbit de plante şi transformat
21 în etilena (principalul metabolit), care este un hormon natural al plantei.
22 Etefonul poate fi prezent, sub formă de reziduuri în produsele alimentare la care s-au
23 practicat tratamente, atât înainte de recoltare, cât şi după recoltarea produsului alimentar
24 incriminat. Chiar dacă etefonul este un compus cu toxicitate scăzută, fiind încadrat în Grupa a
25 IV-a de toxicitate, cu DL 50 peste 1000 mg/kg corp- Etichetă neagră, utilizarea neraţională poate
26 conduce la situaţii în care consumatorilor să li se ofere alimente nesigure.
27 Siguranţa alimenului nu poate deveni un fapt real decât dacă aceasta constituie o responsabilitate
28 a tuturor celor implicaţi în domeniul alimentar, de la profesionişti la consumatori.
29 Studiile efectuate de Autoritatea Europeană pentru Siguranţa Alimentară (EFSA) arată că
30 etefonul, regulator de creştere al plantelor, are un nivel scăzut de toxicitate şi nu va fi periculos
31 pentru sănătatea umană dacă este utilizat în conformitate cu bunele practici agricole. Cu toate
32 acestea, în cazul în care sunt utilizate în mod abuziv, culturile vor creşte excesiv de rapid, ducând
33 la maturarea produsului numai la suprafaţa a fructului, cu miezul rămânând crud, ceea ce va
34 afecta negativ gustul şi calitatea fructelor.
35
36 MOTIVAŢIA CERCETĂRII
37
38 Garantarea siguranţei alimentare este o problemă transfrontalieră, deoarece multe dintre
39 alimentele pe care le consumăm provin din alte ţări. Uniunea Europeană este o piaţă unică, iar
40 produsele, inclusiv cele alimentare, pot circula liber pe teritoriul său.
41 Prin organisme specializate (Autoritatea Europeană pentru Siguranţa Alimentară)
42 Uniunea Europeană stabileşte norme privind calitatea alimentelor, circuitul lor pe traseul
43 producător-consumator şi controlează permanent respectarea acestora, în scopul protejării şi
44 asigurării sănătăţii publice.
45 Calitatea materiilor prime, neprocesate, este crucială pentru siguranţa şi calitatea
46 produsului finit. De aceea, este nevoie de o abordare sistematică a controlului produselor
47 alimentare pe circuitul producător - consumator pentru a evita contaminarea lor şi pentru a
48 identifica posibilele riscuri. Siguranţa alimentului nu poate deveni un fapt real decât dacă aceasta
49 constituie o responsabilitate a tuturor celor implicaţi in domeniul alimentar, de la profesionişti la
50 consumatori.
51 Subiectul ales ca temă pentru realizarea tezei de doctorat este de mare actualitate, în
52 condiţiile în care etefonul, unul dintre cei mai utilizaţi regulatori de creştere pentru plante a fost
53 interzis în cultivarea tomatelor. Această măsură a fost o provocare pentru noi şi am dorit să
54 apreciem modul în care această prevedere legislativă a fost respectată. Determinarea reziduurilor
55 de etefon în tomate poate aprecia gradul de siguranţă al acestor produse alimentare, foarte
56 apreciate de toţi consumatorii.
57 Raportul prezentat la Reuniunea pentru fixarea nivelurilor maxime de pesticide în
58 alimente (JMPR) din 2016 (Woltherink et al., 2016) a concluzionat că „este puţin probabil ca,
59 ingestia pe termen lung a reziduurilor de etefon care rezultă din utilizările corecte, raţionale
60 actuale ale acestuia în agricultură să prezinte o preocupare pentru sănătatea publică”.
61 Un motiv în plus pentru alegerea temei a fost faptul că, fiind interzis, produsul cu care se
62 realizează tratamentele nu se achiziţionează din unităţi specializate, cu instrucţiuni de utilizare
63 clare şi cu atenţionarea privind riscurile utilizării incorecte.
64 Datele din literatura de specialitate erau limitate privitor la modificările histopatologice
65 care apar la animalele de laborator după administrarea etefonului. În plus, profitând de
66 experienţa anterioară privind cercetările referitoare la capacitatea seleniului de a proteja
67 organismul animal în intoxicaţiile cu metale grele, am considerat necesar şi util de a aborda şi
68 acest aspect al siguranţei alimentelor în care ar putea fi prezente reziduuri de etefon. Considerăm
69 că rezultatele acestor cercetări vor contribui la acumularea informaţiilor privind calitatea
70 alimentelor de origine vegetală în cultura cărora s-a apelat, din motive diferite, la utilizarea,
71 uneori ilicită, a regulatorilor de creştere.
72
73 OBIECTIVELE TEZEI DE DOCTORAT
74
75 Cercetările experimentale care au stat la baza realizării tezei de doctorat au urmărit:
76 adaptarea unei metode HPLC de determinare a etefonului din produse alimentare de natură
77 vegetală, prin stabilirea condiţiilor de aplicare a metodei (selectivitate, liniaritate, limită de
78 detecţie, limită de cuantificare, regăsire)
79 aplicarea metodei la determinarea etefonului din probe de produse alimentare de natură vegetală
80 (tomate şi căpşuni);
81 evaluarea remanenţei etefonului în probe (tomate şi căpşuni) îmbogăţite cu etefon, în condiţii de
82 conservare prin congelare, timp de 6 luni;
83 evaluarea modificărilor hematologice, biochimice şi histopatologice la şobolani, în intoxicaţia
84 subacută cu etefon (200 mg/kgc/zi);
85 studierea potenţialului protector al seleniului (administrat sub formă de selenit de sodiu) asupra
86 şobolanilor Wistar în intoxicaţia experimentală, pe cale orală cu etefon, prin evaluarea
87 modificărilor hematologice, biochimice şi histopatologice.
88
89 Capitolul III
90 DETERMINAREA ETEFONULUI DIN PRODUSE ALIMENTARE
91
 92 În mod tradiţional determinarea reziduurilor de etefon prezente în probe de origine vegetală s-a
93 efectuat prin metode gaz-cromatografice. Aceste analize sunt indirecte şi laborioase şi includ o
94 etapă de derivatizare înainte de injectarea probei în sistemul gaz cromatografic. Detecţia
95 reziduurilor de acid 2-cloretilfosfonic (etefon) în probe de tomate, cireşe şi mere s-a efectuat
96 indirect pe baza etenei rezultate din descompunerea moleculei de etefon, la valori ridicate ale
97 pH-ului.
98 Obiectivele cercetărilor incluse în acest capitol au urmărit:
99 adaptarea unei metode HPLC de determinare a etefonului din produse alimentare de natură
100 vegetală, prin stabilirea condiţiilor de aplicare a metodei (selectivitate, liniaritate, limită de
101 detecţie, limită de cuantificare, regăsire)
102 aplicarea metodei la determinarea etefonului din probe de produse alimentare de natură vegetală
103 (tomate şi căpşuni);
104 evaluarea remanenţei etefonului în probe (tomate şi căpşuni) îmbogăţite cu etefon, în condiţii de
105 conservare prin congelare, timp de 6 luni.
106 Analiza imaginilor cromatografice arată că nu au fost observate interferenţe ale picurilor fazei
107 mobile la timpul de retentie al etefonului (7,43minute). (Fig.III.2.). În fig.III.2. sunt prezentate
108 comparativ cromatograma fazei mobile (jos) şi cea a etefonului,la limita de cuantificare (sus).
109 Rezultatele obţinute la determinarea liniarităţii metodei în intervalul 0-35 µg/mL sunt inserate în
110 fig. III.7. şi în tabelul III.
111
112 Limita de detecţie (LD)
113
114 Limita de detecţie(LD) - cantitatea minimă de etefon care se poate pune în evidenţă, faţă de o
115 probă martor, cu o limită de încredere de 1%, s-a calculat prin relaţia:
116
3,3 xSD 1
117 LD= × (µg/mL) =0,027808 (µg/mL)
p 20
118
119 Limita de cuantificare (LC)
120
121 Limita de cuantificare - cantitatea minimă de etefon care se poate cuantifica cu certitudine, cu
122 precizia şi acurateţea acceptabile în condiţiile analitice stabilite s-a calculat prin multiplicarea cu
123 3 a limitei de detecţie (LD):
124 după formula:
125
10 xSD
126 LC = (µg/mL) = 0,083307(µg/mL)
p
127
128 Cerinţa ca limita de cuantificare (LC) să reprezinte multiplicarea de 3ori a limitei de detecţie
129 (LD) a fost respectată.
130 III. 3.1.4.3. Randament de recuperare
131
132 Randamentul de recuperare al etefonului a fost determinat pe două tipuri de probă:
133 căpşuni şi tomate ajunse la maturitate, tratate cu soluţie de etefon cu o concentraţie de
134 aproximativ 0,8g/L, prin pulverizare cu un pulverizator manual. La 2 zile de la tratament fructele
135 s-au recoltat şi s-a realizat o probă medie, prin omogenizare în blender.
136 Cotă parte din proba omogenizată a fost supusă extracţiei şi analizei HPLC pentru
137 determinarea etefonului. Aceleaşi cantităţi din proba proaspăt omogenizată au fost tratate cu
138 volume de soluţie standard de etefon corespunzătoare la concentraţia de 10, respectiv 20 µg
139 etefon/kg. Aceste probe îmbogăţite au fost utilizate pentru determinarea randamentului de
140 recuperare a etefonului din probe de tomate şi de căpşuni.
141 Din analiza acestor valori se constată pentru tomate, un procent de recuperare pentru etefon care
142 variază între 87,44% şi 100,65% pentru o limită de cuantificare a metodei de 0,083307(µg/mL).
143 Pentru probele de căpşuni regăsirea s-a situat în intervalul 70,13% - 101,77%.
144 Metoda HPLC studiată a fost aplicată la determinarea reziduurilor de etefon din probe de căpşuni
145 şi tomate.
146
147 III.3.1.5.Studiu privind stabilitatea etefonului în tomate şi în căpşuni, după recoltare
148
149 III. 3.1.5.1. Protocol
150
151 Tratamentele culturilor de tomate, respectiv de căpşuni cu regulatorii de creştere, care stimulează
152 coacerea (înroşirea fructelor) se programează în aşa fel încât, perioada de timp dintre recolare şi
153 consum să asigure descompunerea etefonului reţinut în produsul alimentar.
154 Nivelul concentraţiilor de etefon prezente în aliment trebuie să respecte limitele maxime de
155 reziduuri impuse de legislaţia sanitară.
156 În cercetările realizate am studiat nivelul reziduurilor de etefon în probe de tomate şi de căpşuni,
157 conservate prin congelare, timp de 6 luni. Culturile respective au fost tratate prin pulverizarea
158 (pompă manuală) unei soluţii de etefon (Flordimex) cu concentraţia de 200mg/L. La 2 zile după
159 tratament, probele au fost recoltate şi s-a realizat determinarea HPLC a etefonului.Cotă parte din
160 probele de tomate, respectiv de căpşuni au fost menţinute la congelator (-18ºC) timp de 6 luni.
161 După decongelare (în frigider,+4 ºC) s-a realizat determinarea HPLC a etefonului.
162
163 III.4. Concluzii
164
165 Cercetările incluse în acest capitol au prezentat rezultatele unui studiu analtic al etefonului.
166 Standardizarea metodei HPLC a etefonului, cu detecţie UV a condus la stabilirea condiţiilor de
167 cromatografice de aplicare:
168 Instrument: Thermo Finnigan Surveyor HPLC
169 Coloană: coloana cromatografică BDS HYPERSIL C18, 150 x 4.6 mm, dimensiunea particulelor
170 5 µm (Thermo Scientific, USA), Zorbax SB-C18 100x3.0 mm, 3.5 µm.Coloana cromatografică a
171 fost preîncălzită la o temperatură de 400C înainte începerii determinărilor analitice..
172 Faza mobilă:eluţia analitului s-a realizat în gradient, prin utilizarea ca fază mobilă a doi 2
173 solvenţi în proporţie de 85:15.
174
175 Solvent A: metanol absolut;
176 Solvent B: Soluţie de metanol 10%, în apă bidistilată; pH-ul 8,5 s-a realizat cu soluţie de acetat
177 de amoniu 10% în apă bidistilată.
178
179 Debit: 0,3mL/min,
180 Volum de injecţie: 15 µL.
181 Timp de retenţie: 7,35 minute
182 Timp de analiză / proba: 8 minute
183 Ecuaţia dreptei: y=9470∙x+47326
184 Limita de detecţie:0,027808 (µg/mL)
185 Limită de cuantificare a metodei: 0,083307 (µg/mL).
186 Curba de calibrare este liniară în intervalul 0-35µg/mL.
187
188 Metoda a fost aplicată la determinare etefonului din 36 probe de tomate şi 18 probe de căpşuni.
189 Procentul de recuperare pentru etefon din probe îmbogăţite a variat între 87,44% şi 100,65%
190 pentru o limită de cuantificare a metodei de 0,083307 (µg/mL). Pentru probele de căpşuni,
191 regăsirea s-a situat în intervalul 70,13% - 101,77%.
192 Valoarea medie a concentraţiilor etefonului în probele de tomate analizate a fost de 29,48 µg /kg
193 de produs.
194 Pentru probele de căpşuni, valoarea medie a fost de 13,03 µg /kg produs.
195 Determinarea experimentală a stabilităţiietefonului în probele conservate prin congelare,
196 comparativ cu rezultatele iniţiale a evidenţiat o reducere a nivelului regulatorului de creştere de
197 la o valoare medie de 15,15 µg/kg la 11,49 µg/kg; procentual, scăderea a fost de 24,16%. Pentru
198 probele de căpşuni, procentul de scădere a concentraţiei etefonului, în cele 6 luni de experiment a
199 fost de 63,47%.
200
201 Capitolul IV
202 EVALUAREA EXPERIMENTALĂ A TOXICITĂŢII ETEFONULUI ÎN INTOXICAŢIA
203 SUBACUTĂ LA ŞOBOLAN, PE BAZA UNOR PARAMETRI HEMATOLOGICI,
204 BIOCHIMICI ŞI HISTOPATOLOGICI
205
206 IV. 2. Obiectivele cercetării
207
208 Cercetările experimentale inserate în acest capitol îşi propun ca obiectiv: evaluarea modificărilor
209 hematologice, biochimice şi histopatologice la şobolani, în intoxicaţia subacută cu etefon (200
210 mg/kgc/zi);
211
212 IV. 3. Material şi metode
213
214 IV. 3.1. Protocol experimental
215
216 Ca reactiv biologic s-au utilizat şobolani masculi Wistar, achiziţionaţi de la Institutul Naţional de
217 Cercetare-Dezvoltare în Microbiologie şi Imunologie "Cantacuzino", Bucureşti, România
218 (CNIRDMI). Animalele au fost păstrate în cuşti colective, în condiţii de mediu relativ constante
219 (temperatură 18-22°C, ciclu lumină-întuneric 12 h /12 h), dietă standard pentru şobolani şi apă
220 ad libitum.
221 Şobolanii masculi, cu greutatea cuprinsă între 180-230 g, au fost constituiţi în 4 loturi de câte 6
222 animale cărora, după 12 ore de post, timp de 14 zile, li s-a administrat prin gavaj gastric:
223
224 Lot I (Control) – ser fiziologic = C;
225
226 Lot II – etefon, soluţie apoasă (200 mg/kgc/zi) = ETF
227
228 Toate animalele au fost cântărite din nou în a 15-a zi, după care au fost anesteziate cu amestec
229 ketamină-xilazină 1:1, v/v, administrată intraperitoneal (100 mg / kgc, soluţie injectabilă pentru
230 uz veterinar).
231 Probele de sânge pentru hemoleucograma completă au fost recoltate în vacutainere cu
232 anticoagulant (K2EDTA) prin puncţie cardiacă; pentru analiză s-a utilizat un analizor
233 hematologic Sysmex XT 1800 (Sysmex Corporation, SUA).
234 Probele de sânge pentru determinările biochimice au fost recoltate în vacutainere specifice
235 tipului de analiză care urma să fie realizată.
236 Ficatul integral recoltat a fost spălat rapid cu soluţie de ser fiziologic, adus la temperatura de 2-
237 3°C, şi după îndepărtarea excesului de soluţie de spălare a fost cântărit.
238 Fragmente din ficat, pe care s-a efectuat determinări pe omogenat, s-au menţinut la congelator, la
239 temperatura de -35ºC, până în momentul efectuării analizelor.
240 Fragmente din ficat, pe care s-a efectuat studiul histopatologic au fost menţinute timp de 2
241 săptămâni în formol tamponat, pentru fixare. Probele de ţesut hepatic fixat au fost prelucrate
242 conform tehnicii standard şi au fost încorporate în blocuri de parafină. Secţiunile de parafină au
243 fost colorate cu hematoxilină şi eozină (tehnica HE), apoi au fost analizate şi fotografiate
244 utilizând un microscop Olympus CX41 cu o cameră digitală integrată DP21 (Olympus
245 Corporation, Japonia).
246
247 IV. 3.2. Analiza statistică
248
249 Evaluarea statistică s-a efectuat folosindu-se valorile mediilor aritmetice obţinute
250 experimental±SD. Semnificaţia statistică s-a stabilit prin testele ANOVA, LSD şi testul t.
251 Obţinerea unor valori p < 0,05 a indicat faptul că rezultatele experimentului au avut semnificaţie
252 statistică.
253
254 IV.3.3.2. Evaluarea modificărilor parametrilor hematologici la şobolani
255
256 Probele de sânge pentru hemoleucograma completă au fost recoltate în vacutainere cu
257 anticoagulant (K2EDTA) prin puncţie cardiacă; pentru analiză s-a utilizat un analizor
258 hematologic Sysmex XT 1800 (Sysmex Corporation, SUA).
259 Rezultatele obţinute la examinarea hematologică a probelor de sânge recoltate de la cele 2 loturi
260 experimentale sunt consemnate în fig. IV.3. - IV.11.
261
262 IV. 3.3.3. Evaluarea modificărilor parametrilor biochimici la şobolani, în intoxicaţia subacută
263 cu etefon
264
265 După recoltare, probele de sânge destinate determinărilor biochimice au fost centrifugate pentru
266 15 minute, la 3000 rotaţii pe minut. Plasma obţinută a fost supusă imediat determinărilor
267 biochimice care s-au realizat prin metode standardizate folosind kituri RANDOX. Pentru
268 determinarea glutation peroxidazei (GPx), statusului antioxidant total (TAS) s-au utilizând kituri
269 RANDOX. Determinările biochimice pe omogenat de ficat s-au realizat prin metode
270 spectrofotometrice; malonildialdehida (MDA) s-a determinat prin metoda Meredino et al. (2003),
271 iar glutationul redus s-a determinat prin metoda spectrofotometrică Shaik și Mehvar ( 2006).
272 Evaluarea parametrilor de stres oxidativ consecutiv intoxicaţiei cu etefon s-a realizat, prin:
273 determinarea activităţii superoxid dismutazei (SOD), a glutation peroxidazei (GPx) şi a statusului
274 total antioxidant (TAS) în sânge; determinarea malondialdehidei (MDA) şi a glutationului redus
275 (GSH) în omogenate de ficat;
276 Determinările cantitative ale parametrilor biochimici vizaţi de experimentul realizat, s-au
277 efectuat pe analizorul semiautomat Randox (SOD, GPx, TAS), sau prin determinări
278 spectrofotometrice clasice (GSH şi MDA). Toate rezultatele prezentate reprezintă media a 3
279 determinări (fiecare parametru a fost determinat individual pe plasma recoltată de la 6 şobolani).
280 Analiza statistică a fost efectuat folosind o variantă a analizei ANOVA. Testul Tukey a fost
281 utilizat pentru comparaţii multiple (software Statistici Direct versiunea 2.6).
282 Markerii hepatici de stres oxidativ (SOD, CAT, GSHPx şi MDA) pun în evidenţă acţiunea
283 hepatotoxică a regulatorilor de creştere. Analiza statistică a valorilor mediei aritmetice pentru
284 activitatea enzimatică antioxidantă a evidenţiat o scădere semnificativă statistic a valorilor medii
285 activităţii enzimelor antioxidante la şobolanii trataţi cu etefon comparativ cele ale şobolanilor din
286 grupul de control (p < 0,001). Tratamentul cu etefon a indus o creştere semnificativă a
287 concentraţiei de MDA hepatic (p < 0,001) (Hussein et al., 2011).
288
289 IV. 3.3.4. Studiu histopatologic
290
291 Fragmente din ficat, pe care s-a efectuat studiul histopatologic au fost menţinute timp de 2
292 săptămâni în formol tamponat, pentru fixare. Probele de ţesut hepatic fixat, au fost prelucrate
293 conform tehnicii standard şi au fost încorporate în blocuri de parafină. Secţiunile de parafină au
294 fost colorate cu hematoxilină şi eozină (tehnica HE), apoi au fost analizate şi fotografiate
295 utilizând un microscop Olympus CX41 cu o cameră digitală integrată DP21 (Olympus
296 Corporation, Japonia
297 Ficatul animalelor din lotul CONTROL a prezentat o structură histoarhitectonică normală,
298 nefiind decelată nici o modificare morfologică.
299
300 Ficatul sobolanilor expusi la etefon a prezentat o serie de modificari variabile ca intensitate, în
301 functie de individ. La un sobolan au aparut mici zone de necroză în jurul spatiului portobiliar dar
302 și intralobular. Au fost surprinse venule ectaziate (Fig IV.24.a.). La un alt individ (Fig IV.24.b.)
303 se pot observa venulele ectaziate. Cordoanele Remak apar dispuse radiar de la venula
304 centrolobulară. Capilarele sinusoide apar ectaziate. Printre lobuli se pot observa aglomerari de
305 hepatocite, cu nuclei intens colorați, care au pierdut așezarea în cordoane.
306 La doi dintre şobolanii expusi la etefon au aparut zone mari de congestie și necroză
307 (fig.IV.25.a.b.). În aceste zone se pot observa hepatocite cu modificari nucleare specifice morții
308 celulare reprezentate de picnoza, cariorexa, carioliza. Hepatocitele au dimensiuni neuniforme la
309 fel și nucleii acestora. Venulele din spațiul portobiliar sunt ectaziate cu peretele hipertrofiat (fig.
310 25.a. b.). Au fost observate spații porobiliare cu infiltrații limfoide (fig. 26.a.). Apar și zone cu
311 hepatocite balonate a caror citoplasmă este colorată uniform. Capilarele sinusoide din aceste
312 zone sunt greu vizibile (fig.27 a.b.). Hepatocitele balonizate şi cu citoplasmă necolorată, cu
313 nucleul uşor colorat şi indistinct sau fără delimitare celulară clară au fost rar întâlnite.
314
315 Rezultatele examenelor histologice pentru probele de ficat luate în studiu au susţinut rezultate
316 biochimice menţionate mai sus.
317
318 S-au identificat zone de necroză tisulară uşoară, prezenţa infiltratelor celulare inflamatorii şi
319 apariţia numeroaselor celule apoptotice. Aceste celule apoptotice au fost de dimensiuni reduse,
320 cu nuclei piknotici. În hepatocite a apărut vacuolaţii, fiind identificate celule inflamatorii în
321 structura hepatocitelor. La nivelul hepatocitelor s-a constatat condensarea proteinelor în jurul
322 venei centrale şi a celulelor endoteliale din sinusuri. S-a produs apoptoza unor hepatocite cu
323 contracţia nucleelor şi condensarea heterocromatinei lor. Citoplasma a fost lipsită de organite
324 citoplasmatice (rarificare citoplasmatică). Unele celule apoptotice au prezentat mitocondrii
325 gonflate şi vacuolizări.
326
327 IV. 3. 4. Concluzii
328
329 Rezultatele cercetărilor incluse în acest capitol au evdenţiat acţiunea toxică moderată a etefonului
330 asupra organismului şobolanilor.
331
332 Categoriile de parametri urmărite prin experimentul realizat au fost :
333 -greutatea animalelor şi greutatea ficatului
334 -evaluarea modificărilor hematologice prin determinarea hemoleucogramei totale ;
335 -urmărirea integrităţii celulei hepatice prin determinarea enzimelor AST şi ALT;
336 -evaluarea funcţiei hepatice prin determinarea glicemiei şi fosfatazei alcaline;
337 -evaluarea intensităţii proceselor de peroxidare lipidică prin:
338 -determinarea SOD, GPx ŞI TAS în sânge, şi
339 -determinarea GSH şi MDA în omogenate de ficat
340 -evaluarea funcţiei renale prin determinarea ureei şi a creatininei
341 Rezultatatele obţinute la determinarea numărului de eritrocite arată că, la animalele tratate cu
342 etefon, media numărului de eritrocite este uşor mai scăzută (p > 0,05). Concentraţia de
343 hemoglobină în eritrocite şi hematocritul, parametri pe baza cărora se investighează calitatea
344 eritropoiezei, au evidenţiat o evoluţie asemănătoare celei observate la numărul de eritrocite.
345
346 În ceea ce priveşte numărul de trombocite, în cercetările noastre s-a constatat că, media valorilor
347 pentru lotul de animale tratat cu etefon a fost mai scăzută decât cea pentru grupul control (p >
348 0,05)
349 Capitolul V
350
351 EVALUAREA EXPERIMENTALĂ A POTENŢIALULUI PROTECTOR AL
352 SELENIULUI ÎN INTOXICAŢIA SUBACUTĂ CU ETEFON LA ŞOBOLANI, PE BAZA
353 UNOR PARAMETRI HEMATOLOGICI, BIOCHIMICI ŞI HISTOLOGICI
354
355 V. 2. Obiectivele cercetării
356
357 Prezentul capitol îşi propune ca obiective: studierea potenţialului protector al seleniului
358 (administrat sub formă de selenit de sodiu) asupra şobolanilor Wistar în intoxicaţia
359 experimentală, pe cale orală cu etefon, prin evaluarea modificărilor hematologice, biochimice şi
360 histopatologice.
361
362 V. 3. Material şi metode
363
364 Protocol experimental
365
366 Ca reactiv biologic s-au utilizat şobolani masculi Wistar, achiziţionaţi de la Institutul Naţional de
367 Cercetare-Dezvoltare în Microbiologie şi Imunologie "Cantacuzino", Bucureşti, România
368 (CNIRDMI). Animalele au fost păstrate în cuşti colective, în condiţii de mediu relativ constante
369 (temperatură 18-22° C, ciclu lumină-întuneric 12 h/12 h), dietă standard pentru şobolani şi apă
370 ad libitum.
371
372 Şobolanii, cu greutatea cuprinsă între 180-230g, au fost constituiţi în 4 loturi de câte 6 animale
373 cărora, timp de 14 zile, după 12 ore de post, li s-a administrat prin gavaj gastric:
374
375 Lot I (Control) – ser fiziologic = C;
376
377 Lot II – etefon, soluţie apoasă (200 mg/kgc/zi) = ETF
378
379 Lot III – etefon, soluţie apoasă (200 mg/kgc/zi) şi soluţie apoasă de selenit de sodiu (echivalent
380 cu 1mg Se/kgc/zi = ETF-SE
381
382 Lot IV – soluţie apoasă de selenit de sodiu (echivalent cu 1 mg Se/kgc/zi)= SE
383
384 Toate animalele au fost cântărite din nou în a 15-a zi, după care au fost anesteziate cu amestec
385 ketamină-xilazină 1:1, v/v, administrată intraperitoneal (100 mg/kgc, soluţie injectabilă pentru uz
386 veterinar).
387
388
389 V. 4. Rezultate
390
391 V. 4. 1. Greutatea animalelor şi greutatea ficatului acestora
392
393 Evoluţia în dinamică a greutăţii animalelor din loturile luate în studiu este prezentată în fig. V. 2.
394 Variaţia greutăţii ficatului animalelor luate în studiu este înserată în Fig V.3
395
396 Rezultatele obţinute la urmărirea greutăţii animalelor din lotul luat în studiu evidenţiază variaţii
397 semnificative între loturile tratate cu seleniu sau cu etefon, comparativ cu lotul martor. Creşteri
398 mai semnificative ale greutăţii medii a animalelor au avut loc în a doua săptămână de
399 experiment. Astfel, dacă pentru lotul martor, creşterea a fost de 4,26% şi pentru lotul tratat cu
400 seleniu s-a înregistrat o creştere de 6,59 %, la lotul tratat cu etefon, creşterea a fost de 37,83%.
401 Aceată creştere poate fi pusă pe seama etefonului, care iniţial, în primele zile de experiment
402 produce o scădere în greutate a animalelor tratate, dar în continuare determină o creştere în
403 greutatea animalelor supuse studiului (Raport JMPR, 2015).
404 Intervenţia seleniului în metabolismul etefonului poate fi explicată prin procentul de creştere în
405 greutate a animalelor din lotul tratat simultan cu cele două substanţe, care este de 30,47%.
406 Această observaţie este în concordanţă cu datele raportate de El-Demerdasch (2014) care a
407 observat tendinţa de scădere a greutăţii animalelor la administrarea de seleniu. În plus,
408 administrarea regulatorilor de creştere de tip organofosforic conduce, în prima etapă, la scăderea
409 greutăţii, urmând o creştere a acesteia în următoarele 2 săptămâni.
410 Aceleaşi variaţii au fost constatate şi pentru greutatea ficatului animalelor. Creşteri în greutate, în
411 cele 14 zile de experiment, s-au constatat la ficatul animalelor tratate cu etefon, respectiv cu
412 selenit de sodiu. Pentru lotul tratat cu asocierea celor două substanţe, greutatea medie a ficatului
413 este foarte apropiată de cea a martorului.
414 Aceste rezultate sunt în acord cu cele raportate de Jia et al. (2005), care au arătat că
415 administrarea de selenit de sodiu la şobolani în doze mai mici de 1 mg Se/kgc favorizează
416 creşterea în greutate a animalelor. La doze mai mari, este bine cunoscut faptul că întârzierea
417 creşterii este o caracteristică majoră a animalelor intoxicate cu seleniu. Inhibarea creşterii ar
418 putea fi cel mai bun indicator al efectelor toxice ale seleniului (Thorlacius-Ussing, 1990; Orskov
419 şi Flyvbjerg, 2000). Selenitul de sodiu în doze de 3-5 mg/kgc a inhibat semnificativ creşterea
420 şobolanilor masculi; administrarea seleniului sub formă de nano-Se în doză de 3 mg/kg corp a
421 condus la scăderi în greutate mai puţin severe, ceea ce sugerează agresivitatea mai mare a
422 seleniului administrat sub formă de selenit de sodiu. Rezultate asemănătoare s-au obţinut şi la
423 administrarea selenitului la şobolani femele.
424 Greutatea ficatului animalelor este diferită, cu cea mai mare valoare pentru lotul tratat cu selenit
425 de sodiu. Faptul că greutatea ficatului, pentru lotul tratat cu asocierea seleniu etefon revine la o
426 valoare foarte apropiată de cea a martorului sugerează interacţiuni majore între efectele celor
427 două substanţe administrate simultan. Richert (2002) a raportat o creştere în greutate a ficatului
428 şobolanilor trataţi cu etefon (gavaj gastric) la doze de 500 mg/kgc.
429
430 V. 4. 2. Evaluarea modificărilor parametrilor hematologici la şobolani
431
432 Probele de sânge pentru hemoleucograma completă au fost recoltate în vacutainere cu
433 anticoagulant (K2EDTA) prin puncţie cardiacă; pentru analiză s-a utilizat un analizor
434 hematologic Sysmex XT 1800 (Sysmex Corporation, SUA).
435
436 Rezultatele obţinute la examinarea hematologică a probelor de sânge recoltate de la cele 4 loturi
437 experimentale sunt consemnate în fig. V.4.-V.20.
438
439 V. 4.2.1. Numarul de eritrocite
440
441 În fig V.4.sunt inserate valorile medii ale numărului de eritrocite pentru loturile luate în studiu.
442
443 Concentraţia de hemoglobină (Fig. V.5.) şi hematocritul (Fig. V.6.) sunt parametri pe baza cărora
444 se investighează calitatea eritropoiezei.
445
446 Determinarea indicilor eritrocitari: volumul eritrocitar mediu (VEM, MCV) (Fig.V.7.;V.8.),
447 concentraţia hemoglobinei eritrocitare (HEM, MCH) (Fig. V.9.) şi lărgimea distribuţiei
448 eritrocitare (RDW) (Fig. V. 10.) completează, în continuare, evaluarea calitativă a populaţiei
449 eritrocitare.
450
451
452 V. 4.2.2. Numărul de trombocite
453
454 În fig. V.10.-V.14. sunt inserate rezultatele obţinute la determinarea numărului de trombocite şi
455 ale indicilor trombocitari: volumul trombocitar mediu (MPV), P-LCR (%), PDW (fL), sunt
456 inserate în fig. V.11.;V.12.; V.13;
457
458 V. 4.2.3. Numarul de leucocite
459
460 Rezultatele obţinute la determinarea numărului de leucocite sunt inserate în fig.V.15.
461 Rezultatele obţinute în urma acestui studiu experimental sunt în concordanţă cu cele raportate de
462 Abd El Raouf şi Girgis (2011), care au evidenţiat scăderea concentraţiei hemoglobinei la loturile
463 de animale tratate cu etefon. Pentru lotul tratat cu seleniu, scăderea valorii medii a hemoglobinei,
464 dar şi a altor parametri care caracterizează procesul de eritropoieză este în deplină concordanţă
465 cu rezultatele obţinute de alţi autori (Slencu et al., 2013) care au testat acţiunea selenitului de
466 sodiu asupra parametrilor hematologici.
467
468 El-Okazy (2008) a raportat că nu s-au înregistrat variaţii semnificative ale nivelurilor
469 hemoglobinei (p > 0,05), la doze mici de etefon; scăderea a fost semnificativă la creşterea
470 dozelor de etefon administrate (p < 0,01). De asemenea, numărul total de eritrocite a scăzut, în
471 corelaţie cu doza de etefon ingerată de animale.
472 Pentru hematocrit, parametrul care exprimă volumul procentual de hematii în sânge (Fig. V.6.),
473 evoluţia valorilor medii este în concordanţă cu cea a concentraţiilor medii ale hemoglobinei;
474 astfel, valoarea medie pentru lotul tratat cu etefon este uşor scăzută faţă de cea a lotului martor
475 (p>0,05). Pentru lotul la care etefonul a fost asociat cu selenitul de sodiu, valoarea medie este
476 mai scăzută faţă de lotul tratat cu seleniu (p > 0,05), dar şi faţă de lotul control (p > 0,05).
477 Această evoluţie, în corelaţie directă cu variaţia valorilor medii ale hemoglobinei sugerează
478 interferenţa unor factori care perturbă procesul de eritropoieză, la asocierea seleniului cu acest
479 compus organofosforic, etefonul.
480 Literatura de specialitate conţine date referitoate la acţiunea etefonului asupra parametrilor
481 hematologici, la animalele de laborator, dependent de doză şi de specie (Abd El Raouf, 2011 ;
482 El-Okazy, 2008). Reddy et al, (2013) au raportat că selenitul de sodiu a crescut uşor numărul de
483 leucocite la şoareci. La doze orale de 1 mg Se / kgc (administrat sub formă de selenit de sodiu
484 timp de 10 zile) numărul de globule roşii a crescut uşor (Sadeghian et al, 2012). Sadeghian et al,
485 2012) au sugerat că la administrarea seleniului la doze supranutriţionale dar subtoxice, numărul
486 total de leucocite nu variază, sau creşte foarte puţin; explicaţia poate fi capacitatea antioxidantă a
487 seleniului şi efectele protectoare ale acestuia faţă de stresul oxidativ.
488 În paralel, selenitul de sodiu a redus concentraţiile de eritrocite şi hemoglobină într-o manieră
489 dependentă de doză. Această evoluţie a numărului de eritrocite şi a valorilor hemoglobinei a fost
490 raportată şi de alţi autori (Al-Fartosi, 2008; Şlencu et al., 2013). În plus, Jia et al. (2005) au
491 confirmat că selenitul de sodiu administrat la şobolani, în experiment subcronic a condus la
492 scăderea, dependentă de doză, a valorilor eritrocitelor şi a hemoglobinei.
493 Mecanismul prin care selenitul reduce numărul de eritrocite din sânge ar putea fi hemoliza, care
494 ulterior duce la epuizarea eritrocitelor circulante. Într-un experiment in vitro, capacitatea
495 hemolitică a selenitului de sodiu a fost evidenţiată prin utilizarea sângelui uman (Brandao et al.,
496 2005).
497 În cercetările noastre, valorile medii ale numărului total de leucocite (fig. V.15.) pentru loturile
498 de animale tratate cu etefon, respectiv cu seleniu sunt foarte apropiate, dar uşor mai scăzute decât
499 cele ale lotului control (p > 0,05, respectiv, pentru lotul tratat cu seleniu); în schimb, s-a constat
500 creşterea numărului total de leucocite la lotul tratat cu asocierea seleniu-etefon (p > 0,05). Pentru
501 acest lot s-a observat un interval de variaţie a valorilor mult mai mare (de la 8,03x10 3/µL la
502 10,61x103/µL), cu o deviaţie standard de 1,5452. Analizând valorile medii ale acestui parametru,
503 se poate sugera intervenţia etefonului, concretizată prin creşterea numărului de leucocite din
504 sânge, în procesele metabolice care au loc în organismul animalelor după ingestia de etefon,
505 respectiv ingestia simultană de etefon şi selenit de sodiu.
506 Rezultatele obţinute în urma acestui experiment sunt în contradicţie cu cele raportate de El-
507 Okazy (2008), care a constatat că numărul total de leucocite a prezentat o creştere semnificativă
508 dependentă de doză (p < 0,01) la loturile tratate cu etefon, comparativ cu lotul martor. Pisek et al.
509 (2008) au confirmat reducerea numărului de globule albe, dependentă de doză, la animalele de
510 laborator după administrare de selenit de sodiu, fenomen prezent şi în cercetările noastre.
511 Sadeghian et al. (2012) au sugerat că la administrarea seleniului la doze supranutriţionale dar
512 subtoxice la ovine, numărul total de leucocite nu variază, sau creşte foarte puţin; explicaţia poate
513 fi capacitatea antioxidantă a seleniului şi efectele protectoare ale acestuia faţă de stresul oxidativ.
514
515 V. 4.3. Evaluarea modificărilor parametrilor biochimici la şobolani
516
517 V. 4.3.1.1. Rezultate
518
519 Rezultate obţinute la determinarea enzimelor AST şi ALT sunt inserate Tabel V.1. şi în Fig.
520 V.21., Fig. V.22.
521 V. 4.3.3. Determinarea parametrilor de stres oxidativ (glutation redus şi a malondialdehidei în
522 omogenate de ficat)
523
524 V. 4.3.3.1. Rezultate
525
526 Rezultatele obţinute la determinarea glutationului redus şi a malondialdehidei în omogenate de
527 ficat sunt inserate în tabelul V.3.
528
529 V. 4.4. Evaluarea modificărilor histopatologice la nivel hepatic la şobolani,
530
531 V. 4.4.1. Rezultate
532
533 Rezultatele obţinute la examenul histopatologic al probelor de ficat recoltate în acest scop sunt
534 prezentate în figurile V.32.- V.39.
535 Analiza acestor imagini evidenţiază imagini histoarhitectonice în concordanţă cu semnificaţia
536 lotului de animale luat în studiu. Ficatul animalelor din lotul Control (fig. V.32.) a prezentat o
537 structură histoarhitectonică normală, nefiind decelată nici o modificare morfologică.
538 Examinarea probelor de ficat de şobolan care au fost trataţi cu selenit de sodiu (fig. V.33) în doză
539 de 1mg Se/kgc a evidenţiat un aspect normal din punct de vedere histologic, asemănător lotului
540 control. Astfel, în spaţiile portobiliare se pot observa arteriole, venule, vase limfatice mici şi
541 canale biliare nemodificate, cu lumen normal. În venulele centrolobulare stagnează hematii.
542 Hepatocitele sunt dispuse în cordoane Remak printre care apar capilare sinusoide
543 sanguine. Hepatocitele si nucleii acestora au dimensiuni apropiate.
544 Ficatul şobolanilor expuşi la etefon a prezentat o serie de modificări variabile ca intensitate în
545 funcție de animalul investigat. La un şobolan au apărut mici zone de necroză în jurul spațiului
546 portobiliar dar și intralobular. Au fost surprinse venule ectaziate (fig. V.34.a). La un alt individ
547 (fig. V.34.b) se pot observa venulele ectaziate. Cordoanele Remak apar dispuse radiar de la
548 venula centrolobulara. Capilarele sinusoide apar ectaziate. Printre lobuli se pot observa
549 aglomerari de hepatocite, cu nuclei intens colorați, care au pierdut așezarea în cordoane.
550 Structurile histoarhitectonice ale ficatului şobolanilor din lotul expus la selenit şi etefon prezintă
551 modificări histologice reduse la marea majoritate a probelor examinate. Spațiile portobiliare au
552 aspect normal. Unele venule au fost surprinse în ectazie cu elemente figurate în lumen.
553 Hepatocitele au aranjament specific, în cordoane radiare (fig. V.38.a,b). Apar frecvent hepatocite
554 binucleate, celule Kupffer şi pigmenţi de uzură (fig V.39.a). Într-un histopreparat au fost
555 surprinse incluzii intracitoplasmatice acidofile. Hepatocitele au nuclei mari, nucleolați, iar
556 frecvența celulelor Kupffer este mai mare (fig. V.39.).
557 Analizând global datele obţinute după evaluarea parametrilor hematologici putem concluziona,
558 că etefonul modifică într-o manieră evidentă majoritatea parametrilor hematologici la şobolani,
559 în intoxicaţia experimentală subacută. Referitor la evoluţia parametrilor hematologici, după
560 administrarea selenitului de sodiu, cu rol de a contracara perturbările produse de etefon, s-a
561 constatat că, la doza de 1 mg Se/ kgc, seleniu acţionează ca toxic şi nu normalizează valorile
562 parametrilor alteraţi.
563 Rezultatele obtinute de noi la determinarea activităţii alanin transaminazei (TGP, ALT) au
564 evidenţiat capacitatea redusă a etefonului de a modifica activitatea acestei enzime (p>0,05); în
565 schimb, valorile medii ale ALT pentru lotul tratat cu seleniu indică o alterare semnificativă a
566 activităţii enzimei (p < 0,05). Pentru lotul tratat cu etefon în asociere cu seleniu, valoarea ALT a
567 crescut semnificativ statistic atât faţă de martor (p < 0,05) cât şi faţă de lotul tratat cu etefon (p <
568 0,05), respectiv cu seleniu (p < 0,05). Cele mai mari valori ale activităţii aspartat transaminazei
569 (TGO; AST) s-au obţinut pentru lotul la care seleniul a fost asociat cu etefonul; creşterea este
570 nesemnificativă statistic (p > 0,05) atât faţă de valorile lotului martor, cât şi faţă de cele pentru
571 fiecare substanţă administrată individual.
572 Creșterea glicemiei după administrarea etefonului poate indica perturbarea metabolizării
573 carbohidraților datorită intensificării glicogenolizei hepatice. Asocierea seleniului reduce
574 semnificativ nivelul glucozei, dar fără a atinge valoarea lotului martor.
575 Modificarea globală a parametrilor de stres oxidativ, provocate de etefon, evidenţiată în
576 rezultatele cercetărilor realizate de noi poate fi atribuită probabil, producției excesive de ROS,
577 care ar putea fi legată de eliberarea enzimelor din hepatocite, consecință a deteriorării integrităţii
578 celulei hepatice. Selenitul de sodiu poate contribui la intensificarea sintezei glutationului, care
579 poate ameliora stresul oxidativ indus de etefon și, în consecinţă poate intensifica detoxifierea
580 organismului animal.
581 Creșterea nivelului de uree și a creatininei serice la șobolanii tratați cu etefon este rezultatul unor
582 tulburări metabolice ale funcției hepatice, deoarece ureea este produsul final al catabolismului
583 proteic.
584 Studiul histopatologic a confirmat că expunerea sobolanilor la etefon a avut un efect hepatotoxic
585 important, producand zone necrotice de dimensiuni varibile în funcție de reactivitatea indivizilor.
586 Selenitul, cu rol antioxidant a determinat o atenuare importantă a leziunilor histologice hepatice,
587 cu rezultate foarte bune la majoritatea indivizilor.
588
589 CONCLUZII GENERALE
590
591 În Uniunea Europeană „Protejarea sănătăţii oamenilor, a animalelor şi a plantelor, în fiecare
592 etapă a procesului de producţie, este o prioritate-cheie a politicilor economice şi de sănătate
593 publică”. UE doreşte să se asigure că cetăţenii săi au acces la alimente sigure şi hrănitoare,
594 obţinute din plante şi animale sănătoase.
595 Cercetările experimentale efectuate pentru finalizarea tezei de doctorat au permis realizarea
596 obiectivelor fixate, pentru fiecare capitol din Partea experimentală şi formularea unor concluzii
597 generale. Astfel
598 Metoda HPLC standardizată a fost aplicată la determinarea etefonului din 36 probe de tomate şi
599 18 probe de căpşuni.
600 Procentul de recuperare pentru etefon din probe de tomate îmbogăţite a variat între 87,44% şi
601 100,65% pentru o limită de cuantificare a metodei de 0,083307 (µg/mL). Pentru probele de
602 căpşuni, regăsirea s-a situat în intervalul 70,13% - 101,77%.
603 Valoarea medie a concentraţiilor etefonului în probele de tomate analizate a fost de 29,48 µg /kg
604 de produs. Pentru probele de căpşuni, valoarea medie a fost de 13,03 µg /kg produs.
605 Determinarea experimentală a stabilităţii etefonului în probele conservate prin congelare, a
606 evidenţiat o reducere a nivelului regulatorului de creştere, de 24,16%. Pentru probele de căpşuni,
607 procentul de scădere a concentraţiei etefonului, în cele 6 luni de experiment a fost de 63,47%.
608 Rezultatele cercetărilor privind modificarea parametrilor hematologici, biochimici şi histologici,
609 în intoxicaţia subacută la şobolani au evidenţiat acţiunea toxică moderată a etefonului asupra
610 organismului acestor animale.Analizând global datele obţinute după evaluarea parametrilor
611 hematologici putem concluziona că etefonul modifică într-o manieră evidentă majoritatea
612 parametrilor hematologici la şobolani, în intoxicaţia experimentală subacută
613 Valorile activităţii enzimelor care caracterizează integritatea celulei hepatice, au evidenţiat
614 capacitatea redusă a etefonului de a modifica activitatea acestei enzime.
615 Etefonul, regulator de creștere cu structură de compus organofosforic intensifică procesele de
616 peroxidare a lipidelor în țesutul hepatic; acest proces a fost evidenţiat prin modificarea valorilor
617 parametrilor de stress oxidativ determinaţi în sânge (SOD; GPx, TAS).Aceleaşi evoluţii le-au
618 avut şi concentraţiile GSH şi a MDA, determinate pe omogenate de ficat.
619 Explorarea funcţiei renale a evidenţiat creșterea nivelului de uree și a creatininei serice, markeri
620 semnificativi al disfuncției renale; etefonul produce tulburări metabolice ale funcției hepatice şi
621 renale, la şobolani
622 Modificările tuturor acestor categorii de parametri, concretizate prin valorile rezultate la
623 analizele efectuate converg spre concluzia că etefonul este un compus moderat hepatotoxic şi
624 care intensifică procesele de peroxidare lipidică; valorile parametrilor care evidenţiază prezenţa
625 stresului oxidativ confirmă această ipoteză.
627 Relevante pentru toxicitatea hepatică a etefonului au fost modificările histopatologice apărute
628 după administrarea etefonului la şobolani, prin gavaj gastric, în doze de 200mg/kgc, timp de 14
629 zile; expunerea sobolanilor la etefon a avut un efect hepatotoxic important, producand zone
630 necrotice de dimensiuni varibile.
631 Investigarea capacităţii selenitului de sodiu de a proteja organismul şobolanilor, afectat de
632 administrarea etefonului a confirmat ipoteza noastră numai în privinţa parametrilor de stress
633 oxidativ şi a celor histopatologici.
634 Referitor la evoluţia parametrilor hematologici, după administrarea selenitului de sodiu, cu rol de
635 a contracara perturbările produse de etefon, s-a constatat că, la doza de 1 mgSe/kgc, administrată
636 de noi, seleniul nu normalizează valorile parametrilor hematologici şi biochimici, modificaţi ca
637 urmare a efectelor hematotoxice ale regulatorului de creştere.
638 Modificarea globală a parametrilor de stres oxidativ, provocate de etefon, evidenţiată în
639 rezultatele cercetărilor realizate de noi poate fi atribuită probabil, producției excesive de SRO
640 (ROS), care ar putea fi legată de eliberarea enzimelor din hepatocite, consecinţă a deteriorării
641 integrităţii celulei hepatice. Pentru selenitul de sodiu se poate sugera capacitatea
642 hepatoprotectoare, probabil prin intensificarea sintezei glutationului, care poate ameliora stresul
643 oxidativ indus de etefon și, în consecinţă poate intensifica detoxifierea organismului animal.
644 Studiul histopatologic a confirmat că expunerea sobolanilor la etefon a avut un efect hepatotoxic
645 important, producând zone necrotice de dimensiuni varibile în functie de reactivitatea indivizilor.
646 Selenitul de sodiu, administrat simultan cu etefonul a condus la o atenuare importantă a
647 leziunilor histologice hepatice, la majoritatea indivizilor.
648 Concluziile finale care se desprinde după finalizarea cercetărilor experimentale:
649 etefonul, pesticid organofosforic utilizat ca regulator de creştere este prezent (în concentraţii mai
650 mici decât limita permisă de legislaţia sanitară) în produse alimentare de origine vegetală
651 (tomate, căpşuni);
652 determinarea parametrilor hematologici, biochimici şi histologici a evidenţiat toxicitatea
653 moderată a etefonului, administrat oral, la şobolani.
654 investigarea eventualului efect protector al seleniului faţă de intoxicaţia cu etefon a evidenţiat
655 tendinţa de normalizare a parametrilor biochimici, mai ales a celor care evidenţiază stres-ul
656 oxidativ; parametrii histologici determinaţi la animalele tratate simultan cu etefon şi selenit de
657 sodiu sugerează în cea mai mare măsură potenţialul hepatoprotector al seleniului.
658
659 ELEMENTE DE ORIGINALITATE
660
661 Teza de doctorat „Regulatori de creştere şi siguranţa alimentelor de origine vegetală“ a abordat
662 un subiect de reală actualitate şi originalitate; este pentru prima dată când în România este studiat
663 nivelul reziduurilor unui regulator de creştere pentru plante. Tema aleasă este cu atât mai
664 incitantă, cu cât legislaţia naţională nu permite utilizarea etefonului în cultura tomatelor şi
665 căpşunilor. Adaptarea metodei HPLC de determinare a etefonului a permis cuantificarea
666 reziduurilor acestui compus în probe de tomate şi de căpşuni. Valorile determinate, deşi mai mici
667 decât cele permise de legislaţie, evidenţiază că etefonul este încă folosit pentru a grăbi
668 maturizarea şi colorarea unor alimente de natură vegetală.
669 De asemenea, investigarea potenţialului protector al seleniului faţă de toxicitatea etefonului, la
670 animalele de laborator a fost o idee originală. În literatura de specialitate nu sunt prezente
671 informaţii privind asocierea seleniu-etefon pentru a proteja organismele care ingeră etefon. Studii
672 mai recente au emis ipoteza că seleniul îşi exercită acţiunea hepatoprotectoare şi antineoplazică
673 comportându-se ca prooxidant şi nu ca antioxidant şi că formele anorganice de Se sunt mai
674 active decât cele în care seleniul este încorporat în compuşi organici.
675 Plecând de la acţiunea detoxifiantă demonstrată a seleniului asupra cadmiului, mercurului,
676 plumbului, cuprului, diazinonului etc., am iniţiat un studiu experimental în care am evidenţiat
677 evoluţia unor parametri hematologici, biochimici şi histopatologici la animalele la care etefonul a
678 fost administrat simultan cu selenitul de sodiu. Rezultatele obţinute au sugerat intervenţia, uneori
679 benefică a seleniului în sensul normalizării valorilor parametrilor determinaţi.
680
681 PERSPECTIVE DE CERCETARE
682
683 Rezultatele preliminarii obţinute în urma investigării potenţialului protector al seleniului faţă de
684 toxicitatea etefonului, la animalele de laborator în condiţiile în care s-a administrat o singură
685 doză de seleniu de 1 mg/kgc, permit concluzii limitate privind eficacitatea asocierii.
686 Continuarea cercetărilor se impune pentru a se putea preciza intervalul de concentraţii la care
687 seleniul poate funcţiona ca protector, prin normalizarea parametrilor biologici. În plus, ideală ar
688 fi determinarea concentraţiilor seleniului în sângele uman, pentru a predicţiona capacitatea
689 seleniului de protector faţă de toxicitatea unor xenobiotice (metale toxice, persicide, elemente
690 radioactive).