Enzimologie speciala

EXTRACTIA ENZIMELOR

1. Alegerea sursei biologice de extractive a enzimelor

2. Parametrii care caracterizeaza extractia enzimelor

3. Metode de extractie
 1. Alegerea sursei biologice de extractie a enzimelor
a. Abundenta enzimelor
◦ Microorganisme – avantaj cresterea randamentului extractiei prin:
◦ Optimizarea mediului de cultura (folosirea inductorilor);
◦ Manipulari genetice.
◦ Tesuturi animale (ficat, splina, rinichi) – dezavantaj contin enzime proteolitice;
◦ Tesuturi vegetale – dezavantaj variabilitate mare si continut ridicat de polifenoli;
◦ Culturi de celule.

b. Disponibilitatea sursei
◦ Trebuie sa fie accesibila din punct de vedere economic si geographic;
◦ Restrictii privind utilizarea unor anumite surse (ex. tesuturi umane, plante de carantina, microorganisme
patogene);
◦ Compromis intre abundenta si accesibilitate
 1. Alegerea sursei biologice de extractie a enzimelor
c. Caracterizarea sursei
◦ Vegetale: gen, specie, varietate, zona de cultivare, perioada de recoltare
◦ Animale: gen, specie, sex, varsta, greutate, regim alimentar
◦ Microorganisme: gen, specie, tulpina, compozitie a mediului de cultura, conditii de cultivare

d. Localizarea celulara
Enzime extracelulare – eliberate de celulele vii in mediul lor inconjurator unde isi exercita actiunea;
- usor de izolat si purificat
Enzime intracelulare – sunt asociate cu membrane sau particule subcelulare si isi exercita actiunea chiar in celulele in care
sunt sintetizate
- nu pot fi extrase direct ci numai prin distrugerea celulelor (distrugere mecanica, liza, autoliza)
◦ Enzimele pot avea o singura localizare celulara sau mai multe
 2. Parametrii care caracterizeaza extractia enzimelor
a. Natura mediului de extractie
◦ Natura si taria ionica a mediului de extractie influenteaza solubilitatea si stabilitatea enzimelor;
◦ Concentratia sarurilor influenteaza solubilitatea enzimelor;
◦ Detergentii
◦ Activatori: disociaza complexele proteine – lipide si proteine – glucide;
◦ Inhibitori: 1. modifica conformatia spatiala a enzimelor prin orientarea unor resturi hidrofobe catre
suprafata moleculelor proteice;
2. determina disocierea proteinei in subunitati;
◦ Solventii
◦ constanta dielectrica mica (acetona, metanol, etanol) – determina preciparea enzimelor
◦ constanta dielectrica mare (dimetilsulfoxid DMSO, dimetilformamida DMFA) – cresc solubilitatea
enzimelor
 2. Parametrii care caracterizeaza extractia enzimelor
b. Temperatura mediului de extractie
◦ Temperaturi ridicate determina ruperea puntilor de hidrogen si a interactiilor hidrofobe, rezultand conformatii
dezordonate, inactive;
◦ Extractia si purificarea se fac de obicei la temperaturi scazute 0 – 4°C;
- pentru separare se foloseste centrifuga cu raciere.

c. pH mediului de extractie
◦ afecteaza structura tridimensionala a enzimelor;
◦ majoritatea enzimelor sunt stabile in intervalul de pH 5 – 9;
◦ pH optim de actiune – asigurat de sistemul tampon;
◦ pH isoelectric – de evitat.

d. Raport de extractie

e. Timp de extractie
 3. Metode de extractie

PRODUS
Enzime Spargerea Recuperare
Extractie Centrifugare Purificare INTRACELU
intracelulare celulelor supernatant
LAR
SURSA
ENZIMATICA
PRODUS
Enzime Recuperare
Centrifugare Purificare EXTRACELU
extracelulare supernatant
LAR
 3. Metode de extractie
I. Simpla separare prin filtrare sau centrifugare
◦ Ex.: ser sanguin, urina, lapte, medii de cultura
◦ Avantaje: numar mic de componente extracelulare si enzime relativ stabile

II. Dezintegrare a peretilor celulari

◦ Dezavantaje: numar mare de componente si prezenta unor contaminanti, inhibitori si enzime proteolitice.
◦ Metode de dezintegrare a celulelor:
◦ a. metode blande;
◦ b. metode moderate;
◦ c. metode severe.
3. Metode de extractie
a. Metode blânde:
Liza celulară - Ruperea osmotică a membranei celulare;
Digestia enzimatică - Ruperea pereţilor celulari cu ajutorul unor enzime;
Omogenizator Potter- Elvehjem - Celulele sunt dezintegrate într-un spaţiu îngust existent între pistil şi
pereţii de sticlă; membranele celulare sunt rupte datorită forţelor care apar
 3. Metode de extractie
b. Metode moderate
Omogenizator cu cuţite (Waring blender)
Membranele sunt tăiate cu ajutorul unor lame care se rotesc;

Mojarare în prezenţă de nisip, alumină sau perle de sticlă;

3. Metode de extractie
c. Metode severe
 Presare (French press) - celulele sunt forţate să treacă prin orificii mici la presiuni foarte mari
astfel incat forţele de rupere afectează integritatea membranelor;
3. Metode de extractie
c. Metode severe
Decompresie explozivă - Celulele sunt echilibrate cu un gaz inert la presiune scazuta, ceea ce
determină ruperea membranelor şi eliberarea conţinutului celular;

Măcinare cu bile (bead mill) - Vibraţiile rapide realizate cu ajutorul

perlelor de sticlă conduc la îndepărtarea pereţilor celulari;
3. Metode de extractie
c. Metode severe
Ultrasonicare - Tratarea suspensiilor celulare cu frecvenţe sonice determină ruperea
membranelor;

Îngheţ-dezgheţ repetat - Ruperea legăturilor de hidrogen şi a celor hidrofobe realizate între

enzime şi alte componente, precum si a membranelor, ca urmare a inghetarii apei
PENTRU NOTA 5
Criteriile de selectie a sursei de izolare a enzimelor sunt:
◦ Abundenta enzimelor
◦ Disponibilitatea sursei
◦ Caracterizarea sursei
◦ Localizarea enzimelor

Pentru extractia enzimelor extracelulare se aplica o simpla filtrare/centrifugare

Pentru extractia enzimelor intracelulare este necesara dezintegrarea celulelor,

urmata de centrifugare