Noţiuni generale

Prezentul suport de curs este destinat pregătirii studenţilor anului II de

la Facultatea de Horticultură, Specializarea Ingineria şi Protecţia Mediului
în Agricultură, în conformitate cu Fişa disciplinei din Planul de învăţământ
aferent programului de studii sub titulatura Noţiuni de Biologie II:
Microbiologie.
Sper că în afară de cultura generală de microbiologie şi de noţiunile de
bază din domeniul microbiologiei, studenţii vor putea dobândi şi o
înţelegere holistică asupra microorganismelor şi, cel mai important, că vor
înţelege rolul şi importanţa controlului microbiologic, aşa cum este prevăzut
în legislaţia sanitară europeană şi naţională. La terminarea cursului, studenţii
vor căpăta:
 Competenţe profesionale privind explicarea
mecanismelor, proceselor şi efectelor generate de prezenţa
principalelor grupe de microorganisme, care determină şi
influenţează starea mediului, precum şi identificarea şi utilizarea
tehnologiilor instrumentale necesare pentru monitorizarea
principalelor grupe de microorganisme;
 Competenţe transversale privind identificarea şi
respectarea normelor de etică şi deontologie profesională, asumarea
responsabilităţilor pentru deciziile luate şi a riscurilor aferente.
Scopul cursului de Microbiologie
Studierea proceselor fizice, chimice şi biologice legate de activitatea
microorganismelor în scopul:
 păstrării şii folosirii celor utile
 anihilării celor dăunătoare.
Obiectivul general al disciplinei constă în cunoaşterea principalelor
categorii de microorganisme - caracteristici morfologice, metabolice şi de
reproducere - cu importanţă în domeniul protecţiei mediului.
Obiectivele specifice ale disciplinei vizează:
 Cunoaşterea grupelor de microorganisme, asemănări şi
deosebiri între Procariote si Eucariote;
 Caracterizarea principalelor grupe de microorganisme
(virusuri, bacterii, ciuperci) şi interrelaţiile dintre acestea cu
implicaţii în protecţia mediului;
 Insuşirea tehnicilor microbiologice de sterilizare şi asepsie ;
 Formarea deprinderii de a executa şi interpreta preparatele
microscopice;
 Cunoaşterea tehnicilor de izolare şi identificare a germenilor
microbieni.
1
 Microbiologia (micro = mic; bios = viată) – este o ramură a biologiei,
care se ocupă cu studiul microorganismelor, a celor mai mici vieţuitoare,
vizibile doar cu microscopul. Studiază, în principal, particularităţile
morfologice, fiziologice, biologia, sistematica lor, ereditatea şi
variabilitatea, originea, evoluţia şi răspândirea lor în natură, ca şi relaţiile
ecologice dintre microorganisme. Microorganismele mai sunt denumite
microbi – de la grecescul „mikros”= mic şi „bios”= viaţă; o altă denumire
dată este de germen – microorganisme capabile de multiplicare. Noţiunea de
“microb” a fost introdusă de Sedillot (l878), cu sensul ei ştiinţific: micro +
bios = viaţă scurtă. Termenul s-a păstrat şi a dat numele domeniului
Microbiologiei.
Principalele grupe de microorganismele sunt:
 alge,
 fungi microscopici: levuri şi mucegaiuri
 bacterii,
 protozoare,
 virusuri.
Microorganismele sunt ubicuitare, majoritatea nepatogene, unele
condiţionat patogene, un mic procent patogene, cu rol important în natură,
industrie, agricultură, medicină etc. Au dimensiuni microscopice,
dimensiunile lor se exprimă în µ (microni), iar cele ale organitelor lor în nm
(10-9m) sau chiar în Å (ångström) (10-10m).
µ = unitate de măsură pentru lungime, egală cu o milionime dintr-un
metru: 1 µ = 10-3 mm = 10-4 cm = 10-6 m.
1 nm = 10-9 m.
1 Å (ångström) = 10-10 m = 0,1 nm = 0,0001/μm.

Ramuri şi subdomenii:
- după natura microorganismelor studiate:
– Bacteriologie (bakterion = bastonaş) - studiază bacteriile
– Micologie (mykos = ciupercă) - studiază ciupercile microscopice
– Virusologie = inframicrobiologia – studiază virusurile
- Protozoologie - studiază protozoarele
– Parazitologie -
- Algologie - studiază algele

2
 - după mediul în care se dezvoltă microorganismele: microbiologia
solului, hidromicrobiologia, geomicrobiologia, microbiologia marină,
microbiologia cosmică
- după aplicaţiile practice:
- imunologia, microbiologia sănătăţii publice şi epidemiologice,
microbiologia alimentelor microbiologia veterinară, microbiologia
petrolului, microbiologia mediului, microbiologia industrială, agricolă,
medicală, biotehnologia, ingineria genetică
Rolul pozitiv al microorganismelor
- Producere de oxigen: cianobacterii
- Circulaţia biologică a materiei în natură: saprofiţi
 ciclul- unor elemente: C, N, S, P, Fe
 CO2 atmosferic + apă + substanţe minerale din sol = sinteza
substanţelor organice = hrană animale, om = moarte = substanţe organice în
sol = descompunere în produşi simpli de microorganisme
- Activitate geologică: formarea de zăcăminte petroliere, cărbuni,
salpetru,sulf,minereuri de fier
- Activitate în mediul marin: asigură circuitul elementelor biogene
În industrie: fabricarea alcoolului etilic,vinificaţie, industria berii,
panificaţie, produse lactate: iaurt, lapte acru, brânzeturi, murături,
prelucrarea inului, cânepii
Protectia mediului: descompun deşeurile rezultate din activitatea
industrială
În agricultură: îngrăşăminte
În industria medicamentului: biosinteza microbiană a vitaminelor B1,
B2, B12, C, A, D2 substanţelor antibiotice
În medicină: inginerie genetică, genă bacteriană, umană, animală, de
la plante – inoculate la bacterii sau ciuperci – informaţie suplimentară –
hormoni de creştere – insulină – interferoni – produse utilizate pentru
realizarea de vaccinuri – pe şi în organismul uman trăiesc de 10 ori mai
multe microorganisme decât totalul numărului de celule (epiteliale,
nervoase, musculare etc.) – pe şi în organismul uman trăiesc între 500 –
1000 specii diferite de microorganisme.
Rolul negativ al microorganismelor
- boli ale plantelor, peştilor, animalelor, omului, sărăcirea solului

3
 - pagube economice: degradare microbiană a documentelor de piatră,
acţiune corozivă a metalelor, descompunerea alimentelor, biodeteriorarea
cauciucului, a maselor plastice, a textilelor, a hârtiei, a operelor de artă etc.

Conţinutul cursului:

 Tema 1 - Introducere în microbiologie.

 Tema 2 - Caracterizarea principalelor grupe de microorganisme.

Virusurile

 Tema 3 - Caracterizarea principalelor grupe de microorganisme.

Bacteriile

 Tema 4 - Caracterizarea principalelor grupe de microorganisme.

Ciupercile microscopice: Levurile şi mucegaiurile

4
 Tema 1 - Introducere în microbiologie

Microorganismele alcătuiesc un grup vast, dar destul de eterogen de

organisme, diferite ca morfologie, activitate biologică şi chiar poziţie
sistematică, având însă drept caractere comune dimensiunile microscopice,
ceea ce le face să nu fie observate cu ochiul liber, organizarea unicelulară şi
o structură internă relativ simplă. Din rândul microorganismelor fac parte:
bacteriile, ciupercile microscopice (mucegaiurile şi levurile), algele şi
protozoarele. La lumea microorganismelor s-au alăturat şi virusurile, care
de fapt nu sunt organisme, ci doar entităţi corpusculare infime, invizibile la
microscopul optic, alcătuite din componentele chimice esenţiale şi
definitorii ale organismelor vii (proteinele şi acizii nucleici), dar sunt lipsite
de atributele structurale şi funcţionale ale organizării celulare, lucru ce le
face inapte de a exista autonom şi de a se multiplica în afara unei celule vii,
deci sunt obligate la un parazitism itracelular absolut.
Obiectul de studiu al Microbiologiei îl reprezintă microorganismele.
Microbiologia este ştiinţa cu un domeniu de cercetare foarte larg, din care
cu timpul s-au desprins diviziunile microbiologiei, ca de exemplu
virologie, micologie, parazitologie, bacteriologie etc.
Microbiologia cuprinde mai multe diviziuni care corespund diferitelor
domenii de studiu divizate după diferite criterii, după cum urmează:
 criterii taxonomice (bacteriologia, virologia, algologia,
micologia, protozoologia);
 criterii funcţionale (fiziologia, biochimia, ecologia, genetica
microorganismelor);
 criterii legate de mediul în care se dezvoltă
microorganismele (microbiologia solului, hidromicrobiologia,
geomicrobiologia);
 criterii legate de aplicaţiile practice ale diferitelor categorii
de microorganisme (microbiologia industrială, medicală,
biotehnologia).
Principalele diviziuni ale microbiologiei legate de ştiinţele pământului
sunt:
Microbiologia solului - care studiază ansamblul microorganismelor
din sol.
Hidromicrobiologia - care studiază microorganismele din mediile
acvatice şi rolul lor în lanţurile trofice.

5
 Geomicrobiologia - care studiază, în principal, microbiologia
petrolului, respectiv rolul microorganismelor în geneza petrolului şi a
zăcămintelor minerale, posibilitatea utilizării acestora în exploatarea,
biodegradarea sau recuperarea petrolului şi zăcămintelor. Prin aceasta
geomicrobiologia are un pronunţat caracter utilitar.

SCURT ISTORIC
Din cele mai îndepărtate vremuri există descrieri ale unor boli care au
provocat un interes deosebit, datorită gravităţii lor şi mai ales ale modului în
care se propagă, făcând un mare număr de victime în comunităţile umane
sau printre animale. Astăzi ştim că asemenea boli sunt provocate de
microorganisme. Această cunoaştere a fost posibilă ca urmare a construirii
unui instrument optic care să ofere posibilitatea observării
microorganismelor în vederea descrierii lor - microscopul. Aşadar,
microbiologia este o ştiinţă tânără. Până la imaginarea microscopului,
asemenea boli erau considerate ca manifestări ale mâniei divine şi drept
urmare nu se puteau vindeca decât cu ajutorul jertfelor şi rugăciunilor.
Asemenea idei au fost treptat abandonate şi s-a trecut la încercarea unor
explicări ştiinţifice, bazate pe observaţii şi interpretări realiste, desigur în
limitele cunoştinţelor existente în epoca respectivă.
Hipocrate (400 î.e.n.) întemeietorul medicinei, consideră doi factori
responsabili de aceste boli: unul intrinsec, reprezentat de contribuţia
bolnavului şi altul extrinsec, constând dintr-o alterare necunoscută a aerului,
care devine prin el însuşi, nociv. Această primă ipoteză asupra etiologiei
bolilor infecţioase a persistat multă vreme sub forma teoriei miasmelor (de
la grecescul miasma - emanaţie putredă, murdărie).
Varon (100 î.e.n.) îmbrăţişează o varintă mai corectă, considerând că
alterarea aerului (malaria - aer rău) este determinată de animale foarte mici,
invizibile care pătrund în organism prin gură şi prin nări.
Giorlomo Fracaster (1488-1553) încearcă să înlăture aceste
concepţii, intuid una dintre caracteristicile esenţiale ale bolilor produsă de
microorganisme şi anume, contagiozitatea lor. El arată că infecţia este
aceeaşi pentru cel care a primit-o şi pentru cel care a dat-o şi că ea este
produsă de particule mici şi imperceptibile (seminaria morbi), care trec de
la un animal bolnav la altul sănătos. Concepţia pur ipotetică, nu s-a putut
impune, motiv pentru care legătura între boală şi un agent microbian s-a
făcut abia în epoca pasteuriană, când a fost dovedită şi experimental. Primul
microscop compus care însă nu a fost folosit pentru studiul
microorganismelor, a fost construit în jurul anului 1590 de fraţii Zaccharias
şi Hans Jansen din Middeburg şi avea o lungime de aproape 2 metri. Galileo

6
Galilei, după 1610, construieşte un instrument similar. Denumirea de
microscop pare a fi creată de Demisciano de la Academia dei Lincei (1614)
sau de Johannes Faber Bon Bamberg. Francis Bacon (1516-1629) în opera
sa “Novum Organon“ (1620) numea noul dispozitiv perspicillum.
Descoperirea microorganismelor se datorează lui Antonie Van
Leeuwenhock (1632-1723), care folosind ca microscop un sistem de lentile
biconvexe de construcţie proprie, cu o putere de mărire de 40-275x şi un
sistem de iluminare probabil de tipul “câmp întunecat”, observă şi descrie
spermatozoizii, armături bucale şi ochi de insecte, solzi de pe aripile
fluturilor, protozoare, alge, levuri şi bacterii care le denumeşte animacula.
Desenele, ca şi descrierea microorganismelor observate în diferite preparate
microscopice de salivă, puroi şi apa de canal, le publică în lucrarea ”Arcana
naturae ope microscopiorum detecta” (Tainele naturii descoperite cu
ajutorul microscoapelor) în anul 1675. Deşi descoperirile lui Leeuwenhock
au stârnit admiraţia şi interesul oamenilor de ştiinţă, studiul
microorganismelor a rămas în continuare empiric şi pur descriptiv,
constituind doar o preocupare a amatorilor de curiozităţi ale naturii, în felul
acesta se acumulează numai date disparate cu privire la forma, structura,
mărimea, multitudinea şi distribuţia în natură a acestor microorganisme.
Celebrul botanist Carl Lineaux încearcă în opera sa “Systema
naturae” (1735), o grupare sistematică a vieţuitoarelor cunoscute, reunind
toate microorganismele într-un singur grup numit semnificativ “Chaos”.
Folosind pentru prima dată metode experimentale, M.M. Terehovski
publică în anul 1775 lucrarea “De chao infusorii linnaei”, în care
demonstrează că fiinţele foarte mici, observate în diferite infuzii bogate în
substanţe organice, cresc, se divid şi se mişcă datorită unor forţe interne
proprii, ajungând la concluzia că aceste microorganisme sunt adevărate
animale în miniatură. Primele lucrări de microbiologie experimentală, sunt
legate de problema generaţiei spontanee şi se datorează lui J.T. Needham
(1713-1781) şi lui L. Spallanzani (1729-1799).
Microbiologia ia naştere ca ştiinţă prin lucrările marelui savant francez
Louis Pasteur (1822-1895). Principiile stabilite de el stau şi azi la baza
acestei ştiinţe şi se fac descoperiri de o importanţă teoretică şi practică
fundamentală. Primele cercetări, Pasteur, le-a consacrat disimetriei
moleculare a cristalelor de acid tartric. El stabileşte că există un raport între
morfologia cristalelor hemiedrice, caracterizate prin prezenţa unor faţete
disimetrice şi capacitatea lor de a roti planul luminii polarizate. A observat
că în amestecul racemic, inactiv din punct de vedere optic, se dezvoltă un
mucegai (Penicillium glaucum), soluţia devine optic activă, deviind de astă
dată spre stânga planul luminii polarizate. Mucegaiul consumă, prin urmare,

7
izomerul dextrogir, lăsând intact pe cel levogir, ce poate fi izolat în stare
pură. Această descoperire ce furniza un procedeu simplu de separare a
izomerilor optici a mai demonstrat şi intervenţia unei caracteristici fizice
(disimetria moleculară) în fenomenele chimice ale vieţii. Cel mai important
lucru îl constituie faptul că a atras atenţia lui Pasteur asupra unui fenomen
spre care se va îndrepta în continuare curiozitatea lui de cercetător şi anume:
microorganismele produc transformări ale substanţelor organice printr-o
activitate fiziologică selectivă, foarte specifică. O altă problemă
fundamentală abordată de Pasteur, a fost natura biologică a fermentaţiilor,
ce constituia în acea vreme, un subiect de controversă ştiinţifică. Concepţiile
lui Cognard Latour (1836), Schwann şi Cutzing (1837) ce susţineau că
globulele din mustul de strugure şi din soluţiile zaharate sunt organisme vii
(levuri), nu izbutiseră să se impună din cauza criticilor lui Berzelius, Liebig
şi Wòhler, care considerau fermentaţiile fenomene pur chimice (Popa Aurel,
Teodorescu Ştefan - 1989).
În legătură cu fermentaţiile vinului şi berii, Louis Pasteur, prin
cercetările întreprinse ajunge la următoarele concluzii fundamentale:
1. fermentaţiile sunt procese biologice determinate de acţiunea unor
microorganisme anaerobe (capabile să se dezvolte în lipsa oxigenului din
aerul atmosferic), deci fermentaţia este viaţă fără aer;
2. fiecare tip de fermentaţie este produs de un anumit microorganism,
care este specific, în sensul că determină o anumită transformare a mediului
pe care creşte;
3. dezvoltarea unui microorganism străin în mediul unde acţionează
un microorganism cu acţiune fermentativă specifică, deviază cursul normal
al fermentaţiei în dauna calităţii (prin apariţia de compuşi noi nedoriţi) şi a
randamentului ei, în produs util, determinând o aşa numită boală a
fermentaţiei;
4.microorganismele străine “contaminante” provin din aer, de pe
vasele sau din ingredientele folosite în producţie, putând fi distruse prin
încălzire.
Până la Pasteur, ideea participării microorganismelor la determinarea
unor boli, era respinsă, ca nefiind probată pe cale experimentală. Pasteur
extinde noţiunea de specificitate din domeniul fermentaţiilor, în acela al
patologiei omului şi animalelor, în sensul că orice boală infecţioasă este
rezultatul activităţii vitale al unui anumit microorganism specific, care se
dezvoltă ca parazit în organismul animal respectiv. Nu târziu după aceea,
C.J. Davaine demonstrează cel dintâi, rolul patogen al unei bacterii prin
descoperirea bacilului cărbunelui care provoacă boala numită cărbune sau
dalac. Cercetările ulterioare ale lui Pasteur au pus în lumină principiul

8
vaccinării şi stabilirea bazelor ştiinţifice ale preparării vaccinurilor,
contribuind în acelaşi timp la descoperirea fenomenului de imunitate.
Primul vaccin folosit în practică, a fost cel antivariolic, preparat de
medicul englez Edward Jenner (1749-1823). În anul 1796 acesta confirma
prin eficacitatea inoculării pe cale cutanată la om a unui preparat de “pulpă
vaccinală“ - observaţia sa, iniţial întâmplătoare, că în urma contactului
accidental al tegumentului mâinilor cu pustulele de pe ugerul vacilor
bolnave de vaccină, se produsese o infecţie uşoară, în urma căreia
organismul uman capătă o rezistenţă solidă faţă de îmbolnăvirea de variolă,
boala foarte gravă şi deseori mortală a omului. Cu toate implicaţiile practice
ale acestei descoperiri, ea a rămas fără ecou din punct de vedere ştiinţific,
fenomenul pe care-l punea în evidenţă, rămas neexplicat, fiind considerat ca
particular. Studiind boala holera găinilor, Pasteur observă că agentul ei
patogen îşi pierde complet, prin învechirea culturii, capacitatea sa specifică
de a produce această boală, adică devine avirulent. Inoculată la păsări
sănătoase, cultura avirulentă le conferă însă rezistenţa faţă de holeră, în
sensul că ele nu se mai îmbolnăvesc nici dacă sunt infectate cu o cultură
proaspătă, virulentă. Păsările vaccinate au devenit imune (sunt apărate) în
urma contactului lor prealabil cu agentul patogen specific lipsit de virulenţă.
Astfel Pasteur pune bazele ştiinţifice ale vaccinării, care au permis
extinderea ei ca procedeu de prevenire a infecţiilor. Pe aceelaşi principiu - a
cărui descoperire i-a sugerat şi ideea (foarte fecundă) variabilităţii
microorganismelor, sub acţiunea unor condiţii de mediu defavorabile -
Pasteur a mai preparat şi utilizat cu succes vaccinul anticărbunos (1881),
apoi vaccinul antirabic (1885), fapt deosebit de important din punct de
vedere practic, mai ales în ceea ce priveşte acesta din urmă, deoarece virusul
care produce turbarea, boală până atunci incurabilă, nu putuse fi pus în
evidenţă de Pasteur din cauza insuficienţei mijloacelor tehnice din aceea
vreme. Pasteur este acela care rezolvă în mod decisiv problema generaţiei
spontanee. Teoria generaţiei spontanee, conform căreia “din materie lipsită
de viaţă pot lua naştere plante şi animale”, a apărut în antichitate, aşa cum
reiese din scrierile lui Aristotel şi Pliniu cel Bătrân. Ea a continuat să fie
admisă până la sfârşitul Renaşterii, când a fost parţial abandonată. Chiar mai
târziu, în secolul al XVIII-lea, în timp ce studiul plantelor şi animalelor
aduce dovezi fără echivoc împotriva ei, primele cercetări efectuate pe
microorganisme îi ofereau, dimpotrivă, argumente favorabile.
Ignorarea, pe atunci, a unor principii esenţiale, care mai târziu au stat
la baza microbiologiei experimentale, în special în ceea ce priveşte
sterilizarea (distrugerea germenilor preexistenţi de pe meterialele de lucru şi
din mediile de cultură) şi asepsia (împiedicarea contaminării cu germeni din

9
afară în timpul lucrului) au făcut posibilă concluzia falsă că
microorganismele pot lua naştere, prin organizarea spontană a substanţelor
organice din produsele supuse fermentaţiei sau panificaţiei. Folosind
baloane speciale - baloane cu gât de lebădă - Pasteur demonstrează că un
mediu de cultură sterilizat, în speţă bulionul de carne, poate rămâne steril
timp indefinit, dacă se evită contaminarea lui cu germeni din aer. Dacă, prin
înclinarea unui asemenea balon, mediul spală porţiunile incubate ale gâtului
rămas descoperit, porţiuni unde s-au sedimentat bacterii din aer, bulionul se
infectează. Faptul că în baloanele cu mediu steril închise ermetic, nu apar
niciodată microorganisme, în timp ce aceelaşi mediu se infectează dacă este
lăsat în contact cu aerul, dovedeşte că microorganismele nu iau naştere
spontan din materia organică neanimată, ci numai se înmulţesc în ea,
pornind de la organisme similare provenite din mediul înconjurător (fig. 1).

Fig. 1. Flacoane cu ”gât de lebădă” folosite de Pasteur

în experienţele sale asupra generaţiei spontanee

Pentru denumirea microorganismelor microscopice, Pasteur a adoptat

termenul de "microb" creat de Sedilton, termen de altfel incorect, deoarece
sensul său este "viaţă scurtă" şi nu "dimensiuni mici". Denumirea s-a păstrat
şi noua ştiinţă, având ca obiect studiul microbilor, a rămas cu numele de
Microbiologie.
Robert Koch (1843-1916) aduce contribuţii valoroase, de ordin
tehnic şi teoretic, la dezvoltarea microbiologiei. El introduce în tehnica
microbiologică, utilizarea mediilor de cultură solidificate (pe atunci, cu
gelatină) pe care creşterea microorganismelor se fac sub formă de colonii
izolate, dacă suspensia folosită pentru însămânţare este suficient de diluată.
O colonie microbiană reprezintă de obicei descendenţa unei singure celule
parentale, ca urmare însămânţarea ei ulterioară într-un mediu steril,
generează o cultură de celule din aceeaşi specie sau tulpină. Obţinerea
culturilor pure a constituit o mare descoperire, un progres care a stat la baza
microbiologiei moderne, oferind un mijloc simplu şi sigur de izolare al
bacteriilor, în vederea studierii particularităţilor lor de specie şi a biologiei
lor, a identificării şi a încadrării lor sistematice.În laboratorul lui Koch au
10
fost transpuse, în practica microbiologică, tehnicile de coloraţie cu coloranţi
de anilină, folosiţi în histologie, ceea ce a uşurat şi a îmbogăţit cu noi
mijloace studiul microscopic al morfologiei bacteriene.Pe lângă faptul că a
descoperit mai multe specii de bacterii patogene, între care bacilul
tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis sau bacilul lui Koch) şi vibrionul
holerei. El a stabilit în urma cercetărilor experimentale pe animale, criteriile
indispensabile pentru ca un microb izolat dintr-un organism afectat de o
anumită boală, să poată fi considerat în mod justificat ca agentul cauzal al
bolii respective. Aceste criterii sunt cunoscute sub denumirea de
"postulatele lui Koch":
1 - microorganismul incriminat să poată fi totdeauna pus în
evidenţă în leziunile care i se atribuie;
2 - să poată fi obţinut în culturi pure, pe medii artificiale;
3 -cultura lui pură, inoculată, la un animal receptiv să producă
leziuni specifice, din care agentul patogen să poată fi reizolat.
Postulatele lui Koch au reprezentat şi reprezintă încă, un principiu
eficace de lucru, a cărui respectare previne interpretările eronate în materie
de diagnostic bacteriologic sau de identificare a unor noi agenţi patogeni
infecţioşi.
Ilia Ilici Metchnikoff (1845-1916), biolog rus, lucrând la Institutul
Pasteur a studiat digestia intracelulară la echinoderme. Urmărind soarta unor
particule de carmin adăugate în mediul unde erau întreţinute aceste animale,
observă că anumite celule prin activitatea lor generală sunt capabile să
capteze şi să înglobeze granule fine de carmin, ca şi alte particule cu care
vin în contact. Plecând de la această observaţie, emite ipoteza că celulele cu
funcţie asemănătoare, denumite de el fagocite, adică "celule care mănâncă"
ar putea exista şi în organismul altor animale, cărora le determină rezistenţa
faţă de infecţie prin încorporarea şi digestia intracelulară a
microorganismelor patogene pătrunse în mediul intern. Ulterior, în anul
1884, studiind infecţia crustaceului "Dalphia magna" cu ciuperca
Monospora bicuspidata numită azi în onoarea sa "Metschnikowia", el
observă că sporii aciculari ai levurii pătrund odată cu hrana în tubul digestiv
al Daphniei, de unde străbătând peretele acestuia trec în cavitatea generală a
animalului, unde sunt atacaţi de celulele mobile care se deplasează prin
mişcări ameoboide, numite ameobocite. Dacă infecţia este moderată,
ameobocitele înglobează şi digeră toţi sporii ciupercii şi aşa crustaceul
supravieţuieşte. Metchnikoff extinde aceste observaţii la animalele
superioare şi la om, demonstrând prezenţa şi importanţa celulelor cu
proprietăţi fagocitare, în reacţiile de apărare ale organismului faţă de
bacteriile patogene, punând astfel bazele unei ştiinţe noi "IMUNOLOGIA".

11
 Buchner (1897) confirmă rezultatele cercetărilor lui Pasteur asupra
fermentaţiilor şi le completează cu date noi. El demonstrează că şi extractul
acelular obţinut din celulele drojdiei de bere, după dezintegrarea lor prin
sfărâmarea în mojar cu nisip, poate produce fermentaţia zahărului la alcool
şi dioxid de carbon, datorită sistemului enzimatic complex pe care îl conţine
- zimaza- care este activ şi după izolarea lui din celulele vii.
În anul 1905 Harden şi Yang arată că, în afară de enzimele
termolabile cu molecule mari, extractul de drojdie de bere conţine şi un
factor termostabil cu moleculă mică, absolut esenţial pentru funcţionarea
sistemului enzimatic descris de Buchner. Acest factor este "cozimaza", care
s-a demonstrat că este implicată şi în metabolismul ţesuturilor animale.
Studiul cozimazei levurilor a permis elucidarea mecanismului oxidării
biologice şi a demonstrat că unul şi aceelaşi factor este necesar ca un
component esenţial al proceselor metabolice fundamentale la
microorganisme şi în ţesuturile animale, ceea ce a constituit una dintre
primele demonstraţii ale similitudinii proceselor metabolice de bază la
organismele din întreaga natură vie. Winogradski S. (1856-1953),
întemeietorul microbiologiei solului, lucrând la Institutul Pasteur din Paris, a
descris procesul de asimilare la organismele chimiosintetizante şi fenomenul
de fixare a azotului atmosferic de către microorganisme, elaborând metode
speciale pentru cercetarea activităţii microorganismelor din sol.
Ivanovski (1864-1920), studiind rolul microorganismelor din sol şi
interrelaţiile dintre aceste microorganisme şi plantele superioare,
demonstrează că boala "mozaicul tutunului" este produsă de un agent
patogen, invizibil la microscop, care traversează filtrele bacteriologice şi
care poate fi transmis de la o plantă bolnavă la una sănătoasă, prin
intermediul filtrului acelular al trituratului de frunze cu leziuni. Beijerink
W. M. (1851-1953) este primul cercetător care intuieşte natura deosebită a
agentului patogen descoperit de Ivanovski şi cunoscut azi ca fiind "virusul
mozaicului tutunului", un agent contagios viu, dar necorpuscular. Este
considerat întemeietorul "Virologiei". Aduce de asemenea contribuţii foarte
importante la cunoaşterea biologiei microorganismelor fixatoare de azot.
Alexander Fleming (1881-1955) deschide prin lucrările lui "era
antibioticelor" de o importanţă excepţională în medicină şi biologie. În anul
1929 el observă că unele culturi ale "mucegaiului Penicillium" elaborează o
substanţă cu proprietăţi antimicrobiene specifice - penicilina.

12
 CONTRIBUŢIA CERCETĂTORILOR ROMÂNI
LA DEZVOLTAREA ŞTIINŢELOR MICROBIOLOGICE

Fondatorul microbiologiei româneşti este Victor Babeş, care a condus

prima catedră de învăţământ medical de anatomie patologică şi
bacteriologică. Împreună cu francezul V. Cornil este autorul primului tratat
de bacteriologie apărut în lume: „Les bactéries”, în anul 1885. Victor Babeş
a studiat boli ca turbarea, morva, lepra, holera, tuberculoza, parazitoze şi a
introdus pentru prima dată în ţara noastră tratamentul prin serotapie –
imunizare cu serul provenit de la animale în prealabil vaccinate. Este
considerat unul dintre cei mai mari savanţi, a rămas în microbiologie prin
numeroasele sale descoperiri.
Ioan Cantacuzino a creat o şcoală de microbiologie având ca centru
institutul care îi poartă numele, organizând şi dezvoltând activitatea de
producţie a serurilor şi vaccinurilor folosite în combaterea bolilor
infecţioase. În domeniul imunologiei, virusologiei şi microbiologiei
generale, se remarcă savanţii: C. Lavaditi, D. Combiescu, M. Ciucă, Şt.
Nicolau etc. care şi-au consacrat activitatea ştiinţifică, combaterii şi
eradicării unor boli, pentru formarea şi dezvoltarea şcolii contemporane de
microbiologie. Traian Săvulescu (1889-1963) este creatorul şi
îndrumătorul şcolii româneşti de fitopatologie, al imunităţii plantelor faţă de
bolile bacteriene, al clasificării bacteriilor fitopatogene, etc.
RELAŢIILE MICROBIOLOGIEI CU ALTE ŞTIINŢE
Microbiologia a beneficiat în primul rând de aportul marilor
descoperiri din fizică şi chimie. Apariţia sa ca ştiinţă a fost condiţionată de
dezvoltarea cunoştinţelor teoretice de optică şi de construcţia unor sisteme
optice de tipul microscopului. Diferitele descoperiri moderne cu aplicaţiile
lor tehnice ca: electronica, utilizarea izotopilor radioactivi,
spectrofotometria, electroforeza, şi-au găsit aplicaţia în practica
microbiologică. Metodele moderne de biochimie au permis elucidarea
rolului fiziologic, nu numai al celulei în întregul ei, ci şi al diferitelor
structuri descoperite în celula microbiană prin microscopia electronică. La
rândul lor, diferite ştiinţe au beneficiat larg de descoperirile din domeniul
microbiologiei.

13
 BIOLOGIA GENERALĂ utilizează cunoştinţele acumulate în
domeniul microbiologiei, pentru abordarea unor probleme importante ca:
originea, natura şi dezvoltarea evolutivă a protoplasmei. Datele de
microbiologie au contribuit la înfrângerea teoriei referitoare la "generaţia
spontanee".
GENETICA foloseşte bacteriile ca model experimental, deoarece
evoluţia modificării organismului poate fi urmărită pe un număr mare de
generaţii, datorită rapidităţii de diviziune a acestor microorganisme şi
rarităţii proceselor sexuale.
CHIMIA foloseşte microorganismele în separarea izomerilor optici
sau în sinteza lor ca şi la unele determinări sensibile şi specifice ca, de
exemplu, dozarea unor vitamine şi aminoacizi.
BIOCHIMIA şi FIZIOLOGIA au beneficiat de rezultatele cercetărilor
efectuate în microbiologie pentru elucidarea unor aspecte necunoscute ale
metabolismului intermediar, a unor probleme de fiziologie celulară
(respiraţia şi nutriţia celulară), în elaborarea unor concepţii unitare asupra
fotosintezei în natură, etc.
ŞTIINŢELE AGRICOLE folosesc în practică datele furnizate de
microbiologia solului, fie pentru a influenţa evoluţia microflorei naturale, fie
pentru ameliorarea artificială a acesteia prin îngrăşămintele bacteriene.
S-a trecut la o utilizare industrială pe baze ştiinţifice a unor procese
fermentative cunoscute de secole (industria vinului, oţetului şi berii,
panificaţie, industria produselor lactate, topitul plantelor textile).
Clasificarea generala a microorganismelor
Variabilitatea extraordinară a microorganismelor şi capacitatea lor de
adaptare la cele mai diferite condiţii ale mediului ambiant, fac ca lumea
microbiană la nivel planetar să fie deosebit de numeroasă şi greu de
clasificat. Clasificarea biologică a lumii vii propusă de Whittaker (1969),
acceptată de numeroşi taxonomişti cuprinde un sistem de cinci regnuri în
funcţie de modul de organizare celulară şi modalităţi de nutriţie, având
următoarea structură:
- regnul Monera include organisme monocelulare de tip procariot cu
nutriţie de tip absorbtiv, cu metabolism fotosintetic sau chimiosintetic şi
reproducere prin diviziune asexuată;
- regnul Protista include organisme monocelulare de tip eucariot
(inclusiv drojdii). Modul de nutriţie este diferit de la un grup la altul, prin
absorbţie sau ingestie şi reproducere sexuată/asexuată;
-regnul Fungi cuprinde organisme multinucleate de tip eucariot
(mucegaiuri) cu nuclei dispersaţi în citosolul hifelor adesea septate, lipsite

14
de plastide şi pigmenţi fotosintetici, cu nutriţie de tip absorbtiv şi
reproducere pe cale sexuată şi asexuată;
- regnul Plantae , cu organisme multicelulare de tip eucariot, cu
perete celulozic, vacuole în citoplasmă şi pigmenţi fotosintetici în plasmide.
Modul principal de nutriţie este cel fotosintetic şi reproducerea predominant
sexuată;
- regnul Animalia , cu organisme multinucleate de tip eucariot fără
perete celular, cu nutriţie predominant prin ingestie şi reproducere sexuată.
Celula de tip procariot ce aparţine primelor forme de viaţă pe Pământ,
prezintă un nucleoid nediferenţiat, lipsit de membrană nucleară. Molecula
de ADN conţine întreaga informaţie genetică; celula procariotă nu conţine în
citozol organite libere (cu membrană) şi ribozomii au dimensiuni mici. Sunt
puţin diferenţiate din punct de vedere morfologic.
În categoria microorganismelor procariote intră:
 Eubacteriile (bacteriile adevărate).
 Cianobacteriile (bacteriile albastre-verzi sau algele albastre-
verzi).
 Actinomicetele (bacteriile filamentoase, cu organizare de tip
micelian).
 Arhebacteriile (microorganisme foarte asemănătoare din
punct de vedere morfologic şi structural cu bacteriile
adevărate, care se găsesc în medii de viaţă variate şi
corespund bacteriilor extremofile).
 Algele albastre.

Celula de tip eucariot , mai evoluată, prezintă un nucleu bine

diferenţiat în care este inclusă partea predominantă a genomului alcătuit
dintr-un set de cromozomi, care în timpul procesului de înmulţire se
divizează şi se repartizează între celulele rezultate. În cromozomi, ADN-ul
este cuplat cu proteine de tipul histonelor. În celula eucariotă există organe
simple prevăzute cu membrană, iar ribozomii au dimensiuni mai mari decât
la procariote.
În categoria microorganismelor eucariote intră:
 Fungii microscopici, care includ:
 mucegaiurile (fungii filamentoşi);
 levurile (drojdiile).

15
  Algele microscopice superioare (algele verzi şi diatomeele).
 Protozoarele.
Virusurile, care nu sunt clasificate ca organisme vii, sunt studiate tot
în cadrul microbiologiei.
Pentru sistematizarea microorganismelor, se studiază întotdeauna
caracterele morfologice, fiziologice, biochimice etc. ale culturii pure, cultură
ce rezultă prin înmulţire dintr-o singură celulă (sau unitate formatoare de
colonie), în mediu nutritiv steril şi deci cuprinde celule aparţinând unei
singure specii. În clasificări, pe bază de criterii morfologice şi fiziologice
riguroase, stabilite de la general la particular, principalele grupe de
microorganisme componente ale regnurilor citate sunt clasate în diviziuni,
clase şi subclase, ordine, familii, triburi, genuri şi specii. La baza tuturor
clasificărilor este situată specia, produs al evoluţiei materiei vii, ca rezultat
al adaptării la condiţiile existente ale mediului ambiant.
Specia corespunde populaţiei de indivizi cu numeroase proprietăţi
comune, denumite caractere cu specificitate de specie, care le disting de alte
specii. Microorganismele aparţinând unei specii au aceeaşi origine sunt
adaptate la un anumit mediu de viaţă, au metabolism asemănător şi sunt
apropiate între ele prin caractere genetice. Specia la microorganisme este
denumită din două cuvinte, primul fiind numele genului, care include mai
multe specii. Cel de al doilea cuvânt scris întotdeauna cu literă mică, de
obicei defineşte un caracter specific. În cadrul speciei se diferenţiază prin
caractere distinctive limitate, subspecii, tulpini, varietăţi. Genul cuprinde
una sau mai multe specii pe baza unor caractere comune, specifice de gen.
Denumirea genului este în limba latină.
Tribul reprezintă un grup de genuri înrudite.
Familia este un grup de triburi sau genuri înrudite.
Ordinul reprezintă un grup de familii înrudite.
Clasa reprezintă gruparea ordinelor înrudite.

16
 Sistematica generală a microorganismelor
Tabel 1
Supraregn Ramură Grupe
Regn
Caractere generale (diviziune) importante
EUCARIOTAE MICETALIA EUMYCOTA 1. Micomicet
Nucleu definit, separat (MYCOTA) (FUNGI) (ciuperci
prin membrană de citozol ; microscopice)
- ADN + histone în 1.1. Monocelulare:
cromozomi ; drojdii, mucegaiuri
- ADN în mitocondrii şi inferioare;
plasmide 1.2.Pluricelulare :
mucegaiuri
superioare (cu
miceliu septat);
2.Macromicete:
ciuperci comestibile

Alge verzi-albastre
surse
ALGE neconvenţionale de
proteine
PLANTAE
Monocelulare, din
care patogene:
Giardia,
PROTOZOARE Trichomonas,
Plasmodium.
ANIMALIA
II. PROCARIOTAE BACTERIA SCOTOBACTERIA Bacterii,
- ADN în citozol actinomicete.

- lipsă organite libere Mycoplasme (bacterii

PHOTOBACTERIA fără perete celular,
patogene)
Bacterii
fotosintetizante
III. VIRA PROTOVIRA RIBOVIRA Virusuri ce conţin
-particule infecţioase EUVIRA DEOXYVIRA ARN
acelulare Virusuri ce conţin
ADN

17
 Prioni-patogeni
transmisibili, agenţi
ai îmbolnăvirilor
degenerative ale
sistemului nervos
central

Tema 2. Caracterizarea principalelor grupe de microorganisme.

Virusurile

Importanţa studiului virusurilor - datorită rolului pe care îl deţin în

producerea diverselor boli la bacterii, plante, animale şi om. Numeroase
virusuri produc boli de o gravitate deosebită ca febra aftoasă, pesta porcină,
pesta ovină sau poliomielita, febra galbenă şi altele la om. Dacă bolile
produse de către bacterii sunt oarecum stăpânite, virozele sunt mult mai
dificil de prevenit şi de combătut, numărul virozelor cu etiologie încă
neprecizată creşte în permanenţă.
ISTORIC - Deşi bolile virale, datorită manifestărilor lor evidente şi
uneori foarte grave, au fost cunoscute din cele mai vechi timpuri, primele
cunoştinţe referitoare la virusuri sunt de dată relativ recentă (sfârşitul
secolului al XIX-lea). Denumirea de virus derivă, după Seifferd, de la
cuvantul grec “ios” folosit iniţial pentru a desemna generic substanţele
otrăvitoare produse de organismele vii, aşa cum este veninul de şarpe (de
aici latinescul virus-venin). Încă din anii 2500 î.e.n. în China existau
descrieri ale variolei umane, iar Aristotel (384-322 î.e.n.) afirmă că “rabia”
(turbarea) este transmisă prin muşcătura de câine. Cât priveşte lumea
vegetală, bolile virotice ale plantelor au făcut obiect al cercetărilor mult mai
târziu, fiind menţionat anul 1720 când Crave demonstrează, fără a fi
descoperit agentul patogen, posibilitatea transmiterii mozaicului panaşat al
lalelelor prin grefă la o plantă sănătoasă. Datorită lipsei mijloacelor optice
perfecţionate, Pasteur este obligat să admită existenţa unui microb al
turbării, dar fără a-l putea decela, descoperind, în perioada 1881-1885
vaccinul antirabic. Beijerinck (1898) adaugă la acestea rezistenţa
îndelungată (2 ani) în frunzele uscate şi difuzibilitatea în agar, denumind
virusurile „contagium virum fluidum”, iar nu microorganisme, precum şi
18
19
faptul că acestea sunt capabile să se multiplice în celula vie odată
încorporate în citoplasma acesteia. Beijerinck devine astfel, primul
cercetător care a intuit natura deosebită a virusurilor faţă de alţi agenţi
patogeni. Meritul de a fi definit particula virală matură – virion – a
principalelor particularităţi ale virusurilor permiţând astfel delimitarea lor de
lumea microorganismelor, revine lui Andre Lwoff (1953). El a definit
virusurile ca „entităţi infectante nucleoproteice, potenţial patogene,
posedând un singur tip de acid nucleic şi care se reproduc prin materialul
lor genetic. Ele sunt incapabile de creştere, diviziune, nu-şi pot sintetiza un
sistem propriu de energie, având nevoie pentru a se reproduce de ribozomii
celulei-gazdă pe care o parazitează.” Ivanovski, 1892, a descoperit virusul
VMT contagium viu corpuscular – un virus filtrabil deoarece extractul din
frunte bolnave a rămas infecţios şi după ce a fost trecut printr-un filtru
bacterian. Ca urmare a marilor descoperiri în domeniul tehnicii
(microscopia electronică, ultracentrifugarea) a fost posibilă izolarea,
purificarea şi studiul complex al virusurilor, ca şi evidenţierea
particularităţilor reacţiilor dintre virusuri şi organismele gazdă.
Definiţia şi caracterele generale ale virusurilor
Virusurile sunt o categorie specifică de agenţi infecţioşi, structural şi
fiziologic diferiţi de celelalte microorganisme cunoscute. Sunt entităţi
infecţioase, în general submicroscopice, având în structura lor un singur tip
de acid nucleic (ADN sau ARN) strict parazite intracelular şi potenţial
patogene. Nu dispun de echipament enzimatic, deoarece sunt metabolic
inerte şi capabile de creştere şi multiplicare prin diviziune. Ele nu se pot
înmulţi decât în celulele vii pe care le parazitează şi al căror metabolism îl
deviază în sensul sintezei de constituienţi virali. Virusurile pot exista în trei
stări distincte: virion, virus vegetativ, provirus.
VIRIONUL (virusul infecţios matur) este o entitate complexă şi
organizată. Complexitatea este dată de prezenţa în structura sa a două
componente: una genetică, reprezentată de un acid nucleic (ADN sau ARN,
dar niciodată amândouă) este partea care poartă informaţia genetică
necesară pentru multiplicare şi alta negenetică, de natură proteică, absolut
necesară pentru exprimarea naturii virale a sistemului. Caracterul organizat
al virionului ţine de faptul că relaţiile spaţiale dintre cele două tipuri de
constituienţi sunt definite şi constante. Virusurile au două atribute în comun
cu organismele: caracterul organizat şi complex al structurii lor şi
capacitatea de replicare (de a face copii exacte) a acestei arhitecturi

20
structurale, conform informaţiei codificate în acidul lor nucleic. Se
deosebesc însă de organisme prin câteva trăsături fundamentale:
- au un singur tip de acid nucleic;
- genomul viral conţine aproape exclusiv instrucţiuni pentru
replicarea acidului nucleic al particulei virale şi pentru sinteza proteinelor
sale, fiind lipsit de informaţia necesară pentru elaborarea enzimelor;
- lipsind echipamentul enzimatic propriu, virionul este lipsit de
metabolism şi incapabil să crească şi să se dividă ca bacteriile;
- reproducerea particulei virale se face pornind numai de la materialul
ei genetic, în timp ce microorganismele se reproduc pornind de la ansamblul
integrat al constituienţilor lor celulari;
- pentru sinteza proteinelor virale, genomul viral foloseşte ARN,
enzimele, ribosomii şi materialul de construcţie (aminoacizii) aprţinând
celulei-gazdă (parazitism absolut) spre deosebire de bacteriilor parazite
intracelular, care folosesc pentru biosinteză proprii lor constituienţi celulari;
- unităţile proteice care îmbracă genomul viral sunt organizate într-un
sistem care prezintă o simetrie de tip helical, de tip cubic sau de tip
combinat (cubic+helical), care nu există la microorganisme;
- spre deosebire de microorganisme (exemplu: bacterii), a căror
unitate de structură şi funcţie este celula, virusurile sunt lipsite de organizare
celulară. Virusurile nu sunt deci microorganisme.
Morfologia virusurilor
Din punct de vedere morfologic, virionii pot aparţine unuia din
următoarele tipuri principale: forma cilindrică, alungită sau de bastonaş
(virusul mozaicului tutunului, virusurile insectelor), forma sferică sau
sferoidală întâlnită la multe virusuri animale (virusul gripal), forma
paralelipipedică - asemănătoare unei cărămizi cu colţurile rotunjite
(virusurile din grupurile variola - vaccina) sau formă de mormoloc,
spermatozoid sau cireaşă cu coadă (majoritatea bacteriofagilor).
Dimensiunile virusurilor variază între 80 -100 Å ca limită inferioară şi
2500 Å ca limită superioară (grupul variola-vaccina).
Organizarea particulei virale
Virionii (particule virale mature) sunt alcătuiţi din următorii
constituienţi:
a. Genomul viral, reprezentat în mod obişnuit printr-o molecula de
acid nucleic, cu greutate moleculară mare, liniară sau circulară, mono sau
bicatenară, împăturită sau înfăşurată pentru a forma o structură compactă;
b. Capsida (grecescul”kapsa” = cutie) care acoperă genomul
reprezentat în forma sa cea mai simplă de un strat mic de molecule proteice

21
identice aşezate în mod regulat sau alteori în două sau mai multe straturi
concentrice, fiecare putând fi constituit dintr-un tip diferit de proteină
Capsida şi genomul viral formează nucleocapsida şi reprezintă
constituienţii principali ai particulei virale. Uneori nucleocapsida este
închisă într-o membrană sau înveliş numit peplos (de la grecescul peplos =
manta) ce este alcătuită din unităţi structurale speciale numite peplomere.
Semnificaţia biologică a constituienţilor virali
a. Genomul viral poartă informaţia genetică necesară pentru propria
lui replicare şi pentru devierea metabolismului celulei gazdă, în sensul
sintezei celorlalţi constituienţi virali şi a precursorilor lor;
b. Capsida protejază materialul genetic mărind rezistenţa virusului în
mediul extern şi infecţiozitatea lui;
c. Peplosul păstrează stabilitatea nucleocapsidei şi asigură fixarea
virionului pe celula gazdă şi prin aceasta transmiterea lui eficientă, deci
infecţia celulei gazdă.

Multiplicarea virusurilor
Multiplicarea virusurilor se face exclusiv în celulele gazdă vii, care
furnizează nu numai materialul de construcţie, dar şi întregul “dispozitiv”
celular necesar pentru reproducerea particulelor virale.
Virusul invadat introduce în celula gazdă informaţia specifică a
propriului său genom, care deviază metabolismul celular în aşa fel încât, în
loc să se mai formeze constituienţi celulari se face sinteza unor enzime
speciale necesare pentru fabricarea de produşi virali.
Multiplicarea virusului reprezintă o consecinţă a introducerii în celulă
a unui acid nucleic străin, cu proprietăţi biologice specifice.
Multiplicarea virusului decurge într-o serie de etape succesive:
a. Adsorbţia şi fixarea virusului pe celula gazdă;
b. Pătrunderea virionului în celulă;
c. Replicarea genomului viral în celula gazdă;
d. Sinteza proteinelor virale şi morfogeneza virionului;
e. Eliberarea din celulă a particulelor virale progene.
a. Adsorbţia şi fixarea virusului pe celulă.
Mecanismul de fixare a virusului pe celula gazdă, trebuie să asigure
fixarea până în momentul când virusul este înglobat în ea. Acest mecanism
variază după morfologia virusului şi în funcţie de celula gazdă.
Specificitatea virusurilor pentru anumite gazde este în primul rând o
specificitate de fixare. Virusurile plantelor nu au specificitate de fixare,
deoarece nu pot adera la peretele celulozic al celulelor vegetale şi nu-l pot
străbate decât dacă integritatea lui a fost afectată prin leziuni mecanice. De

22
aceea, infectarea plantelor necesită cantităţi mari de virus, dar o dată
produsă, ea este însoţită de o multiplicare virală foarte abundentă în celulele
infectate.
b. Pătrunderea virionilor în celulă. Biochimia şi cinetica
replicării virusurilor, sinteza proteinelor virale şi morfogeneza virusurilor
Acidul nucleic viral acţionează în celulă ca un material genetic străin,
care conţine toată informaţia necesară pentru a dirija sinteza mai multor
tipuri de componenţi macromoleculari, asigurând în felul acesta propria sa
replicare. Are loc formarea proteinelor structurale de capsidă, a inhibitorilor
biosintezelor celulare normale, a unor proteine care reglează activităţile
metabolice ale celulei infectate. În această fază, viusul se găseşte în celulă
sub formă de virus vegetativ.
c. Replicarea informaţiei genetice virale
Genomul viral trebuie să fie debarasat de învelişurile sale. La o parte
din virusuri, acest proces are loc simultan cu dezintegrarea membranei
vacuolare, care izolează virusul de citoplasmă. La altele, capsida este
degradată chiar în vacuolă, sub acţiunea enzimelor pectolitice ale celulei, iar
acidul nucleic viral părăseşte vacuola fără a-i rupe peretele, fiind găsit la
aproximativ o oră de la infecţie în matricea citoplasmatică din vecinătatea
nucleului. Capsomerele devenite nefuncţionale, intră în metabolismul
general al celulei.
Perioada în care acidul nucleic (AN) este liber (“nud”), a fost descrisă
ca o fază de dispariţie a virusului infecţios (fază de eclipsă). În această fază,
virusul are o infecţiozitate mică deoarece neizolat are mai puţine posibilităţi
de a iniţia infecţia, în comparaţie cu virusul complet matur. După
aproximativ o oră, AN (“nud”) ajunge la locul unde se vor replica enzimele
implicate în sinteza acidului nucleic şi a proteinelor virale, precum şi la
locul în care se acumulează energia necesară proceselor de replicare şi
sinteză. În acest sens, virusul contribuie numai cu informaţia sa genetică,
celula gazdă furnizează tot materialul necesar sintezelor codificate de
genomul viral (aminoacizi, nucleotide), enzimele, ARN şi propriile sale
sedii de sinteză (ribosomii), precum şi energia acestor sinteze. Dependenţa
virusului faţă de activitatea vitală a celulei sale gazdă este totală, rezultând
parazitismul său absolut.
d. Sinteza proteinelor induse de virus şi morfogeneza virionului
Sub influenţa genomului viral, în celula gazdă se formează două
categorii de proteine: “precoce”şi “tardive”. Proteinele “precoce”, sunt
esenţiale pentru iniţierea replicării genomului viral parental introdus prin
infecţie. Funcţiile acestor proteine care acţionează ca enzime, sunt:

23
 - inhibarea replicării ADN, ARN şi a proteinelor specifice celulei
gazdă;
- cataliza sintezei unor proteine care constituie “matricea virală“,
adică spaţiul în care are loc replicarea, asamblarea şi morfogeneza virusului.
Proteinele “tardive” apar sub influenţa genomurilor virale progene ca
produs al replicării virale în celula gazdă. Ele sunt proteine de structură
(capsidale) şi proteine care întrerup formarea enzimelor induse de virus şi
care asigură desfăşurarea reacţiilor legate de maturarea şi eliberarea
virusului din celulă. La sfârşitul fazei de biosinteză, când în celula gazdă se
acumulează cantităţi mari de acid nucleic şi poteine virale, urmează faza de
asamblare, de grupare a acestor componente pentru a forma structura
organizată a particulei virale mature. Replicarea şi morfogeneza virusurilor
sunt procese intracelulare care au loc, fie în nucleu, fie în matricea
citoplasmatică.
e. Eliberarea din celulă a particulelor virale progene.
Se face în funcţie de particularităţile proprii diferitelor virusuri.
Virusurile cu ADN (cu excepţia virusului herpesului) tind să fie reţinute în
celule chiar după apariţia efectului citopatic şi sunt de aceea eliberate cu
frecvenţă mică sau moderată, pe când cele cu ARN sunt eliberate masiv.
Eliberarea virusurilor se poate face rapid şi exploziv prin ruperi mecanice
sau lent şi controlat prin străbaterea membranei celulare a cărei
permeabilitate este mărită în urma alterărilor morfologice produse de virus.
Sunt cazuri când virusul trece direct de la o celulă la alta adiacentă, alteori
infecţia unor celule este condiţionată de trecerea prealabilă a virusurilor în
afara celulei gazdă în care au fost produse. Mecanismul eliberării este de
asemenea diferit.

TAXONOMIA ŞI NATURA VIRUSURILOR

Din cauza dificultăţilor de izolare şi studiere directă a virusurilor
studiul sistematicii şi taxonomiei lor s-a făcut întotdeauna cu dificultate. Au
fost elaborate până în prezent mai multe sisteme de clasificare a virusurilor,
cel mai complex şi la care subscriem şi noi este cel propus de Comitetul
Internaţional de Taxonomie a Virusurilor, care consideră specia =un grup de
virusuri cu calităţi asemănătoare, iar genul = un grup de specii care au o
serie de caracteristici comune; familia = un grup de genuri care au caractere
comune şi care se desemnează prin adăugarea sufixului - viridae, în timp ce
la denumirea virusurilor genul se desemnează cu sufixul - virus; spre
exemplu, familia Herpesviridae, genul Herpesvirus.
Clasificare
După gazda care le primeşte, virusurile se împart în patru grupe:
24
 1. irusuri patogene pentru bacterii: bacteriofagi:
2. irusuri patogene pentru vegetalele superioare: virusurile plantelor;
3.virusuri patogene pentru nevertebrate: virusurile insectelor;
4.virusuri patogene pentru vertebrate, cuprinzând cinci grupe:
- virusuri al căror tropism este marcat pentru ectoderm (vaccin,
variolă),
- virusuri neurotrope pure (turbare),
- virusuri endoteliomezodermice (limfogranulomatoză venerică la
om)
, - virusuri septicemice (rujeolă, rubeolă),
- virusuri proliferative (sarcomul lui Roux, leucoze şi leucemii
transmisibile).
Exemple:
VIRUSURI LA OM - Gripa, Turbarea, Variola, Varicela,
Poliomielita. Oreionul, Hepatita virala
VIRUSURI L A PLANTE - Mozaicul-tutunului, Mozaicul-
castravetilor, Rasucirea frunzelor de cartof, Viroza cepei, Mozaicul-
porumbului, Viroza lalelelor, Basicarea frunzelor de piersic
VIRUSURI LA ANIMALE - Pesta porcina, Pesta ovina, Pesta
aviara, Febra aftoasa, Turbarea, Encefalita virala a bovinelor( “boala vacii
nebune”).
RELAŢIILE DINTRE VIRUSURI ŞI GAZDĂ sunt foarte
diversificate, complexe şi dependente de particularităţile virusurilor în
raport cu celula gazdă, fie de proprietăţile gazdei, celule sau organisme în
raport cu virusul. Relaţiile datorate particularităţilor virusului ca şi a
patogenităţii lor, precum şi interacţiunile lor cu alte virusuri se manifestă
prin tropisme acestea fiind definite ca fiind afinitatea virusurilor faţă de un
anumit substrat celular, adică faţă de anumite specii de plante sau animale
sau chiar faţă de anumite ţesuturi sau celule. Tropismele pot fi clasificate:
genotropism, histotropism şi citotropism. Relaţiile datorate particularităţilor
gazdei depind de factorii de replicare adică de posibilitatea de acces a
virusurilor, numărul de celule receptive, uşurinţa cu care suportă gazda
replicarea virusurilor, intensitatea şi complexitatea relaţiilor de apărare şi
posibilitatea de îndepărtare sau de inactivare a virusurilor. Aceste
particularităţi ale gazdei se pot manifesta: la nivel celular şi la nivelul
întregului organism. Relaţiile la nivel celular cu virusul se stabilesc în
funcţie de natura factorilor de replicare şi de gradul de exprimare a
mesajului genetic din celula gazdă. Din acest punct de vedere celulele se pot
clasifica în permissive şi nepermisive. Infecţiile cu virusuri la nivel celular
pot să fie: productive, abortive şi persistente.

25
 Relaţiile dintre virus şi celula gazda pot fi influenţate şi de
particularităţile întregului organism în raport cu virusul. S-a constatat că un
virus pătruns în celula parazitată împiedică multiplicarea altor virusuri în
aceeaşi celulă – fenomenul a fost descoperit în anul 1952 – denumit
interferenţă, iar substanţa antivirală elaborată de celula gazda – interferon.
Bacteriofagii - „mâncătorii de bacterii„ care, pentru a se multiplica
intră in celula bacteriană după care o distruge provocând liza acesteia. După
ciclul vital al bacteriofagilor ei pot fi :virulenţi sau temperaţi. După ce au
pătruns în celula bacteriană preiau controlul activităţii celulare; sunt
depolimerizaţi ADN şi ARN, iar bazele azotate rezultate sunt utilizate la
replicarea ADN-ului fagic. Totodată se sintetizează şi proteinele specifice
fagului, facilitând formarea şi eliberarea a 100-200 virioni în mai puţin de
20 minute = ciclul litic; Structura bacteriofagilor. Este diferită de la un grup,
la altul. In general, este format din: cap elicoidal care include genomul şi o
coadă care are rolul de a fixa bacteria şi transferul de ADN propriu în celula
gazdă. Bacteriofagii sunt răspândiţi în apă, aer, sol, organisme umane şi
animale şi au un rol important în ecologia şi evoluţia bacteriilor. De
asemenea, măresc gradul de variabilitate al bacteriilor prin fenomenul de
transducţie genetică (transfer de material genetic între bacterii). Datorită
specificităţii relaţiei fag - bacterie se pot identifica şi clasifica bacteriile în
funcţie de sensibilitatea lor faţă de un anumit fag sau grup de fagi.
Cianofagii sunt agenţi virali similari ca structură şi evoluţie cu bacteriofagii
dar ei ataca o gamă largă de alge albastre-verzi. Micovirusurile sunt
virusurile care atacă majoritatea ciupercilor, ele sunt mai mult latente decât
litice.
Virusurile din sol. Ajung în sol odată cu resturile plantelor şi
animalelor bolnave, solul oferindu-le condiţii favorabile, deşi ele nu rezistă
decât câteva luni. Dacă aceste virusuri rezistă mai mult, se impune
sterilizarea solului fizic sau chimic.
Viroizii. Sunt agenţi infecţioşi subvirali descoperiţi în anul 1967, sunt
formaţi numai din ARN liber nefiind asociaţi cu vreo structură de virion.
Prionii. Analiza unor agenţi patogeni bănuiţi că ar produce „maladia
vacii nebune” demonstrează că sunt formaţi numai din proteine. Aceste
proteine rezistente la enzime sunt produse de aproape toate celulele
organismului, dar ca urmare a acumulării lor în celulele nervoase le
provoacă distrugerea.
Măsuri faţă de căile de transmitere a infecţiei virale:
- în cazul infecţiilor aerogene, dispunem de unele măsuri profilactice,
care însă nu sunt suficiente pentru a controla ori întrerupe circulaţia
microorganismelor patogene prin aer. Se poate recurge la:

26
 - expunere la lumina solară, care este bactericidă;
- dezinfecţia aerului cu surse de raze ultraviolete;
- dezinfecţia (periodică) a camerelor bolnavilor;
- măsuri de împiedicare a ridicării prafului în aer (maturat umed, sau
cu aspiratorul de praf);
- prevenirea contaminării aerului prin tuse şi strănut (batiste, batiste
igienice de hârtie, scuipători de buzunar);
- antisepsie nazo-faringiană cu tablete dezinfectante (faringosept), ori
cu unguente nazale cu antibiotice;
- evitarea aglomerării spaţiilor închise şi aerisirea lor periodică. In
cazul infecţiilor digestive dispunem de măsuri profilactice eficace (cu
condiţia să fie însuşite şi aplicate).
- igiena personală (în special a mâinilor).
- igiena alimentaţiei: alimente curate, recoltate curat, transportate
curat, distribuite curat (nu cu mâini murdare), pregătite şi servite curat.
- apa potabilă controlată. La nevoie ceai sau apă minerală;
- igiena generală, comunală şi sanitară: igiena impecabilă a locuinţei şi
localităţii, depozitarea şi îndepărtarea igienică a gunoaielor şi
excrementelor, canalizare corespunzatoare, instalaţie de apă centrală
controlată, stârpirea vectorilor (muşte, ţânţari, şobolani).
- în cazul infecţiilor de contact sunt eficiente: măsurile de dezinfecţie
imediată cu apă şi săpun, aplicarea de dezinfectante locale (alcool, tinctură
de iod), unguente cu antibiotice (local), tratamentul chirurgical al unor plăgi
(curăţire, excizii).
- în cazul infecţiilor transmise prin vectori (ţânţari, căpuşe, păduchi):
insecticide cu caracter remanent, folosirea de soluţii cu substanţe
respingătoare de insecte, protecţia mecanică (cu site ori voaluri),
deparazitări cu mijloace fizice şi chimice, măsuri de asanare a mediului
pentru prevenirea înmulţirii vectorilor.

27
 Tema 3 - Caracterizarea principalelor grupe de
microorganisme. Bacteriile

CONCEPTUL DE BACTERIE
Termenul de bacterie a fost creat de Ferdinand Cohn în 1872, o dată
cu încercarea de a elabora una dintre primele clasificări ale acestor
microorganisme. Unii microbiologi consideră termenul de bacterie şi microb
ca fiind identici, punct de vedere pe care nu-l împărtăşim, considerând
semnificaţia semantică a conceptului de microb sau microorganism mai
largă şi mai imprecisă, cuprinzând în sfera lui toate vieţuitoarele şi entităţile
de graniţă dintre sistemele vii şi cele nevii, în care se încadrează şi
virusurile. Bacteriile sunt microorganisme bine definite biologic, având
astăzi şi un statut taxonomic pe deplin clarificat.
Ele sunt microorganisme unicelulare definite prin tipul de organizare
procariot, caracterizat prin absenţa structurilor intracelulare delimitate prin
membrane, spre deosebire de tipul eucariot, la care nucleul şi unele organite
intracelulare (cloroplaste, mitocondrii) posedă membrane proprii.
Bacteriile se diferenţiază de celelalte grupe de microorganisme prin
caracterele prezentate în tabelul 2.

Principalele caractere diferenţiale între bacterii, virusuri şi ciupercile

microscopice
Tabel 2
Caracterul diferenţial Virusuri Bacterii Ciuperci microscopice
Numărul tipurilor de
acid nucleic 1 2 2
Tipul de organizare Acelular Celular procariot Celular eucariot
Organizarea Genom viral Un singur cromozom şi Mai mulţi cromozomi
materialului genetic plasmide

28
 Echipament enzimatic Absente Prezente Prezente
şi activitate metabolică
proprie
Capacitate de creştere Absentă Prezentă Prezentă
Mod de reproducere Sunt sintetizate Independent, mai ales prin Independent, prin
de celula gazdă sciziparitate forme variate
asexuate sau sexuate
Capacitate de Nu este cazul Absentă Prezentă
diferenţiere celulară
Parazitism absolut Constant, Absent Absent
obligat
Forme biologice de - virion- - Celulă vegetativă- - Miceliu sau
existenţă în natură infecţios, capabilă de diviziune ; pseudomiceliu (tal) ;
temporar - Spor (formă de - Spor (formă de
extracelular ; conservare) reproducere)
- virus
vegetativ,
intracelular, în
curs de sinteză ;
- virus integrat-
fixat în
cromozomul
celulei gazdă
Poziţia pe scara La graniţa între Organisme vii cu Organisme vii cu
filogenetică viu şi neviu organizare simplă diverse grade de
(protiste) complexitate
morfofiziologică

Morfologie, proprietăţi fizice

Forma bacteriilor este controlată genetic, pentru aceasta, deşi ea
variază mult în funcţie de condiţiile de mediu, polimorfismul acestor
microorganisme este relativ limitat şi caracterizat de cele mai multe ori prin
predominanţa formei tipice pentru specia dată.
Forma bacteriilor este greu de apreciat direct în mediile naturale, de
aceea condiţiile de morfologie bacteriană se referă de obicei la celulele
cultivate în condiţii artificiale de laborator, în care caz forma celulei poate fi
influenţată de vârsta culturii, compoziţia chimică a mediului, de temperatură
etc. Convenţional, forma bacteriilor (criteriu taxonomic) se apreciază pe
celule provenite din culturi tinere în faza de creştere activă, pe medii de
cultură corespunzătoare şi în condiţii optime de temperatură, presiune,
oxigen, pH etc.
Forma bacteriilor. După forma celulei, bacteriile pot fi grupate în trei
categorii: bacterii sferice, bacterii cilindrice, bacterii spiralate sau elicoidale.
Bacteriile sferice sau cocii, au forma sferică, ovoidală, elipsoidală,
reniformă. Forma sferică este modificată de diferiţi factori de mediu. În
funcţie de poziţia celulelor fiice, după diviziune, cocii prezintă următoarele
şase subtipuri morfologice: cocul simplu sau izolat - la care celulele
29
30
rezultate din diviziuni ramân independente, diplococul (de la grecescul
“diplos” = dublu) - la care diviziunea se face după planuri succesive
paralele, celulele rezultate rămânând grupate câte două (“Diplococcus
pneumoniae”); streptococul (de la grecescul “streptos” = împletit) - la care
diviziunea se face tot după planuri succesive paralele, dar celulele rezultate
formează lanţuri de lungimi variabile, ca un şirag de mărgele
(“Streptococcus pyogenes”); tetracocul sau tetrada - la care planurile
succesive de diviziune sunt perpendiculare unele faţă de altele, iar celulele
rezultate sunt dispuse în grămezi de patru elemente (“Micrococcus
tetragenes”), sarcina, planurile de diviziune sunt orientate în trei direcţii
diferite ale spaţiului şi sunt reciproc perpendiculare unul pe altul, de unde
rezultă o grupare în cuburi sau pachete (baloturi), exemplu: Sarcina flava,
stafilococul, planurile succesive de diviziune sunt dispuse în câteva direcţii,
iar organismele rezultate se organizează în grupări neregulate în formă de
ciorchine (“ Staphylococcus aureus “). (Fig.2).

Fig. 2. Aşezări diferite ale cocilor

1. coc; 2. diplococ; 3. streptococ; 4. streptodiplococ;
5.tetradă; 6. sarcină; 7. stafilococ

Bacteriile cilindrice sunt cunoscute sub denumirea comună de bacili,

au formă de bastonaşe, diametrul lor longitudinal fiind mai mare decât cel
transversal. Raportul dintre cele două axe variază mult, unele bacterii
cilindrice putând lua un aspect filamentos, iar altele având aproape o formă
sferic-ovalară (cocobacili), acestea din urmă diferenţiindu-se greu de coci.
În culturile pure există însă întotdeauna câteva celule suficient de lungi
pentru a indica natura lor cilindrică. Bacilii sunt drepţi sau uşor curbaţi la
mijloc sau la una din extremităţi. Bacilii pot fi grupaţi câte doi (diplobacili),
în lanţuri cu lungimi variabile (streptobacili) sau în palisadă (ca scândurile
unui gard). (Fig. 3.)
Unele bacterii (Agrobacterium stellulatum, Agrobacterium
radiobacter) formează grupuri caracteristice în formă de rozetă sau de stea.

31
 Fig. 3. Aşezări diferite ale bacililor
1. bacil; 2. diplobacil; 3. streptobacil (după J. Ribereau-Gayon)

Bacteriile spiralate sau elicoidale cuprind două subtipuri

morfologice:
a. Vibrionul - bacterie în formă de virgulă (Vibrio cholerae);
b. Spirilul - în formă de spirală cu mai multe tipuri flexibile care se
pot strânge sau relaxa (genurile Borrelia, Treponema, Leptospira).
Alte forme de bacterii mai întâlnim:
- bacteriile pedunculate din genul Caulobacter răspândite în mediile
acvatice naturale. Celula lor cilindrică, fuziformă sau curbată asemenea unui
vibrion, elaborează un peduncul care este format dintr-o prelungire tubulară
foarte fină, de câteva ori mai lungă decât corpul celular, terminată cu un fel
de “ventuză“ sau “crampon” alcătuit din material lipicios aderent la
substraturi.
- bacteriile filamentoase - au ca prototip pe Sphaeretilus natas prezent
în apele dulci bogate în substanţe organice.

Fig. 3a. Forme posibile la bacterii: Fig. 3b. Modul de grupare la bacterii:
1. coc sferic; 2. coc oval; 3. coc asimetric cu un pol 1. diplococi; 2. streptococi; 3. tetradă; 4. sarcină; 5.
ascuţit şi unul rotunjit; 4. coc asimetric în formă de bob stafilococ; 6. diplobacil; 7. grupare în formă de
de cafea (reniform); 5. formă cocoidă; litera “V”;
6. cocobacil; 7. bacili fini; 8. bacili cu dilataţia terminală 8. streptobacil; 9. filament;
în formă de măciucă; 9. bacili cu capete retezate; 10. 10. filament cu citoplasma granulară;
bacili cu capete rotunjite; 11. vibrion; 11. forme ramificate (caracteristice
12. spirochet cu spirale mari; Actinomycetelor); 12. grupare în palisadă; 13.
grupare neregulată de bacili.
13. spirochet cu spirale mici.

Dimensiunile bacteriilor. Bacteriile sunt organisme cu dimensiuni

foarte mici (în medie 0,5-1m x 3-6m). Cele mai mici dintre ele se apropie

32
de limita de rezoluţie a microscopului optic (Spirillum parvum: 0,1-0,3m x
1-3m; Vibrio percolans: 0,3-0,4m x 0,4-2m).
Densitatea sau greutatea specifică a celulei bacteriene vii (în stare
umedă) variază între 1,07-1,30. Celulele tinere turgescente, au densitatea
mai mică decât cele bătrâne, iar la bacteriile cultivate pe medii lichide,
valoarea ei este mai mică decât la cele cultivate pe medii solidificate.
Datorită densităţii lor mici, bacteriile rezistă la sedimentare spontană în
medii gazoase şi lichide, din care pot fi separate prin centrifugare.
Suprafaţa celulei bacteriene se poate calcula încadrând bacteriile într-
o formă geometrică regulată, pe baza dimensiunilor celulei (B. anthracis
are o suprafaţă de 33m2, un coc cu diamtru de 1m are 3,15m2).
Volumul celulei bacteriene poate fi apreciat cu ajutorul formulelor de
calcul aplicate corpurilor geometrice regulate (8,75m3 pentru o bacterie
mare - B. anthracis; 1,5m3 pentru Salmonella typhi; 0,52m3 pentru un coc
şi 0,004m3 pentru Pasteurella tularensis). Ca termen de comparaţie,
amintim că o celulă sanguină, de exemplu un limfocit are volumul de
524m3.
Greutatea unei bacterii vii se poate calcula împărţind greutatea unei
anumite mase de celule la numărul unităţilor celulare componente (este de
9,6 x 10-12 pentru o celulă de B. athracis; 0,012 x 10-12 genul Brucella).
Raportul între suprafaţa celulei şi greutate are valoare foarte ridicată
la bacterii. La un coc cu un diametru de 1m acest raport este egal cu
55000, la B. anthracis cu 35000, iar la B. melitensis cu 200000. Acelaşi
raport la om 24000 cm2/70000 g = 0,25.
Raportul între suprafaţa celulei şi volum are valoare foarte mare la
bacterii. Astfel 1 ml masă compactă de celule ale unui coc poate să conţină
1012, adică 1000 miliarde celule ce însumează o suprafaţă de contact cu
mediu de circa 3,15 m2.
Structura internă a celulei bacteriene.
Cunoaşterea structurii interne a celulei bacteriene a fost posibilă în
urma perfecţionării mijloacelor de cercetare şi în special graţie microscopiei
electronice pe secţiuni ultrafine, microscopiei în contrast de fază şi
metodelor de citochimie. S-a demonstrat că celula bacteriană este o entitate
morfologică şi funcţională fiind constituită din următoarele componente:
peretele celular, structurile subparietale, membrana citoplasmatică şi
mezozomul, citoplasma, ribosomii, materialul nuclear, sporul, cromatoforii
(la bacteriile fotosintetizante) vacuolele şi incluziile şi în sfârşit structurile
exparientale (capsula, stratul mucos, cilii şi pilii).

33
 Peretele celular are ca funcţie principală susţinerea mecanică a
întregii arhitecturi celulare şi protejarea ei faţă de influenţele nefavorabile
din mediu. Peretele bacterian nu pare să fie dotat cu nici o activitate vitală
esenţială, deoarece atunci când este în întregime îndepărtat, activitatea
metabolică (viaţa celulei) nu este compromisă, deşi celula rămasă viabilă
devine mult mai vulnerabilă la activitatea unor factori fizico-chimici ai
mediului. Datorită rigidităţii sale, peretele celular asigură celulelor
bacteriene forma lor caracteristică. El asigură de asemenea elasticitatea
celulei bacteriene (respectiv capacitatea de a recăpăta forma şi dimensiunile
iniţiale după modificări reversibile de volum determinate de creşterea
presiunii lor sau de variaţii ale presiunii osmotice a mediului) şi
ductibilitatea (rezistenţa la deformare).
Membrana citoplasmatică, acoperă de jur împrejur citoplasma
bacteriilor separând-o de suprafaţa internă a peretelui celular, de care ea
însăşi este de obicei strâns alipită. Ea este sediul structural al barierei
osmotice de permeabilitate care reglează pătrunderea în celulă şi eliminarea
selectivă a diferitelor substanţe. Ea menţine în celulă o concentraţie ridicată
de macromolecule, molecule mici şi chiar ioni (K +, Mg++), împiedicându-le
difuzarea în mediu deşi concentraţia lor extracelulară este mult mai mică. La
nivelul său sunt localizate permeazele, enzime care asigură transportul activ
în interiorul celulei al unor substanţe organice polare din mediu cu care
formează permeazele complexe uşor disociabile. Ea mai conţine şi
numeroase enzime ale metabolismului respirator (citocromi, enzimele
ciclului acizilor tricarboxilici). Membrana citoplasmatică are un rol
important în coordonarea creşterii şi diviziunii celulare, la nivelul său ia
naştere semnalul care declanşază iniţierea replicării cromozomului bacterian
şi tot ea asigură segregarea celor doi cromozomi fii prin formarea septului
transversal care separă cele două celule fiice.
Mezozomii, reprezintă un sistem membranos intracelular format prin
invaginarea membranei citoplasmatice, de care de altfel rămân legaţi tot
timpul vieţii celulei bacteriene. Nu se cunosc diferenţele dintre membranele
plasmatice şi mezozomi. Mezozomii joacă pe de o parte, rolul de centrii ai
sistemelor transportoare de electroni implicate în semipermeabilitatea
acestei membrane, iar pe de altă parte sunt legaţi de cromozomul bacterian a
cărui replicare pare a fi iniţiată prin intermediul lor.
Citoplasma este considerată ca un sistem coloidal complex format din
proteine, glucide, lipide, apă şi substanţe minerale. Citoplasma bacteriană
poate fi caracterizată ca un complex de stări fizice într-o continuă
transformare, în funcţie de starea funcţională şi de vârsta celulei. O
caracteristică a citoplasmei bacteriene este prezenţa unei mari cantităţi de

34
acizi ribonucleici (ARN) ceea ce explică bazofilia ei intensă, mai evidentă la
celulele tinere. Celulele moarte se colorează mai puţin intens decât celulele
bătrâne, la care sinteza ARN a încetat, iar cel existent este folosit ca sursă de
N şi P. În interiorul citoplasmei se găsesec: materialul nuclear, incluziile,
vacuolele, cromatoforii şi ceilalţi constituienţi ai protoplastului.
Materialul nuclear (“nucleul”) este o structură plastică lipsită de
membrană nucleară (structură procariotă) situată în mod obişnuit în partea
centrală a celulei bacteriene şi care nu suferă modificări de tip mitotic în
cursul ciclului de diviziune. Mai poartă numele de nucleoid sau corp
cromatinic.
În tabelul 3. sunt prezentate caracterele diferenţiale ale celulelor
procariote şi eucariote.

Caractere diferenţiale ale celulelor procariote şi eucariote

Organisme cu acest tip de
organizare
Perete celular
Nucleu
Membrană nucleară
Cromozom
Tipul de diviziune obişnuit
Înmulţire sexuată
Curenţi citoplasmatici
Reticul endoplasmatic
Mitocondrii
Organe de locomoţie
Tabel 3
Celule procariote Celule eucariote
Bacterii, alge albastre Fungi, alge verzi,
protozoare, plante şi
animale superioare
Rigid: mucocomplex cu constituţie Rigid: chitină (fungi),
chimică foarte caracteristică celuloză (alge verzi şi
plante superioare) sau
absent.
Primitiv, netipic, fără formă Tipic (“adevărat”) cu
caracteristică (nucleoid sau material nucleol.
nuclear).
Absentă Prezentă (dublă,
străbătută de pori)
Unic “genofor”, “lineom” sau Mai mare ca 1; număr
“nucleosom”- (moleculă circulară constant pentru specie
ADN); în anumite condiţii 2-4 într-o
celulă, dar identici
Diviziune directă (amitoză) Diviziune indirectă
(mitoză sau cariochineză)
cu faze caracteristice
Rară (cu excepţii) şi de tip particular: Frecventă; formarea
parasexualitate. Formare de zigot gameţilor (haploizi)
parţial şi tranzitoriu diploid precedată de meioză
(diviziune reducţională)
zigot diploid
Absenţi (excepţional, foarte slabi) Prezenţi
Absent; sisteme membranoase izolate Prezent, cu organizare
mai mult sau mai puţin, rudimentare caracteristică
(mezozomi)
Absente Prezente
Facultative: cili de tip special Facultative: cili sau
flageli cu organizare
complexă

35
 Mişcare ameboidă Absentă (perete celular rigid) Absentă la celule cu
perete rigid; prezentă la
celule fără perete rigid
Dimensiuni Mărime medie inferioară aceleia a Mai mari decât
eucariotelor procariotele

Ribozomii sunt formaţiuni citoplasmatice de formă aproximativ

sferică având un diametru variabil cuprins între 70 şi 200 Å. Au un rol
esenţial în procesul de biosinteză a proteinelor celulare datorită capacităţii
lor de a fixa ARN mesager, care asigură aranjarea specifică a aminoacizilor
în lanţul polipeptidic. De aceea sunt consideraţi ca adevărate “fabrici“ de
proteine celulare.
Cromatoforii sunt organite citoplasmatice specializate ca centre
fotochimice prezente la bacteriile fotosintetizante purpurii, la care pot
ajunge să constituie pănă la 40-50% din greutatea uscată a celulei. În afară
de pigmenţii fotosintetizanţi, cromatoforii mai conţin proteine, lipide şi
sisteme enzimatice, precum şi transportorii de electroni care intervin în
fosforilarea fotosintetică (fotosforilare).

Fig. 4. Reprezentarea schematică a unei celule vegetale eucariote.

Principalii constituienţi nu sunt reprezentaţi la scară (după Wattson).

36
 Fig. 5. Reprezentarea schematică a principalilor constituienţi
structurali ai unei celule bacteriene (după G. Zarnea).

Sporul este o formaţie endocelulară care apare în anumite condiţii de

viaţă la unele bacterii şi care este capabilă să păstreze multă vreme în stare
latentă toate caracterele genotipice ale formei vegetative din care provine. În
marea majoritate a cazurilor, într-o celulă vegetativă se formează un singur
spor. Numai în cazuri rare, în interiorul unei celule vegetative se pot forma
doi spori-bacterii bisporulate.
La bacteriile clasice, sporul are funcţia biologică de a asigura, prin
rezistenţa sa crescută faţă de factorii nocivi din mediu, conservarea speciei.
El nu îndeplineşte nici un rol de multiplicare. Excepţie fac actinomicetele,
singurele bacterii la care, ca şi la ciuperci, sporul este o formă de înmulţire.
Procesul de formare a sporului poartă numele de sporogeneză. Sporul,
la rândul lui, se poate transforma din nou în celulă vegetativă, proces numit
germinare. Prin germinarea unui spor ia naştere o singură celulă vegetativă.
Atât sporogeneza, cât şi germinarea sunt determinate de factori
genetici existenţi în celulele speciilor bacteriene sporogene. La rândul lor,
factorii genetici sunt represaţi sau depresaţi de anumite procese interne din
celulă şi de diverşi factori de mediu.
La bacteriile de formă sferică, sporogeneza este o însuşire mai rar
întâlnită. Singura specie sporogenă din grupa cocilor este Sporosarcina
ureae.
Primele observaţii privind exitenţa sporilor aparţin lui Pasteur,1865,
iar primul studiu mai amplu asupra sporulării bacteriilor, lui Koch, 1877.
Sporul bacterian, spre deosebire de celula vegetativă biologic activă,
este o formă dormantă, fiind caracterizat prin următoarele proprietăţi
esenţiale:
- absenţa activităţii biosintetice;
- absenţa funcţiei de multiplicare;
- intensitate mai redusă a celorlalte funcţii vitale;
37
 - rezistenţa crescută faţă de acţiunea factorilor de mediu.
Sporogeneza. Procesul de sporogeneză se desfăşoară în mai multe
etape şi anume:
Pregătirea celulei pentru procesul de sporogeneză, caracterizată prin
următoarele fenomene succesive:
- contopirea materialului genetic nuclear în cazurile când se găseşte
divizat într-o singură masă cromatică;
- segmentarea şi reorganizarea acesteia prin replicare rezultând doi
cromozomi distincţi.
Formarea presporului, stadiu incipient al viitorului spor, rezultă prin:
- constituirea unui sept transversal în urma invaginării membranei
citoplasmatice, care separă cei doi cromozomi; septul se poate forma central
sau excentric (mai apropiat de unul din polii celulei vegetative); (Fig. 10).
- evoluţia pe două căi dierite a celor două segmente celulare, una din
ele devenind prespor, iar a doua sporangiu:
- presporul îşi măreşte gradul de refringenţă şi de capacitate faţă de
lumină şi electroni, paralel cu încetatrea replicării cromozomului şi iniţierea
organizării învelişurilor sporale;
- sporangiul, reprezentând restul celulei vegetative, păstrează
caracteristicile morfologice ale acesteia; la unele specii, ca de exemplu
Bacillus cereus, el se lizează sub acţiunea unor enzime autolitice specifice,
în timp ce altele, ca de exemplu Clostridium tetani,rămâne ataşat de spor un
timp nedefinit, fără a se putea preciza dacă păstrează sau nu însuşirile vieţii.
Maturarea sporului este stadiul final, de organizare a constituenţilor
sporali, însoţită de dobândirea însuşirilor biologice caracteristice. Se
realizează prin următoarele transformări care se petrec în spor:
- morfogeneza învelişurilor sporale;
- apariţia unor compuşi chimici specifici sporului, inexistenţi în celula
vegetativă;
- reducerea sensibilă a activităţii metabolice;
- dobândirea rezistenţei la căldură şi la alţi factori fizici şi chimici, la
care celula vegetativă este sensibilă.

38
Fig. 6. Reprezentarea schematică a stadiilor succesive ale procesului de creştere vegetativă,
sporogeneză şi germinare a sporului la Bacillus subtilis (după G. Zarnea)

Constantele morfologice şi fizice ale sporului. Sporul se deosebeşte de

celula vegetativă prin mai multe constante morfologice, prin structură şi
afinităţi tinctoriale.
Constantele morfologice ale sporului sunt următoarele:
- forma sporului la majorittea speciilor sporogene este ovală, cu
excepţia sporului de formă sferică, caracteristic pentru Clostridium tetani;
- dimensiunile variază între limitele: 1,5-2 µm lungime şi 0,5-1,2 µm
diametrul transversl;
- volumul sporului este mai redus ca al celulelor vegetative; la
Bacillus subtilis s-a putut stabili ca fiind de 0,593-0,07 µm3.
Structura sporului este, în general, mai densă decât a celulei
vegetative, constituienţii celulari găsindu-se într-o formă mai concentrată.
Părţile constructive ale sporului bacterian, pornind de la interior la exterior,
sunt:
- inima sporului numită şi sâmbure, core sau protoplast sporal
analog conţinutului celulei vegetative, este compusă din:
- sporoplasmă, corespunzătoare citoplasmei, dar mai densă, în care se
observă numeroase granule de aproximativ 10 nm, corespunzând probabil
ribozomilor
- nucleoplasmă sau materialul nuclear format din ADN.
- membrana internă a sporului, numită şi intină, similară membranei
citoplasmatice, delimitează nemijlocit sporoplasma; ea poate forma uneori şi
mezozomi;
39
 - cortexul, strat gros al învelişului exterior membranei interne a
sporului, cu un grad redus de opacitate electronooptică, constituit din
peptidoglican modificat;
- învelişul extern, cunoscut în literatura de specialitate şi sub
denumirile de exină sau tunici sporale, având la rândul lui o structură
plurilamelară; la Bacillus cereus, Aronson şi Fitz-James (1976), aplicând
tehnica de îngheţare-fracturare, evidenţiază următoarele straturi (de la
interior spre exterior): membrana externă a presporului (limitrofă
cortexului), stratul de sub înveliş, stratul cu scobituri şi stratul peticelor
încrucişate;
- exosporiumul, un înveliş suplimentar analog cu capsula celulei
vegetative; este prezent numai la sporii anumitor specii; în unele cazuri
aderă intim la un înveliş extern, iar la altele are caracterul unei anvelope
laxe, între spor şi exosporium putându-se observa un spaţiu perisporal
traversat de filamente suspensoare care ataşează exosporul de exină;
- apendicii, expansiuni situate de obicei la o extremitate a sporului,
orientate paralel, dispuse sub forma unui smoc, sunt structuri de 2-3 ori mai
lungi decât lungimea sporului, având diametrul de 130 nm. Au o structură
multistratificată şi aspectul unor tuburi turtite, iar din punct de vedere al
funcţiei nutritive în perioada maturării sporului sau că ar fi rezultatul unor
alterări metabolice; sunt prezenţi numai la sporii anumitor specii;
- corpii parasporali sunt formaţiuni cristaloide observabile pe
suprafaţa sporilor unor specii ca Bacillus subtilis, Bacillus megatherium etc.
a căror semnificaţie biologică este incertă. Unii autori corelează prezenţa
corpilor parasporali cu patogenitatea bacteriei pentru insecte.
Afinităţile tinctoriale ale sporului sunt distincte de ale celulei
vegetative. Prin tehnica Gram se colorează palid numai conturul sporului, nu
şi conţinutul, pentru colorarea căruia sunt necesare metode energice
implicând colorarea la cald cu soluţii concentrate capabile să impregneze
structurile sporale dense.
Raporturile anatomice între spor şi sporangiu
În frotiuri sporii se pot găsi fie liberi, fie ataşaţi sau integraţi în celula
vegetativă în interiorul căreia s-au format. În cazul când sporii rămân în
interiorul sporangiului, pot fi luate în considerare, două categorii de
raporturi anatomice între spor şi sporangiu; raportul între diametrul
transversal al sporului faţă de cel al sporangiului şi poziţia sporului în raport
cu axul longitudinal al sporangiului.
Raportul dintre diametrele transversale evidenţiază două posibilităţi:
- diametrul sporului este mai mic decât al celulei vegetative;

40
 - diametrul sporului este mai mare decât al celulei vegetative şi din
această cauză o bombează.
Aşezarea sporului de-a lungul axului longitudinal permite diferenţirea
a trei feluri de poziţii:
- sporul central - situat aproximativ la mijlocul axului longitudinal al
celulei vegetative;
- sporul subterminal - situat către una din extremităţi, delimitat de
porţiuni inegale din sporangiu - la unul din capete o porţiune foarte mică, la
celălalt cea mai mare parte din corpul bacterian;
- sporul terminal - situat la una din extremităţi,
- sporul lateral - situat central sau asimetric în raport cu grosimea
bacteriei.
În funcţie de ambele categorii de raporturi arătate mai sus, bacterile
sporulate pot adopta diferite forme, cu semnificaţie taxonomică, şi anume:
- forma de bacil nedeformat, cu sporul situat central, caracteristic
pentru genul Bacillus;
- forma de lămâie - spor central cu diametrul transversal mai mare ca
al celulei vegetative, întâlnit la mai multe specii ale genului Clostridium;
- forma de ac cu gămălie - spor sferic terminal cu diametrul
transversal mai mare ca al celulei vegetative, specific pentru Clostridium
tetani;
- forma asimetrică excentrică pe o singură latură a celulei vegetative-
spor lateral caracteristic speciei Bacillus laterosporus.
Particularităţile biochimice, fiziologice şi biologice ale sporului.
Sporul are mai multe particularităţi biochimice şi fiziologice din care
apoi derivă însuşirile sale biologice caracteristice şi determinante pentru
starea criptobiotică care-l defineşte.
Particularităţi biochimice: sporii se caracterizează printr-un conţinut
mai redus în apă liberă, în săruri de fosfor şi potasiu şi în acizi nucleici. Sunt
total absente incluziile de poli--hidroxibutirat, enzimele ciclului Krebs şi
unii transportori de electroni din membrană. Sporul conţine în proporţie mai
ridicată decât celula vegetativă ioni de calciu, magneziu şi mangan şi
cisteină. În spor se găsesc şi unii compuşi chimici absenţi în celula
vegetativă, unele proteine structurale, enzime litice sporale,
glucozodehidrogenază etc. Spre deosebire de enzimele celulei vegetative,
celulele sporale au masa moleculară mai mică şi sunt termorezistente.
Termostabilitatea lor pare a se datora unei configuraţii moleculare aparte,
conferită de o substanţă de asemenea absentă în celula vegetativă - acidul
dipicolinic - un acid aromatic cu formula C5H3(COOH)2N, care se găseşte

41
sub formă de sare de calciu (dipicolinat de calciu). Există un raport direct
între cantitatea de acid dipicolinic şi gradul de termorezistenţă al sporilor.
Particularităţi fiziologice: procesele metabolice în interiorul sporului
se desfăşoară cu o intensitate redusă, sporul fiind o formă dormantă, la
nivelul căruia nu au loc schimburi de substanţe cu mediul ambiant, care nu
creşte şi nu se multiplică.
Însuşiri biologice: sporii bacterieni sunt caracterizaţi printr-o
rezistenţă mult mai accentuată faţă de factorii de mediu, în raport cu formele
vegetative:
- termorezistenţa: căldura este mult mai puţin activă faţă de spori, care
rezistă uneori până la 1200C, în cazul căldurii umede şi 180 0C în cazul
căldurii uscate, în comparaţie cu celulele vegetative care sunt omorâte
obişnuit la 600C. Gradul de termorezistenţă al sporilor nu este egal. El
depinde de mai mulţi factori, dintre care cei mai importanţi sunt prezentaţi
în continuare;
- specia bacteriană: există unele diferenţe de termorezistenţă între
sporii diferitelor specii, de exemplu sporii de Bacillus subtilis sunt mai
rezistenţi la temperatură decât ei de Bacillus anthracis ;
- biotopul: în cadrul aceleiaşi specii există diferenţe de rezistenţă între
biotopuri. Astfel, sporii tipului E de Clostridium perfringens au un grad mai
ridicat de termorezistenţă în comparaţie cu cei aparţinând tipurilor C şi D ;
- condiţiile de mediu în care s-a produs sporogeneza: în cazul speciei
Bacillus megatherium s-a constatat că sporii formaţi în prezenţa ionilor de
calciu sunt mai rezistenţi decât cei formaţi în absenţa acestora.
- rezistenţa la uscăciune: sporii bacteriei se caracterizează printr-o
remarcabilă capacitate de supravieţuire în condiţii de uscăciune. Sunt greu
de precizat limitele de timp, oricum foarte îndelungat, în care sporii pot
rămâne viabili în diverse materiale în stare uscată.
- rezistenţa la factori chimici: substanţele chimice cu acţiune
antibacteriană sunt, în general, mai puţin active faţă de spori. Unele sunt
chiar total inactive (alcool şi cloroform); altele cum este glicerina au o
acţiune conservantă asupra sporilor. Pe această însuşire se bazează utilizarea
glicerinei pentru stabilizarea suspensiilor de spori în practica preparării
vaccinului anticărbunos.
Capacitatea sporogenetică a bacteriilor este uneori corelată cu alte
însuşiri biologice cum sunt toxinogeneza şi antibioticogeneza. Astfel,
secreţia toxinei la Clostridium histolyticum şi cea de antibiotic la Bacillus
subtilis sunt proprietăţi care nu se manifestă la variantele asporogene.

42
 Germinarea sporului. Este procesul de transformare a sporului în
celulă vegetativă. Ea se realizează în două faze, morfologic şi biologic
distincte:
- iniţierea germinării: prima fază, când sporul se măreşte în volum,
consecutiv absorbţiei de apă şi pierde majoritatea însuşirilor specifice
sporului termorezistenţa, refringenţa şi impermeabilitatea faţă de coloranţi.
În această fază, învelişul sporal la unele specii cum sunt Bacillus cereus şi
Bacillus mycoides, se lizează, iar la altele, ca Bacillus subtilis, se
dezintegrează mecanic;
- creşterea (dezvoltarea) postgerminativă: este a doua fază şi se
caracterizează prin redobândirea de către bacterie a tuturor însuşirilor
morfologice şi fiziologice caracteristice celulei vegetative.
Germinarea este considerată încheiată în momentul reluării
multiplicării.
Determinismul proceselor de sporogeneză şi germinare. Ambele
procese se găsesc sub controlul a aproximativ 50 gene situate în loji diferiţi
pe cromozom. În celula vegetativă ele sunt represate sub acţiunea unor
represori sintetizaţi de bacterie pe baza utilizării anumitor compuşi chimici
din mediu când substanţele respective sunt epuizate, represorul nu mai este
sintetizat, genele sunt derepresate şi se exprimă fenotipic prin decalanşarea
procesului de sporogeneză. Factorilor genetici le revine responsabilitatea
ratei de sporulare şi de germinare caracteristice fiecărei specii, iar în cadrul
speciei fiecărei tulpini. Ca rezultat al proceselor mutative sau de
recombinare genetică au loc variaţii genotipice şi anume apariţia de variante
oligosporogene cu rata de sporulare redusă sau asporogene, lipsite total de
capacitatea de a sporula. La rândul lor, sporii pot şi ei suferi variaţii în sens
invers, devenind spori vegetativi, incapabili de a mai germina.
Controlul genetic al sporogenezei pare să fie corelat la unele specii
bacteriene cu cel al sintezei de antibiotice. Astfel, producţia de gramicidină,
de către Bacillus brevis, de bacitracină de către Bacillus polymyxa etc., este
în relaţie directă cu capacitatea sporogenetică a tulpinilor. Mutantele
asporogene ale speciilor amintite sunt lipsite de proprietăţi antibiotico-
secretoare. Un interesant studiu al interrelaţiei dintre fenomenele de
sporogeneză şi antibiotico-secreţie a fost realizat de Stamatin în perioada
1968-1981, la Bacillus laterosporus. Autorii constată un raport de
proporţionalitate directă între intensitatea sporogenezei şi cantitatea de
antibiotic produsă.
Factorii de mediu exercită un rol stimulator sau inhibitor asupra
proceselor de sporogeneză şi germinare, în funcţie de modul în care
acţionează asupra sintezei represorului care menţine genele sporale în stare

43
nefuncţională. Factorii de mediu care acţionează inhibitor asupra sintezei
represorului vor declanşa sporogeneza. Astfel, sporularea are loc numai
între anumite limite de temperatură (la Bacillus anthracis între 180C-400C).
Uscăciunea, prezenţa oxigenului la bacteriile aerobe şi absenţa lui la cele
anaerobe, o anumită densitate a germenilor pe unitatea de volum, etc., au de
asemenea un efect favorabil asupra sporogenezei.
Germinarea sporilor este influenţată în sens pozitiv de: o anumită
temperatură, în general cea apropiată de temperatura optimă de multiplicare;
umiditate; şocul termic (încălzirea bruscă la 60-800C) şi pH-ul între 6 - 8;
diferite substanţe chimice ca glucoza, unii aminoacizi (L-alanina), ionii de
sodiu, potasiu şi calciu. Au o acţiune inhibantă asupra germinării apa
distilată, glicerina şi unele antibiotice, ca laterosporinele.
Bacteriile sporogene se caracterizează printr-o existenţă saprofită. Ele
se găsesc, supravieţuiesc teoretic un timp nelimitat şi, de cele mai multe ori,
se şi multiplică în mediile naturale.
După modul de formare, structura şi rezistenţa lor, sporii bacterieni se
grupează în trei tipuri diferite:
1. sporul propriu-zis sau endosporul, dotat cu mare rezistenţă la
condiţiile defavorabile, apare în interiorul unei celule vegetative numită
“sporangiu“;
2. artrosporul se formează prin fragmentarea unor celule vegetative
care devin din ce în ce mai mari. Are o formă mai neregulată şi o rezistenţă
intermediară între aceea a endosporului şi cea a formei vegetative;
3. microchistul (chlamidosporul), provine din transformarea unei
celule vegetative în întregul ei, prin îngroşarea pereţilor şi acumularea de
material de rezervă. Are o rezistenţă mai mică decât a endosporului;
4. gonidia (gonidia-sămânţă), apare endocelular prin contracţia,
condensarea şi fragmentarea protoplasmei unei celule vegetative numită
gonidangiu.
În tabelul 4. este redată diferenţa dintre conţinutul în apă liberă al
celulei vegetative şi sporului, la câteva specii bacteriene.

Conţinutul în apă liberă al celulei vegetative şi al sporului

(după Friedman şi Henry)
Tabel 4.
Microorganismul Apă liberă în %
Celula vegetativă Sporul
B. subtilis 68,9 3,4
B. megaterium 60,2 4,5
B. mycoides 50,0 11,9
44
 În concepţia actuală stadiul de spor corespunde unei etape fiziologice
normale din evoluţia celulei bacteriene aparţinând unei specii sporogene.
Aşa se explică faptul că sporogeneza necesită condiţii de mediu foarte
similare, obişnuite pentru celula vegetativă, procesul de sporulare putând fi
oprit tocmai prin degradarea sau deteriorarea acestor condiţii. Sporii au o
rezistenţă mare la căldură, tolerând uneori expuneri de câteva ore la120 oC,
câteva minute la 180oC (uneori chiar 2-3 ore la115oC - 200oC, căldură
uscată). Rămân vii o săptămână în fenol 5% şi mai multe săptămâni în
alcool. Sporul are longevitate foarte mare, asigurând supravieţuirea speciei
în natură. Sporii de B. anthracis sunt viabili 70 de ani, ai bacteriilor
saprofite, aflate în conserve alimentare, peste 114 ani. S-au găsit spori
viabili în roci scoase de la o adâncime de 37-45 m ajunşi acolo probabil în
epoca cuaternară, în timpul glacialului.
Vacuolele sunt formaţiuni sferice cu diametrul de 0,3-0,5m, apar în
celula bacteriană în perioada ei de creştere activă. Numărul lor este variabil
în raport cu mediul de cultură (6-20 de vacuole pe celulă). Nu se cunoaşte în
prezent dacă vacuolele apar ca rezultat al activităţii metabolice şi al acţiunii
unor condiţii de mediu sau dacă reprezintă un loc de acumulare al produşilor
de degradare sau toxici pentru celulă. Se consideră că vacuolele pline cu
lichid ar îndeplini rolul de reglator al presiunii osmotice în raport cu mediul
extern, iar care conţin gaze ar permite celulelor să se ridice la suprafaţa
mediilor lichide, asigurând astfel contactul lor cu aerul.
Incluziile, sunt formaţii structurale, interne care apar în citoplasma
bacteriilor la sfârşitul perioadei lor de creştere activă. Prezenţa şi abundenţa
incluziilor variază în funcţie de condiţiile de mediu. Incluziile sunt structuri
legate de activitatea metabolică a celulei bacteriene, reprezentând în cele
mai multe cazuri, materiale de rezervă care se acumulează în diferite regiuni
ale celulei atunci când dezvoltarea culturii se face în ritm lent sau a încetat.
Capsula şi stratul mucos. Unele bacterii au proprietatea de a elabora,
în anumite condiţii de mediu, un material macromolecular cu caracter
vâscos, gelatinos. Capsula nu reprezintă o parte integrantă din celula
bacteriană, ci un produs inert, care rezultă din activitatea ei metabolică şi
care, de aceea, poate fi îndepărtat fără ca viaţa celulei să sufere. Capsula
protejează celula bacteriană de efectul nociv al desicaţiei, datorită
proprietăţilor sale hidroscopice. La bacteriile patogene, capsula exercită un
rol protector şi faţă de acţiunea fagocitelor, fie direct, împiedicând
adeziunea la suprafaţa leucocitului, fie indirect, prin efectul chimiotatic
negativ (antifagocitar) al substanţelor pe care le conţin. Datorită acestui fapt,
bacteriile patogene capsulate au o virulenţă mai mare pentru om şi animale.

45
 Cili sau flagelii sunt filamente subţiri, flexibile şi fragile, de formă
helicală cu spire de amplitudine neuniformă. Dispoziţia cililor la suprafaţa
celulei bacteriene, ca şi numărul lor, sunt în general caracteristice pentru o
anumită specie şi de aceea reprezintă un caracter taxonomic important (Fig.
7).

Fig. 7. Diferite tipuri de bacterii ciliate:

1-bacterie atrihă (neciliată); 2-monotrihă; 3-lofotrihă;
4-amfitrihă; 5-peritrihă; 6-cili inseraţi subterminal;
7-cili inseraţi ecuatorial.

Din acest punct de vedere întâlnim:

a) bacterii atrihe (lipsite de cili);
b) bacterii monotrihe (prevăzute cu un singur cil);
c) bacterii amfitrihe (cu câte un cil la fiecare pol al celulei);
d) bacterii lophotrihe (lophos-smoc de păr), cu un smoc de 5-30 cili
la unul sau la ambele capete ale celulei;
e).bacterii peritrihe (cu 30-100 cili situaţi de jur împrejurul
celulei).
Cilii reprezintă organele de locomoţie ale bacteriilor mobile, aşa
numite liber înnotătoare. Mişcarea cililor se realizează prin contracţii rapide
şi ritmice propagate de la o extremitate la alta a flagelului care îşi conservă
forma spiralată.
2.3. Compoziţia chimică a bacteriilor
Compoziţia chimică a bacteriilor este controlată genetic în ceea ce
priveşte numărul şi diversitatea, atât ale macromleculelor cât şi ale unor
molecule mici corelate funcţional cu acestea.
Apa reprezintă componentul cel mai important al celulelor bacteriene
(în medie 75-80% din greutatea medie a masei celulare). Apa se găseşte în
stare liberă şi legată. Îndeplineşte următoarele funcţii absolut esenţiale
pentru viaţa microorganismelor;
- solvent al diferiţilor constituienţi hidrosolubili şi ca mediu de
dispersie al celorlalţi constituienţi chimici insolubili în apă;

46
 - condiţionează activitatea enzimelor şi prin acestea face posibilă
desfăşurarea reacţiilor de metabolism intermediar;
- asigură transportul diferiţilor metaboliţi şi al produşilor de
catabolism în celula bacteriană. Scăderea conţinutului în apă liberă, conferă
bacteriilor o rezistenţă mărită la acţiunea temperaturii şi a substanţelor
chimice, iar dincolo de anumite limite, această scădere determină chiar
întreruperea activităţii metabolice a celulei.
Acizii nucleici. ADN se găseşte sub forma unei molecule unice dublu
helicale, cu greutatea moleculară 2,5x109 neasociată cu proteine sau alte
componente chimice înrudite, reprezintă circa 1/5 din conţinutul celulei.
Această cantitate fixă de ADN stabileşte prin ea însăşi o limită a numărului
de proteine care se pot sintetiza într-o celulă bacteriană şi implicit o limită a
numărului de molecule mici. ARN, reprezintă aproximativ10-20% (media
17) din greutatea uscată a celulei şi se găseşte în citoplasmă sub trei forme
foarte diferite sub raportul mărimii moleculei, al funcţiilor exercitate din
celulă şi al secvenţei bazale din structura lor: ARN mesager (ARNm), ARN
de transport sau solubil (ARNt sau ARNs) şi ARN ribozomal (ARNr).
Proteinele, reprezintă în medie 60% din greutatea uscată a
bacteriilor. În afară de proteinele simple în celula bacteriană se mai găsesc
proteine combinate cu molecule neproteice, alcătuind heteroproteide şi
cenapse (complexe glucidoproteice sau lipidoproteice). Cantitatea totală a
proteinelor bacteriene variază puţin în raport cu starea fiziologică a celulei,
însă natura proteinelor componente este foarte diferită, numărul de molecule
existente într-o bacterie putând varia între 1 şi105 pentru fiecare tip diferit
de proteină. Aproximativ jumătate din proteinele bacteriene funcţionează ca
enzime, iar restul au rol structural. (Fig. 12).
Glucidele, totalizează 4-25% din greutatea celulelor bacteriene uscate.
Sunt reprezentate de glucide simple (mono şi dizaharide) şi prin
polizaharide. Glucidele simple iau parte la metabolismul intermediar al
celulei, în timp ce polizaharidele au, după caz, rol plastic, energetic sau de
material de rezervă.
Lipidele reprezintă 1-20% din greutatea bacteriilor uscate, cantitatea
lor variind după specie, vârsta culturii şi condiţiile de cultivare. Lipidele
apar atât ca un component major al membranei citoplasmatice, cât şi sub
formă de granule intracitoplasmatice. Formarea şi degradarea lor în funcţie
de condiţiile de mediu, sugerează că ele ar reprezenta un depozit de rezervă
al atomilor de carbon, sub formă de substanţe cu nivel energetic relativ înalt.
Substanţele minerale, reprezintă 2-30% din greutatea uscată a
bacteriilor şi sunt reprezentate de P,K, Na, Ca, S,Cl, Fe, în cantităţi mai mici
se găsesc Cu, Mg, Zn. Cel mai bine reprezentat este fosforul, 45% putând

47
însă ajunge la bacilul tuberculozei până la 75% din greutatea totală a
substanţelor minerale ale celulei. Constituienţii minerali au un rol deosebit
de important în viaţa celulei bacteriene, prin aceea că:
- influenţează permeabilitaea peretelui celular;
- contribuie la reglarea presiunii osmotice şi la menţinerea echilibrului
de membrană;
- intră în compoziţia multor cnstituienţi celulari (rol plastic) şi a unor
enzime;
- activează (Cu, Mg, Zn) unele sisteme enzimatice;
- contribuie la reglarea pH-ului şi a potenţialului de oxido-reducere.
Celulele bacteriene tinere conţin de 6 - 7 ori mai multe substanţe
minerale decât cele bătrâne.
Pigmenţii bacterieni, sunt elaboraţi de celulele speciilor cromogene.
Pigmenţii bacterieni sunt substanţe colorate care pot rămâne în interiorul
celulelor, colorând caracteristic coloniile, sau difuzează la exterior, colorând
mediul de cultură.
După natura lor chimică, pigmenţii se împart în:
- derivaţi pirolici, de tipul bacterioclorofitelor întâlnite la bacteriile
fotosintetice;
- pigmenţii fenozinici;
- pigmenţii carotenoizi, de culoare roşie, galbenă sau portocalie;
- pigmenţii chinonici, înrudiţi cu vitamina K, de culoare galbenă;
- pigmenţi antocianici;
- pigmenţii melanici de culoare brună sau neagră.
Semnificaţia biologică a pigmenţiilor este variabilă în funcţie de
natura lor chimică. Aşa de exemplu, bacterioclorofitele au un rol esenţial şi
direct în fotosinteză, carotenoizii - atunci când se găsesc în cromatofori -
participă numai indirect la acest proces, captând energia luminoasă pentru a
o ceda clorofilelor.
Pigmenţii carotenoizi ai bacteriilor care nu sunt capabile de
fotosinteză au rol de a proteja celula faţă de razele ultraviolete. Alţi
pigmenţi se comportă ca vitamine cu acţiune binefăcătoare pentru bacteria
producătoare sau pentru organismele gazdă, iar alţii au o evidentă activitate
antibiotică faţă de alte microorganisme.

48
 Fig. 8. Reprezentarea schematică a raporturilor dintre diferiţi constituienţi chimici într-o
celulă la Escherichia (după Wattson)
Echipamentul enzimatic
Enzimele sunt biocatalizatori organici elaboraţi de celula vie şi sunt
caracterizate prin semnificaţia lor în raport cu substratul - moleculele asupra
cărora acţionează - şi prin comportarea lor ca acceleratori ai unor reacţii
implicând formarea sau desfacerea unei anumite legături covalente din
structura substratului lor. O dată reacţia desăvârşită, enzima se eliberează
pentru a se adsorbi pe noua moleculă de substrat, fiind capabilă să catalizeze
astfel până la 10-16 reacţii specifice pe minut.
Sub aspect chimic, enzimele bacteriene sunt fie proteine simple, fie
proteine conjugate. În acest din urmă caz, enzima activă (holoenzima) este
formată din două componente, inactive atunci când sunt separate şi anume:
apoenzima - proteina care determină specificitatea reacţiei enzimatice şi
coenzima - un compus termostabil organic sau anorganic. După raportul lor
cu celula în care s-au format, enzimele bacteriene se împart astfel:
a) enzime extracelulare (exoenzime), în general hidrolaze, care
sunt de obicei eliberate în mediu;
b) enzime intracelulare (endoenzime), care rămân în celulă.
Enzimele intracelulare aparţin la două subtipuri:
1 - enzime solubile, localizate la nivelul structurilor de suprafaţă ale
celulei de unde sunt eliberate cu uşurinţă în urma distrugerii acesteia sub
acţiunea ultrasunetelor sau a abrazivilor;
2 - enzime -”particulate”- legate de constituienţi insolubili ai celulei
ca membrana citoplasmatică, mezozomii, cromatoforii etc. În această ultimă
categorie intră enzimele metabolismului energetic şi cele ale aparatului
fotosintetizant care rămân, după dezintegrarea celulei, legate de resturile
celulare.
Metabolismul bacterian
Metabolismul bacterian reprezintă totalitatea reacţiilor biochimice
implicate în activitatea biologică a celulei bacteriene, prin intermediul
cărora energia şi elementele biogene ca atare sau sub formă de combinaţii
49
mai mult sau mai puţin complexe, sunt preluate din mediu şi utilizate pentru
biosinteză şi creştere, ca şi pentru alte diferite activităţi fiziologice
secundare (mobilitate, liminiscenţă etc). Ca urmare a acestor reacţii,
substanţele din mediu sunt transformate în constituienţi celulari, energie şi
produşi de uzură. După cum reacţiile metabolice sunt însoţite de eliberare
sau de consum de energie, ele sunt de două tipuri, reprezentând două feluri
de căi metabolice:
a) reacţii prin care se eliberează energie (exotermice sau
exergonice) corespund catabolismului sau proceselor de dezasimilare, prin
care se eliberează energie în urma degradării enzimatice a unor substanţe
nutritive din mediu;
b) reacţii prin care se consumă energie (reacţii endotermice sau
endergonice) corespunzând anabolismului sau proceselor de asimilare în
care energia este folosită pentru sinteza de constituienţi celulari.
Diferitele reacţii ale metabolismului îndeplinesc patru funcţii esenţiale
pentru viaţa celulei:
1. producerea subunităţilor folosite pentru construcţia constituienţilor
celulari, pornind de la substanţe nutritive;
2. eliberarea de energie şi stocarea ei sub formă de ATP şi alţi
compuşi macroergici;
3. activarea subunităţlor de construcţie monomere pe seama energiei
de legătură din compuşii macroergici;
4.formarea constituienţilor celulari macromoleculari prin
polimerizarea monomerilor (proteine, acizi nucleici, unele polizaharide)
proces care în unele cazuri, decurge conform schemei de programare
specifică, reprezentată de informaţia genetică a celulei.
Una dintre caracteristiciele distinctive ale activităţilor metabolice
microbiene este intensitatea lor excepţională, comparativ cu aceea a
activităţilor omoloage ale organismelor superioare. Aşa de exemplu,
activitatea respiratorie a unui gram (greutate uscată) de bacterii aerobe este
de câteva sute de ori mai intensă decât aceea a omului, iar procesul
metabolic al microorganismelor din cei 25 cm superficiali ai solului de pe o
suprafaţa de 1 ha, este echivalent cu acela al câtorva zeci de mii de oameni.
Pentru ca organismul uman să atingă un asemenea nivel de activitate
metabolică, ar avea nevoie de mai multe mii de tone de alimente pe oră. O
asemenea intensitate a activităţii biologice este posibilă în bună parte
datorită suprafeţelor foarte mari a celulelor microbiene în raport cu greutatea
lor. Aceste organisme au o suprafaţă largă de contact cu mediul
înconjurător, deci de schimb de substanţe între celule şi mediu, precum şi o
serie de proprietăţi fizico-chimice caracteristice sistemelor coloidale.

50
 Excepţionala viteză de creştere a bacteriilor reprezintă un avantaj
biologic important pentru supravieţuirea populaţeiei bactereiene în natură şi
în acelaşi timp constituie factorul principal care condiţionează dimensiunile
mici ale celulei bacteriene.
Exigenţele nutritive ale bacteriilor. Metabolismul bacteriilor este
condiţionat de prezenţa în mediu a tuturor materialelor necesare speciei date
pentru sinteza constituienţilor celulari şi pentru obţinerea de energie.
Mediile trebuie să conţină într-o formă organică şi minerală, calitativ şi
cantitativ corespunzătoare, toate elementele prezente în constituţia celulei
bacteriene. Trebuie deci să fie surse de: C, H, O, N, P, S, ca şi K, Mg, Mn,
Ca, Fe, Cl, sulfat, fosfat şi în cantităţi mici Zn, Cu, Mo (oligoelemente) care
sunt indispensabile pentru activitatea catalitică a enzimelor.
Pătrunderea substanţelor nutritive în celula bacteriană
Peretele celular, destul de “poros” al bacteriilor nu constituie o
barieră în calea substanţelor hrănitoare din mediu cu excepţia celor
insolubile sau care se prezintă sub formă de particule. Substanţele nutritive
care pătrund ca atare în celulă pot fi degradate chiar în mediul extracelular,
sub acţiunea enzimelor localizate la suprafaţa celulei. O dată trecute de
peretele bacterian, substanţele mai au de străbătut membrana citoplasmatică
de natură lipoproteică. Unii compuşi pot să o traverseze printr-un mecanism
specific, aşa cum se întâmplă cu solvenţii lichidelor care se strecoară prin
porii reţelei lipoproteice. În cele mai multe cazuri însă, pătrunderea
substanţelor nutritive în celulă poate avea loc numai printr-un fenomen de
transport selectiv, care implică o activitate metabolică celulară, deoarece se
realizează prin legarea prealabilă a moleculei, care urmează să intre în
celulă, de unele suprafeţe combinate specifice de la nivelul membranei
citoplasmatice. Transportul specific se poate realiza şi printr-un proces de
difuziune atunci când concentraţia externă a substanţei de transport este mai
mare decât concentraţia internă.
Procesele de degradare a substratului nutritiv la bacterii
Eliberarea de energie prin procese de catabolism se realizează în trei
faze distincte:
a. macromoleculele sunt descompuse pe cale enzimatică la unităţile
lor structurale: proteinele la aminoacizi, grăsimile la glicerol şi acizi graşi,
iar glucidele la hexoze. În această fază se eliberează mai puţin de 1% din
energia totală a macromoleculelor, care nu este utilizată în totalitate de
celulă şi se pierde în bună parte sub formă de căldură;
b. diferitele molecule rezultate din descompunerea efectuată în faza a
I-a sunt degradate mai departe în mod incomplet, cu eliberarea unei treimi

51
din energia lor totală şi cu formarea de CO2, H2 şi a numeroşi alţi produşi
diferiţi;
c. cea de a III-a fază de eliberare a energiei se realizează pe două căi:
1. la microorganismele care pot descompune integral substanţele
nutritive până la CO2 şi H2O, procesul final se desfăşoară pe calea ciclului
acizilor tricarboxilici;
2. la microorganismele care realizează numai o descompunere
parţială a substratului lor nutritiv, eliberarea de energie este mult mai slabă
şi rezultă din reacţii de fermentaţie în care produşii căilor catabolice
serversc direct sau indirect ca acceptori sau donatori de H în reacţii cuplate
de oxido-reducere. În această fază se eliberează cea mai mare cantitate de
energie utilizabilă pentru celulă.
Procesul de oxido-reducere biologică se poate prezenta schematic
astfel:
DH2+AD+AH2
Procesul nu se realizează spontan, ci necesită intervenţia unor
catalizatori celulari specifici (dehidrazele).
Metabolismul energetic la bacterii
După natura acceptorului final de H sunt trei tipuri de procese
metabolice:
1. respiraţia (respiraţia aerobă-oxibiotică), acceptorul final de H este
oxigenul molecular;
2. respiraţia anaerobă (anoxibiotică), acceptorul final de H poate fi
orice substanţă anorganică, exceptând O2;
3. fermentaţia, proces de oxido-reducere biologică, producător de
energie, în care acceptorul final de electroni este un compus organic.
Aceasta se realizează prin două procese de importanţă fundamentală:
a - eliberarea fracţională a energiei;
b - stocarea excesului de energie.
Tipurile de respiraţie la microorganisme
După comportarea lor faţă de oxigenul molecular, microorganismele
se grupează în patru tipuri respiratorii:
1. Microorganisme strict (obligatoriu) aerobe, care folosesc O
2 ca
acceptor final de H în ultima etapă a transferului de electroni în sistemul
citocromilor, au deci nevoie de prezenţa continuă a oxigenului atmosferic.
Capacitatea de a trăi în anaerobioză s-ar datora lipsei enzimelor respiratorii
sau faptului că pentru ele, produşii finali ai respiraţiei anaerobe sunt toxici;
2.
Microorganisme strict (obligatoriu) anaerobe. Nu se pot dezvolta
în prezenţa oxigenului molecular şi ca urmare, se pot cultiva numai în medii
sărăcite în oxigen. Ele nu dispun de enzimele respiratorii din categoria
52
citocromilor şi implicit de citocromi oxidază. În aceasta constă şi explicaţia
anaerobiozei lor stricte, deoarece în prezenţa O2 care se comportă ca
acceptor final de H,nu se formează apă, ci peroxid de hidrogen, care devine
toxic pentru bacteriile anaerobe.
S-H2+O2SH2O2
Microorganismele aerobe nu sunt expuse toxicităţii apei oxigenate,
deoarece ele ori nu produc acest peroxid sau dacă îl produc dispun de două
posibilităţi de al descompune rapid: prin intrarea în acţiune a catalazei,
enzimă care foloseşte ca substrat, prezentă la toate bacteriile aerobe:
2H2O22H2O+O2 sau prin utilizarea lui ca acceptor de electroni (H) în
oxidările catalizate de peroxidaze care îl reduc la apă:
H2O22(H)+2H2O
Bacteriile anaerobe sunt lipsite de catalază. Pe de altă parte se
consideră că moartea bacteriilor în prezenţa O2 ar fi determinată de creşterea
potenţialului de oxido-reducere care ar afecta ireversibil activitatea
proteinelor lor enzimatice, foarte sensibile la oxidare. Dacă în mediu se
adaugă substanţe reducătoare ca: cisteină, acidul ascorbic, care menţin
potenţialul de oxido-reducere la un nivel scăzut, ele pot trăi;
3.
Microorganismele aerobe facultativ anaerobe, capabile să-şi
orienteze metabolismul (spre respiraţie sau spre fermentaţiei) în funcţie de
disponibilităţile de O2, au în mod obişnuit un metabolism anaerob, fără însă
a fi sensibile la prezenţa O2. Unele dintre microorganismele de acest tip
respirator şi anume levurile, pot trece de la metabolismul aerob la cel
anaerob, în funcţie de condiţiile de mediu;
4. Microorganismele microaerofile, au nevoie de o cantitate de O mai
2
mică decât aceea din aerul atmosferic. Această particularitate s-ar datora
sensibilităţii unora din enzimele lor la condiţiile de oxidare puternică.
Procesele de asimilare la bacterii
Asimilarea este procesul pin care materialul nutritiv de natură exogenă
sau produşi simpli derivaţi din el, sunt încorporaţi în substanţa proprie a
unui organism. Ea se realizează prin intermediul căilor anabolice ale
metabolismului. Aceste căi sunt secvenţe de reacţii enzimatice, desfăşurate
în trepte prin care se efectuează sinteza constituienţilor celulari pornind de
la precursorii reprezentaţi de produşii intermediari ai catabolismului sau de
substanţe preluate din mediu.
Procesele de asimilare evoluează în mod diferit, în funcţie de prezenţa
sau absenţa O2 în mediu. În cazul asimilării oxidative, efectuată în prezenţa
oxigenului şi ca atare, caracteristică microorganismelor aerobe, numai o
parte din substratul consumat este folosit pentru oxidări, restul (cca. 50%)
fiind asimilat şi convertit în constituienţi specifici celulari, ceea ce are ca
53
rezultat o creştere celulară intensă, însoţită de multiplicarea activă. Dacă în
mediu sunt cantităţi limitate de substanţe folosite ca surse de carbon şi
energie, consumul de O2 continuă până când tot substratul din mediu este
epuizat, după care procesele metabolice se desfăşoară mai departe la un
nivel scăzut caracteristic celulelor în repaus, sursa de energie fiind în acest
caz endogenă. Spre deosebire de asimilarea oxidativă în cursul proceselor
anaerobe de fermentaţie, substanţele carbonate şi energetice din mediu sunt
folosite pentru formarea de constituienţi celulari numai în proporţie de 5%,
chiar în cazul celulelor în curs de creştere, în timp ce restul este degradat în
vederea obţinerii de energie, substanţele rezultate din reacţiile de degradare
acumulându-se în mediu ca produşi finali ai fermentaţiei.
Principalele tipuri de nutriţie bacteriană
Pentru activitatea lor vitală, bacteriile pot folosi fie energia radiantă
luminoasă, în care caz, având capacitatea de fotosinteză, au un mod de
nutriţie fototrof, fie energia eliberată prin reacţii chimice oxidative, la
întuneric, aşa cum se întâmplă cu marea majoritate a bacteriilor care sunt
capabile numai de chimiosinteză şi aparţin, ca atare, tipului de nutriţie
chimiotrof.
În raport cu capacitatea ei de biosinteză a metaboliţilor esenţiali,
celula bacteriană îşi poate desfăşura activitatea vitală printr-una din
următoarele modalităţi de nutriţie:
a. Autotrofia, care corespunde capacităţii de sinteză a tuturor
constituienţilor celulari pornind de la surse anorganice simple de C şi de N,
ca: CO2, NH3, NO2-, NO3-, etc;
b. Heterotrofia, care implică incapacitatea de sinteză a unor
metaboliţi esenţiali şi, decurgând din aceasta, nevoia obţinerii lor din mediu
ca substanţe preformate. Organismele cu asemenea insuficienţă metabolică
nu se pot dezvolta decât în prezenţa unor substanţe organice care servesc cel
puţin ca sursă de energie, de N şi C, astfel încât în timp ce autotrofele
sintetizează substanţa organică pornind de la compuşi minerali simpli,
heterotrofele nu-şi pot realiza sinteza substanţei proprii decât dacă dispun de
substanţe organice pe care să le descompună până la produşi mai mult sau
mai puţin simpli utilizabili în metabolismul lor.
c. Hipotrofia, care impune condiţionarea capacităţii de multiplicare
celulară, de o organizare adecvată a unor structuri şi activităţi complexe ale
celulei gazda.

Multiplicarea bacteriilor
Spre deosebire de organismele pluricelulare, la care multiplicarea
celulelor duce la mărirea taliei individului, la bacterii, ca şi la celelalte

54
microorganisme unicelulare, ea are ca rezultat creşterea numărului de
indivizi. Acest proces se realizează pe două căi:
1. Diviziunea simplă, directă sau binară;
2. Înmugurirea sau ramificarea.
Multiplicarea prin diviziunea simplă, este tipică pentru majoritatea
speciilor bacteriene atunci când celulele se află în condiţii optime de viaţă.
Constă în scindarea unui individ în două celule noi, care pot fi aproximativ
egale (diviziune izomorfă) sau inegale (diviziune heteromorfă).
La bacili şi spirili, diviziunea este de obicei transversală, urmând un
plan perpendicular pe axul mare al celulei şi numai excepţional, la unii
spori, ea se produce longitudinal, într-un plan paralel cu acest ax (Fig. 9.

Fig. 9 Reprezentarea schematică a diviziunii

bacteriilor prin strangulare (după Scanga)

Diviziunea prin strangulare se realizează prin îngustarea mediană a

celulei, determinată de invaginarea membranei ei citoplasmatice, urmată de
creşterea spre interior, tot prin invaginare, a peretelui celular. În felul acesta
fiecare din celulele fiice are propriul său perete celular astfel că în mod
obişnuit ele se pot separa definitiv la sfârşitul procesului.
La culturile tinere, la care diviziunea este foarte rapidă, se pot vedea
bacili divizaţi prin septuri derivate din membrana citoplasmatică în trei-
patru celule fiice care însă nu sunt încă separate din cauza dezvoltării
incomplete a pereţilor lor celulari.
Multiplicarea bacteriilor se face după un mecanism unic, în trei etape
succesive:
a. diviziunea citoplasmei prin intermediul unui sept transversal derivat
din membrana citoplasmatică şi dispus perpendicular sau oblic faţă de axul
mare al celulei. (Fig. 10).

Fig. 10. Reprezentarea schematică a diviziunii bacteriilor

prin formarea unui sept transversal (după Scanga)

55
 b. gâtuirea la nivelul acestui sept a peretelui celular care formează, la
rândul său, un perete transversal, pătrunzând prin creştere centripetă în
interiorul septului citoplasmatic pe care îl separă în două straturi subţiri;
celulele fiice astfel rezultate au nucleu, citoplasme şi membrane
citoplasmatice proprii, dar peretele lor celular este comun;
c. separarea efectivă a celulelor fiice prin scindarea peretelui lor
celular comun, urmată de despărţirea lor sub acţiunea forţelor de tracţiune
din mediu în funcţie şi de elasticitatea peretelui lor celular.
Multiplicarea prin ramificare şi înmugurire
Celula bacteriei mature formează o ramificaţie tubulară fină, ca o mică
umflătură terminală, care crescâd, devine o nouă celulă ovoidă, după care în
mijlocul tubului de legătură, se constituie un sept transversal.
Celulele fiice rezultate prin înmugurire au tendinţa să rămână ataşate
de celulele din care au derivat, astfel că prin asemenea procese succesive de
multiplicare se formează colonii de celule unite prin ramificaţiile lor
tubulare (Fig. 11).
Viteza de multiplicare a bacteriilor este excepţional de mare. Durata
unei generaţii - intervalul de timp dintre două diviziuni succesive- este tipică
pentru fiecare specie, dar variază şi în funcţie de condiţiile de mediu.

Fig. 11. Reproducerea bacteriilor prin înmugurire

laterală şi terminală (A şi B).

Celulele bacteriene fiice (spre deosebire de cele embrionale) ajung la

maturitatea deplină într-un interval extrem de scurt. Rapiditatea multiplicării
bacteriilor s-ar datora valorii foarte ridicate a raportului dintre suprafaţa şi
greutatea lor. Celula bacteriană are de aceea o suprafaţa de absorbţie
proporţional foarte mare, motiv pentru care procesele ei de asimilare şi
sinteză, de creştere şi reproducere se desfăşoară într-un timp foarte scurt.
Evoluţia unei culturi bacteriene
În condiţii experimentale, evoluţia unei culturi bacteriene este destul
de bine cunoscută şi se desfăşoară într-o serie de faze succesive: (Fig. 16).
a. Faza de latenţa sau de creştere zero - este cuprinsă între
momentul introducerii celulelor în mediu (însămânţare) şi momentul în care
56
ele încep să se multiplice. În cursul acestei faze, numărul bacteriilor rămâne
neschimbat, sau chiar scade temporar.
Faza de latenţa apare deci ca o perioada de adaptare la condiţiile noi
de cultură, în care bacteriile viabile din noul mediu îşi acumulează în celulă
metaboliţii esenţiali şi sistemele enzimatice necesare creşterii, în cazul în
care aceste componente biochimice le lipseau datorită condiţiilor de viaţă
anterioare însămânţării;
b. Faza de multiplicare exponenţială sau de creştere
logaritmică, este caracterizată prin aceea că, după o scurtă perioadă (cca. 2
ore) de accelerare a ritmului de creştere, în care multiplicarea se produce cu
o viteză progresiv mărită, acest ritm devine constant şi caracteristic pentru
un organism dat în anumite condiţii de cultură, durata unei generaţii fiind
minimă.
În aceasta fază celulele au dimensiuni mai mari decât cele
caracteristice speciei, iar citoplasma lor este omogenă, nu conţine materiale
de rezervă şi are o mare afinitate pentru coloranţii bazici datorită
conţinutului ei ridicat în ARN.
Celulele aflate în fază exponenţială de multiplicare sunt cele mai
potrivite pentru cercetări de genetică şi fiziologie bacteriană. După un timp
relativ scurt, tendinţa de multiplicare rapidă scade progresiv datorită
epuizării substanţelor nutritive din mediu şi acumulării în el a produselor de
catabolism în concentraţii cu efect inhibitor.
Acest fenomen de încetinire şi desincronizare a creşterii populaţiei
bacteriene reprezintă un mare avantaj pentru asigurarea echilibrului dintre
organismele vii în natură.
Dacă procesul de diviziune s-a desfăşurat numai în ritmul caracteristic
pentru mediile de cultură favorabile (în mediu câte o diviziune la 20’) în
interval de 48 ore, dintr-o singură bacterie ar deriva prin creştere
exponenţială 2,2x1043 celule. Cu toate că o celulă nu cântăreşte decât 2x10-
12
, o asemenea cultură ar avea circa 24 24 tone, adică o masă de aproximativ
de 4000 ori mai mare decât aceea a Pământului. (Fig. 12).
c. Faza staţionară maximală.
În această fază, numărul celulelor viabile este maxim şi rămâne
constant o perioadă de timp care durează de la câteva ore la câteva zile, în
funcţeie de sensibilitatea bacteriilor la condiţiile defavorabile de mediu.
Celulele bacteriene sunt considerate mature, având morfologia descrisă
drept caracteristică pentru fiecare specie: dimensiuni mai mici decât în faza
de creştere exponenţială, citoplasma mai puţin omogenă datorită apariţiei de
incluzii şi acumulării unor substanţe de rezervă, afinitate moderată, normală
pentru coloranţi şi prezenţa sporilor la speciile sporogene.

57
 Fig. 12. Curba de creştere a unei populaţii bacteriene în raport cu timpul, exprimată
prin logaritmul numărului de bacterii.
A - însămânţarea: A-B - faza de lag; B-C - faza de accelerare a ritmului de creştere; C-
D - faza de multiplicare logaritmică; D-E - faza de încetinire a ritmului de creştere; E-
F - faza iniţială de declin; F-G - faza intermediară; G-H - faza finală de declin.

d. Faza de declin corespunde unei scăderi progresive a numărului

de celule mobile, mergând până la sterilizarea bacteriologiă a culturii. La un
moment dat, numărul bacteriilor mobile scade în progresie geometrică în
raport cu timpul, datorită morţii unui număr foarte mare de celule. Uneori
celulele mobile pot persista câteva luni, multiplicându-se lent pe seama
substanţelor nutritive eliberate prin liza celulelor moarte.

Fig. 13. Modul de acţiune a substanţelor detergente: A - molecula asimetrică a unui detergent;
B - orientarea moleculelor de detergent la interfaţa a două lichide insolubile (apă şi ulei) cu formarea
stratului de adsorbţie care face legătura între ele; C - orientarea moleculelor de detergent la
interfaţadintre membranele celulei bacteriene care conţin lipide şi mediu apos înconjurător.

Norme generale de nomenclatură a bacteriilor

Codul Internaţional de nomenclatură al bacteriilor, elaborat în anul
1966, consideră drept categorie taxonomică de bază specia şi admite
următoarele categorii taxonomice principale în succesiunea lor ascendentă:
specia, genul, familia, ordinul, clasa şi diviziunea.
Potrivit acestor norme, fiecare microorganism este denumit după
sistemul binomial al lui Linne, prin două cuvinte latinizate (ex. Bacillus
subtilis). Primul cuvânt care indică genul este un substantiv la singular de
origine latină, greacă sau oricare altă limbă dar latinizat. El desemnează
anumite trăsături morfologice (Bacillus - baston mic, Micrococcus-grăunte
mic, sarcină-pachet) uneori asociate cu habitatul natural al bacteriei

58
(Lactobacillus-bastonaş mic din lapte) sau este derivat din numele unor
oameni de ştiinţă (Pasteurella-Pasteur).
Numele genului se scrie cu iniţială majusculă şi poate fi prescurtat (B.
subtilis). Cel de-al doilea cuvânt - epitetul specific - este în general
descriptiv pentru substantivul care reperezintă genul şi se seferă la culoare,
sursă, boală produsă, descoperitor sau orice alt element distinctiv. El poate fi
după caz:
- un adjectiv acordat în gen cu numele generic (Bacillus albus,
Sarcina aurantica, Spirillum rubrum);
- un adjectiv în forma participiului prezent al unui verb (Clostridium
dissolvens care este capabil să dizolve);
- un substantiv al genitivului posesiv (Streptococcus lactis –
streptococul laptelui; Diplococcus pneononiae - diplococul pneumoniei);
- un substantiv în opoziţie cu rol explicativ (B. radicicula-care trăieşte
pe rădăcini);
- un nume propriu în cazul genitiv (Proteus rettgeri) sau un adjectiv
derivat dintr-un nume propriu (Clostridium pasteurianum).
Epitetul specific se scrie totdeauna cu iniţială mică şi nu se
prescurtează. În unele cazuri, denumirea speciei este urmată de un singur
nume, acela al descoperitorului ei, sau două nume, al celui care i-a dat
primul numele şi al celui care l-a clasat (Micrococcus luteus-Schroeter
Cohn). Pentru speciile de bacterii, ca şi pentru plante şi animale se folosesc
două feluri de denumiri care trebuie bine diferenţiate: numele ştiinţific
acceptat internaţional (Mycobacterium tuberculosis) şi numele comun sau
popular (Bacilul tuberculozei, Bacilul lui Koch).
Tulpina bacteriană este o cultură pură a unei specii provenind din
descendenţii unei singure izolări din mediul natural; în mod obişnuit ea este
denumită adăugându-se la numele de specie numele persoanei care a făcut
izolarea, al localităţii, un număr sau un alt semn conevenţional de laborator.
Unele specii sunt subdivizate în subspecii sau varietăţi cu denumiri latine
(Mycobacterium tuberculosis, var. hominis – varietate provenită de la om).
Genul reprezintă un grup taxonomic format din mai multe specii
înrudite cu specia tip. El poate fi format dintr-o singură specie (gen
monotipic) sau obişnuit din mai multe specii.
Familia este un grup format din mai multe genuri înrudite, dintre care
unul este denumit genul tip. Numele familiei se formează de la numele
genului tip plus sufixul aceae, adăugat la rădăcina numelui generic. De
exemplu: Bacillus-bacillaceae; Spirochaeta-Spirochaetaceae.

59
 Ordinul este constituit dintr-un grup de familii înrudite şi este
denumit prin substituirea cu sufixul ales a sufixului aceae din numele
familiei tip: Spirochaetaceae - Spirochaetales.
Clasa este un grup taxonomic format din mai multe ordine înrudite.
Diviziunea (Phyllum) este constituită dintr-un grup de clase înrudite.
Încadrarea bacteriilor în regnul vegetal este justificată de o serie de
particularităţi morfologice şi mai ales fiziologice cum sunt:
- multe bacterii au capacitaţi de sinteză similare acelora ale plantelor
verzi care au un sistem metabolic autotrof, graţie căruia se hrănesc cu
substanţe anorganice;
- bacteriile heterotrofe au nevoie de substanţe organice pentru nutriţia
lor;
- substanţele nutritive pătrund în corpul bacterian sub formă solubilă.
În rarele cazuri când bacteriile folosesc o hrană solidă, aceasta este iniţial
hidrolizată şi solubilizată în mediul extracelular sub acţiunea unor enzime
eliberate din corpul bacterian;
- bacteriile pierd apa şi substanţele hidrosolubile prin diviziune
indirectă din interiorul celulei spre mediul extern, prin peretele celular;
- multiplicarea bacteriilor se face prin diviziune binară de-a lungul
axului transversal;
- bacteriile au un perete celular rigid, morfologic diferenţiat, care
înveleşte la exterior citoplasma şi membrana citoplasmatică aşa cum
membrana celulozică înveleşte celula vegetală.
Clasificarea generală a bacteriilor
Clasificarea bacteriilor s-a realizat pe baza criteriilor morfologice şi
fiziologice încât pentru identificarea unei specii sunt uneori necesare 40
până la 100 de teste. Dintre criteriile morfologice mai importante sunt cele
ce se referă la formele derivate prin sciziune, care dau denumirea de gen.
Un criteriu de bază este afinitatea tinctorială a bacteriilor; familia ca
unitate taxonomică, conţine acelaşi tip de bacterii: Gram pozitiv sau Gram
negativ.
Dintre criteriile fiziologice sunt folosite testele de asimilare sau
fermentare a glucidelor, relaţia faţă de oxigen, temperatură, pH, rezistenţă la
inhibitori ş.a.
Dintre datele ecologice se iau în consideraţie : habitatul, patogenitatea,
sensibilitatea la bacteriofagi. În cazul bacteriilor patogene şi facultativ
patogene, pentru identificare se folosesc reacţii serologice, deoarece aceste
bacterii, prin compoziţia lor, ajungând în circuitul sanguin, îndeplinesc
funcţia de antigen, declaşând în organism reacţiile de apărare prin formarea

60
de anticorpi specifici. Identificarea se face pe baza reacţiilor specifice între
antigeni-anticorp.
Clasificarea de bază folosită în prezent aparţine lui Bergey, în care
bacteriile sunt grupate în 10 ordine şi 47 familii (1952); această clasificare
este modificată în 1984 după criterii morfologice, prin care bacterile sunt
reîmpărţite în 33 de secţiuni. În continuare, în mod selectiv se vor trece în
revistă principalele ordine, familii şi genuri cu importanţă practică.
În clasificarea generală a microorganismelor, bacteriile sunt incluse în
regnul Procariotae, cu două diviziuni:
- Diviziunea SCOTOBACTERIA - cuprinde bacterii care folosesc
pentru creştere şi multiplicare energia rezultată din reacţii chimice (bacterii
chimiosintetizante);
- Diviziunea PHOTOBACTERIA - cuprinde bacterii ce conţin
pigmenţi similari clorofilei şi care pot folosi energia luminoasă în procese
de biosinteză celulară.
În diviziunea SCOTOBACTERIA bacteriile sunt clasificate în 3 clase:
A. Clasa BACTERIA - bacterii chimiosintetizante propriu-zise,
eubacterii;
B. Clasa ACTINOMYCES, bacterii filamentoase;
C. Clasa MOLICUTES (micoplasma) - bacterii lipsite de perete
celular, prezintă polimorfism, sunt bacterii patogene.

A. Clasa BACTERIA
1. Ordinul PSEUDOMONADALES – bacterii Gram negative, cu
habitat în sol şi ape, aerobe, nesporulate.
1. Familia PSEUDOMONADACEAE, cu următoarele genuri:
Pseudomonas - bastonaşe tipice, răspândite pe produse vegetale,
carne, pui; dau alterarea produselor refrigerate.
Acetobacter - bacterii acetice, produc oxidarea alcoolului etilic, se
folosesc la fabricarea acidului acetic de fermentaţie.
Xanthomonas - dau alterări ale legumelor, produc un polimer -
xanthanul.
Zymomonas - bacterii care pot produce fermentarea glucidelor, cu
formare de alcool ; sunt folosite la obţinerea alcoolului carburant din materii
celulozice.
2. Familia NITROBACTERIACEAE, cu genurile Nitrobacter şi
Nitrosomonas, care produc oxidarea compuşilor cu azot rezultaţi din
putrefacţie, cu transformarea azotului amoniacal în azotiţi şi azotaţi, formă
asimilată de către plante.

61
 3. Familia THIOBACTERIACEAE, produc oxidarea compuşilor cu
sulf. Bacterii din genul Thiobacillus pot fi agenţi ai coroziunii biologice.
4. Familia SPIRILLACEAE, produc degradarea celulozei în condiţii
aerobe. Dintre genuri: Cellvibrio, Cellfacicula, Cellulomonas. Bacterii ale
genului Cellulomonas sunt folosite pentru prelucrarea deşeurilor de hârtie
pentru obţinerea de proteină bacteriană folosită în scop furajer.
II. Ordinul EUBACTERIALES - cuprinde bacteriile propriu-zise,
foarte răspândite, ce cuprind bacterii în formă de coccus, bacterium şi forme
derivate prin sciziune.
1. Familia ACHROMOBACTERIACEAE - bacterii nesporulate, Gram
negative, produc putrefacţia.
Achromobacter – produc prin degradarea protidelor, amine biogene
toxice, sunt bacterii aerobe, produc alterarea produselor refrigerate.
Alcaligenes - produc reacţie alcalină în lapte, sunt nepigmentate, se
găsesc în carne, pui, peşte şi materii fecale.
Flavobacterium - se prezintă sub formă de bastonaşe, produc un
pigment galben-roşu, ducând la alterarea produselor la refrigerare.
2. Familia AZOTOBACTERIACEAE - bacterii care folosesc azotul
atmosferic în nutriţie, au rol în circuitul natural al azotului şi pentru
obţinerea de îngrăşăminte biologice - Azotobacter chroococcum.
3.Familia BACILLACEAE - cuprinde bacterii sub formă de bastonaşe,
Gram pozitive, producătoare de endospori.
Bacillus (25 de specii), cuprinde bacterii de putrefacţie aerobe,
anaerobe ; unele specii selecţionate se folosesc pentru obţinerea de enzime :
amilaze, proteaze, glucanaze.
Clostridium (93 de specii) - bacterii de putrefacţie anaerobe,
producătoare de toxine, bacterii butirice, bacterii producătoare de solvenţi.
4. Familia ENTEROBACTERIACEAE - cuprinde bacterii Gram
negative, nesporulate, aerobe/facultativ anaerobe, patogene/facultativ, cu
habitatul în tractul digestiv.
Escherichia - bacterii de putrefacţie, facultativ patogene (agenţi ai
gastroenteritelor), se pot înmulţi în produse alimentare, pot produce toxine.
E.coli este folosit ca indicator sanitar pentru verificarea condiţiilor de igienă,
la fabricarea produselor alimentare.
Enterobacter - face parte din microbiota intestinală.
Erwinia - produce putrezirea umedă a legumelor.
Proteus - bacterii de putrefacţie mobile, aerobe, produc alterarea
cărnii, a ouălor păstrate la temperatura camerei.

62
 Salmonella - cuprinde bacterii patogene pentru om; se pot înmulţi în
produse alimentare şi pot produce endotoxine, astfel încât prin consumul
alimentelor contaminate produc toxiinfecţii alimentare.
Serratia - bacterii aerobe, produc pigmentare în roşu, predomină în
produse vegetale, carne refrigerată.
Shigella - cuprinde bacterii enteropatogene (agentul dizenteriei).
5. Familia LACTOBACILLACEAE - bacterii lactice Gram pozitive,
nesporulate, facultativ anaerobe, sub formă de bacili (bastonaşe subţiri) sub
formă de derivate de coccus. Caracterul fiziologic comun este capacitatea de
a fermenta lacoza cu formare de acid lactic.
Streptococcus - cuprinde bacterii sub formă de streptococi. O parte
din speciile genului au trecut în g. Lacococcus, folosite drept culturi starter
în industria laptelui.
Lactobacillus - bacterii lactice acidotolerante, folosite în industria
laptelui şi pentru conservarea prin murare a produselor vegetale.
Pediococcus – bacterii lactice sub formă de tetrade. Pot produce
acrirea berii.
Leuconostoc – bacterii lactice heterofermentative, agenţi de alterare a
sucurilor, siropurilor de zahăr ş.a. Pot produce biosinteza dextranului.
6. Familia MICROCOCCACEAE – cuprinde bacterii Gram pozitive
cu forma coccus sau forme derivate prin sciziune.
Micrococcus - bacterii aerobe/anaerobe, de putrefacţie.
Sarcina - bacterii aerobe de putrefacţie.
Staphylococcus - bacterii facultativ patogene, produc enterotoxine şi
sunt agenţi ai intoxicaţiilor alimentare.
7. Familia PROPIONIBACTERIACEAE - bacterii nesporulate Gram
pozitive, produc fermentaţia propionică.
Propionibacterium - bacterii folosite la fabricarea brânzeturilor cu
pastă tare şi desen pentru obţinerea vitaminei B12.
B. Clasa ACTINOMYCES
I. Ordinul ACTINOMYCETALES - cuprinde bacterii
filamentoase, Gram pozitive, saprofite sau facultativ patogene, folosite
industrial pentru obţinerea de substanţe biologic active.
1. Familia MYCOBACTERIACEAE - cuprinde bacterii patogene.
În genul Mycobacterium-M. tuberculosis (agentul tuberculozei) şi M.
leprae.
2. Familia ACTINOMYCETAEA - bacterii patogene pentru
animale/plante. Au rol în formarea humusului şi la închiderea la culoare a
solului.

63
 3. Familia STREPTOMYCETACEAE - bacterii filamentoase. În
genul Streptomyces numeroase specii sunt folosite pentru obţinerea de
antibiotice (tetraciclina, streptomicina, cloramfenicol) sau pentru enzime
(glucozizomeraze).
II. Ordinul RICKETSIALES - cuprinde bacterii obligat parazite ale
insectelor, transmisibile prin înţepături la animale şi om.
Ricketsia - cu sp. R. prowazecki - agent al tifosului eczantematic.
Coxiella – bacterii patogene, produc febra Q-hemoragică. C. bruneti
se poate transmite prin lapte.

Tema 4 - Caracterizarea principalelor grupe de

microorganisme. Ciupercile microscopice: Levurile şi
mucegaiurile

CIUPERCILE MICROSCOPICE
Din rândul ciupercilor prezintă importanţă levurile şi mucegaiurile.
Levurile sunt larg folosite în practică pentru obţinerea unor produse
datorită activităţii lor fermentative (industria spirtului, oenologie,
panificaţie, industria berii, etc.) şi pentru extragerea din culturile lor a unor
vitamine din grupul B (B1 şi B2) şi a provitaminei D (ergosterol).
Unele specii de fungi (Aspergillus sp., Penicillum sp., Fusarium sp.
etc.) sunt folosite în industrie datorită capacităţii lor de a face biosinteza
unor substanţe foarte utile în practică.
Levurile şi mucegaiurile pot contamina alimentele, descompunând
siropurile de zahăr, dulceţurile, fructele conservate, laptele condensat, untul,
brânzeturile, făina, carnea conservată (chiar păstrată la frig) şi chiar
murăturile. De asemenea degradează pielea, hârtia (cărţi vechi şi documente
de valoare), legături de cărţi etc.

LEVURILE
Clasa ciupercilor se divide în patru subclase, printre care şi aceea a
Ascomicetelor, care formează spori numiţi ascospori în interiorul unei
celule cu perete gros, numită ască. Levurile aparţin acestei subclase care
cuprinde două ordine subdivizate în mai multe familii, printre care şi familia
Saccharomyceteelor în cadrul căreia Saccharomyces reprezintă unul din
genuri. Dar nu toate levurile formează asce.
Cele care nu formează asce, cum sunt levurile apiculate şi unele levuri
rotunde, sunt considerate ciuperci imperfecte (fungi imperfecţi) şi aparţin
familiei Cryptococcaceelor. Reiese deci că termenul de levuri nu are sens
botanic şi se referă la o grupă neomogenă de microorganisme.
64
Heterogenitatea botanică a levurilor face ca ele să fie repartizate în subclase
diferite de ciuperci. Totuşi, ele constituie o unitate destul de bine conturată.
O trăsătură specifică importantă, biochimică şi biologică a levurilor
este capacitatea lor de a produce fermentaţia caracteristică a mediilor care
conţin zaharuri. Termenul de levuri (de la lat. levere-a ridica; de la fr.
levain-aluat dospit ) prin care mai sunt desemnate aceste microorganisme,
reflectă efectul vizibil al acţiunii lor fermentative. Drojdia reprezintă de fapt
masa mare de celule rezultată din multiplicarea microorganismului, pe
seama substratului nutritiv ce îl constituie produsul fermentescibil, de unde
denumirea de drojdii echivalentă aceleia de levuri.
Clasificarea botanică a levurilor
Primul microbiolog care s-a ocupat de vin a fost chiar inventatorul
microscopului Antony van Leeuwenhock care a cercetat cu ajutorul
lentilelor şlefuite de el, multe produse între care şi sedimente de diferite
vinuri (1687).
Louis Jacques Thenard (1803) este cel dintâi care ia în considerare
levurile drept veritabilă cauză a fermentaţiei, iar mai târziu (1837)
Cagniard de la Tour arată că este posibilă cultura lor. Tot în acest an şi în
mod independent unul de altul, Kutzing şi apoi Schwann ajung la aceeaşi
concluzie şi anume că levurile sunt plante care se înmulţesc prin înmugurire
şi efectuează fermentarea alcoolică tot timpul vieţii lor.
Iulius Ferdinand Meyen Ress (1870) clasifică levurile drept ciuperci
şi introduce denumirea de specie ciuperci de zahăr-Saccharomyces (în
elenă, saccharos-zahăr, iar mycos-ciupercă).
Louis Pasteur (1857) este cel care demonstrează ştiinţific, prin
memorabilele sale lucrări, rolul levurilor în fermentaţia alcoolică. Emil
Christian Hansen (1881) imaginând un procedeu pentru obţinerea
culturilor pure prin care se porneşte de la o singură celulă de levură, a
studiat pentru prima dată proprietăţile difertelor tulpini şi a dovedit că unele
levuri sunt tot atât de dăunătoare pentru bere ca şi bacteriile. Tot Hansen
(1904) este cel care elaborează prima clasificare a levurilor, distingând pe
cele sporogene de cele nesporogene.
A. Guillermond în anul 1928 reia clasificarea lui Hansen, divide
genurile de Saccharomyces în cinci grupe şi descrie metodele de diferenţiere
utilizate. O mare contribuţie în această direcţie a fost adusă de savanţii
olandezi din şcolala lui Kluvyer de la Delf: în anul 1931, apare lucrarea lui
Stelling-Dekker asupra levurilor sporogene, în anul 1934 a lui Lodder
asupra levurilor asporogene nefilamentoase, în anul 1942 a lui Diddens şi
Lodder asupra celor asporogene filamentoase, iar în anul 1952 Lodder şi
Krege van Rij în lucrarea lor iau în considerare toate formele de levuri.

65
 Trebuie menţinută şi clasificarea făcută de Kudrawzen (1960) destul
de apropiată de aceea a lui Lodder şi colab. apărută în anul 1952. În lucrarea
lui Lodder în 1970 se acordă în sistematizarea levurilor un rol primordial
caracterelor fiziologice, fie de fermentare, fie de asimilare, rezervând un rol
secundar caracterelor morfologice şi extrem de redus celor ecologice.
Conform acestei noi clasificări care a adus multe schimbări de
denumire, levurile sporogene comportă 25 de genuri cu 190 de specii, iar
levurile asporogene 12 genuri cu 170 de specii. În prezenta lucrare se vor
păstra totuşi pentru Saccharomyces ellipsoideus şi Saccharomyces oviformis
vechile denumiri obişnuite în oenologie, bine cunoscute de practicieni care
folosesc curent în însămânţări aceste levuri.
Levurile izolate până acum în diferite ţări, pe struguri, în musturi ce
fermentează, în vinuri sau pivniţe - aparţin la 36 specii sporogene distribuite
în 8 genuri şi la 32 de specii nesporogene, reprezentând 7 genuri diferite.
Levurile sunt denumite prin numele latin al genului, urmat de numele
speciei care poate fi al autorului care a descoperit-o, Saccharomyces
steinerii, Saccharomycodes ludwigi sau inspirat de forma celulei
Saccharomyces oviformis, Kloeckera apiculata, sau numele locului unde
levura a fost descoperită Saccaharomyces italicus, Kloeckera africana.
În nomenclatura exactă se indică numele latin al genului (după caz şi
al speciei) urmat de numele autorului (levurile din genul Saccharomyces
(Meyen) Ress; Saccharomyces oviformis Osterwalder).
3.1.2. Morfologia şi structura internă a levurilor
Definite ca unitatea cea mai mică de materie vie care poate exista în
mod independent şi poate să se reproducă, celula este o masă de
protoplasmă limitată în spaţiu de un perete sau de o membrană celulară şi
posedă un nucleu. Ea se caracterizaeză în primul rând prin formă, mărime şi
structură internă.
Forma celulelor de levuri, controlată genetic, variază destul de mult
în funcţie de mediu, vârstă, etc; polimorfismul este pronunţat dar predomină
obişnuit forma tipică genului şi speciei: elipsoidală (Sacccharomyces
ellipsoideus), ovalară (Saccharomyces oviformis), sferică (Torula),
apiculată, asemenea unei lămâi (Kloeckera apiculata), alungită,
filamentoasă (Candida) etc.
Mărimea celulelor este diferită, variind de la 2-3µm până la 20-25µm
lungime, raportul între lungime şi lăţime fiind în general tipic speciei.
Peretele celular, element de structură care răspunde de forma
specifică celulei, alcătuit din mai multe straturi, este constituit din polimeri
de glucoză (glucani) şi de manoză (manani), proteină şi chitină. Între
copolimerii proteine manani şi proteine glucani, legaţi structural prin

66
intemediul glucozaminei, au fost puse în evidenţă legături -S-S. La nivelul
peretelui celular, îşi au sediul unele sisteme enzimatice hidrolizante
(exemplu: invertază) sau care participă la transportul diferitelor substanţe în
celulă (permează). Aceste sedii ar fi localizate în anumite zone ale peretelui
şi s-ar afla în spaţiu dintre perete şi membrana citoplasmatică sau chiar în
straturilor peretelui.
Pe suprafaţa exterioară a peretelui celular, gros de 700-1500 Å se
observă cicatricile lăsate de muguri după desprinderea lor de celula mamă.
Tot aici sunt vizibili pori mici cu rol de filtru ce permit accesul şi eliminarea
de substanţe în şi din celulă. (Fig.14).
Cu o structură granulară, mai subţire şi flexibil la celulele tinere, mai
gros şi rigid la cele batrâne, peretele celular controlează schimburile dintre
celulă şi mediu, protejând constituienţii celulari. Presiunea osmotică internă
ridicată menţine peretele întins, într-o stare de tensiune. Elasticitatea sa iese
totuşi în evidenţă când în mediul exterior celulei, intervin schimbări bruşte
ale presiunii osmotice.
Membrana citoplasmatică este structura ce separă peretele celular de
conţinutul celular la care aderă foarte intim şi de care nu se desprinde decât
printr-un şoc osmotic; este groasă de cca. 80 Å şi este alcătuită din trei
straturi, unul intern, unul extern, mai dense şi un strat intermediar mai clar.
Ea este constituită din lipoproteine, liponucleoproteine, polizaharide şi
compuşi ai siliciului (Fig. 15). Pe suprafaţa externă a membranei celulare s-
a observat prezenţa unor particule în aranjament hexagonal constituite din
manani şi proteine lipsite de activitate enzimatică. Ele intervin ca unităţi în
reţeaua peretelui celular şi sunt în strânsă legătură cu structurile fibrilare de
glucani.S-a observat prezenţa unor particule în aranjament hexagonal
constituite din manani şi proteine lipsite de activitate enzimatică. Se
presupune că la nivelul membranei externe citoplasmatice s-ar produce
polimerizarea glucozei în glucani, constituient de bază al peretelui celular.

Fig. 14. Structura internă a unei levuri (după Lindegran).

1. perete celular; 2. membrană citoplasmatică; 3. strat nucleoproteic; 4-5.
mitocondrii; 6. deschideri ale fusului adiacent vacuolei nucleare; 7.
deschidere prin care cromozomii intră în vacuola nucleară; 8. ADN dispersat
omogen; 9.
deschidere prin care cromozomii intră în vacuola nucleară; 10. ADN organizat; 11.
proteine receptoare; 12. baza histonică a cromozomului; 13. vacuola nucleară; 14.
67
 nucleol; 15. loc de ieşire al reticulului endoplasmatic din vacuola nucleară în
citoplasmă; 16. reticul endoplasmatic; 17. ribosomi; 18. ARN

Fig. 15. Structurile lipidice şi proteice din structura membranei celulare

Membrana citoplasmatică prezintă 10-15 porţiuni invaginate pe µm2,

lungi de circa 3000 Å, late de 200 şi adânci de 500 Å . Tocmai pentru că
membrana citoplasmatică nu este netedă ci prezintă numeroase invaginaţii şi
microvilozităţi, suprafaţa activă totală a celulelor dintr-o masă de must în
fermentare, este cu mult mai mare decât suprafaţa totală calculată a
acestora.
Rolul exercitat de membrana citoplasmatică este aceela al unei bariere
osmotice de permeabilitate, reglând pătrunderea în celulă şi eliminarea
selectivă a diferitelor substanţe ea menţine în celulă o concentraţie ridicată
de macromolecule, molecule mici şi ioni de K+ şi Mg++, impiedicându-le
difuzarea în mediu, deşi concentraţia lor extracelulară este mult mai mică
(G.Zarnea-1970).
Cercetările din ultima vreme au conchis ca în celulă, pe partea externă
a citoplasmei, ar fi localizate sisteme de transport a diferitelor molecule de
substrat, prin membrană, de la suprafaţa externă la cea internă. Aceste
sisteme denumite transportori, transportaze, permeaze ar avea trăsături
caracteristice enzimelor, pretinzând specificitate de substrat şi
stereospecificitate.
Ele s-ar combina cu ioni sau molecule de substanţe din mediul lichid
extracelular; complexul transportor astfel format ar putea difuza prin
membrană spre suprafaţa ei interioară, după care ionul sau molecula
transportată s-ar disocia de molecula transportoare, intrând astfel în lichidul
intracelular.
Viteza de transport a moleculelor prin intermediul acestor transportori
este influenţată de temperatură. Diferite molecule de substrat pot intra în
competiţie pentru un sistem de transport şi se diferenţiază prin afinitatea lor.
Aşa de exemplu, din categoria aminoacid-permeazelor a fost pusă în

68
evidenţă la S. cerevisiae o permează specifică pentru arginină care poate fi
inhibată competitiv de unii aminoacizi bazici.
De asemenea s-au evidenţiat permeaze ce asigură sistemul de transport
al lizinei în celulă, aminoacid ce poate folosi şi sistemul arginin-permeazei.
Similar metionina poate folosi două sisteme de transport însă numai pentru
unul are afinitate mai mare. Asimilarea aminoacizilor cu sulf ar putea în
acest fel să fie inhibată de alţi aminoacizi cu structură apropiată, prezenţi în
mediu în concentraţii mai ridicate (Grensen -1967).
La Saccharomyces chevalieri cultivată pe un mediu complet este
reprimată biosinteza sistemului de transport specific prolinei ceea ce ar
explica asimilarea extrem de redusă a acestui aminoacid de către levurile de
fermentaţie din mustul de levuri (Magana-Schencke, 1969).
Transportul activ ce intervine prin mijlocirea permeazelor necesită
energie. Este posibil ca ATP-aza pusă în evidenţă în membrana
citoplasmatică să fie implicată în transportul molecular care absoarbe
energie.
Citoplasma, constituită din apă, proteine, glucide, acizi nucleici etc.,
este incoloră, cu o reacţie neutră sau uşor alcalină şi ocupă cea mai mare
parte din celulă. La celulele tinere la care se observă curenţi citoplasmatici
cu mişcări circulare şi contracţionale, citoplasma are un aspect omogen, pe
când la cele bătrâne este neomogenă, cu o vâscozitate mai mare şi
refringentă datorită vacuolelor şi incluziunilor.
Citoplasma este locul unde în condiţii de anaerobioză se desfăşoară
cea mai mare parte a metabolismului energetic (fermentaţia).
Citoplasma posedă o organizare complexă şi conţine diferite structuri,
de două categorii: organite şi incluziuni. Organitele sunt structuri
specializate ale citoplasmei care fac parte din materialul viu al celulei:
reticulul endoplasmatic, ribozomii, aparatul lui Golgi, mitocondriile.
Incluziile citoplasmatice sunt structuri prezente în citoplasmă,
prevăzute cu membrană, dar care nu fac parte din matria vie; ele sunt
constituite în primul rând din substanţe alimentare stocate. De asemenea, în
citoplasmă se observă vacuole şi nucleul celular.
Reticulul endoplasmatic. Microscopia electronică a permis să se
constate că citoplasma celulară nu este un gel “optic vid” ci este străbătută
de un sistem membranos de canale tubulare, cu diametru de 120 la 150 Å, al
căror ansamblu formează reticulul endoplasmatic, pus în evidenţa de Porter
(1945).
Acest reticul, cu o structură destul de instabilă, se întinde de la
membrana citoplasmatică până la membrana extrenă a nucleului. Împreună
cu aparatul lui Golgi, reticulul endoplasmatic reprezintă elementele unui

69
sistem citoplasmatic vacuolar, ale cărui părţi comunică între ele în unele
locuri, în mod permanent sau temporar.
Se consideră că reticulul endoplasmatic ar servi la transportul
metaboliţilor celulari; se presupune că prin intermediul unor enzime
localizate la nivelul său ar participa la procesul de multiplicare, declanşând
înmugurirea. Reticulul endoplasmatic este constituit din reticul neted,
agranular şi reticul granular.
Ribozomii se găsesc pe faţa externă a canalelor care formează
reticulul endoplasmatic granular, precum şi în spaţiile dintre aceste canale.
Denumiţi şi “granule Palade” după numele cercetătorului de origine
română care le-a pus în evidenţă (1953), ribozomii joacă un rol esenţial în
procesul de biosinteză a proteinelor specifice celulei.
Ei au capacitatea de a fixa ARN-mesager (ARNm), care asigură
aranjarea specifică a aminoacizilor în lanţul polipeptidic. Ribozomii au
tendinţa de a se grupa în grămezi de 4-10-55 elemente individuale, formând
polisomi (poliribozomi) prin care se realizează cu mai multă eficienţă
procesul de biosinteză proteică.
Caracterizaţi după viteza lor de sedimentare la ultracentrifugare
(apropiată în unităţi Svedberg, notate cu litera “S”) ribozomii levurilor
Saccharomyces sunt constituiţi din mai multe fracţiuni cuprinse între 30S şi
120S.
Aparatul lui Golgi, constituit dintr-un complex de vezicule mai mari,
saculi şi din microvezicule, este de dimensiuni mici şi, aflându-se într-un
număr redus de unităţi (într-o celulă obişnuit 1 sau 2), este mai greu de pus
în evidenţă şi de aceea existenţa lui a fost de multe ori controversată.
Recent, este considerat ca o structură produsă de reticulul endoplasmatic,
consumată pe măsură ce are loc sinteza compuşilor peretelui celular; aşa s-
ar explica faptul că nu poate fi găsit constant în celulă. Opiniile sunt
împărţite cu privire la rolul acestei formaţiuni, considerându-se că ar
participa la metabolismul lipidelor, la sinteza compuşilor peretelui celular,
la acumularea unor substanţe toxice.
Mitocondriile apar în microscopul optic ca nişte grăuncioare în masa
citoplasmatică, dispuse mai ales în jurul membranei citoplasmatice.
Observate la microscopul electronic, reiese că ele sunt formaţiuni
aproximativ cilindrice, scurte, cu dimensiuni de la 1 la 3µm lungime şi 0,3
µm la 1µm grosime, mai mari la celulele mature.
Fiecare celulă conţine 40-50 de mitocondrii; celulele care îmuguresc
au un număr mai mare decât cele aflate în faza de repaus pentru că o parte
din mitocondrii trec la celula fiică; de asemenea la sporulare ele trec la

70
spori. Se consideră (Freywislin, 1955) că mitocondriile se dezvoltă în celulă
din particule mici care conţin acid nucleic, aşa numite promitocondrii.
S-a mai observat că peretele mitocondriei este constituit din două
membrane, dintre care cea internă se pliază spre interior formând cristale
caracteristice care crează un sistem compartimental de loji, de mărimi,
formă şi orientare dieferită, denumite spaţii intercristale. (Fig. 16).
Mitocondriile sintetizează, pe lângă enzimele din sistemul citocrom şi
multe aminoacid-oxidaze, putând realiza reacţiile caracteristice ciclului
Krebs, ca şi cele proprii esterificării fosfatului inorganic.
Ele îndeplinesc deci funcţii de importanţă vitală pentru celula de
levură, conţinând sisteme enzimatice care participă la metabolismul
energetic, la procesul de activare a aminoacizilor, la metabolismul lipidelor,
etc.

Fig. 16. Structura schematică a unei mitocondrii

(după Robertis şi Iraldi)

Se consideră că funcţia cea mai importantă a mitocondriilor este de a

produce şi conserva energia provenită din oxidările biologice (respiraţie).
Ele au fost asemănate cu centrala electrică ce furnizează celulei, sub formă
de ATP, mare parte din energia necesară. Se presupune că în spaţiile
intercristale sunt aşezate într-o anumită ordine numeroase enzime, ce
acţionează succesiv în mecanismele biochimice complexe la care participă.
(Fig. 17).

71
 Fig. 17. Aspectul unei mitocondrii văzută la microscopul electronic

Vacuolele sunt formaţiuni intracitoplasmatice, prevăzute cu

membrană periferică, provenind probabil din reticulul endoplasmatic ce au
formă sferică şi sunt pline cu un lichid în care se află numeroşi corpusculi
în mişcare.
Vacuolele mici, cu diametrul de aproximativ 0,5µm sunt obişnuit
grupate câte 5-6 în jurul nucleului, pe când cele mari, în număr de una sau
două, cu diametrul de peste 3µm sunt izolate. În afară de apă, zaharuri,
săruri minerale, în vacuole au fost găsite baze purinice, diferiţi aminoacizi,
polifosfaţi şi alte substanţe reţinute aici nu numai ca rezervă pentru nevoi
strict de hrană, ci mai ales pentru a le regla presiunea osmotică din interiorul
celulei. Semnificaţia biologică a vacuolelor este foarte controversată.
Considerate ca formaţiuni ce nu fac parte din materialul viu al celulei, ele
sunt apreciate de unii cercetători ca structuri trecătoare a căror apariţie este
legată de vârsta celulei şi de condiţiile de mediu; alţii admit că ele ar fi
formaţiuni cu caracter constant, supuse însă unor modificări de formă şi
mărime datorită unor factori încă necunoscuţi; vacuola centrală cu contur
neregulat, adiacentă nucleului ar comunica cu acesta, formând împreună cu
el organul complet. Mai recent, vacuolele sunt privite ca lizozomi tipici ce
răspund de digestia intracelulară a proteinelor, polipeptidelor, etc.,
membrana vacuolară trebuind să aibă în acest caz o structură care să reziste
acţiunii enzimelor hidrolitice conţinute în celulă.
Incluziunile citoplasmatice sunt constituite din lipide,
polimetafosfaţi, glicogen şi alte substanţe necesare celulei.
Granulele lipidice de formă globulară foarte refringente, în număr de
2-4 în celulele tinere, sunt mai numeroase în celulele mature, îndeosebi ale
levurilor micodermice, care provoacă boala denumită floarea vinului. Ele
servesc la depozitarea rezervelor de lipide, probabil fosfatide. Incluziile de
polimetafosfaţi, sub forma unor picături mici ce pot să conflueze, al căror
număr se micşorează foarte mult în condiţii de înfometare, reprezintă o
rezervă de substanţe cu rol extrem de important în respiraţie şi biosinteza
72
proteinelor şi acizilor nucleici. Incluziile de glicogen sub formă de
granulaţii refringente, repartizate în citoplasmă sau depozitate în vacuole,
constituie forma tipică de rezervă hidrocarbonată a celulelor de levuri (cu
excepţia celor apiculate) - Amerine M. 1970. Uşor de pus în evidenţă prin
coloraţia brună ce o formează cu iodura de potasiu, glicogenul începe să fie
depozitat în celulă după declanşarea fermentaţiei. Proporţia sa mică la
început, îndeosebi în celulele tinere (sub 30%) creşte apoi treptat putând
ajunge până la 40% din substanţa uscată, dar treptat se împuţinează pentru a
deveni absent la sfârşitul fermentaţiei. Când levura sporulează în celulă sunt
constituite rezerve importante de glicogen şi lipide. Unele levuri sunt
colorate în roşu (Rhodotorula) prin pigmenţi aparţinând grupului
carotenoizilor.
Nucleul reprezintă în celulă structura cu rol fundamental în ereditate
şi în reglarea sintezei proteinelor şi a acizilor nucleici, el apare la microscop
de culoare mai deschisă decât citoplasma, cu aspect granular, de formă oval-
alungită, deosebindu-se astfel de vacuole, de obicei sferice. Cu diametrul de
circa 2µm nucleul este înconjurat de o membrană dublă, de grosime totală
de 350-500 Å care este străpunsă pe întreaga ei suprafaţă de circa 200 de
pori circulari largi, cu diamtrul de 800-900 Å ce servesc la trecerea de
material între nucleu şi citoplasmă. Masa de nucleoplasmă a nucleului în
repaus are o reacţie neutrală, uşor acidă. Sărac în enzime respiratorii,
nucleul levurii îşi procură energia sa anabolică din substanţe bogate în
energie, cu care îl aprovizionează citoplasma. În ceea ce priveşte structura
internă a nucleului, opiniile cercetătorilor sunt încă foarte diferite.
Densitatea sau greutatea specifică a levurilor
Greutatea specifică a celulei vii de levuri în stare umedă variază între
1,06 şi 1,25. Ea depinde de proporţia diferitelor substanţe ce intră în
alcătuirea celulei şi care au densitate diferită de a apei (D = 1): lipidele cu
D< 1, glucidele şi proteinele cu D ~1,5, acizii nucleici cu D = 2, sărurile
minerale cu D = 2 la 2,5. Deoarece chiar la aceeaşi apecie compoziţia
chimică variază cu vârsta celulei şi cu compoziţia chimică a mediului,
celulele tinere turgescente au o greutate specifică inferioară celor bătrâne
mai ales dacă acestea din urmă sunt cultivate pe medii solidificate. Datorită
micimii lor şi îndeosebi valorii însemnate a raportului suprafaţă/greutate,
celulele de levuri se pot menţine în suspensie în must sau vin un oarecare
timp şi chiar în aer, având totuşi o densitate superioară acestor medii, ele se
sedimentează spontan, motiv pentru care levurile pot fi separate uşor prin
centrifugare din lichidele în care se găsesc.

73
 Compoziţia chimică a levurilor
Levurile au o compoziţie chimică foarte variabilă după specie, mediul
de cultură, vârstă. Cantităţile de substanţe conţinute în masa de celule,
provin şi sunt extrase în totalitate din mediu (mustul) în care acestea s-au
format; se pare că la unele levuri (peliculare) ele provin şi prin asimilarea
azotului din aer (H. Schanderl, 1940; H. Frei, 1942).
Levurile sunt constituite în principal din apă (70-75%), substanţe
azotate, glucide, lipide, substanţe minerale, vitamine, enzime precum şi alte
substanţe în proporţii mai mici.
Apa se găseşte în stare liberă mai ales în citoplasmă şi ca apă
inseparabilă din microstructura celulei legată prin forţe fizico-chimice de
diferiţi constituienţi celulari ce intră în structura celulei. Din punct de vedere
al conţinutului în apă, deosebirea dintre celula vegetativă şi spor nu este de
ordin cantitativ ci calitativ, în sensul că la spori marea majoritate a apei este
legată de constituienţi celulari; de aici decurge şi rezistenţa mai mare a
sporilor la temperaturi ridicate.
Substanţele azotate sunt foarte abundent reprezentate în celula de
levură. Conţinutul în azot total (N) al acesteia este de 4,8-12% din substanţa
uscată, ceea ce reprezintă 30-75% exprimat ca proteine (Nx6,25). Azotul se
găseşte în celulă sub formă de macromolecule şi de molecule simple.
Proteinele sunt constituienţii azotaţi cei mai abundenţi, cu viteză de
reînnoire foarte mică; ele conţin toţi aminoacizii naturali. (Tabel 5.). În afară
de proteinele simple, în celulă se mai găsesc şi heteroproteide
(glucoproteine, lipoproteine). Aproape jumătate din proteine funcţionează ca
enzime, iar restul au rol structural. Acizii nucleici sunt distribuiţi inegal în
celulă: ARN care se găseşte mai ales în citoplasmă predomină faţă AND
localizat în nucleu.

Constituţia medie în aminoacizi a proteinelor levurilor

(după Block şi Bolling) % din greutatea proteinelor
Tabel 5
Aminoacizii % din greutatea proteinelor
Cistină, Triptofan, Metionină 1,2 - 1,5
Histidină, Fenilalanină 2,6 - 3,5
Tirozină, Arginină, Glicocol, Prolină, Izoleucină 4,1 - 4,8
Serină, Treonină, Valină 5,0 - 5,7
Alanină, Leucină 6,1 - 6,3
Lizină, Asparagină 7,3 - 7,9
Glutamină 10,8

74
 Alături de aceste forme insolubile, se găseşte o parte importantă de
azot sub formă solubilă şi uşor schimbabilă cu mediul extern. Există în
celulă o rezervă (pool) de aminoacizi abundentă (15-20%) din azotul total
care constituie depozitul din care celula alege şi preia necesarul pentru
sintetizarea proteinelor sale (P. Dupny şi colab., 1967). Formele de azot
purinic şi pirimidinic, constituienţii acizilor nucleici ai levurii, reprezintă
aproximativ 8 şi respectiv 4% din azotul total.
Conţinutul în azot al levurilor variază în acelaşi sens cu conţinutul lor
în substanţe minerale şi în sens inevrs cu cel în glicogen.
Glucidele sunt după apă şi substanţe azotate un constituient abundent
reprezentat în compoziţia levurilor, proporţia lor putând ajunge 25-50% din
substanţa uscată a celulei. Glucidele intră în compoziţia peretelui celular
(glucani, manani, glucozamină, chitină), în compoziţia ADN (dextroriboză
şi riboză) şi ARN (riboză) sau sunt depozitate ca substanţe de rezervă
(glicogen).
Pot fi astfel distinse două grupe de polizaharide: structurale şi
metabolice. Polizaharidele structurale, îndeosebi cele componente ale
peretelui celular se află în proporţii relativ constante, variabile cu vârsta
celulei.
Bazat pe rezultatele spectrelor de rezonanţă magnetică, protonică s-a
stabilit că aceste polizaharide sunt compuse din manan ce conţine 95-98%
fragmente monopiranozice (I.V. Zintchenke şi colb., 1976).
Sunt şi levuri, îndeosebi nesporogene, mai ales din genul Torulopsis,
care formează în jurul celulei un fel de capsulă constituită din substanţe
asemănătoare cu amidonul, ce dau coloraţie pozitivă cu iodul (astfel de
hidrocarbonate capsulare au fost făcute răspunzătoare de toxicitatea şi
reacţiile imunologice la levurile ce provoacă micoză).
Referitor la polizaharidele metabolice în celulele bine hrănite
majoritatea carbohidraţilor este depozitată ca glicogen. Ca alte polizaharide
citoplasmatice, mai sunt menţionate gume, îndeosebi manani.
Proporţia zaharurilor simple (monozaharide) este foarte variabilă,
adesea de la 0,1% raportat la substanţa uscată, apropiindu-se de 50% la
levurile osmofile. Anaerobioza impusă levurii are drept consecinţă o
creştere a conţinutului în zaharuri uşor fermentescibile a celulelor,
comparativ cu aerobioza.
Lipidele reprezentate de trigliceride, glicerofosfatide şi steroli (de
exemplu ergosterolul), constituie o substanţă de rezervă cu înalt nivel
energetic, 2-5% din greutatea substanţei uscate a celulelor de levuri.
Acumularea lor în celulele bătrâne este un semn de degenerescenţă. La

75
unele specii (Torulopsis lipofera) şi în anumite condiţii de cultură, proporţia
de lipide poate ajunge la 50%.
Substanţele minerale se găsesc în proporţie de 5-10% din greutatea
uscată a celulei. Componenţii principali ai substanţei minerale sunt: fosforul
(circa 50%) şi potasiu (circa 25%), restul fiind reprezentat de magneziu,
calciu, fier, sulf, siliciu, clor şi altele.
Aceste elemenete se găsesc în combinaţii anorganice sau intră în
compoziţia unor substanţe organice, aflându-se deci ca electroliţi în soluţie
sau sub formă de complexe coloidale .
Vitaminele din grupa B se găsesc în proporţie însemnată în
compoziţia levurilor .
Provitamina D (ergosterol) este de asemenea reprezentată, iar unele
specii de levuri roz (Torula rubra, Torula sanguinea) conţin cantităţi
însemnate de carotenoizi, înrudiţi cu vitamina A. Vitaminele hidrosolubile
se găsesc în proporţii mici.
Capacitatea levurilor de a se înmulţi repede şi de a sintetiza şi acumula
în mare proporţie aminoacizii esenţiali şi vitamine din grupa B, substanţe de
mare însemnătate pentru alimentaţia animalelor ca şi a omului, justifică
amploarea ce a luat-o producţia industrială a acestor microorganisme,
pornind de la cele mai diferite materii pentru obţinerea de masă celulară
(drojdii furajere) şi pentru extragerea din culturile lor a unor vitamine din
grupul B şi a provitaminei D (ergosterol).
Echipamentul enzimatic al levurilor este foarte complex, numărul
tipurilor de enzime limitat ca la toate fiinţele vii de numărul determinanţilor
genetici cuprinşi în genomul celulei, este la aceste organisme deosebit de
mare, ceea ce explică activitatea lor fiziologică intensă şi variată. În celula
vie a levurii se sintetizerază enzime extracelulare (exoenzime), în general
hidrolaze, de obicei eliberate în mediu şi enzime intracelulare
(endoenzime) ce rămân în celule din care unele pot fi eliberate uşor prin
zdrobirea mecanică a celulei (enzime solubile) pe când altele (enzime
particulate) rămân fixate de constituienţii insolubili ai structurii pe care se
află în celulă (membrana celulară, mitocondrii).
Substanţe cu masă moleculară mare şi structuiră complexă, enzimele
îşi exercită efectul catalitic reacţionând cu o mare specificitate numai cu
anumite substanţe (substratul), care de regulă are o masă moleculară de sute
de ori mai mică; se caracterizează prin comportarea lor ca acceleratori ai
unor reacţii implicând formarea sau desfacerea unei anumite legături
covalente din structura substratului lor, o dată reacţia desfăşurată, enzima se
eliberează pentru a se adsorbi pe o nouă moleculă de substrat, fiind capabilă
să catalizeze astfel până 106 reacţii specifice pe minut. Reacţiile enzimelor

76
se desfăşoară la temperatura obişnuită cu un randament încă nerealizabil în
laborator, în aceleaşi condiţii de reacţie.
Unele enzime sunt alcătuite din două componente, apoenzime şi
coenzime, funcţia catalitică fiind realizată de coenzimă, iar apoenzima
asigurând specificitatea reacţiei. Luată separat, coenzima are slabe
proprietăţi catalitice. În complexul apoenzimă cu coenzima corespunzătoare,
activitatea catalitică creşte enorm.
Alte enzime sunt constituite dintr-o singură componentă, proteine cu
grupări funcţionale (centre sau şisturi active) ce-i conferă proprietăţi
catalitice.
În majoritatea cazurilor acţiunea catalitică a enzimelor se manifestă
numai în prezenţa unor substanţe denumite cofactori. În prezent se
deosebesc trei grupe de cofactori: coenzimele, substanţe organice cu
greutate moleculară mică, termostabile, care dializează uşor; grupări
prostetice, substanţe combinate strâns cu apoenzima care disociază greu şi
rămân fixate pe apoenzimă; activatorii (cofactorii anorganici) substanţe
nespecifice (diferite metale, agenţi reducători) care mediază trecerea
enzimei într-o stare catalitică activă.
Multe grupări prostetice şi coenzime cunoscute până în prezent sunt
derivaţi ai vitaminelor hidrosolubile; se pare că vitaminele liposolubile nu
pot fi cofactori. Starea coloidală a enzimelor condiţionează o localizare
strictă a lor şi deci şi a reacţilor biochimice efectuate de ele la nivelul
diferitelor structuri în ineriorul celulei. În principiu, o enzimă poate cataliza
o reacţie în ambele sensuri: în practică, adică în interiorul celulei, nu este
totuşi posibil ca ea să acţioneze simultan în ambele direcţii. Însă cum în
locurile foarte aglomerate nu se poate folosi o singură scară ci două: una
urcătoare, alta coborâtoare - tot astfel în celulă o enzimă realizează reacţia
într-un sens iar o alta, aceeaşi reacţie, dar în sens invers (izoenzime).
Pentru a conduce la o fermentaţie continuă şi completă enzimele
trebuie să fie prezente în proporţia necesară şi să se afle la optimum de
activitate.
Majoritatea enzimelor implicate în catabolism sunt sintetizate numai
în prezenţa substratului lor în mediu (inductibile), pe când altele sunt
elaborate de celulă independent de compoziţia mediului nutritiv
(constitutive). Celula dispune de sisteme de reglare care ajustează continuu
setul de enzime în activitate şi cantitatea realativă din fiecare, după cerinţele
metabolismului ei şi ca răspuns la variaţiile mediului extern.
Sunt numeroase dovezi că în celulă există o organizare biochimică
controlată şi interrelaţii între diferitele sisteme. Astfel, celulele nu manifestă
reacţii pe care sunt potenţial capabile să le efectueze. De exemplu, energice

77
proteinaze endogene, întreţinute în celula vie, nu-i fac nici un rău şi nu-i
provoacă autoliza decât după moartea acesteia, sau aparenta imunitate a
rezervelor de hidrocarbonat ale celulei vii, faţă de atacul sistemului ei
fermentativ în absenţa aerului. Este de presupus că in vivo enzimele ar fi
protejate structural de accesul la substraturilor lor, ori că ele există într-o
stare inactivă şi la un semnal sunt convertite în forme active.
Organizarea biochimică a celulei reiese şi din reacţiile ei cu pH-ul.
Puţin influenţate de pH-ul din jurul lor într-un larg interval de valori (3,5-8),
levurile menţin în fapt, în interiorul celulei, un nivel cât se poate de constant
al concentraţiei ionilor de hidrogen, pH-ul variind aici foarte puţin, în jurul
valorii 6. Celula ca un întreg este electropozitivă şi îşi menţine această stare
de-a lungul unei game largi a valorilor pH chiar când sarcina ei este
reversibil redusă de clorura de sodiu ce provoacă pierderea de K+ din celulă.
Unele substanţe (acid acetic, acid propionic) pătrund repede în întreaga
celulă; altele (acid gliceric, acid succinic, ioni clor) traversează uşor peretele
celular dar rămân în aşa numita cameră metabolică externă neputând depăşi
membrana citoplasmatică; o altă categorie (inulina, ionii succinat sau de
sodiu) nu pot intra în celulă nici după 30 minute. Că aceste proprietăţi rezidă
în limita protoplasmatică o indică şi capacitatea acidului piruvic de a intra în
celulă, dar nu şi ionul piruvat. Situaţia este similară şi pentru alţi acizi slabi,
chiar anorganici, ca de exemplu acizii sulfuroşi şi hidrofluoric. De
asemenea, puterea de tamponare a celulei este considerabilă; 10 ml de acid
sulfuric n/22 schimbă pH-ul a 12,5 g levuri de la 5,94 la 5,27 (M. Ingram,
1955).
Această organizare ce permite controlul funcţionării tuturor sistemelor
interne asigură celulei vii o unitate integrală şi o suficientă rezistenţă la
influenţele externe. Dar o perturbare, chiar de scurtă durată, a acestei
organizări duce la deranjamente importante şi cel mai ades la moartea
celulei. Astfel încălzirea pentru câtva timp la temperaturi de 600C sau
tratarea cu soluţii hipertonice, ori cu solvenţi (acetat de etil) sunt cauze ce
pot declanşa autoliza şi moartea celulelor.
3.1.4. Reproducerea levurilor
Levurile se pot înmulţi pe cale asexuată prin înmugurire sau prin
diviziune directă şi pe cale sexuată prin conjugare.
În timp ce reproducerea pe cale asexuată este observată la toate
genurile şi speciile de levuri, reprezentând modul cel mai tipic de înmulţire
a lor în condiţii favorabile de mediu, reproducerea pe cale sexuată însoţită
de sporulare este observată numai la levurile sporogene.
Înmugurirea este un proces iniţiat de un semnal chimic emis la
nivelul reticulului endoplasmatic, care se declanşază imediat ce mediu este

78
bogat în hrană şi temperatura prielnică; el începe cu deplasarea treptată a
nucleolui către peretele celulei după care se produce o alungire şi apoi o
divizare a lui; în locul de contact are loc o invaginare a peretelui care este
străpuns prin deplasarea de masă protoplasmatică, iar pe suprafaţa celulei se
formează un muguraş ce se măreşte repede şi care este celula fiică (Fig. 18).
Pe măsura creşterii sale se produce ştrangularea deschiderii din peretele
celulei-mamă, ajungându-se curând la închiderea totală a acesteia.
Înmugurirea este denumită polară, bipolară sau multipolară după cum noua
celulă se formează la una sau la două din extremităţile celulei mamă, sau în
oricare loc pe suprafaţa acesteia. Noua celulă se desprinde apoi de celula ei
de origine şi curând formează la rândul ei muguri. Când celulele fiice nu se
desprind, ci rămân ataşate, iar înmugurirea continuă atât pe celula mamă cât
şi pe celulele fiice, pot să se formeze grupuri arborescente în formaţii
pseudomiceliene ca la levurile înalte folosite în industria berii. În
fermentaţia mustului de struguri celulele fiice se izolează, element
caracteristic levurilor joase.

Fig. 18. Înmugurirea la levuri (după C.J. Perez şi R.D. Reid, 1972).1. mugure; 2. canal de
legătură; 3. nucleu; 4. vacuolă adiacentă nucleului; 5. nucleol.

În mod obişnuit, fiecare celulă-fiică este liberă când atinge cam

jumătate din mărimea normală şi nu înmugureşte până nu ajunge la mărimea
caracteristică maturităţii. La unele levuri, uneori, se întâmplă ca celulele
fiice să înceapă să prolifereze înainte de a se elibera aşa că se formează
lanţuri scurte de celule cu talie din ce în ce mai mică, celulele desprinzându-
se libere pe rând de la capătul gros.
Dacă desprinderea celulelor se produce când celulele fiice sunt încă
mici, celulele lanţului au mărimi ce descresc repede şi lanţul este scurt
(Short-shoot growth); dacă separarea este mai târzie, lanţurile vor fi relativ
lungi şi celulele sunt puţin diferite ca mărime (long-shoot growth).
Primul tip de creştere serveşte spre a distinge speciile de
Saccharomyces în faza haploidă. A fost posibil experimental să se distingă
diviziunea celulelor de creşterea lor, ca substanţă celulară, prima fiind
dependentă de aprovizionarea cu grupări - SH, a doua de raportul dintre
vitezele de diviziune şi de formare a substanţei celulare.
79
 Nitratul de cobalt inhibă diviziunea fără a împiedica creşterea în
volum a celulei, dând celule gigantice; acţiunea toxicului poate fi anulată
prin adaus de compuşi prin grupari - SH (cisteină, de exemplu). Aerarea,
reacţionând asupra proporţiilor de grupări - SH în mediu, influenţează şi
morfologia levurilor.
Diviziunea directă, asemănătoare cu cea de la bacterii este un mod de
reproducere asexuată caracteristic levurilor din genul Schizosaccharomyces
(numite şi levuri de fuziune). Procesul începe cu alungirea celulei, după care
nucleul se divide, cei doi nuclei formaţi migrând spre extremităţile celulei.
Prin formarea unui sept transversal în mijlocul celulei mamă, se petrece
separarea celor două celule-fiice, care se pot desprinde una de alta sau pot
rămâne legate, dând naştere astfel unui pseudomiceliu.
Evoluţia unei culturi de levuri interesează pe oenolog tot atât de
mult cât şi comportamentul unei singure celule.
Dacă la anumite intervale de timp, începând din momentul
însămânţării se numără celulele de levuri într-un mediu nutritiv, se constată
că procesul de multiplicare evoluează după o curbă de creştere la care se
pot distinge mai multe faze principale succesive (Fig. 19).

Fig. 19. Curba de înmulţire a levurilor prin înmugurire.

1-2. faza de repaus (faza lag); 1.a. perioada de adaptare; 2.a. perioada de
refacere; 2-3. faza exponenţială; 3-4. faza staţionară; 3.b. perioada de spor de creştere
vegetativă; 4.b. perioada staţionară (propriu-zisă); 4. faza de pieire.

Faza de latenţă (de creştere zero sau de lag) reprezintă etapa de

timp când după inoculare numărul celulelor rămâne neschimbat sau chiar
scade; adaptarea la noile condiţii de mediu implică latenţa necesară inducţiei
acelor enzime corespunzătoare noului mediu nutritiv. După aceasta,
populaţia de celule intră în echilibru cu mediu înconjurător, se declanşază
înmulţirea şi viteza de diviziune se apropie de un nivel constant. Faza este
obişnuit mai scurtă dacă inocularea s-a făcut cu celule în creştere activă şi

80
mai lungă cu celule bătrâne; ea poate fi prelungită de inhibitori (SO 2). Un
inoculum dintr-o cultură ce conţine spori produce la început o cultură cu o
proporţie însemnată de suşe diploide, care datorită complexului lor
enzimatic probabil superior, sunt capabile să crească mai repede ca cele
haploide.
Faza de multiplicare exponenţială (logaritmică) se caracterizează
printr-o creştere în progresie geometrică (cu raţia 2:20, 21, 22, ..2n) a
numărului de celule ca şi a cantităţii de materie vie formată. În această fază
de creştere, durata de formare a unei generaţii noi este minimă şi
caracteristică fiecărui microorganism (la levuri deşi mai mare ca la bacterii,
acaeastă durată nu depăşeşte totuşi câteva ore).
Creşterea populaţiei de levuri poate fi apreciată fie prin numărul
celulelor, fie prin greutatea uscată a masei acestora, folosind metode directe
sau indirecte, adecvate. Atât timp cât echilibrul este menţinut, creşterea
continuă cu viteză constantă chiar dacă concentraţia substanţelor nutritive
suferă schimbări mari (de exemplu, zaharurile scad de la 200 la 20 g/l,
azotul uşor asimilabil de la 1 la 0,1 g/l); aceasta deoarece reacţiile de bază
sunt enzimatice şi cât timp substanţele rămân prezente în concentraţii
adecvate saturării enzimelor, metabolismul continuă cu aceeaşi viteză.
Perioada de echilibru poate fi menţinută numai atât cât nu intervin alterări
importante pe care creşterea le poate provoca în compoziţia mediului
(formarea de alcooli).
Faza staţionară în care numărul celulelor viabile este maxim şi
rămâne constant o perioadă de timp, iar numărul total al celulelor (vii şi
moarte) creşte, se instalează treptat pe măsură ce mediul se epuizează în
substanţe nutritive (zaharuri) şi se îmbogăţeşte în produşi toxici de
catabolism. Intervine astfel un declin al vitezei de multiplicare şi o
pronunţată scădere a viabilităţii celulelor. Viteza de multiplicare scade în
aşa măsură încât devine egală cu aceea cu care celulele mor. Prin cultivarea
la temperaturi ridicate, numărul maxim de celule viabile, ca şi durata fazei
staţionare, se micşorează. Celulele de levuri au în această fază
caracteristicile morfologice cele mai tipice genului şi speciei.
Faza de declin se caracterizează printr-o scădere în progresie
geometrică, în raport cu timpul, a numărului de celule vii, datorită morţii tot
mai multor celule. Pe măsură ce mediul devine mai puţin favorabil, celulele
vii încetează de a mai forma muguri, deşi activitatea lor mai continuă un
timp după care mor şi intră în autoliză. Acest declin poate interveni cu mai
multă întârziere la tipurile robuste de levuri. În unele cazuri, aşa zisele
celule durabile folosind substanţe nutritive eliberate prin exorbţie şi prin
autoliza celulelor moarte şi micşorându-şi talia ca şi grosimea pereţilor,

81
reuşesc să-şi păstreze viabilitatea, aşa că au putut fi observate chiar celule
înmugurite în culturi vechi de mai mulţi ani. Aceasta dovedeşte dieferenţele
fiziologice mari ce există în celulele unei aceleiaşi culturi, datorită
variabilităţii de comportament.
La sfârşitul acestei ultime faze se înregistrează maximul absolut al
numărului total de celule formate pe parcursul întregii evoluţii a culturii.
Se apreciază că după terminarea fermentaţiei spontane a unui must
proaspăt de struguri (desfăşurată timp de câteve zile, fără folosirea de
anhidridă sulfuroasă) numărul total al celulelor de levuri ce revine pentru un
litru este de circa 200 miliarde. Diviziunea atât de rapidă a levurilor şi a
microorganismelor în general, comparativ cu alte vieţuitoare, este posibilă
graţie valorii foarte mari a raportului dintre suprafaţa totală a celulei şi
greutatea ei, ceea ce le dă posibilitatea să realizeze foarte repede procesele
de asimilare şi sinteză, devenind mature şi capabile de reproducere într-un
timp foarte scurt.
Aspectul celulelor de levură, la examenul microscopic al culturii în
diferite faze al evoluţiei acesteia, este deosebit. Levurile tinere,
predominante în mustul pornit în fermentare au un aspect turgescent,
peretele celular este subţire, protoplasma lor este omogenă, hialină, sunt
apropape transparente, cu vacuole mari, cu o structură a plasmei slab
pronunţată.
Totdeauna sunt prezente celule înmugurite. Celulele mature,
dominante în timpul şi mai ales spre sfârşitul ferementării, sunt mai ferm
conturate; în plasma lor, cu aspect granular sunt adunate substanţe de
rezervă (glicogen, picături de grăsime), iar vacuolele deşi mai mici, sunt
mult mai evidente. Levurile în stare de repaus, cele înfometate şi îmbătrânite
aflate într-un mediu nefavorabil, care pot fi întâlnite cel mai frecvent după
terminarea fermentaţiei (respectiv în vinul nou) sunt zbârcite, peretele se
îngroaşă, iar protoplasma lor devine net granuloasă.
Cum în masa lichidului nu mai ia naştere şi nu se mai degajă gaz
carbonic (CO2), celulele de levuri încă vii, încep să se depună la fund. În
condiţiile de epuizare a mediului şi carenţă a oxigenului, ele sunt constrânse
să recurgă la consumarea lentă a substanţelor de rezervă din plasma proprie;
după un interval de timp, chiar dacă sunt transferate într-un mediu favorabil,
ele nu mai sunt capabile, cu rare excepţii, să se multiplice. Pierderea
capacităţii de reproducere nu este însă obligatoriu urmată şi de încetarea
activităţii metabolice. De aceea, sub toate celelalte raporturi, în mediu
prielnic unele dintre aceste celule pot să se comporte pe o durată limitată ca
celule normale.

82
 Unii cercetători (E. Minarik-1970) apreciază că ele sunt vii pentru că,
deşi epuizate de substanţele de rezervă şi inapte de multiplicare, sistemele
lor enzimatice în stare de activitate funcţionează fiziologic normal. Totuşi,
se consideră ca mai corect a fi apreciate drept vii sau cel puţin viabile,
numai celulele apte să se reproducă şi drept neviabile sau moarte pe cele
care au pierdut ireversibil această capacitate (Gh. Zarnea, 1970).
Microscopic celulele moarte se deosebesc de cele vii prin faptul că se
colorează albastru închis cu soluţie de albastru de metilen (1:10000,
pH=4,6).
Autoliza celulelor de levuri începe când sistemul central de diviziune
a enzimelor nu mai poate exercita controlul activităţii acestora. Scăpate de
sub control, enzimele hidrolitice din celulă descompun întregul ei eşafodaj
şi toate structurile interne, prin demolarea constituienţilor macromoleculari
ai acestora.
Reproducerea sexuată. De multă vreme se observă la culturile pure
de levuri modificări morfologice sau dispariţia bruscă a unor proprietăţi utile
de maximă importanţă practică (fabricarea berii, a spirtului, vinificaţie).
Acestea erau interpretate drept rezultat al degenerării sau al infectării cu
levuri sălbatice. De abia în anul 1939 O. Winge dovedeşte că astfel de
schimbări morfologice şi biologice decurg din fenomenele de sexualitate ce
se produc la levuri.
Proprie numai levurilor sporogene, reproducerea sau multiplicarea
sexuată reprezintă un proces complex care se desfăşoară în forme diferite de
la un gen şi specie de levuri la altul. Desfăşurarea sa în modul cel mai
simplu întâlnit la levurile din genul Saccharomyces, implică în primul rând
unirea prin conjugare a două celule morfologic identice dar cu polarizare
sexuală diferită (semn + şi semn -), ceea ce le conferă funcţia de gameţi,
dezagregarea pereţilor celulari în zona de alipire a celor două celule
determină, prin fuzionarea (plasmogamie + cariogamie) conţinutului celular,
formarea uneia singure, care reprezintă un zigot. Această celulă-zigot se
poate multiplica în continuare prin înmugurire, sau se poate transforma într-
o ască în interiorul căreia se formează obişnuit patru spori (din care doi de
semn + şi doi de semn -) la rândul lor capabili să germineze fie după
eliberarea lor în mediul extern, fie chiar în interiorul ascei. Semnul sporilor
este sub control monogenetic. (Fig. 20, Fig. 21).

83
 Fig. 20. Conjugarea a două celule nediferenţiate morfologic
(conjugarea izogenă) după M.J. Pelezar şi R.D. Reid, 1972

Fig. 21. Schema principalelor etape ale ciclului biologic la levuri

(după P. Galzy, 1973)
Pe lângă acest mod de conjugare izogenă la levurile sporogene, rar la
cele din genul Saccharomyces, mai este întălnită şi conjugarea heterogenă,
care implică unirea a două celule sexuate diferite nu numai ca polarizare
sexuală, dar şi ca mărime şi vârstă. Acest tip de conjugare se poate realiza în
mai multe moduri, existând astfel o variaţie considerabilă în comportarea
din punct de vedere morfologic, a celulelor care fuzionează ceea ce conduce
la o diferenţiere a gameţilor.
De cele mai multe ori formarea sporilor la levuri se petrece ca o
consecinţă a procesului de conjugare; cel mai caracteristic tip de spori la ele
este ascosporul. Când în ască sunt mai mulţi spori ei provin prin diviziuni
ale nucleului, urmate de ale citoplasmei şi de formarea unor membrane
sporale corespunzătoare. Numărul sporilor într-o ască este obişnuit,
caracteristic genului şi speciei, corespunzând numărului de diviziuni
nucleare; la genul Saccharomyces cel mai ades se formează patru spori, dar
84
sunt şi levuri la care se formează numai unul singur, la altele 8 sau 32.
Numărul lor, inferior lui 4 când unii nuclei degenerează, depinde mult şi de
felul mediului de sporulare. (Fig. 22).

Fig. 22. Ciclul de reproducere sexuată şi asexuată la Saccharomyces cerevisiae

(după. G. Zarnea, 1970)

Ciclul de viaţă al levurilor sporogene, în care sporularea reprezintă o

funcţie biologică normală, are două faze: una haploidă, în care numărul
cromozomilor celulei este simplu (n) şi o fază diploidă, în care numărul
cromozomilor celulei este dublu (2n). Levurile haploide (unisexuate
mascule sau femele) sunt incapabile să sporuleze separat între ele. Ele pot
ajunge să sporuleze numai după diploidizare. Aceasta intervine numai după
ce o celulă haploidă masculă (semnul-) cu altă celulă haploidă femelă
(semnul +) se conjugă, formându-se un zigot diploid din care mai departe
iau naştere - diplofaza - celule normale diploide. Este deci un heterotaltism
pentru că încrucişarea nu este posibilă decât între celule de semn opus.
Trecerea de la diplofază la haplofază prin diviziune reducţională sau
meiotică, intervine într-un moment al fazei vegetative totdeauna
premergătoare formării celulelor sexuale. Aceste “treceri” pot avea loc într-
un interval scurt, dar alteori foarte lung, în decursul căruia celulele
vegetative se pot multiplica prin înmugurire. La Saccharomyces faza
haploidă este în general foarte scurtă în natură; în laborator este din contră
foarte uşor să fie consemnată o suşă haploidă. Este suficient să se evite
contactul cu suşa de semn opus.
Când la o specie faza haploidă este mai lungă, ea corespunde tipului
Zygosaccharomyces propriu-zis, cu celule ceva mai mici şi de formă sferică;
când faza diploidă este mai îndelungată, suntem în prezenţa tipului
Saccharomyces propriu-zis, cu celule ceva mai mari şi alungite. Spre

85
deosebire de cele diploide, levurile haploide necesită un nivel redox mai
înalt şi sunt capabile să creeze în citoplasma lor contrapresiuni osmotice mai
înalte. Ele sunt izolate mai ales din medii cu concentraţii mari de zaharuri
(boabe stafidite de struguri, miere, curmale uscate), din care cauză au fost
denumite levuri “osmofile”. Astăzi nu se mai face nici o distincţie între
Zygosaccharomyces şi Saccharomyces, considerându-le ca două faze ale
aceleiaşi specii - Saccharomyces.
Reiese deci că, prin modul în care se formează, ascosporii reprezintă şi
originea unor celule vegetative cu caractere noi ce rezultă din recombinarea
materialului genetic provenit de la celule parentale ce diferă prin anumite
caractere. De aceea, pentru a ajunge la o rasă cu caracteristici ereditare
absolut pure (rasă homozigotă), care să-şi păstreze nemodificate însuşirile
valoroase, la izolarea şi obţinerea culturilor pure de levuri trebuie să se
pornească de la un spor haploid sau de la o celulă haploidă. Fiecare spor dă
în principiu un c1 de celule haploide. Trebuie evitată o multiplicare
exagerată căci suşele haploide pierd un cromozom şi devin aneuploide.
Aceste suşe se păstrează mult timp la rece la +50C în tuburi cu geloză
înclinată, efectuându-le câte un repicaj la fiecare 6 luni. Selecţia de suşe
valoroase pentru diferite caractere se face de preferinţă pe suşe haploide.
Totuşi, în industriile fermentative se folosesc curent suşe diploide şi
poliploide. Suşele diploide pot fi multiplicate indefinit pe cale vegetativă dar
trebuie evitată sporularea care se produce când mediul devine sărac în
elemente. La fiecare repicaj al colecţiilor, cultura nouă este transferată la
rece (+50C) înainte de terminarea creşterii: multiplicarea celulară este oprită,
dar celulele păstrează o viaţă încetinită care permite o conservare de lungă
durată.
Ca fază culminantă a creşterii şi reproducerii, peocesele sexuale sunt
cele mai complexe şi cer condiţii specifice mult mai favorabile decât cele de
multiplicare vegetativă. De exemplu: limitele de temperatură pentru
sporulare (Tabel 6.) sunt mai restrânse decât pentru înmugurire (M. Ingram,
1955).

Temperaturile limită (0C) pentru înmugurire şi sporulare la levuri

(M. Ingram, 1955)
Tabel 6
LEVURA ÎNMUGURIRE SPORULARE
Minim Maxim Minim Maxim
Hansenula anomala 0,5-1 37-38 2,5-2,7 32-34
Pichia 0,5 35-36 2,5-7,5 33-35
membranefaciens
Sacch.cerevisiae 1-3 40 9-11,5 37-37,5

86
 Sacch. ellipsoideus 0,5 40-41 4-7,5 31,5-32,5
Sacch. marxianus 0,5 46-47 4-8 32-34
Sacch. validus 0,5 39-40 4-8,5 28-29

Sporularea începe în general, atunci când mediul devine defavorabil,

celulele de levuri au consumat zaharurile şi încetează să se mai înmulţească
prin înmugurire, dar şi-au constituit suficiente rezerve celulare (glicogen,
lipide); mai este însă necesar ca mediul să fie suficient de umed, cu
temperatura moderată (20-250C) şi mai ales să ofere un larg contact cu
aerul. De aceea, în mod obişnuit, sporularea se petrece în medii solide care
pot întruni astfel de condiţii; din aceelaşi motiv, în vinul rezultat după
terminarea fermentaţiei mustului, levurile nu pot sporula şi mor.
Modul de formare al ascosporilor este un caracter foarte important în
examinarea unei noi levuri. Totuşi puţine levuri sporulează uşor. S-a mai
constatat că adesea, o levură care a format spori uşor când a fost de curând
izolată, poate pierde această capacitate după cultivarea pe medii artificiale.
Pe de altă parte sunt şi levuri care nu pot forma spori (nesporogene).
Într-un caz individual este deci greu de a decide dacă o levură nu
poate forma spori sau dacă metodele folosite nu sunt potrivite pentru a
încuraja potenţialul de sporulare. Dificultatea este mai mare când levura prin
celelalte caractere ale ei pare sigur să aparţină speciilor sporogene.
Cercetările au arătat că pentru a realiza o stare fiziologică potrivită
sunt necesare medii bogate speciale, explicându-se astfel de ce capacitatea
de sporulare se pierde prin cultivarea pe medii artificiale. Procedura
generală constă deci în a creşte mai întâi levura pe un mediu convenabil
bogat de pre-sporulare şi apoi de a o transfera în condiţii de "inaniţie" într-
un mediu de sporulare (blocuri de ghips, porţelan umed, agar spălat, gel de
silice ş.a.) uneori este necesară repetarea acestui ciclu.
După cum pH-ul optim pentru creştere este în jur de 5, sporularea este
favorizată de pH-ul între 7 şi 8 precum şi de prezenţa acetatului. Este
esenţial faptul că levurile nu pot forma spori în absenţa oxigenului. Lumina
ultravioletă care în exces omoară microorganismele, în doză moderată
stimulează sporularea celulelor ce supravieţuiesc, probabil că determină
secreţia unor substanţe stimulatoare pentru creştere şi a căror abundenţă
inhibă sporularea (M.Ingram-1955).
Sporii levurilor ca celule rezistente. Indiferent de calea lor de
realizare, sporii levurilor sunt o formă de multiplicare şi în aceelaşi timp o
formă de rezistenţă favorizând menţinerea şi diseminarea speciei în natură;
ei suportă mult timp condiţii de mediu care celulelor vegetative le sunt
defavorabile; rezistă la temperaturi scăzute, 3 luni la -15 0 C şi la uscăciune,
circa 4 luni, în sol (Gh.Zarnea-1970).
87
88
 Totuşi, spre deosebire de sporii bacteriilor, cei ai levurilor nu sunt cu
mult mai rezistenţi decât celulele vegetative. În suspensie ascosporii suportă
obişnuit tenperaturi mai mari cu 5 la 10 0C decât celulele vegetative (cele
mature fiind mai rezistente decât cele tinere). În stare de deshidratare
rezistenţa la căldură este mult mai mare: celulele vegetative suportă căldură
uscată de peste 1000C, iar sporii de Schizosaccharomyces octosporus
supravieţuiesc la temperaturi de 1150C. În general sunt diferenţe mai mici
între spori şi celule vegetative în ceea ce priveşte rezistenţa la căldură uscată
decât la cea umedă (Tabel 7).

Rezistenţa sporilor de levuri şi a celulelor vegetative la căldură umedă

(după Lund. Ingram, ş.a.)
Tabel 7
Specia Medii Temperatura Timp letal (minute)
(0C)
Spor Celulă
vegetativa
Saccharomyces Must struguri 60 15 5
ellipsoideus 55 20 10
50 35 10
48 35 25

Alcoolul care ucide celulele vegetative este suportat de ascosporii

maturi pentru un timp îndelungat, iar ascosporii viabili sunt mai bine
separaţi de celulele vegetative pe această cale decât prin căldură.
Ciclul vegetativ al levurilor
H.Schanderl (1958) a observat la unele rase, capacitatea ce o au în
general levurile ca după fermentaţia alcoolică a mustului şi sedimentare, să
înceapă o nouă înmugurire la suprafaţa vinului, unde celulele înmulţindu-se
formează o peliculă care se îngroaşă treptat (a se vedea "levuri peliculare");
în aceste condiţii, oxidând o parte din alcoolul şi acizii vinului, levurile îşi
constituie rezerve celulare (lipide) şi pot sporula. Perioada de viaţă în care
levurile manifestă această însuşire se evidenţiază numai în condiţiile unei
verificări în contact cu aerul şi când gradul alcoolic al vinului nu depăşeşte
15-16 vol % (Spania-Jerez, "flor del vino"). Ea a fost denumită de Scanderl
"faza (stadiul) oxidativă".
Tabel 8 arată ciclul vegetativ al levurilor de vin, în natură şi în condiţii
de vinificaţie. În cazul fermentaţiei închise obişnuite, condiţiile de existenţă
- create de om, nu permit levurilor să realizeze sinteza substanţelor necesare
fermentaţiei deschise şi sub influenţa aerului, ciclul vegetativ se încheie la
fel ca şi în natură, prin sporulare.

89
 Ciclul vegetativ al levurilor de vin (după Schanderl)
Tabel 8
În vinificaţie
În contact cu aerul Ferit de aer (condiţii
În natură (focare de fermentare)
(fermentaţia deschisă) obişnuite de fermentaţie
închisă)
Germinarea sporilor Germinarea sporilor Germinarea sporilor
Formarea celulelor de levuri Formarea celulelor de levuri Formarea celulelor de
levuri
Înmugurire Înmugurire Înmugurire
Fermentaţia alcoolică Fermentaţia alcoolică Fermentaţia alcoolică
Trecerea imediată în faza oxidativă Sedimentarea levurilor Sedimentarea levurilor
Respiraţie, sinteza de lipide Noua înmugurire la Moartea majorităţii
suprafaţa vinului levurilor (nici o sporulare)
Sporulare Faza oxidativă, oxidare de
alcool şi acizi
Sinteza lipidelor
Sporulare

MUCEGAIURILE
Mucegaiurile sunt fungi filamentoşi care se reproduc prin spori
asexuaţi şi sexuaţi şi care sunt răspândiţi pretutindeni în natură (apă, aer,
sol) ca saprofiţi, pe substanţa organică în descompunere şi ca paraziţi, la
plante şi animale. Au capacitate foarte mare de adaptare la condiţii variate,
nefavorabile în general pentru alte microorganisme (aciditate, presiune
osmotică mare, uscăciune etc). Ca toate ciupercile, mucegaiurile sunt plante
fără clorofilă cu structură celulară de tip eucariot. Corpul este constituit
dintr-un tal, adică dintr-o masă vegetală neregulată în care nu se diferenţiază
rădăcini, tulpini, frunze şi se formează prin creşterea împreună a numeroase
filamente lungi şi subţiri numite hife, al căror ansamblu reprezintă un
miceliu.
În dezvoltarea mucegaiurilor se cunosc două faze:
a. Faza vegetativă, reprezentată în majoritatea cazurilor dintr-un
sistem hifal sau micelian, în care diferenţierile structurale sau funcţionale
sunt absente sau minime;
b. Faza reproducătoare, caracterizată prin formarea unor elemente de
reproducere asexuată sau sexuată, adesea cu un înalt grad de diferenţiere şi
variind ca dimensiuni, de la microscopice la macroscopice şi ca durabilitate,
de la efemer la peren. Reproducerea poate începe de timpuriu şi, în acest
caz, ea poate să coincidă cu cea mai mare parte a existenţei vegetative, ori
poate să se producă tardiv sau chiar după ce activitatea vegetativă a încetat.

Metabolismul mucegaiurilor

90
 Mucegaiurile sunt organisme vegetale heterotrofe, incapabile de
fotosinteză, care se dezvoltă bine în medii bogate în substanţe organice.
Frecvent utilizează ca sursă de carbon diferite glucide, alcooli şi acizi
organici, iar ca sursă de azot, compuşi organici (peptone, aminoacizi) şi
uneori săruri de amoniu şi nitraţi. Ele cresc bine în atmosferă umedă, iar pH-
ul lor optim este de 5-6 (variaţiile tolerate fiind cuprinse între pH = 2 şi pH=
9,6). Au capacităţi foarte mari şi variate de sinteză, putând forma în cursul
metabolismului lor polizaharide, lipide, acizi organici, pigmenţi, substanţe
organice şi substanţe celulare cu înaltă valoare nutritivă, care rămân
localizate în miceliu sau sunt eliminate în medu. Temperatura optimă de
dezvoltare este de 22-320C, cea minimă de 5-100C şi cea maximă de 30-
400C. Aproape toţi reprezentanţii grupului sunt aerobi şi ca atare, au nevoie
de prezenţa unei concentraţii ridicate de oxigen.
Dinamica procesului de creştere. Creşterea unui miceliu pornind de
la un inocul de spori sau de la un fragment micelian, parcurge mai multe
faze:
a. Faza iniţială de lag, durează câteva ore, este caracteristică nu prin
fenomene de creştere, ci prin procesele de germinare a sporilor sau de
regenerare a hifelor rupte şi legate care au servit ca inocul;
b. Faza de creştere liniară, corespunde perioadei în care pe suprafaţa
mediului apare o colonie circulară care creşte liniar în raport cu timpul;
c. Faza de învechire, se traduce prin încetinirea vitezei de creştere, pe
măsură ce colonia se apropie mai mult sau mai puţin de bariera mecanică
reprezentată de marginea plăcii Petri, dar ea este determinată de efectul
dăunător al produşilor de metabolism eliberaţi din colonie. Încetinirea
ritmului de creştere apare mai repede când cultura se dezvoltă în medii
bogate în substanţe nutritive şi la temperaturi optime şi supraoptimale,
acumularea produşilor de metabolism făcându-se mai rapid în aceste
condiţii.

Reproducerea mucegaiurilor
Deşi procesul de reproducere a mucegaiurilor se manifestă în forme
diferite, acestea au însă unele trăsături comune. În anumite faze ale creşterii
hifelor, survine o modificare morfologică în urma căreia apar hife
specializate, care participă la reproducere prin formarea de spori. Sporii sunt
de două tipuri: spori sexuaţi (care apar în stadiul perfect al fungilor)
rezultaţi direct sau indirect dintr-un proces de încrucişare între două celule
polarizate sexual, însoţit de transfer cromozomic şi recombinare genetică, şi
spori asexuaţi (care apar în stadiul imperfect al fungilor) care se formează

91
prin simplă divizare din celulele vegetative mai mult sau mai puţin
specializate.
După locul lor de formare, sporii pot fi endogeni (endosporii), dacă
apar în interiorul unor celule sau organe sporogene, aşa cum sunt zoosporii,
sporangiosporii şi ascosporii sau exogeni (exospori) dacă se diferenţiază
extracelular pe suporturi speciale reprezentată de conidiofori şi bazidii, ca în
cazul conidiilor şi bazidiosporilor.
Sporii asexuaţi sunt cel mai frecvent observaţi la mucegaiuri. Această
categorie este reprezentată prin câteva tipuri caracteristice:
- zoosporii sau planosporii reprezintă cel mai simplu tip de spor
asexuat, se formează în celule speciale saciforme, numite zoosporangi din
care se eliberează prin ruperea peretelui sporangial sau prin traversarea
porilor apăruţi secundar în structura acestuia. Acest tip de spori îl întâlnim la
speciile din clasele Archimycetes şi Phycomycetes;
- sporangiosporii sau aplanosporii, apar într-un sporangiu care se
constituie ca o umflătură la capătul rotunjit al unei hife fertile denumită
sporangiospor. Capătul de hifă rotunjit în formă de măciucă pe care se
găseşte sporangele şi care este în parte acoperit de acesta, constituie
columela.
Sporangiul umplut cu spori se poate deschide spontan prin explozie
sau poate fi rupt în urma unui contact din exterior, eliberând sporii care se
răspândesc în natură. Acest gen de spori îl întâlnim la fungii neseptaţi
(Phycomycete - Rhizopus nigricans) (Fig. 23).
- conidiile şi conidiosporii sunt spori expuşi de la începutul
contactului cu mediul extern, nefiind protejate de un sporange deoarece sunt
aşezaţi la extremităţile unor hife fertile numite conidiofori. Capetele
conidioforilor se diferenţiază sub formă de celule speciale, cu aspectul unor
umflături, pe care sunt aşezate celulele denumite sterigme, din care derivă
conidiile. Reproducerea prin conidii este caracteristică pentru Ascomycetes
(exemplu: Aspergillus-Fig.24) şi pentru mulţi fungi imperfecţi.

92
 Fig. 23. Rhizopus nigricans : A. Miceliul reproducător

Fig. 24. Mucegai din genul Aspergillus - reprezentarea schematică a unei hife vegetative
care poartă o hifă fertilă pe care se formează conidii

- clamidosporii iau naştere prin dezvoltarea unui perete gros în jurul

unei celule din miceliu. Ei conţin substanţe de rezervă şi au o mare
rezistenţă la uscăciune, în timpul căreia pot rămâne în stare de latenţă chiar
pe o perioadă îndelungată. Clamidosporii pot fi produşi de toate
mucegaiurile;
-oidiile sau artrosporii se formează la mucegaiurile septate prin
fragmentarea în celulele componente a unor hife vegetative terminale. Nu au
o rezistenţă mare la uscăciune şi par să nu fie analogi funcţionali cu
sporangiosporii şi conidiile. În condiţii favorabile, ei dau naştere unui
miceliu nou.

93
 Sporii asexuaţi sunt mai puţin întâlniţi decât cei sexuaţi, deoarece
reproducerea pe cale sexuată are loc numai în anumite condiţii de mediu. În
funcţie de modul de formare se împart în mai multe tipuri:
- ascosporii iau naştere prin fuzionarea a două prelungiri tubulare
emise de două celule vecine de pe acelaşi miceliu sau după micelii separate.
Nucleii celulelor fuzionate se contopesc, astfel că celula formată prin
fuziune devine un zigot, după care nucleul unic rezultat suferă una până la
trei diviziuni. Apoi fiecare dintre nucleii-fii apăruţi prin diviziune, se
înconjoară cu un strat dens de citoplasmă şi cu un perete celular pentru a
forma câte un spor. Odată constituită, sporii rămân mai departe, pentru un
timp în celula de origine rezultată din procesul sexual, care este denumită
ască din cauza formei de sac (Fig. 25).

Fig. 25. Formarea ascosporului la mucegaiuri.

În celula bacteriană (A) produsă prin fuzionarea a două celule din aceelaşi miceliu sau din micelii diferite, nucleii
se unesc (B), se divid repetat (C şi D) formând 8 nuclei sporali (E) care sunt conţinuţi într-o celulă numită ască

- bazidiosporii caracteristici ciupercilor din clasa Basydiomycetes, se

formează la exteriorul unui organ specializat numit bazidie. În partea apicală
a bazidiei se formează apoi patru mici proiecţii, denumite sterigme, care se
alungesc terminal şi se lăţesc. Bazidia este aproape similară unei asce, dar
spre deosebire de aceasta, îşi poartă sporii nu în interiorul, ci la exteriorul ei.
O bazidie matură are la suprafaţa ei patru bazidiospori. Pentru eliberarea
acestora, la nivelul pedunculilor de legătură cu bazidia, apare câte o picătură
de lichid care creşte treptat până la circa 1/5 din volumul sporului şi care,
prin presiunea pe care o exercită, ajunge la un moment dat să proiecteze cu
putere sporul în aer.
- oosporii se formează la unele Phycomycetes, prin unirea unei celule
mici reprezentând gametul femel ( ♀ ) - cu gametul mascul cu o celulă mare
( ♂ ) diferenţiate pe hife vecine. Peretele lor este gros, ceea ce le oferă o
rezistenţă foarte mare la uscăciune, se pot menţine mult timp în stare de
latenţă (Fig.26).

94
 Fig. 26. Etapele succesive ale formării unei bazidii şi liberarea bazidiosporilor:
A. celula binucleată; B. fuziunea nucleilor;
C-D. diviziunea nucleară; E. formarea bazidiosporilor;
F-G. liberarea lor (după Stanier).

- zigosporii apar la unele Phycomycetes (exemplu Rhizopus nigricans)

în urma unirii a două celule aparent identice, provenind din hife homotalice
(de la aceeaşi plantă) sau heterotalice. Zigosporii rămân vreme îndelungată
în stare latentă. Ajunşi în condiţii de mediu favorabile ei germinează şi
produc un corp fructifer tipic asexuat.
Germinarea sporului. Cea mai importantă modificare suferind în
cursul trecerii de la stadiul de latenţă sporal la cel vegetativ, constă în
umflarea sporului aflat în condiţii de mediu favorabile, urmată de apariţia
unei mici umflături parietale şi ruperea peretelui sporal la acest nivel. Aceste
modificări morfologice sunt corelate cu declanşarea unor transformări
fiziologice profunde (iniţierea sintezei de acizi nucleici, aminoacizi,
proteine, creşterea consumului de oxigen) şi corespund trecerii de la stadiul
de viaţă latentă caracterizat printr-un nivel extrem de scăzut al proceselor
metabolice, la stadiul de vegetaţie condiţionat de o activitate metabolică
intensă.
Taxonomia mucegaiurilor
Mucegaiurile fac parte din Phyllum Mycophyta sau Fungi şi reprezintă
împreună cu levurile un grup, incluzând aproximativ 100-200000 de specii.
Numărul mare de specii şi mai ales polimorfismul lor marcant, au făcut ca
mucegaiurile să nu aibă până acum o clasificare atotcuprinzătoare, bazată pe
criterii care să întrunească acordul maxim al specialiştilor. Ele sunt împărţite
în patru clase:
1. Phycomycetes, fungi inferiori cu miceliu vegetativ tipic neseptat;
2. Ascomycetes, fungi mai evoluaţi care posedă cu excepţia levurilor,
un miceliu ramificat cu hife septate şi care se reproduc pe cale asexuată (în
stadiu imperfect) prin conidii şi deseori pe cale asexuată (în stadiu perfect)
prin ascospori;

95
 3. Basidiomycetes, fungii cei mai evoluaţi, cu miceliu bine dezvoltat
şi înmulţire sexuată prin bazidiospori;
4. Fungi imperfecţi, cu miceliu septat şi reproducere exclusiv
asexuată, mai ales prin conidii.
În ultimele sisteme de clasificare, ciupercile primitive endoparazite de
tip intracelular sunt încadrate separat în clasa Archimycetes.
Răspândirea în natură şi importanţă
Mucegaiurile sunt foarte răspândite în natură. Cele mai multe trăiesc
ca saprofite în solul umed pe substanţe organice în curs de descompunere.
Unele dintre ele sunt adaptate la mediul acvatic, trăind în apele dulci şi
marine. Unele mucegaiuri (Perenosporaceae, Erysiphaceae, Uredinalis)
sunt parazite obligate, dezvoltându-se numai pe seama ţesuturilor vii şi fiind
incapabile să crească pe medii artificiale de laborator. Răspândirea largă în
natură este favorizată de marea lor rezistenţă la condiţii ca: aciditate,
uscăciune, presiune osmotică ridicată, în general nefavorabile pentru alte
microorganisme, precum şi de faptul că toate tipurile de spori prezintă
adaptări speciale pentru eliberarea la distanţă şi pentru împrăştierea lor prin
intermediul curenţilor de aer sau prin apă.
O parte din mucegaiuri sunt patogene pentru plante, om şi animale, la
care produc boli numite micoze. Altele (Arthrobotrys robusta, Dactylaria
gracilis) sunt prădătoare, având capacitatea de a captura animale mici
(nematode). Unele specii de fungi (Aspergillus sp., Penicillium sp.,
Fusarium sp., etc.) sunt folosite în industrie datorită capacităţii lor de a
realiza biosinteza unor substanţe foarte utile în practică.

96
Sterilizarea presupune îndepărtarea pentru o anumită perioadă
de timp, a germenilor preexistenţi de pe obiectele de lucru şi
din mediile de cultură.
Asepsia presupune evitarea contaminării cu germeni din afară
în timpul lucrului.

Multitudinea obiectelor de lucru şi compoziţia chimică

diferită a mediilor de cultură presupun metode diferite de
sterilizare ce utilizează agenţi fizici şi chimici care pot distruge
total germenii microbieni sau pot realiza numai o inhibare a
activităţii acestora.
Asepsia presupune evitarea contaminării cu germeni din afară
în timpul lucrului.
Metodele de sterilizare pot fi grupate în funcţie de agenţii care
determină distrugerea microorganismelor, astfel:

1. metode de sterilizare cu ajutorul factorilor fizici:

temperatura;

radiaţiile;

filtrele;

vibraţiile ultrasonice;

centrifugarea

2. metode de sterilizare cu ajutorul agenţilor chimici

Sterilizarea cu ajutorul temperaturii

Temperatura poate distruge formele sporulate şi vegetative

ale microorganismelor sau poate realiza numai o inhibare a
activităţii germenilor microbieni.

Utilizarea temperaturilor ridicate sau a căldurii presupune mai

multe metode şi anume:

- metode de sterilizare cu ajutorul căldurii umede: autoclavarea,

97
fierberea, pasteurizarea, tindalizarea;

- metode de sterilizare cu ajutorul căldurii uscate: incinerarea,

încălzirea la roşu, flambarea şi sterilizarea în etuvă sau cuptor
Pasteur.
Căldura umedă ca agent de sterilizare

Acţiunea temperaturii ridicate asupra microorganismelor se

manifestă prin denaturarea proteinelor celulare şi implicit a enzimelor.
Căldura umedă prezintă un grad mai mare de penetrare comparativ cu
căldura uscată astfel că temperatura care trebuie atinsă şi timpul
necesar sterilizării sunt mai mici, comparativ cu căldura uscată.

Autoclavarea - este o metodă de sterilizare ce utilizează

concomitent doi factori fizici corelaţi între ei: temperatura şi
presiunea vaporilor de apă prezenţi în autoclav.

În autoclav se sterilizează mediile de cultură a căror compoziţie

chimică nu suferă modificări sub acţiunea temperaturii mai mari de
100°C, apa şi serul fiziologic, dopurile de cauciuc, de vată sau tifon
precum şi instrumentele metalice care nu pot fi flambate.

Laboratoarele de
microbiologie foarte mari şi
bine echipate dispun de două
autoclave:

- unul în care se
sterilizează mediile de
cultură înainte de
însămânţare

- şi un al doilea în care se
sterilizează mediile
contaminate cu
microorganisme şi care nu
mai servesc analizei
microbiologice.

De buna funcţionare a autoclavului depinde reuşita sterilizării. În

acest sens trebuiesc respectate anumite reguli la punerea în funcţiune a
autoclavului şi anume:

- se pune apă distilată în autoclav până la nivelul marcat sau până la

nivelul grătarului sau coşului de sârmă în care sunt aşezate obiectele
98
ce trebuiesc sterilizate. Este recomandat ca recipientele care se
aşează în autoclav să fie acoperite cu hârtie astfel încât vaporii de apă
rezultaţi prin condensare să nu determine umezirea dopurilor de vată
sau tifon;

- se închide etanş autoclavul;

- se conectează la reţeaua electrică sau la sursa de căldură, cu supapa
pentru aer deschisă;

- când aerul a fost complet evacuat şi pe supapă ies primii vapori de

apă, se închide această supapă şi se urmăreşte atingerea presiunii la
care dorim să realizăm sterilizarea;

- după ce presiunea şi temperatura au fost menţinute suficient pentru

reuşita sterilizării, se deconectează autoclavul de la sursa de căldură
sau reţeaua electrică şi se aşteaptă scăderea presiunii la zero. Se
deschide supapa pentru evacuarea aerului astfel că ultimii vapori de
apă vor fi eliminaţi din autoclav. Se deschide autoclavul şi se scoate
coşul cu obiectele supuse sterilizării.

Pentru reuşita sterilizării şi evitarea producerii accidentelor în

timpul funcţionării autoclavului trebuie ţinut cont de următoarele
precauţii:

- nu se întrerupe autoclavul în timpul funcţionării;

- se supraveghează permanent funcţionarea autoclavului notându-se

dacă presiunea se menţine constantă;

- se va evita aglomerarea obiectelor în autoclav astfel încât vaporii de

apă să circule în incintă asigurând sterilizarea completă;

- nu se deschide autoclavul înainte de evacuarea completă a vaporilor

de apă evitând astfel producerea unor arsuri grave cu vapori de apă
supraîncălziţi şi sub presiune;

- trebuie evitată deschiderea prea târzie a autoclavului deoarece vaporii

de apă se condensează pe dopurile de vată, tifon sau hârtie,
umectarea acestora putând conduce la contaminări ulterioare. De
asemenea, sub influenţa vidului creat are loc deteriorarea
cauciucului.

Pentru a stabili dacă sterilizarea a fost completă, mediile de

cultură sterilizate prin autoclavare se incubează timp de 24 ore la
25-30ºC.
99
Cel mai eficient control este însă controlul temperaturii şi
presiunii pe tot parcursul funcţionării autoclavului.

Tindalizarea
Imaginată în anul 1877 de către Thyndall, tindalizarea este
practic o sterilizare fracţionată ce se aplică numai în cazul mediilor
de cultură şi a soluţiilor care conţin substanţe termolabile sau
termodegradabile (care se denaturează sub acţiunea temperaturilor
ridicate).

Sterilizarea fracţionată, cum mai este numită tindalizarea,

presupune efectuarea a trei încălziri repetate (30 minute la 50-90ºC),
efectuate la interval de 24 ore. Încălzirile se realizează prin
menţinerea recipientelor cu soluţii sau medii de cultură în băi de apă,
cu temperatura constantă.

Principiul tindalizării constă în distrugerea formelor

vegetative ale germenilor microbieni. Astfel, prima încălzire
distruge formele vegetative. După 24 ore, sporii prezenţi în medii
germinează dând naştere la alte forme vegetative care sunt
distruse prin cea de-a doua încălzire. A treia încălzire este una de
siguranţă care distruge formele vegetative rezultate în urma
germinării sporilor rămaşi după cea de a doua încălzire.

Controlul sterilizării prin tindalizare se face la fel ca şi în

cazul autoclavării, prin termostatarea mediilor sterilizate la
28-37ºC, timp de 24 ore.

Pasteurizarea

Utilizată în special în industria alimentară (lapte, bere), această metodă

de sterilizare este considerată incompletă deoarece nu distruge decât formele
vegetative ale microorganismelor fără să afecteze viabilitatea sporilor. Este
practic o încălzire controlată un anumit interval de timp.

În funcţie de temperatură şi timp există mai multe tipuri de pasteurizări:

pasteurizare joasă - 30 minute la 56ºC;

pasteurizare medie - 20 minute la 70ºC

pasteurizare înaltă - 2-3 minute la 90ºC;

flash pasteurizare - câteva secunde la 100ºC

10
După pasteurizare, lichidele se păstrează la temperaturi scăzute (+4ºC)
care nu permit germinarea sporilor.

Fierberea
Este o metodă de sterilizare prin care se distrug numai
formele vegetative ale microorganismelor. Se realizează în cutii
de inox sau fierbătoare încălzite electric sau cu ajutorul becului
de gaz. Prin fierbere se sterilizează unele instrumente metalice.

Fierberea la 100ºC timp de 30 minute asigură o sterilizare de

scurtă durată ceea ce implică utilizarea imediată a materialului
sterilizat.

Căldura uscată ca agent de sterilizare

Căldura uscată are aceeaşi acţiune ca şi căldura umedă, având

însă asupra microorganismelor o eficienţă mai mică decât aceasta.

Metodele de sterilizare cu ajutorul căldurii uscate sunt:

incinerarea

flambarea

încălzirea la roşu

sterilizarea în etuvă

sau cuptor Pasteur

Incinerarea

Se realizează la temperaturi de 300-500ºC, în

crematorii şi se aplică în cazul materialelor folosite în
analiza microbiologică şi irecuperabile, a produselor
patologice şi a dopurilor de vată sau tifon.

Încălzirea la roşu

Presupune menţinerea obiectului metalic în flacăra becului

Bunsen, până la înroşirea completă. Prin această metodă se
sterilizează ansa şi acul de însămânţare atât înainte cât şi după
efectuarea însămânţării.

Sterilizarea este completă, metoda10prezentând dezavantajul că

obiectele se deteriorează. Este important ca după încălzirea la roşu,
obiectele cu care se face prelevarea de germeni să se răcească tot în
zona de acţiune a becului Bunsen, prelevarea germenilor realizându-se
numai atunci când obiectele sunt perfect reci.
După însămânţare, bucla ansei nu este trecută prima prin flacără,
ci porţiunea învecinată a buclei. Se evită astfel răspândirea stropilor
încărcaţi cu germeni microbieni. Resterilizarea ansei este obligatorie
după fiecare recoltare şi însămânţare.

Flambarea

Constă în câteva treceri ale obiectelor prin flacăra unui bec de gaz.
În urma flambării germenii microbieni sunt carbonizaţi. Metoda se
aplică în cazul obiectelor cu suprafaţa netedă (lame de sticlă) sau a
obiectelor metalice (suportul anselor). De asemenea prin flambare se
realizează fixarea frotiurilor. Pipetele cu care se prelevează lichidele ce
se însămânţează, chiar dacă au fost sterilizate, înainte şi după prelevarea
probelor se flambează.

Flambarea se poate realiza şi prin arderea câtorva picături de alcool

depuse pe lama de sticlă.

Sterilizarea în etuvă sau cuptor Pasteur

În etuvă sau cuptor Pasteur se sterilizează sticlăria de

laborator, obiectele din porţelan - mojare, capsule - precum şi
obiectele metalice.

Efectul microbicid al căldurii uscate se manifestă mai întâi

prin coagularea proteinelor celulare şi ulterior prin carbonizarea
germenilor.

Sterilizarea cu ajutorul radiaţiilor UV

Pentru mesele de lucru, aerul din încăperi, hota cu

flux laminar şi obiectele din material plastic care nu pot
fi sterilizate prin alte metode se practică metoda
sterilizării cu ajutorul radiaţiilor UV.

Filtrarea

Filtrarea microbiologică este efectuată cu scopul

izolării virusurilor sau îndepărtării dintr-un lichid a
microorganismelor prezente, realizând astfel sterilizarea
lichidului supus filtrării. 10

Centrifugarea

Este numai o metodă de separare a microorganismelor din

lichidele în care au fost suspendate.
Sterilizarea cu ajutorul agenţilor chimici

Anumite substanţe chimice prezintă efect microbicid (determină moartea celulelor

microbiene) sau efect microbiostatic (inhibă multiplicarea celulelor microbiene).

Pentru a putea încadra o substanţă chimică în categoria substanţelor microbicide sau

microbiostatice, trebuie să se ţină cont de următoarele criterii:

concentraţia substanţei chimice;

viteza de apariţie a efectului nociv;

relaţia dintre concentraţia substanţei şi viteza ei de acţiune.

În general, substanţele microbicide sunt cele al căror efect se produce cu viteză mare, chiar
la concentraţii foarte mici. Substanţele microbiostatice sunt cele la care efectul lor nociv rămâne
acelaşi şi la concentraţii mari, viteza de distrugere fiind relativ mică. Termenii de substanţă
bactericidă şi bacteriostatică sunt cunoscuţi în practică mai ales sub denumirea de antiseptici şi
dezinfectanţi.

Antisepticele - sunt substanţe care aplicate pe

ţesuturile vii, împiedică activitatea şi multiplicarea
microorganismelor prezente în aceste ţesuturi. Aşadar
antisepticele au efect microbiostatic.

Termenul de antiseptic provine din limba greacă şi

se traduce ca agent care previne putrefacţia (sepsis =
putrefacţie).

Antisepsia - presupune ansamblul de procedee prin

care este inhibată dezvoltarea microorganismelor pentru
o anumită perioadă de timp.

Dezinfectantele - sunt substanţe care se aplică în mod obişnuit pe

obiecte în scopul distrugerii microorganismelor contaminante (efect
microbicid).

Efectul antisepticilor şi dezinfectanţilor se manifestă prin:

10 fenolului, detergenţilor
denaturarea unor proteine sub acţiunea
săpunurilor;

inhibarea procesului de sinteză proteică sub acţiunea sulfamidelor;

modificarea permeabilităţii la nivelul peretelui celular şi al membranei

citoplasmatice sub acţiunea fenolului, detergenţilor şi săpunurilor;

blocarea activităţii unor enzime implicate mai ales în metabolismul

energetic, în special sub acţiunea formolului, a sărurilor metalelor grele
şi a agenţilor oxidanţi.

Factorii care condiţionează efectul antisepticilor şi dezinfectanţilor sunt:

- natura şi concentraţia antisepticului;

- solubilitatea substanţei în straturile externe ale celulei;

- încărcătura microbiană şi tipul microorganismelor ce trebuiesc distruse

(microorganismele sporogene sunt mai rezistente la acţiunea substanţelor
microbicide);

- temperatura şi pH-ul mediului în care acţionează substanţa microbicidă

(temperatura ridicată şi pH-ul scăzut măresc efectul de distrugere al
substanţelor dezinfectante);

- timpul de expunere.
Având în vedere faptul că în mediile naturale (sol, apă, aer, produse alimentare etc.)
microorganismele nu se află în cultură pură ci în asociaţii heterogene, pentru a identifica
un microorganism în condiţii de laborator este necesară parcurgerea următoarelor etape:

recoltarea probelor;

examenul microbiologic direct al materialului examinat;

izolarea microorganismului în cultură pură din probele recoltate în condiţii aseptice;

studiul morfologic al germenilor izolaţi, notând forma şi dimensiunea celulelor,

modul de grupare;

studiul caracterelor coloniale (însămânţarea pe mediu solid) şi de cultură

(însămânţarea în mediu lichid);

studiul caracterelor biochimice (însămânţarea microorganismului izolat pe medii

speciale);

10
testarea sensibilităţii microorganismului izolat la acţiunea substanţelor antibiotice.

Rezultatele obţinute la testele morfologice, culturale şi biochimice vor fi

comparate cu cele înscrise în determinatoarele în vigoare. Pentru bacteriologie
se utilizează determinatorul Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology în
timp ce pentru micologie se utilizează determinatorul Barnett: The yeasts a
taxonomic study.

Recoltarea probelor pentru examenul microbiologic

Rezultate concludente într-un diagnostic microbiologic se obţin numai

prin respectarea riguroasă a unor reguli în ceea ce priveşte:

- modul de recoltare al probelor;

- conservarea probelor;

- transportul la laborator.

Recoltarea probelor trebuie făcută de o persoană autorizată în acest scop şi

care trebuie să ţină seama de următoarele norme:

- totdeauna recoltarea probelor se face în recipiente sterile. Fiecare

recipient cu proba prelevată trebuie să poarte etichete vizibile şi fişa în care se
înscrie: denumirea probei, examenul microbiologic solicitat (dacă nu se
execută un examen complet), locul de unde a fost prelevată proba;

- se va evita contactul probei cu substanţe antiseptice care influenţează

nefavorabil dezvoltarea eventualelor microorganisme;

- recoltarea trebuie făcută înainte de utilizarea unor substanţe cu efect

antiseptic sau dezinfectant.

Ambalarea probelor recoltate se face cât mai corect şi ermetic

pentru a evita contaminarea probelor sau eventualele accidente
care ar deteriora probele sau ar putea provoca răspândirea
germenilor microbieni.

Expedierea se va face urgent, orice întârziere provocând

înmulţirea numărului de microorganisme sau dezvoltarea florei
de asociaţie.

Pentru transport se vor asigura temperaturi scăzute (recipiente

cu gheaţă, amestecuri frigorifice sau temperaturi de 37ºC, acolo
unde este cazul).

10diferit, în funcţie de
Recoltarea probelor de apă - se face
sursa de recoltare.

Apa de robinet se recoltează în flacoane care, în momentul

sterilizării se astupă în prealabil cu dop de vată îmbrăcat în
tifon, iar dopul de sticlă, împachetat în hârtie se leagă de
flacon. La recoltare se lasă apa să curgă 15-20 minute, se
flambează gura robinetului, se umple ¾ cu apă.

Apa din profunzime a lacurilor, râurilor, puţurilor, canalelor

se recoltează în dispozitive special confecţionate, din
flacoane de sticlă, montate pe un suport metalic greu.

Recoltarea probelor de alimente

Dacă alimentele sunt lichide, înainte de recoltare se omogenizează proba

prin agitare sau amestecare cu o spatulă. Dacă sunt consistente (ex. carne,
brânză), se taie cu ajutorul instrumentelor sterile, fragmente din diferite părţi
ale probei, evitându-se pe cât posibil suprafaţa şi se introduc în plăci Petri sau
alte recipiente sterile. Laptele prelevat direct de la animale se va recolta în
eprubete sterile după îndepărtarea primelor picături din canalul mamar în care
se pot găsi germeni din mediul extern. Înainte de recoltare se recomandă
spălarea mamelei cu apă şi săpun şi dezinfectarea acesteia cu alcool.

Probele primite la laborator se înregistrează dându-se un număr

şi în dreptul probei se consemnează data primirii, datele existente
în fişele însoţitoare, urmând ca ulterior să se înregistreze şi
examenele efectuate.

Examenul microbiologic direct

Celula microbiană, datorită dimensiunilor sale reduse (de

ordinul micrometrilor) se poate examina numai cu ajutorul
microscopului. Aşadar, când vorbim de examen microbiologic
direct, facem referire la examenul microscopic.

Prin examen microscopic putem stabili grupa de

microorganisme prezente într-un produs (bacterii, levuri sau
mucegaiuri), forma, dimensiunea, modul de grupare al celulelor.

Preparatele microscopice efectuate în laboratorul de

microbiologie sunt de două tipuri:

- preparate proaspete care permit examinarea

microorganismelor vii;

10 numite frotiuri.
- preparate de durată, fixate şi colorate

Examinarea microorganismelor în stare vie, în preparate

proaspete se poate realiza în două moduri:

preparate în picătură turtită;

preparate în picătură suspendată.

Tehnica efectuării preparatelor în picătură turtită - constă

în depunerea unei picături din proba de examinat pe lama
microscopică şi aşezarea lamelei astfel încât să se evite formarea
bulelor de gaz între lamă şi lamelă. Depunerea picăturii pe lamă
se poate realiza cu pipeta Pasteur sau cu ansa de însămânţare.
Excesul de suspensie se va absorbi cu hârtie de filtru.

În cazul germenilor patogeni se va evita pe cât posibil excesul

de suspensie între lamă şi lamelă.

Preparatele astfel obţinute vor fi examinate imediat deoarece

se pot usca foarte repede. În astfel de preparate microscopice se
evidenţiază forma şi se poate stabili dimensiunea celulelor.

Tehnica picăturii suspendate

Pentru a efectua astfel de preparate este nevoie de lame speciale cu

excavaţie sau godeu. Etapele de lucru sunt următoarele:

cu ajutorul unei baghete se depune vaselină de jur împrejurul godeului

de pe lamă, astfel încât aceasta să formeze un inel;

cu ansa sau pipeta Pasteur se depune o picătură din suspensia de

examinat, în centrul unei lamele microscopice bine degresată;

se întoarce lama cu godeul în jos şi se apropie de lamelă astfel încât

aceasta să rămână prinsă de lamă prin intermediul stratului de vaselină;

se aşează preparatul astfel obţinut pe măsuţa port-obiect a microscopului

evitând mişcările bruşte care ar putea conduce la desprinderea picăturii
de pe lamelă. Un preparat bine realizat presupune menţinerea picăturii pe
lamelă astfel încât aceasta să nu atingă godeul lamei.

Preparatele proaspete se pot colora pentru a observa astfel mai uşor

celulele. Cel mai frecvent se utilizează coloraţia vitală cu albastru de
metil, verde de metil sau roşu neutru.

Mod de lucru: după ce pe lamă sau10lamelă a fost depusă picătura

din proba de examinat, se pune o picătură de colorant care se
omogenizează bine cu proba de analizat. Se montează preparatul şi se
examinează imediat la microscop.

Rezultatul colorării: celulele moarte apar colorate (roşu, verde sau

albastru) în timp ce celulele vii apar incolore. Metoda se utilizează în
special în cazul fungilor pentru stabilirea procentului de viabilitate al
celulelor.

Examinarea microorganismelor în preparate fixe

Frotiul reprezintă un strat foarte subţire şi omogen de celule

răspândite în mod uniform.

Pentru efectuarea unui frotiu trebuiesc parcurse următoarele etape :

- etalarea. Suspensia microbiană depusă pe lama microscopică se

întinde foarte bine cu ansa de însămânţare sau cu o lamă şlefuită la
unul din capete. În urma etalării trebuie să se obţină un strat uniform
de celule. Frotiul se poate realiza atât din cultură dezvoltată în mediu
lichid cât şi din colonii. În cazul frotiului obţinut din cultura crescută în
mediu lichid, pe suprafaţa unei lame bine curăţată se depune cu pipeta
Pasteur o picătură din cultura în mediu lichid. Etalarea se face cu ansa.

Atunci când frotiul se realizează din culturi dezvoltate pe mediu

solid, pe lama microscopică se depune mai întâi o picătură de apă
fiziologică în care se dispersează cu ajutorul ansei o cantitate dintr-o
colonie. Se omogenizează bine şi se etalează cu ansa sau cu lama
şlefuită.

Dacă în proba din care se efectuează frotiul numărul de

microorganisme este foarte mic, se vor depune pe lama microscopică
cu ajutorul pipetei Pasteur, 2-3 picături care nu se mai etalează ci se
lasă să se usuce aşa cum au fost depuse pe lamă.

- uscarea frotiului se face la temperatura camerei sau la termostat

la temperatura de 37°C;

- fixarea frotiului - este etapa cea mai importantă care se

efectuează pentru inactivarea germenilor, aderarea acestora la lamă
şi o mai bună colorare a celulelor datorită creşterii permeabilităţii
peretelui celular.

Pentru fixarea frotiurilor se pot utiliza agenţi fizici (căldura) şi

chimici (alcool etilic, metilic).
10
Fixarea frotiului cu ajutorul căldurii - constă în treceri
succesive ale frotiului prin flacăra becului de gaz, cu partea pe
care s-au etalat celulele în sus. Menţinerea frotiului în flacără nu
trebuie să depăşească o secundă la fiecare trecere pentru a evita
carbonizarea celulelor.
Fixarea prin flambare cu alcool

Pe frotiu se pun 4-5 picături de alcool etilic care se aprind. Odată

cu epuizarea alcoolului are loc şi stingerea flăcării astfel că fixarea
este încheiată. Depunerea unei cantităţi mari de alcool determină
arderea flăcării timp îndelungat şi în final carbonizarea celulelor.

Fixarea cu amestec alcool - eter

Presupune depunerea câtorva picături dintr-un amestec în părţi

egale alcool-eter. Se lasă să acţioneze 2-3 minute şi se îndepărtează
excesul. Uscarea se face la temperatura camerei.

Fixarea cu acid osmic

Se aşează frotiul într-un vas închis etanş în care au fost puse în

prealabil câteva granule de acid osmic. Se menţin 30 minute în vapori
de acid osmic, se spală şi se lasă să se usuce. Este important să nu se
folosească o cantitate prea mare de acid osmic pentru că evaporarea
acestuia după deschiderea vasului poate provoca iritaţii ale ochilor.
Acidul osmic acţionează asupra grupărilor proteice pe care le fixează
în celulă.

Fixarea cu acid cromic

Se acoperă frotiul cu soluţie de acid cromic care se menţine

aproximativ 5 minute pe frotiu. Se spală cu apă şi apoi se lasă să se
usuce.

Conservarea frotiurilor

Frotiurile pot fi păstrate în stare colorată sau

necolorată. Atunci când nu sunt colorate, pentru
păstrare, frotiurile trebuie numai inscripţionate
(notate) şi aşezate în cutii pentru a fi ferite de praf.

Colorarea frotiurilor

Coloraţia reprezintă o reacţie de combinare între unii

constituenţi celulari şi substanţele 10
colorante.

Colorarea frotiurilor a fost efectuată pentru prima dată de

către Weigert (1875) care a utilizat soluţie verde de metil
pentru colorare.
Rezultatul colorării depinde de proprietăţile chimice ale
colorantului şi de structura fizico-chimică a constituienţilor
celulari.

La efectuarea unei coloraţii trebuie să se ţină cont de următoarele:

- aplicarea coloranţilor se face numai cu sticluţa picurătoare. Numai

în cazul în care se specifică faptul că frotiul trebuie expus timp mai
îndelungat în colorant, se scufundă în vase speciale cu soluţie colorantă

- este indicată aşezarea frotiurilor pe suporturi metalice astfel încât

aplicarea colorantului să se facă pentru mai multe frotiuri

- uscarea frotiurilor se face pe stativ, la temperatura camerei, în

termostat sau între hârtie de filtru.

- dacă se urmăreşte realizarea de microfotografii, este bine ca

acestea să fie realizate imediat, deoarece unii coloranţi îşi pierd din
culoare în timp

Clasificarea coloranţilor:

după originea lor:

coloranţi naturali (ex. safranina, carminul, hematoxilina) de origine

vegetală sau animală. Sunt relativ puţin utilizaţi în microbiologie.

coloranţi artificiali sau sintetici.

după structura lor chimică:

- coloranţi bazici (cationici) sunt săruri care au baza colorată şi acidul incolor. Sunt
încărcaţi pozitiv şi se combină cu constituienţii celulari încărcaţi negativ - acizii nucleici,
polizaharidele acide. Exemple de coloranţi bazici: albastru de metilen, cristal violet,
fuxina bazică etc.

- coloranţi acizi (anionici) - sunt săruri care au baza incoloră şi acidul colorat. Sunt
încărcaţi electric negativ şi se combină cu constituienţii celulari încărcaţi pozitiv
-proteinele. Exemple de coloranţi acizi: safranina, roşu de Congo, fuxina acidă, acidul
eozinic.
11
- coloranţi neutri în care atât baza cât şi acidul sunt colorate.

Clasificarea colorărilor

după tipul colorării:

- colorare directă - se realizează prin acţiunea directă a colorantului asupra
microorganismelor (ex. coloraţia cu albastru de metilen);

- colorare indirectă - constă în tratarea prealabilă a frotiului cu o substanţă

denumită mordant (de fier, potasiu sau crom, acidul fenic, formolul etc.) care
permite sau ajută la fixarea colorantului. Mordantul se utilizează numai atunci
când unii coloranţi nu pot acţiona direct asupra celulelor, astfel că acestea
trebuiesc supuse unui tratament de sensibilizare sau modificare chimică finalizat
cu o mai bună fixare a colorantului. Operaţia poartă numele de mordansare. Prin
mordansare, între ţesut, mordant şi colorant se formează o combinaţie stabilă ce
rezistă la agenţii de decolorare.

după metoda de colorare:

- colorări difuze - sunt cele care colorează uniform întregul preparat (ex.colorarea cu
albastru de metilen);

- colorări selective - au rolul de a pune în evidenţă anumite organite celulare sau structuri
chimice intracelulare (ex. colorarea nucleilor, colorarea sporilor, etc.).

după timpul aferent colorării:

- colorări progresive - utilizează coloranţi foarte diluaţi ce sunt înlocuiţi de câteva ori,
acţiunea lor fiind mai îndelungată;

- colorări regresive - utilizează o soluţie concentrată de colorant, timp scurt, excesul de

colorant fiind îndepărtat cu un agent de decolorare.
Coloraţia simplă - constă în acţiunea unui singur colorant care transferă culoarea sa
celulelor din preparat. Coloranţii utilizaţi în coloraţia simplă sunt: albastru de metilen, fuxina
diluată sau soluţia hidroalcoolică 1% de violet de genţiana.

Tehnica de lucru:

obţinerea frotiului prin etalarea germenilor pe lamă şi fixarea termică;

colorarea frotiului cu unul din coloranţi:

- soluţie Loëffler 1-2 minute;

11
- soluţie fuxină diluată 1/10, 30 secunde;

- soluţie hidroalcoolică violet de genţiana 1%, 1 minut;

spălarea frotiului cu apă de robinet;

uscare la temperatura camerei;

examinare la microscop.

Coloraţia Gram

Imaginată în anul 1883 de către H.C. Joachim Gram, coloraţia care îi

poartă numele este şi în prezent utilizată ca o coloraţie de diagnostic
bacteriologic deoarece permite împărţirea bacteriilor în Gram pozitive şi Gram
negative.

Această clasificare se realizează în funcţie de structura peretelui celular.

Organismele gram-pozitive au un conţinut mai mare de peptidoglican (glucide şi
peptide) în peretele lor celular decât organismele gram-negative. Când celulele sunt
colorate cu violet cristal acesta se leagă de peretele celular.

Când etanolul este folosit ca agent decolorant, bacteriile gram-negative pierd

membrana lor exterioară datorită conţinutului ridicat de lipide, permiţând complexelor
cristal violet să se scurgă prin peretele celular. În schimb la organismele gram-pozitive,
violetul cristal este prins în interiorul celulei datorită conţinutului ridicat de
peptidoglican din peretele celular. Organismele gram-negative se colorează în roz/roşu
iar organismele gram-pozitive în albastru/violet.

Principiul acestei coloraţii este tratarea bacteriilor cu coloranţi bazici

(violet de genţiana) care formează împreună cu acizii din citoplasmă un
complex intracelular. În cazul bacteriilor G(+), complexul intracelular rămâne
colorat şi după tratarea frotiului cu soluţii decolorante. În cazul bacteriilor G(-)
acest complex intracelular se decolorează sub acţiunea alcool-acetonei şi
bacteriile trebuiesc recolorate cu un colorant de contrast (fuxina).

Soluţiile utilizate în coloraţia Gram sunt:

soluţia violet de genţiana (soluţie colorantă);

soluţia Lügol (mordant);

soluţia decolorantă alcool-acetonă;

soluţia fuxină (soluţie colorantă);

Tehnica de colorare: 11

pe frotiul fixat la flacără se pipetează câteva picături soluţie violet de genţiana care
se menţin 1-2 minute pe frotiu;

opţional se poate spăla frotiul pentru a îndepărta excesul de colorant dar există
riscul de a efectua spălarea înainte ca tot colorantul să fie legat în celulele
bacteriene;

mordansarea cu soluţie Lügol timp de 2-4 minute;

decolorarea frotiului cu alcool-acetonă. Se va ţine lama înclinată astfel încât frotiul

să fie spălat continuu cu soluţia decolorantă. Un frotiu bine decolorat trebuie să se
prezinte după tratarea cu alcool-acetonă la fel ca înainte de aplicarea violetului de
genţiana.

spălarea frotiului după decolorare este indicată pentru a îndepărta complet excesul
de iod şi pentru a prelungi timpul de decolorare;

colorarea cu fuxină diluată (1/10) timp de 30 secunde;

spălarea cu apă de robinet;

uscarea frotiului la temperatura camerei;

Rezultatul colorării:

celulele G (+) apar colorate în violet iar cele G (-) în roşu;

Caracterul Gram al celulelor bacteriene este condiţionat şi de starea fiziologică

a celulelor. Exemple de bacterii G(+): Staphylococcus, Streptococcus, Leuconostoc,
Clostridium, Bacillus, levurile. G(-) sunt bacteriile din genurile: Escherichia,
Salmonella, Proteus, bacteriile acetice.

Utilizată de mai bine de 100 de ani în bacteriologie, mecanismul

coloraţiei Gram nu a fost încă elucidat până în prezent, fiind însă propuse
câteva ipoteze:

anumite substanţe chimice aflate în straturile superficiale ale celulei

(ribonucleat de Mg - proteine - polizaharide) formează împreună cu
iodura de potasiu din soluţia Lügol un compus insolubil în alcool
acetonă;

anumite polizaharide prezente în peretele celular împiedică accesul

decolorantului la complexul ribonucleat de Mg -proteină-colorant;

peretele celular al bacteriilor G(+)11

este deshidratat de colorant astfel
încât porii lui se închid împiedicând eliberarea complexului insolubil
colorat;

reacţia Gram este legată direct de structura fizică a peretelui celular al

microorganismelor;
Coloraţia Ziehl –Neelsen

Bacteriile alcool-acido-rezistente (AAR) cum ar fi Mycobacterium

tuberculosis se colorează greu utilizând tehnicile uzuale datorită faptului că
lipidele din componenţa celulei formează un strat ceros în jurul celulei astfel
încât împiedică pătrunderea colorantului.

Aceste bacterii pot fi colorate numai la cald. După colorare, celulele

bacteriene rezistă atât la acţiunea decolorantă a acizilor cât şi a alcoolului,
fiind numite bacterii AAR.

Soluţii utilizate:

soluţia fuxină bazică (soluţie colorantă);

acid sulfuric diluat (soluţie decolorantă);

alcool etilic 96° (soluţie decolorantă);

soluţie albastru de metilen (soluţie colorantă);

Tehnica de colorare:

frotiul fixat se acoperă cu soluţie fuxină;

se încălzeşte frotiul la flacăra becului de gaz;

se îndepărtează colorantul prin spălare cu apă de robinet;

tratarea timp de 2 minute cu acid sulfuric diluat;

spălare cu apă de robinet;

recolorarea cu soluţie albastru de metilen 30-60 secunde;

spălare cu apă de robinet;

uscare;

11
examinarea cu obiectivul de imersie.

Rezultatul colorării: bacteriile AAR apar colorate în roşu strălucitor în

timp ce bacteriile care nu rezistă la acţiunea acizilor şi alcoolului apar
colorate în albastru.
AAR

Non AAR

Colorări selective

Colorarea endosporilor

Bacteriile din genurile Bacillus şi Clostridium produc anumite

structuri rezistente capabile să supravieţuiască o perioadă îndelungată
în condiţii nefavorabile de mediu şi să dea naştere unei noi celule.
Această structură se numeşte endospor şi se dezvoltă odată cu celula
bacteriană.

Poziţia şi mărimea endosporilor variază cu specia având astfel

valoare în identificarea bacteriilor.

Endosporii nu se colorează uşor dar odată coloraţi, ei rezistă la

decolorare.

Metoda de colorare a endosporului cu verde malachit (metoda

Schaeffer-Fulton)

Soluţii necesare: soluţia de verde malachit 5% şi soluţia de safranină 0,5% sau

soluţia de fuxină diluată.

Tehnica de lucru:

frotiul uscat şi fixat se acoperă cu soluţia verde malachit;

încălzirea frotiului pe baie de apă timp de aproximativ 5 minute aşezând lama pe

o hârtie de filtru;

se mută frotiul pe o altă hârtie de filtru şi după răcire se spală cu apă timp de 30
secunde;

recolorarea cu fuxină diluată 1/10 timp de 30 secunde;

spălarea cu apă de robinet;

11 coloraţi în verde, iar formele vegetative în

Rezultatul colorării: endosporii apar
roz.

Metoda Pooman

Soluţii necesare:
soluţie fuxină Ziehl;

soluţie albastru de metilen;

acid sulfuric 1%;

Tehnica de lucru:

frotiul fixat se colorează cu fuxină Ziehl;

se încălzeşte pe baie de apă timp de 2-3 minute până la apariţia vaporilor;

decolorarea cu acid sulfuric 1%;

spălare cu apă;

recolorarea cu albastru de metilen timp de 3 minute;

spălare cu apă şi uscare.

Rezultatul colorării: endosporii apar coloraţi în albastru în timp ce formele

vegetative se colorează în roşu.

Endospori

Forme
vegetative

Colorarea flagelilor

Bacteriile falgelate au organe de locomoţie fine şi subţiri, ce pot fi văzute direct

(fără colorare) la microscopul electronic. La microscopul optic, bacteriile flagelate pot fi
mai uşor observate după tratarea cu mordanţi - acid tanic şi alaun de potasiu respectiv
colorarea cu un colorant de contrast.

Metoda Gray utilizează fuxina pentru colorarea flagelilor în timp ce metoda West
utilizează azotatul de argint.

Colorarea flagelilor este dificilă, însă prezenţa şi poziţia lor constituie un criteriu
de identificare a bacteriilor. 11

Tehnica de lucru:

pe o lamă microscopică se plasează 3 picături apă distilată în care se suspendă cu ansa

bacteriologică sau cu firul drept bacterii flagelate - Pseudomonas fluorescens,
Alcaligenes faecalis;

se lasă frotiul la uscat timp de 15 minute;

se acoperă frotiul cu soluţia mordantă pentru 4 minute;

se spală cu apă distilată;

se aşează frotiul pe o hârtie de filtru şi se colorează cu un colorant de contrast,

încălzindu-se pentru 5 minute;

se aşează frotiul pe suport şi se inundă în apă distilată pentru un minut;

se îndepărtează excesul de apă de pe lamă;

se lasă la uscat la temperatura camerei.

Rezultatul colorării: flagelii apar coloraţi în roşu în cazul metodei Gray şi în negru în
cazul metodei West.

Metoda Casares Gill pentru colorarea flagelilor

Soluţii necesare:

soluţia mordantă;

soluţie fuxină Ziehl.

Soluţia mordantă se prepară astfel: se amestecă 10 g acid

tanic cu 18g clorură de aluminiu hidratată şi 33 ml alcool
etilic 70%. Separat se amestecă 10 g clorură de zinc şi 1,5 g
fuxină bazică cu 10 ml apă distilată. Cele două soluţii obţinute
se amestecă, punând picătură cu picătură cea de-a doua soluţie
în prima.

Tehnica de colorare:

pe o lamă bine curăţată se pune o picătură de ser fiziologic în care se

suspendă germenii, omogenizând încet, pentru a nu se desprinde flagelii
care sunt foarte fragili;
11
se lasă preparatul astfel obţinut la uscat în condiţii de laborator sau se
poate realiza etalarea germenilor pe lamă, după menţinerea suspensiei în
termostat la 37°C timp de 2 ore;

se acoperă frotiul cu soluţie mordantă diluată (o parte mordant în patru

părţi apă distilată) care se menţine pe frotiu până ce acesta capătă un
luciu metalic;

se îndepărtează excesul de mordant şi pe frotiul încă umed se aplică

fuxina Ziehl care se menţine 1-2 minute;

se îndepărtează excesul de colorant şi se spală frotiul;

Rezultatul colorării: celulele bacteriene apar colorate în roşu iar flagelii

în roz pal.

Colorarea capsulei bacteriene

Unele bacterii numite capsulate sau capsulogene, prezintă o structură

extraparietală care apare numai în anumite condiţii de mediu. Compoziţia
capsulei este diferită, în funcţie de specia bacteriană. Astfel au fost
identificate în capsulă polizaharide, polipeptide şi glicoproteine.

Evidenţierea capsulei bacteriene este foarte importantă, bacteriile

patogene capsulate prezentând o virulenţă mai mare.

Metoda Giemsa pentru colorarea capsulei bacteriene

Soluţia Giemsa are proprietatea de a fixa şi colora frotiul în acelaşi timp.

Tehnica de lucru:

frotiurile uscate dar nefixate se acoperă cu soluţie Giemsa în strat subţire,

numărându-se picăturile de soluţie depuse pe lamă;

se menţine soluţia 30-60 secunde după care se adaugă apă distilată în raport cu
volumul de colorant iniţial;

după amestecarea colorantului cu apă, se menţine soluţia rezultată timp de 3-5

minute;

se spală frotiul cu apă iar după uscare se examinează la microscop;

Rezultatul colorării: capsula bacteriană se colorează în diferite nuanţe de

roz-violet, corpul bacterian fiind colorat în violet mai închis.
11
Metoda de colorare cu tuş de China (India)

Soluţii necesare: tuş de China (India), alcool metilic, violet de metil (soluţie apoasă
0,5%), soluţie glucoză (6%).
Tehnica de colorare:

cultura bacteriană se suspendă într-o picătură din soluţia de glucoză plasată la

extremitatea lamei;

în suspensia rezultată se adaugă o picătură tuş şi se întinde cu o altă lamă suspensia

şi tuşul;

după uscare, frotiul se fixează cu alcool metilic care se menţine timp de 15 minute;

după uscarea alcoolului se colorează frotiul timp de 2 minute cu soluţie violet de

metil;

se spală cu apă;

Rezultatul colorării: capsula apare ca un spaţiu colorat în violet, pe un fond negru

cenuşiu.

Metoda de colorare cu albastru de toluidină

Această metodă utilizează o soluţie de albastru de

toluidină ce se prepară din: albastru de toluidină - 0,5 g,
alcool etilic de 96° -10 ml, acid fenic - 3g, apă distilată
sterilă până la 100 ml.

Tehnica de lucru:

frotiul fixat se acoperă cu soluţie albastru de

toluidină care se menţine timp de 1-2 minute;

se îndepărtează excesul de colorant;

se spală frotiul;

Rezultatul colorării: capsula bacteriană apare colorată în roz şi corpul

bacterian în albastru.

Colorarea preparatelor microscopice fungice

Colorarea nucleilor în celulele de levuri*

11
*Ciuperci microscopice unicelulare din familia blastomicetelor, care se
reproduc, în general, prin înmugurire, cea mai importantă - drojdia de bere
Saccharomyces cerevisiae.

Materiale utilizate:
culturi de levuri (Candida, Aspergillus, Fusarium, Cryptococus);

alcool etilic 40%;

soluţie apoasă KOH;

soluţie colorantă de albastru de toluidină 0,1% în alcool etilic 10%

Tehnica de lucru:

prepararea frotiului şi uscarea la temperatura camerei;

fixarea cu alcool etilic 40% timp de 2 minute;

spălarea cu apă de robinet;

colorarea cu albastru de toluidină, 2 minute;

spălare cu etanol 10%;

uscare, montare în balsam de Canada.

Interpretarea rezultatelor: nucleul celulei se colorează în albastru intens iar

citoplasma în roz-pal.

Colorarea sporilor la levuri

Pentru a induce sporularea (celule reproducătoare) la levuri, tulpinile de testat

se cultivă pe mediu de sporulare, sărac în elemente nutritive (mediul Goorodkowa).

Materiale utilizate:

etalarea suspensiei de levuri pe o lamă microscopică şi uscarea la temperatura

camerei;

colorarea cu fuxină bazică diluată 1/10 timp de 2-3 minute, încălzind de

câteva ori frotiul colorat;

spălare cu apă de robinet;

12
decolorare cu HCl 10% (2 părţi) şi alcool etilic (1 parte) - timp de 30 secunde;

spălare cu apă de robinet;

recolorare cu albastru de metilen 1%, 1-2 minute;

spălare cu apă de robinet, uscare, examinare.

Interpretarea rezultatelor: sporii se colorează în roşu intens; celulele vegetative

şi peretele ascelor (celulele mamă producătoarede spori) se colorează în albastru.

Colorarea hifelor de mucegai

Hifele reprezintă filamentele ce alcătuiesc miceliul unei ciuperci. Miceliul este

alcătuit din totalitatea filamentelor subţiri şi ramificate care alcătuiesc aparatul
vegetativ.

Majoritatea hifelor de mucegai posedă o pigmentaţie naturală şi ca atare pot fi

examinate direct între lamă şi lamelă. Pentru a mări contrastul de culoare între hife şi
restul preparatului microscopic, se pot aplica diferite tehnici de colorare.

Cel mai frecvent se utilizează tehnica de colorare cu bleu-cotton în lactofenol sau

acid lactic şi colorarea cu fuxină.

Colorarea cu bleu-cotton în lactofenol

Materiale utilizate:

culturi de mucegai dezvoltate pe mediu solid;

colorantul bleu-cotton în lactofenol sau acid lactic;

Tehnica de lucru:

se recoltează o cantitate mică de miceliu şi se depune pe

o lamă microscopică într-o picătură de colorant;

se acoperă cu lamela şi în cazul în care se constată o

aglomerare a hifelor miceliene se presează uşor lamela cu
o baghetă de sticlă;

Interpretarea rezultatelor: citoplasma hifelor şi

conidioforilor tineri se colorează în albastru deschis.
(conidiofor – hifă sporiferă pe care se formează
conidiile – spori imobili ce asigură reproducerea la
ciuperci) 12

Colorarea cu fuxină

Se utilizează aceleaşi materiale descrise mai sus,

colorantul fiind fuxina dizolvată în lactofenol şi acid lactic.
După suspendarea miceliului într-o picătură de colorant
aşezată pe lamă, se acoperă cu lamela şi se examinează la
microscop. Citoplasma hifelor miceliene se va colora în
roşu.

după numărul de coloranţi utilizaţi:

- colorări simple - care utilizează un singur colorant ce colorează uniform toate

microorganismele;

- colorări complexe sau combinate - utilizează acţiunea succesivă a mai multor coloranţi
care dau un efect de contrast (ex. coloraţia Gram, coloraţia Ziehl-Neelsen).

după momentul aplicării colorantului:

- colorări vitale - constau în inocularea în organismul

viu a unor coloranţi puţin toxici. După un interval de
timp se realizează prelevarea de celule din organismul
viu şi examinarea microscopică.

- colorări postvitale - constau în efectuarea de biopsii

după care materialul prelevat este colorat.
Mediul de cultură este un substrat solid, lichid, organic sau anorganic
care favorizează dezvoltarea microorganismelor în condiţii de laborator (în
afara nişei ecologice naturale).

Primul mediu de cultură utilizat în microbiologie a fost reprezentat de

fragmente de cartof sterilizate. Meritul de a fi introdus mediile de cultură ca
metodă de cultivare şi studiere a microorganismelor îi revine lui Robert Koch
(1882). La început au fost utilizate numai medii lichide care au fost ulterior
solidificate cu gelatină. Agarul, ca agent de solidificare a mediilor de cultură a
fost pentru prima dată utilizat în anul 1883 de către Fannie E. Hesse.

Condiţii obligatorii pentru un mediu de cultură

Mediile de cultură se obţin prin amestecarea mai multor substanţe cu proprietăţi

şi compoziţie diferită. În prezent există foarte multe reţete de medii de cultură,
clasificarea acestora în funcţie de anumite criterii fiind destul de dificilă.

Indiferent de compoziţia chimică a12mediilor de cultură, acestea trebuie să

îndeplinească anumite condiţii pentru a putea fi utilizate la cultivarea
microorganismelor şi anume:

să conţină toate elementele trofice necesare cultivării microorganismelor;

să prezinte o reacţie corespunzătoare cu cerinţele microorganismelor (acidă
pentru levuri şi bazică pentru bacterii);

să ofere microorganismelor cultivate condiţii optime de aerare şi umiditate;

să fie steril şi să fie repartizat în recipiente sterile;

să reproducă într-un mod cât mai fidel substratul natural al

microorganismului studiat;

să fie limpede (clar) pentru a permite studierea uşoară a caracteristicilor

coloniale ale microorganismelor studiate.

Clasificarea mediilor de cultură

Necesităţile nutritive diferite ale microorganismelor impun o diversitate

mare a compoziţiei chimice a mediilor nutritive astfel încât o clasificare a
acestora este destul de dificilă deoarece pot să apară suprapuneri între
criteriile de clasificare.

Cu toate acestea, există câteva criterii de clasificare a mediilor de cultură

şi anume:

după consistenţă:

- medii lichide;

- medii solide;

după provenienţă:

- medii naturale - în care sursa de azot şi carbon este reprezentată de

substraturi naturale (must de malţ, must de struguri, mediu cu lapte, cu ou);

- medii artificiale care conţin ingrediente cu o compoziţie chimică

nedefinită (extractele de malţ, de levuri sau extractele din ţesuturi animale
şi vegetale) şi care se adaugă în mediul de cultură pentru suplimentarea
resurselor nutritive ale microorganismelor.

- medii sintetice - sunt cele care au o compoziţie chimică definită.

12
după scopul utilizării:

- medii uzuale;

- medii speciale:
- medii selective;

- medii de îmbogăţire;

- medii de diagnostic diferenţial;

- medii de menţinere.

Mediile uzuale sunt utilizate în mod curent în laborator pentru cultivarea unui
număr mare de germeni microbieni.

Mediile speciale - sunt medii complexe care permit creşterea unui număr restrâns
de germeni dintr-un amestec heterogen sau testarea anumitor particularităţi fiziologice
ale unor microorganisme (fermentarea unor zaharuri, asimilarea zaharurilor, a nitraţilor,
etc.). Un mediu uzual devine special atunci când în compoziţia sa este:

- un indicator pH sau o substanţă care modifică reacţia mediului astfel încât acesta
devine favorabil creşterii numai anumitor microorganisme;

- un zahăr fermentescibil - ajută la testarea capacităţii fermentative a levurilor;

- un antiseptic selectiv care inhibă unele microorganisme şi ajută la dezvoltarea

altora;

- un antibiotic.

Mediile selective - sunt acelea care includ unul sau mai mulţi agenţi inhibitori,
care restrâng multiplicarea anumitor microorganisme. Agenţii inhibitori utilizaţi pot fi
coloranţi, antibiotice, săruri biliare.

Antibiotice frecvent administrate în mediile de cultură pentru inhibarea

activităţii anumitor microorganisme:

Denumire antibiotic

Doza de
administrare

Microorganismele inhibate
12
Amphotericin B

2,5 mg/l

Levurile şi mucegaiurile
Ampicilină

2,5 mg/l

Bacteriile

Ciprofloxacin

10-40 mg/l

Micoplasmele

Nystatin

50 mg/l

Levurile şi mucegaiurile

Tetraciclină

10 mg/l

Bacteriile

Mediile de îmbogăţire - nu conţin substanţe bacteriostatice (care stopează

dezvoltarea bacteriilor) dar prin compoziţia lor oferă condiţii de creştere pentru
anumite specii bacteriene.

Mediile de diagnostic diferenţial - sunt cele care prin compoziţia lor evidenţiază
anumite particularităţi metabolice, caracteristice unei specii de microorganisme.

Mediile de menţinere – sunt destinate păstrării culturilor de microorganisme şi

trebuie să asigure o bună viabilitate a celulelor pentru perioade de timp cât mai
îndelungate.

După prezenţa sau absenţa oxigenului, mediile de cultură pot

fi:

- medii pentru microorganismele aerobe;

12
- medii pentru microorganismele anaerobe;

Mediile pentru microorganismele anaerobe pot avea aceeaşi

compoziţie ca şi mediile pentru aerobe, dar li se adaugă substanţe
cu efect reducător (acid ascorbic, cisteină, fragmente proaspete de
organe vegetale sau animale, boabe de orez în curs de germinare
etc).

AEROB

ANAEROB

Ingrediente utilizate la prepararea mediilor de cultură

Atunci când mediile de cultură se prepară în laborator, este necesară asigurarea

ingredientelor necesare.

Cele mai utilizate ingrediente sunt:

- carnea - este utilizată la prepararea bulionului de carne, a unor peptone

bacteriologice sau la prepararea extractului de carne;

peptonele - pot fi preparate în laborator sau pe cale industrială. Termenul de

peptonă este utilizat în sens mai larg pentru amestecul de fracţii proteice, cele
vegetale având un conţinut mai mare de carbohidraţi. Peptonele nu coagulează la
cald, astfel că pot fi sterilizate prin autoclavare şi sunt lipsite de vitamine;

sângele - recoltat aseptic se utilizează pentru îmbogăţirea calităţilor nutritive ale

unor medii de cultivare, pentru studiul capacităţilor hemolitice ale bacteriilor (de
distrugere a globulelor roşii), pentru diferite reacţii serologice;

serul - se utilizează pentru îmbogăţirea unor medii de cultură, pentru studiul

proteolizei (descompunerea şi degradarea proteinelor), al pigmentaţiei coloniilor
bacteriene, pentru izolarea germenilor din genul Corynebacterium (difteria);

gelatina - se obţine prin hidroliza (descompunerea) colagenului din anumite

ţesuturi. S-a întrebuinţat mult timp pentru solidificarea mediilor de cultură, fiind
ulterior înlocuită de agar. În prezent gelatina este utilizată pentru studiul
proteolizei bacteriene. Este important ca pentru obţinerea gelului să se umecteze
bine gelatina şi să se realizeze o concentraţie corespunzătoare obţinerii unui gel
clar;

extractul de levuri - constituie o sursă importantă de aminoacizi şi vitamine

hidrosolubile (dizolvabile în apă). Intră în componenţa mediilor de cultură
destinate în special identificării speciilor şi genurilor de levuri. Mediile cu extract
12
de levuri nu pot fi autoclavate la temperaturi foarte mari;

extractul de malţ - se utilizează ca şi cel de levuri la obţinerea mediilor de cultură

destinate studiului ciupercilor (levuri şi mucegaiuri);

hidraţii de carbon - intră în componenţa mediilor uzuale ca sursă de carbon şi în

componenţa mediilor selective destinate testării anumitor particularităţi fiziologice
(funcţii) ale microorganismelor;

agarul - este un polizaharid care se extrage din anumite genuri de alge marine:
Gellidium, Gracillaria, Pterocaldia. Se adaugă în mediile de cultură pentru
solidificare, în proporţie de 2%. Principala însuşire a agarului este aceea că se
dizolvă în apă la 100˚C şi solidifică la 40˚C, astfel încât mediul poate fi distribuit
în recipiente (plăci Petri, eprubete) în stare lichidă, solidificarea realizându-se
ulterior. Trebuie ştiut de asemenea că agarul nu solidifică mediile puternic acide.

Agarul nu prezintă semnificaţie nutritivă. Mediile de cultură care conţin agar trebuie
omogenizate pe agitatoare prevăzute cu sistem de încălzire.

Toate ingredientele utilizate în prepararea mediilor de cultură trebuie să asigure

microorganismelor condiţii nutritive optime pentru dezvoltare.

În funcţie de rolul lor, ingredientele pot fi încadrate în:

surse de carbon şi energie care sunt necesare în reacţiile de biosinteză şi la multiplicarea

microorganismelor;

surse de azot - necesare proteosintezei (sinteza proteidelor rezultate din combinarea unei
proteine cu osubstanţă neproteică);

săruri minerale - necesare menţinerii echilibrului ionic al celulei. Acestea sunt necesare în
cantităţi mici dar absenţa lor din mediu conduce la o dezvoltare slabă a germenilor
microbieni;

factorii de creştere sunt necesari ca şi sărurile minerale în cantităţi mici şi numai pentru
microorganismele auxotrofe (care îşi asigură factorii necesari creşterii din mediul
exterior)care nu pot sintetiza aceşti factori pornind de la sursele de carbon şi azot;

agentul de solidificare;

apa ca solvent al ingredientelor de mai sus.

Etapele preparării mediilor de cultură

Fiecare mediu de cultură, indiferent de compoziţia sa sau scopul utilizării

(identificarea, studierea sau conservarea microorganismelor) trebuie să asigure
o conservare adecvată a elementelor12 nutritive astfel încât să permită
dezvoltarea microorganismelor cultivate.

Etapele de preparare a mediilor de cultură sunt următoarele:

- stabilirea compoziţiei chimice a mediului de cultură (alegerea reţetei)

adecvat pentru microorganismul pe care dorim să îl izolăm, cultivăm sau
conservăm;

- cântărirea ingredientelor conform reţetei şi dizolvarea acestora în ½ din

cantitatea de apă necesară;

- omogenizarea componentelor după adăugarea restului de apă. Se

utilizează în acest scop agitatoare magnetice;

- determinarea valorii pH a mediului şi corectarea acestuia în funcţie de

necesităţile microorganismelor. Se va ţine cont de faptul că prin autoclavarea
mediului, pH-ul scade cu 0,3 unităţi;

- filtrarea mediului - nu este o etapă obligatorie. Se execută numai pentru

înlăturarea eventualelor precipitate după care se efectuează o recorectare a
pH-ului;

- sterilizarea mediului - majoritatea mediilor de cultură se sterilizează prin

autoclavare (la 121˚C timp de 15-20 minute). Mediile de cultură
termodegradabile sau cele care conţin zaharuri se sterilizează prin tindalizare
sau filtrare sterilizantă;

- distribuirea mediului în recipiente sterilizate în prealabil. Dacă mediul

este lichid, distribuirea în eprubete sau vase Erlenmayer se poate realiza
înainte de sterilizare. Mediile solide se sterilizează în vase Erlenmayer sau
Berzellius distribuindu-se apoi în plăci Petri sterilizate.

CÂNTĂRIREA

DIZOLVAREA

CORECTARE PH

STERILIZARE

FILTRAREA

DISTRIBUIREA MEDIULUI

Distribuirea mediului trebuie să se realizeze în condiţii de asepsie, în hotă,

urmărind ca recipientele în care se12 distribuie mediul să rămână cât mai puţin
timp descoperite. După distribuirea mediului în plăci şi solidificare, plăcile vor
fi întoarse cu capacul în jos astfel încât picăturile de apă rezultate să nu ajungă
pe suprafaţa mediului.

Pentru a se putea ajunge la o cultură pură de microorganisme trebuie să se

realizeze mai întâi inocularea urmată de însămânţarea şi cultivarea
microorganismului.

Cei doi termeni ”inoculare” şi “însămânţare”sunt de obicei utilizaţi cu

acelaşi înţeles. Trebuie precizat însă că:

- inocularea presupune trecerea unei cantităţi mici (inocul)

dintr-o probă pe suprafaţa unui mediu de cultură;

- însămânţarea presupune pasajul unei culturi pure pe un nou mediu de

cultură.

Indiferent dacă se realizează numai o inoculare sau dacă aceasta este

urmată de însămânţare, cele două operaţii trebuie să se desfăşoare în condiţii
de strictă sterilitate astfel încât pe mediul de cultură să ajungă numai
microorganismele prezente în probă sau cele prelevate dintr-o cultură
microbiană preexistentă.

Pentru evitarea contaminării cu alte microorganisme din exterior sau a contaminării

mesei de lucru şi a laboratorului cu germeni microbieni, trebuiesc respectate anumite
condiţii şi anume:

inocularea şi însămânţarea microorganismelor se va realiza numai în hote sterile;

pentru a evita răspândirea în mediul înconjurător a germenilor ce urmează a fi

inoculaţi, este absolut obligatoriu ca însămânţarea să se realizeze în zona de protecţie
a becului de gaz;

se va evita atingerea instrumentelor de însămânţare cu orice obiect nesteril;

inocularea trebuie să se realizeze într-un interval de timp cât mai scurt astfel încât
contactul cu aerul nesteril să fie cât mai redus;

în intervalul în care sunt deschise, recipientele cu medii sterile trebuiesc menţinute în

poziţie oblică sau orizontală cât mai aproape de flacăra becului de gaz (în zona de
protecţie a becului).

Inocularea mediilor de cultură se face diferenţiat în funcţie de natura mediului (solid

sau lichid) şi de modul de creştere al microorganismelor (aerob sau anaerob).

Inocularea mediilor solide 12

a. mediul solid distribuit în tuburi în poziţie înclinată

Tehnica de însămânţare: ansa ţinută în mâna dreaptă se sterilizează prin

încălzire la roşu. Recipientul din care se face prelevarea probelor se ţine în mâna
stângă, se deschide în zona de acţiune a becului de gaz, se încarcă ansa cu probă
după ce a fost răcită în prealabil astfel încât să nu fie omorâţi germenii. Se
închide recipientul din care a fost prelevată proba. Tot în mâna stângă se ţine şi
recipientul în care urmează să se facă inocularea. Operaţiunile sunt asemănătoare
cu cele de prelevare a probei: se deschide tubul ţinând dopul între degetul mic şi
podul palmei, se flambează orificiul tubului, şi se introduce ansa până la baza
mediului distribuit în tub (unde începe înclinarea mediului). Se trasează cu bucla
ansei, prin mişcări rapide, un zig-zag astfel încât să se distribuie prelevatul pe
toată suprafaţa mediului înclinat.

b. mediu solid turnat în coloană

Tehnica de lucru în acest caz constă în următoarele operaţiuni: se deschide tubul în

zona flăcării becului de gaz, şi cu firul drept pe care se află germenii prelevaţi, se înţeapă
mediul trasând o linie dreaptă spre suprafaţa mediului.

c. mediu solid turnat în plăci Petri

La fel ca şi în cazul mediului solid distribuit în tuburi, şi în această situaţie,

inocularea se poate realiza la suprafaţa mediului sau în profunzime.

Inocularea pe suprafaţa mediului presupune următoarele: se ţine ansa cu prelevatul în

mâna dreaptă şi cu stânga placa Petri cu mediul de cultură. Se deschide capacul plăcii,
fară ca acesta să fie îndepărtat total de placă (se ţine în poziţie oblică)
şi se striază suprafaţa mediului în diferite moduri.

Inocularea în profunzime se poate realiza utilizând două metode:

- metoda între două straturi presupune însămânţarea la suprafaţa mediului

după care se toarnă un alt strat subţire de geloză (apă şi agar) astfel încât proba
însămânţată să rămână prinsă între cele două straturi;

- metoda plăcilor turnate presupune depunerea în placa Petri a unei cantităţi

de probă peste care se toarnă mediul de cultură, se amestecă şi se lasă să
solidifice. Se crează astfel condiţii de semianaerobioză necesare izolării anumitor
bacterii.

Inocularea în medii lichide

Mediile lichide se inoculează cu pipeta gradată şi pipeta Pasteur atunci când

13şi cu ansa, firul drept sau o spatulă atunci
prelevarea se face din probe lichide
când prelevarea se face din medii solide.

Incubarea

Recipientele cu medii de cultură inoculate vor fi inscripţionate cu numărul

probei şi data la care a fost efectuată inocularea. Se termostatează la temperatura
considerată a fi optimă pentru fiecare germen microbian. Timpul de incubare
variază de la o specie la alta, fiind cuprins între 18-24 ore, pentru majoritatea
germenilor, dar sunt şi specii care necesită o incubare de câteva săptămâni sau
chiar câteva luni.
Izolarea microorganismelor dintr-o probă şi cultivarea acestora pe medii
de cultură solide sau lichide a fost realizată pentru prima dată de către Robert
Koch în anul 1881, el definind şi noţiunea de cultură microbiană.

Cultura pură de microorganisme este o populaţie omogenă de celule ce

aparţin unei singure tulpini şi care se dezvoltă într-un anumit mediu de
cultură.

Este absolut necesară izolarea microorganismelor în cultură pură deoarece

numai asupra acestor culturi se pot realiza:

- studii privind caracterele culturale ale microorganismelor (netede,

umede ,lucioase, uscate, mate etc.);

- menţinerea microorganismelor în colecţii;

- obţinerea unor produse de sinteză a microorganismelor (compusi

aromatici, aditivi alimentari etc.).

A. Tehnici de selecţie a microorganismelor

Pentru a realiza selecţia microorganismelor ce trebuie apoi inoculate şi

însămânţate, se practică mai multe metode care pot fi grupate astfel:

metode fizice;

metode chimice;

metode biologice.

Metodele fizice de izolare a microorganismelor constau în utilizarea

temperaturilor optime de cultivare a germenilor şi în separarea acestora în
funcţie de termorezistenţa lor.

Temperaturile optime de cultivare se utilizează în special pentru separarea

13
bacteriilor termofile (adaptate să crească la temperaturi mai mari de 45˚C şi
majoritatea au temperaturi optime la 55-65˚C şi temperaturi maxime la peste
90˚C, de ex. Lactobacillus, Clostridium, Bacillus etc.) şi criofile prezente
într-o probă (au temperatura minimă de creştere la 0˚C, cresc bine la 7˚C, între
20 şi 30˚C şi maximă la 35-40˚C, de ex. Enerobacter, Hafnia, Yersinia,
Pseudomonas, Campylobacter, Vibrio, Listeria; drojdii din genurile Candida
şi mucegaiuri, microorganisme ce pot da alterări ale alimentelor păstrate prin
refrigerare).

Metodele chimice de selecţie a microorganismelor constau în utilizarea mediilor

selective şi în administrarea într-un mediu uzual a anumitor antibiotice care permit
creşterea unor microorganisme şi inhibarea altora.

Metodele biologice se bazează pe crearea condiţiilor de

antagonism (relaţie benefică doar uneia dintre specii) şi
izoantagonism (inhibă indivizii aceleiaşi populaţii) într-un anumit
mediu, prin însămânţarea de tulpini pure, bine controlate, sau pe
receptivitatea particulară a unor animale faţă de unele specii
microbiene. Proba se inoculează pe cale subcutanată la animalul
receptiv.

După producerea infecţiei se izolează, din organele

animalului mort în urma infecţiei, bacteria care interesează.
Astfel se izolează, de exemplu Mycobacterium tuberculosis prin
inocularea la cobai a materialului contaminat.

B.Tehnici de obţinere a coloniilor izolate

Pentru a se putea ajunge la o cultură pură de microorganisme este necesară

mai întâi obţinerea coloniilor izolate care să poată fi ulterior transferate uşor pe
un nou mediu de cultură.

Colonia de microorganisme apare ca urmare a multiplicării pe suprafaţa

unui mediu solid a uneia sau mai multor celule de acelaşi tip.

Este important ca pentru obţinerea coloniilor izolate, probele să fie

prelucrate prin diluare, în cazul în care numărul de microorganisme este foarte
mare (ex. produsele alimentare, solul, apele impurificate) sau centrifugare, în
cazul în care probele prezintă un număr mic de microorganisme pe unitatea de
volum.

Pentru obţinerea coloniilor izolate se practică următoarele tehnici:

tehnica epuizării ansei;

tehnica diseminării inoculului la suprafaţa mediului;

13
tehnica încorporării inoculului.

Tehnica epuizării ansei - constă în recoltarea microorganismelor din probă pe

bucla ansei şi parcurgerea pe suprafaţa mediului solid a unui traseu separat în patru
sectoare, numărul de germeni diseminaţi pe suprafaţa mediului fiind în descreştere de la
primul la ultimul sector inoculat.

După incubare, în ultimul sector inoculat trebuie să se dezvolte colonii

izolate ce pot fi uşor însămânţate pe un nou mediu.

Atunci când după inocularea unui sector se sterilizează ansa şi sectoarele

următoare se inoculează prin trasarea unor striuri ce pornesc din sectorul
anterior, se realizează tehnica numită fracţionarea striurilor.

Tehnica diseminării inoculului diluat pe suprafaţa mediului

Pentru a obţine colonii izolate prin această metodă, este important ca

suprafaţa mediului să fie zvântată înainte de inoculare şi inoculul să fie foarte
bine repartizat astfel încât să permită formarea coloniilor din celule izolate
înainte ca acestea să se multiplice.

Există mai multe metode de diseminare a inocului diluat şi anume:

metoda diseminării cu bagheta;

metoda diluţiilor zecimale;

metoda Domerq.

Metoda diseminării germenilor cu ajutorul baghetei

Inocularea pe suprafaţa mediului se face cu ajutorul unei pipete sterile

urmând apoi etalarea cu ajutorul unei baghete în formă de “L”.

Atunci când pe suprafaţa mediului rămâne o peliculă fină, nu se obţin

colonii izolate ci o creştere sub formă de gazon.

Metoda diluţiilor zecimale - presupune parcurgerea următoarelor etape de

lucru:

- se pun câte 9 ml apă distilată în mai multe eprubete şi se sterilizează prin

autoclavare;

- în prima eprubetă se pipetează steril 1mL din proba din care trebuie să
izolăm germenii microbieni. Dacă proba este solidă, se introduce 1g în prima
eprubetă cu apă distilată sterilizată.13Se obţine astfel diluţia 10-1 sau o diluare a
probei iniţiale de 10 ori;

- pentru a obţine diluţia 10-2 se prelevează steril 1mL din prima eprubetă şi
se transferă în cea de a doua eprubetă;
- se continuă aceeaşi operaţiune până ce se ajunge la diluţii de 10-6 - 10-8,
în funcţie de încărcătura totală a probei şi de natura germenilor ce trebuie
izolaţi.

Pentru obţinerea izolatului colonial se fac însămânţări din ultimele diluţii pe

suprafaţa mediului solid. Tot prin această metodă se poate face şi determinarea
numărului total de germeni.

Metoda Domerq - este foarte asemănătoare cu metoda diluţiilor zecimale,

deosebirea constând în faptul că transferul dintr-o eprubetă în alta se face cu ansa
calibrată (2, 10 sau 20μl).

Tehnica încorporării inoculului

Pentru a obţine colonii izolate în cazul bacteriilor de tip microaerofil (specii ce

trăiesc în medii sărace în oxigen), este absolut necesară încorporarea inoculului în
mediul de cultură astfel încât microorganismul să primească o cantitate de oxigen mai
mică decât cea prezentă în atmosferă.

Pentru realizarea acestei metode, mediul de cultură trebuie distribuit iniţial în

eprubete.

Tehnica de lucru:

- încălzirea eprubetelor cu mediu de

cultură pe baia de apă, până când mediul
de cultură devine lichid;

- repartizarea inoculului cu ajutorul unei

pipete gradate, într-o placă Petri sterilă;

- mediul lichid, răcit la 40 - 45°C se

distribuie în placa Petri peste inocul;

- agitarea plăcii pentru omogenizarea

inoculului în mediul de cultură;

- după solidificarea mediului în placă şi

notarea plăcilor, se relizează termostatarea
acestora menţinându-se cu capacul în jos.
13
C.Tehnici de transfer a microorganismelor

Transferul microorganismelor se realizează diferit, în funcţie de mediile în

care se află microorganismele şi de mediul în care se realizează transferul.
Astfel pot fi întâlnite următoarele tipuri de transfer al germenilor:

transferul din mediu lichid în mediu lichid;

transferul din mediu lichid pe mediu solid;

transferul de pe mediu solid în mediu lichid;

transferul de pe mediu solid pe mediu solid.

Transferul germenilor din mediu lichid în mediu lichid

Pentru realizarea acestui tip de transfer se pot utiliza următoarele

instrumente: ansa, pipeta gradată, pipeta Pasteur.

Transferul germenilor cu ansa se poate realiza numai atunci când mediul

lichid este foarte bogat în germeni microbieni şi distribuţia acestora este
omogenă.

Pipeta Pasteur se utilizează atunci când se urmăreşte transferul germenilor

de pe un mediu uzual pe un mediu selectiv. În acest caz, este necesar ca în
mediul uzual germenii să fie bine dezvoltaţi.

Transferul germenilor din mediu lichid pe mediu solid

Acest tip de transfer se poate realiza cu ansa, cu pipeta gradată sau cu

pipeta Pasteur. Transferul cu ansa este posibil atât în cazul mediilor solide
distribuite în plăci, cât şi în cazul mediilor solide distribuite în tuburi în poziţie
înclinată.

Atunci când se utilizează pipeta gradată, însămânţarea se face cu 0,1 sau 1

mL probă, mediul solid fiind distribuit numai în plăci. Se pipetează proba în
placă şi apoi se distribuie mediul răcit la 40-45˚C. După solidificarea mediului,
coloniile se vor dezvolta în profunzimea stratului de mediu, rezultând astfel o
însămânţare prin înglobare.

Transferul germenilor cu ajutorul pipetei Pasteur presupune întâi

distribuirea mediului şi ulterior pipetarea probei la suprafaţa mediului. Atunci
când numărul de germeni este foarte mare, se poate realiza o distribuire a
germenilor cu ajutorul spatulei Drigalski, rezultând astfel însămânţarea tip
gazon. 13

Transferul germenilor de pe mediu solid pe mediu solid

Se pot realiza transferuri de germeni dezvoltaţi pe mediu solid distribuit în

plăci Petri sau în tuburi în poziţie înclinată. Mediul solid pe care se face
transferul poate fi de asemenea distribuit în placă sau în tuburi în poziţie
înclinată.

Toate aceste transferuri de germeni se realizează cu ansa.

Transferul germenilor de pe mediu solid în mediu lichid

Instrumentele utilizate în acest tip de transferuri sunt: ansa, firul drept şi

firul spatular. Şi în acest caz este important ca, după încălzirea la roşu a
instrumentelor cu care se face transferul, să se realizeze o răcire a acestora.

După prelevarea germenilor, instrumentul cu care se realizează transferul

se introduce în tubul cu mediu lichid şi se agită energic astfel încât germenii
prelevaţi să se desprindă de pe intrumentul metalic şi să rămână în mediul
lichid. După însămânţare se agită bine tubul cu mediu lichid pentru a se realiza
o distribuţie uniformă a germenilor în mediu.
Identificarea microorganismelor impune parcurgerea următoarelor etape:

izolarea microorganismelor în cultură pură;

studiul caracterelor microscopice ale microorganismelor izolate;

studiul caracterelor coloniale ale microorganismelor;

studiul caracterelor metabolice sau biochimice;

studiul caracterelor antigenice (substanţe proteice care determină

apariţia anticorpilor);

studiul patogenităţii germenilor.

O importanţă mai mică în identificarea germenilor o prezintă ecologia şi

sensibilitatea germenilor faţă de unii factori de mediu.

Cultura pură = o cultură de laborator care conține o singură specie de

organism. O cultură pură este de obicei derivată dintr-o cultură mixtă (una care
conține mai multe specii) prin transferarea unei probe mici într-un mediu de
creștere steril nou, astfel încât să disperseze celulele individuale pe suprafața
mediană sau prin subțierea probei de mai multe ori înainte de inocularea pe un
mediu nou.
13
Ambele metode separă celulele individuale astfel încât, atunci când se
înmulțesc, fiecare să formeze o colonie discretă cu asigurarea că va fi prezent
un singur tip de organism.

Studiul caracterelor de cultură ale microorganismelor

Studiul caracterelor de cultură ale microorganismelor constituie o etapă
obligatorie în identificarea unui microorganism izolat dintr-un mediu natural
sau dintr-un produs patologic.

Caracterele de cultură se examinează prin însămânţarea germenilor pe

medii uzuale, în timp ce caracterele biochimice se urmăresc prin însămânţarea
germenilor pe medii speciale.

Examinarea caracterelor de cultură ale microorganismelor, însămânţate în

medii lichide şi pe medii solide se realizează zilnic sau de câteva ori pe zi
notându-se modificările apărute.

1. Examinarea caracterelor de cultură în medii lichide

După însămânţarea germenilor în mediu lichid şi incubarea acestuia se fac

notări asupra următoarelor caracteristici:

momentul dezvoltării culturii în mediu lichid;

gradul (viteza) de creştere a germenilor - se notează după 48 ore de

incubare şi poate fi: sărac, moderat, abundent sau excesiv;

turbiditatea mediului care poate fi: absentă, uşoară, moderată sau

densă;

tipul turbidităţii: uniformă, granulară, floculentă (coagulantă);

depozitul format: absent, neînsemnat, moderat, abundent;

textura depozitului: fin, granular, floculent, membranos;

comportamentul depozitului la agitare: cu dezintegrare completă şi cu

dezintegrare incompletă;

prezenţa unor formaţiuni de suprafaţă (creşterea la suprafaţa mediului):

creştere inelară în jurul pereţilor eprubetei;

creştere peliculară - la suprafaţa mediului se formează un voal sau o peliculă

subţire. Pelicula poate avea aspect13
neted, granular sau rugos uneori fiind uşor
plisată. Desprinderea peliculei de pereţii tubului poate fi completă sau incompletă.

creştere membranară - este foarte asemănătoare cu cea precedentă, cu diferenţa că

la suprafaţa mediului se formează o membrană groasă ce se prezintă ca un dop.
Membrana se dezintegrează greu, uneori, prin agitarea tubului, aceasta coboară în
mediu fără a se dezintegra.

creştere floculentă - la suprafaţa mediului se acumulează o masă de celule care

plutesc sub forma unor flacoane de dimensiuni diferite.

În general, creştere membranară, peliculară sau floculentă prezintă

microorganismele de tip aerob sau microaerofil, microorganisme a căror
capacitate respiratorie este mai mare decât capacitatea fermentativă.

culoarea culturii - unele microorganisme colorează diferit mediul de

cultură datorită unor pigmenţi ce difuzează din celulă în mediul de
cultură lichid (ex. culturile de Rhodotorula formează inel roşu - orange,
mediul de cultură lichid căpătând o culoare orange; pe mediu solid,
pigmenţii speciei Rhodotorula nu difuzează în mediu).

mirosul culturii;

formarea bulelor de gaz care demonstrează prezenţa unui proces

fermentativ;

tipul respirator al microorganismelor.

2. Examinarea caracterelor de cultură pe medii solide

Caractere de cultură observate pe mediu solid dispus în tub înclinat

Atunci când germenii microbieni se însămânţează în eprubete cu mediu

solid înclinat, se fac următoarele observaţii asupra culturilor:

momentul apariţiei coloniilor

gradul de creştere al coloniilor după o perioadă completă de

incubare (48-72 ore). Creşterea culturii poate fi: săracă, moderată,
abundentă sau excesivă.

aspectul traseului de însămânţare care poate fi: subţire, gros, umed sau
uscat;

culoarea culturii şi gradul de difuzare al pigmentului în mediul de cultură.

13
După cum pigmentul coloniei difuzează în celulă sau în mediul de cultură,
microorganismele pot fi grupate astfel:

microorganisme cromofore - la care pigmentul rămâne legat în celulă, la locul

sintezei;
microorganisme paracromofore - pigmentul rămâne legat în structurile superficiale
ale celulei - peretele celular, capsula bacteriană. Aceste microorganisme formează
colonii izolate;

microorganisme cromopare - al căror pigment este eliminat în mediu astfel încât

mediul se colorează caracteristic.

modul de creştere al culturii - cultura se dezvoltă numai pe striul de însămânţare sau

apar şi colonii izolate de striu. Germenii imobili se dezvoltă de regulă numai pe striul de
însămânţare în timp ce germenii mobili se dezvoltă pe toată suprafaţa mediului înclinat

forma marginii culturii care poate fi:

- întreagă
- lobată
- rizoidă

- ondulată - dinţată

Pe mediile solide gelozate, distribuite în tuburi în poziţie verticală se notează:

dacă gelatina a fost sau nu fluidizată;

aspectul zonei de fluidizare care poate fi:

crateriform

infundibular

filiform

în strat de suprafaţă

total

Examinarea caracterelor morfologice coloniale

Colonia este rezultatul creşterii şi multiplicării la un loc a descendenţilor uneia

sau mai multor celule ce aparţin unei singure specii de microorganisme.

13
Pentru a fi notate caracterele de morfologie colonială, mediul solid se va distribui
în plăci Petri.

După însămânţare şi incubare, se notează:

momentul apariţiei coloniilor;

gradul de uniformitate al coloniilor;

forma coloniilor;

aspectul marginii coloniei;

profilul coloniei;

Caracteristici de creştere colonială

consistenţa coloniei care poate fi:

vâscoasă (grasă)

granulară (fibrilară)

gradul de transparenţă al coloniilor care pot fi:

transparente

translucide

opace

aspectul suprafeţei coloniei:

- netedă - lucioasă - încreţită - uscat-pudrată – rugoasă - mată - strălucitoare

Aspectul suprafeţei coloniei unui microorganism este determinat de factori

genetici care condiţionează capacitatea de sinteză a polizaharidelor capsulare.
Transformarea coloniilor de tip neted (S) în colonii rugoase (R) şi invers, în
condiţiile păstrării pe acelaşi mediu de cultură, este rezultatul mutaţiilor
genetice. Uneori schimbarea condiţiilor de cultivare a microorganismelor poate
induce modificarea aspectului coloniei.

Coloniile de tip neted sunt circulare, au marginea întreagă, profilul convex,

sunt umbonate, au suprafaţa netedă, lucioasă, mată sau strălucitoare.

Pentru
microorganismele 14
patogene, apariţia
coloniilor de tip neted este
indiciul unor tulpini cu
patogenitate mare. Din
aceste colonii, după
însămânţarea în mediul
lichid se vor dezvolta
culturi care dau o
turbiditate uniformă
mediului.

Coloniile rugoase sunt neregulate, ondulate, lobate, rizoide, radiare. Profilul lor
este plat. Acest tip de colonie este caracteristic tulpinilor mai puţin patogene.

Pentru bacteriile anaerobe însămânţate prin înţeparea coloanei de mediu, după

perioada de incubare se notează:

profunzimea până la care are loc creşterea în coloana de mediu;

forma creşterii care poate fi:

filiformă (continuă pe traseul de însămânţare)

mărgeluită (discontinuă), fără sau cu ramificaţii în masa mediului

creşterea la suprafaţa mediului:

prezentă

absentă

La levuri, pentru a stabili dacă tulpina testată aparţine sau nu genurilor sporogene,
se fac însămânţări pe mediu de sporulare (Goorodkowa) notându-se dacă se dezvoltă
sau nu colonii pe acest mediu.

3. Examinarea caracterelor biochimice de cultură ale microorganismelor

Testele biochimice de identificare a microorganismelor se efectuează numai

asupra culturilor pure şi prin comparaţia cu un martor reprezentat de culturi pure
standardizate (culturi de colecţie).

Proprietăţile biochimice ale microorganismelor au o mare importanţă pentru

identificare deoarece ele reflectă natura echipamentului enzimatic şi în mod indirect
particularităţile genetice ale microorganismelor studiate.

Pentru a efectua testele biochimice,14trebuie ţinut cont de faptul că

microorganismele utilizează diferite substanţe chimice din mediul de cultură, fie ca
sursă de energie, fie ca material de construcţie pentru creştere şi multiplicare,
producând modificări ale mediului iniţial (dispariţia unor substanţe din mediu, apariţia
unor produşi noi, modificări de pH, producere de gaze etc).
Modificările de pH se pun în evidenţă prin alegerea unui indicator adecvat, evitând
indicatorii care inhibă creşterea microorganismelor sau pe cei care au o culoare
asemănătoare pigmenţilor produşi de microorganisme sau o culoare asemănătoare cu cea a
mediilor în care sunt însămânţaţi.

Producerea de gaz evidenţiată la microorganismele cu activitate fermentativă, se testează

prin acumularea bulelor de gaz în tuburi de fermentaţie tip Durham, tuburi ce se introduc
în eprubetele cu mediu lichid.

Caracterele biochimice ale microorganismelor se rezumă la evidenţierea activităţii

acestora faţă de anumite substraturi metabolizabile, mai frecvent urmărite fiind: glucidele,
proteinele şi lipidele.

Studiul metabolizării glucidelor (hidraţi de carbon)

Metabolizarea carbohidraţilor de către microorganisme se poate realiza prin două procese

fundamental diferite:

fermentarea - molecula de glucoză fosforilată este scindată în două molecule de trioză

(monozaharidă cu trei atomi de carbon) care sunt apoi transformate prin procese independente
de prezenţa oxigenului;

oxidarea - molecula de glucoză nu este scindată la trioze, grupul aldehidic fiind oxidat la
carboxil ce formează acid gluconic (utilizat ca acidulant în praful de copt, pâine, brânză,
mezeluri și alte alimente).

Ca substanţe fermentescibile, cel mai frecvent se utilizează următoarele:

monozaharide:

pentoze: arabinoză, xiloză, ramnoză;

hexoze: dextroză, manoză, galactoză, glucoză.

dizaharide: lactoza, celobioza;

trizaharide: rafinoza;

polizaharide: inulina, amidonul, glicogenul;

alcoolii: glicerol, manitol, sorbitol.14

Acidul lactic este un acid organic slab cu rol decisiv în anumite procese de fermentație, cum
ar fi pregătirea silozului pentru animale, sau la producerea produselor din lapte, iaurt,
chefir, urdă, brânză, etc.
Acidul propionic este un aditiv alimentar din categoria conservanţilor naturali, obţinut prin
fermentaţie bacteriană. Se utilizează împotriva drojdiilor şi fungilor, cât şi împotriva
degradărilor provocate de unele microorganisme. Datorită mirosului său puternic, se
foloseşte într-o gamă restrânsă de produse (pâine feliată preambalată şi pîine de secară).

Aspergillus niger este folosită în întreaga lume în producția industrială de acid citric. Cu
toate acestea, în condiții specifice de cultivare, tulpinile producătoare de acid citric de A.
niger acumulează acid oxalic ca produs secundar.

Acidul gluconic oferă un gust acru revigorant multor alimente precum vinul, sucurile de
fructe etc.

Acidul butiric se găsește în unele grăsimi în mici cantități, cum ar

fi untul, laptele de capră și oaie, sau parmezanul și este un produs final
al fermentației anaerobe. Are un miros neplăcut și un gust acru.

Metoda modificării pH-ului mediului

Principiul metodei: adăugarea în mediul de cultură a unei cantităţi de glucid

(* substanță organică naturală care conține carbon, hidrogen și oxigen, reprezentând un
constituent fundamental al materiei vii și având un rol important în metabolism; hidrat
de carbon, carbohidrat) în concentraţie de 0,5-1 % şi un indicator pH. Metabolizarea
glucidului va determina acidifierea mediului, care va fi înregistrată prin virajul
indicatorului pH, acidifierea putând fi sau nu însoţită de producerea de gaz.

Soluţii indicator utilizate:

roşu fenol: 0,01 g în 100 ml apă distilată

la pH = 6,4 indicatorul are culoare galbenă

la pH = 8,2 indicatorul are culoare roşie

roşu de bromcrezol: 0,0025 g în 100 ml apă distilată

la pH = 5,2 indicatorul are culoare galbenă

la pH = 6,8 indicatorul are culoare roşu închis

albastru de bromtimol: 0,0025 g în 10 ml apă distilată

14
la pH = 6,0 indicatorul are culoare galbenă

la pH = 7,0 indicatorul are culoare verde

la pH = 7,6 indicatorul are culoare albastră

turnesolul se utilizează pentru mediile albe şi pentru cele opace

După însămânţare, culturile se incubează la 37˚C notându-se zilnic

modificările de culoare ce apar în mediul de cultură.

Determinarea producerii de gaz

Fermentarea glucidelor, specifică multor specii de levuri şi unor specii

bacteriene , este de cele mai multe ori însoţită de producerea de dioxid de carbon.

Principiul metodei: captarea dioxidului de carbon în tuburi de fermentaţie

(tuburi Durham).

Tehnica de lucru:

în eprubete prevăzute cu dop de vată sau de cauciuc se introduc în poziţie

răsturnată tuburile de fermentaţie (tuburi Durham);

se distribuie mediul de cultură în eprubete şi se sterilizează prin autoclavare;

după răcirea mediului, se însămânţează suspensia microbiană cu ansa astfel încât

germenii să ajungă la baza tubului de fermentaţie;

se incubează la temperatura optimă de dezvoltare a germenilor (25˚C pentru

levuri şi 37˚C pentru bacterii).

Este foarte important ca pentru realizarea acestui test, să fie respectate

următoarele condiţii:

să se utilizeze la însămânţare celule dezvoltate pe mediu solid care pot fi

uşor depuse la baza tubului de fermentare

înainte de însămânţare tubul de fermentaţie trebuie să fie plin cu lichid

Interpretarea rezultatelor:

în cazul în care reacţia este pozitivă (tulpina a fermentat glucidele), în

tubul de fermentaţie se acumulează gaz astfel încât tubul se poate ridica în
mediul lichid la diferite înălţimi
14
în cazul unei reacţii negative, în tubul de fermentaţie nu se acumulează
gaz

Metoda microcomprimatelor cu zaharuri şi alcooli

Principiul metodei: modificarea culorii mediului datorită modificării
pH-ului în urma fermentării glucidelor.

Metoda se poate aplica atât în cazul mediilor solide cât şi în cazul mediilor
lichide şi constă în utilizarea unor comprimate rotunde cu diametrul de 5 mm,
microcomprimate care conţin anumite cantităţi de zaharuri sau alcooli.

Microcomprimatele vor fi marcate pe ambele feţe cu simbolul zahărului

sau alcoolului ce îl conţin (ex. arabinoză, aesculină, glucoză, rafinoză,
trehaloză).

Cantitatea de zahăr este de regulă de 0,006 g/microcomprimat.

Materiale necesare:

mediu de cultură: geloza nutritivă;

microcomprimate imbibate în zaharuri sau alcool;

soluţii indicator de pH:

- turnesol (10 g colorant în 90 ml apă distilată);

- albastru de brom timol (1g colorant, 475ml apă distilată şi 25ml NaOH);

cultura microbiană;

anse, pipete Pasteur.

Tehnica de lucru:

pentru mediile lichide: după însămânţare se adaugă în fiecare tub câte un

microcomprimat ce conţine zahărul testat;

pentru mediile solide se pot practica două tehnici:

însămânţarea germenilor la suprafaţa mediului şi dispunerea echidistantă a

microcomprimatelor pe mediu, cu ajutorul unei pense sterile;

însămânţarea germenilor în godeuri realizate în mediu şi depunerea

microcomprimatelor tot în godeuri.14

În ambele cazuri, după însămânţare, plăcile se incubează timp de 30

minute la 37˚C şi apoi se depun microcomprimatele. Incubarea se realizează în
acest caz cu capacul plăcii în sus.
Interpretarea testului:

în cazul în care zaharurile au fost metabolizate, datorită modificării de pH

are loc modificarea culorii mediului în jurul microcomprimatelor;

reacţia negativă (zaharurile nu au fost fermentate), culoarea mediului

rămâne neschimbată în jurul microcomprimatelor.

Determinarea hidrolizei amidonului

Principiul metodei: unele microorganisme produc anumite enzime numite

amilaze care hidrolizează (descompun) amidonul, cu producerea în mod obişnuit de
maltoză (substanță zaharoasă formată din două molecule de glucoză; zahăr de malț).
Anumite bacterii (Bacillus subtilis, Clostridium acetobutirycum) hidrolizează
amidonul cu producere de glucoză.

Tehnica de lucru:

mediul nutritiv ce conţine amidon şi agar se sterilizează prin autoclavare şi se

repartizează în plăci Petri;

se însămânţează tulpina ce trebuie testată şi o tulpină martor care nu

hidrolizează amidonul;

se incubează la temperatura de 28˚C timp de 48 ore;

pentru evaluarea testului se acoperă mediul cu soluţie Lugol, 5-10 ml/placă.

Interpretarea testului:

reacţia pozitivă (amidonul este hidrolizat) este indicată de apariţia unor

zone clare, necolorate în jurul coloniilor;

reacţia negativă este indicată de culoarea albastră a mediului;

în cazul unei hidrolize parţiale a amidonului (numai până la dextrine), în

jurul coloniilor apar zone brun roşietice.

Determinarea producerii de acetil-metil-carbinol (Testul

Voges-Proskauer)
14
Reacţia Voges-Proskauer pune în evidenţă capacitatea unor
microorganisme de a produce, prin fermentarea glucozei (substanța organică
cea mai răspîndită din natură, fiind materia de bază a celulozei și a amidonului
și care, în stare pură, este cristalină, dulce, solubilă în apă),
acetil-metil-carbinol, care în prezenţa alcalilor este oxidat la diacetil. Diacetilul
se combină cu arginina (aminoacid), creatina sau creatinina (substanţe
proteice) din mediu determinând apariţia unei coloraţii roşii.

Pentru realizarea acestui test sunt necesare următoarele:

mediul de cultură bulion-glucoză-fosfat

cultura bacteriană de testat

culturi martor: Bacillus subtilis, Bacillus cereus şi Klebsiella pneumonie

ca tulpini care dau reacţie pozitivă şi Escherichia coli ca tulpină ce dă
reacţie negativă

α -naftol (6 g în 100 ml alcool etilic 96˚)

KOH (16 g în 100 ml apă distilată)

pipete gradate de 1 ml, sterilizate

tuburi de hemoliză sterile

Tehnica de lucru:

se repartizează câte 5 ml mediu de cultură în tuburi şi se sterilizează

prin autoclavare

din culturile dezvoltate în 5 ml mediu se transferă 1 ml de cultură în

tubul de hemoliză la care se adaugă apoi 0,5 ml soluţie α -naftol 6% şi
0,5 ml KOH 16%

se agită bine tubul şi se lasă în repaus timp de 5 minute.

Interpretarea rezultatelor:

în cazul unei reacţii pozitive, după 5 minute, mediul se colorează în

roşu;

în cazul unei reacţii negative, culoarea mediului rămâne neschimbată.

Procedeul descris permite detectarea unei cantităţi foarte mici (1 ppm) de

acetil-metil-carbinol. 14

Studiul metabolizării proteinelor

Evidenţierea lichefierii gelatinei

Unele microorganisme au capacitatea de a hidroliza (descompunere a unor săruri)
gelatina sub acţiunea unor enzime proteolitice specifice (gelatinaze) care au activitate
maximă în faza de creştere exponenţială a microorganismelor.

Etapele de lucru sunt următoarele:

se dizolvă gelatina la cald şi se reaprtizează în tuburi;

se însămânţează mediul prin înţepare cu firul drept, păstrând un tub neînsămânţat ca

martor;

se incubează la 28˚C, pentru 2-14 zile.

Interpretarea rezultatelor: în cazul unei reacţii pozitive, se observă lichefierea

gelatinei. Controlul reacţiei de lichefiere se face prin menţinerea tubului cu gelatină
lichefiată sub jet de apă rece. Dacă mediul solidifică la temperaturi scăzute, reacţia este
negativă. În cazul unei reacţii pozitive, prin răcirea tubului, gelatina rămâne nelichefiată.

Evidenţierea producerii de indol

Anumite microorganisme degradează triptofanul cu producere de indol.

Materiale utilizate:

mediu de cultură selectiv ;

culturi ale microorganismelor ce se testează

culturi martor de: Escherichia coli, Proteus vulgaris care dau reacţie pozitivă şi
Agrobacterium tumefaciens, Bacillus thuringiensis care dau reacţie negativă

xilol

reactiv Erlich Böhme

tuburi de hemoliză, sterile

pipete gradate de 1 ml, sterile

pipete Pasteur
14
Tehnica de lucru:

mediul de cultură se repartizează în cantitate de 5 ml în eprubete şi se sterilizează prin

autoclavare
se însămânţează suspensiile şi se incubează la 37˚C

din cultura dezvoltată în mediu lichid se transferă 1 ml într-un tub de hemoliză steril

se adaugă două picături de xilol

se agită bine tubul de hemoliză

se adaugă în tubul de hemoliză câteva picături de reactiv Ehrlich-Böhme, fără a agita

tubul

Interpretarea rezultatelor:

reacţie pozitivă: prezenţa unui inel roşu

reacţie negativă: nu apare inel colorat

Indolul produs se acumulează la suprafaţa mediului datorită xilolului adăugat.

Determinarea producerii de hidrogen sulfurat

Principiul metodei: anumite specii bacteriene produc H₂S în urma reducerii unor
compuşi anorganici cu sulf (ex.sulfiţi, sulfaţi) sau prin descompunerea compuşilor organici
cu sulf cum ar fi cistina, cisteina, metionina sau glutationul (aminoacizi).

Materiale utilizate:

mediu de cultură selectiv

culturi ale germenilor de testat

culturi de Escherichia coli, Proteus vulgaris

Tehnica de lucru:

mediul de cultură se repartizează câte 10 ml în tuburi şi se sterilizează prin

autoclavare

se însămânţează suspensia bacteriană, lăsând ca martori tuburi neînsămânţate

se incubează la 1-2 zile la 37˚C 14

Interpretarea rezultatelor:

reacţie pozitivă: mediul de cultură se înnegreşte ca urmare a formării sulfurii de fier

reacţie negativă: culoarea mediului rămâne neschimbată

Determinarea producerii de H₂S în mediu cu clorură feroasă şi gelatină

Principiul metodei: producerea de H₂S înnegreşte mediul nutritiv datorită formării

sulfurii de fier prin reacţia dintre H₂S şi FeCl₂.

Materiale utilizate:

mediu de cultură selectiv

cultura microbiană ce se testează

ansa

Tehnica de lucru:

se dizolvă ingredientele în apă, cu excepţia clorurii feroase

se sterilizează mediul prin autoclavare

înainte de distribuire, în mediu se adaugă clorura feroasă, sterilizată prin filtrare

se repartizează mediul de cultură în tuburi şi se solidifică drept

însămânţarea se face prin înţepare

incubarea se face la 20˚C, timp de 10-15 zile

Interpretarea rezultatelor:

reacţie pozitivă: înnegrirea mediului de cultură

reacţie negativă: mediul rămâne neschimbat la culoare

Prin acest test se indică şi hidroliza gelatinei (acţiunea proteolitică a bacteriilor asupra
gelatinei).

Evidenţierea activităţii dezaminazelor

15
Determinarea producerii de amoniac

Principiul metodei: unele microorganisme au capacitatea de a produce amoniac prin

dezaminarea (eliminarea) aminoacizilor rezultaţi din descompunerea substanţelor proteice
din mediu.
Materiale utilizate:

mediu de cultură selectiv

culturi de Agrobacterium tumefaciens

martorul este reprezentat de un tub cu mediu neînsămânţat

reactivul Nessler

plăci Petri cu godeuri

pipete gradate de 1 ml, sterilizate

anse

Tehnica de lucru:

se repartizează mediu de cultură în cantitate de 7 ml în tuburi şi se sterilizează prin

autoclavare

se însămânţează tulpinile testate

incubarea se realizează la 28˚C, timp de 2-7 zile

se testează periodic capacitatea de producere a amoniacului prin amestecarea în

godeurile plăcii a unor cantităţi egale de suspensie microbiană şi reactiv Nessler.

Interpretarea rezultatelor:

reacţie pozitivă: apariţia unei coloraţii portocalii cu tendinţă de brunificare, datorită

prezenţei amoniacului

reacţie negativă: culoare galben pal sau absentă în urma amestecării reactivului şi a
suspensiei

Testul decarboxilazei

Principiul metodei: unele microorganisme pot produce decarboxilarea (eliminarea CO2 din
acizi organici) aminoacizilor prezenţi în mediu astfel încât mediul devine alcalin. Modificarea
15 soluţie indicator.
pH-ului mediului este evidenţiată cu

Materiale utilizate:

mediul de cultură selectiv

aminoacizii care se testează: lizină, arginină, ornitină 5 %

culturi de bacterii din grupul Enterobacteriaceaelor (ex. Klebsiella, Enterobacter,

Citrobacter, Salmonella)

Tehnica de lucru:

mediu lichid se repartizează în tuburi;

în jumătate dintre tuburile cu mediu se adaugă aminoacizii care trebuiesc testaţi;

însămânţarea se realizează în câte două tuburi (unul cu aminoacid şi altul fără aminoacid);

incubarea se realizează timp de 4 zile la 37˚C, examinările fiind realizate zilnic.

Interpretarea rezultatelor:

reacţie pozitivă: mediul capătă o culoare purpurie ca urmare a decarboxilării

aminoacizilor şi a alcalinizării mediului de cultură

reacţie negativă: mediul se acidifică în urma fermentării glucozei, culoarea sa

devenind galbenă.

Studiul metabolizării lipidelor

Pentru a evidenţia acţiunea microorganismelor asupra lipidelor prezente în mediul de

cultură, se utilizează medii bogate în lipide şi coloranţi care pun în evidenţă fie clarifierea
fie opacizarea zonei din jurul coloniilor dezvoltate de microorganisme.

Evidenţierea hidrolizei lipidelor prin tehnica coloraţiei cu albastru Victoria

Materiale utilizate:

mediu de cultură selectiv

grăsimi din unt sau margarină

soluţie saturată de CuSO4

albastru Victoria
15
culturi de microorganisme (bacterii, ciuperci)

Tehnica de lucru:
la 1 ml mediu de bază se adaugă 0,06 g albastru Victoria, mediul de cultură
colorându-se în mov

se emulsionează lipidele în mediu de bază prin agitare energică şi se repartizează

apoi în plăci Petri

se însămânţează germenii într-un striu sau în striuri distanţate

incubarea se realizează timp de 2-14 zile la temperaturi diferite în funcţie de germenul

însămânţat

după dezvoltarea coloniilor se acoperă mediul cu 8-10 ml soluţie CuSO4, care se

menţine 10 -15 minute

se spală plăcile cu mediu şi colonii cu apă de robinet

Interpretarea rezultatelor:

reacţie pozitivă: în jurul coloniilor apar zone colorate în albastru intens (zonele de
lipoliză)

reacţie negativă: mediul de cultură are aceeaşi culoare cu cea iniţială

Evidenţierea hidrolizei compuşilor Tween

Compuşii Tween sunt esteri ai acizilor graşi. Cel mai frecvent utilizat ca agent de
dispersie celulară este compusul Tween 80 (ester al acidului oleic : acid gras omega-9).

Materiale utilizate:

mediu nutritiv

culturi ale germenilor de testat

Ansă

Tehnica de lucru:

se sterilizează mediul de cultură prin autoclavare şi se repartizează în plăci Petri;

15
se însămânţează germenii ce trebuiesc testaţi într-un striu unic sau în striuri distanţate;

se incubează la temperatura optimă de dezvoltare a germenilor pentru 1-7 zile.

Interpretarea rezultatelor:

reacţie pozitivă: prin hidroliza compuşilor Tween 80, în jurul coloniilor apar zone
opace datorită formării sărurilor de Ca ale acizilor graşi eliberaţi;

reacţie negativă: nu apar zone opace în jurul coloniilor.

Determinarea activităţii reductazelor

Sub acţiunea reductazelor (dehidrogenaze) microbiene, anumiţi coloranţi sunt reduşi,

decolorându-se sau schimbându-şi culoarea. Intensitatea activităţii reductazelor se
apreciază în funcţie de gradul decolorării şi de rapiditatea cu care se produce.

Testul se aplică numai microorganismelor anaerobe, facultativ anaerobe şi

microaerofile.

Reducerea coloranţilor

Reducerea albastrului de metilen

Materiale utilizate:

mediu nutritiv selectiv;

soluţie albastru de metilen (0,1 g în 100 ml apă distilată);

culturile ale microorganismelor ce se testează;

culturile martor de Agrobacterium tumefaciens pentru reacţia pozitivă a testului.

Tehnica de lucru:

se dizolvă toate ingredientele mediului în apă distilată;

se adaugă în mediu soluţia de albastru de metilen astfel încât să se realizeze o

concentraţie finală de 1:10 000;

mediul astfel pregătit se repartizează în tuburi de hemoliză, câte 2 ml/tub şi se

sterilizează prin autoclavare; 15

după răcire, mediul se însămânţează şi se incubează la temperatura optimă de

dezvoltare a germenului testat;

tuburile martor vor fi neînsămânţate;

examinarea testului se face zilnic.

Interpretarea rezultatelor:

reacţie pozitivă: mediu de cultură se decolorează

reacţie negativă: nu se produc modificări ale culorii mediului

Reducerea roşului neutru

Materiale utilizate:

mediul nutritiv este acelaşi cu cel utilizat la reducerea albastrului de metilen;

cultura microbiană ce se testează;

cultură martor pentru reacţia pozitivă: Agrobacterium tumefaciens;

mediu neînsămânţat pentru evidenţierea reacţiei negative;

roşu neutru 2 g în 100 ml apă distilată.

Tehnica de lucru:

mediul nutritiv se repartizează în tuburi de hemoliză, câte 5 ml/tub şi se sterilizează

prin autoclavare;

se însămânţează suspensia bacteriană;

incubarea se realizează timp de 24-48 ore la temperatura optimă de dezvoltare a

germenilor microbieni;

pentru evaluarea testului se adaugă 1-2 picături soluţie roşu neutru 2% şi se incubează
încă 24-48 ore.

Interpretarea rezultatelor:

reacţie pozitivă: culoarea galbenă a mediului

15
reacţie negativă: culoarea roşie a mediului

Reducerea nitraţilor (metoda Griess –Ilosvay)

Principiul metodei: unele microorganisme au capacitatea de a reduce nitraţii (NO3-)

din mediu la nitriţi (NO2-), sau uneori până la azot molecular.
Materiale utilizate:

mediu de cultură selectiv;

culturi ale microorganismelor ce se testează;

culturi martor care dau reacţie pozitivă: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus
cereus şi Pseudomonas aeruginosa;

culturi martor care dau reacţie negativă: Bacillus megatherium;

reactivul Ilosvay - Griess I;

reactivul Ilosvay - Griess II;

pipete gradate de 1 ml.

Tehnica de lucru:

în eprubete se introduc tuburi de fermentaţie (Durham) şi se distribuie câte 7 ml

mediu nutritiv;

se sterilizează mediul prin autoclavare;

se însămânţează pe mediul cu nitraţi suspensia microbiană a germenilor ce urmează a

fi testaţi;

incubarea se face la 37˚C;

testarea reducerii nitraţilor se realizează după 24, 48, 72 ore şi 8 zile de la

însămânţare, prin adăugarea în mediul de cultură a câte 1 ml din cei doi reactivi.

Interpretarea rezultatelor:

reacţie pozitivă: după adăugarea reactivilor în

mediul de cultură are loc virarea culorii mediului în
roşu - purpuriu până la maron;

reacţia negativă: nu apar modificări de culoare ale

mediului de cultură; 15

acumularea gazului în tuburile de fermentaţie indică

reducerea nitraţilor şi a nitriţilor până la azotul
molecular.
Determinarea activităţii catalazice a microorganismelor

Catalaza are proprietatea de a descompune apa oxigenată (H2O2) cu eliberare de

oxigen. Acţiunea acestei enzime se poate pune în evidenţă direct, în culturi de
microorganisme strict sau facultativ aerobe.

Materiale utilizate:

mediu de cultură nutritiv;

culturi martor care dau reacţie pozitivă: Staphylococcus aureus şi Saccharomyces

cerevisiae;

culturi martor care dau reacţie negativă: Clostridium pasteurianum (strict anaerobă);

culturi ale germenilor de testat;

apă oxigenată;

tuburi de hemoliză, pipete gradate de 2 ml, pipete Pasteur, ansă.

Tehnica de lucru:

culturile martor şi test se însămânţează pe mediu solid şi se incubează la temperatura

optimă de dezvoltare;

după ce s-au dezvoltat coloniile, în tuburi de hemoliză se repartizează 1-2 ml soluţie

salină în care se suspendă colonii microbiene cu ajutorul ansei;

se adaugă apă oxigenată, fără a agita tubul de hemoliză.

În cazul culturilor de Saccharomyces cerevisiae se poate adăuga apa oxigenată direct

pe coloniile dezvoltate pe mediu solid.

Interpretarea rezultatelor:

reacţie pozitivă: apariţia bulelor de gaz (efervescenţa) în tuburile de hemoliză sau la

suprafaţa coloniilor de levuri;

reacţie negativă: nu apar bule de gaz în tuburile de hemoliză sau efervescenţă la

suprafaţa coloniilor. 15

Determinarea proprietăţilor hemolitice ale microorganismelor

Numeroase microorganisme au proprietatea de a liza (distruge) hematiile diferitelor

specii de animale.
Principiul metodei: sub acţiunea hemolizinelor eliberate de unele microorganisme,
hematiile (globulele roşii) încorporate într-un mediu nutritiv solidificat sunt lizate şi în
jurul coloniilor respective apare o zonă cu aspect clar.

Materiale utilizate:

mediu nutritiv geloză - sânge;

suspensia microbiană ce se testează.

Tehnica de lucru:

însămânţarea germenilor pe suprafaţa mediului de cultură astfel încât să se obţină

colonii izolate;

incubarea la 37˚C;

examinarea la interval de 24 ore.

Interpretarea rezultatelor:

reacţie pozitivă: în jurul coloniilor apare o zonă clară (mediul de cultură nu mai are
culoare roşie) ceea ce denotă o hemoliză totală. Dacă apare o coloraţie verzuie în jurul
coloniei, se notează hemoliza parţială.

reacţie negativă: în jurul coloniilor mediul de cultură are culoare roşie, asemănătoare
cu cea iniţială.

Determinarea prezenţei şi activităţii coagulazei

Microorganismele care au în echipamentul enzimatic coagulaza, au proprietatea de a

produce coagularea plasmei sanguine.

Tehnica de evidenţiere a activităţii coagulazei în tuburi

Materiale utilizate:

culturi de Staphylococus aureus în mediul bulion nutritiv;

15 patru părţi apă distilată;

plasmă sanguină (umană) diluată cu

tuburi de hemoliză sterile;

pipete gradate de 1 ml, sterile.

Tehnica de lucru:

în două tuburi de hemoliză se introduc 0,5 ml plasmă diluată;

în tubul de reacţie se adaugă 0,5 ml suspensie microbiană;

în tubul martor nu se adaugă suspensie microbiană;

incubarea se realizează la temperatura de 37˚C timp de o oră.

Interpretarea rezultatelor:

reacţie pozitivă: coagularea plasmei în 1- 4 ore;

reacţie negativă: mediul rămâne în stare lichidă.

În ultimul timp, pentru a reduce tot mai mult volumul de teste laborioase ce se
impun pentru identificarea unui microorganism, au fost concepute KIT-uri de identificare
(KIT-ul este definit ca un set de teste miniaturizate şi standardizate).

Cele mai utilizate sisteme multitest de identificare rapidă sunt: sistemul API 20C şi
API 20E pentru fungi, sistemul API Staph-Ident pentru identificarea stafilococilor,
sistemele Enterotest IC şi Enterotube II pentru identificarea bacteriilor din grupa
Enterobacteriaceaelor, sistemul Biolog pentru bacterii Gram-negative, sistemul
Oxi/Ferm Tube pentru bacteriile Gram-negative şi oxidazo-pozitive.

Sistemele multitest se livrează cu instrucţiuni care cuprind şi tehnica de lucru.

Avantajele utilizării sistemelor multitest sunt următoarele:

obţinerea unor rezultate rapide şi uniforme;

precizia rezultatelor;

simplitatea metodelor;

consum minim de medii de cultură şi reactivi.

Toate testele de identificare au drept scop caracterizarea morfologică, fiziologică şi

biochimică a microorganismului studiat. Rezultatele acestor teste se compară cu
15
rezultatele standard descrise în determinatoare.

Se încadrează astfel taxonomic microorganismul identificat. În cazul unor

microorganisme nou identificate, rezultatele testelor descrise anterior se completează cu
testul ADN obţinut prin metode electroforetice. Se poate stabili astfel dacă
microorganismul este rezultatul unei mutaţii.
Determinarea numărului de microorganisme dintr-o probă se
poate realiza prin mai multe metode care pot viza stabilirea
numărului total de germeni (NTG) ce încadrează germenii
viabili şi neviabili sau numai a germenilor viabili.

Pentru determinarea NTG se practică următoarele metode:

metoda camerei de numărat

metoda nefelometrică

metoda examenului microscopic al membranei filtrante

Germenii viabili se pot determina prin următoarele metode:

metoda unităţilor formatoare de colonii (UFC)

metoda diluţiilor seriale sau zecimale

metoda diluţiilor multiple

metoda titrului

metoda membranei filtrante

1. Determinarea numărului total de celule cu ajutorul

camerei de numărat

Metoda se bazează pe distribuirea celulelor de microorganisme într-o reţea cu o

suprafaţă cunoscută.

Camerele de numărat sunt lame speciale de sticlă care prezintă în partea centrală
un cadrilaj (reţea) sub formă de pătrat, format din mai multe pătrăţele.

Latura reţelei de pe care se face numărarea germenilor este de 1 mm, suprafaţa

reţelei fiind de 1 mm².

Reţeaua camerei de numărat este formată din 400 pătrăţele (microcelule),

suprafaţa unui pătrăţel este de 0,0025 mm².

16 în 16 pătrate separate prin câte o linie

Cele 400 microcelule sunt organizate
despărţitoare ce împarte fiecare al cincilea pătrăţel.

Volumul probei din care se face numărarea germenilor este de 0,1 mm³, înălţimea
stratului de lichid dintre cameră şi lamelă este de 0,1 mm, ceea ce corespunde cu un volum
de 0,00025 mmᶟ.
Există mai multe tipuri de camere de numărat, cele mai utilizate fiind
camera Thoma şi camera Türk care se deosebesc între ele prin aceea că la
camera de numărat Thoma se pot vizualiza la microscop 256 pătrăţele şi liniile
despărţitoare dintre acestea. În câmpul optic se observă 16 pătrate, citirile
fiind făcute din cinci pătrate, fiecare cu câte 16 pătrăţele (80 pătrăţele).

În cazul camerei Türk se vizualizează patru pătrate cu câte 16 pătrăţele.

În câmpul optic se observă câte un pătrăţel, citirile fiind făcute din 16
pătrăţele.

Indiferent de tipul constructiv, la toate camerele de numărat se respectă

un anumit sens de citire al pătrăţelelor şi de numărare a celulelor din interiorul
pătrăţelelor.

În interiorul unui pătrăţel se numără toate celulele aflate între cele patru
laturi şi celulele aflate pe latura de sus şi din dreapta, fără a număra celulele
aflate pe latura de jos şi din stânga.

Sensul citirii pătrăţelelor şi numărarea celulelor

Tehnica de lucru:

se curăţă bine camera de numărat şi lamela microscopică;

se pipetează cu pipeta Pasteur câteva picături pe suprafaţa reţelei camerei

de numărat şi se acoperă cu lamela;

se lasă în repaus timp de 3 minute pentru probele în care se fac numărări

de drojdii şi aproximativ 15 minute pentru bacterii;

se examinează la microscop cu obiectivul 20x sau 40x;

în cazul celulelor aflate pe laturile pătrăţelului, se vor număra numai cele

care trec cu mai mult de jumătate în interiorul pătrăţelului;

atunci când în interiorul pătrăţelelor sunt mai mult de 16 celule, se face

diluţia cu acid sulfuric, în părţi egale.

Numărul de celule prezente într-un mililitru probă se află cu ajutorul următoarelor formule:
16
- pentru camera de numărat Thoma

X cel/ml = (a x 4.000.000 x c)/b

în care : a - numărul de celule din cele 80 pătrăţele;

c - factorul de diluţie;

b - numărul de pătrăţele din care s-a făcut numărarea;

4.000.000 - coeficient pentru volumul pătrăţelelor şi pentru transformarea în cm³

pentru camera Türk

X cel/ml = a x 4.000 x 1000 x c

în care : a - media numărului de celule/ pătrăţel

c - factorul de diluţie;

1000 - factor de transformare în cm³

4.000 - coeficient pentru volumul pătrăţelelor

Dezavantajele metodei de evaluare a numărului de microorganisme cu

ajutorul camerei de numărat sunt următoarele:

- nu permite separarea germenilor viabili de cei neviabili;

- nu permite evaluarea bacteriilor de dimensiuni foarte mici sau a celor

mobile;

- atunci când bacteriile sunt înlănţuite (ex. streptococ, stafilococ) trebuie

să se numere celulele care formează grupările respective;

- prezintă un grad mare de eroare.

2. Metoda nefelometrică

O cultură microbiană acţionează ca o suspensie coloidală care blochează şi

reflectă lumina ce o străbate. Între anumite limite, lumina absorbită sau
reflectată de către o suspensie bacteriană este proporţională cu concentraţia de
celule din cultură.

Nefelometria constă în măsurarea reflecţiei de către celulele microbiene a

16
razelor luminoase, în timp ce turbidimetria constă în măsurarea procentului de
lumină absorbită de către celulele microbiene.

Rezultatele se exprimă sub formă de densitate optică (D.O.), procente de

transmitanţă (T%) sau concentraţie. În mod obişnuit, gradul de turbiditate al
unei probe se determină la o densitate optică cuprinsă între 400 şi 600 nm.
Aprecierea numărului de microorganisme dintr-o suspensie se mai poate
face şi pe baza unei curbe etalon, realizată cu suspensii cu număr cunoscut de
celule microbiene sau pulberi inerte, cărora li se determină spectrofotometric
densitatea optică.

În practica de laborator se prepară etaloane nefelometrice din BaCl₂ şi

H₂SO4, stabile un an de zile.

O întrebuinţare largă în numărarea germenilor prin metoda

nefelometrică o au scările nefelometrice Brown şi Mc Farland.

Prepararea scării Brown

Scara Brown este constituită dintr-o serie de tuburi conţinând suspensii de turbidităţi
diferite, care prin comparaţie permit stabilirea aproximativă a concentraţiei în germeni a unei
suspensii microbiene.

Tehnica de lucru:

- se aleg 10 tuburi de sticlă cu acelaşi diametru (7-10 mm);

- se prepară o soluţie 1 % BaCl₂ şi se pune în fiecare tub câte o cantitate crescândă, de la

0,1 la 1 ml (0,1; 0,2; 0,3.........1,0 ml);

- se prepară o soluţie de H₂SO4 1% şi se completează în fiecare tub până la 10 ml;

- se astupă tuburile cu dopuri de cauciuc sau se închid la flacără.

În tuburi se va forma un precipitat alb de sulfat de bariu care corespunde unei turbidităţi
egale cu:

tubul 1 = 300.000.000 germeni (3 x 108 celule/cm³)

tubul 2 = 600.000.000 germeni (6 x 108 celule/cm³)

tubul 3 = 900.000.000 germeni (9 x 108 celule/cm³)

Scara Mc Farland se prepară în mod asemănător, deosebirea constând în

16 H₂SO4 şi BaCl₂.
faptul că se utilizează 100 ml amestec

Metoda nefelometrică se poate aplica numai în cazul drojdiilor şi bacteriilor

care prezintă o creştere omogenă (tulbură uniform mediul de cultură). În cazul
mucegaiurilor, metoda nu se poate aplica, datorită creşterii acestora exclusiv la
suprafaţa mediilor lichide unde întâlnesc condiţii suficiente de aerare.
În tabel se prezintă modul de preparare a soluţiilor necesare scării Mc Farland.

Turbiditate

ccrespunzătoare
la nr. bacterii/ml

3. Metoda numărării germenilor prin examinarea microscopică pe

membrane filtrante

Această metodă implică utilizarea dispozitivelor de filtrare prevăzute cu pompe de

vid şi a membranelor filtrante cu porozitate cunoscută.

Dacă nu sunt ambalate steril, membranele se vor steriliza prin fierbere. Înainte de
filtrarea probei, pe faţa lucioasă a membranei se picură formol 35%.

Tehnica de lucru:

se filtrează un volum cunoscut de probă;

se opreşte pompa şi peste membrana filtrantă se adaugă soluţie colorantă (albastru

de metilen) astfel încât membrana să fie complet acoperită;

se lasă colorantul să acţioneze timp de cinci minute;

se porneşte pompa şi se filtrează prin membrană soluţia colorantă;

se spală bine membrana cu apă distilată până când filtratul este complet
necolorat;

membrana se ia cu o pensă, se usucă şi se saturează în ulei de imersie (se cufundă

membrana într-o placă Petri cu ulei de imersie) pentru a realiza transparenţa
acesteia;

se aşează membrana pe lama microscopică şi se examinează cu obiectivul de

imersie.
16
Se recomandă ca soluţia colorantă să se filtreze prin hârtia de filtru înainte de
utilizare.

Rezultatele se exprimă ca număr celule microbiene raportate la volumul de probă

filtrată. Prin colorarea cu albastru de metilen se pot diferenţia germenii viabili de cei
neviabili.

METODE DE DETERMINARE A NUMĂRULUI

GERMENILOR VIABILI

1. Metoda unităţilor formatoare de colonii (UFC)

Este o metodă indirectă de determinare a numărului de germeni (nu studiază

germenii în starea lor naturală, ci descendenţii acestor germeni - coloniile) şi se bazează
pe însămânţarea unui volum cunoscut de probă într-un mediu de cultură.

Stabilind unităţile formatoare de colonii, se poate spune care este numărul

germenilor viabili, pornind de la premisa că o colonie este rezultatul multiplicării unui
singur germen.

Metoda UFC se poate aplica atât în cazul unor probe omogene cât şi în cazul
probelor heterogene.

Principiul metodei: celulele viabile prezente într-o probă formează prin

însămânţarea pe suprafaţa mediilor solide, colonii caracteristice.

Atunci când numărul de germeni este foarte mare, pe suprafaţa mediului se vor
dezvolta foarte multe colonii astfel încât nu pot fi numărate. În acest caz, proba se diluează
prin metoda diluţiilor zecimale ce constă în următoarele:

se pregătesc eprubete cu apă distilată sterilizată, în volum de 9 ml, în fiecare eprubetă;

se omogenizează proba şi se prelevează steril 1 ml probă;

se pipetează proba peste cei 9 ml din prima eprubetă şi se obţine astfel diluţia 1:10 sau
10-1;

se recoltează steril 1 ml din prima eprubetă şi se pipetează peste cei 9 ml din eprubeta
a doua obţinând astfel diluţia 1:100 sau 10-2;

Se consideră diluţie optimă acea diluţie care permite dezvoltarea unui

număr redus de colonii astfel încât acestea să poată fi numărate uşor pe
suprafaţa plăcii Petri.

16
- pentru stabilirea UFC, se fac însămânţări din trei diluţii succesive în câte
trei plăci Petri;

- metoda de însămănţare este tip gazon;

- se însămânţează 0,1 ml suspensie;

- se incubează plăcile pentru 24-48 ore;

- se numără coloniile dezvoltate pe suprafaţa celor trei plăci şi se stabileşte

media coloniilor dezvoltate din aceeaşi diluţie;

- numărul germenilor viabili, exprimat sub formă de unităţi formatoare de colonii, se

calculează cu ajutorul formulei:

UFC = m*c*10

în care :

m - media aritmetică a coloniilor numărate pe cele trei plăci însămânţate din aceeaşi
diluţie;

c - inversul diluţiei din care s-a făcut însămânţarea;

10 - coeficient de raportare a rezultatelor la 1 ml probă

Metoda UFC se practică şi în cazul recoltării probelor prin sedimentare (ex.microflora

aerului), raportarea fiind făcută ca număr germeni viabili sedimentaţi dintr-un m3 aer.

Pentru sedimentarea germenilor, se menţin plăcile deschise timp de 5-10 minute după
care se acoperă şi se incubează la temperatura optimă de dezvoltare a germenilor, pentru
24-48 ore.

Se numără unităţile formatoare de colonii de pe fiecare placă şi se stabileşte numărul

de germeni prezenţi într-un m3 aer cu ajutorul formulei:

în care:

n - numărul de colonii dezvoltate pe suprafaţa mediului

S - suprafaţa plăcii Petri

T - timpul de expunere

16 determinarea UFC
2. Metoda membranei filtrante pentru

Principiul metodei: concentrarea microorganismelor dintr-un volum mare de probă pe

suprafaţa unui filtru membrană şi punerea în contact a acestuia cu mediul de cultură solid.

Tehnica de lucru:
-în aparatul de filtrare se introduce un filtru membrană cu porozitate cunoscută;

-se porneşte pompa de vid şi se filtrează proba;

-atunci când filtrarea este încheiată, se opreşte pompa şi se preia cu o pensă sterilă
membrana filtrantă care se aşează pe suprafaţa mediului de cultură solid distribuit în plăci;

-se incubează plăcile cu capacul în sus, la temperatura optimă pentru germenii

studiaţi.

Rezultatele se exprimă ca unităţi formatoare de colonii raportate la volumul probei

care a fost filtrată. Metoda este indicată în special atunci când numărul de germeni prezenţi
în probă este redus.

3. Metoda titrului

Titrul reprezintă cantitatea minimă de probă în care sunt prezenţi germeni

microbieni.

Principiul metodei: inocularea în medii de cultură lichide selective a unor

cantităţi diferite de probă. În urma dezvoltării germenilor se produc modificări
ale mediului de cultură - turbiditate accentuată, formare de voal sau peliculă,
producere de gaz.

Tehnica de lucru:

- se pregătesc trei serii a câte 3-5 eprubete fiecare;

- atunci când se urmăreşte modificarea compoziţiei mediului prin fermentarea

unor glucide, se distribuie câte un tub de fermentaţie în fiecare eprubetă;

- se distribuie câte 10 ml mediu în fiecare eprubetă şi se sterilizează prin

autoclavare;

- în prima serie de eprubete se adaugă 10 ml probă (se poate utiliza diluţia 10-1
în cazul probelor concentrate);

- în seria a doua de eprubete, peste cei 10 ml mediu se adaugă 1 ml probă sau

din diluţia 10-1; 16

- în seria a treia de eprubete se adaugă 0,1 ml din proba de analizat sau din
diluţia 10-1;

- se incubează eprubetele astfel pregătite la temperatura optimă de dezvoltare a

germenilor studiaţi, pentru 24 - 48 ore.

Interpretarea rezultatelor:

- se notează în câte eprubete din fiecare serie s-au produs modificări ale
mediului de cultură;

- se stabileşte numărul caracteristic pe baza celor trei cifre notate la seriile de

eprubete;

- se stabileşte numărul de germeni pe baza tabelului Mac Cready.

Atunci când probele ce se analizează sunt foarte bogate în germeni microbieni,

se fac diluţii zecimale de până la 10-4 - 10-5 şi din fiecare diluţie se fac însămânţări în
câte trei eprubete.

Se notează apoi, după incubare, în câte eprubete ale seriei s-au produs
modificări. Se vor lua în calcul trei diluţii succesive. Prima diluţie care se ia în calcul
este diluţia în care nu sunt toate eprubetele pozitive (nu s-au produs modificări în
toate eprubetele). Se stabileşte numărul caracteristic pe baza celor trei cifre
caracteristice notate la diluţiile succesive.

Numărul total de germeni se stabileşte tot cu ajutorul tabelului Mac Cready.

Când se fac însămânţări din diluţii, pentru aflarea numărului de germeni se

înmulţeşte numărul caracteristic din tabel cu inversul diluţiei reper (ultima diluţie în
care toate eprubetele au fost pozitive).
PRELEVAREA PROBELOR DE PRODUSE ALIMENTARE
ÎN VEDEREA TESTĂRII MICROBIOLOGICE

1. SCOP
Procedura are ca scop organizarea şi desfăşurarea activităţilor de prelevare, transport şi păstrarea/
depozitarea probelor în cadrul controalelor oficiale în vederea testării microbiologice.

2. DOMENIU DE APLICARE
Procedura se aplică în cadrul controalelor oficiale de către inspectorii desemnaţi ai DSVSA
judeţene/a
municipiului Bucureşti.
Procedura facilitează înţelegerea şi16aplicarea de către inspectorii oficiali ai ANSVSA/DSVSA a
prevederilor legislaţiei specifice domeniului microbiologic, desfăşurarea într-un mod unitar a
prelevării
de probe în cadrul controalelor oficiale şi interpretarea rezultatelor analizelor microbiologice.

3. GENERALITĂŢI
3.1. Definiţii aplicabile
Criteriul de siguranţă a alimentelor – un criteriu care defineste gradul de acceptabilitate al unui
produs sau al unui lot de produse alimentare, aplicabil produselor introduse pe piaţă; (Articolul
2(c) al
Regulamentului (CE) nr. 2073/2005);
Criteriul de igienă a procesului - un criteriu care indică gradul de acceptabilitate al funcţionării
procesului de productie. Un astfel de criteriu nu se aplică produselor introduse pe piaţă. Acesta
stabileste o valoare de referinţă a contaminarii, la depaşirea căreia se impun măsuri corective
destinate
să mentină igiena procesului în conformitate cu legislaţia în domeniul alimentelor; (Articolul
2(d) al
Regulamentului (CE) nr. 2073/2005);
Respectarea criteriilor microbiologice – obţinerea rezultatelor satisfăcătoare sau acceptabile
atunci
când se testează valorile stabilite pentru aceste criterii prin prelevarea de probe, efectuarea de
analize şi
aplicarea de măsuri corective, în conformitate cu legislaţia în domeniul alimentar şi cu
instrucţiunile
date de către autorităţile competente; (Articolul 2(l) al Regulamentului (CE) nr. 2073/2005);

Monitorizare - realizarea de observaţii sau măsuri planificate secvenţial, cu scopul de a obţine o

evaluare generală a nivelului de conformitate cu legislaţia în domeniul hranei pentru animale sau
cu
legislaţia în domeniul alimentelor, cu regulile de sănătate şi bunăstare a animalelor; (Articolul
2(8) al
Regulamentului (CE) nr. 882/204);
Supraveghere - examinare atentă a uneia sau mai multor întreprinderi cu activitate în domeniul
alimentar şi întreprinderi cu activitate în domeniul hranei pentru animale, a operatorilor cu
activitate în
domeniul hranei pentru animale sau a operatorilor cu activitate în domeniul alimentar ori a
activităţilor
acestora; (Articolul 2(9) al Regulamentului (CE) nr. 882/204);
Legislaţie în domeniul alimentelor - legi, alte acte normative, precum şi prevederi administrative
ce
reglementează alimentele, în general, şi siguranţa alimentelor, în special, inclusiv reziduurile şi
contaminanţii prezenţi în alimente şi în hrana pentru animale, şi se aplică în toate etapele de
producere,
prelucrare şi distribuţie a alimentelor, precum şi a hranei pentru animale, produsă sau utilizată
pentru
animalele destinate producerii de alimente; (Articolul 3(3) al Regulamentului (CE) nr.
178/2002); 16
Risc - probabilitatea apariţiei unui efect nociv pentru sănătate, precum şi severitatea acestui
efect, ca
urmare a expunerii la un pericol; Articolul 3(9) al Regulamentului (CE) nr. 178/2002);
Lot – un grup sau o serie de produse identificabile obţnute în urma unui anumit proces în condiţii
practic identice şi produse într-un anumit loc în cadrul unei perioade de producţie determinate;
(Articolul 2(e) al Regulamentului (CE) nr. 2073/2005);
Transport - o cantitate de produse livrate în acelasi timp. Poate fi format fie dintr-o porţiune a
unui lot,
fie dintr-un grup de mai multe loturi. In cazul inspecţiei statistice, pentru interpretarea
rezultatelor se va
considera transportul ca un lot nou.
- Dacă transportul este o porţiune a unui lot, fiecare porţiune este considerată ca un lot, în
vederea
inspecţiei;
- Dacă transportul este un grup de mai multe loturi, înaintea oricărei inspecţii, se va avea în
vedere
omogenitatea transportului. Dacă nu este omogen, poate fi utilizată o prelevare stratificata;
(CAC/GL 50-2004);
Proba - un set compus din una sau mai multe unităţi sau dintr-o porţiune a unei materii, selectate
prin
diferite mijloace dintr-o populatie sau dintr-o cantitate importantă de materie şi având ca scop
furnizarea de informaţii cu privire la o anumită caracteristică a populaţiei sau a materiei studiate
şi
oferirea unei baze pentru o decizie cu privire la populaţia în cauză sau la materia în cauză sau cu
privire
la procesul din care a rezultat; (Articolul 2(j) al Regulamentului (CE) nr. 2073/2005);
Proba reprezentativă – o proba în care se păstrează caracteristicile lotului din care a fost
prelevată.
Acesta este cazul în special atunci când oricare dintre articolele sau prelevările elementare din lot
este

caracterizat de acelasi grad de probabilitate de a face parte din probă; (Articolul 2(k) al
Regulamentului
(CE) nr. 2073/2005);
Apa potabilă - apa destinată consumului uman, după cum urmează:
a) orice tip de apa în stare naturala sau după tratare, folosită pentru băut, la prepararea hranei ori
pentru alte scopuri casnice, indiferent de originea ei şi indiferent dacă este furnizată prin reţea de
distribuţie, din rezervor sau este distribuita în sticle ori în alte recipiente;
b) toate tipurile de apa folosită ca sursa în industria alimentara pentru fabricarea, procesarea,
conservarea sau comercializarea produselor ori substanţelor destinate consumului uman, cu
excepţia
cazului în care Ministerul Sănătăţii şi Familiei şi Ministerul Agriculturii, Alimentaţiei şi
Pădurilor
aproba folosirea apei şi este demonstrat ca apa utilizata nu afectează calitatea şi salubritatea
produsului
alimentar în forma lui finita, 17
c) apa provenind din surse locale, precum fântâni, izvoare etc., folosită pentru băut, gătit sau în
alte
scopuri casnice; în funcţie de condiţiile locale specifice, autorităţile de sănătate publică judeţene,
respectiv a municipiului Bucureşti, pot face excepţie de la valorile parametrilor de calitate, dar
fără să
fie pusă în pericol sănătatea consumatorilor (Artticolul 1 alin.1 a Legii nr. 458 /2002);
Prelevarea - procedura utilizată pentru obţinerea sau constituirea unei probe;
Unitati ale produselor alimentare - un obiect concret sau conventional pe care se pot face o serie
de
observaţii şi care este prelevat, pentru a forma o probă; cantitatea de material prelevată o dată
dintr-o
cantitate mai mare de material pentru a forma o probă; (CAC/GL 50-2004);
Nota: termenii „individ”, „element” si „unitate”sunt sinonime
Omogenitate - un lot este omogen raportat la o caracteristică dată, dacă caracteristica este
uniform
distribuită în intreg lotul în conformitate cu o regulă de probabilitate dată. Dacă un lot este
omogen
pentru o caracteristică dată aceasta nu inseamna că valoarea caracteristicii este aceeaşi în întreg
lotul.
Un lot este neomogen raportat la o caracteristică dată dacă caracteristica nu este uniform
distribuită în
întreg lotul. Unităţile dintr-un lot pot fi omogene pentru o caracteristică în timp ce pentru altă
caracteristică pot fi neomogene; (CAC/GL 50-2004);
Defect şi neconformitate
neconformitate – neîndeplinirea unei cerinţe (SR EN ISO 9000:2006, Sisteme de management al
calităţii. Principii fundamentale şi vocabular);
defect – neîndeplinirea unei cerinţe referitoare la o utilizare intenţionată sau specificată. (SR EN
ISO
9000:2006, Sisteme de management al calităţii. Principii fundamentale şi vocabular)

Notă: Distincţia dintre conceptele de defect şi neconformitate este importantă deoarece aceasta
are
conotaţii legale, în special cele asociate problemelor referitoare la răspunderea juridică pentru
produs.
În consecinţă, termenul ‘defect’ ar trebui utilizat cu deosebită prudenţă. (SR EN ISO 9000:2006,
Sisteme de management al calităţii. Principii fundamentale şi vocabular)
- un defect (o neconformitate) apare într-o unitate de produs atunci când una sau mai multe
caracteristici calitative nu îndeplinesc specificaţia calitativă stabilită. O unitate defectuoasă
conţine
unul sau mai multe defecte; (CAC/GL 50-2004);
Plan de prelevare – reprezintă o procedură planificată care permite să se aleagă, sau să se
preleveze
probe separate dintr-un lot, pentru a obţine informaţiile dorite, cum ar fi o decizie referitoare la
starea
de conformitate a lotului. Un plan de prelevare este o schema care defineşte numărul de unităţi
ce 17
trebuie colectate şi numărul de unităţi neconfirmate cerute intr-o prelevare pentru a evalua starea
de
conformitate a lotului. (CAC/GL 50-2004).
Plan de clasa a doua - furnizează un mod simplu de inspecţie în care planul de prelevare este
definit
prin doua valori, n si c. Valoarea lui n defineste mărimea probei exprimat ca numărul de unităţi
de
probă; şi valoarea c indică numărul maxim al unităţilor neconforme permise intr-o probă. Când
se
realizează o evaluare microbiologică, o concentraţie maximă de microorganisme permisă în orice
unitate este indicată de m; orice unitate contaminată la o concentraţie mai mare decat m este
considerată a fi neconformă. (CAC/GL 50-2004).
Plan de clasa a treia este definit de valorile n, c, m si M; şi se referă la situaţiile în care calitatea
produsului poate fi imparţită în trei clase de atribute care depind de concentraţia
microorganismelor din
probe.
• Calitate inacceptabilă, cu o concentratie a microorganismelor peste valoarea M (care nu trebuie
să fie depăşită de nicio unitate din probă);
• Calitate satisfăcătoare, în care concentraţia nu trebuie să depăşească valoarea m;
• Calitate acceptabilă. Unităţile periferice au concentraţii care depăşesc m, dar care sunt mai mici
decat M (aceste concentratii sunt nedorite dar unele pot fi acceptate, numărul maxim acceptabil
fiind indicat de c). (CAC/GL 50-2004).

4. DESCRIERE PROCEDURĂ
Procedura de prelevare presupune alegerea unei probe (sau a mai multor probe) dintr-un lot,
inspecţia şi analiza probelor şi clasificarea lotului ca fiind „acceptabil sau „inacceptabil” pe baza
rezultatelor inspecţiei sau analizei probelor.

Trebuie luate toate măsurile necesare pentru a se asigura că proba prelevată este reprezentativă
pentru
transport sau lot.
Dacă un transport este format din mai multe loturi, trebuie prelevate probe reprezentative
pentru fiecare lot.

4.1. Scopul prelevarii. Prelevarea în cadrul controlului oficial

Prelevarea pentru testarea microbiologică poate fi realizată pentru:
- verificarea conformităţii cu criteriile stabilite în Regulamentul (CE) nr. 2073/2005;
- verificarea siguranţei microbiologice a alimentelor pentru care nu sunt stabilite criterii
microbiologice la nivel comunitar (de ex: ordin nr. 27/2011);
- obţinerea de informaţii generale despre starea microbiologică a anumitor produse puse pe
piaţă;
- monitorizarea atentă a unuia sau mai multor operatori din domeniul alimentar prin
verificarea implementării procedurilor bazate pe principiile HACCP şi/sau sistemul lor de
management al siguranţei alimentelor;
- controlul conformităţii loturilor individuale ;
17 alimentare suspecte,
- investigarea apariţiei unor toxiinfecţii
- pentru soluţionarea reclamaţiilor şi sesizărilor;
- identificarea şi obţinerea de informaţii cu privire la pericole noi sau pericole microbiologice
emergente, generând date pentru analiza şi evaluarea riscului.

Alegerea probei dintr-un lot

Inspecţia sau analiza probei

Clasificarea lotului

Acceptabil Inacceptabil

Prelevarea şi testarea oficială reprezintă o parte a procesului de verificare efectuat de către

ANSVSA.
Verificarea conformităţii cu criteriile stabilite în Regulamentul (CE) nr. 2073/2005 se poate
efecua prin
audituri, inspecţii, monitorizări, supravegheri, prelevare şi testare.
Pentru verificarea implementării de către operatorii din domeniul alimentar a
procedurii/procedurilor
bazate pe principiile HACCP şi a bunelor practici de igienă se va realiza o evaluare a caracterului
adecvat al schemelor de prelevare şi testare ale acestora (verificarea autocontrolului), verificând
buletinele de analiza obţinute în urma testării şi evaluând dacă acţiunile preventive şi corective
intreprinse sunt adecvate.
Operatorii din domeniul alimentar realizează prelevări şi testări, în cadrul procedurilor lor bazate
pe
principiile HACCP şi/sau sistemului lor de management al siguranţei alimentelor, pentru a
demonstra
conformitatea cu R (CE) nr. 2073/2005.
Prelevarea oficială poate fi realizată având ca scop monitorizarea, supravegherea şi verificarea
conformităţii cu legislaţia aplicabilă în vigoare. Pentru a beneficia de pe urma prelevării şi
testării
alimentelor, prelevarea de probe trebuie să fie foarte bine planificată, luându-se în considerare
scopul
şi obiectivul prelevării.
a) Prelevarea obiectivă (planificată) - O strategie planificată bazată pe selectarea unei probe
aleatorii, care este, din punct de vedere statistic, reprezentativă pentru populaţia ce va fi
analizată.
Fiecare unitate din cadrul populaţiei are o probabilitate specifică de a fi selectată. Aceasta
strategie
furnizează date de la care concluzia statistică poate fi implementată. Aceasta înseamnă că
rezultatele la
care se ajunge sunt comparabile.
Prelevarea obiectivă– reprezintă prelevarea planificată conform planurilor cifrice stabilite în baza
programului de supraveghere şi control în domeniul siguranţei alimentelor (se selectează o probă
aleatorie).
b) Prelevarea selectivă - O strategie17planificată unde selecţia probelor se realizează plecând de la
grupuri de populaţie definte anterior ca fiind de “risc înalt”. Probele, în mod normal, sunt
selectate
pentru a exemplifica sau a documenta condiţii necorespunzătoare sau falsificarea suspectă a unui
produs. Prelevarea este selectivă şi orientată către anumite produse sau producători. Procedura de
prelevare poate fi aleatorie sau nu. Specificaţia populaţie de “risc înalt” este dată fie de studii
ştiinţifice,
fie de analize anterioare sau informaţii referitoare la alte regiuni sau ţări. Comparabilitatea
rezultatelor
se bazează atât pe definiţia populaţiei ce va fi analizată cât şi pe modul în care probele au fost
prelevate. Rezultatele pot fi aplicate pentru întreaga populaţie dacă proba este prelevată aleatoriu,
asigurând reprezentativitatea populaţiei analizate.

Prelevarea selectivă – reprezintă prelevarea suplimentară ca urmare a identificării unui risc sau a
unor rezultate al analizelor probelor necorespunzătoare ce impune o supraveghere suplimentară.
Note
de serviciu - tematice, controale judetene,
c) Prelevarea la suspiciune – selectarea unui produs individual sau a unei anumite unităţi din
domeniul alimentar în special pentru a confirma sau respinge o suspiciune de neconformitate. Nu
este o
prelevare aleatorie. Datele raportate se referă ele însele la unităţile suspicionate ale populaţiei.
Rezultatele nu se generalizează şi se referă numai la produsul alimentar prelevat sau la unitatea
aleasă.
Exemplu – Prelevarea în cazul suspiciunii unor cauze care pot declanşa boli la om sau la
animale,
prelevare neplanificată ca urmare a unei notificări SRAAF, reclamaţii, prelevare ca urmare a
unor
rezultate de laborator necorespunzătoare

Prelevarea oficială se desfăşoară în cadrul controlului oficial privind siguranţa alimentelor de

către inspectorii desemnaţi ai DSVSA judeţene/a municipiului Bucureşti.
Frecvenţa prelevării probelor, locul de prelevare şi parametrii care se determină prin analize de
laborator din probele prelevate sunt prevăzute în ,,Programul de supraveghere şi control în
domeniul
siguranţei alimentelor”.
Pentru atingerea scopului propus în cadrul controalelor oficiale, pentru stabilirea şi verificarea
conformităţii cu cerinţele de igienă se prelevează:
- probe de produse alimentare, apă (ca ingredient alimentar şi produs în contact cu produsul
alimentar)
şi
- verificarea eficienţei operaţiunilor de igienizare, dezinfecţie şi curăţenie de pe suprafeţe de
lucru, ce
vin în contact cu produsul alimentar, ustensile, recipiente, utilaje, echipamente de protecţie,
mâini,
microflora din aerul încaperilor în care sunt produse, prelucrate, distribuite produsele alimentare,
recipienţi de sticlă, metal, material plastic (inclusiv capace, capse), ambalaje, ce vin în contact cu
produsul alimentar. 17

4.2. Activităţi preliminare. Pregătirea prelevării

Anterior desfăşurării activităţii de prelevare oficială a probelor în vederea testării lor
microbiologice,
inspectorul are în vedere asigurarea următoarelor dotări necesare:
- documentele necesare: Procesul verbal de prelevare, Cererea de analiză, Eticheta probei;
- echipamentul individual de protecţie;

- echipamentele şi instrumentele sterile pentru prelevare;

- recipiente sterile pentru prelevare şi transportul probelor;
- echipamente de măsură şi control – termometru
- lăzi frigorifice - ambalaje pentru transportul probelor, care să asigure temperatura de conservare
a acestora până la laboratorul de destinaţie, precum şi condiţii de transport pentru ca proba să nu
fie
deteriorată, sigiliul să rămână intact.
Prelevarea probelor în cadrul controlului oficial se face în mod obligatoriu de catre inspectorul
oficial (ANSVSA), în prezenţa operatorului sau a unui reprezentant legal al acestuia (un martor).
4.3. Planuri de prelevare
Planurile de prelevare sunt folosite pentru prelevarea probelor de produse alimentare în vederea
aplicarii criteriilor microbiologice stabilite în R (CE) nr. 2073/2005 şi în Ordinul nr. 27/2011.
În contextul prelevării oficiale, când este evaluată acceptabilitatea unui lot de alimente sau un
proces,
condiţia minim necesară este utilizarea planurilor de prelevare descrise in R (CE) nr. 2073/2005
şi în
Ordinul nr. 27/2011.
Atenţie! Numărul şi marimea unităţilor analitice pentru un lot testat trebuie să fie cele
stabilite în planul de prelevare şi nu trebuie modificate.
Un lot nu trebuie să fie supus testărilor repetate pentru a-l transforma în lot conform.

4.4. Metode de prelevare

Se aplică metode de prelevare distincte, în funcţie de tipul probei prelevate:
- teste pentru verificarea eficienţei operaţiunilor de igienizare, dezinfecţie şi curăţenie;
- probe de produse alimentare şi apă.
Probele prelevate în vederea testării microbiologice trebuie să fie predate laboratorului
specializat în cel mai scurt timp posibil, astfel încât să nu depăşească 24 ore din momentul
prelevării. (ora prelevării va fi înregistrată în procesul verbal de recoltare). Responsabilitatea
respectării acestei prevederi este a inspectorului care realizează prelevarea.
Probele primite în laboratorul specializat în vederea testării microbiologice se introduc în lucru
în cel mai scurt timp posibil, cu precizarea că intervalul maxim este de 24 ore de la momentul
primirii, respectiv maximum 48 ore din momentul prelevării lor. Responsabilitatea respectării
acestei prevederi este a laboratorului specializat care realizează testarea microbiologică.

Metodele de prelevare diferă în funcţie de produsul ce trebuie să fie prelevat (ex: produse
alimentare
solide, lichide, vrac sau preambalate).
Proba elementară este porţiunea de17produs colectată dintr-un lot în prima etapa a procesului de
prelevare.
Atâta timp cât este posibil, probele elementare trebuie luate din puncte diferite, distribuite în
întregul
lot şi orice abatere de la această cerinţă trebuie înregistrată în Procesul verbal de prelevare.
Se colectează probe elementare de dimensiuni similare şi în cantităţi suficiente, pentru a facilita
analizele de laborator. Este importantă şi imperios necesară menţinerea măsurilor de precauţie în
cursul
prelevării probelor elementare şi a tuturor procedurilor ulterioare, pentru a păstra integritatea
probelor
(de ex: evitarea contaminării probelor, sau altor operaţiuni ce ar putea face ca proba să devină
nereprezentativă pentru lotul din care a fost prelevată).
Unitatea este proba rezultată în urma alăturării probelor elementare. Probele elementare trebuie
să fie
extrase intr-un număr suficient de mare pentru a permite realizarea probei de laborator si probei
pentru
opinie suplimentară, după caz.
Proba de laborator şi proba pentru opinie suplimentară se ambalează şi se sigilează individual,
numărul sigiliilor şi dimensiunea probei vor fi consemnate în Procesul verbal de prelevare.
Proba de laborator şi proba pentru opinie suplimentară trebuie să fie alcătuite dintr-un număr
de unităţi n, număr stabilit în planul de prelevare
Toate probele trebuie să fie păstrate în aşa fel încât caracteristicile controlate să nu se modifice.
În cadrul acţiunii de control oficial se prelevează după caz:
- proba de laborator – se foloseşte în cadrul controlului oficial pentru analiza conformităţii
produselor alimentare cu prevederile legislaţiei în vigoare.
- proba pentru opinie suplimentară - este folosită de operator pentru contestarea rezultatului
obţinut la analiza probei de laborator. Această probă rămâne în custodia operatorului.
Responsabilitatea respectării acestei prevederi este a inspectorului care realizează prelevarea
probelor.

4.5. Controlul microbiologic al stării de igienă

Prelevarea testelor pentru controlul bacteriologic/microbiologic al suprafeţelor, utilajelor,
instrumentelor şi echipamentelor de protecţie
Materiale:
- tampoane de sanitaţie cu tijă, sterile;
- soluţie fiziologică peptonată, sterilă
Tehnica de lucru:
Prelevarea testelor pentru controlul bacteriologic/microbiologic al suprafeţelor ce vin în contact
cu
produsul alimentar se execută înainte de începerea lucrului sau după spălare şi decontaminare şi
niciodată în timpul lucrului. În situaţia în care se observă murdărie vizibilă, resturi de materie
organicǎ, curăţenia trebuie considerată ca neacceptabilă fără nici o altă evaluare microbiologică.
Locurile cărora trebuie să li se acorde cea mai mare atenţie sunt zonele în care este cel mai
probabil să
apară risc de contaminare microbiologică, respectiv zonele care sunt destinate să intre în contact
sau
17
lot

Proba de
laborator
proba de
opinie
seperată

Probă elementară

intra în contact cu produsul. Aproximativ doua treimi din numărul total de probe trebuie să fie
recoltate de pe suprafeţele care vin în contact cu alimentele.
Suprafaţa de pe care se face prelevarea probelor trebuie să fie cel puţin 1/10000 din suprafaţa
totală
supusă decontaminării.
Prelevarea probelor se execută prin ştergerea suprafeţei de testat, astfel încât să se acopere o
suprafaţă
totală de 100 cm2

(10 cm x 10 cm), marcată de un şablon steril sau prin apreciere. Recoltarea se face
aplicând o presiune fermă pe suprafaţă, trecând tamponul de 3 ori prin acelaşi loc, în direcţii
diferite (a
doua trecere perpendiculară pe prima, iar a treia, oblică pe primele două).
Pentru zonele umede pot fi suficiente tampoanele din bumbac uscate. În cazul suprafeţelor
uscate,
tampoanele din bumbac se umectează cu 1 ml soluţie fiziologică peptonată, sterilă (8,5 g NaCI, 1
g
triptona-cazeina-peptona, după caz, 1g agar şi 1000 ml apa distilată). Dacă recoltarea se
efectuează
după curăţenie şi dezinfecţie, la soluţia de umectare pentru tampoane trebuie adăugată o cantitate
de 30
g/l Tween 80 şi 3g/l Lecitina (sau alte produse cu un efect similar), după caz.
Transportul şi păstrarea probelor
Probele se individualizează prin etichetare şi se trimit la laborator, cu asigurarea temperaturii de
4°C pe
durata transportului.
În timpul transportului, probele sunt protejate de acţiunea directă a razelor solare şi se evită, pe
cât
posibil, păstrarea acestora mai mult de 24 ore la frigider.

4.6. Controlul microbiologic al aerului

Pentru a verifica îndeplinirea şi realizarea criteriilor de igienă de proces şi a criteriilor de
siguranţa
alimentelor, trebuie luate probe din arii de procesare, transport şi comercializare a alimentelor.
Controlul microbiologic al aerului 17 ambiant se adresează spaţiilor de lucru şi depozitare ale
produselor
destinate consumului uman.
Materiale:
Plăci Petri cu diametru de 10 cm, furnizate de laborator, cu medii de cultură pentru determinările
specifice: Număr total de germeni şi număr total de drojdii şi mucegaiuri.
Tehnica de lucru:
Se solicită laboratorului pregătirea plăcilor cu mediile de cultură specifice determinărilor. În
încaperile
de controlat se lasă descoperite câte 2 placi cu mediu pentru număr total de germeni şi câte 2
plăci cu
mediu pentru drojdii şi mucegaiuri, timp de 10 minute.

Plăcile se aşează astfel:

- în încaperile de lucru – la nivelul suprafeţelor de lucru,
- în depozite: - o placă pe paviment şi o placă la înălţimea de 0,8 – 1,0 m.
După 10 min., plăcile se acoperă cu capacele lor, şi se transportă imediat la laborator.
Transportul şi păstrarea probelor
După recoltare, plăcile se identifică în funcţie de locul prelevării, se ambalează, se sigilează şi se
transportă în condiţii de refrigerare (2-40C) la laborator, unde se vor incuba imediat.

4.7. Controlul microbiologic al recipientelor (de sticlă, metal, material plastic)

Materiale:
- ser fiziologic steril sau apă distilată, sterilă;
- recipiente supuse controlului microbiologic.
Tehnica de lucru:
In recipientul de controlat se introduce aseptic lichidul de spălare sterilizat, adus de
inspector/operator
de la laborator. Cantitatea de lichid de spălare va fi egală cu 1/100 din capacitatea recipientului
de
controlat (de ex. 10 ml pentru un recipient de 1 l, 50 ml pentru unul de 5 l). Prin urmare, 1 ml
lichid de
spălare reprezintă 100 ml din capacitatea recipientului.
NOTA: Se vor utiliza un numar suficient de recipiente, astfel încât capacitatea lor totală să fie de
1 l.
Recipientul se acoperă cu capacul propriu sau cu altele improvizate, dar sterilizate, se agită bine
prin
mişcări în sensuri diferite, în aşa fel încât lichidul de spălare să treacă prin acelaşi loc de cel
puţin 10
ori.
Se recoltează lichidul de spalare în mod aseptic, în vasele din care a provenit şi se transportă
rapid la
laborator pentru a fi introdus imediat în lucru.
Ca alternativă, dacă nu pot fi asigurate condiţii stricte de asepsie în timpul operaţiunilor descrise
(spălare şi prelevare a lichidului de spălare), este preferabilă prelevarea în condiţii de asepsie a
recipientelor şi expedierea lor la laborator. Pentru ambalarea şi sigilarea acestor recipiente se pot
utiliza 17
ambalaje de polietilenă de uz alimentar, aflate la prima utilizare.

Pentru controlul microbiologic al recipientelor, se vor recolta prin sondaj un număr minim de 5 şi
maxim de 10 recipiente , cu precizarea că este necesar ca în cazul ambalajelor de capacitate
redusă, să
se recolteze suficiente recipiente, astfel încât capacitatea lor totală să fie de minim 1 litru.
Transportul şi păstrarea probelor
Lichidul de spălare recoltat aseptic, se va ambala în condiţii care să asigure integritatea şi se
expediază
la laborator, în condiţii de refrigerare (2-40C) în cel mai scurt timp posibil astfel încât intervalul
scurs
între prelevare şi introducerea în lucru, să nu depăşească 24 ore.
În situaţia în care se vor preleva direct recipiente, acestea ambalate, etichetate şi sigilate se vor
expedia
la laborator în maximum 24 de ore.

Controlul microbiologic al unor materiale de ambalaj - (folii de material plastic, hartie

pergaminată, tăviţe polistiren, ş.a.)
Se vor recolta prin sondaj un număr minim de 5 şi maxim de 10 unităţi de ambalaj. Pentru
ambalarea
şi sigilarea acestor recipiente se utiliză ambalaje de polietilenă de uz alimentar, aflate la prima
utilizare.
Transportul şi păstrarea probelor
Probele prelevate, ambalate, etichetate şi sigilate se vor expedia la laborator în maximum 24 de
ore.

4.8. Controlul bacteriologic al mâinilor personalului care prelucrează şi manipulează produse

alimentare
Prelevarea probelor se execută înainte de începerea lucrului.
Materiale:
- tampoane de sanitaţie cu tijă, sterile
Tehnica de lucru:
Cu tamponul uşor umectat în ser fiziologic sau uscat, după caz, se şterge faţa palmară şi spaţiile
interdigitale de la o mână, frecându-se cu tamponul de 3 ori pe acelaşi loc. Se spală bine
tamponul în
serul fiziologic din eprubetă, se stoarce cât mai bine prin presarea lui pe pereţii acesteia. Cu
acelaşi
tampon se execută în acelaşi mod, ştergerea celeilalte mâini. Tamponul se introduce în eprubeta
cu ser
fiziologic şi se trimite la laborator.

Transportul şi păstrarea probelor

Tampoanele se păstrează la temperatura de refrigerare (2-40C) până la introducerea în lucru în
cadrul
laboratorului specializat.
17
4.9. Tehnici de prelevare pentru diferite produse alimentare
Metodele de prelevare diferă în funcţie de materialul ce trebuie să fie prelevat (ex apa, produse
alimentare solide, lichide, vrac sau preambalate). Dacă probele nu sunt luate în ambalajul final,
atunci
trebuie să se utilizeze tehnici aseptice de prelevare.
Proba elementară este porţiunea de produs colectată dintr-un lot în prima etapa a procesului de
prelevare si este denumită „unitate”.
Atata timp cat este posibil, probele elementară trebuie luate de peste tot din lot şi abaterile de la
această cerinţă trebuie înregistrate în Procesul verbal de prelevare.
Se colectează probe elementară de dimensiuni similare şi în cantităţi suficiente, pentru a facilita
analizele de laborator. Este importantă şi imperios necesară menţinerea măsurilor de precauţie în
cursul
prelevării probelor elementare şi a tuturor procedurilor ulterioare, pentru a păstra integritatea
probelor
(de ex., evitarea contaminării probelor, sau altor operatiuni ce ar putea face ca proba să devină
nereprezentativa pentru lotul din care a fost prelevată).
Unitatea
Când în planul de prelevare se cere acest lucru, unitatea este realizată prin amestecarea cu grijă a

unităţilor dintr-un lot de produse preambalate, sau prin amestecare cu grijă a probelor elementare
dintr-
un lot în vrac (nepreambalat).

Proba de laborator - proba rezultată în urma alăturării unităţilor şi trimisă la laborator pentru
analize
Proba de laborator trebuie sa fie păstrată în aşa fel încât caracteristicile controlate să nu fie
modificate; este obligatorie utilizarea de echipamentele şi instrumentele sterile pentru prelevare;
recipiente sterile pentru prelevare şi transportul probelor.

4.10. Apa
Activităţi preliminare
Se solicită ODA şi se analizează informaţii privind:

- sursa de apă :
- proprie – date privind sistemul de tratare, controlul calităţii apei obţinute;
- sistem centralizat de alimentare cu apă potabilă;
- tip sursă:
- de suprafaţă
- de profunzime
- schema circuitelor de apă:
- apă potabilă
- apă nepotabilă,
- apă reciclabilă
- apă de răcire,

Stabilirea punctului de prelevare şi18consemnarea în Procesul verbal de prelevare a acestuia.

Prelevarea apei potabile
Materiale:
- flacoane de sticlă, dop de sticlă rodat sau cu capac metalic cu filet ori flacoane de plastic sterile,
dopul
şi gâtul sticlei sunt protejate cu înveliş de hârtie ori de pergament sau cu folie subţire de
aluminiu.
Flacoanele necesare prelevării sunt puse la dispoziţia inspectorilor de către laboratorul de
analize.
Acestea trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
o să conserve compoziţia probei, evitându-se pierderile prin absorbţie, evaporare sau
contaminare cu substanţe străine;
o să reziste la temperaturi extreme;
o să reziste la şocuri mecanice;
o să aibă facilitatea de închidere etanşă şi de redeschidere uşoară.
Tehnica de lucru:
Când se prelevează mai multe probe din acelaşi loc, se recomandă ca proba destinată examenului
bacteriologic/microbiologic să fie prelevată prima, pentru a împiedica contaminarea punctului de
recoltare în timpul prelevării altor probe.
Recipientele sterile sunt păstrate nedeschise până în momentul prelevării probei de apă.

În cazul prelevarii apelor clorinate, înainte de sterilizarea flaconului pentru recoltarea probei, se
introduce în flacon 1 ml soluţie 0,5% tiosulfat de sodiu, pentru fiecare 100 ml apa ce urmează a
fi
recoltata.
Din apele tratate sau dezinfectate provenite din ape de suprafaţă sau de profunzime, probele se
recoltează din puncte reprezentative fiecărei trepte de tratare.
În timpul prelevării, dopul şi gâtul sticlei nu trebuie să atingă nici un obiect, iar sticla trebuie
ţinută
aproape de partea ei inferioară.
Pentru prelevare, inclusiv a probelor din reţeaua de distribuţie, se deschide robinetul şi se lasă să
curgă
apa, timp de 5-10 min. Se închide robinetul şi se flambează. Se deschide din nou robinetul şi se
reglează debitul apei, astfel încât să se formeze o coloană de apă continuă de maxim 1 cm
diametru. Se
scoate dopul flaconului iar flaconul ţinut cu mâna de partea lui inferioară se aşează vertical sub
coloana
de apă, se umple şi se acoperă cu dopul.
Când nu există posibilitatea recoltării probei de la robinet, flaconul sterilizat se introduce în
bazin sau
rezervor, se umple şi se acoperă cu dopul.
Din surse locale (fântâni şi izvoare), probele se recoltează direct cu flaconul sau prin turnare în
flacon
din găleata fântânii.
Probele de apă recoltate pentru examen microbiologic vor avea un volum minim de 500 ml, iar
flacoanele vor fi umplute pâna la aproximativ 2 cm sub dop.
Transportul şi păstrarea probelor 18
Probele se transportă la laborator în ziua recoltarii, în condiţii de refrigerare (2-40C), în special
în
anotimpul cald; dacă acest lucru nu este posibil, probele se vor trimite în maxim 24 de ore, fiind
păstrate la temperatura de 4°C. In conformitate cu documentul ISO/DIS 7218, analiza
microbiologică
trebuie să înceapă de îndată ce este posibil după primirea la laborator.
În cazul întârzierii, probele de apă se pot filtra la locul de prelevare, iar membrana de filtrare se
poate
pune pe un burete absorbant saturat cu mediu de transport prevăzut în SR ISO 5667-2, într-o
placă
Petri.
Conservarea probelor de apă prelevate
a) probele de apă sunt ţinute la o temperatură inferioară celei din momentul prelevării;
b) în vederea conservării pe termen scurt a probelor de apă, acestea sunt refrigerate la o
temperatură de
2-4oC;
c) congelarea la -20oC măreşte timpul de conservare; se folosesc în acest scop recipienţi de
polietilenă;

d) o metodă de conservare care poate fi utilizată este adaosul de agenţi de conservare, prevăzuţi
în SR
ISO 5667-3, înainte sau după prelevare, în cantităţi mici, dar în concentraţii mari;

4.11. Produse alimentare ambalate individual

A. Produse în stare solidă
În cazul produselor alimentare în stare solidă ambalate individual, unitatea (n) este reprezentată
de un
produs aflat în ambalajul propriu.
Unităţile (n) se prelevează aleatoriu, din locuri diferite ale lotului, numărul acestora fiind dat de
Planul
de prelevare aplicat.
Dimensiunea unităţii (n) este cuprinsă între 200 g şi 500 g şi va fi consemnată în Procesul verbal
de
prelevare. Fiecare unitate de produs va fi identificată unic şi clar prin numerotare.
Atenţie:
- în cazul unităţilor de produs ambalate individual, cu masa mai mică decât 200 g, unitatea va fi
constituită din mai multe ambalaje individuale, astfel incât cantitatea/unitate să aibă minimum
200g.
- în cazul unităţilor de produs ambalate individual, cu masa mai mare decât 500 g, unitatea va fi
constituită din unitatea de produs ambalată individual utilizănd o metodă de reducere adecvată,
astfel incât cantitatea/unitate să aibă minimum 200 g.
Totalul unităţilor de produs prelevate constituie proba finală, care se ambalează (vezi 5.5.) şi
sigilează,
numărul sigiliului fiind consemnat în Procesul verbal de prelevare.
B. Produse în stare lichidă
18 lichidă ambalate individual, unitatea (n) este reprezentată
În cazul produselor alimentare în stare
de un
produs aflat în ambalajul propriu.
Unităţile se prelevează aleatoriu, din locuri diferite ale lotului, numărul acestora fiind dat de
planul de
prelevare aplicat.
Dimensiunea unităţii este cuprinsă între 200 ml şi 500 ml şi va fi consemnată în Procesul verbal
de
prelevare. Fiecare unitate de produs va fi identificată unic şi clar (individualizată prin
numerotare).
Atenţie:
- în cazul unităţilor de produs ambalate individual, cu masa mai mică de 200 ml, unitatea va fi
constituită din mai multe ambalaje individuale, astfel incat cantitatea/unitate sa aibă minimum
200 ml.

- în cazul unităţilor de produs ambalate individual, cu masa mai mare decât 500 ml, unitatea va fi
constituită din unitatea de produs ambalată individual utilizănd o metodă de reducere adecvată,
astfel incat cantitatea/unitate sa aibă minimum 200 ml.
Totalul unităţilor de produs prelevate constituie proba finală, care se ambalează (vezi 5.5.) şi
sigilează,
numărul acestuia fiind consemnat în Procesul verbal de prelevare.

4.12. Produse alimentare vrac

A. Produse în stare solidă
În cazul produselor alimentare în stare solidă neambalate (vrac), unitatea (n) este reprezentată de
cantitatea de produs prelevată o dată cu echipamentul special de prelevare, din masa produsului.
Unităţile se prelevează aleatoriu, din locuri diferite ale lotului, numărul acestora fiind dat de
planul de
prelevare aplicat.
Dimensiunea unităţii este cuprinsă între 200 g şi 500 g şi va fi consemnată in Procesul verbal de
prelevare. Fiecare unitate de produs va fi prelevată în ambalaj corespunzător, (de ex. ambalaj de
uz
alimentar, la prima utilizare), suficient de rezistent la rupere, individualizat unic şi clar prin
numerotare.
Totalul unităţilor de produs prelevate constituie proba finală, care se ambalează (vezi 5.5.), se
eticheteaza şi sigilează, numărul sigiliului fiind consemnat în Procesul verbal de prelevare.
B. Produse în stare lichidă
În cazul produselor alimentare în stare lichidă neambalate (vrac), unitatea (n) este reprezentată de
cantitatea de produs prelevată o dată cu echipamentul special de prelevare, din volumul
produsului.
Unităţile se prelevează aleatoriu, din locuri diferite ale lotului, numărul acestora fiind dat de
planul de
prelevare aplicat.
Dimensiunea unităţii este cuprinsă între 200 ml şi 500 ml şi va fi consemnată in Procesul verbal
de
prelevare. Fiecare unitate de produs va fi prelevată în ambalaj corespunzător, respectiv flacoane
de 18
prelevare sterile, etanşe, suficient de rezistente, individualizate unic şi clar prin numerotare,.
Totalul unităţilor de produs prelevate constituie proba finală, care se ambalează (vezi 5.5.) şi
sigilează,
numărul acestuia fiind consemnat în Procesul verbal de prelevare.
4.13. Ambalarea si transportul probelor către laborator. Păstrarea şi înregistrarea probelor
După prelevare, fiecare probă se indentifică unic prin etichetare, se ambalează separat, se
ambalează în
recipiente inerte şi curate, care să confere protecţie adecvată împotriva contaminării externe şi

deteriorării probei în timpul transportului. Ulterior, probele se sigilează în aşa fel încât
deschiderile
neautorizate sa fie detectabile (pentru a nu fi posibilă substituirea produsului sau contaminarea
lui).
Numărul sigiliului aplicat va fi menţionat în Procesul verbal de prelevare.
Proba finală (de laborator) este trimisă la laborator cat mai curand posibil, luând toate măsurile
necesare de precauţie împotriva scurgerilor sau alterării (de ex., alimentele congelate trebuie
păstrate congelate, cele perisabile trebuie păstrate reci sau congelate, după caz).
Pentru produsele refrigerate proaspete foarte perisabile sunt necesare următoarele indicaţii
suplimentare:
- trebuie evitate temperaturile de congelare în timpul transportului şi depozitării;
- alimentele preambalate trebuie să fie depozitate la sau sub temperatura de depozitare
indicată pe eticheta produsului.

În lipsa unor menţiuni existente pe eticheta produsului privind condiţiile de transport şi păstrare a
probelor de produse alimentare, se recomandă ca pe perioada transportului şi păstrarii probelor
până la
analizarea lor să se asigure:
- temperatura probei finale (de laborator) – menţinută în regimul de refrigerare (2-4oC);
- materialul în care este ambalată proba finală (de laborator)– să fie inert şi curat, să aibă
facilitatea
de închidere etanşă şi de redeschidere uşoară, rezistenţă la şocuri mecanice sau alte deteriorări
intenţionate sau accidentale;
- introducerea în lucru a probei finale (de laborator) sosite la laborator se va face în maximum 48
ore
de la momentul prelevării.

4.14 Prelevarea probelor pentru opinii suplimentare

În conformitate cu articolul 11(5) si (6) al R (CE) nr. 882/2004, autoritatea competenta -
ANSVSA,
prin reprezentanţii ei, trebuie să asigure în timpul prelevării oficiale informarea operatorului din
domeniul alimentar (sau a reprezentantului acestuia) referitor la:
 dreptul lui de a obţine probe pentru o opinie suplimentara din partea unui expert. Acordul OIA
referitor la prelevarea/neprelevarea probei pentru opinie suplimentară se înregistrează în Procesul
verbal de prelevare.
 limitarea prelevărilor suplimentare18 pentru analizele microbiologice. Pentru analizele
microbiologice
rezultatele probelor pentru o opinie suplimentară pot avea o valoare limitată deoarece distribuţia
microorganismelor într-un aliment este adesea neomogenă. Două probe de aliment nu vor fi la
fel şi nu
este neobişnuit ca rezultatele probelor pentru controlul oficial şi cele pentru opinia suplimentară
să fie
diferite. De asemenea, bacteriile pot să nu supravieţuiască sau pot uneori să se multiplice în
timpul
depozitării probelor afectând din nou rezultatele probelor pentru o opinie suplimentară.
 dreptul lui să deţină probe pentru o opinie suplimentară poate fi restricţionat doar dacă
alimentul
este foarte perisabil sau lotul este într-o cantitate insuficientă pentru o prelevare suplimentară;
 condiţiile de depozitare şi transport în vederea analizării a probei suplimentare, în cazul
prelevării
acesteia.
Acordul operatorului (exprimat prin semnătură) referitor la prelevarea/neprelevarea probei
pentru opinie suplimentară şi instruirea lui cu privire la îndeplinirea condiţiilor de transport şi
depozitare a probei pentru opinie suplimentară se înregistrează în procesul verbal de prelevare.

În cazul în care operatorul optează pentru existenţa probei pentru opinie suplimentară, prelevarea
acesteia trebuie făcută cu respectarea următoarelor condiţii:
 termenul de valabilitate a produsului să permită prelevarea şi păstrarea în vederea testării
microbiologice a unei probe, pentru un interval de timp mai îndelungat;
 să existe suficient substrat pentru o prelevare suplimentară;
 prelevarea se face simultan şi în aceleaşi condiţii cu cea a probei de laborator şi a probei de
referinţă,
rezultând prin divizarea probei globale, de către aceeaşi persoană;
 proba suplimentară, ambalată, sigilată corespunzător şi unic identificată prin etichetare rămâne
în
grija şi răspunderea OIA (asumată prin semnătură).. Pe eticheta probei suplimentar prelevate se
vor înscrie aceleaşi date ca pe cea a probei oficiale, cu menţiunea ‚Probă pentru opinie
suplimentară’.

4.15 Prelevarea probelor la suspiciune

In conformitate cu Programul anual de supraveghere şi control, în cazul unor rezultate de
laborator
necorespunzătoare (depasire de limita maxima admisa, prezenta unor microorganisme patogene),
se
prelevează probe şi pentru următoarele loturi ce provin din ţări terţe sau state membre cu origine
comună cu cea a lotului necorespunzător sau provin de la acelasi operator, până la obţinerea de
rezultate care se încadrează în criteriile de acceptabilitate. In aceste situaţii, probele prelevate
sunt
însoţite de o notă justificativă în care se preciează motivaţia recoltării acestora în afara frecvenţei
stabilite prin Programul de Supraveghere si Control.
18
În cazul în care există suspiciuni cu privire la prezenţa neconformităţii cu legislaţia (produsul nu
este
sigur) sau în cazul în care există îndoieli cu privire la destinaţia reală a lotului sau la
corespondenţa
dintre lot şi garanţiile certificate.
Inspectorii din cadrul direcţiilor sanitare veterinare şi pentru siguranţa alimentelor judeţene
respective a
municipiului Bucureşti efectuează controale oficiale pentru a confirma sau pentru a elimina
suspiciunea
sau îndoiala. Lotul este reţinut oficial până la obţinerea rezultatelor controalelor oficiale.

4.16. Documente utilizate în activitatea de prelevare oficială

Documentele asociate activităţii de prelevare în cadrul controlului oficial sunt:
 Procesul verbal de prelevare şi Cererea de analiză - formulare aprobate prin Ordinul
preşedintelui ANSVSA nr. 145/2007 privind aprobarea Normei pentru siguranţa alimentelor care
stabileşte condiţiile în care se derulează operaţiunile de import-export şi comerţ intracomunitar
de
produse alimentare de origine nonanimala supuse supravegherii şi controlului pentru siguranta
alimentelor;
 Eticheta probei;
 Buletinul de analiză.
Procesul verbal de prelevare
Prelevarea implică completarea formularului de proces verbal în conformitate cu Ordinul
preşedintelui
ANSVSA nr. 145/2007, în care trebuie completate obligatoriu următoarele informaţii - numele
inspectorului oficial,
- - numele inspectorului oficial în clar şi semnătura,
- datele de identificare ale operatorului (denumirea societăţii, CUI, nr. înregistrare sanitar
veterinar şi pentru siguranţa alimentelor),
- numele martorului ( reprezentant legal al OIA),
- data şi locul prelevării,
- ora prelevării,
- temperatura probei,
- temperatura la care se transportă proba către laborator
- motivul prelevării (control oficial, la solicitarea operatorilor),

o prelevare în cadrul controlului oficial - prelevare obiectivă, selectivă sau la suspiciune,

o prelevare la solicitarea operatorilor,
- numărul sigiliului aplicat fiecărei probe (probă de laborator, probă pentru opinie
suplimentară);
- originea probei (ţara de origine a produsului, ţara de provenienţă),
- date de identificare ale lotului/transportului: nr. lot, cantitate lot
- cantitatea de probă prelevată, nr. de unităţi/probă şi numărul de probe prelevate,
- temperatura la care se transportă proba către laborator,
- metoda de prelevare utilizată (denumire procedură, produs solid/lichid),
- alte informaţii suplimentare ce pot 18veni în sprijinul analistului, cum ar fi durata (ora) şi
condiţiile de transport precum şi orice alte date suplimentare pot fi completate la
rubrica ,Menţiuni’,
- informaţii cu privire la prelevarea probei pentru opinie suplimentară
o decizia operatorului de prelevare/neprelevare,
o instruirea operatorului cu privire la condiţiile de depozitare şi transport în vederea analizării
probei,
o asumarea răspunderii prin semnătură,
o metoda de prelevare utilizată (denumire procedură),
o numărul sigiliului unic aplicat pe ambalajul probei.
Orice abatere de la prezenta procedură de prelevare se consemnează în Procesul verbal de
prelevare. Se anexează un raport detaliat despre procedura de prelevare care a fost aplicată, şi
cauzele care au condus la neaplicarea prezentei proceduri..
Cererea de analiză
Este documentul care însoţeşte proba (probele) prelevate la laboratorul care o (le) va analiza şi
care
conţine:
- datele de identificare a probei prelevate şi supuse analizelor de laborator,
- detalii referitoare la tipul analizelor solicitate.
- natura eventualei pretratări (unde e cazul, de ex. la apă);
- agenţii de conservare sau stabilizare folosiţi (în cazul conservării probei).

Eticheta
Probele trebuie să fie clar (vizibil şi lizibil) şi unic identificate, prin etichetare.
 Fiecare unitate ce compune proba se va identifica prin numerotare: număr de forma x/y, unde
x
= numărul unităţii de probă 1, 2, 3, 4 sau 5, iar y = numărul probei formată din x unităţi.
Ambalajul final ce reuneşte toate unităţile unei probe, va fi etichetat. Eticheta trebuie să conţină
cel
puţin următoarele date:
 numarul probei (in situatia in care sunt prelevate mai multe probe cu un singur proves verbal
de
prelevare)
 tipul probei (ex: apă, alimenta gata pentru consum, legume tăiate, etc.)
Completarea Procesului verbal de prelevare şi a Cererii de analiză se face în trei exemplare,
semnate
si ştampilate de părţile implicate (reprezentant autoritate, reprezentant operator economic), iar
cele trei
exemplare se distribuie astfel:
 exemplarul original rămâne la inspectorul oficial şi se îndosariază în conformitate cu
procedura
proprie privind controlul înregistrărilor;
 un exemplar în copie este predat operatorului;
 un exemplar în copie însoţeşte proba la laboratorul indicat în Cererea de analiză.
Buletinul de analiză
Buletinul de analiză este documentul emis de laboratorul care efectuează testarea probei
prelevate şi, 18
după emitere, acesta este transmis către DSVSA judeţeană sau a municipiului Bucureşti care a
solicitat
efectuarea analizelor.
Buletinul de analiză completează, alături de Procesul verbal de prelevare şi Cererea de analiză
lista
documentelor întocmite cu ocazia prelevării oficiale.

Echipamente
Echipamentele utilizate în activitatea de prelevare a probelor de produse alimentare în vederea
testării
microbiologice sunt: echipamentul individual de protecţie folosit de persoana care efectuează
prelevarea, instrumente şi recipiente sterilizate folosite pentru prelevarea şi transportul probelor
la
laborator.
Echipamentul individual de prelevare folosit de inspectorul care realizează prelevarea probelor
trebuie
să fie curat şi să elimine riscul contaminării accidentale a probei prelevate. El include:

o halat,
o mănuşi chirurgicale,
o mască facială,
o bonetă (capelină),
o botoşi.

Echipament individual de protecţie

Masca boneta manuşi botoşi echipament individual

Instrumente de prelevare – Pentru examenul microbiologic se folosesc pentru prelevare
instrumente
sterilizate, iar probele prelevate se ambalează în recipiente sterilizate (pentru unităţi) sau în pungi
de
polietilenă de uz alimentar (pentru proba finală).

instrumente sterile pentru prelevare

Pentru prelevarea fiecărei probe se folosesc alte instrumente sterilizate. Prelevarea succesivă a
mai
multor probe trebuie să se facă în aşa fel încât să nu se amestece părţi din acestea, sau să nu se
contamineze între ele.

Materialele necesare prelevării probelor de apă (recipientele de recoltare) şi placile Petri cu

mediu
nutritiv pentru determinări microbiologice din mediul ambiant sunt puse la dispoziţia
inspectorului de
către laboratorul din cadrul DSVSA judeţene şi a municipiului Bucureşti.
Recipiente sterile pentru prelevare18
şi transportul probelor

Celelalte materiale, instrumente şi ambalaje pentru unităţi/probe sunt asigurate de către DSVSA
judeţeană şi a municipiului Bucureşti, ele trebuind să fie sterile în momentul efectuării prelevării.
Pentru asigurarea transportului probelor în condiţii optime, cu menţinerea temperaturii probelor
la un
nivel constant, care să nu permită se folosesc lăzi frigorifice.

Ladă frigorifică

Mijloace de măsură şi control:

– termometru aflat în perioada de valabilitate a buletinului de verificare metrologică;

STABILIREA CONFORMITĂŢII LOTURILOR

Organisme indicator

Enterobacteriaceae
Enterobacteriaceae-le sunt indicatori ai igienei şi indicatori ai contaminării post procesare a
alimentelor. Testul pentru Enterobateriaceae inlocuieste testele pentru coliformi care au fost
utilizate
în mod traditional ca indicatori de igiena şi contaminare după procesare.
Enterobacteriaceae-le sunt o familie extinsă de microorganisme ce reuneşte numeroase genuri şi
specii
bacteriene, lactoza-pozitive (Escherichia, Citrobacter, Enterobacter s.a.) şi lactoza negative
(Salmonella, Proteus, Shigella si Yersinia).
Astfel, determinarea numărului total Enterobacteriaceae poate avea o relevanta mai mare cu
privire la
probabilitatea prezenţei patogenilor, şi poate furniza informaţii exacte despre manipularea şi
depozitarea mărfurilor/produselor.
Escherichia coli (total) si Listeria (total)
Listeria monocytogenes
Unele standarde de calitate impun un nivel zero pentru L.monocytogenes în etapa de producţie a
unui
aliment. Astfel, un nivel de 102

cfu/g la punctul de vânzare/consum reprezintă un risc potenţial pentru

sănătate. Numărarea la acest nivel poate de asemenea indică o lipsă semnificativă a standardelor
de
igiena în pregatirea şi/sau depozitarea unor astfel de alimente.
In baza informatiilor actuale, este inacceptabil ca alimentele gata pentru consum să conţină
serogrupuri
de L.monocytogenes la nivelul sau deasupra nivelului de 102

cfu/g. Unele serotipuri/fagotipuri de L.

monocytogenes pot fi rar asociate cu infecţia umană, dar prezenţa lor reprezintă un nivel
necorespunzator de igiena.
L.monocytogenes este larg răspandită 18 în mediu şi este capabilă să se multiplice lent la 40C.
Termenul de
valabilitate a alimentelor variază foarte mult. Anumite alimente – cum ar fi brânza uşor maturată,
pateu
impachetat în vid, şi carne feliată. - au un termen de valabilitate lung în condiţii de refrigerare, şi
prezenţa L.monocytogenes la orice nivel poate fi riscantă datorită potenţialului său de dezvoltare
în
timpul depozitării.
Escherichia coli – prezenţa E.coli în alimentele gata de consum este nedorită deoarece aceasta
indică
condiţii de igienă reduse care au condus la contaminare sau un tratament termic neadecvat. In
mod
ideal, E.coli nu trebuie să fie detectată şi un astfel de nivel < 3/g (limita testului celui mai
probabil
număr) este indicat ca şi criteriu satisfacător pentru acest organism. Nivelurile care depăşesc
100/g sunt
neacceptabile şi indică un nivel al contaminării care poate arăta prezenţa de patogeni sau că
patogenii,
daca sunt prezenţi în aliment înainte de procesare, au supravieţuit.

Regulamentul (CE) nr. 2073/2005 defineşte criteriile microbiologice pentru alimente. Anexa I a
acestui
Regulament defineşte criteriile pentru L. monocytogenes pentru trei categorii de alimente gata de
consum.
Salmonella, Campylobacter si E. Coli O157
Alimentele gata pentru consum nu trebuie sa contina spp Salmonella, spp Campylobacter si E
coli
o157 si alte serotipuri de E. coli verocitotoxice.
Trebuie să se asigure masuri de control specifice in timpul producţiei, standarde de igiena
adecvate,
gătire adecvată în timpul pregătirii finale pentru ca produsele finale să nu conţină organisme
viabile şi
ca alimentele gătite să fie de bună calitate.
Clostridium Perfrigens
Niveluri nesatisfacatoare de C.perfringens în general apar ca rezultat al utilizării temperaturii în
exces
atunci când alimentele gătite sunt ţinute la temperaturi ridicate (<600C, în special temperatura
camerei)
pentru perioade lungi de timp sau răcite (la 50C sau mai puţin) prea încet. Alimentele asociate cu
toxiinfecţii alimentare cauzate de C.perfringens, includ bucăţi de carne (în special bucati de
carne mari
şi rulate) şi feluri de mancare din carne şi legume (de exemplu: tocana şi plăcintă). Detectarea
nivelurilor ridicate (>103

cfu/g) de C.perfringens trebuie să conducă la o investigare a controloalelor

realizate de către operatori în ceea19

ce priveşte manipularea alimentelor. Nivelurile de ≥ 104

cfu/g sunt
considerate riscuri potenţiale deoarece consumul alimentelor cu acest nivel de contaminare poate
conduce la toxiinfecţii alimentare.
Bacillus cereus şi alte specii ale genului Bacillus, potenţial patogene
Un nivel nesatisfacator de B. cereus în alimentele gătite apare în general ca rezultat al unui
control
neadecvat al temperaturii. In cazul C. perfringens alimentele gătite trebuie să fie ţinute la sau sub
temperatura de 600C sau la sau sub temperatura de 50C pentru a preveni dezvoltarea acestuia,
sau
păstrate în afara intervalului de temperatură pentru un timp limitat. Alimentele asociate cu
contaminarea alimentelor prin B.cereus includ feluri de mâncare cu orez, alte alimente gătite care
au la
bază cereale precum paste/tăiţei, fidea, deserturi pe bază de produse lactate, carne sau mâncăruri
de
legume care conţin condimente. Detectarea nivelurilor ridicate de B.cereus (>103

cfu/g) trebuie să
conducă la o investigare a controalelor realizate de catre operatori cu privire la manipularea
alimentelor. Nivelurile ≥ 104

cfu/g sunt considerate cu risc potenţial deoarece consumul alimentelor cu

acest nivel de contaminare poate conduce la toxiinfecţii alimentare. Alte specii de Bacillus
precum B.
subtilis si B. licheniformis au fost de asemenea asociate cu toxiinfecţii alimentare şi pot fi de
asemenea
testate.
Staphylococci coagulazo-pozitivi

Contaminarea alimentelor gata pentru consum cu stafilococi coagulazo-pozitivi este în mare

măsură un
rezultat al contactului uman. Contaminarea trebuie să fie minimizată prin bune practici de
manipulare a
alimentelor iar dezvoltarea organismelor trebuie evitată prin controlul adecvat al temperaturii.
Nivelurile nesatisfacatoare a stafilococilor coagulazo-pozitiv indică faptul că folosirea excesiva a
timpului/temperaturaturii pentru un aliment poate să fi aparut în urma manipulării improprii în
timpul
pregătirii alimentelor. Un test pentru enterotoxine, SET, poate fi corespunzator dacă nivelul
stafilococilor coagulazo-pozitivi depăşeste 103

cfu/g.; Este posibil ca organisme viabile să nu mai fie

prezente într-un numar semnificativ în alimente, în acest caz suspectam practici
necorespunzatoare de
manipulare a alimentelor. Nivelurile ≥ 104

19 deoarece consumul
cfu sunt considerate riscuri potenţiale

alimentelor cu acest nivel de contaminare poate conduce la toxiinfecţii alimentare.

I PLANURI DE PRELEVARE DE CLASA A DOUA

1. PROBA NESATISFĂCĂTOARE - LOT RESPINS
Exemplu: Inspecţia prezentei de Salmonella în legumele proaspete
A. Prezentarea planului de prelevare:
n = 5 = numărul unităţilor din proba;
m = 0 CFU in 25 g - conţinutul maxim admis de Salmonella pe unitate
c = 0 = numărul maxim de unităţi ale probei în care concentraţia de Salmonella este mai mare
decat
conţinutul maxim admis de Salmonella (m)
Rezultatele identificate în probă sunt urmatoarele:
n1 - conţinutul în Salmonella este X1 = Salmonella identificata
n2 - conţinutul în Salmonella este X2 = 0
n3 - conţinutul în Salmonella este X3 = 0
n4 - conţinutul în Salmonella este X4 = 0
n5 - conţinutul în Salmonella este X5 = 0

Exista o unitate în care Salmonella a fost identificată (de ex., a cărei concentraţie de Salmonella
este
mai mare decat conţinutul maxim admis m)

PROBA NESATISFĂCĂZOARE LOT RESPINS

Salmonella X2=0 X3=0 X4=0 X5=0

Prezenta
Plan de prelevare n = 5, m = 0 cfu/g, c = 0
X1≠ 0 → c ≠ 0 → PROBĂ NESATISFĂCĂTOARE → LOT RESPINS

2. PROBA SATISFĂCĂTOARE - LOT ACCEPTAT

Plan de prelevare n = 5, m = 0 cfu/g, c = 0
Rezultatele identificate în probă sunt urmatoarele:
n1 - conţinutul în Salmonella este X1 = 0
n2 - conţinutul în Salmonella este X2 = 0
n3 - conţinutul în Salmonella este X3 = 0
n4 - conţinutul în Salmonella este X4 = 0
n5 - conţinutul în Salmonella este X5 = 0

X1=0 X2=0 X3=0 X4=0 X5=0

Plan de prelevare: n=5, m= absent în 25 g, c=0 X concentratia de Salomonella în unitate

n = 5, m = 0 cfu/g, c = 0 → PROBĂ SATISFĂCĂTOARE → LOT ACCEPTAT

II PLAN DE PRELEVARE CLASA A TREIA

1. PROBĂ NESATISFĂCĂTOARE 19 - LOT RESPINS
Exemplu: Inspectia concentratiei de microorganisme aerobe mezofile in legumele proaspete
A. Prezentarea unui plan n = 5 = numărul de unităţi din proba, m = 106

CFU/g, M = 5 107
CFU/g c = 2
= numărul maxim permis de unităţi din proba a căror concentraţie de microorganisme aerobice
mezofile se află între m si M
B. Rezultatul inspectiei
Mărimile concentraţiei din probă sunt urmatoarele:
X1 = 2.107
m < x1 < M
X2 = 2.106
m < x2 < M
X3 = 2.107
m < x3 < M
X4 = 2.106

m < x4 < M

X5 = 2.106

m < x5 < M

Sunt 5 unitati ale probei a caror concentratie de microorganisme aerobe mezofile se afla intre m
si M,
această cifră este mai mare decât c (c = 2)

X1= 2.107
X2= 2.106

X3= 2.107

X4= 2.106

X5= 2.106

n=5, c=2, m = 106

CFU/g M= 5 107
CFU/g

m – conţinutul maximum admis, M - nivel de contaminare de risc pentru cele c=2 unităţi
c ≠ 2 c = 5 → probă nesatisfăcătoare →LOT RESPINS
19
2. PROBĂ SATISFĂCĂTOARE - LOT ACCEPTAT
Mărimile concentraţiei din probă sunt urmatoarele:
X1 = 2.107
m < x1 < M
X2 = 2.106
m < x2 < M
X3 = 2.105
x3 < m
X4 = 2.104
x4 < m
X5 = 2.103
x5 < m

daca nicio unitate nu indică o concentraţie mai mare decat M şi dacă numărul maxim de unităţi
din
proba a caror concentraţie se află între m şi M, este cel mult egal cu c.

X1= 2.107 X2= 2.106 X3= 2.105 X4= 2.104 X5= 2.103

n=5, c=2, m = 106 CFU/g M= 5 107 CFU/g → probă satisfăcătoare → lot acceptat
3. LOT RESPINS

X1= 6.107
X2= 105

X3= 2.105

X4= 2.104

X5= 2.103

Plan de prelevare n=5, c=2, m = 106

CFU/g M= 5 107
CFU/g

X1 = 6.107
x1 > M
X2 = 105
x2 < m
X3 = 2.105
x3 < m → probă nesatisfăcătoare → LOT RESPINS
X4 = 2.104
x4 < m
X5 = 2.103
x5 < m 19

Parametrii microbiologici pentru apa comercializată în sticle sau alte recipiente

Nr.
crt
Parametru Valoare maximă
admisă

Metoda de
analiză
1 Bacterii coliforme şi Escherichia coli (E.coli) 0/250 ml ISO 9308-1
2 Enterococi 0/250 ml ISO 7899-2
3 Pseudomonas aeruginosa 0/250 ml EN ISO 12780
4 Număr de colonii la 22° C 100/ml EN ISO 6222
5 Număr de colonii la 37° C 20/ml EN ISO 6222
6 Clostridium perfringens (specia, inclusiv sporii)
Acest parametru trebuie monitorizat atunci când
sursa de apa este de suprafata sau mixtă, iar în
situaţia în care este decelat trebuie investigata şi
prezenta altor microorganisme patogene, ca de
ex.: criptosporidium

0/100ml u

Interpretarea rezultatelor testului

Limitele stabilite conform R (CE) 2073/2005 se referă la fiecare unitate de probă testată
Rezultatele
testelor demonstrează calitatea microbiologică a lotului testat.
L. monocytogenes în produsele alimentare gata pentru consum care permit dezvoltarea de L.
monocytogenes înainte ca produsul alimentar să fi părăsit controlul imediat al operatorului din
sectorul
alimentar care l-a produs, în cazul în care acesta nu este în măsură să demonstreze că produsul nu
va
depăși limita de 100 ufc/g în timpul perioadei de conservare:
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate indică absenţa bacteriei;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care prezenţa bacteriei este detectată în oricare dintre unităţile de
probă.
L. monocytogenes în alte produse alimentare gata pentru consum
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ limita;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care oricare dintre valori este > limita.
Salmonella în diferite categorii de produse alimentare:
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate indică absenţa bacteriei;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care prezenţa bacteriei este detectată în oricare dintre unităţile de
probă.
E. coli în legumele și fructele tăiate anterior (gata pentru consum) și în sucurile de fructe și
legume 19
nepasteurizate (gata pentru consum):
— satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate sunt ≤ m;
— acceptabile, în cazul în care un punct maxim al valorilor c/n se situează între m și M, iar restul
valorilor observate sunt ≤ m;
— nesatisfăcătoare, în cazul în care una sau mai multe dintre valorile observate sunt > M sau mai
mult
de c/n valori sunt între m și M.
Pentru apa minerală şi apa de izvor
Conformitatea probelor de apă minerală naturala şi apa de izvor este stabilită în art. 12 şi 13 din
H.G.
nr. 1.020/2005 pentru aprobarea Normelor tehnice de exploatare şi comercializare a apelor
minerale
naturale
Pentru apa potabilă

Conformitatea apei potabile este stabilită în anexa nr. 1 a Legii nr. 458 /2002 privind calitatea
apei
potabile, cu modificările şi completările ulterioare.

Tabel

Teste de sanitaţie: Parametrii Valori acceptate

Suprafeţe de lucru care vin
în contact cu produsul
alimentar

Număr total de germeni (NTG)

Bacterii coliforme

2/cm2
Absent/10 cm2
Se acceptă NTG = 20/cm2, daca
bacteriile coliforme sunt absente pe
10 cm2

Ustensile, recipiente Număr total de germeni (NTG)

Bacterii coliforme

10/ml lichid de spălare

-

Utilaje Număr total de germeni (NTG)

Bacterii coliforme
19
2/cm2 (pt. aparate 1/cm2)
Absent/10 cm2
Se acceptă NTG = 20/cm2, dacă
bacteriile coliforme sunt absente pe
10 cm2
Echipamente de protecţie Număr total de germeni (NTG)

Bacterii coliforme

2/cm2
Absent/10 cm2
Se acceptă NTG = 20/cm2, dacă
bacteriile coliforme sunt absente pe
10 cm2

Mâini Enterobacteriaceae
Stafilococ coagulazo-pozitiv

absent
absent

Aeromicrofloră Număr total de germeni (NTG)

Numărul total de drojdii şi mucegaiuri

600/m3
300/m3

Recipienţi de sticlă, metal,

material plastic inclusiv
capace, capse

Număr total de germeni (NTG)

Bacterii coliforme

10/ml lichid de spălare

-

Ambalaje polietilenă,
polistiren

Număr total de germeni (NTG)

Bacterii coliforme
Numărul total de drojdii şi mucegaiuri

1/cm2 19
3/cm2
Absent

Rezultatele care indică valori mai mari decât limitele menţionate în tabelul de mai sus sunt
considerate nesatisfăcătoare şi pot semnifica:
- cerinţe preliminare neimplementate (absenţa unei proceduri/instrucţiuni de igienizare
documentate);

- operaţiuni ineficiente/necorespunzătoare de curăţenie, igienizare, dezinfecţie în cadrul

procedurii de
igienizare şi a planului propriu de igienă, aparţinând sistemului propriu de autoverificare bazat pe
principiile HACCP;
- personal insuficient instruit pentru aplicarea instrucţiunilor de curăţenie/igienizare;
- evidenţe neconforme/lipsa înregistrărilor privind controlul temperaturii
- nerespectarea diluţiilor/concentraţiilor recomandate pentru substanţele de curăţenie;
- contaminări încrucişate sau intersecţii ale unor faze salubre cu cele insalubre în cadrul
circuitelor
funcţionale (de ex. atingeri ale circuitului ambalajelor cu cel al deşeurilor);
- condiţii funcţionale necorespunzătoare (de ex. ventilaţia insuficientă în depozite, în cazul unor
rezultate necorespunzătoare ale microaeroflorei etc.);
- manipulare, întreţinere şi/sau depozitare necorespunzătoare a produselor alimentare,
ambalajelor,
deşeurilor etc.

Rezultatul neconform va fi adus la cunoştinţa ODA în 48 ore de la data primirii buletinului de

analiză
în cadrul unui control oficial efectuat de inspectorii desemnaţi din cadrul DSVSA, în cadrul
căruia se
vor analiza cauzele posibile ale apariţiei neconformităţii şi, după caz, se vor stabili termene de
remediere, sancţiuni şi/sau prelevarea oficială a acelor probe pentru care testele au fost
necorespunzătoare, precum şi a altor teste, în funcţie de cerinţe, însoţită de o notă justificativă în
care se
precizează motivaţia recoltării acestora în afara frecvenţei stabilite prin program.
Masuri in caz de neconformitate a probelor
Măsuri luate de ANSVSA
În cazul în care testele pe baza criteriilor de siguranţă a produselor alimentare dau rezultate
nesatisfăcătoare, ANSVSA solicită OIA să iniţieze procedurile de retragere /rechemare a
produselor
neconforme, aşa cum prevede cu articolul 19 al Regulamentului (CE) nr. 178/2002.
Atunci cand rezultatul testului microbiologic este neconform cu criteriul de siguranţa alimentelor
se
notifică imediat prin sistemul rapid de alerta pentru alimente si furaje (SRAAF) cu respectarea
procedurilor SRAAF.
În cazul unor rezultate nesatisfăcătoare cu privire la criteriile de igienă a procesului trebuie luate
măsuri
de imbunătăţire a igienei producţiei,19 precum şi a selecţiei şi/sau a originii materiilor prime.
Măsuri luate de OIA

Dacă nu sunt îndeplinite criiteriile microbiologice pentru produse alimentare, OIA nu pune pe
piaţă
alimentul şi/sau iniţiază procedurile de retragere/rechemare a produselor neconforme aşa cum
prevede
articolul 19 al Regulamentului (CE) nr. 178/2002.
Procedurile bazate pe principiile HACCP si/sau procedurile de management al sigurantei
alimentelor
trebuie de asemenea revizuite pentru a oferi siguranţa că produsele vor fi conforme in viitor.
Dacă un criteriu de proces este depăşit, aceasta conduce la o revizuire a procedurilor curente
pentru a
îmbunătăţii igiena producţiei.
Operatorii din sectorul alimentar trebuie să analizeze evoluţia rezultatelor testelor. În cazul în
care se
constată o evoluţie spre rezultate nesatisfăcătoare, operatorii din sectorul alimentar iau măsuri
adecvate,
fără întârzieri nejustificate, pentru a remedia situaţia în vederea prevenirii apariţiei riscurilor
microbiologice.

5. RESPONSABILITĂŢI
5.1. Responsabilităţile ANSVSA
- Pregătirea prelevării,
- Prelevarea probelor,
- Transportul probelor,
- Completarea Procesului verbal de prelevare şi a Cererii de analiză, a etichetei probei
- Păstrarea înregistrărilor (Procesului verbal de prelevare şi a Cererii de analiză, Buletin de
analiză)
conform legislaţiei în vigoare,
- Acţiunile intreprinse în cazul neconformităţilor, păstrarea înregistrărilor acestora

5.2. Responsabilităţile laboratorului

- Recepţionarea probelor,
- Păstrarea probelor,
- Introducerea în lucru în cel mai scurt timp posibil, a probelor prelevate în vederea testării
microbiologice, cu precizarea că intervalul maxim este de 24 ore de la momentul primirii,
respectiv
maximum 48 ore din momentul prelevării lor,

- Păstrarea înregistrărilor (Procesului verbal de prelevare şi a Cererii de analiză , Buletin de

analiză) conform legislaţiei în vigoare,
- Orice alte acţiuni intreprinse în conformitate cu procedurile de lucru ale laboratorului
(denaturarea
probelor, neanalizarea lor, etc.) sunt comunicate inspectorului oficial, acesta informând la rândul
său
OIA. 19

5.3. Responsabilităţile OIA

- Asigură condiţii optime pentru desfăşurarea controlului oficial respectiv acţiunea de prelevare
de probe,
- Asigură prezenţa unui reprezentant pe durata desfăşurării controlului oficial /prelevării
probelor,
- Păstrează proba pentru opinie suplimentară (dacă aceasta a fost prelevată) în condiţiile
specificate în Procesul-verbal,
- În cazul unor rezultate nesatisfăcătoare iniţiază proceduri de retragere /rechemare a produselor
neconforme.

6. ÎNREGISTRĂRI/FORMULARE APLICABILE
Proces verbal de prelevare - Formular conform ordinului 145/2007
Cerere analiză - Formular conform ordinului 145/2007
Eticheta
Metabolismul microbian este dependent de numeroşi factori fizico-chimici
şi biologici ceea ce a condus în cursul evoluţiei lor la adaptări specifice prin
stabilirea de interrelaţii între microorganisme şi mediu.

Celula microbiană, datorită masei sale reduse, este puternic influenţată de

condiţiile mediului ambiant şi reacţionează foarte rapid la diferiţi factori, fie
prin adaptare, fie prin dispariţie.

Pentru a stabili care este nivelul maxim şi minim al factorilor de mediu,

până la care celulele se pot adapta şi la ce valori ale fiecărui factor sunt
distruse celulele, este necesară supunerea microorganismelor în condiţii
diferite de mediu, variind separat fiecare factor în parte.

Datoriă faptului că microorganismele cresc în medii foarte

diferite, este dificil să se facă o prezentare a tuturor factorilor:

extrinseci (dependenţi de condiţiile mediului ambiant)

intrinseci (dependenţi de natura mediului)

impliciţi (dependenţi de interrelaţiile ce se stabilesc între

microorganismele prezente în acelaşi mediu).

Influenţa temperaturii

Desfăşurarea reacţiilor metabolice este dependentă de temperatura

mediului cu cele trei coordonate ale sale: temperatura minimă, optimă şi
maximă.

Sensibilitatea microorganismelor la o anumită temperatură este

20
determinată de sensibilitatea enzimelor, membranelor sau a ribozomilor.

Temperatura minimă - este nivelul termic cel mai scăzut până la care
creşterea microorganismului studiat mai poate fi observată.

Temperatura optimă - este nivelul termic la care reproducerea celulară este

cea mai rapidă.

Factorii extrinseci care pot influenţa metabolismul microorganismelor

Optimul pentru creşterea microorganismelor este corelat cu

temperatura habitatului normal al microorganismului. Aşa de
exemplu, temperatura optimă de creştere a microorganismelor
patogene pentru om este temperatura sângelui uman (35-37˚C).

Temperatura maximă este nivelul termic cel mai ridicat până la

care creşterea microorganismului studiat mai poate fi observată.

Microorganismele pot fi grupate în trei categorii, în funcţie de

temperatura optimă de dezvoltare şi anume:

microorganisme psihrofile: cresc la 0˚C, au o activitate maximă la

10-15˚C, temperatura maximă suportată fiind de 20˚C;

microorganisme mezofile: temperatura minimă de dezvoltare este

10-15˚C, temperatura optimă este de 20-45˚C, temperatura maximă fiind
mai mare de 45˚C;

microorganisme termofile: optimul activităţii lor este la 45-65˚C,

temperatura maximă de dezvoltare este de 90˚C, fără a rezista mult timp
la acţiunea temperaturilor scăzute.

Microorganism mezofil

Pentru a testa influenţa temperaturii asupra microorganismelor, culturile

pure dezvoltate în mediu lichid sunt menţinute un timp la temperatura a cărei
influenţă dorim să o testăm.

Se fac notări zilnice asupra:

gradului de creştere al culturii: turbiditate accentuată, sediment

abundent, apariţia unor formaţiuni de suprafaţă specifice (inel, peliculă);

activităţii fiziologice a celulelor (ex. fermentarea zaharurilor).

20 poate face transferul culturii pe

La sfârşitul perioadei de incubare se
medii solide pentru a stabili dacă celulele şi-au păstrat viabilitatea. Unele
microorganisme, numite termorezistente pot supravieţui, un anumit timp, în
medii cu temperaturi ridicate, datorită rezistenţei endosporilor. Aceste
microorganisme pot fi utilizate pentru controlul sterilizării prin căldură.
Metoda de lucru

Materiale utilizate:

culturi pure de Escherichia coli, Bacillus stearothermophylus;

mediu agar nutritiv cu 0,02 % MnCl2 x 4 H2O (clorură de mangan tetrahidrat).

Tehnica de lucru:

se transferă aseptic câte 1 ml suspensie microbiană în tuburi cu mediu lichid

(9 ml în fiecare tub);

se incubează tuburile la 4˚C, 23-25˚C, 60˚C şi 85 sau 100˚C (de obicei se

incubează câte două tuburi pentru fiecare temperatură);

după 15 minute de incubare a tuburilor la temperaturile amintite se fac

însămânţări pe mediu solid înclinat;

incubarea se face la 35˚C, timp de 24 - 48 ore.

Atunci când se constată o dezvoltare abundentă a

microorganismelor, înainte de însămânţare se fac diluţii seriale
astfel:

se transferă aseptic 0,1 ml din diluţia 10-1 în 9,9 ml apă distilată

obţinând astfel diluţia 10-2;

se amestecă energic şi se transferă 0,1 ml din diluţia 10-2 în 9,9

ml apă distilată obţinând astfel diluţia 10-3.

Din aceste diluţii se fac însămânţări pe mediu nutritiv înclinat.

Interpretarea rezultatelor:

- reacţie pozitivă: pe mediu de cultură se dezvoltă colonii

- reacţie negativă: absenţa coloniilor pe mediu de cultură

20
Influenţa pH-ului

pH-ul mediului de cultură afectează metabolismul microorganismelor

influenţând activitatea enzimelor, în special a celor implicate în biosinteză şi creştere.
Fiecare specie microbiană are un pH definit ca interval de creştere şi un pH
distinct ca optim al creşterii.

Microorganismele pot fi grupate în trei categorii, în funcţie de pH-ul la care

activitatea fiziologică este cea mai intensă:

acidofile care au optimul creşterii la pH = 1- 5,5 (ex. Acidobacterium,

Leptospirillum, Picrophilus, Ferroplasma)

neutrofile care au optimul creşterii la pH = 5,5 – 8 (ex. Escherichia coli,

Staphylococcus, Salmonella)

alcalofile care au optimul creşterii la pH = 8,5 - 11,5 (ex. Bacillus, Micrococcus,

Pseudomonas, Streptomyces)

În general grupele de microorganisme au un pH optim

caracteristic. Majoritatea bacteriilor şi protozoarelor sunt
neutrofile, ciupercile se dezvoltă în mediu acid la pH = 4-6,
algele fiind favorizate de aciditate.

Multe bacterii produc acizi metabolici al căror pH scăzut

poate inhiba creşterea. Pentru aceasta se utilizează soluţii tampon
care produc un echilibru al pH-ului atunci când sunt adăugate în
mediul de cultură pentru a neutraliza aceşti acizi. Exemplu:
peptonele în mediile complexe au efectul soluţiilor tampon.

Metoda de lucru

Materiale utilizate:

- culturi pure de Escherichia coli şi Saccharomyces

cerevisiae

- tuburi cu soluţie salină şi pH diferit (3; 5; 7; 9)

Tehnica de lucru:

- se suspendă 0,1 ml din suspensia microbiană în soluţie

salină distribuită în tuburi;

20 la 35˚C pentru
- incubarea se face timp de 24-48 ore
Escherichia coli şi la 25˚C pentru Saccharomyces cerevisiae.

Interpretarea rezultatelor:

- se stabileşte prin nefelometrie gradul de dezvoltare al culturii la o lungime de

undă λ = 550 - 600 nm;

- se calibrează nefelometrul cu mediu neinoculat pentru fiecare valoare pH;

- se umple apoi fiecare recipient cu 2/3 din fiecare suspensie microbiană şi se

citeşte absorbanţa.

În funcţie de turbiditatea mediului pe baza unei scale, se stabileşte la ce valoare pH

s-au dezvoltat cel mai bine germenii studiaţi.

În cazul microorganismelor cu creştere omogenă (ex. Saccharomyces cerevisiae),

se poate face înregistrarea vizuală a rezultatelor notându-se:

+, ++, +++, ++++ în cazul dezvoltării culturii

în cazul în care germenii nu s-au dezvoltat

Influenţa presiunii osmotice

Microorganismele sunt separate de mediul lor de membrana plasmatică

selectiv permeabilă şi afectată de schimbările presiunii osmotice celulare.

Presiunea osmotică este forţa dezvoltată când două soluţii de concentraţii

diferite sunt separate de o membrană permeabilă numai pentru solvent.

Solventul este lichidul care dizolvă substanţa (solutul).

În soluţiile hipotonice (solut puţin - solvent în cantitate mare) apa poate să

intre în celulă cauzând umflarea acesteia.

Multe microorganisme au membrana celulară rigidă astfel că celulele îşi

menţin integritatea în soluţii hipotonice.

În soluţii hipertonice (solut în cantitate mare - solvent în cantitate mică) apa

intracelulară va părăsi celula prin membrana plasmatică, proces cunoscut ca
plasmoliză.

Această deshidratare afectează creşterea.

20
Bacteriile halofile (ex. Vibrio parahaemolyticus) sunt tolerate în soluţii
concentrate. Aceste bacterii capabile să trăiască în medii cu salinitate foarte
mare sunt numite halofile extreme (Halophilic archaea) pentru a le distinge de
halofilele moderate (ex. Halomonas smyrnensis) care trăiesc în mare.
În soluţii izotonice concentraţia solutului este aceeşi în interiorul şi
exteriorul celulei. Celula este în echilibru osmotic şi nu îşi modifică volumul.

Metodă de lucru

Materiale utilizate:

culturi pure de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Holobacterium salinarum;

5 plăci cu mediu de cultură solid cu concentraţii diferite de săruri.

Tehnica de lucru:

fiecare placă Petri se împarte cu creionul de scris pe sticlă în trei zone;

în fiecare placă se însămânţează cele trei culturi amintite;

se incubează timp de 48 ore la 35˚C.

Interpretarea rezultatelor:

Se notează cu “+, ++, +++, ++++” în cazul în care au crescut colonii şi cu “ -“

dacă nu s-au dezvoltat colonii pe suprafaţa mediului.

Influenţa umidității

Unele microorganisme pot să reziste o perioadă lungă în medii cu umiditate foarte

scăzută (medii uscate) în timp ce altele mor rapid în aceste medii.

Microorganismele care pot rezista la uscăciune îşi menţin viabilitatea fără a creşte.
Pe aceasta se bazează păstrarea culturilor prin uscare şi uscarea sub vacuum prin
îngheţare (liofilizare).

În microbiologia medicală această particularitate a microorganismelor de a rezista

în condiţii de umiditate scăzută este foarte importantă deoarece multe microorganisme
capabile să producă boli infecţioase pot să supravieţuiască în medii uscate.

Exemplu: Staphylococcus aureus poate rezista în aerul uscat fiind astfel extrem de
20
periculos pentru pacienţi sau personalul medical.

Metodă de lucru

Materiale utilizate:
5 plăci Petri pentru fiecare microorganism studiat

5 lamele pentru fiecare microorganism testat

mediu de cultură solid (agar, geloză nutritivă) distribuite în

tuburi

anse, pense sterile

Tehnica de lucru:

se aşează într-o placă Petri câte 5 lamele pe care se depune cu ansa suspensia
microbiană sau un fragment de colonie ce aparţine germenului testat;

se acoperă plăcile şi se menţin la temperatura camerei;

după ce suspensia microbiană s-a uscat pe lamele, se transferă cu o pensă sterilă o

lamelă cu suspensie uscată într-o nouă placă Petri;

se încălzeşte un tub cu mediu solid până la lichefierea acestuia;

se distribuie mediul în placa Petri rotind uşor placa astfel încât mediul să fie uniform
repartizat şi lamela cu suspensie să rămână în poziţie centrală;

se acoperă placa şi se incubează cu capacul în sus la temperatura camerei sau la

temperatura optimă a germenului studiat;

se procedează în mod asemănător cu celelalte patru lamele, transferul realizându-se la

fiecare trei zile.

Interpretarea rezultatelor:

se notează dacă pe mediul de cultură s-au dezvoltat sau nu

colonii. Apariţia coloniilor denotă rezistenţa
microorganismului studiat la umiditate foarte scăzută.

Influenţa radiațiilor ultraviolete

Radiaţia ultravioletă este letală pentru majoritatea microorganismelor. Efectul letal al

radiaţiei UV depinde de lungimea ei de undă. Radiaţia cu lungimea de undă 260 nm
(2600Å) are activitatea microbicidă 20cea mai mare datorită faptului că ADN-ul izolat are
maximul de absorţie la aceeaşi lungime de undă.

Efectul letal al radiaţiilor UV se stabileşte prin calcularea procentului de viabilitate al

celulelor expuse la acest tip de radiaţii.
Metoda de lucru

Materiale utilizate:

culturi de 24 ore de Staphylococcus aureus dezvoltate în mediu lichid;

pipete de 1 şi 10 ml;

25 plăci Petri cu mediu solid;

alcool etilic;

centrifugă, lampă UV şi ochelari de protecţie.

tehnica de lucru:

se centrifughează 10 ml cultură de Staphylococcus aureus la 1200 rpm timp de trei

minute;

supernatantul se îndepărtează şi peste cultură se adaugă 10 ml soluţie salină sterilă,

agitând energic;

suspensia salină de Staphylococcus aureus se recentrifughează la 1200 rpm pentru trei

minute;

se îndepărtează supernatantul şi se spală încă o dată cultura bacteriană cu 10 ml soluţie

salină sterilă urmată de recentrifugarea la 1200 rpm, timp de trei minute;

0,1 ml din această suspensie se adaugă peste 9,9 ml soluţie salină martor obţinând
diluţia 10-1;

se continuă diluarea probei până la 10-10;

0,1 ml din diluţiile 10-5-10-10 se însămânţează pe mediu solid;

suspensia microbiană rămasă din fiecare diluţie se depune în plăci Petri care se expun
fără capac, la o distanţă de 15 cm faţă de sursa UV;

după fiecare minut de expunere se iau 0,1 ml din fiecare suspensie iradiată şi
se fac însămânţări pe mediu de cultură;
20
plăcile însămânţate se incubează timp de 24 ore la 35˚C;

se determină unităţile formatoare de colonii din fiecare placă, înainte şi după

iradiere, luându-se în considerare numai plăcile pe care s-au dezvoltat între 25
şi 250 colonii;
se determină procentul de celule moarte.

Influenţa substanțelor antiseptice și dezinfectante asupra

microorganismelor

Pentru evaluarea eficaciţăţii substanţelor chimice utilizate ca antiseptice

sau dezinfectante s-au descris mai multe metode precum: metoda determinării
indicelui fenolic, metoda cu hârtie de filtru uscată, metoda plăcilor cu agar,
metoda cupelor în agar.

Metoda determinării coeficientului sau indicelui fenolic

Coeficientul fenolic poate fi definit ca raportul între activitatea bactericidă

a unei substanţe antiseptice date şi activitatea bactericidă a fenolului.

Tehnica de lucru:

se pregătesc trei serii a câte 3-5 eprubete fiecare;

atunci când se urmăreşte modificarea compoziţiei mediului prin fermentarea

unor glucide, se distribuie câte un tub de fermentaţie în fiecare eprubetă;

se distribuie câte 10 ml mediu în fiecare eprubetă şi se sterilizează prin

autoclavare;

în prima serie de eprubete se adaugă 10 ml probă (se poate utiliza diluţia 10-1 în
cazul probelor concentrate);

în seria a doua de eprubete, peste cei 10 ml mediu se adaugă 1 ml probă sau din
diluţia 10-1;

în seria a treia de eprubete se adaugă 0,1 ml din proba de analizat sau din diluţia
10-1;

se incubează eprubetele astfel pregătite la temperatura optimă de dezvoltare a

germenilor studiaţi, pentru 24 - 48 ore.

Interpretarea rezultatelor:

20
- se notează în câte eprubete din fiecare serie s-au produs modificări ale
mediului de cultură;

- se stabileşte numărul caracteristic pe baza celor trei cifre notate la seriile de

eprubete;
- se stabileşte numărul de germeni pe baza tabelului Mac Cready.

Atunci când probele ce se analizează sunt foarte bogate în germeni microbieni,

se fac diluţii zecimale de până la 10-4 - 10-5 şi din fiecare diluţie se fac însămânţări în
câte trei eprubete.

Se notează apoi, după incubare, în câte eprubete ale seriei s-au produs
modificări. Se vor lua în calcul trei diluţii succesive. Prima diluţie care se ia în calcul
este diluţia în care nu sunt toate eprubetele pozitive (nu s-au produs modificări în
toate eprubetele). Se stabileşte numărul caracteristic pe baza celor trei cifre
caracteristice notate la diluţiile succesive.

Materiale utilizate:

culturi pure (test) de Staphylococcus aureus sau Salmonella typhi, în

cultură de 24 ore, cu o rezistenţă la fenol 1:90;

cultura ce se testează;

fenol diluat 5 %;

ansă cu diametrul interior de 4 mm;

20 tuburi cu mediu de cultură bulion nutritiv.

Tehnica de lucru:

se determină coeficientul de inhibiţie al substanţei care se testează (se însămânţează

tulpina ce se testează în soluţii cu diferite concentraţii de substanţă şi se notează la
ce concentraţie nu se mai dezvoltă cultura);

se pregătesc cinci diluţii în apă distilată din substanţa de testat, cea mai mică diluţie
fiind sub coeficientul de inhibiţie determinat anterior;

se pregătesc cinci diluţii fenol 5% în apă distilată;

se aşează pe un rând al stativului, cele cinci tuburi cu diluţiile substanţei de testat, în

fiecare tub fiind câte 5 ml dezinfectant;

pe alte patru rânduri ale stativului se aşează câte 5 tuburi, fiecare tub conţinând 5 ml
mediu lichid; 20

se însămânţează primul tub din seria diluţiilor de dezinfectant cu 0,2 ml suspensie

bacteriană, al doilea tub fiind însămânţat la 30" după primul tub;
după ce toate tuburile cu dezinfectant au fost însămânţate cu suspensia bacteriană, din
primul tub se face transferul cu o ansă calibrată (diametrul interior al buclei ansei trebuie
să fie de 4 mm) în primul tub cu mediu lichid, fără dezinfectant;

tubul al doilea cu mediu lichid se însămânţează după 30" cu o ansă din diluţia următoare
(tubul al doilea cu dezinfectant şi cultură microbiană);

se continuă operaţia însămânţând pe rând tuburile cu mediu lichid cu câte o ansă din
tuburile cu dezinfectant şi cultură microbiană, intervalul între inocularea tuburilor fiind de
30";

ultimul tub cu mediu lichid va fi însămânţat după 12 minute de contact al dezinfectantului

cu suspensia microbiană;

se procedează în acelaşi mod şi cu diluţiile de fenol, însămânţările fiind efectuate la

aceleaşi intervale de timp;

se incubează tuburile însămânţate la temperatura de 37˚C, pentru 48 ore notându-se cu

“+” tuburile în care s-a dezvoltat cultura şi cu “-“ tuburile în care nu s-a dezvoltat cultura
microbiană.

Calculul coeficientului fenolic

Coeficientul fenolic se calculează prin raportarea diluţiilor de dezinfectant

în care cultura însămânţată după 2'30" şi după 5' s-a mai dezvoltat. Se notează
la ce diluţie a fenolului s-a dezvoltat cultura însămânţată după 2'30" şi după 5'.

Se face raportul celor două diluţii, valoarea aflată reprezentând indicele

sau coeficientul fenolic. Acesta exprimă de câte ori substanţa respectivă este
mai activă sau mai puţin activă decât fenolul.

Efectul agenților antimicrobieni

Antibioticele sunt substanţe chimice sintetizate de unele specii de bacterii,

actinomicete şi ciuperci microscopice, în cursul activităţii lor biologice. În
soluţii foarte diluate, antibioticele pot împiedica multiplicarea altor
microorganisme sau pot avea chiar efect microbicid.

Antibioticele au acţiune selectivă. Spre deosebire de antiseptici şi

21 în acelaşi mod asupra oricărui
dezinfectanţi care îşi exercită efectul
microorganism, fiecare antibiotic are un spectru caracteristic de activitate.

În funcţie de concentraţie şi de durata perioadei de contact, un antibiotic

poate exercita un efect bacteriostatic sau bactericid asupra unei tulpini
bacteriene.
Evidenţierea sensibilităţii unui microorganism la acţiunea antibioticelor se
face prin antibiogramă.

În cazul microorganismelor patogene, este absolut obligatorie efectuarea

antibiogramei înainte de administrarea unui antibiotic.

Testarea antibioticelor se face la început cu ajutorul tehnicilor calitative. În acest

scop, germenul testat este pus în contact cu mai multe antibiotice.

Se notează care sunt antibioticele la care germenul este cel mai sensibil
stabilindu-se astfel spectrul de sensibilitate al germenului studiat.

Pentru a stabili gradul de sensibilitate la acţiunea antibioticelor testate, se

utilizează doze diferite de antibiotic. Se stabileşte astfel CMI (concentraţia minimă
inhibitoare), reprezentată de cea mai mică concentraţie de antibiotic care inhibă
dezvoltarea germenilor.

Stabilirea spectrului de sensibilitate al germenilor studiaţi se realizează prin

metode difuzimetrice.

Se pot testa simultan 12 antibiotice sau se poate testa eficacitatea unui singur
antibiotic, faţă de mai mulţi germeni.

Tehnica microcomprimatelor cu antibiotic

Principiul metodei: antibioticele, care sunt impregnate în cantităţi

cunoscute în discuri speciale, difuzează în mediul solid însămânţat cu
germenul a cărui sensibilitate se testează.

Eficacitatea antibioticelor testate se face prin măsurarea zonei de inhibiţie

a creşterii în jurul discurilor.

Având în vedere faptul că anumiţi factori (compoziţia mediului, vârsta

celulelor, cantitatea de inocul) ar putea influenţa diametrul zonei de inhibiţie
din jurul discurilor, s-a realizat standardizarea condiţiilor în care se realizează
antibiograma.

Materiale utilizate:

mediul Muller-Hington sau geloză21 peptonată. Atunci când mediul se

prepară în laborator, concentraţia agarului trebuie să fie de 1,5 -1,7 %, cu
un pH = 7,2-7,4, grosimea mediului în placă 4 mm şi suprafaţa mediului să
fie uscată;

culturi bacteriene ce urmează a fi testate;

discuri cu antibiotic. Se pot procura fie anumite antibiotice, fie truse
speciale care conţin mai multe antibiotice;

plăci Petri;

pensă;

pipete Pasteur.

Truse de antibiotice

Tehnica de lucru:

mediul sterilizat prin autoclavare se distribuie în plăci Petri urmărind ca prin

solidificare să se realizeze o suprafaţă perfect plană;

se usucă suprafaţa mediului prin introducerea plăcilor la termostat timp de 15 -20

minute, la 37˚C;

germenul ce se testează se va însămânţa cu ajutorul pipetei realizând diseminarea

pe suprafaţa mediului cu ajutorul spatulei Drigalski sau a unei baghete în formă
de “L” (însămânţare tip gazon). Dacă pe suprafaţa mediului a fost depusă o
cantitate mai mare de suspensie microbiană, excesul se preia cu o pipetă Pasteur;

se termostatează plăcile la 37˚C pentru a se realiza uscarea suprafeţei mediului;

se plasează cu ajutorul unei pense sterile discurile de antibiotic urmărind să se

realizeze o echidistanţă între discuri şi între discuri şi marginea plăcii;

incubarea se face la 37˚C timp de 18-24 ore, plăcile fiind menţinute cu capacul în
sus.

Pentru a stabili corect eficacitatea antibioticelor, este necesar

ca tulpinile testate să se afle în faza de creştere staţionară. Atunci
când celulele sunt în faza de creştere logaritmică, sensibilitatea
germenilor este mai mică în timp ce celulele aflate în faza de
declin sunt mai rezistente la acţiunea antibioticelor.

Interpretarea rezultatelor: 21

se măsoară cu ajutorul riglei diametrul zonei de inhibiţie şi pe

baza datelor standardizate se stabileşte dacă germenul testat
este rezistent, intermediar sau sensibil la acţiunea
antibioticului respectiv.
Tehnica
microcomprimatelor

Interpretarea zonelor de inhibiţie a

culturilor test

Atunci când în zona de inhibiţie apar colonii considerate ca

rezistente, se va lua în calcul numai zona în care nu au apărut colonii.

La germenii din genul Staphylococcus, care produc penicilinază se

recomandă să se facă în paralel şi o testare a sensibilităţii faţă de
penicilină cu o cultură diluată 1/10, care să producă pe placă o creştere
în pânză. Cantitatea de penicilinază produsă de inoculul dens fiind mai
mare vor apărea pe placă şi colonii rezistente.

Metoda microcomprimatelor nu se aplică microorganismelor care

au creştere lentă sau în cazul antibioticelor care difuzează lent în
mediul de cultură agarizat.

Tehnica benzilor de hârtie de filtru

Este o metodă difuzimetrică ce permite examinarea sensibilităţii mai

multor tulpini bacteriene faţă de un antibiotic.

După solidificarea şi uscarea mediului de cultură distribuit în plăci Petri,

se însămânţează germenii în linii paralele şi apoi se aplică banda îmbibată cu
antibiotic, la mijlocul plăcii, perpendicular pe liniile de însămânţare.

Interpretarea se face în funcţie de mărimea zonei de inhibiţie a culturilor

pe liniile de însămânţare, după o incubare de 20-24 ore de la însămânţare.

Metoda diluţiilor

Se poate executa în medii lichide sau solide. Indiferent de metodă, se prepară în

prealabil soluţii stoc (cu 1000 sau 1280 µg/ml antibiotic) din substanţele ce se găsesc
în comerţ, sub formă de pulberi. Pentru aceasta, se dizolvă antibioticul în diferiţi
solvenţi (soluţii tampon, apă), în funcţie de antibiotic şi se conservă la temperaturi
joase (-20˚C) până la 6 luni.
21
În practică, metoda diluţiilor se execută în medii lichide, fiind recomandat
mediul Muller-Hington, iar pentru unele bacterii, mediul cord sau bulion.

Tehnica de lucru:
se fac diluţii seriale din soluţia stoc de antibiotic;

în fiecare tub cu antibiotic se repartizează câte 0,1 ml din cultura de 20 ore diluată
10-3 în cazul stafilococilor şi al enterobacteriaceelor şi 10-2 în cazul streptococilor;

se incubează tuburile la 37˚C pentru 24 ore.

Interpretarea rezultatelor:

- se stabileşte sensibilitatea bacteriei faţă de antibiotic prin CMI, adică

prin concentraţia minimă de antibiotic, în micrograme, care inhibă dezvoltarea
bacteriei, ceea ce corespunde cu ultimul tub în care bacteria nu s-a dezvoltat
(mediul rămâne limpede);

- se stabileşte CMB (concentraţia minimă bactericidă), după determinarea

CMI prin metoda diluţiilor, se fac transplantări pe medii fără antibiotic, din
prima diluţie care prezintă turbiditate şi din tuburile fără creştere vizibilă. Se
notează până la ce concentraţie de antibiotic a fost posibilă dezvoltarea
bacteriei.

Metoda diluţiilor este recomandată în special pentru bacteriile anaerobe.

Un obiectiv important al laboratoarelor de microbiologie, în special a

laboratoarelor clinice sau de cercetare, este păstrarea culturilor de
microorganisme sub formă de colecţii de culturi.

Conservarea culturilor de microorganisme se face din următoarele

considerente:

controlul identificării unui germen izolat prin compararea sa cu un germen

de referinţă procurat dintr-o colecţie de culturi

efectuarea unor cercetări complementare asupra germenului izolat, cercetări

care necesită mult timp, astfel încât germenul trebuie păstrat în cultură pură

în industria alimentară este absolut necesară păstrarea microorganismelor

cu care se fac inoculări în vederea obţinerii unor produse alimentare de
fermentaţie (ex. păstrarea culturilor de bacterii lactice pentru inocularea
laptelui şi obţinerea de iaurt)
21
păstrarea tulpinilor etalon-internaţional, utilizate pentru diferite dozaje
microbiologice (determinarea coeficientului fenolic)

Condiţiile conservării microorganismelor

păstrarea culturilor conservate în stare viabilă, în condiţii puţin favorabile
multiplicării celulelor, la temperatură scăzută (4-22˚C), în medii vâscoase,
sărace în substanţe nutritive, păstrate în lipsa oxigenului

evitarea acţiunii nocive a luminii, care ar produce degenerarea sau

omorârea celulelor

evitarea apariţiei celulelor mutante, în scopul păstrării intacte a fondului

genetic al tulpinii conservate, prin următoarele mijloace:

excluderea cultivării în medii lichide

conservarea proprietăţilor de virulenţă prin cultivarea cât mai rară a acestei

tulpini înainte de conservare.

Tehnici de conservare a culturilor de microorganisme

Conservarea culturilor microbiene se poate face prin:

cultivarea pe medii nutritive obişnuite sau selective

acţiunea asupra culturilor de microorganisme a unor

temperaturi scăzute (congelarea), a umidităţii foarte reduse
(desicarea) sau prin răcirea şi extragerea bruscă a apei din
celulă (liofilizarea).

Conservarea pe medii de cultură

Se utilizează numai medii solide distribuite în tub în poziţie înclinată. Se

recomandă ca tuburile în care se distribuie mediu să fie prevăzute cu dop de
cauciuc care se poate parafina uşor. Mediile de cultură destinate conservării vor fi
sărace în peptone şi glucide pentru a reduce la minim multiplicarea celulelor.

Însămânţarea mediului se face în zig-zag sau “în amprentă”, prin atingerea

ansei în trei puncte pe mediul de cultură înclinat.

Incubarea se realizează la temperatura optimă pentru microorganismele

studiate (25˚C pentru levuri, 37˚C pentru bacteriile patogene). După dezvoltarea
coloniilor, se adaugă steril ulei de parafină astfel încât să fie acoperită în întregime
cultura microbiană. 21

Conservarea culturilor prin metoda păstrării pe mediu de cultură selectiv

impune transferul periodic al culturilor. Atunci când peste culturi s-a adăugat
ulei de parafină şi dopurile au fost parafinate, transferul se poate realiza chiar
şi la 2-3 ani.

Conservarea culturilor microbiene prin congelare

Este o metodă mai puţin practicată deoarece, de multe ori, acţiunea

lentă a temperaturilor scăzute poate conduce la formarea unor cristale de
gheaţă în celula microbiană astfel că, prin decongelare, aceste cristale ar
conduce la ruperea peretelui celular sau a membranei plasmatice.

Congelarea se realizează la temperatura de -20˚C.

Desicarea

Pentru a extrage apa din celula microbiană, se obţin mai întâi suspensii
microbiene foarte dense care se etalează pe suprafaţa unei hârtii de filtru
sterile.

Uscarea se face în exicator, la temperatură scăzută, în prezenţa anhidridei

fosforice. Timpul necesar desicării este de 48 ore.

Liofilizarea

Este procedeul care, deşi este foarte costisitor, permite păstrarea unui
procent mare de celule viabile, timp îndelungat.

Liofilizarea presupune de fapt o congelare rapidă a suspensiei microbiene,

urmată de desicarea acesteia.

Microorganismele destinate liofilizării vor fi cultivate pe mediu solid şi apoi

suspendate în mediu lichid stabilizator, cu efect protector faţă de şocurile
osmotice sau termice (se suspendă coloniile dezvoltate pe mediu înclinat în 2
ml lichid stabilizator). Ca mediu stabilizator se utilizează laptele degresat 10%,
gelatina 1-10%, glucoza 5-10%, zaharoza 5 -20%.

Culturile supuse liofilizării trebuie să aibă vârsta de 18-24 ore asigurând o

densitate celulară de 109-1015 celule/ml.

Liofilizarea se realizează în aparate speciale, numite liofilizatoare, etapele de lucru

fiind următoarele:
21
se introduce suspensia bacteriană în fiole de sticlă, volumul suspensiei fiind de 1/5
din volumul total al fiolei

congelarea bruscă a suspensiei bacteriene prin plasarea fiolelor în amestec de răcire

reprezentat de alcool şi zăpadă carbonică
menţinerea suspensiei congelate în vid înalt, timp de câteva ore

închiderea fiolelor cu culturi liofilizate, fie la flacără (în cazul în care s-a realizat
liofilizarea în fiole), fie are loc o închidere automată (tip flacon de antibiotic).

Este important ca bacteriile patogene să nu se manevreze sub vid datorită riscului

contaminării.

Culturile liofilizate sunt sub forma unor pulberi şi au mare afinitate pentru lichide.
Conservarea culturilor liofilizate se face la întuneric şi la temperaturi scăzute (+ 4˚).
Pentru revitalizarea culturilor liofilizate se deschide flaconul sau fiola cu
pulberea microbiană în zona de protecţie a becului de gaz, se adaugă câteva
picături de mediu lichid, se omogenizează şi apoi se face trecerea pe mediu
solid. Restul suspensiei microbiene va fi transferat aseptic în mediu lichid
selectiv.

În prezent, există numeroase colecţii de culturi de microorganisme,

colecţii care servesc atât la studiile de genetică microbiană, de biologie
celulară sau biochimie cât şi în scopul comercializării tulpinilor test
standardizate.

Astfel de colecţii sunt:

ATCC - American Type Culture Collection, Maryland, U.S.A
CCEB - Culture Collection of Entomogenous Bacteria, Prague
CCTM - Centre de Collection de Types Microbiens, Lausanne, Elveţia
CIP - Collection de l'Institut Pasteur,
Tehnicile microbiologice utilizate în mod curent au scopuri
diverse în raport cu profilul laboratorului.

Microbiologia alimentară

Microbiologia industrială

Microbiologia medicală

Microbiologia farmaceutică

În microbiologia alimentară, scopul final al analizelor

21
microbiologice este identificarea germenilor prezenţi în
produsele alimentare, germeni care pot interveni pozitiv
(ex.utilizarea mucegaiurilor la obţinerea brânzeturilor de tip
Camembert şi Roquefort) sau negativ asupra calităţii
produsului alimentar. (Ex. Penicilium roqueforti; P.
camemberti; Lactobacillus sp.; Aspergillus sp.; Sacharomyces
cerevisiae; Acetobacter sp., etc.)

Microbiologia industrială are drept scop obţinerea culturilor

pure de microorganisme, culturi care pot fi utilizate în
procesele fermentative.

În microbiologia medicală se urmăreşte izolarea şi

identificarea agenţilor patogeni precum şi gradul lor de
sensibilitate faţă de anumite antibiotice, în vederea stabilirii
măsurilor terapeutice.

Microbiologia farmaceutică urmăreşte controlul sterilităţii

medicamentelor precum şi dozajul substanţelor care inhibă sau
favorizează dezvoltarea microorganismelor.

Clasificarea microorganismelor

Microorganismele din
prima clasă sunt saprofite
(îşi procură hrana din
substanţe organice aflate în
descompunere), nepatogene
pentru om şi mediu. Aici
sunt incluse bacteriile
lactice (genurile
Leuconostoc, Lactobacillus,
Lactoccocus) bacteriile
acetice şi majoritatea
levurilor.

2. Cea de a doua clasă cuprinde microorganisme patogene

dar puţin periculoase care pot fi distruse cu un tratament eficace.
Aici se încadrează majoritatea microorganismelor implicate în
industria alimentară: Campylobacter, Edwarsiella, Enterobacter,
Enterococcus, Escherichia, Klebsiella, Legionella, Listeria
monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella, Shigella,
Staphylococcus aureus, Streptococcus, Vibrio cholerae, Yersinia
entorocolitica, Candida albicans, Aspergillus fumigatus.

3. Microorganismele din clasa a treia de patogenitate sunt

21
foarte periculoase şi nu pot fi manipulate decât de personal
competent şi în condiţii adecvate. Aici se încadrează: Brucella
(febra de Malta), Mycobacterium tuberculosis.

4. În clasa a patra de patogenitate se încadrează virusurile

împotriva cărora nu există tratamente adecvate sau eficace.
Amenajarea laboratorului de microbiologie

- o sală de manipulare, adăpostită de curenţi de aer, cu podea

şi pereţi “căptuşiţi” astfel încât să fie uşor de dezinfectat şi
curăţat, construiţi din materiale rezistente, impermeabile şi
incombustibile. Această sală trebuie să fie prevăzută cu sursă de
apă, de gaz şi prize electrice. Hota sterilă şi lampa UV sunt de
asemenea indispensabile în această sală. Utilizarea becului
Bunsen şi a unor produse inflamabile impun prezenţa
dispozitivelor antifoc;

- o sală de preparare a mediilor de cultură, de sterilizare a

sticlăriei şi de decontaminare. Este absolut necesară prezenţa
autoclavului în această sală. De preferat este să se dispună de
două autoclave, unul care să fie utilizat pentru sterilizarea
mediilor ce urmează a fi însămânţate şi altul pentru
decontaminarea mediilor însămânţate care nu mai servesc
analizei microbiologice.

În măsura posibilităţilor, încăperile anexe servesc la stocarea

sticlăriei, a mediilor deshidratate, a ingredientelor pentru medii
de cultură. În aceste încăperi este necesară prezenţa unei instalaţii
frigorifice pentru conservarea mediilor, a produselor şi tulpinilor
microbiene sensibile la căldură. Pentru conservarea de durată a
tulpinilor liofilizate este necesar un congelator sau un sistem de
congelare în azot lichid.

Laboratorul de microbiologie trebuie să dispună de asemenea

de termostate reglate la diferite temperaturi: 25, 30, 37, 44 şi 55°
C, un microscop, o centrifugă, mai multe băi de apă reglate la 45,
50 şi 100°C precum şi distilator de apă, balanţă analitică,
agitatoare, pH-metre.

La toate acestea se adaugă ustensilele de prelevare şi sticlăria

specifică lucrărilor de microbiologie.

Clasificarea laboratoarelor după nivelul securităţii biologice

(NSB), este stabilită în funcţie de clasificarea microorganismelor:

21 patogene nu se
- Nivelul 1 (NSB 1): microorganismele
manipulează în aceste laboratoare. De aceea nu sunt absolut
necesare echipamente specifice de securitate. Aplicarea regulilor
de igienă clasică şi decontaminarea deşeurilor sunt în acelaşi timp
necesare;
- Nivelul 2 (NSB 2): este cazul cel mai frecvent în
microbiologia alimentară unde germenii manipulaţi aparţin, cu
unele excepţii claselor 1 şi 2. Personalul care pătrunde în
laborator trebuie să cunoască pericolul biologic. Halatul este
obligatoriu şi o atenţie particulară trebuie acordată dezinfectării.
Normele de securitate impun ca în astfel de laboratoare, toate
persoanele care fac însămânţările microbiologice să aibă un post
de securitate microbiologică (PSM I sau II);

Clasificarea laboratoarelor de microbiologie

- Nivelurile 3 şi 4 (NSB 3 şi NSB 4): cuprind laboratoare

foarte specializate care dispun de locuri specifice prevăzute cu
filtre de aer sub presiune. Uşile şi ferestrele acestor laboratoare
sunt închise ermetic, intrarea în laborator fiind strict
reglementată. Regulile de igienă şi decontaminare sunt foarte
severe (PSM II sau PSM III).

În microbiologia industrială şi alimentară, cel mai

frecvent se execută transferul microorganismelor
dintr-un recipient în altul fiind suficientă zona de
protecţie a becului Bunsen şi hota sterilă fără să fie
absolut necesar un post de securitate microbiologică
(PSM).

Posturile de securitate microbiologică (PSM) sunt

incinte destinate asigurării protecţiei manipulatorului
şi mediului şi eventual a ceea ce se transferă.

PSM clasa I-a: trebuie să cuprindă un aspirator de aer care este

montat în faţa zonei sterile, evacuarea se face printr-un filtru
montat deasupra zonei sterile realizată de becul Bunsen. În aceste
condiţii transferul germenilor de către manipulator nu este
protejat.

PSM clasa a-II-a: este prevăzut cu un aspirator realizat

deasupra planului de lucru, transversal se află un filtru în timp ce
evacuarea se realizează la fel ca şi în cazul PSM I. După caz ele
pot avea unul sau două ventilatoare şi posibilitatea unui reciclaj
total. În cadrul acestui post de securitate microbiologică, protecţia
manipulatorului şi a mediului este 22completă faţă de germenii care
sunt transferaţi.

PSM clasa a III-a: sunt incinte închise etanş oferind astfel

securitate maximă. Transferul germenilor se face cu ajutorul unor
mănuşi care se înlocuiesc după fiecare transfer.
1. Hota cu flux laminar - este o incintă
paralelipipedică prevăzută cu o masă de lucru
din oţel inoxidabil şi cu un sistem de
aspirare-refulare a aerului din încăpere.

Echipamente

2. Lampa UV - este formată din 1-2 tuburi de

sticlă cu lungime variabilă (max. 90 cm) şi
diametrul de cca. 2 cm, montate între două
contacte electrice. Tuburile lămpii UV sunt
montate pe suporturi ce pot fi fixate pe tavan,
pe perete sau pot fi montate în suporturi fixe
sau mobile.

3. Becul de gaz - este sub forma unui cilindru metalic

montat pe un suport. La baza cilindrului se află o
duză prin care iese gazul metan şi un dispozitiv de
reglare a debitului de aer necesar combustiei gazului
metan. În funcţie de tipul constructiv al acestui
dispozitiv, există becuri de tip Bünsen şi Teclu.

4. Autoclavul - este construit sub forma unui cilindru

metalic cu pereţii dublii, dimensionat pentru presiuni
mari (1-5 atm), prevăzut cu un sistem de încălzire al
apei, sistem de reglare a presiunii, manometru pentru
indicarea presiunii, termometru şi ventile pentru
depresurizare. Este utilizat pentru sterilizarea
mediilor de cultură.

5. Termostatul - este o incintă metalică încălzită la

exterior cu o rezistenţă electrică. În interiorul incintei
se află montat termometrul, sistemul de reglare a
temperaturii şi 1-3 rafturi metalice. Domeniul de
termostatare este: temperatura camerei până la 60-70°
C. Fiind o incintă izolată termic, se utilizează pentru
menţinerea constantă a temperaturii necesară mediilor
de cultură însămânţate.

22
6. Etuva - din punct de vedere constructiv este
asemănătoare cu termostatul, diferenţa constând în
plaja mult mai largă dereglare a temperaturii (maxim
240 - 250°C). Este destinată uscării produselor
biologice şi sterilizării sticlăriei.
7. Distilatorul de apă - indiferent de tipul constructiv se
compune din vasul de fierbere a apei la care este
conectat un refrigerent pentru condensarea vaporilor
de apă rezultaţi.

8. Balanţa analitică - utilizată în laboratorul de

microbiologie trebuie să aibă o precizie de 0,0001 g.

9. Agitatorul - utilizat în microbiologie trebuie să fie

prevăzut cu o plită a cărei temperatură poate fi
reglată. În cazul mediilor de cultură solide, agitarea
trebuie să se facă la cald.

10. Baia termostat cu apă - este necesară pentru

menţinerea constantă a temperaturii până la maxim
100°C.

11. Microscopul (micros = mic, scopeo = privesc) - este

un dispozitiv optic construit pentru studiul obiectelor
ale căror dimensiuni coboară sub limitele de
observare ale ochiului omenesc.

Ustensile necesare în laboratorul de microbiologie

În laboratorul de microbiologie se folosesc ustensile

metalice şi din sticlă. Ustensilele metalice sunt
reprezentate de: firul drept, ansă, spatula Drigalski,
spatule obişnuite, pense, cleşti pentru prinderea lamelor.

Ustensilele din sticlă sunt reprezentate de: lame şi

lamele pentru preparate microscopice, cutii Petri,
eprubete, pipete gradate, pipete Pasteur, vase
Erlenmayer, pahare Berzelius,

pâlnii, tuburi Durham, vase de fermentare,

exicatoare, vase Roux, vase Fernbach, camera de
numărat.

Alte ustensile necesare în laboratorul de microbiologie sunt:

sticlele de ceas, fiolele de cântărire, stative pentru eprubete,
22 spirtiere,
capsule şi creuzete de porţelan, pisete,

sticle picurătoare şi cu dop rodat, cilindru gradat, balon cotat,

baghete din sticlă,