LABORATOR CONTROL CALITATE APĂ

PROCEDURĂ SPECIFICĂ

DETERMINAREA NUMĂRULUI DE COLONII DIN APE

LA 22 0C şi 37 0C

1. SCOP
Prezenta procedură stabileşte modul de organizare şi desfăşurare a activităţii de enumerare a
microorganismelor prezente în apă, care se dezvoltă şi formează colonii, pe mediul de cultură cu
agar nutritiv, după incubarea în aerobioză la 22 0C, respectiv 36 0C, în vederea asigurării şi
confirmării capabilităţii tehnico-organizatorice a laboratorului de a satisface cerinţele impuse de
standardele de metodă şi de calitate în vigoare.

2. DOMENIUL DE APLICARE
Procedura se aplică tuturor tipurilor de apă: de suprafaţă, subterană, de folosinţă umană
(potabilă), inclusiv apa din containere închise (îmbuteliată) şi ape naturale minerale, care vor fi
încercate microbiologic, de către personalul
Numărul de colonii este un parametru indicator pentru evaluarea integrităţii surselor de apă şi
eficienţei proceselor de tratare a apei (coagulare, filtrare, dezinfecţie), precum şi pentru aprecierea
curăţeniei şi integrităţii sistemului de distribuţie. Orice creştere bruscă a numărului de colonii
dintr-o apă, bazată pe o monitorizare a acesteia pe termen lung şi în mod frecvent, poate fi o
atenţionare imediată despre o poluare serioasă, impunându-se investigaţii imediate.
În funcţie de scopul urmărit, determinarea numărului de colonii se poate face pentru:
 probe nediluate de apă dezinfectate sau îmbuteliate, cu un conţinut probabil mic
sau chiar lipsite de microoroganisme;
 diluţii ale probelor de apă nedezinfectate, cu un conţinut mare sau necunoscut de
microorganisme.
Încercările se execută în:
 sala - recepţie probe apă potabilă;
 sala - cameră decontaminare;
 sala - cameră termostate;
 sala - cameră încercări microbiologice;
 sala - preparare, sterilizare materiale.

3. DOCUMENTE DE REFERINŢĂ ŞI CONEXE

3.1. Documente de referinţă
3.2. Documente conexe
SR EN ISO 6222/2004 Calitatea apei. Numărarea microorganismelor de cultură. Numărarea
coloniilor prin însămânţare în mediu de cultură agar;
SR EN ISO 8199/ 2008 Calitatea apei. Linii directoare pentru numărarea microorganismelor
în mediul de cultură;
SR EN ISO 7218/2007 Microbiologia alimentelor şi furajelor. Cerinţe generale şi ghid
pentru examenele microbiologice;
SR EN ISO 6887-1/2002 Microbiologia alimentelor şi furajelor. Pregătirea probei pentru
analiză, a suspensiei iniţiale şi a diluţilor decimale pentru examenul
microbiologic. Partea 1: Reguli generale pentru pregătirea
suspensiei iniţiale şi a diluţiilor decimale;
SR EN ISO 19458/2006 Calitatea apei. Prelevare pentru analizele microbiologice;
SR EN ISO 5667-3/2004 Calitatea apei. Prelevare. Partea 3: Ghid de conservare şi
manipulare a probelor;
SR CEN/TS 11133-1/2009 Microbiologia alimentelor şi furajelor. Ghid de preparare şi obţinere
a mediilor de cultură. Partea 1: Ghidul general pentru asigurarea
calităţii pentru pregătirea mediilor de cultură în laborator;
SR CEN/TS 11133-2/2009 Microbiologia alimentelor şi furajelor. Ghid de preparare şi obţinere
a mediilor de cultură. Partea 2: Ghid teoretic pentru încercări de
performanţă ale mediilor de cultură;
SR ISO 3696/1995 Apa utilizată în laboratoarele de încercare. Metode specifice de
lucru;
Legea nr.458/2002 Legea privind calitatea apei potabile.
modificată cu L. 311/2004

4. DEFINIŢII ŞI ABREVIERI
4.1. Definiţii
 micro-organisme viabile: toate bacteriile aerobe, drojdiile şi mucegaiurile capabile să formeze
colonii în mediul de cultură specificat şi în condiţiile de incubare descrise în prezenta
procedură;
 colonie: aglomerare de bacterii care se dezvoltă dintr-o singură celulă sau grup de celule de
acelaşi fel (unitate formatoare de colonie) şi este vizibilă cu ochiul liber pe suprafaţa mediului
de cultură solid;
 mediul de cultură: soluţie care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare creşterii
şi multiplicării bacteriilor;
 suspensie iniţială (diluţie primară): suspensie (soluţie) obţinută după ce un volum măsurat din
proba de analizat a fost amestecat cu de nouă ori cantitatea de diluant;
 diluţii decimale: suspensii (soluţii) obţinute prin amestecarea unui volum măsurat din
suspensia iniţiala cu de nouă ori volumul de diluant şi repetarea acestei operaţii cu
următoarele diluţii până se obţine o serie de diluţii decimale, corespunzătoare pentru
inocularea mediului de cultură.
4.2. Abrevieri

5. DESCRIEREA ACTIVITĂŢII
5.1. Principiul metodei
Volume de 1ml din proba de analizat sau din diferite diluţii ale probei respective (0,1; 0,01;
0,001), sunt inoculate prin amestecare cu un mediu de cultură specificat, în cutii Petri, cu
diametrul de 90 mm. Un set de cutii sunt incubate la (22±2) 0C pentru (68 ± 4) ore, iar un alt set
la (36±2) 0C pentru (44 ± 4) ore.
Calcularea numărului de unităţi formatoare de colonii (UFC) se face pe 1ml probă din numărul
coloniilor dezvoltate pe mediul de cultură.
5.2. Resurse necesare
5.2.1. Sticlărie şi alte materiale consumabile
 spatulă;
 fiolă cântărire;
 cilindri gradaţi de 500 ml, 1000 ml;
 pipete gradate de 10 ml, 1 ml, clasa A;
 containere din inox sau tavă cu capac din PP, pentru sterilizare pipete;
 balon Griffin sau pompă plastic cu piston;
 cutii Petri din sticlă sau din plastic, cu diametrul de 90 sau 100 mm;
 eprubete din sticlă, lungime 150 mm, diametru 16 mm, cu dop din PP, cu filet şi garnitură
din teflon;
 stativ pentru eprubete;
 baloane cotate de 500 ml, 1000 ml, clasa A;
 sticle de laborator, transparente, cu dop filetat din PP, volum 250ml, 500ml, 1000ml;
 flacon pentru prelevare probe, din PP, cu gât larg, capac filetat din PP, sau sticle prelevare
probe, transparente, cu dop şlefuit, volum 500ml, 1000ml;
 pungi autoclavabile pentru decontaminarea cutiilor Petri;
 markere permanente pentru sticlă şi plastic;
 apă;
 gaz;
 curent electric.
Sticlăria este verificată metrologic, fiind însoţită la livrare de certificat de calitate.
5.2.2. Medii de cultură şi reactivi
Mediul de cultură utilizat în încercarea numărului de colonii din apă este „Agar triptonă cu
extract de drojdie” (Tryptone Yeast Extract Agar), un mediu complet, deshidratat, cu următoarea
compoziţie (g/L):
 triptonă (peptonă din caseină, pancreas)…………………......6.0 g
 extract de drojdie deshidratată ……………..……….......….....3.0 g
 agar………………………………………...………........…10–20 g
Pentru dizolvarea mediului se utilizează apa
Reactivii utilizaţi în încercarea numărului de colonii din apă, pentru executarea diluţiilor de
probe, corectarea pH-ului mediului de cultură, neutralizarea agentului dezinfectant sunt:
 hidroxid de sodiu;
 acid clorhidric;
 dihidrogen fosfat de potasiu;
 clorură de magneziu;
 tiosulfat de sodiu.
5.3. Condiţii prealabile
5.3.1. Prelevarea, conservarea, identificarea, manipularea, recepţia şi înregistrarea probei
de apă pentru încercarea numărului de colonii din apă se face de către personalul laboratorului.
În cazul solicitărilor de încercări de către clienţii externi, prelevarea probelor poate fi executată de
către aceştia. În această situaţie laboratorul menţionează în raportul de încercare emis faptul că
probele sunt prelevate de solicitanţi, laboratorul neasumându-şi responsabilitatea acestei etape, ci
doar asupra rezultatelor obţinute.
Probele de apă pentru încercările microbiologice se prelevează în recipiente sterile, cu volumul de
500 ml sau 1000 ml (în funcţie de numărul încercărilor pentru proba respectivă şi de tipul probei),
din sticlă sau din polipropilenă, respectând prescripţiile de prelevare a probelor de apă potabilă,
suprafaţă sau subterană. Recipientele cu probele de apă, ce vor fi încercate microbiologic, se
păstrează închise înainte de umplerea acestora. În momentul recoltării se desface cu grijă capacul
recipientului, evitându-se atingerea acestuia sau a gâtului recipientului. Umplerea recipientelor se
face fără clătirea acestora. Imediat după recoltarea probei se închide capacul. Recipientele de
probe nu se umplu complet cu apă, lăsându-se un spaţiu cu aer, necesar pentru amestecul probei
înainte de examinare şi pentru prevenirea unei contaminări accidentale.
Recipientele cu probe pentru încercări microbiologice sunt transportate în genţi frigorifice, în cel
mai scurt timp posibil, la laborator unde vor fi încercate imediat după recepţionarea şi
eşantionarea lor; dacă acest lucru nu este posibil, recipientele vor fi păstrate timp de maxim 12
ore de la recoltare, la o temperatură de (5±3)0C, în refrigerator.
5.3.2. Pregătirea sticlăriei
Pregătirea sticlăriei şi materialelor necesare încercării numărului de colonii constă în spălarea,
uscarea, ambalarea şi sterilizarea acestora.
Până la utilizare, toate materialele de laborator (sticlărie, plastic etc.) sterilizate, se protejează de
praf, păstrându-se în dulapuri închise cu uşi.
5.3.4. Pregătirea soluţiilor şi a mediului de cultură
5.3.4.1. Pregătirea soluţiilor pentru corectarea pH-ului
Soluţiile utilizate în corecţia pH-ului mediului de cultură şi a apei de diluţie sunt: soluţia de
hidroxid de sodiu (NaOH), concentraţie 1 mol/L (40 g/L) şi soluţia de acid clorhidric,
concentraţie 1 mol/L (36,5 g/L).

5.3.4.3. Pregătirea mediului de cultură

Prepararea corectă a mediilor de cultură este una din etapele de bază în încercarea
microbiologică.
Se cântăreşte la balanţa cantitatea corespunzătoare de mediu deshidratat “Agar triptonă cu extract
de drojdie” (24 g/L) şi se toarnă cu o pâlnie pentru pulberi într-o sticlă de laborator
termorezistentă, cu dop cu filet din PP, de volum potrivit volumului de mediu ce se doreşte a fi
obţinut (500 ml, 1000 ml); se adaugă progresiv volumul necesar de apă distilată (sau bidistilată),
evitându-se formarea de cocoloaşe.
După dizolvarea completă se închide flaconul cu dopul PP corespunzător (fără a se înfileta
complet) şi se sterilizează în autoclav la temperatura de (121±3) 0C, presiunea de 1,2 atm, timp de
(15±1) minute. După sterilizare se măsoară pH-ul prin folosirea pH-metrului, la temperatura de
250C. Ajustarea pH-ului se face cu soluţie de NaOH 40 g/L sau HCl 36,5 g/L, astfel încât
valoarea acestuia să se încadreze în intervalul 7,2±0,2 unităţi de pH. pH-metrul se calibrează
săptămânal,
Înainte de utilizarea în încercarea numărului de colonii, se topeşte mediul de cultură, sterilizat şi
păstrat în refrigerator, prin introducera flaconului respectiv în baia de apă, la temperatura de
fierbere, După topire, se răceşte flaconul, cu dopul închis ermetic, sub jet de apă rece potabilă şi
se păstrează la (45±1)0C, în baia de apă Agarul topit trebuie utilizat în maxim 4 ore de la topire,
după care va fi aruncat.
5.3.4.4. Pregătirea apei de diluţie
5.3.5. Măsuri preventive
Personalul din laborator este dotat cu echipament de protectie:
 halat alb cu mânecă lungă;
 mască de protecţie nas şi gură, de unică folosinţă;
 mănuşi latex sterile şi nesterile;
 ochelari de protecţie raze UV;
 materiale igienico-sanitare: săpun, spirt, perie dinţi, creme emoliente;
 lapte antidot.
Este absolut necesar ca în cazul operaţiilor ce se efectuează în laborator, EIP să fie în perfectă
stare de curăţenie.
Încercările microbiologice se execută în hotele cu flux de aer laminar, care protejează atât proba,
cât şi operatorul.Ventilaţia prin sistemul CTA (centrală de tratare a aerului) este un mijloc
suplimentar de reducere a concentraţiei de microorganisme şi substanţe toxice în zonele de
muncă.
La finalizarea activităţii se închid toţi robineţii de alimentare cu gaz şi apă din spaţiile de lucru.
De asemenea, se decuplează de la instalaţia electrică toate aparatele care permit acest lucru.
Personalul este instruit din punct de vedere al protecţiei muncii, pentru fiecare loc de muncă.
5.4. Execuţia încercării
5.4.1. Mod de lucru
Pentru evitarea contaminării probei (eşantionului) luată în lucru, încercarea numărului de colonii
din probele de apă se execută în hota cu flux de aer laminar vertical.
În hota de lucru se pregătesc cutiile Petri sterile, care se scot din ambalajul steril şi se aşează cu
capacul în sus pe suprafaţa de lucru a hotei. Pentru fiecare eşantion de probă, care necesită diluţii
decimale, se pregătesc două seturi a câte 3 sau 4 cutii Petri, în funcţie de cât este estimată
încărcarea microbiană a acesteia.
Un set de cutii se pregăteşte pentru încercarea numărului de colonii la 22 0C, iar al doilea set
pentru încercarea numărului de colonii la 37 0C.
Pe capacul fiecărei cutii se notează cu un marker permanent, de către executantul încercării:
 codul probei luată în lucru;
 diluţia probei care se va inocula;
 temperatura de incubare (22 0C sau 37 0C);
 data execuţiei încercării.
În hota cu flux de aer laminar, în care se execută încercarea, se pune un container din inox cu
pipete gradate sterile cu volumul de 1 ml şi alt container cu pipete gradate sterile cu volumul de
10 ml. Din refrigeratorul în care sunt păstrate flacoanele cu mediul de cultură, apa tamponată de
diluţie şi eprubetele goale sterilizate, se scot cu aproximativ o oră înainte de începerea execuţiei
încercării, cantitatea necesară din aceste produse. Pentru prevenirea distrugerii microorganismelor
prin schimbări bruşte ale temperaturii, se recomandă ca temperatură diluantului să fie aproximativ
aceeaşi cu temperatura camerei.

5.4.1.1. Prepararea suspensiei iniţiale de probă şi a diluţiilor decimale

Înainte de începerea încercării, proba de apă se omogenizează prin agitarea manuală a
recipientului cu probă, efectuându-se aproximativ 10 mişcări de sus în jos. În funcţie de tipul de
apă şi de conţinutul bacterian anticipat (diluţia trebuie aleasă astfel încât numărul estimativ de
UFC formate pe cutiile Petri cu diametrul de 90-100 mm să fie maxim 300) se realizează
suspensia iniţială de probă şi o serie de diluţii decimale necesare.

5.4.1.2. Inocularea probei şi a diluţiilor

Metoda utilizată este cea a încorporării în placă, paşii de lucru fiind următorii:
 se flambează la becul de gaz din hotă, vârful pipetei gradate şi gura recipientului cu proba
de încercat sau a eprubetei cu diluţiile executate;
 se introduce pipeta flambată, după aproximativ 5 secunde de la flambare pentru ca aceasta
să se răcească în recipientul cu probă sau în eprubetele cu diluţii şi se aspiră un volum de
1ml;
 se scoate pipeta cu volumul aspirat de 1ml probă, respectiv diluţii ale acesteia, din
recipientul cu probă, respectiv eprubete cu diluţii;
 se ridică cu mâna stângă capacul cutiei Petri sterilă, pregătită şi marcată corespunzător,
conform punctului 5.4.1. şi se deversează în cutie volumul de 1ml aspirat în pipetă, după
care se acoperă cutia cu capacul, care s-a ţinut în mâna stângă;
 se repetă operaţiile descrise până la inocularea tuturor cutiilor pregătite;
 se scoate flaconul cu mediu de cultură din baia de apă în care a fost păstrat la temperatura
de 450C şi se aduce în hota cu flux de aer laminar, în care s-a executat încercarea şi se
găsesc cutiile inoculate;
 se ţine flaconul cu mediul de cultură în mâna dreaptă, se deschide cu mâna stângă dopul
acestuia, care se lasă pe masa hotei şi se flambează gura flaconului la flacără becului de
gaz, pornită la apăsarea pedalei acestuia;
 se ridică cu mâna stângă capacul unei cutii inoculate şi se toarnă în aceasta mediul de
cultură din flacon, într-un strat de aproximativ 2 mm grosime, volumul fiind aproximativ
de 15-20ml mediu, după care se acoperă cutia cu capacul care a fost ţinut în mâna stângă;
 se amestecă inoculul din cutie cu mediul de cultură turnat prin rotaţii lente, de 5 ori în
sensul acelor de ceasornic şi de 5 ori în sens invers acelor de ceasornic, pentru a se obţine
o distribuire uniformă a eventualelor microorganisme prezente şi se lasă cutia pentru
solidificare pe o suprafaţă orizontală;
 se repetă operaţiile descrise pentru toate cutiile Petri inoculate.
NOTĂ: timpul de la inocularea probei sau diluţiilor acesteia în cutii Petri şi până la adăugarea
mediului de cultură nu trebuie să fie mai mare de 15 min.

5.4.1.3. Incubarea şi examinarea

După solidificarea mediului de cultură, un set din cutiile Petri, astfel inoculate, se întorc cu
capacul în jos şi se incubează, la (36±2)0C pentru (44±4) ore în termostat pentru încercarea
numărului de colonii la 37 0C la probele de apă.
Al doilea set din cutiile Petri, astfel inoculate, se întorc cu capacul în jos şi se incubează, la
(22±2)0C pentru (68±4) ore, în termocriostat. pentru încercarea numărului de colonii la 22 0C la
probele de apă.
Examinarea cutiilor se efectuează după ce acestea se scot de la incubaţie, iar dacă nu este posibil
acestea se conservă la (5±3)0C, în refrigerator.timp de maxim 48 ore. Se elimină orice cutie pe
care se observă o creştere confluentă a coloniilor sau un număr de peste 300 UFC.
5.4.1.4. Numărarea coloniilor
După perioada de incubare corespunzătoare, executantul scoate din termostate toate cutiile Petri
inoculate şi le aşează pe masa de lucru. Pentru fiecare temperatură de incubare, se numără
coloniile cu creşteri evidente de pe fiecare cutie Petri.
5.5. Prezentarea rezultatelor
5.5.1. Mod de calcul
Calcularea rezultatului pentru o probă de apă se face din numărul coloniilor de pe toate cutiile
Petri inoculate cu proba respectivă sau cu diluţiile acesteia, număr care a fost înregistrat de
executantul încercării în caietul de lucru. Calculul rezultatului final se face după următoarea
ecuaţie:
Cs = [ N / (n1 x V1 x F1) + (n2 xV2 x F2) + (n3 x V3 x F3)] x Vs,
în care:
Cs = numărul de UFC în raport cu volumul de referinţă al probei (Vs);
N = suma tuturor coloniilor numărate în cutiile Petri inoculate, derivînd din diluţiile F1, F2...Fi ;
n1, n2, n3……….ni = numărul cutiilor luate în calcul pentru fiecare diluţie F1, F2 …. Fi ;
V1, V2, V3………Vi = volumul test folosit cu diluţiile F1, F2 …. Fi ;
F1, F2 …. Fi = diluţia folosită pentru porţiunea test V1,V2, V3………Vi
( F=1 pentru o probă nediluată, F=0,1 pentru dilutia 0,1….etc).