1

Facultatea deȘtiințe ale Naturii și Științe Agricole

Disciplina: genetica microorganismelor
Specializarea. Biologie – anul III

LP nr.7

Tehnici de genetic bacteriană

IZOLAREA ŞI PURIFICAREA ADN PLASMIDIAL LA BACTERII PRINTR-UN
PROTOCOL DERIVAT DIN TEHNICA MANIATIS ȘI COLAB. (1982)

Pentru izolarea ADN plasmidial au fost elaborate numeroase metode, dintre care
unele sunt specifice pentru plasmide cu greutate moleculară mică iar altele pentru ADN
cu greutate moleculară mare. Există însă şi un număr considerabil de metode care se
pretează la izolarea ambelor tipuri de plasmide.
În general, metodele utilizate pentru purificarea plasmidelor se bazează pe liza
alcalină a bacteriilor în vederea denaturării selective a ADN. În acest caz este necesar
un tratament mai brutal pentru liza celulară, prin trecerea suspensiei printr-un ac de
seringă sau agitare puternică cu ajutorul unui agitator magnetic sau mixer.
Dispersarea totală a celulelor tratate cu lizozim (care le face să devină osmotic
sensibile) în tamponul alcalin de liză este foarte importantă. Dacă dispersarea este
incompletă, nu asigură îndepărtarea completă a ADN cromosomal şi poate duce la
denaturarea ireversibilă a ADN plasmidial CCI . ADN plasmidial, chiar şi cel cu greutate
moleculară mare, datorită formei sale supraîncolăcite, rezistă aproximativ 5 minute la
agitare puternică în soluţie alcalină, în timp ce ADN cromosomal este fragmentat şi
denaturat.
Liza celulelor în tampon alcalin (pH 12,4) duce la micşorarea vâscozităţii lizatului
şi nu mai este necesară agitarea lui, pH-ul ridicat asigurând în acelaşi timp şi protecţia
ADN prin inhibarea acţiunii exonucleazelor. În acest stadiu se pare că ADN linear este
denaturat complet iar cea mai mare parte a ARN este hidrolizat în prezenţa RN-azei.
Neutralizarea lizatului, realizată fie cu Tris HCl pH 7, fie cu acetat de potasiu pH 4,8 ,
conduce la renaturarea doar a ADN plasmidial CCI.
O altă etapă critică în izolarea ADN plasmidial o constituie precipitarea
proteinelor prin tratarea lizatului cu fenol în prezenţa NaCl deoarece, în timpul agitării
necesare amestecării celor două faze, se pot produce pierderi de ADN plasmidial, mai
ales dacă acesta este de dimensiuni mari, prin generarea de ADN plasmidial
monocatenar vizibil uneori după migrarea electroforetică.
 2

Uneori, preparatul de ADN obţinut prin precipitarea cu alcool izopropilic sau

etanol se dizolvă cu greu în tamponul TE pH 8 şi prezintă o turbiditate crescută.
Aceasta nu crează probleme deosebite deoarece, aplicând indicaţia lui Birnboim
(1983), şi anume amestecarea cu cloroform şi centrifugarea la 12.000xg timp de 15
minute la 200C, preparatul obţinut se clarifică prin îndepărtarea proteinelor precipitate
ireversibil şi care erau insolubile.
ADN plasmidial dizolvat în tampon TE pH 8 se poate păstra un timp îndelungat
(până la o lună) fără o denaturare importantă. De asemenea, deşi nu a fost purificat prin
ultracentrifugare, ADN plasmidial obţinut de noi a fost suficient de pur pentru a putea fi
utilizat pentru transformare genetică sau pentru clivare cu enzime de restricţie
(procurate de la diferite firme producătoare: Serva sau Sigma).

Principiul metodei

Denaturarea ADN cromosomal şi ADN plasmidial are loc la un pH puternic

alcalin. Dacă liza celulelor bacteriene se realizează la pH 12,5 (alcalin), odată cu
aceasta are loc şi denaturarea ADN. Totuşi, forma moleculară CCC (eng. „covalently
closed circular”) sau dublu catenară circulară închisă covalent a ADN plasmidial nu
poate fi denaturată complet. ADN cromosomal, deşi este o moleculă CCC, datorită
dimensiunii mari este fragmentată linear şi denaturată complet. De asemenea,
formele moleculare plasmidiale circulare deschise şi formele moleculare plasmidiale
lineare sunt denaturate în condiţiile experimentale prezentate mai sus.

La adăugarea unei soluţii (pH 4,8) se reface pH neutru al amestecului de

reacţie, iar formele plasmidiale CCC îşi refac forma nativă dublu catenară, circulară
închisă covalent (CCC). ADN cromosomal şi formele moleculare plasmidiale circulare
deschise şi lineare nu-şi pot reface forma nativă şi precipită împreună cu resturile
celulare (fragmente de perete celular, membrană plasmatică şi proteine). Extractul
final va conţine numai forma moleculară CCC a ADN plasmidial.

Medii de cultură şi soluţii

Mediul de cultură Luria-Bertani cu formula:

- bacto-triptonă 1% ;
- extract de drojdie 0,5%;
- NaCl 1% ; pH 7,5.
 3

Soluţia I: lizozim în tampon TEG (Tris-HCl 25 mM; EDTA-Na2 10 mM; glucoză 50

mM; pH 8,2 – 8,7). Lizozimul se adaugă în tamponul TEG în concentraţie variabilă,
funcţie de tulpina bacteriană utilizată; pentru tulpinile de enterobacteriacee este
suficientă concentraţia de 2 – 5 mg/mL. Lizozimul se adaugă înainte de utilizare şi nu
se păstrează ca soluţie.
Soluţia II: NaOH 0,2 N şi SDS 1%, pH 12,5 (se prepară în momentul utilizării din
soluţii stoc de NaOH 0,4 N şi SDS 10%).
Soluţia III: tampon acetat de K, pH 4,8 (60 mL de acetat de K 5 M, 11,5 mL de acid
acetic glacial şi 28,5 mL de apă distilată); se prepară în momentul utilizării numai
volumul necesar, păstrând proporţiile din formulă. Se păstrează la frigider).
Soluţia IV: soluţie stoc de proteinază K (20 mg/mL în apă distilată sterilă); se
prepară 1 mL soluţie într-un tub Eppendorf (capacitate 1,5 mL) steril, se repartizează
f mici de 0,5 mL, sterile, şi se stochează la – 200C. În
momentul în care se scot din congelator şi se dezgheaţă se folosesc imediat,
deoarece prin recongelare enzimele îşi pierd activitatea. Soluţia V: soluţie stoc de
RNază (10 mg/mL în apă distilată sterilă); într-un tub Eppendorf de 1,5 mL steril se
pune 1 mL de apă distilată sterilă, după care se adugă o cantitate de RNază A pentru
a obţine o concentraţie de 10 mg/mL. Se agită pentru dizolvare şi se repartizează
capacitate. Se stochează la – 200C; pentru
utilizare se scoate un tub din congelator şi se decongelează rapid. Enzima se poate
recongela o singură dată. Soluţia VI: fenol redistilat şi echilibrat prin spălare cu Tris-
HCl 1 M, pH 8 şi tampon TE, pH 8.
Soluţia VII: fenol:cloroform:alcool izoamilic (25:24:1, v/v); se prepară în momentul
utilizării din 25 volume de fenol redistilat şi echilibrat prin spălare cu Tris-HCl 1 M pH
8 şi tampon TE, 24 volume de cloroform şi 1 volum de alcool izoamilic.
Soluţia VIII: amestec cloroform:alcool izoamilic 24:1 v/v; se prepară în momentul
utilizării.
Soluţia IX: etanol 100% rece (-200C).
Soluţia X: etanol 70% rece (-200C).
Soluţia XI: tampon TE (Tris-HCl 10 mM; EDTA-Na2 1 mM; pH 8).
Soluţia XII: sarcosyl 0,5% g/v în apă distilată.
 4

Tehnica
Protocolul de izolare, purificare şi manipulare a materialului genetic se
realizează realizat în varianta minimetodă. S-a lucrat cu tuburi tip Eppendorf având
capacitatea de 1,5 mL iar centrifugările au fost realizate la o microcentrifugă
prevăzută cu sistem de răcire (4oC).
Tulpina bacteriană se cultivă în 100 mL mediu de cultură Luria-Bertani, timp
de 20 de ore (faza logaritmică de creştere), la o temperatură cuprinsă între 28 0C –
370C, în condiţii de agitare puternică.
Un volum de 1,5 mL cultură bacteriană se trece într-un tub tip Eppendorf, iar
celulele depuse prin centrifugare (40C) timp de 10 minute la 10.000 r.p.m.

În cazul tulpinilor bacteriene cu un conţinut bogat în polizaharide, sedimentul

celular se spală de două ori cu 250 L de soluţie XII (sarcosyl 0,5%). Fiecare
spălare este urmată de o centrifugare timp de 10 minute la 10.000 r.p.m.

Îndepărtarea peretelui celular se realizează prin resuspendarea sedimentului

celular în 200 L de soluţie I (lizozim 10 – 30 mg/mL concentraţie finală în tampon
TEG). Tubul se agită uşor şi se menţine 15 - 25 minute în baie de apă la 370C.
Concentraţia de lizozim depinde de structura peretelui celular al tulpinii bacteriene
luată în lucru, fiind necesare mai multe testări pentru determinarea concentraţiei
optime de lizozim.

Tubul Eppendorf se scoate din baia de apă şi agitat uşor. Se adaugă 400 L
de soluţie II (volum dublu faţă de volumul soluţiei I), iar conţinutul este amestecat
prin inversarea tubului respectiv. Tubul este incubat 10 - 20 minute în baie de apă la
370C. Pentru realizarea lizei alcaline a celulelor, la unele tulpini de enterobacteriacee
s-au aplicat şocuri termice (370C ──> 550C ──> 200C). SDS din soluţia II produce
liza celulelor bacteriene prin degradarea membranei plasmatice, iar pH de 12,5
realizează denaturarea ADN.

În tub se adaugă 300 L de soluţie III rece (40C). Conţinutul se amestecă prin
inversarea tubului, după care s-a incubat 10 minute pe gheaţă şi la congelator (-
200C). Prin refacerea pH neutru formele moleculare plasmidiale CCC îşi refac forma
nativă dublu catenară circulară închisă covalent (CCC), iar proteinele celulare şi ADN
cromosomal precipită sub forma unui precipitat alb.
 5

Precipitatul este îndepărtat prin centrifugare 15 – 30 minute (40C) la 15.000

r.p.m. Sedimentul conţine resturi celulare, proteine, ADN cromosomal, forme
moleculare plasmidiale circulare deschise, forme moleculare plasmidiale lineare şi
ARN cu greutate moleculară mare. Supernatantul conţine ADN plasmidial CCC,
proteine şi ARN cu greutate moleculară mică. După centrifugare supernatantul a fost
transferat cu o pipetă automată într-un alt tub Eppendorf.

Deproteinizarea enzimatică se realizează prin tratarea supernatantului

respectiv, timp de o oră, la 370C, cu soluţie IV (soluţie stoc de proteinază K, 20
mg/mL) până la o concentraţie finală de 200 g/mL. Proteinaza K este o protează
nespecifică care prezintă activitate enzimatică şi la pH alcalin. Uneori este necesară
o etapă de deproteinizare cu solvenţi organici înainte de tratamentul cu proteinaza K.

Deproteinizarea cu solvenţi organici se realizează în trei etape succesive:

i) Se adaugă în tubul cu lizatul celular un volum egal de soluţie VI (fenol

redistilat şi echilibrat prin spălare cu Tris-HCl 1 M, pH 8 şi tampon TE,
pH 8). Conţinutul se amestecă prin inversare repetată a tubului
Eppendorf. Se centrifughează 10 minute la 10.000 r.p.m., după care se
extrage din tubul respectiv faza superioară cu o pipetă automată, fără a
pătrunde în interfaţa care separă cele două faze, şi se transferă într-un
alt tub Eppendorf.

ii) Peste lizatul celular se adaugă un volum egal de soluţie VII (amestec
fenol:cloroform:alcool izoamilic, 25:24:1, v/v), după care cele două faze
se amestecă prin inversarea tubului. Amestecul se centrifughează timp
de 10 minute la 10.000 r.p.m.. Se reia faza superioară care se transferă
într-un alt tub Eppendorf.

iii) Peste lizatul celular se adaugă un volum egal de soluţie VIII (amestec
cloroform:alcool izoamilic, 24:1 v/v), după care cele două faze se
amestecă viguros prin inversarea tubului. Amestecul se centrifughează
10 minute la 10.000 r.p.m. Se reia faza superioară şi se transferă într-
un alt tub Eppendorf.

Precipitarea ADN plasmidial se realizează prin adăugarea de soluţie IX

(etanol 100% răcit la -200C) în tubul Eppendorf (până la un volum total de 1,5 mL).
Se inversează tubul de câteva ori, după care se incubează la congelator (-200C) timp
 6

de 15 – 30 minute (uneori timpul de precipitare se prelungeşte peste noapte la –

200C). Precipitatul este depus prin centrifugare timp de 15 minute (4 0C) la 15.000
r.p.m. Supernatantul se aruncă, iar sedimentul se usucă 30 minute prin incubarea
tuburilor cu capacele desfăcute la termostat la 370C.

Îndepărtarea moleculelor de ARN din extract se realizează prin adăugare de

soluţie V (soluţie stoc de RNază cu o concentraţie de 10 mg/mL) pentru a ajunge la
o concentraţie finală de 100 g/mL. Tubul cu amestecul respectiv se incubează timp
de o oră în baie de apă la 370C.

Extractul de ADN este deproteinizat prin adaugarea unui volum egal de

soluţie VIII (amestec cloroform:alcool izoamilic, 24:1 v/v), după care cele două faze
se amestecă viguros, la temperatura camerei, prin inversarea tubului respectiv.
Amestecul se centrifughează 10 minute la 10.000 r.p.m. Se reia faza superioară şi se
transferă într-un alt tub Eppendorf.

Precipitarea ADN se realizează prin adăugare de soluţie IX (etanol 100% răcit

la - 200C) până la un volum total de 1,5 mL. Se amestecă conţinutul prin inversarea
tubului de câteva ori. Etapa de precipitare a acizilor nucleici este prelungită prin
incubarea amestecului timp de 30 minute la – 200C, sau prin incubare peste noapte
la – 200C. Precipitatul este depus prin centrifugare (40C) timp de 15 minute la 15.000
r.p.m. Se aruncă supernatantul iar sedimentul se usucă 30 minute prin incubarea
tubului cu capacul desfăcut la termostat (370C).

Sedimentul este spălat cu 500 L de soluţie X (etanol 70% răcit la - 200C),

care se toarnă încet pe pereţii tubului pentru nu disloca sedimentul, după care tubul
se inversează de câteva ori amestecând conţinutul. Se centrifughează 15 minute
(40C) la 15.000 r.p.m., iar supernatantantul se aruncă.

Sedimentul de ADN din tubul Eppendorf se usucă 30 minute la 37 0C într-un

termostat, cu capacul desfăcut, după care se resuspendă în 50 L de soluţie XI
(tampon TE, pH 8); volumul de TE variază funcţie de concentraţia preparatului de
ADN. Tubul se incubează 10 ore la frigider la 40C pentru dizolvarea completă a ADN,
după care se păstrează la – 200C.