Genul Staphylococcus

Etapele diagnosticului de laborator in infectia cu

Staphylococcus spp.

Stafilococi coagulazo-pozitivi: S. aureus

Stafilococi coagulazo-negativi (SCN) cu importanţă clinică: S. lugdunensis, S.
schleiferi, S. epidermidis, S.haemolyticus, S. saprophyticus. etc
Produse patologice
 portaj: secreţie din cavitatea nazală anterioară, secreţie faringiană, probe de pe
tegumente (zona axilară, perianală)
 plăgi, otite, infecţii tegumentare Þ puroiul (S. aureus)
 infecţii urinare Þ urină (S. saprophyticus, S. aureus)
 infecţii gastro-intestinale, toxiinfecţii alimentare Þ materii fecale, vomismente,
alimente.
 meningite LCR
 septicemie, febră puerperală, sânge pt hemocultura (S. aureus, SCN)
 pneumonie, spută.
 infecţii nosocomiale - S. aureus meticilino-rezistent (MRSA, SARM ),
SCN meticilino-rezistent-(MRS)
S. aureus intermediar vancomicina (VISA)
S. aureus rezistent la vancomicina ( VRSA)

1
Recoltare produs patologic

a)CANTITATE OBSERVATII
PRODUS RECOLTARE b)TRANSPORT RESPECTA PRECAUTIUNILE
UNIVERSALE
Dezinfecteaza cu a) > 1ml, sau Se recomanda recoltarea cu seringa
ABCES alcool etilic 70%, 2 tampoane din sterila prin aspiratie sau biopsie. Daca
betadina. Daca acelasi loc. se recolteaza cu tamponul, este
DESCHIS este necesar iriga b) < 2 h. obligatorie recoltarea a doua tampoane
leziunea cu o din profunzimea leziunii ( 1 tampon
solutie salina non- pentru insamantare si 1 tampon pentru
inhibitorie. frotiul Gram ).
Aspira cu o Mediul de transport Stuart sau Amies.
seringa sterila Evita contaminarea produsului
( de preferat ) sau patologic in momentul recoltarii cu
cu tampon steril, bacterii ce nu sunt implicate in procesul
profund din infectios.
leziune. Sistemul anaerob de transport este
obligatoriu pentru a asigura
supravietuirea bacteriilor anaerobe
implicate in procesul infectios. Sistem
INCHIS Aspira cu o a) > 1 ml anaerob : PRAS transport medium,
seringa sterila. b) < 2 h, sistem Accu- CulShure -oxygen free-swab,
Transfera imediat anaerob de containere fara oxigen pentru biopsiile
aseptic tot transport de tesut.. (vezi anexa nr.3)
materialul intr-un
sistem anaerob. Aceleasi recomandari la recoltare
pentru: vezicule, pustule,plaga, flictene,
furuncule, arsuri, ulcer decubit, fistule,
plaga muscata,etc
Gangrena : se recolteaza si
hemocultura in acelasi timp.

2
Examenul macroscopic: puroi cremos, filamentos, gălbui.
Examenul microscopic direct = frotiu din produsului patologic (pp)
 coloraţia Gram: coci Gram pozitivi, dispuşi în grămezi asemănătoare ciorchinilor
de strugure
 coci Gram pozitivi localizati intra si perileucocitar; prezenta celulelor inflamatorii
este dovada ca s-a recoltat un produs patologic real, de la nivelul procesului
infectios

Gram stain of Staphylococcus aureus in pustular exudate

3
Insamantarea pp
 se insamanteaza in poligon deschis ( fara o latura) – pe medii solide, in scopul
obtinerii coloniilor microbiene izolate: geloza-sange sau Columbia –sange,
mediul Chapman

4
  se insamanteaza si in mediu lichid de imbogatire – BHI

Incubare aerobă la 37°C, 18 – 24 ore.

Identificarea bacteriei:
 Caractere morfotinctoriale: frotiu din cultură pură : coci Gram pozitivi, în
grămezi.
 Caractere de cultură: colonii “S” pigmentate sau nepigmentate ( medii solide)
Medii lichide- tulbura uniform bulionul cu depozit moderat la fundul tubului

5
Producerea de hemolizine – pe geloză-sânge
 hemoliza beta (S. aureus,) datorată hemolizinei alfa
 nu prezintă hemoliză (majoritatea tulpinilor SCN)
Descompunerea manitolului pe mediul Chapman (manito-pozitiv, colonii galbene, S.
aureus)

6
A) Staphylococcus aureus, (B) Staphylococcus epidermidis, and (C) Escherichia
coli streaked on a mannitol salt agar plate. The mannitol fermenting colony
(yellow) is S. aureus, while the mannitol nonfermenting colony (pink) is S.
epidermidis.  The growth of E. coli was inhibited by the high salt concentration.

7
  Caractere biochimice:
Testul catalazei
Diferentiaza coloniile de staphylococ de cele de streptococ.
Deoarece ambele bacterii cresc pe mediu cu sange se recomanda folosirea doar a
varfurilor coloniilor de stafilococ sau streptococ pentru a evita reactii fals pozitive
datorita catalazei eritrocitare(din mediu cu geloza –sange).
Pe o lama de microscop depune 1-2 picaturi de H2O2 , peste picatura de reactiv se adauga
coloniile testate.
Citire si interpretare:
 Test pozitiv-aparitia bulelor de gaz pana la efervescenta
 Test negativ-absenta bulelor

Identificarea Staphylococcus aureus

Se face prin testul coagulazei pe lama , stafilococul auriu fiind producător de coagulază.
Pe o lamă de microscop se pune o picătură de plasmă . În picătură se omogenizează cu
grijă o ansă din cultura pură a bacteriei de identificat. Omogenizarea se continuă
imprimând lamei mişcări de rotaţie.
Citire si interpretare
 Test pozitiv-apariţia de grunji, care lasă picătura limpede înseamnă reacţie
pozitivă.
 Test negativ- amestecul rămâne omogen;Orice reactie negativa se continua cu
testarea coagulazei in tub.

8
 Testul coagulazei in tub -0,5 ml plasma se incubeaza cu 0.5 ml cultura de 24 ore a
tulpinii de testat in bulion glucozat,.la 37 C pentru patru ore.
Citire si interpretare
 Rezultat pozitiv presupune aparitia unui coagul, se poate prelungi incubarea
probei pana la 16-18 ore, daca coagulul nu a aparut in primele patru ore, cu
verificarea periodica a probei
 Rezultat negativ-lipsa coagulului

 coagulaza liberă pozitiv: S. aureus;

 coagulaza liberă negativ: stafilococi coagulazo-negativi (SCN)

9
Identificarea S.aureus -test rapid:
Slidex Staph Plus este un test rapid de latex aglutinare
pentru identificarea Staphylococcus aureus izolat pe mediile de cultura

rezultat negativ, absent S.aureus

1
Fermentează glucoza, manitolul, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid

Truse API de identificare biochimica

Tipizarea bacteriilor: pentru identificarea sursei de infecţie, compararea tulpinilor

izolate
 prin lizotipie (determinarea sensibilităţii stafilococului faţă de bacteriofagi;)
 prin metode de biologie moleculară
Antibiograma – testeaza sensibilitatea tulpinilor izolate
Mediul Muller Hinton, inocul 0.5 McFarland, temp 35 C, incubare 18 pana la 24 ore
Alegerea discurilor pentru testarea sensibilitatii prin metoda difuzimetrica, interpretarea
rezultatelor conform Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;
CLSI /2009( anterior numit NCCLS)

1
antibiograma E-TEST
pentru tulpinile cu inalta rezistenta la antibiotice

Modul de desfasurare a lucrarii practice

studentii primesc manuscrisul cu „etapele diagnosticului de laborator in
infectia cu Staphylococcus spp.
1. Lp se desfasoara interactiv- se discuta pe marginea manuscrisului primit
anterior LP-ului
2. Fiecare student efectueaza reactia catalazei
3. material demonstrativ- lucreaza doar asistentul -testul slidex Staph Plus

1
 4. material demonstrativ-medii de cultura-Columbia-sange -colonii de
S. aureus, studentii recunosc coloniile de tip S, recunosc coloniile beta
hemolitice si non-hemolitice
5. material demonstrativ-trusa API pentru identificarea biochimica
6. antibiograma S.aureus, studentii masoara diametrele si noteaza in caiet,
interpretare conform CLSI/2009, Staphylococcus spp.
7. Fiecare student prinde imaginea la microscop si examineaza frotiuri :coci
Gram pozitivi in gramezi

Bibliografie
 Bacteriologie Medicala, Olga Dorobat, editura UTM, 2006
 Clinical Microbiology Procedures Handbook, Henry D. Isenberg, editata
American Society for Microbiology, 2004
 Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology , Washington
C Winn, Stephen D. Allen, Gail L. Woods, William M. Janda, Paul C.
Schreckenberger , editura Lippincott Williams & Wilkins, 2005
Manual of Clinical Microbiology , Patrick R. Murray ,
Ellen Jo Baron , Michael A. Pfaller , Fred C. Tenover , Robert H. Yolken, editura
ASM, 2007
● Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing”.M 100, S19

CLSI /2009