Protocolul prelevării, transportului și

condiționării probelor biologice și metodologia

diagnosticului de laborator în pesta porcină
clasică (PPC)

Student: Ambrosimov Adela

Grupa A, Anul VI
 Cuprins
INTRODUCERE .........................................................................................................................3

1. Etiologie ...............................................................................................................................4

2. Caractere epizootologice ......................................................................................................4

3. Protocolul de recoltare, transport și condiționare al probelor biologice .................................5

3.1 Recoltarea de probe pentru laborator .............................................................................6

3.2 Transportul și condiționarea probelor biologice ............................................................7

4. Teste virusologice ................................................................................................................8

4.1 Detectarea antigenului viral ...........................................................................................8

4.2 Izolarea virusului ......................................................................................................... 10

4.3 Detectarea genomului viral .......................................................................................... 11

5. Testele serologice ............................................................................................................... 12

Bibliografie ............................................................................................................................... 15

2
 INTRODUCERE

Pesta porcină clasică este o boală virală, extrem de contagioasă, specifică suideelor,
caracterizată prin tulburări cardiovasculare, respiratorii, digestive și prin leziuni de tip
hemoragic. Prin răspândirea ei, prin procentul ridicat de mortalitate și morbiditate, această boală
continuă să rămână una dintre cele mai păgubitoare afecțiuni a specie porcine. (Perianu T. și
colab., 2015)
În anul 2017, în cadrul lucrărilor celei de-a 85-a Sesiuni Generale a Adunării Mondiale a
delegaților Organizației Mondiale pentru Sănătatea Animalelor (OIE), România este admisă pe
listă statelor libere de pestă porcină clasică. În luna martie a anului 2020, României i se revocat
acest statut, motivul fiind neîndeplinirea în totalitate a dispozițiile relevante din Codul de
sănătate al animalelor terestre, pentru menținerea statusului oficial de țară liberă de pestă porcină
clasică (PPC).
Conform informațiilor furnizate de platform OIE-WAHIS, în anul curent, pesta porcină
clasică evoluează pe continentele Sud-American și Asiatic.
În țară noastră, conform Ord. 67/2005, prezenţa sau suspicionarea pestei porcine clasice
este notificată obligatoriu şi imediat autorităţii veterinare competențe. Autoritatea veterinară
română trebuie să notifice boală şi să furnizeze informaţii Comisiei Europene şi Statelor Membre
cu privire la cazurile ulterioare confirmate la suinele dintr-o zonă infectată.
Pentru a se garanta aplicarea de proceduri uniforme de diagnostic la nivel național, a fost
elaborat un Manual de diagnostic al pestei porcine clasice ce stabilește procedurile de
diagnosticare, metodele de prelevare de probe și criteriile de evaluare a testelor de laborator
pentru confirmarea pestei porcine clasice.

3
 1. Etiologie

Pesta porcină clasică este produsă de un virus ARN cu anvelopă, din familia Flaviviridae,
genul Pestivirus. Acest virus este înrudit cu Pestivirus ai rumegătoarelor care provoacă diareea
virală a bovinelor (DVB) și pesta virală ovină (PVO). Această corelare are repercusiuni
importante pentru diagnostic, căci se produc reacții încrucișate care pot duce la rezultate fals
pozitive ale testelor de laborator.
Virusul pestos are afinitate pentru organele hemato- și limfopoetice și endoteliul vascular,
unde se replică.
Se cultivă pe culture celulare de țesuturi de porc bogate în elemente reticulo-endoteliale sau
culture renale și testiculare de porc. Acesta este unic din punct de vedere antigenic, dar cu mari
variații de patogenitate în funcție de tulpină. Tulpinile viulente (A) sau forme septicemice, iar
tulpinile hipovirulente (B) se manifestă la purceii proveniți din mame infectate.
Virusul pestei porcine clasice este relativ stabil în excrețiile umede ale porcilor infectați, în
carcasele de porc, în carnea proaspătă de porc și în anumite produse din carne de porc. El este
ușor inactivat de detergenți, solvenții grași, proteaze și dezinfectanții uzuali.

2. Caractere epizootologice

În mod normal la pesta porcină clasică sunt receptive numai animalele din familia Suidee:
porci domestici, porcii mistreți și porcii sălbatici, precum porcul de pădure, porcul de rău, porcul
cu negi, etc.. Cele mai sensibile la infecție sunt rasele perfecționate și tineretul după înțărcare.
Principala cale naturală de infectare este de tip oronazal, prin contact direct sau indirect cu
porcii infestați sau prin administrarea animalelor de hrană contaminată cu virus. În zonele cu o
mare densitate de crescătorii de porci, virusul se propagă cu ușurință de la o exploatație la
exploatația vecină.
Sursa virusului o constituie: sângele şi ţesuturile, secreţiile şi excreţiile animalelor bolnave
şi moarte, purceii infectaţi congenital cu viremie persistentă şi care pot împrăştia virusul luni
întregi. Virusul se transmite, de asemenea, prin materialul seminal provenit de la vieri infectați.

4
 Perioada de incubație la indivizi este cuprinsă între o săptămână și zece zile, dar, în condiții
reale, este posibil că simptomele clinice să nu apară într-o exploatație decât după două până la
patru săptămâni de la introducerea virusului.
Se pot distinge forme supraacute, acute, cronice și prenatale ale pestei porcine clasice.
Semne clinice în forma acuta:
 febra (41ºC), anorexie, letargie, hiperemie multifocală și leziuni hemoragice ale
pielii,
 conjunctivite, cianoza pielii, în special a extremităților;
 constipație, diaree, vomitări ocazionale, dispnee, tuse;
 ataxie, pareze și convulsii;
 moarte, după 5-15 zile de la apariția semnelor clinice;
 mortalitatea la mistreții tineri poate atinge 100%
Leziunile morfopatologice în forma acută:

Fig. 1 Leziuni anatomopatologice in PPC. (A) Hemoragii difuze la nivelul pielii. (B)
Hemoragii epicardice. (C) Infarcte multifocale marginale pe splină. (D) Ganglioni limfatici
măriţi în volum şi hemoragici. (E) Petesii hemoragice pe corticala renala. (E) Petesii
hemoragice si ulcere pe suprafata mucoasei gastrice.

3. Protocolul de recoltare, transport și condiționare al probelor biologice

Tablul clinic foarte variabil a PPC exclude diagnosticare doar pe baza semnelor clinice și
morfopatologice. Prin urmare, metodele de laborator sunt esențiale pentru un diagnostic

5
neechivoc. Detecția virusului sau a acidului nucleic viral în sângele integral necoagulat și a
anticorpilor din ser sunt metodele de elecție pentru diagnosticarea PPC la porcii vii, diagnosticul
virusului, a acidului nucleic viral sau antigenului în probele de organe, este cel mai potrivit atunci
când porcul este mort.

3.1 Recoltarea de probe pentru laborator

Accesul medicului veterinar, atât în exploatațiile profesionale cât și non-profesional, în

cazul în care se suspicionează PPC, se realizează purtând echipament de protecţie individual
complet. Acest echipament este format din : . combinezon de unică folosinţă complet sau costum
salopetă, cizme cauciuc, mască buco-nazală de unică folosinţ, mănuşi de unică folosinţă.
Înainte de efectuarea prelevării de probe dintr-o exploatație, trebuie să fie realizată o harta
a exploatației și trebuie să fie identificate subunitățile epidemiologice ale acesteia. De fiecare
dată când se consideră că ar putea fi necesară o reprelevare de probe, toți porci de la care se
prelevează probe, trebuie să fie unic marcați în așa fel încât să fie ușor de efectuat reprelevarea .
Pentru detectarea virusului, antigenul sau genomul virusului pestei porcine clasice de la
porcii morţi sau eutanasiaţi, cele mai potrivite probe sunt ţesuturile din tonsile, splină şi rinichi.
În plus, este recomandat să se preleveze două probe din alte ţesuturi limfatice, cum ar fi
limfonodulul retrofaringian, parotidian mandibular sau mezenteric şi o probă de ileon. În cazul
carcaselor autolizate, se alege un os lung întreg sau sternul. Probele se recoltează în timpul
necropsiei de către medicul veterinar oficial sau, în lipsa acestuia, de către medicul veterinar de
liberă practică împuternicit.
De la porcii care au prezentat febră sau alte semne de boală, trebuie prelevate probe de
sânge pe anticoagulante (EDTA). Probele destinate testelor serologice nu trebuie prelevate de la
purcei cu vârsta mai mică de opt săptămâni.
Toate probele trebuie să fie trimise la laborator însoțite de formulare corespunzătoare, în
conformitate cu cerințele stabilite de autoritatea competentă. Formularele vor menționa detalii
privind antecedentele porcilor supuși prelevării de probe, precum și semnele clinice sau leziunile
post mortem observate.
În cazul porcilor dintr-o exploatație, trebuie furnizate informații clare referitoare la vârsta,
categoria și exploatația de origine a porcilor supuși prelevării de probe. Se recomandă că

6
localizarea fiecăruia dintre porcii supuși prelevării de probe în exploatație să fie înregistrată în
același timp cu marca să specifică de identificare.

3.2 Transportul și condiționarea probelor biologice

Se recomandă că toate probele:

- să fie transportate şi depozitate în containere închise ermetic;
- să nu fie congelate, dar să fie păstrate reci, la temperatura frigiderului şi transportate pe
pachete de refrigerare (nu pe gheaţă carbonică);
- să fie expediate spre laborator cât mai repede posibil;
- probele individualizate se ambalează astfel: țesuturile sau organele sunt puse într-o pungă
de plastic separată, închisă și etichetate corespunzător, şi împachetate cu suficient material
absorbant pentru a le proteja de deteriorare și pentru a absorbi lichidele care se pot scurge;
- probele se introduc în primul sac de plastic care se închide și se decontamineaza la
exterior, după care se introduc în cel de-al doilea sac de plastic, care se sigilează, apoi se introduc
în lada izoterma sau în termos;
- lada izoterma (cu baterii refrigeratoare) sau termosurile (cu gheață) se închid și se
sigilează efectuându-se dezinfecţia exterioară a acestora. - acolo unde este posibil, probele să fie
transportate direct la laborator, de personal competent, pentru a se asigura un transport rapid și
sigur; când acest lucru nu este posibil, ele vor fi refrigerate; probele patologice, cu excepția
sângelui (pentru ser), trebuie conservate pe parcursul transportului la 4oC mai ales dacă
transportul va necesită mai mult de 1 ora;
- exteriorul pachetului trebuie să fie etichetat cu adresa laboratorului destinatar și trebuie să
fie înscris evident următorul mesaj: Material patologic animal; Perisabil; Fragil; A nu se
deschide în afară unui laborator pentru pesta porcină clasică. Pe lada frigorifică trebuie lipită
şi o etichetă cu “BIOHAZARD”, după unul dintre următoarele modele:

7
 Fig. 2 Eticheta
Fig. 3 Eticheta
- probele patologice trebuie să fie însoțite de un formular de trimitere către laborator, care a
fost completat corespunzător, incluzând toate detaliile necesare identificării animalului, date
informative privind semnele clinice, suspiciunea de diagnostic, precum și solicitarea pentru un
anumit test sau teste de diagnostic.
Pentru transportul cu avionul al probelor trimise laboratorului comunitar de referință pentru
pesta porcină clasică de către alte state membre decât Germania sau de către țări terțe, ambalajul
trebuie să fie etichetat în conformitate cu regulamentele Asociației de Transport Aerian
Internațional (AȚă). Transportul internațional necesită, de regulă, că probele biologice să fie
ambulate în gheață carbonică (CO2 solid).

4. Teste virusologice

4.1 Detectarea antigenului viral

Testul de imunofluorescență directă (IFD)

Testul de imunofluorescență se utilizează pentru detecția antigenului VPPC în secțiuni

criostatice din organele țintă pentru virus (tonsile, splină, rinichi, limfonoduri, porțiunea distala a
ileonului) și frotiuri de măduva roșie sternala. Testul este realizat cu un conjugat fluorescent
obținut din ser policlonal anti-VPPC ce reacționează specific cu antigenul VPPC din probele
biologice. Pentru a diferenția pestivirusurile, se folosesc anticorpi monoclonali în testul imuno
peroxidazei. Complexul antigen-anticorp specific - FITC (conjugat cu FITC) format, este pus în
evidență la lumina ultravioleta.
Modul de executare IFD:
1. Se taie secțiuni din organele țintă cu un microtom criostatic și se pun pe lamele.
Secțiunile criostatice și frotiurile de suc medular (măduva sternala roșie) se usucă la
temperatura camerei sau se fixează în acetonă 10 min;

8
 2. Se va include o secțiune pozitivă și una negativă în test pentru a verifică activitatea
conjugatului și colorarea de fundal;
3. Se clătesc secțiunile cu tampon fosfat salin (PBS);
4. Secțiunile criostatice sau frotiurile (probele) se acoperă cu un strat subțire și uniform din
soluția de lucru a conjugatului fluorescent;
5. Se incubează 30 minute la 37oC, în atmosfera umedă;
6. Lamele se spală cu soluție tampon fosfat salin pentru spălare;
7. Se scurg lamelele și se fixează pe lame cu soluție tampon glicerinata;
8. Se examinează seciunile pentru celulele fluorescente (citoplasmă) cu un microscop cu
lumina UV.
Reacție pozitivă: Fluorescenta specifică este evidențiată printr-o coloratie verzuie sau
galben verzuie a citoplasmei asemănătoare cu cea înregistrată la martorii pozitivi de reacție de pe
lamele martor de control.
Reacție negative: Nu se observă celule cu fluorescent descrisă anterior, aspectul fiind
identiv cu frotiul martor negative.

Fig. 4 Reactie pozitiva IFD PPC Fig. 5 Reactie negative IFD PPC
Frotiu maduva sternala FITC, x400 Frotiu maduva sternala FITC, x400

Testul ELIȘA pentru detectarea antigenului

Se recomandă utilizarea tehnicilor ELIȘA Sandwich pentru detectarea antigenului pe

probele provenind de la animale care prezintă semne clinice sau leziuni patologice ale bolii. Nu
este recomandată pentru investigarea individuală a animalelor.

9
 Probele potrivite sunt leucocitele, serul, sângele necoagulat, precum și suspensiile
organelor, prelevate de la porci suspecți de a fi infectați cu virusul pestei porcine clasice.
Metodă de lucru:
1. Se utilizează un suport solid ce conține anticorpi de captare specifici atg de identificat;
2. Se repartizează proba de antigen de cercetat și se incubează 1-2 ore la temperatura de
37oC, după care se spală microplaca;
3. Se adaugă un ser cu anticorpi primari specifici nemarcati și se incubează 1 ora la 37oC,
după care se spală microplaca;
4. Se adaugă conjugatul enzimatic format din atc secundari (atc anti-Ig de specie) cuplați cu
enzima și se lasă 30 minute la 37oC, după care se spală placă;
5. Se adaugă substratul enzimatic specific și se lasă la întuneric 30 minute la temperatura
camerei;
6. După adăugarea soluției de stopare, se face citirea în cel mult 10 minute la un
spectofotometru.

4.2 Izolarea virusului

Izolarea virusului din probe de țesut se face pe culturi celulare sensibile PK 15, SK 6 sau pe
alte linii celulare la fel de sensibile (susceptibile). În general, este avantajos să se folosească mai
multe linii de celule porcine pentru inoculare, pentru a spori șansele unui rezultat pozitiv. În
cazul în care virusul pestei porcine clasice este prezent în probă, el se va reproduce în celule în
cantități detectabile prin imunocolorarea celulelor infectate cu anticorpi conjugați.
Cele mai bune probe pentru tehnică de izolare a virusului pestei porcine clasice sunt
leucocitele, plasmă sau sângele total, prelevate de pe probe de sânge necoagulat sau organe.
Amigdalele sunt cel mai potrivit organ pentru izolarea virusului de la porcii care au murit sau au
fost uciși în scop de diagnostic. Alternativ sau în plus, se pot utiliza și splina, rinichii, ileonul sau
ganglionii limfatici.
Deoarece creșterea virusului nu provoacă efect citopatic, prezența să trebuie demonstrată
printr-o metodă de imunocolorare, care poate fi efectuată după unul sau două pasaje de virus.
Acest lucru se poate face prin examinarea culturilor prin testul cu anticorpi fluorescenți (FĂT)
după 24-72 de ore sau prin testul cu anticorpi marcați cu imunoperoxidaza după 3-4 zile de
incubație. Întotdeauna trebuie incluși martori pozitivi și negativi.

10
 Izolarea virusului trebuie considerată că fiind testul virologic de referință și trebuie să fie
utilizată că test de confirmare, după caz. Utilizarea să este recomandată îndeosebi în cazul în care
rezultate pozitive ale testelor IFD, ELIȘA sau PCR nu sunt asociate cu detectarea semnelor
clinice sau cu leziuni ale bolii, precum și în orice alt caz suspect.
Metodă de lucru (Anita A., 2014):
1. Se prepară o soluție stoc cu antibiotice folosind un mediu tamponat (TPL sau TFS) cu
penicilină și streptomicina;
2. Se realizează o suspensie de 10% a materialului patologic (1g de organ + 9g soluție stoc);
3. Se centrifugheaza la 2 000 rpm timp de 10 minute;
4. Supernatantul se inoculează pe culturile celulae;
5. Culturile sunt incubate la 37oC și inspectate periodic, o dată sau de două ori pe zi
Dacă se folosește o proba de sânge, acesta se poate utiliza că atare (nediluat). Când este
nevoie numai de leucocite, sângele trebuie centrifugat, iar strtatul intermediar de celule albe este
prelevat și suspendat în TPL.

4.3 Detectarea genomului viral

PCR servește la detectarea genomului virusului în probele de sânge, de țesuturi sau de

organe. Deoarece aceste teste nu detectează decât o secvență a genomului virusului, PCR poate
da un rezultat pozitiv chiar în absența virusului pestei porcine clasice.
PCR poate fi utilizat pe un mic număr de probe, selectate cu grijă, de la animale suspecte
sau pe un material provenind de la fetuși avortați. Aceasta ar putea fi metoda ideală pentru
carcasele de porci sălbatici, în cazul în care materialul este autolizat și izolarea virusului nu mai
este posibilă din cauza citotoxicității.
Materialul care se pretează la diagnosticul cu ajutorul PCR se compune din probe ale
organelor menționate pentru izolarea virusului sau sângele necoagulat.
Metoda este foarte sensibilă, dar se pot produce ușor contaminări, ceea ce duce la rezultate
fals pozitive. Este deci indispensabil să se aplice proceduri severe de control al calității. Anumite
metode sunt specifice Pestivirus și nu pestei porcine clasice și necesită teste de confirmare
suplimentare, cum sunt secvențierea produsului PCR.
Metoda de lucru:
1. Omogenizarea fragmentelor de țesut într-o soluție denaturantă;

11
 2. Amestecarea omogenatului în mai multe etape cu soluții de acetat de sodium, fenol și
chloroform/alcool izoamilic;
3. Centrifugarea omogenatului și transferarea fazei apoase superioare într-un tub nou.
4. Precipitarea ARN-ului cu izopropanol și incubarea acestuia 30 minute;
5. Centrifugarea și apoi înlăturarea supernatantului;
6. Resuspendarea sedimentului ARN în sol. etanol și incubarea 10-15 minute la
temperatura camerei;
7. Centrifugarea și apoi înlăturarea supernatantului; uscarea sedimentului ARN;
8. Resuspendarea sedimentului ARN în apă ultrapure;
9. Verificarea integrităţii ARN prin electroforeză în gel denaturant de agaroză;
Acidului nucleic extras se utilizeaza pentru detecția prin PCR în timp real.

5. Testele serologice
La porcii infectați cu virusul pestei porcine clasice, anticorpii pot în general să fie detectați
în probele de ser după două-trei săptămâni de la infectare. La porcii vindecați, anticorpi
protectori și neutralizanți pot fi detectați timp de mai mulți ani și chiar de-a lungul întregii vieți.
De asemenea, pot fi detectați sporadic anticorpi la animale bolnave în fază terminală. La unii
porci care prezintă forme cronice de pestă porcină clasică, pot fi detectați anticorpi timp de
câteva zile la sfârșitul primei luni care urmează infectării.
Detectarea anticorpilor virusului pestei porcine clasice în probele de ser sau de plasmă
servește la confirmarea diagnosticului de pestă porcină clasică în exploatațiile suspecte, la
stabilirea vârstei infecției în caz de focar confirmat. Cu toate acestea, testele serologice au o
utilitate limitată pentru detectarea pestei porcine clasice într-o exploatație recent infectată.
Un mic număr de porci seropozitivi care prezintă un titru scăzut de neutralizare poate
indică o infecție recentă (două sau trei săptămâni). Un număr mare de porci caracterizați printr-
un titru de neutralizare ridicat indică faptul că virusul a pătruns în exploatație cu mai mult de o
lună în urmă. Localizarea porcilor seropozitivi în exploatație poate furniza informații utile despre
modul în care virusul pestei porcine clasice a intrat în exploatație.
Testul de seroneutralizare cu anticorpi marcați cu peroxidazan (TNV) și ELIȘA sunt
cele mai bune pentru diagnosticul serologic al pestei porcine clasice.

12
 Testul de seroneutralizare se realizează în microplaci cu godeuri sterile, pentru culturi
celulare. Metodă constă în inocularea pe culturi celulare a amestecului format din suspensia
virală și diferite dilutii din serul de cercetat (inactivat la 56oC, timp de 30 de minute, pe baia de
apă).
Evidențierea virusului rămas liber (neneutralizat) și replicat în sistemul celular se face cu
ajutorul unui ser hiperimun cu anticorpi specifici antivirali. Cuplul antigen-anticorp format se
identifica cu ajutorul unui conjugat format din atc anti-IgG de specie cuplați cu o enzima
(peroxidaza). Developarea se realizează cu ajutorul unui substrat cromogen specific enzimei.
Stoparea reacției de culoare se realizează prin adăugarea de NaCl în toate godeurile. Citirea se
face la microscop ranversat în lumină normală.
Reacție pozitivă - Absența anticorpilor în serul de testat determina multiplicarea virusului
în citoplasma celulelor care apare roșu închis.
Reacție negativă - Prezența anticorpilor în serul de testat inhibă replicarea virusului, iar
citoplasma celulelor are o ușoară tentă roz deschis.
Testul de seroneutralizare este testul cel mai sensibil și cel mai fiabil pentru detectarea
anticorpilor virusului pestei porcine clasice. De aceea se recomandă să se recurgă la el pentru
examenul serologic atât al unui animal izolat, cât și al unei turme. Cu toate acestea, acest test
permite și detectarea anticorpilor de neutralizare încrucișată specifici ai infecțiilor cu Pestivirus
ai rumegătoarelor la porci.
Mai multe tehnici ELIȘA care utilizează anticorpi monoclonali specifici au fost puse la
punct; ele sunt de două feluri: tehnicile concurențiale sau de blocaj și tehnicile neconcurențiale.
Testul ELIȘA concurențial sau de blocaj se bazează în general pe anticorpi monoclonali. În
cazul în care proba de ser conține anticorpi ai virusului clasic, legătura între un anticorp
monoclonal cuplat cu peroxidaza și antigenul virusului va fi inhibată, ceea ce are că rezultat o
atenuare a semnalului.
În testele ELIȘA neconcurențiale, legătura anticorpilor serului cu antigenul este măsurată
direct cu ajutorul anticorpilor antiporci cuplați cu peroxidaza.
Enzima acționează că un amplificator și chiar și în cantități mici moleculele de enzima vor
produce multe molecule semnal.
Sensibilitatea testului ELIȘA este considerată inferioară celei a TNV și se recomandă să fie
utilizat că test de depistare la nivelul turmei. Testele ELIȘA trebuie să permită detectarea tuturor

13
infecțiilor cu pesta porcină clasică în stadiul convalescenței și trebuie să fie pe cât posibil lipsite
de orice interferență cu anticorpii care prezintă o reacție încrucișată cu Pestivirus ai
rumegătoarelor.

Fig. 6 Test ELISA pentru detectia anticorpilor PPC

Fig. 7 Analizator ELISA complet automatizat

14
 Bibliografie

1. Anita A., Anita DC – Virusologie. Lucrari practice, Ed. “Ion Ionescu de la Brad”, Iasi, 2014,
ISBN 978-973-147-157-0.
2. Horhogea C – Imunologie si imunopatologie. Indreptar de lucrari practice, Ed. “Ion Ionescu
de la Brad”, Iasi, 2015, ISBN 978-973-147-185-3.
3. Manualul de diagnostic al pestei porcine clasice. www.eur-lex.europa.eu.
4. Manualul de teste de diagnostic si vaccinuri pentru animale terestre OIE, Ed. 2019, sectiunea
3.8, cap. 3.8.3.
5. Perianu T., si colab (2005) – Boli infectioase ale animalelor. Viroze. Vol. 2. Ed. Universitas
XXI, Iasi.

15