Evaluación de una cepa de levadura para fermentar diferentes

concentraciones de miel de Apis mellifera.

Lic. Miriam Concepción Lorenzo, MsC. Carlos Alberto del Risco Ríos, Lic. Dora María
Lorenzo, Lic. Mario Fajardo e Ing. Juan Carlos Pérez Morales.

Estación Experimental Apícola, Tel. 2020027, E-Mail miriam@eeapi.cu Cuba

Resumen
S e prepararon dos corridas experimentales en paralelo a diferentes concentraciones de
miel de Apis mellifera desde 10 hasta 21ºBrix, con tres réplicas por cada concentración. A
la miel utilizada se le controlaron los siguientes parámetros: diastasa, hidroximetilfurfural,
por ciento de humedad, acidez libre, por ciento de sólidos solubles, Fructosa, glucosa,
sacarosa, maltosa y turanosa. La primera de las corridas sin fuente de nitrógeno exógena
y la segunda con un exceso de esta fuente. Dichos mostos fueron inoculados con la cepa
a evaluar controlándose el final de la fermentación con la toma del ºBrix aparente por
refractometría y la producción de alcohol por oxidación del dicromato de potasio. La
tolerancia al etanol se midió haciendo crecer la cepa en mosto de 10 ºBrix a
concentraciones de etanol absoluto desde 1 hasta 16 %. La miel utilizada para este fin no
cumplió con ciertos parámetros de la exportación. La cepa utilizada se clasificó como
productora de alcohol, esta no excedió el 10% y alta tolerante al mismo. La producción de
alcohol, los azúcares fermentables iniciales y finales medidos por cromatografía líquida de
alta resolución así como el rendimiento y las eficiencias fermentativas arrojaron que los
puntos más adecuados para preparar el mosto son 18 y 19 ºBrix y que la adición de la
fuente de nitrógeno exógena no tuvo influencia sobre el rendimiento de alcohol.
Introducción
Los procesos fermentativos que conducen a productos de utilidad cotidiana, resultan de
gran importancia para la humanidad debido a su amplio uso, ya sea de forma directa
como medicamentos o alimentos, o de forma indirecta como materiales para la industria
farmacéutica, alimenticia o química. La creciente lista de nuevos productos comerciales
derivados de la fermentación y el incremento de la demanda para su utilización, han
intensificado la búsqueda de nuevos conocimientos sobre la tecnología de estos
bioprocesos.
El proceso fermentativo es uno de los primeros aporte de la humanidad para la obtención
de productos biotecnológicos y se desarrolló empíricamente en el antiguo Egipto según
testimonios que datan del año 2000 A.N.E. (Llyons, Kelsall y Murtagh, 1995). A pesar de
su uso milenario, no ha perdido perspectiva por cuanto constituye aun un modo de
producción de vital interés.
La fermentación es un proceso mediante el cual la levadura convierte azúcares en
alcohol, CO 2 y otros metabolitos secundarios, regido químicamente por la ecuación
establecida por el químico francés Joseph-Louis Gay Lussac en 1815.

C 6 H 12 O 6 2CO 2 + C 2 H 5 OH
Sin embargo, a pesar de la existencia de esta ecuación que describe la esencia del
proceso, su naturaleza no es químicamente pura.
Teniendo en cuenta que los fermentos alcohólicos son productos biológicos, la
interrelación de los eventos microbiológicos, bioquímicos y de ingeniería, así como su
conocimiento y cuidadoso manejo son los llamados a jugar el papel esencial en el éxito
del proceso fermentativo, siendo este último el causante de las principales pérdidas en la
producción.
Algunas de las tendencias actuales en nuestro país sobre esta temática han estado
encaminadas a la producción y fermentación de mostos de alta gravedad, lo que implica
la selección de microorganismos que sean capaces de imponerse a las adversas
condiciones ambientales y nutricionales propias del proceso; esto permitirá aumentar los
rendimientos y productividad del mismo.
La finalidad de este trabajo es evaluar una cepa de levadura en cuanto a su producción y
tolerancia al alcohol, determinando el ºBrix de mejor rendimiento y eficiencia fermentativa,
así como, determinar la influencia de una fuente de nitrógeno en exceso sobre la
producción de alcohol.
Materiales y Métodos
S e prepararon dos corridas experimentales en paralelo de diferentes concentraciones de
miel de Apis mellifera utilizando agua estéril y suave. Los mostos fueron ajustados por
refractometría desde 10 hasta 21 ºBrix y envasados en Erlenmeyers de 500 mL a razón
de 450 ml . La primera de las corridas se realizó sin fuente de nitrógeno exógeno mientras
que a la segunda se le añadieron 10 g de sulfato de amonio por replica como fuente de
nitrógeno en exceso. Dichos mostos fueron inoculados con la cepa a evaluar,
perteneciente al género Saccharomyces , controlándose el final de la fermentación con la
toma del ºBrix aparente cada 24 h. Para la determinación de etanol en el medio
fermentado se utilizó una modificación de la técnica de Dietrich, (del Risco 1999).
Se aplicó la técnica de tolerancia al alcohol (Bendová, 1981 y KocKová, 1954) que
consistió en preparar mosto de 10 ° Brix conteniendo a su vez 0, 1, 4, 8, 9, 10, 11, 12, 13
y 16 % de alcohol absoluto en volumen, cuya respuesta es la siguiente:
• Las cepas con alta tolerancia soportan de 12 hasta 16 % de etanol.
• las cepas con tolerancia soportan de 9 hasta 11 % de etanol.
• Las cepas con mediana tolerancia soportan de 4 hasta 8 % de etanol.
• Las cepas con tolerancia negativa soportan de 1 hasta 3 % de etanol.
Para el control de la calidad de la miel utilizada se evaluaron los siguientes parámetros:
Diastasa, hidroximetilfurfural, % de humedad, acidez libre y % de sólidos solubles
(Harmonized methods in the Apimondia honey commissión, 1995; Harmonized methods of
the European honey commission, 1997 and AOAC of Oficial method 980.23). Los
azúcares fructosa, glucosa, sacarosa, maltosa y turanosa se determinaron por
cromatografía gaseosa de alta resolución en las siguientes condicione:
Modelo del equipo: Cromatógrafo líquido KNAUER
Detector IR
Columna NH 2
Flujo: 1,3 mL por minutos
Temperatura del horno 30ºC
A partir de los valores obtenidos de alcohol y azúcares fermentables se calcularon los
siguientes índices fermentativos, según:

Donde 64.4 es el valor teórico del rendimiento de la fermentación (Jörgensen, 1959).

R: Rendimiento, EP: Etanol Producido, AFI: Azúcares Fermentables Iniciales, E1:
Eficiencia fermentativa 1, E2: Eficiencia fermentativa 2, ETT: Etanol Teórico Total.
Resultados y Discusión
En la Tabla 1 se muestran los resultados del control de la calidad de la miel utilizada; la
misma no cumple con las normas cubanas en cuanto a los niveles de diastasa e
hidroximetilfurfural (HMF). Lo anteriormente planteado es compatible con la finalidad de
las mieles que se desean destinar a la fermentación, las cuales no corresponden con
ciertos parámetros de las normas de exportación. El HMF es un compuesto hidrosoluble y
se oxida rápidamente expuesto al aire o por acción de la luz. Se origina a partir de una
deshidratación irreversible de las hexosas, principalmente de la fructosa. La formación de
HMF puede favorecerse por la presencia de aminoácidos (reacción de Maillard) (Tegge,
1984), que juegan un papel importante durante el proceso de fermentación, garantizando
la fuente de nitrógeno a-amino.
Los azúcares Fructosa, glucosa, sacarosa, maltosa y turanosa de la miel empleada,
fueron cuantificados por ser los más comúnmente fermentables por las levaduras.
Además, fructosa y glucosa son los monosacáridos más abundantes en la miel y por tanto
los de más rendimiento alcohólico durante la fermentación. No se observa sacarosa, lo
que denota una actividad invertasa alta, mientras que los resultados de la maltosa y la
turanosa son bajos, no ofreciendo así importancia en el rendimiento alcohólico una vez
que la miel ha sido diluida a sus respectivas concentraciones.
Según la bibliografía los porcentages de los elementos solubles en la miel no
concernientes a los azúcares son los siguientes: Proteínas 1.50%, sales de hierro, cobre,
calcio, fósforo, potasio, azufre y otros 1.80%, enzimas 2.60%, vitaminas 0.003% y ácidos
orgánicos 0.67 %. La suma de estos valores con los de fructosa 37.64%, glucosa 29.20%,
maltosa 1.08% y turanosa 1.78% es igual a 76.3%. El resultado del por ciento de sólidos
solubles de la miel utilizada es de 80,4; la diferencia de 4% pudiera corresponder a
azúcares fermentables no cuantificados en el experimento que incrementan los porcientos
de alcohol.
La adición de 10 g de sulfato de amonio como fuente de nitrógeno a las distintas
concentraciones de miel durante la fermentación, surte a las levaduras de una fuente
externa de nitrógeno en exceso. Esto se traduce en el metabolismo como un incremento
en la producción de alcohol si la materia prima carece de nitrógeno a-amino. Casey
(1985) estudiando el comportamiento de cepas de levadura para cerveza en
fermentaciones de alta gravedad (27 % de carbohidratos) concluyó que los factores que
limitan tales fermentaciones eran, sobre todo, el contenido de lípidos del mosto y la
cantidad total de nitrógeno asimilable en el medio. Como podemos observar en la tabla 2,
la adición del sulfato de amonio incrementó los ºBrix establecidos entre 12.4 y 22.4, lo que
justifica que los ºBrix aparentes al final de la corrida experimental con nitrógeno exógeno
fueron superiores a la corrida en paralelo sin nitrógeno. Por una parte el sulfato de amonio
favorece la reacción fermentativa y por otra incrementa el ªBrix inicial, aumentando las
presiones osmóticas del medio que se oponen a los procesos celulares. De igual modo se
justifica el ascenso de los ºBrix finales a medida que crecen los iniciales, producto del
aumento de la concentración de carbohidratos en el medio.
En la tabla 3 se presentan las concentraciones de fructosa y glucosa iniciales de cada
ºBrix analizado. Como era de esperar, las mismas se incrementan. La suma de los
porcentajes de fructosa y glucosa permitió el cálculo del etanol teórico donde se asumió
de manera ideal que toda fructosa y glucosa se convirtieran en etanol.
En la figura 1 se muestran los azúcares finales de las fermentaciones sin nitrógeno
exógeno. Se observa que desde 10 hasta 20 ºBrix, el comportamiento tanto de fructosa
como de glucosa es cero o muy cercano a cero. Esto evidencia la casi totalidad de
consumo de los azúcares controlados, no siendo así para 21 ºBrix, donde la sumatoria
fructosa más glucosa fue de 3.64%.
En la figura 2, referente a los azúcares finales de la corrida experimental con nitrógeno,
los resultados se comportaron con cierta regularidad. En este caso, la sumatoria de los
porcientos de fructosa mas glucosa entre 10-19 ºBrix fue generalmente cero o muy
cercanos a cero (en el caso de 18 y 19 ºBrix con 0.42 y 0.46 % respectivamente). A partir
de 20 ºBrix se incrementaron los azúcares reductores finales por encima del 1%.
En la corrida experimental sin nitrógeno, las condiciones se mostraron adversas a partir
de 21 ºBrix y como consecuencia, se proyectó un salto de los azúcares fermentables
finales. Este fenómeno sucedió en la corrida experimental con nitrógeno pero a partir de
los 20 ºBrix, esto puede ser consecuencia del incremento de los ºBrix iniciales al añadir el
sulfato de amonio. El aumento progresivo de los niveles de sólidos en el medio
incrementan las presiones osmóticas, lo que conlleva a un incremento en la concentración
de etanol intracelular, lo cual da como resultado un decremento de las enzimas
intracelulares que intervienen en la producción de etanol. Otros reportes (Yonnis, 1999;
Stewart, 1999; O´Connor-Cox, 1996; Edelen-CL, 1996 y Anon, 1996) confirman estos
resultados e indican que un nivel intracelular de etanol de 0.20 a 0.25 X 10 -6 mg por
célula viable es el límite máximo antes de que la viabilidad de la célula de levadura se
afecte negativamente.
Las producciones de alcohol de ambas corridas experimentales se muestran en la figura
3. Como se puede observar, los resultados para cada ºBrix entre las corridas
experimentales son muy similares, la fuente de nitrógeno exógeno no ejerce efecto en
cuanto al aumento de la producción de alcohol. Esto evidencia que la miel utilizada
contiene la suficiente cantidad de nitrógeno alfa amino para el metabolismo celular a estas
concentraciones.
En las corridas experimentales con nitrógeno y sin nitrógeno los resultados de etanol se
comportaron en el rango de 4.88 - 9.84 % y 4.95 - 9.56% respectivamente. En ninguno de
los casos se excedió el 10% por lo que se clasificó la cepa de levadura como media
productora de etanol. A partir de los 18 ºBrix los ingresos de alcohol para ambas corridas
no fueron relevantes, pues los efectos osmóticos comienzan a jugar el papel inhibitorio
junto con las concentraciones de alcohol citoplasmáticas. Se ha demostrado que las
membranas citoplasmáticas y de varios organelos son el blanco principal para la inhibición
por etanol (Ingram y Buttke, 1984). El alcohol ocasiona alteraciones en la organización y
permeabilidad de las mismas al afectar su composición lipídica y el funcionamiento de
proteínas de membrana involucradas en el transporte de azúcares y aminoácidos (Lucero
y cols., 1997; Aguillera y Benítez, 1986; Ingram, 1984; Leao y Van Uden, 1984). Estos
cambios en la permeabilidad, causan la fuga de cofactores, coenzimas y nucleótidos
(Mizoguchi y Hara, 1998). La pérdida de estas biomoléculas, esenciales para la actividad
de enzimas involucradas en la glicólisis y producción de alcohol, son suficientes para
explicar el efecto inhibitorio del mismo.
Observemos que en ambas corridas entre 10-16 ºBrix, la producción de alcohol está por
encima de los resultados teóricos planteados , entre 17-21 ºBrix son similares y finalmente
los teóricos sobrepasan los prácticos. Los resultados teóricos son calculados en base a la
concentración de fructosa y glucosa. Se conoce que en la miel existen otros azúcares
fermentables en bajas concentraciones .No obstante, la sumatoria de los mismos puede
incrementar las concentraciones de alcohol práctico por encima de los teóricos de forma
notable, mientras las presiones osmóticas y las concentraciones de alcohol lo permitan.
Una vez aumentados los ºBrix entre 17-21, el incremento de las presiones osmóticas así
como la concentración de alcohol comienzan a ejercer su papel inhibitorio sobre la célula,
el cual se hace máximo al llegar a 21 ºBrix.
En la figura 4 se muestra el rendimiento y las eficiencias de cada fermentación sin
nitrógeno. El valor teórico de rendimiento fermentativo es igual a 64.4%. Como podemos
ver, desde 10 hasta 16 ºBrix los rendimientos se comportan por encima del teórico y las
eficiencias por encima del 100%, desde 17 hasta 19 ºBrix los rendimientos prácticos son
similares al teórico y las eficiencias cercanas al 100%, para 20 y 21 ºBrix los rendimientos
y las eficiencias quedan por debajo del valor teórico. Es lógico que el rendimiento y las
eficiencias se expresen de la misma forma ya que ambos parámetros son directamente
proporcionales al alcohol obtenido. Existe un decrecimiento escalonado tanto del
rendimiento como de las eficiencias: en el primer escalón tenemos 11, 12, 13, 14, 15 y 16
ºBrix, en el segundo 17, 18 y 19 ºBrix y finalmente decrece de forma lineal.
Los rendimientos y las eficiencias de las fermentaciones con nitrógeno se muestran en la
figura 5. Ambos parámetros se encuentran por encima de los teóricos entre 10-16 ºBrix y
a partir este último valor, los mismos están notablemente por debajo del umbral. Esto es
debido al incremento de las presiones osmóticas correspondientes a los carbohidratos de
la miel y a la adición del sulfato de amonio.
Los ºBrix de mayor rendimiento y eficiencia fermentativa que se ajustan a la etapa
experimental fueron 18 y 19. Es conocido el procedimiento de obtención de alcohol etílico
por la vía fermentativa según el método Mell-Bonet. En este método se realiza el
tratamiento previo de la miel (melaza de la caña de azúcar) y el ajuste del mosto entre 18
y 20º Brix en los cuales se obtienen mejores rendimientos y eficiencias fermentativas.
Otro método de obtención del alcohol etílico por vía fermentativa es el de Jacquemine en
el cual se ajusta también el mosto entre 18 y 20º Brix (Sánchez Collazo, 1987).
La tolerancia al etanol es una característica importante en la selección de cepas por su
incidencia en la eficiencia de la producción de alcohol (Gera y Sharma, 1991). La
evaluación realizada al respecto, mostró que la producción de etanol así como la
disminución del ºBrix aparente de todas las cepas se afectó con el incremento de las
concentraciones de alcohol en el medio. Este efecto inhibitorio se hizo más evidente a
partir de 8% en lo adelante, haciéndose nula la actividad celular después del 13% como lo
muestra el gráfico 6. Al respecto, comparada con otros eucariontes, el género
Saccharomyces spp. se muestra como el más alcohol resistente, ya que es capaz de
crecer en concentraciones etanólicas de hasta un 12-20 % (Mizogrchi, 1998; Dieren,
1996; Price, 1995).
Como podemos observar entre los valores de 1 y 4 hay una caída drástica en cuanto a la
actividad celular lo cual se repite a partir del 8% de etanol inicial en el medio. No siendo
de este modo entre los valores 4 y 8% lo cual existe una meseta que demuestra la
estabilidad en la actividad celular dentro de esos valores.
El etanol ejerce influencia negativa sobre muchos componentes y eventos intracelulares.
Dentro de estos, podemos citar la inhibición y desnaturalización de varias proteínas
internas y enzimas glicolíticas, la inhibición del flujo de protones inducidos por glucosa, así
como la inducción de una acelerada reentrada pasiva de protones (Juroszek, Fenillat y
Charpentier, 1987; Cartwright y cols.,1986; Nagodawithana; Whitt y Cutala,1977;
O'Connor, 1991).
Tabla 1 Control de la calidad de la miel utilizada y azúcares fermentables más comunes

Parámetros Normas
Resultados
de control Cubanas
Diastasa U.Gothe 18.24 >20
HMF mg/kg miel 23.44 <20
% Humedad 17.8 <=20
Acidez libre meq/kg 22.41 <=40
%Fructosa 37.64 -------
%Glucosa 29.20 -------
%Sacarosa nd <5%
 %Maltosa 1.08 -------
%Turanosa 1.08 -------
% Reductores T. 69.7 >65 %
% Sólidos solubles 80.4

Tabla 2 Control del ºBrix antes y después de las fermentaciones

ºBrix
Inicial Final Aparentre
normal con SO4(NH4)2 con SO4(NH4)2 sin SO4(NH4)2
10 12.4 6 3.4
11 13.2 6.2 3.9
12 14.3 6.3 4.3
13 15.1 6.9 4.9
14 15.8 7.4 5
15 16.9 8 5.4
16 17.8 8.1 5.8
17 18.7 9 6
18 19.6 9.5 6.9
19 20.4 10.3 7.1
20 21.5 10.7 7.9
21 22.4 11.6 8.1

Tabla 3 Azúcares Controlados

ºBrix % F m/v % G m/v % F+G m/v
10 3.70 2.59 6.29
11 4.03 2.84 6.87
12 5.34 3.74 9.08
13 5.83 3.72 9.55
14 6.18 4.37 10.55
15 6.47 4.67 11.14
16 6.89 4.89 11.78
17 7.82 5.63 13.45
18 8.47 5.97 14.44
19 8.60 6.31 14.91
20 9.23 7.01 16.24
21 10.49 7.37 17.86
Figura 1 Azúcares finales en la fermentación sin nitrógeno

Figura 2 Azúcares finales en la fermentación con nitrógeno

Figura 3 Etanol teórico y práctico de las fermentaciones con nitrógeno y sin nitrógeno

Figura 4 Rendimiento y eficiencias en las fermentaciones sin nitrógeno

Figura 5 Rendimiento y eficiencias en las fermentaciones con nitrógeno
Gráfico 6 Alcohol producido durante la fermentación. Conclusión a diferentes
concentraciones de etanol inicial en el medio

Concluciones

En nuestro estudio, la cepa se evaluó como media productora al alcohol así como
resistente al mismo, mostrando los mayores rendimientos y eficiencias fermentativas a los
18 y 19 ºBrix. La adición de sulfato de amonio ejerce un efecto positivo como fuente de
nitrógeno pero a la vez incrementa, a la concentración utilizada, las presiones osmóticas
del medio lo que actúa como efecto negativo. Los efectos se anulan entre sí por no existir
un incremento del rendimiento y la eficiencia fermentativa que puede estar dado también
por la presencia de suficiente nitrógeno alfa amino en la miel utilizada que surta el fuego
metabólico de la célula durante la fermentación.
Recomendaciones
Recomendamos el estudio de la misma fuente de nitrógeno pero a concentraciones
inferiores.
Continuar el estudio con otras cepas en busca de resultados más prometedores.

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