Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
6 Biomat COLprop2
6 Biomat COLprop2
Iași, 23.11.2013
Acţiunea enzimelor asupra colagenului
Pentru ca o enzimă să fie
clasificată drept colagenază, Colagenul nativ este rezistent la acţiunea
trebuie să scindeze colagenul de degradare a proteazelor la pH neutru
nativ la pH în jur de 7 şi la o
temperatură de aproximativ 37°C
Singura enzimă capabilă să degradeze colagenul nativ, în condiţii
fiziologice de temperatură şi pH este colagenaza bacteriană izolată din
variatele tulpini de Clostridium
1
colagen solubil 3
în săruri neutre 2
colagen insolubil
colagen solubil în soluţii
diluate de acizi organici
Pentru solubilizarea colagenului în mediu acid se utilizează acizii organici, iar cei
anorganici se folosesc numai în soluţii tampon.
Frecvent se utilizează acidul acetic, acidul citric şi mai puţin acidul clorhidric (pag.100)
La extracţie şi mai ales la CN-1 şi CN-2, odată cu colagenul trec în soluţie şi
componente necolagenice (albumine, globuline, glicoproteine, mucopolizaharide etc.).
În toate soluţiile se adaugă 10% clorură de sodiu, iar la CN-1 şi CN-2 şi acid acetic,
pentru a coborî pH-ul la valori de 3-4.
Prin această metoda se extrage din pielea de viţel nou născut, proaspătă, 8-10% tropocolagen.
3
Solubilizarea colagenului insolubil
Colagenul prezintă o structură complexă şi rezistentă la acţiunea de solubilizare a acizilor.
A.Courts, R.Reed, G.Stainsby, L.Urban şi Michal au obţinut După datele lui Gh.Cioca, 1 kg
A.G.Ward au tratat oase cu o soluţii de eucolagen din şpalt de piele gelatină de bovine,
soluţie de 5% NaOH, saturată deşeuri de piele sau neutralizat şi spălat, se tratează cu
cu Na2SO4, timp de 5 zile, la tendoane de animale prin 3 l soluţie de 10% NaOH, 3% NaCl
temperatura de 20°C şi apoi au tratarea lor, mai întâi, cu şi 3% Na2SO4, timp de 48 de ore, la
putut să extragă până la 30% 10% NaOH şi 1M Na2SO4 temperatura camerei. Şpaltul astfel
colagen cu o soluţie tampon timp de 48 ore, la tratat se supune spălării şi apoi
citrat (pH=3,7). temperatura de 20°C şi apoi neutralizării cu 3 l soluţie de 10%
solubilizarea într-o soluţie de HCl; urmează o spălare, pentru a
Materialul obţinut a fost
0,5M acid acetic. se elimina sarea formată la
denumit eucolagen, pentru a-l
neutralizare şi dizolvarea totală a
deosebi de tropocolagen, deşi Masa moleculară medie a
colagenului în 10 l soluţie de 1%
comportarea sa generală colagenului solubilizat a fost
acid acetic, timp de 24-48 ore.
aminteşte de acesta. de 350 000 - 400 000.
Soluţia obţinută se filtrează printr-o
sită cu 100 de ochiuri/ cm2.
Se utilizează enzime, preparate enzimatice,
Solubilizarea enzimatică medii de cultură fermentate
Sărurile de calciu şi
Tensioactivii adăugaţi la magneziu au efect de
solubilizarea enzimatică
Tratamente cu enzime proteolitice
activare a enzimelor
măresc randamentul în proteolitice
colagen extras. Solubilizarea totală a colagenului
Acizii minerali sau organici permit realizarea pH-ului Creşterea temperaturii până la temperatura
optim de acţiune pentru enzime, cum este cazul de contracţie a colagenului sau superioară,
pepsinei, contribuind la intensificarea procesului de favorizează solubilizarea sa la tratamente cu
solubilizare a colagenului. enzime proteolitice (tripsina).
Resursa de materie primă cea mai importantă cantitativ pentru
producerea materialelor colagenice în vederea utilizării lor ca biometeriale o
reprezintă pielea animală.
OASE
DEGRESAREE
Oase degresate
DEMINERALIZARE
PIEI BOVINE Oseină PIEI PORCINE
TRATAMENT TRATAMENT
ALCALIN ACID
EXTRACŢIE
EXTRACŢIE
PURIFICARE
PURIFICARE
GELATINĂ
GELATINĂ ALCALINĂ
ACIDĂ pHi=7-9
PHi=4,5-5,5
Tipuri de produse colagenice
Solid - lichid,
Soluţii lichid-lichid,
solid 1 – solid 2-lichid,
solid-lichid 1 – lichid 2
Gel-gel, gel-soluţie,
gel-solid, gel-gaz
În scopul diversificării utilizării, materialele colagenice pot fi supuse unor
tratamente chimice care le fac mai compatibile.
În aceste tratamente pot fi implicate grupele funcţionale ale resturilor de amino-
acizi (reacţii polimer-analoage), se pot grefa la molecula de colagen unii
oligomeri sau se pot produce reticulări pentru a se forma sau a se accentua
structura tridimensională.
_
N _ CH2 _ CH3 NH _ CH2 CH3
_
Col COOH+ C _ Col
_
CO _ OR + CO
_ CH _ CH + HO R _ _
N 2 3 NH CH2 CH3
Colagen Etilcarbodiimidã
CO _ CH
_ 2 _ _ _ _
Col CH2OH O
+ Col_ CH2 O _ CO CH2 CH2 COOH
CO _ CH 2
Anhidrida succinicã
CO
Col_ NH 2+ O C6H4 Col_ NH _ CO _ C6H4 _ COOH
CO
Anhidrida ftalicã
Col_ NH2 + C6H5 _ COCl Col NH CO _ C6H5 + HCl
Acid clor benzenic
În vederea folosirii, orice produs chimic şi mai ales farmaceutic, natural sau obţinut pe cale
de sinteză, este supus unor operaţii de purificare ce pot consta din:
a. operaţii primare de filtrare, centrifugare, sedimentare sau decantare;
b. separări prin extracţie cu solvenţi, adsorbţie, precipitare, ultrafiltrare;
c. purificare prin precipitare fracţionată, cromatografie şi cristalizare.
Exemple de produse care sunt obţinute prin extracţia cu solvent sunt: etanolul, acidul
lactic, acidul citric, penicilina G., cefalosporina, streptomicina, vita-mina B, riboflavina.
Solventul este astfel ales pentru a înlesni selectarea şi separarea cât mai bună a
produsului în această fază.
Extracţia cu fluid supercritic.
Fluidele dincolo de temperatura şi presiunea lor critică se numesc
fluide supercritice.
Dioxidul de carbon a fost în cea mai mare măsură utilizat ca fluid supercritic
pentru extracţie în industria alimentară, dar şi în alte sectoare cum ar fi cel
farmaceutic. Costurile acestei tehnici împiedică însă extinderea aplicaţiilor sale.
Metodele cromatografice
Sunt indispensabile pentru izolarea produselor de înaltă puritate.
Cromatografia de adsorbţie pe silicagel sau alumină (trioxid de aluminiu) s-a
practicat de chimiştii organicieni de zeci de ani.
Adsorbanţii sintetici neionogeni, ca răşinile de polistiren şi răşinile de metacrilaţi se
folosesc, de asemenea, pentru variate aplicaţii.
Cromatografia cu schimbători de ioni are aplicaţii multilaterale.
Nicio partea a acestui material nu poate fi reprodusă sub nicio formă și
prin niciun fel de mijloc – electronic sau mecanic – inclusiv prin
fotocopiere, înregistrare magnetică sau orice alt sistem de stocare și de
redare a informației, fără permisiunea explicită scrisă a deținătorului de
Copyright în persoana prof.univ. Mihai Chiriță
Iași, 23.11.2013
Practica curentă de purificare a proteinelor se poate divide în:
metode cromatografice şi metode necromatografice.
Afinitatea la precipitare.
Această tehnică se bazează pe faptul că unii polimeri solubili în apă pot fi conjugaţi
printr-o afinitate adecvată a ligandului.
Complexul de afinitate format poate precipita din soluţie.
Proteina poate fi recuperată din acest complex de afinitate folosind cromatografia de
afinitate.
Afinitatea ligandului facilitează trei faze de repartiţie.
Trei faze de repartiţie este o altă tehnică de precipitare care exploatează sinergetic
o sare şi un solvent organic la precipitarea proteinelor.
Precipitarea în trei faze a fost în mare măsură folosită pentru purificarea unui mare
număr de proteine.
masa moleculară
afinitatea biologică faţă
încărcarea electrică
de alte molecule
solubilitate
diferenţe în caracteristicile
de adsorbţie
Separarea proteinelor bazată pe masa moleculară.
Amestecul de proteine dizolvat într-o soluţie tampon adecvată, este trecut, datorită forţei
de gravitaţie, printr-o coloană încărcată cu un polimer inert, puternic hidratat şi spălat
cu soluţia tampon. Se foloseşte Sephadex (un derivat polizaharidic) sau Bio-gel ( un
derivat de poliacrilamidă) sau agaroză.
Precipitare izoelectrică.
pH-ul la care o proteină este cel mai puţin solubilă este pH-ul izoelectric (pHi),
când molecula nu are încărcare electrică şi nu se deplasează într-un câmp electric.
La pHi nu există respingere electrostatică între moleculele de proteină vecine,
rezultând agregarea moleculelor = formarea de precipitate.
Când un amestec de proteine, în soluţie, este adus la pHi al unei componente, cea mai
mare parte sau toată componenta va precipita, lăsând în soluţie proteinele cu valori ale
pHi deasupra sau sub acel pH.
Proteina precipitată la pHi îşi păstrează conformaţia nativă şi poate fi redizolvată la pH-ul corespunzător.
Salifierea proteinelor
La concentraţii mici în săruri neutre are loc creşterea solubilităţii proteinelor globulare.
Sărurile divalente [(NH4)2SO4, MgCl2] sunt mult mai eficiente decât sărurile monovalente
(NH4Cl, NaCl, KCl).
Capacitatea sărurilor neutre de a influenţa solubilitatea proteinelor este în funcţie de
tăria ionică (mărime care măsoară concentraţia şi numărul de sarcini electrice ale
cationilor şi anionilor formaţi de sare).
La o anumită tărie ionică o proteină poate să precipite aproape complet din soluţie,
fenomen ce poartă numele de salifiere.
Sulfatul de amoniu este preferat pentru salifierea proteinelor deoarece este foarte
solubil în apă, realizându-se o tărie ionică mare.
Fracţionarea cu solvenţi.
Atât etanolul cât şi acetona au constante dielectrice mult mai mici decât ale apei
(de exemplu, la 200C, apa=80, etanolul=24, acetona=21), ceea ce face ca la
adăugarea lor în soluţia proteică apoasă să crească forţa de atracţie dintre
sarcinile de semn opus, scăzând astfel gradul de ionizare a grupelor R ale
proteinei, iar moleculele de proteină au tendinţa de a se agrega şi a precipita.
Iași, 23.11.2013
Diagrama paşilor
experimentali a
formării unei proteze
din fibre de coalgen
reconstituit şi etapele
implantării.
Reprezentare schematică
a ingineriei tisulare