EXEMPLE DE PH-METRE, SPECTROFOTOMETRE, CROMATOGRAFE

SI ELECTROFOREZE UTILIZATE IN LABORATOARE MEDICALE SI

DE REVOLUTIE (COLAJE DE IMAGINI, MOD DE LUCRU, CURBE DE
ETALONARE);

Hartia indicatoare de ph

Fabricata prin impregnarea hartiei de filtru de calitate ridicata cu solutii indicatoare

sau solutii indicatoare mixte.

Aparatura

pH-metru, echipat cu electrod de calomel (electrodul de referinta) si electrod de

sticla (electrodul de masurare).

In stare de repaus electrodul de calomel se pastreaza cufundat intr-o solutie

saturata de KCl, iar cel de sticla in apa distilata. Daca inainte de utilizare se
constata ca in interiorul electrodului de referinta exista bule de aer, se completeaza
lichidul din interiorul acestuia cu solutie saturata de clorura de potasiu.
Mod de lucru

Pentru etalonarea aparatului se folosesc de obicei doua solutii tampon care

au pH-ul cel mai apropiat de cel presupus la proba ce se analizeaza.

Cu 10-15 minute inainte de determinare, se deschide aparatul. Se aduce la

zero, conform instructiunilor insotitoare.

Se aduce solutia tampon la temperatura de 20°C, regland si aparatul pentru

aceasta temperatura (din butonul de reglarea temperaturii).

Se introduc electrozii in solutia tampon; daca acul indicator nu arata exact

pH-ul acelei solutii, se aduce la acea valoare (conform instructiunilor aparatului).

Se indeparteaza solutia tampon, se spala electrozii cu apa si se tamponeaza

usor cu hartie de filtru. Se introduc apoi electrozii in extractul apos al probei de
cercetat; dupa 1-2 minute se masoara temperatura lichidului, se regleaza aparatul la
acea temperatura si se citeste pH-ul.

Dupa efectuarea determinarii electrozii se spala cu apa apoi cel de calomel

se introduce in solutia saturata de dorura de potasiu, iar cel de sticla in apa distilata.

SPECTROFOTOMETRE

Un spectrofotometru sau un colorimetru utilizeaza transmiterea luminii

printr-o solutie pentru determinarea concentratiei unui solut in solutia respectiva.
Spectrofotometrul difera de colorimetru prin modul in care lumina este separata in
lungimile de unda componente. Spectrofotometrul utilizeaza o prisma pentru
separarea luminii, iar colorimetrul utilizeaza filtre. Ambele se bazeaza pe un model
simplu de trecere a luminii de lungime de unda cunoscuta printr-o proba si
masurarea cantitatii de energie luminoasa care este transmisa. Aceasta se realizeaza
prin plasarea unei fotocelule in partea opusa a probei respective. O raza de lumina
este formata din fotoni; cand un foton intalneste o molecula de analit, exista sanse
ca analitul sa absoarba fotonul. Aceasta absorbtie reduce numarul de fotoni din
raza de lumina, astfel reducand intensitatea luminoasa.Toate moleculele absorb
energie radianta la anumite lungimi de unda. Cele care absorb energie in spectrul
vizibil sunt cunoscute ca pigmenti. Proteinele si acizii nucleici absorb lumina in
domeniul ultraviolet.
Un spectrofotometru implica o sursa de lumina, o prisma, un suport pentru
probe si o fotocelula. Acestea sunt conectate la un sistem electric sau mecanic care
controleaza intensitatea luminii, lungimea de unda si conversia energiei primite la
nivelul fotocelulei in fluctuatii voltmetrice. Fluctuatiile voltmetrice sunt apoi
proiectate pe o scala metrica/digitala si valorile sunt inregistrate intr-un computer.
Intensitatea culorii dintr-o proba depinde de cantitatea de solut din proba
respectiva. Transmisia luminii nu este o functie liniara, ci mai degraba
exponentiala. Transmitanta este procentul relativ de lumina care a trecut prin
proba. Transmitanta procentuala este transformata intr-o functie logaritmica
inversa cunoscuta ca absorbanta (sau densitate optica).
Legea Beer-Lambert: absorbanta este minus log10 din transmitanta (A = -
log10T). Aceasta valoare este mai utila decat transmitanta deoarece proiectia
absorbantei versus concentratie determina o linie dreapa, absorbanta crescand
odata cu cresterea concentratiei (transmitanta scade odata cu cresterea concentratiei
de analit).
Pentru a utiliza un spectrofotometru este necesara stabilirea unei serii
cunoscute de dilutii a unor cantitati cunoscute de solut. Una din acestea nu contine
solut si este cunoscuta ca “blank”. Este utilizata pentru ajustarea instrumentului sa
citeasca 100% transmitanta pentru absorbanta 0. O valoare a transmitantei de 0%
(absorbanta infinita) este stabilita prin plasarea unei bariere intre sursa de lumina si
fotocelula. Toate celelalte masuratori sunt apoi efectuate prin simpla plasare a
probelor in calea luminii. Dupa inregistrarea absorbantei pentru o serie de probe
standard este efectuata o dreapta absorbanta versus concentratie. Panta dreptei
reprezinta coeficientul de extinctie. Aceasta valoare este o constanta si este
utilizata pentru conversia oricarei absorbante masurate in concentratia
corespunzatoare (C = A/ε).
Un spectrofotometru poate utiliza atat lumina vizibila (de obicei avand ca
sursa de lumina o lampa cu tugsten/halogen), cat si lumina UV. Singura modificare
necesara este inlocuirea tuburilor de sticla cu cuvete de quartz (sticla absoarbe
lumina UV si nu este potrivita pentru un spectrofotometru UV).
 Majoritatea testelor de chimie clinica efectuate pe analizorul automat sunt
teste colorimetrice, distingandu-se urmatoarele tipuri de teste:
 teste enzimatice colorimetrice in care substanta de analizat este tratata cu
una sau mai multe enzime specifice, in urma reactiei rezultand hidrogen
peroxid, care in prezenta unui substrat, sub actiunea peroxidazei duce la
formarea unui pigment iminoquinonic care este determinat fotometric,
intensitatea culorii formate fiind proportionala cu concentratia analitului
respectiv (ex: determinarea acidului uric cu utilizarea uricazei);
 teste colorimetrice in care substanta de analizat se cupleaza specific cu
reactivul cu formarea unui produs conjugat colorat care este determinat
fotometric (ex.: bilirubina se cupleaza cu ionul diazoniu in mediu puternic
acid cu formarea azobilirubinei de culoare rosie); in cazul determinarii
enzimelor, acestea cliveaza enzimatic un substrat specific, produsul rezultat
fiind colorat/ se cupleaza cu un cromogen si formeaza un complex colorat;
 teste UV: NADH/NADPH care este fie produs, fie consumat in timpul
reactiilor care au loc este determinat fotometric in lumina ultravioleta,
concentratia sa fiind direct, respectiv invers proportionala cu concentratia
analitului de determinat (ex: determinarea ALT si AST).
 teste kinetice: produsul final este determinat kinetic (in timp fix), ceea ce
ofera o linearitate mai mare (ex.: test kinetic UV pentru determinarea ureei).

CROMATOGRAF

Cromatografia reprezinta un grup

de metode de laborator care se
bazeaza pe adsorbtia selectiva, prin
care componentele unui amestec
complex pot fi identificate si/sau
purificate (adsorbtia reprezinta
aderenta moleculelor la suprafata
unei alte substante). Metoda a fost
utilizata initial de botanistul rus
Mikhail Tsvett pentru separarea de
produsi intens colorati, de unde
denumirea de cromatografie.
Cromatografia in coloana implica o faza mobila (lichid sau gaz) care curge peste o
faza stationara (solida sau lichida). In cromatografia in coloana un amestec de
molecule este separat pe baza afinitatii fiecarei molecule pentru faza mobila sau
stationara: daca o molecula are o afinitate mai mare pentru faza stationara decat o
alta molecula, atunci cea din urma va migra prin coloana mai rapid decat prima
molecula. Solutia de analizat este adaugata prin partea superioara a coloanei si este
apoi eluata cu solvent; fractiunile sunt colectate prin partea inferioara a coloanei.
Exista mai multe varietati de cromatografie in coloana: cromatografia cu gel
filtrare (excludere moleculara), cromatografia cu schimb de ioni, cromatografia cu
faza inversa, cromatografia cu gaz-lichid, cromatografia cu interactiuni hidrofobe,
cromatografia cu afinitate, cromatografia cu separare.
In cromatografia cu gel-filtrare (excludere moleculara) moleculele dintr-o
solutie sunt separate in functie de marimea lor pe masura ce trec printr-o coloana
de bile legate intre ele intr-o retea tridimensionala. Aceste bile polimerice (dextran,
agaroza sau acrilamid) prezinta pori de anumite dimensiuni. Pe masura ce o proba
trece prin coloana, moleculele mai mari decat dimensiunile porilor nu vor patrunde
in ochiurile retelei ramanand in solutie, astfel incat ele vor elua primele din
coloana. Moleculele mai mici vor patrunde prin pori in ochiurile retelei si astfel se
vor deplasa mai lent prin coloana si vor elua ultimele din solutie. Pe masura ce
proba elueaza la capatul coloanei fractiunile sunt colectate in tuburi. Fractiunile
eluate sunt apoi testate pentru determinarea compozitiei si cantitatii componentelor
respective prin spectrofotometrie, electroforeza sau teste functionale.
Cromatografia cu gel filtrare este utilizata in primul rand pentru a purifica proteine
sau alte molecule si poate fi utilizata pentru estimarea marimii unor proteine
necunoscute (coloane calibrate cu proteine cu GM cunoscuta).
In cromatografia cu schimb de ioni moleculele sunt separate pe baza
incarcaturii lor ionice. Faza stationara este reprezentata de o rasina cu incarcatura
fixa; daca aceasta incarcatura este negativa (carboximetil celuloza), procesul se
numeste cromatografie cu schimb de cationi, iar daca incarcatura este pozitiva
(dietilaminoetil celuloza), este cromatografie cu schimb de anioni. Faza mobila
este reprezentata de o solutie tampon. Atunci cand o proteina trece prin coloana se
poate lega de matrice si poate fi in continuare eluata prin cresterea concentratiei
ionice a solutiei tampon (elutia poate fi privita ca o competitie pentru situsurile de
legare ale matricei; pe masura ce puterea ionica a tamponului creste, o sare ionica
din tampon va ocupa un situs al matricei si proteina va fi eluata din coloana). pH-ul
solutiei tampon este critic in cromatografia cu schimb de ioni. Exista doua cai de
efectuare a elutiei: prin gradient, in care concentratia salina creste constant si
gradual in timpul procesului de elutie si elutia brusca, in care modificarea in
concentratia salina este abrupta.
Electroforeza, ca si cromatografia cu schimb de ioni, poate fi utilizata ca un
instrument eficient pentru analiza unui amestec de ioni. O fasie de hartie sau gel
polimeric saturata cu un electrolit este asezata astfel incat sa traverseze doua
solutii care contin electrozi. Amestecul de analizat este aplicat pe hartie/gel si cei
doi electrozi sunt conectati la o sursa de inalta energie (~5000 volti). Ionii pozitivi
vor migra intr-o directie, iar cei negativi in cealalta directie. Cu cat este mai mare
incarcatura ionului, cu atat va migra mai departe. Metoda este in mod special utila
pentru separarea amestecurilor proteice.
In cromatografia cu faza inversa moleculele sunt legate de o matrice
hidrofoba (hidrocarburi cu lant lung legate de o matrice de silicon) intr-un tampon
hidrofil. Moleculele pot fi apoi eluate prin scaderea polaritatii tamponului, de
exemplu prin cresterea concentratiei de alcool sau alt solvent nepolar din tampon.
Cromatografia cu afinitate este utilizata mai mult in scop de cercetare;
moleculele sunt separate pe baza unor aspecte specifice ale structurii si activitatii
lor biologice. Sunt utilizati liganzi care sunt imobilizati intr-o matrice de suport,
din care este efectuata o coloana; peste coloana se toarna proba care contine
proteina de interes si care se leaga de liganzii continuti in coloana; proteina este
apoi eluata, fie prin modificarea conditiilor din coloana (modificarea pH-ului sau
concentratiei saline), fie prin utilizarea unei alte molecule care va intra in
competitie cu molecula de interes pentru situsurile de legare ale liganzilor.
Exemple de liganzi in functie de substanta de purificat: substrat, inhibitor, cofactor
(pentru enzime), antigene (pentru anticorpi), secvente de baze complementare
(pentru acizi nucleici).
Cromatografia lichida de inalta performanta utilizeaza pompe care
furnizeaza presiuni inalte care imping solventii prin coloane metalice. Aceasta
creste viteza procesului de separare si previne raspandirea solutiilor care poate
aparea in cromatografia in coloana gravitationala. Separarea are loc in minute in
loc de ore si este net superioara. Utilizand cromatografia cu faza inversa pot fi
separate doua proteine a cate 100 aminoacizi fiecare care difera printr-un singur
aminoacid.
Cromatografia cu gaz utilizeaza un lichid cu punct de fierbere inalt impregnat intr-
un suport solid inert ca faza solida si heliu ca faza mobila, intregul sistem fiind
incalzit. Solutul este injectat in coloana si se volatilizeaza imediat, heliul
indepartand componentele din coloana, fiecare component fiind inregistrat de un
detector care determina cantitatea relativa a acestuia. Polaritatea si volatilitatea
componentelor determina timpul cat acestea sunt retinute de coloana. Capacitatea
coloanei in cromatografia cu gaz fiind foarte mica, aceasta este utilizata in
principal ca un instrument analitic.
In cromatografia in strat subtire si cromatografia cu hartie coloana este
inlocuita cu un strat adsorbant (silicon, aluminiu, celuloza) aplicat pe un suport de
sticla/plastic/folie de aluminiu. Solutul este aplicat cu un tub capilar, iar solventul
este lasat sa se evapore. Apoi componentele sunt eluate cu un solvent care este
lasat sa urce pe placuta prin actiune capilara, antrenand componentele amestecului
in grade diferite. In final se aplica un agent oxidant, astfel incat fiecare component
apare ca o pata intunecata pe placuta, localizarea si marimea fiecareia dintre
acestea servind pentru identificarea si masurarea cantitatii relative a
componentelor.

ELECTROFOREZA

Electroforeza proteinelor serice  reprezinta separarea electroforetica a

fractiunilor proteice din serul sanguin si evaluarea concentratiei componentilor prin
metoda fotometrica. Proteinele totale din ser sunt descompuse in 5 categorii de
substante numite fractiuni proteinice.
Valorile medii normale ale acestor fractiuni (care se refera la persoanele de
varsta adulta si normal hranite) pot sa varieze pana la 10% in plus sau in minus, in
special la copii, varstnici sau la persoane care nu se alimenteaza normal.

Valori normale

- albumine: 52 - 62% sau 3,64 - 4,34 grame;

- globuline: 38 - 48% sau 2,66 - 3,36 grame;
- alfa-1-globuline: 2 - 5% sau 0,14 - 0,35 grame;
- alfa-2-globuline: 6 - 9% sau 0,42 - 0,63 grame;
- beta-globuline: 8 - 11% sau 0,56 - 0,77 grame;
- gamma-globuline: 14 - 21% sau 0,98 - 1,47 grame.