 Analiza microbiologică a materiei prime şi a produselor finite din industria prelucrării

legumelor şi fructelor

1.Analize microbiologice-, pe preparate microscopice umede şi uscate pentru identificarea bacteriilor

2.Analize microbiologice-, pe preparate microscopice umede şi uscate pentru identificarea drojdiilor

3.Analize microbiologice-, pe preparate microscopice umede şi uscate pentru identificarea

mucegaiurilor

FIȘA DE DOCUMENTARE
EXAMINAREA MORFOLOGICĂ A
MICROORGANISMELOR
Lucrările de microscopie au drept obiectiv identificarea microorganismelor, după
caracteristicile morfologice. Sunt observate îndeosebi microorganismele cu importanţă
deosebită în industria alimentară.
Desenele, realizate prin examinare microscopică, sunt comparate, în vederea identificării, cu
reprezentările grafice ale microorganismelor.
Preparatele microscopice sunt de două feluri: umede şi uscate (colorate)
Preparatele microscopice umede sunt cele mai des folosite şi se numesc astfel pentru că se
fac cu ajutorul unei picături de apă; cu ele se observă microorganismele în stare vie. Tehnica
de pregătire a preparatelor microscopice umede este prezentată mai jos.
Preparatele microscopice uscate, simplu colorate, utilizate pentru examenul microscopic al
bacteriilor, pot fi realizate după schema din figură.
În pregătirea preparatelor se efectuează mai întâi frotiul şi apoi colorarea lui.
Prin frotiu se înţelege materialul microbian etalat în strat subţire pe suprafaţa unei lame de
microscop, curată şi degresată.
Operaţiile de uscare şi fixare a preparatelor realizează omorârea bacteriilor, favorizează
colorarea, deoarece proteiniele coagulate aderă mai bine pe lamă şi fixează mai bine
colorantul, ceea ce împiedică desprinderea frotiului, în timpul operaţiilor de colorare-spălare.
PREPARATE MICROSCOPICE UMEDE
Mod de lucru
I.PREGĂTIREA LAMEI

a - se curăţă o lamă şi o lamelă cu alcool

b- se flambează
II. PREGĂTIREA PREPARATULUI MICROSCOPIC UMED
- se aşează în centrul lamei cu o pipetă Pasteur sterilizată o picătură de apă distilată sau din
cultura lichidă
- se plimbă lamela înclinată la 450C pe suprafaţa lamei până întâlneşte picătura, apoi lamela
se lasă uşor, evitând prinderea aerului în preparat

- se îndepărtează, dacă este cazul, excesul de lichid cu o hârtie de filtru

- se aşază lama cu preparatul microscopic pe platina microscopului şi se fixează cu ajutorul
clemelor
III. EXAMINAREA PREPARATULUI
- se examinează preparatul
- se aduce în axul optic obiectivul dorit, prin rotirea revolverului;
- se prinde imaginea;
- se observă şi se desenează;
- se ridică tubul microscopului şi se scoate lama
Colorarea frotiului poate fi simplă şi compusă.
Coloraţia simplă utilizează un singur colorant. Uzuală este coloraţia cu albastru de metilen.
Coloraţia compusă foloseşte mai mulţi coloranţi, permiţând astfel diferenţierea germenilor în
funcţie de proprietăţile lor. Dintre coloraţiile compuse, se utilizează cel mai des coloraţia
Gram. Principiul acestei metode constă în formarea unui complex între sarea de magneziu a
acidului ribonucleic din celula bacteriană, colorantul violet de genţiană şi iod, complex insolubil
în soluţia decolorantă alcool - acetonă (soluţia Nicolle).
PREPARATE MICROSCOPICE USCATE ŞI COLORATE
I. PREGĂTIREA USTENSILELOR

a - se degresează lama şi lamela cu vată îmbibată cu alcool;

b - se flambează lama şi mânerul ansei; se încălzeşte la roşu vârful ansei;
c - se pune în centrul lamei o picătură de apă;
d - se recoltează cu vârful ansei (răcit în prealabil) o porţiune mică din probă şi se
emulsionează în apă, formând un strat cât mai subţire şi cât mai uniform ca grosime (frotiu).
II. USCAREA Şl FIXAREA PREPARATULUI

a - se usucă la căldură slabă (la min. 250 mm deasupra flăcării);

b - se fixează prin trecerea lentă de 2-3 ori prin flacără, cu frotiul deasupra;
III. COLORAREA PREPARATULUI

a - se acoperă frotiul cu albastru de metilen fenicat şi se lasă să acţioneze un minut, după
care se scurge colorantul;
b - se spală cu apă până preparatul nu mai cedează colorant;
c - se usucă cu hârtie de filtru;
d - se pun peste frotiu 1-2 picături de ulei de cedru;
IV. EXAMINAREA PREPARATULUI
- se examinează la microscop, cu imersie.
- se aduce în axul optic al microscopului obiectivul de 90;
- se prinde imaginea şi se clarifică prin manevrarea vizelor;
- se desenează; bacteriile sunt albastre
- se ridică tubul, se scoate lama şi se şterge obiectivul.
Bacteriile care păstrează coloraţia albastru-violet se numesc Gram-pozitive, iar bacteriile care
nu formează complexul şi sunt colorate complementar cu fucsină, apar colorate în roşu şi se
numesc Gram-negative.
Pentru coloraţia Gram se folosesc următorii coloranţi: violet de genţiană 1%, fucsină
1%, soluţie Lugol preparată din iod metalic 1g, iodură de potasiu 2g, 300 ml apă
distilată, soluţie Nicolle, amestec de alcool şi acetonă în proporţie de 5:1
ANALIZA MICROBIOLOGICĂ A CONSERVELOR
Analiza microbiologică are ca scop verificarea stării generale, sanitare a recipientului şi a
produsului supus analizei şi, dacă este cazul, stabilirea caracterelor eventualei microflore
reziduale.
1. Examinarea recipientelor, în prima fază se notează în fişă toate semnele stanţate
de pe recipient sau înscrise pe eticheta acestuia. Se scoate eticheta, se examinează cu
ajutorul lupei şi se notează toate defectele fizice exterioare (rugină, deformări,
închideri necorespunzătoare, fisuri, scurgeri) şi interioare (după recoltarea probei).
b) Incubarea la termostat Aceasta se face, pentru microflora mezofilă, la 37°C/7-10 zile,
iar în cazuri speciale sau la cerere, pentru microflora termofilă, la 55°C/5 zile. Se examinează
apoi periodic la 24-48 ore. Dacă se observă bombaj sau scurgere de conţinut, nu se mai fac
alte examene.
c) Recoltarea probei, în vederea recoltării probei se va avea grijă ca:
- să se lucreze în boxe, prevăzute cu lămpi bactericide cu radiaţii ultraviolete;
- toate instrumentele utilizate se sterilizează în etuvă la 180° C/60 minute;
- se lucrează în apropierea flăcării;
- se perforează capacul neştanţat al recipientului; la produsele lichide se face un orificiu de
10-15 mm, la produsele consistente orificiul va fi mai mare;
- se recoltează, în funcţie de consistenţa produsului, cu sonde de sticlă (d = 8-10 mm), pipete
cu orificiul larg, bisturie, foarfece, pense etc.;
- produsele cu consistenţă solidă vor fi trecute în suspensie în apă sterilă.
d) Examenul microscopic direct. Scopul: aprecierea cantitativă a germenilor existenţi.
Acest examen nu se aplică produselor obţinute prin fermentaţie microbiană. Examinarea se
face după schema următoare:
Întinderea picăturii în centrul lamei
Uscarea în aer
Degresarea cu xilen+alcool
Colorarea cu albastru de metilen 1%;1 minut
Spălarea, uscarea
Observare cu imersie oc. 1Qx; ob. 90x
Examenul sterilităţii. Examenul sterilităţii se face prin însămânţare în medii de cultură
adecvate, a unei părţi din conţinutul recipientului supus analizei şi care n-a prezentat vreo
modificare exterioară în cursul incubării în termostat.
Mediile de cultură folosite, durata şi temperatura de termostatare sunt date în
tabelul următor:
Mediul de cultură Condiţii de incubare Condiţii de incubare
Bulion nutrtiv glucozat 37°C 72 ore
Bulion nutritiv glucozat 37°C 72 ore
fitat
Bulion cu peptonă 35°C 72 ore
tripsică

Tehnica de lucru: * se însămânţează fiecare eprubetă cu mediu, cu aproximativ 3g de

produs de analizat, se incubează la 37°C timp de 72 ore; * zilnic se urmăresc mediile de
cultură însămânţate, eprubetele în care au apărut semne de dezvoltare microbiană se
examinează. * dacă la sfârşitul perioadei de incubare nu au apărut semne de creştere
microbiană, recipientul supus analizei se consideră steril. Examinarea culturilor, în ziua
apariţiei semnelor de creştere microbiană, se execută frotiuri, care se colorează după metoda
Gram şi se examinează prin imersie. Dacă se observă prezenţa cocilor sau bacililor nesporulaţi
Gram-negativi, se consideră că recipientul analizat a conţinut microflora nesporulată. Dacă se
observă doar bacili nesporulaţi Gram-pozitivi eprubetă se ter-mostatează încă 72 ore, după
care se repetă examenul microscopic. Dacă nici la acest examen nu se găsesc spori
bacterieni, se consideră că recipientul a conţinut numai microflora
nesporulată. Interpretarea rezultatelor analizei microbiologice Se consideră
corespunzător din punct de vedere microbiologic recipientul care nu a suferit modificări
exterioare (bombaj) după incubarea în termostat şi care îndeplineşte următoarele condiţii: *
conţinutul nu prezintă modificări de miros sau aspect, determinate de o activitate microbiană,
la examenul microscopic se observă, în medie, cel mult 10 microorganisme pe un câmp
microscopic, iar mediile de cultură însămânţate rămân sterile; * la examenul microscopic se
observă, în medie, mai mult de 10, dar mai puţin de 30 microorganisme/câmp, iar mediile de
cultură însămânţate rămân sterile. Se consideră necorespunzător din punct de vedere
microbiologic, recipientul la care în cursul termostatării apare bombaj, iar conţinutul prezintă
modificări de miros sau aspect, determinate de o activitate microbiană.