Imunologie curs 6

Activarea LT
De ce avem nevoie sa activam LT ?

Vrem sa obtinem dintr-un numar mic de LT capabile sa recunoasca un anume DA un numar

foarte mare. Nu numai ca si numar trebuie sa fie importante, ci si ca functionalitate, deci trebuie sa fie
capabile sa exercite functii efectoare, deci sa fi parcurs complet ciclul de maturizare pana la a atinge
nivelul de limfocite efectoare. Trebuie de asemenea sa avem o alta categorie din aceste LT care sa fie
capabile sa recunoasca si sa aiba o durata de viata mai lunga, sa supravietuiasca mai mult si sa fie
capabile sa se activeze mai rapid, adica avem nevoie si de LT cu memorie.

Evenimentul central al oricarui RI adaptat fie el umoral, fie celular, este recunoasterea de catre
LT naiv a determinantului antigenic. Asta se realizeaza in cadrul unei cooperari celulare dintre APC si LT .
Care dintre LT ? CD4+ ( mai avem pana le spunem helper; ultima data le-am categorizat drept CD4+ ).
Apoi, alt eveniment important e cooperarea CD4+ si CD8.

Intrebari despre activarea LT

1.Unde se realizeaza activarea?

2.Cine participa la ea?

3.Cum se realizeaza?

4.Ce rezulta?

1.Unde se realizeaza activarea?

Ne aducem aminte ca LT naive sunt localizate in organele limfoide secundare, iar daca ele ar
veni in contact cu un antigen nativ ajuns acolo prin difuziune, nu sunt capabile sa reactioneze pentru ca
nu il recunosc => singura posibilitate ar fi ca sa intalneasca DA (acela pe care il pot recunoaste),
prezentat pe MHC II . In continuare detaliem situatia antigenelor T-dependente.

Pentru a ne ajunge in contact cu DA prezentat in forma convenabila, avem nevoie ca patogenul

nostru sa fi strabatut barierele, sa fi intalnit o APC (aici este figurata o cel dendritica imatura , un
Langerhans) , aceasta sa realizeze o recunoastere nespecifica prin PRR (de ex. TLR) . Ca urmare a acestei
recunoasteri si inglobari a acelui patogen se vor intampla 2 lucruri: incepe activarea acelei APC =>
modificarea permanenta in evolutie a fenotipului acelei celule => exprimarea de chemokina 7 care ii va
determina traseul(o va trimite pe un anumit traseu). In timpul acesta , dpdv functional, va sintetiza MHC
II si va prelucra antigenul .El isi va realiza traseul , atras fiind de chemokina 7 care este exprimata la
nivelul epiteliului vascular inalt din ganglionii limfatici in zona T dependenta, adica in paracortex. Cand a

1
Imunologie curs 6

ajuns acolo, APC este pe deplin functional, este matur=> fenotipul ei este de celula interdigitata,
exprimand:

• MHC II cu DA ;
• Molecule costimulatorii (B71, B72 = CD80, CD86) ;
• Moleculele de adeziune celulara ;
• Receptori citokine (vor contribui la relatiile lor ulterioare);

2.Cine participa la activare?

Participa APC-ul matur . Moleculele de adeziune celulara ii permit acestuia localizarea la nivelul
endoteliului vascular inalt, prin perechea de molecule chemokina 7(exprimata la acest nivel) -
receptorul pentru chemokina 7 (exprimat pe APC matur). Dpdv functional exprima MHC II cu DA in cap.
Ce mai exprima? Molecule costimulatorii si receptori pt citokine.

Vom avea LT naive , care sunt in repaus. Acuma ele vor trece ca la speed dating : vor trece LT
naive fiecare cu cerintele sale , restrictionate de secventele variabile ale TCR-ului (CDR3, 2, 1 + CD4). Se
aseaza la masa, discuta (incearca sa se adapteze sa vada daca se potrivesc conformational) . Este
necesar ceva mai mult de atat pentru aceasta asezare la masa, intrucat ambele celule sunt incarcate
electronegativ la suprafata, deci ar trebui sa se respinga=> avem nevoie ca intr-o prima etapa sa intre in
actiune cuplul de adeziune intercelulara care sa le asigure distanta optima si un timp suficient de lung a.i
sa faca tatonari – se potrivesc ele dpdv conformational?

LT naiv si APC matur trebuie sa se apropie suficient de mult incat sa aiba 2 verificari.

Daca nu se potrivesc, LT tot va primi niste semnale care ii vor permite sa supravietuiasca(nu
semnale activatoare) . Semnalele sunt consecutive recunoasterii MHC-urilor. Apoi, se detaseaza pleaca
mai departe intra in circulatie isi fac turul si revin.

Daca se potrivesc, atunci vor fi declansate o suma de etape care vor duce la activarea LT .
Activarea LT naive este posibila doar dupa parcurgerea integrala a tuturor etapelor de activare. Povestea
aceasta spusa acum cu asezarea LT si stabilirea unor contacte initiale se numeste supraveghere
antigenica= supraveghere imunologica.

3.Cum se activeaza LT naive?

Am putea, in scop didactic, sa consideram ca sunt produse contacte la mai multe niveluri:

• Aspecte intercelulare globale –presupun sinapsa imunologica ;

• Aspecte intercelulare molecular-receptoriale de recunoastere antigenica
o Aici intervin interactiunile dintre moleculele MHC care expun DA si TCR + CD4 (receptorii
de recunoastere antigenica) ;
• Aspecte intracelulare = interactiune molecular- subcelulare
o Vorbim despre transducerea semnalului activator

2
Imunologie curs 6

Tot la contactele intercelulare intra si contactele dintre receptorii cu rol accesor in activarea LT si
moleculele costimulatoare . Contactele interreceptoriale se desfasoara in afara celulei.

In urma realizarii acestor contacte se produc modificari conformationale la nivelul acestor

molecule care vor declansa transmiterea semnalului activator in interiorul LT si vom avea aspecte
intracelulare concretizate prin transducerea semnalului activator si dupa cum e celula facuta vom avea o
etapa intracitosolica si o etapa intranucleara si intr-un final am ajuns in nucleu unde intr-un final vom
ajunge la genele acelea a caror rata de transcriptie vrem sa o crestem.

La aspectele intercelulare spunem ca avem ca principala interactiune cooperarea celulara dintre

APC si LT. Dpdv global, aceasta cooperare celulara imbraca 2 aspecte: poate fi activare anterograda= in
sensul de prezentare al Ag, adica APC va transmite semnale activatorii catre LT, realizata pe 2 nivele:

• Cale principala, care implica receptori de recunoastere antigenica (care includ si TCR CD3 zeta
zeta, dar si CD4) ;
• Cale accesorie=secundara, ce presupune interactiunea cu receptorii accesori pentru activare
limfocitara(CD28, CD45, CD40 ligand, CTLA4) ;

Ca urmare a transmiterii stimulului prin aceste 2 cai va fi declansata activarea LT care se va

desfasura ea insasi in etape si va presupune modificari cate putin cate putin a functionalitatii acestei
celule. Va duce la proliferarea LT, cu activare metabolica, care are drept scop sinteza moleculelor
efectoare . Daca vorbim de LTCD4 vorbim de sinteza de citokine. Una dintre primele modificari care au
loc in urma transmiterii semnalelor activatoare este sinteza si secretia de IL. O parte din aceste IL vor fi
descarcate si vor exercita un efect activator retrograd—vor actiona asupra APC, transmitand semnale
activatorii suplimentare acestuia. LT descarca IL4 si IFN gamma. Ce se va intampla pe APC? Va creste
capacitatea lui de sinteza a MHC si va creste capacitatea lui de expunere a moleculelor costimulatorii.
Vor fi transmise si mai multe semnale activatorii catre LT si de fapt observam ca avem o „conversatie”
intre ele pana cand se atinge pragul de stimuli activatori necesari LT de a parcurge etapele ulterioare.

La nivel receptorial, o sa avem o etapa antigen-independenta si una antigen dependenta. Etapa

antigen independenta este valabila pentru ambele situatii ale supravegherii imunologice( si daca
recunoaste antigenul, si daca nu) pentru ca ea are drept scop micsorarea distantelor pana la invingerea
fortelor electrostatice de respingere, aducerea la distanta suficient de mica pe suprafata suficient de
mare si in timp suficient de lung. Cu cine se face? Se face cu primul cuplu de adeziune = CD2-CD58.
Aceste molecule se mai cheama LFA2- LFA3 (Limphocyte function associated antigen 2 si 3).

Aceste molecule care apartin cuplului de adeziune primara au o afinitate nativa crescuta unele
pentru altele. Sunt exprimate in mod nativ de LT (deci nu trebuie sa fie activat ca sa le exprime), dar
APC-ul exprima CD58=LFA3 doar dupa activare//presupun ca CD2 e al LT atunci// .Dupa ce primul cuplu
de adeziune a adus celulele la o distanta suficient de mica, este permisa intrarea in actiune a celui de-al
doilea cuplu de adeziune format din LFA1 + ICAM . Ele sunt dispuse oriunde pe suprafata moleculara-
cand vin celulele in apropiere nu sunt orientate dupa prezenta CD-urilor si atunci primele care vor avea
atractie vor intra in actiune CD2 CD58 care vor orienta celulele.

3
Imunologie curs 6

Vor permite intrarea in actiune a celui de-al doilea cuplu + permit migrarea TCR-urilor , respectiv
a MHC-urilor, a.i ele sa ajunga fata in fata. Deci, in acest moment am constituit ceea ce se numeste o
sinapsa imunologica = reprezinta contactul fizic dintre cele 2 celule la nivel receptorial. Constituirea
acestei sinapse este obligatorie in vederea activarii LT.

In urma constituirii sinapsei imunologice exista 2 posibilitati: exista afinitate conformationala

sau nu. Daca nu exista, singurele semnale sunt transmise prin CDR1 si 2 , respectiv secventele polimorfe
MHC, a.i vor fi transmise semnale care permit supravietuirea LT naive. Nu exista alta afinitate in ceea ce
priveste CDR3 si DA =>ne desprindem, plecam . Daca exista afinitate conformationala=> modificari
conformatioanle =>prelungirea contactelor.

Sinapsa imunologica are 2 portiuni :

• Centrala= cea in zona careia se stabileste contactul TCR-MHC si se afla in imediata apropiere a
PKC izoforma teta, care are un rol deosebit de important in transmiterea semnalului activator ;

• Arie marginala ,in care membranele celor 2 celule sunt mai apropiate decat in restul celulelor
dar nu atat de apropiate precum in zona centrala ;
o In zona marginala a sinapsei imunologice sunt prezente legaturile dintre moleculele de
adeziune intercelulara;

Etapele de formare a sinapsei imunologice

1.Stabilirea legaturilor dintre cuplurile de adeziune

2.Largirea pe suprafata extinsa a legaturilor dintre cuplurile de adeziune ( prin intermediul celui de-al
doilea cuplu de adeziune se realizeaza mai multe legaturi inspre periferie => permitem apropierea celor
2 suprafete pe o suprafata mai larga => vom creste sansele sa gasim TCR si MHC; in plus, permitem
migrarea acestor molecule si aducerea lor in pozitie)

Toate astea vor duce la: permitem stabilizarea legaturii dintre TCR si MHC, in timp si a numarului
lor. De asemenea, permitem stabilirea de legaturi cu receptorii activatori accesori.

Rolul sinapsei imunologice:

Stabilirea de contacte + permite crearea unui spatiu in care se descarca citokinele din etapele de
inceput ale activarii LT care sa actioneze pe APC si sa realizeze activarea retrogada.

Etapa Ag-dependenta presupune legaturile dintre receptorii celor 2 celule. Cea mai importanta
este recunoasterea antigenica . Aceasta se realizeaza de catre TCR si MHC. In urma acestei recunoasteri,
ceea ce presupune modificari conformationale la nivelul TCR-ului, aceste modificari conformationale (la
nivelul structurii cuaternare) vor fi transmise catre CD3 si catre zeta zeta (TCR-urile fiind in stransa
legatura cu acestea).

4
Imunologie curs 6

Care este consecinta? Stim ca capacitatea de transducere a semnalului activator al moleculelor

CD3 si zeta zeta se baza pe existenta motivului activator tirozinic care in conformatia nativa era foldat in
interior. In urma transmiterii, s-a despaturit (care despaturie a determinat alte modificari in cele 2
molecule) si aceste molecule vor atinge structuri conformationale in care expun reziduul tirozinic. Acesta
este cel care prin fosforilare declanseaza transducerea semnalului (= o cascada de fosforilari care se
transmit din aproape in aproape de catre enzime care au forma inactiva catre alte substraturi astfel
incat sa ajungem sa activam molecule care exista in citosol, sunt in forma inactiva si in urma activarii
sunt capabile sa treaca in nucleu si sa se cupleze in zona promotor sau enhancer a genei si sa determine
cresterea ratei de transcriptie).

Era o stransa legatura intre TCR si CD3 datorita incarcarii lor pozitive, respectiv negative. Se
produc modificarile conformationale care vor determina expunerea reziduurilor tirozinice ce vor fi
capabile sa fie fosforilate. Acelasi lucru e valabil si pt CD4.

Cine face asta? Protein-tirozin kinazele = clasa de enzime capabile sa fosforileze reziduurile
tirozinice. Ele au denumiri fiecare in parte - noi o sa retinem P56LCK si Fyn .

De ce sunt importante? Pentru ca CD3 in conformatia sa nativa e cuplat la capatul N-terminal cu

Fyn astfel incat, dupa ce am recunoscut noi, TCR-ul a recunoscut, s-a modifcat, s-a expus tirozina, Fyn
abia asteapta sa o fosforileze, declansand prima etapa de fosforilare.

Pe de alta parte, CD4 e cuplata cu o alta protein-tirozin-kinaza = LCK, care face acelasi lucru (ea e
cuplata prin capatul N-term, sta linistita pana cand CD4 expune reziduul tirozinic si atunci are pe ce
actiona). Ca urmare a acestei modificari, va intra in actiune urmatoarea proteina deosebit de importanta
= proteina ZAP-70 (proteina atasata lantului zeta zeta cu greutate moleculara de 70 kDa). Este o
proteina foarte importanta pentru ca face legatura de la momentul membranar catre interiorul celulei.
Ea e atasata de zeta-zeta.

Transmiterea semnalului activator poate sa fie pe calea lunga cu CD3: am spus ca expune
tirozina, care este fosforilata de catre Fyn si urmarea acestui lucru e ca leaga ZAP.

ZAP-70 poate face mai multe:

➢ Poate fosforila zeta zeta ;

➢ Poate cupla alte proteine adaptor ;

➢ Are activitate protein tirozin kinazica proprie(la randul ei va fosforila urmatorul substrat si va
declansa caile activatoare intracelulare, in numar de 3; ea activeaza doar 2 dintre ele) ;

Deci, ZAP pe de o parte e activat de protein-tirozin-kinazele legate de formele native ale CD3 si
CD4, se fosforileaza si capata activitate protein-tirozin-kinazica proprie. Pe de alta parte sunt capabile sa
exercite rolul de proteina adaptor - asta inseamna ca va aduce in apropiere 2 molecule - se va cupla cu 2
molecule: LAT (linker of activated T cells) si SLP76 (este o proteina care are tot rol de linker) – acestea

5
Imunologie curs 6

sunt proteine adaptor. Avem nevoie de aceste proteine adaptor ca sa activam caile de transducere a
semnalului activator.

Importanta acestei molecule a fost dovedita prin studii experimentale in sensul in care pe
soarecii knockout pentru aceasta molecula s-a demonstrat ca ei nu pot sa determine aparitia unui RI
adaptat - nu se pot apara din cauza lipsei acestei molecule, facand imposibila activarea LT ca urmare a
recunoasterii unui determinant antigenic. De altfel, acest lucru e vizibil si din rolurile pe care le are – de
substrat, de protein-tirozin-kinaza, de adaptare a moleculelor adaptor si de recrutare a unor noi motive
ITAM . In functie de numarul de motive ITAM pe care le poate fosforila, va exercita si rol de regulator al
intensitatii semnalului.

Am ajuns sa legam modificarile conformationale de la nivelul receptorilor cu proteinele adaptor

care vor fi capabile sa lege activarea cailor intracelulare.

PLC gamma 1 este o izoforma a fosfolipazelor membranare care are activitate de hidroliza a
fosfatidil-inozitolului, a fosfolipidelor membranare, care dau IP3 si DAG.

IP3 e hidrosolubil, e recunoscut de receptorii de pe RE, ca urmare a cuplarii pe receptorii de pe

RE va fi descarcat Ca intracitosolic. Cresterea concentratiei intracitosolice de Ca va duce la activarea
calcineurinei, care va interveni in activarea factorului de transcriptie nucleara, trecandu-l pe acesta din
forma inactiva in forma activa capabila sa treaca la nivelul nucleului.

Tot la originea acestei cai este DAG = liposolubil, actioneaza prin intermedul PKC , determinand
activarea factorului nuclear kB (NF-kB ), prezent in citosol in forma inactiva datorita cuplarii sale cu un
inhibitor. Activare presupune dizolvarea inhibitorului in urma fosforilarii si eliberararea formei NF-kB
capabile se actioneze la nivelul genei.

Mai avem calea mitogen activated (MAP kinazelor) care va duce la activarea unei familii de
factori de transcriptie nucleara AP-1.

Schema simplificata a cuplarii, recunoasterii Ag & transcrierea semnalului:

PLC gamma 1 va determina pe calea IP3 cresterea concentratiei Ca intracelular, activarea

calcineurinei (o fosfataza), ceea ce va determina activarea factorului de transcriptie nucleara. Pe calea
DAG se va activa factorul de transcriptie NF-kB, iar pe cascada MAP-kinazelor (proteinelor activatoare
mitogenice) avem proteinele cu greutate moleculara mica (small G-proteins) care sunt capabile sa
transfere guanina).

SGP (small G-proteins)- capabile sa transfere guanina

Desen: aici, am ajuns la nucleu. PKC a fost capabil sa indeparteze partea inhibitorie, avem NF-kB care
este activ, a patruns in nucleu, in acest moment este capabil sa se lege in zona promotor (sau enhancer)
a genelor care vor codifica molecule efectorii ale LT CD4+. Aici este figurat rezultatul: activarea

6
Imunologie curs 6

transcrierii pentru IL-2. Acelasi lucru aici: este figurata activarea NF-kB si aici este activarea pe calea
MAP-kinazelor. Acestea sunt proteinele capabile sa transfere resturile guaninice, ceea ce va determina
sa actioneze in sensul unui fosfataze a factorului activator AP-1.

NFAT (nuclear factor of activated T-cells) - inactiv in citosol. Este activat de (//pe??//) PLC-gamma,
calcineurina, calmodulina. Acesta se leaga de obicei impreuna cu AP-1. Creste rata de transcriptie pentru
IL 2,4, TNF-alfa. De asemenea, stimuleaza diviziunile mitotice.

Calea Ras-MAP-kinazelor. Acestea sunt proteinele G. Dintre acestea (//adica Ras-Map-kinaze?//) sunt
figurate aici proteinele GRB 2. Ca urmare a fosforilarii si adapatarii de catre LAT este posibila trecerea
din proteina GDP in GTP. Urmeaza cascada care implica ERK-urile (endoplasmic reticulum kinases) care
fac legatura cu faza nucleara.

Am terminat de descris calea principala de activare. Am demonstrat sinteza de IL-2, in exemplul

din imagine. Pt ca vorbim de LT naive, mai avem nevoie de costimulare, asta inseamna ca in sinapsa
imunologica de care vorbeam sunt cuprinse si legaturile dintre B71, B72 = CD80, CD86 expuse pe
suprafata APC matur si CD28.

B71, B72 sunt molecule costimulatorii exprimate pe APC-ul matur. CD28 este cuplat la enzima
LCK => in urma cuplarii dintre aceste molecule costimulatorii el isi va expune reziduul tirozinic care va fi
fosforilat de LCK . Pe calea IP3 si de asemenea prin intermediul caii MAP-kinazelor vor duce la activarea
NF-kB => stimularea IL-2. Un alt efect al stimularii pe calea CD28 va fi cresterea expresiei CD40L .

Cea de-a doua categorie de molecule costimulatorii erau CD40 exprimat pe APC si CD40L . Pe
CD40-CD40L vom determina prin transmitere retrograda a stimulului cresterea expresiei de B71, B72 si
din nou transmitem retrograd stimulii activatori catre APC astfel incat aceasta sa-si creasca sinteza si
expresia de MHC si sinteza si expresia de molecule costimulatorii astfel incat LT naiv sa primeasca stimuli
activatori pana atinge un prag de activare de la care poate sa parcurga restul de etape.

Modularea transmiterii semnalului : mecanisme de amplificare si mecanisme de inhibare.

1.Mecanisme de amplificare:

a)Unele din mecanismele de amplificare presupun utilizarea progresiva a motivelor activatorii tirozinice
(ITAM). Atunci cand presupune recunoasterea de catre TCR si cuplarea cu CD3 am zis ca avem 2 cai:
calea lunga pe CD3 (care ne va duce pe Fyn si pe ZAP) si pe calea scurta (TCR este cuplat cu zeta zeta
care are 3 reziduuri tirozinice si e cuplat direct cu ZAP). Deci, utilizarea progresiva a unui numar de ITAM
va duce la amplificarea stimulilor activatori. Pe de alta parte, insasi prezenta CD4 mai adauga inca un
motiv ITAM care va transmite semnale activatorii (prin LCK), deci avem utilizarea progresiva a ITAM.

b)Stimulii prin coreceptori (CD4/CD8)

c)Stimulii prin receptorii costimulatori (CD28 si CD40L)

7
Imunologie curs 6

Cat am zis ca avem nevoie de stimulii activatori? Pana la atingerea pragului de activare declasam
si din acel moment LT e capabil si sa prolifereze si sa sintetizeze moleculele efectoare. In plus, pentru ca
vorbim de CD4+ avem nevoie sa se diferentieze in subseturile LTh si in plus sa contina si subpopulatiile
CD4 cu memorie. Am primit suficienti stimuli activatori si trebuie sa oprim acum chestia asta.

2.Mecanisme de inhibare:

a)Mecanismele de inhibare presupun interventia unor receptori inhibitori (CTLA-4 de exemplu).

b)Pe de alta parte putem sa blocam semnalul activator prin interventia unor fosfataze. Acestea sunt
enzime care vor face procesul invers fosforilarii (adica defosforilare): vor scoate fosfatul, ceea ce va
bloca conducerea stimulului activator.

c)A treia cale este prezenta unor ITIM (immunoregulatory tyrosine-inhibiting motifs)