SPECTROFOTOMETRIA DE ABSORBŢIE ÎN UV ŞI VIS

Spectrul electromagnetic:

10-3 nm 10-1 nm 102 nm 5.102 nm 104 nm 107 nm 1012 nm

Raze gamma Raze X Ultraviolet Vizibil Infraroşu Microunde Unde radio

Creşte lungimea de undă

Scade energia radiaţiilor

Domeniul spectral UV-VIS:
- UV apropiat: 185 – 400 nm;
- Vizibil: 400 – 700 nm;
- IR foarte apropiat: 700 – 1100 nm.

I0 I I0 – intensitatea radiaţiei incidente;

I – intensitatea radiaţiei transmise.
 hc
Energia fotonilor: E  h    h  c 


h – constanta lui Plank;

 - frecvenţă;
c – viteza de propagare a luminii;
 - lungimea de undă.

Surse de radiaţii:
- vizibil: lampa cu filament de W (300 – 2500 nm);
- UV: lampa cu hidrogen sau deuteriu (160 – 380 nm).
Absorbţia radiaţiilor. Tranziţii electronice.
-energie de translaţie; energie de rotaţie; energie de vibraţie;
tranziţii electronice.

Nivele de energie
v1
electronică
E1 v0

Nivele de energie
v1 vibraţională
Nivele de energie
E0 rotaţională
v0
A B C
Tipuri de tranziţii electronice.

Electronii dintr-o molecula:

- e- din straturile fundamentale

- e- de tip 
- e- de tip n
- e- de tip 

1. Tranziţii  - *; *

2. Tranziţii  - *; *

3. Tranziţii n - *; n

4. Tranziţii n - *; 

Cromofori. Deplasări bato şi hipsocrome.

Cele mai importante grupe cromofore sunt:

a) grupa nitrozo -N=O
Efect hipercromic
b) grupa nitro -NO2
c) grupa azo -N=N- A
d) grupa cetonica -C=O
e) dubla legatura >C=C<
deplasare deplasare
Grupe auxocrome: -NH2, OH- alcooli şi hipsocromă batocromă
fenoli

Modificări spectrale:
-deplasare batocromă;
-deplasare hipsocromă; Efect hipocromic

-efect hipercromic;
-efect hipocromic.
 Legea fundamentală a absorbţiei (legea Lambert-Beer)

I0 A
A  log  abc  a 
I bc
A
A  bc   
bc

A – absorbanţa; I0 – intensitatea radiaţiei incidente; I – intensitatea

radiaţiei transmise;
b – grosimea stratului de lichid; c – concentraţia (exprimată în g/L sau
mol/L);
a – absorbtivitate (atunci când c – g/L);
 – absorbtivitate molară (atunci când c – mol/L).
Atunci când soluţia de analizat este multicomponentă, se calculează
absorbanţa totală:

Atotal  A1  A2  ...  An  1bc1   2bc2  ...   nbcn

Legea lui Beer este valabilă numai pentru soluţii diluate şi se poate
exprima:
I  I 010bc

Transmitanţa este egală cu raportul dintre intensitatea luminii

transmise şi cea a luminii incidente:

I I I0
T log T  log   log   A
I0 I0 I
Determinarea conținutului de cafeină (sol. apoasă)

-soluție standard de cafeină în apă: 4,5 x 10-5 M.

-absorbanţa măsurată la 273 nm a fost de 0,454 (1cm).
-absorbtivitatea molară a cafeinei în condițiile date :

A 0,454
  5
 10089
bc 1  4,5  10

- soluția de probă: 0,367 la aceeași lungime de undă, pentru același

drum optic (1cm) și în același solvent (apă) ca şi soluția standard

A 0,367
c   3,64  10 5 M
  b 10089  1
Determinarea cafeinei din amestecuri necunoscute prin metoda
adaosului standard

- Balonul A: 10 ml probă – la semn (20 ml) cu apă distilată

- Balonul B: 10 ml probă + 2 ml sol. etalon cafeină cu conc. 4,5 x 10-5 M – la semn

(20 ml) cu apă distilată

- absorbanta soluției A = 0,356 la 273 nm 0,356    1  c

- absorbanta soluției B = 0,810 la 273 nm 

0,810    1 c  4,5  105 
0,356  1 c c
 0,440  c  3,54  105

0,810   1 c  4,5  10 5  
c  4,5  10 5 

Concentrația probei: 2 x 3,54 . 10-5 M = 7,08 . 10-5 M

 10
Absorbanţa specifică: A 1%
1cm 
Mr

- reprezintă absorbanţa unui strat de soluţie cu grosimea de 1 cm, care conţine

dizolvat 1 g substanţă în 100 mL soluţie.

A
c  1%
A1cm
 Aparatura utilizată în spectrofotometria UV-VIS

oglindă concavă
oglindă concavă

reţea de difracţie
fantă intrare fantă ieşire
Surse de radiaţii:
- vizibil: lampa cu filament de W (300 – 2500 nm);
- UV: lampa cu hidrogen sau deuteriu (160 – 380 nm)
Radiaţie policromatică Radiaţie monocromatică

Monocromatorul (prisma optică sau reţea de difracţie) selectează din spectrul de

emisie al sursei o bandă ingustă de lungimi de undă specifică excitării probei.

Detectorul: fotomultiplicator sau reţea de fotodiode

Abateri de la Legea Lambert-Beer

-este respectată doar în soluţii diluate

-este limitată de radiaţiile policromatice

Erori datorate instrumentelor folosite:

-zgomotul de fond al sursei luminoase;
-zgomotul de fond al fotomultiplicatorului
-procese de reflexie şi difuzie care apar în timpul parcursului optic.
Inregistrarea spectrelor

A T

 

Spectrele UV ale unor soluţii de permanganat de potasiu

Măsurarea absorbanţei este influenţată de:

• lungimea de undă;
• pH-ul probei (substanțe acide sau bazice);
• solventul probei;
• temperatură (în măsură relativ mică).
Influenţa lungimii de undă asupra absorbţiei
- lungimea de undă la care analiții prezintă absorbție maximă,
- curbe de calibrare exacte folosite pentru determinările cantitative

Absorbanţă Absorbanţă

Lungime de undă Concentraţie

Spectrul UV-VIS al codeinei

- la lungimi de undă la care analitul are o absorbanță puternică, curba de calibrare este
abruptă, iar sensibilitatea, definită ca pantă a curbei de calibrare este mare
Influenţa pH-ului asupra absorbţiei

Absorbanta

Lungime de unda (nm)

Spectrul UV al fenilefrinei în soluție de NaOH si HCl 0,1 M

Influenţa solventului asupra absorbţiei

- solventul nu trebuie să absoarbă la lungimea de undă la care se fac măsurătorile

Solvent Cut-off Solvent Cut off

(nm) (nm)
Apă 190 Dietil-eter 210
Acetonitril 190 Dioxan 220
n-Hexan 195 Diclormetan 220
Metanol 205 Cloroform 240
Etanol 210 Benzen 280
Ciclohexan 210 Acetona 330

- solvenții absorb radiații la lungimi de undă mici.

- peste această lungime de undă (cut-off), solvenții sunt transparenţi (nu absorb radiații) pot fi
utilizaţi în spectrofotometrie UV.
 SPECTROMETRIA DE FLUORESCENŢĂ
(Spectrofluorimetria)

M + h M* M* M + h

E Relaxare
vibraţională
S2 Conversie
internă

S1

T1

fluorescenţă

fosforescenţă
S0
 Structura chimică şi fluorescenţa

- compuşii aromatici şi heterociclici cu anumite grupe funcţionale, compuşii

cu legături duble conjugate produc fluorescenţă;

- grupe functionale donoare de e- : - OH, -NH2, -O-CH3 măresc fluorescenţa;

- grupe functionale cu e- de tip : - NO2, -COOH, -CO-R inhibă fluorescenţa;

- fluorescenţa depinde de pH;

- compuşii nefluorescenţi: derivatizare (condensare) cu izocianat de

fluoresceină.
 Relaţia între concentraţie şi intensitatea fluorescenţei

It
rad. care
If
se pierd

I0

Randamentul cuantic de fluorescenţă Φ (valori 0 - 1):

If nr. fotoni  emisi
  Ia  I0  It
I a nr. fotoni  absorbiti
Intensitatea fluorescenţei se poate calcula astfel:
 It 
I f    I a   I 0  I t  I f    I 0 1  
 I0 
 
Io It
A  log sau  10  A I f    I 0 1  10  A
It Io
- pentru soluţii diluate cu care se lucrează în spectrometrie:

1  10  A  A
I f    I0  A A    b  c  I f    I0   b  c

ε - absorbtivitatea molară a analitului

b - grosimea cuvei
c - concentraţia analitului (mol / l)

Φ, ε şi b se reunesc într-o constantă K:

If
I f  K  I0  c c
K  I0
Determinările cantitative: curba de calibrare obţinută pentru patru
concentraţii diferite.

If If

c4

c3

c2

c1

 c

Liniaritatea dintre intensitatea fluorescenţei şi concentraţia

- se lucrează în soluţii diluate

 Aparatura utilizată în spectrometria de fluorescenţă

Sursă UV Monocromator Cuva cu

de excitaţie probă

Monocromator
de emisie

Detector

Sursa UV – lampă de Xe cu arc (fără filament)

Detector – fotomultiplicator sau reţea de fotodiode
- hidrocarburi aromatice policiclice cancerigene;
- metale grele toxice – sub formă de chelaţi ai 8-hidroxichinolinei.
- chinina, adrenalina, hormoni, vitamine, steroizi, teracicline, deriv. antracenici, etc.
 SPECTROMETRIA ÎN IR

IR – apropiat (NIR) 0,75-2,5 μm 13000 – 4000 cm-1

IR – mediu (NaCl) 2,5 – 50 μm 4000 – 200 cm-1

IR - îndepărtat 50 -1000 μm 200 – 10 cm-1

Tranziţii de vibraţie şi de rotaţie:

-vibraţii de întindere simetrice şi asimetrice
-rotaţii în plan sau în afara planului moleculei: de forfecare, de balansare,
de torsiune

- să aibă un moment de dipol sau să poată dobândi o structură de dipol prin

excitaţie cu radiaţii IR
Aparatura în spectrometria IR

- spectrofotometre cu dublu fascicul

Celulă cu
probă

Amplificator Înregistrator
Sursă IR Monocromator Detector

Celulă
referinţă

- sursele de radiaţii utilizate în IR-ul mijlociu:

Lampa Globar: vergea de carbură de Si fixată între doi electrozi, menţinută
la temperaturi înalte de 15000C.
Lampa Nernst: un filament dintr-un amestec de oxizi de zirconiu şi ytriu
încălzit la 20000C.
Filamentul de W încălzit la 30000C.

- monocromatoare: cu prismă sau cu reţea de difracţie, selectează benzi de un domeniu

spectral mult mai îngust

- detectorul este de obicei un termocuplu care măsoară diferenţa de energie dintre

cele două fascicule de radiaţii IR
 Înregistrarea spectrelor IR

1. Metoda prin transmisie detector

sursă

-probe lichide probă

-cuve cu ferestre de NaCl sau AgCl

2. Metoda prin transreflexie

-probe lichide şi semisolide sursă

-suspensii sau emulsii în Nujol probă

detector

3. Metoda prin reflexie difuză detector

sursă
-probe solide
-pastile transparente în amestec cu KBr
probă
Aplicaţii ale Spectrometriei IR în analiza medicamentelor

Identificarea de substanțe active, excipienți și produşi intermediari de

fabricație;

Proprietățile fizice ale probelor solide:

-dimensiunea particulelor, forma cristalină și polimorfismul
-duritatea, comportamentul la dizolvare și modelul de dezintegrare
Absorbanţă Transmitanţă

Lungime de undă Număr de undă

Spectrul UV şi IR al paracetamolului
Spectrele IR conţin două regiuni;
• regiunea de citire a grupelor funcționale (1200 - 3600 cm-1)
• regiunea de amprente (600 - 1200 cm-1)

Spectrul IR al acidului salicilic

Transmitanţă

Număr de undă

- banda de absorbție de la 3220 cm-1 - grupa fenol.

- banda de absorbție la 3050 cm-1, relativ slabă, derivată din legăturile C-H.

- banda de absorbție la 1650 cm-1, puternică, pentru gruparea -C=O din acid

- banda de absorbție la 1140 cm-1, se datorează legăturii C=C din inelul aromatic.