Microscopul optic compus

Microscoapele optice compuse sunt utilizate în multe tipuri de examinări medico-legale/criminalistice. Stereomicroscopul discutat în Lucrarea de laborator 2
este utilizat pentru examinările care cer mărire mai mică in timp ce microscopul optic compus este în general, utilizat pentru a obţine o mărire mai mare a
obiectelor. Ca si stereomicroscopul, microscopul optic compus foloseste o combinatie de lentile pentru a produce o imagine mărită. Pentru a realiza acest
lucru, microscopul are mai multe componente, care colectează lumina şi redirecţionează traseul razelor luminoase astfel încât se obţine o imagine mărita a
obiectului. Un microscop optic compus are următoarele componente de bază:
-sursă de lumină
-condensor
-măsuţă cu proba/platformă
-obiectiv
-dispozitive de reglare si aliniere
-oculare

Practic, lumina ce provine de la o lampă de iluminare este colimată de condensator. Lumina apoi interacţionează cu proba (care este plasată pe măsuţa cu
proba/platformă) şi este colectată de obiectiv. Obiectivul re-focalizează imaginea in planul focal obiect al ocularului.. Ocularele primesc această imagine
intermediară şi o re-focalizează pe ochiul privitorului.

Microscoapele optice compuse au o mărire mai mare comparativ cu stereomicroscoapele. Ocularele şi obiectivele cu care sunt dotate oferă o mărire totale în
intervalul de 40X la 400X. La măriri mari se obţine un câmp vizual mai mic şi o adancime a campului mai mică. Probele sunt vizualizate cu lumină transmisă.

Microscoapele optice compuse sunt utilizate pentru identificarea şi caracterizarea diverselor probe. Nivelul mai ridicat de
mărire permite vizualizarea unor caracteristici ale eşantioanelor care nu sunt viziibile la examinarea cu stereomiocroscopul. O analiză suplimentară de probe
poate fi, de asemenea, efectuată cu microscoape şi / sau instrumentele suplimentare.

Familiarizarea cu Microscopul Optic Compus

OBIECTIVE
La finalizarea acestui exercitiu studentul va dezvolta o înţelegere de bază privind:
1. componentele unui microscop optic compus
2. utilizarea microscopului optic compus
3. apertura numerică
4. puterea de rezoluţie
5. centrarea obiectivelor
6. sistemul de iluminare Kohler

INTRODUCERE
Aşa cum s-a văzut in lucrarea precedentă referitoare la stereomicroscop, un microscop este un instrument optic care foloseste o combinatie de lentile pentru a
produce o imagine mărită a obiectelor mici. Pentru a realiza acest lucru, un microscop optic compus foloseşte mai multe componente, care colecteazaă lumina
şi redirecţionează razele acesteia obţinandu-se astfel o imagine mărita a obiectului. Un microscop optic compus este prezentată în figura 2A-1 şi are
următoarele componente de bază:
-sursa de lumină
-condensator
-etapa probă
-obiectiv
-dispozitive de porţiuni de sprijin şi aliniere
-Oculariele

Practic, lumina provine de la lampa de iluminare şi este colimată de condensator. Lumina apoi interacţionează cu proba (care este plasată pe măsuţa cu
proba/platformă) şi este colectată de obiectiv. Obiectivul re-focalizează imaginea in planul focal obiect al ocularului. Ocularele primesc această imagine
intermediară şi o re-focalizează pe ochiul privitorului. Cele patru puncte de focalizare sunt: diafragma de câmp, planul probei, planul focal obiect al ocularului
şi nivelul retinei a ochiului. Aceste componente sunt montate intr-un sistem ce permite o mare precizie de centrare şi aliniere.

Microscopul optic compus este folosit in diverse aplicatii medico-legale. În general, probele de observat pot fi subţiate si in felul acesta lumina este transmisă
prin probe, focalizata de obiectiv si apoi de oculare. Microscopul optic compus este în general utilizat la măriri totale în intervalul de 40X - 400X si este folosit
pentru a obţine informaţii morfologice despre un eşantion/probă. Aspectul vizual al probei si detaliile morfologice pot fi examinate datorită măririi mai mari ale
microscopului optic compus. De o importanţă similară este capacitatea de a obţine informaţii analitice: culoarea şi grosimea etc. care ajuta la identificarea de
probe necunoscute. Mai multi factori intra in joc atunci când se utilizează un microscop compus.

1
 Figure 2A-1 mersul razelor de lumină intr-un microscop optic compus

Apertura numerica este o măsură numerică a capacităţii unui obiectiv (sau a unei lentile-in general) de a rezolva detaliile fine ale probei. Apertura numerica
este legată de deschiderea unghiulară a fascicolului ce intră in obiectiv de următoarea formulă:

   (2A-1)

în care
- NA este apertura numerica
-n este indicele de refracţie al spaţiului dintre lamela de acoperire si obiectiv (obiectul se află plasat intre lama de sticlă si lamela de acoperire)
-A este deschiderea unghiulară (unghiul format de razele de lumina periferice, care pot fi colectate de către obiectiv).

Rezoluţia unui microscop se defineşte ca fiind cea mai mică distanţă dintre două puncte ale unei probe/eşantion care pot fi vizualizate ca două puncte
separate. Apertura numerica determină puterea de rezoluţie a unui obiectiv: cu cat este mai amre de apertura numerică cu atât mai mare este rezoluţia.

Lentile care au distanţa focală mică (mărire mai mare) au o mai mare deschidere unghiulară, o mai mare apertură numerică si in consecinţă o rezolutie mai
mare

O mărire şi o rezoluţie bună sunt importante pentru realizarea unui microscop bun. Totuşi sunt cazuri in care deşi partea optică a unui microscop sunt de
calitate, iluminare sa nu fie corectă. O iluminarea corectă presupune o distribuţie uniformă iluminarii obiectului pe întregul câmp de vizualizare. De asemenea,
permite controlul intensităţii luminoase, al dimensiunii acmpului iluminat precum şi a aperturii unghiulare a a conului de iluminare. Diafragma de apertură
(aflată sub masuţa cu obiectul) este utilizată pentru a controla intensitatea luminii.

Filtre neutre şi un transformator de tensiune variabila ce alimentează sursa de lumina pot controla, de asemenea, intensitatea luminii. Cu toate acestea,
metoda cea de a doua afectează culoarea luminii. Diafragma câmp poate controla dimensiunea campului luminos si diafragma de sub masuţa probei poate
controla apertura unghiulară

Iluminarea este, în general, realizată cu ajutorul a trei tehnici: Nelsonian, Kohler, şi Difuză. Cele mai multe laboratoare criminalistice utilizează metoda Kohler
sau Kohler modificată. Această tehnică se bazează pe poziţionare şi alinierea diferitelor componente optice în microscop, cum ar fi condensorul de langa
lampa de iluminat, condensorul de langă măsuta cu proba/pltaforma, obiective, oculare, şi sursa de lumina, pentru a produce două seturi de imagini conjugate.

2
O imagine se observă ortoscopic (fără lentile Bertrand) şi cealaltă conoscopic (cu obiectiv Bertrand). În primul caz, diafragma de câmp, proba şi planul focal
obiect al ocularului sunt focalizate şi centrate pe axa microscopului. An al doilea caz (conoscopic), filamentul becului lampei de iluminat, diafragma de apertura
de sub masuţa probei, planul focal imagine al obiectivului şi planul focal al ocularului sunt sunt focalizate şi centrate pe axa microscopului. Multe microscoape
moderne sunt echipate cu difuzoare de lumină, din sticlă, astfel încât la unele microscoape iluminarea Kohler adevărată nu poate fi obţinută. Iluminarea de tip
Kohler sau Kohler modificată produce o iluminare uniformă a campului vizual care permite examinatorului să utilizeze microscopul la potenţialul său maxim.
MASURI DE SIGURANŢĂ
Utilizaţi procedurile standard de protecttia muncii asa cum au fost descrise in primul laborator. Fiţi prudenti cu nivelul de iluminare al microscopului
microscop, pentru a evita leziunile oculare

PARTEA I: Părţile componente ale microscopului compus

Scrieţi numele părţii componente in dreptul numelui corespunzator. În spaţiul de mai jos scrieţi o singură frază care explică funcţia fiecărei părţi componente in
parte.

3
 Figure 2A-2 Photograph of a DMEcompound light microscope.

PARTEA II: MODUL DE OPERARE CU MICROSCOPUL OPTIC COMPUS

Familiarizaţi-vă cu microscopul compus. Localizati fiecare parte a microscopului. Plasaţi un lama cu un preparat preparat/probă pe masuţa obiectului. După
pornirea sursei de lumină reglaţi ocularele pentru a regla distanţa interpupilară, astfel încât atunci când vizionează un obiect, imaginea din dreapta şi din
stânga să fuzionez intr-una singura.
2. Ajustaţi focalizarea sus şi în jos. Utilizand ocularul non-reglabil, obţineţi imaginea clară a probei
3. Focalizaţi privind prin ocularul celălalt (dacă este necesar).
4. Focalizaţi imaginea utilizand diverse măriri pentru a deveni familiar cu gama de măriri .Încercaţi să păstraţi ambii ochi deschisi.
5. Calculaţi mărirea totală maximă şi minimă a microscopulu.
Mărire totală minimă= ….
Mărirea totală maximă=….

PARTEA III: CENTRAREA OBIECTIVELOR

1. Plasaţi o probă (una cu aspect granular e cea mai bună) şi focalizaţi imaginea utilizand obiectivul cu mărirea cea mai mică.
2. Plasaţi proba astfel încât o particulă a acesteia să fie situată în centrul câmpului vizual.
3. Rotitii măsuţa CARE?????. Particula centrată anterior trebuie să rămână în acelaşi loc. În cazul în care se mişcă foarte mult sau iese se impune centrarea
obiectivului.
4. Pentru a centra obiectivul, rotiţi particula focalizată anterior acordand atenţie traseului acesteia in timp ce MASUŢA CARE? este rotită. Observaţi când
particula este la cea mai mare distanta din centrul câmpului vizyal. Rotiţi proba astfel incat particula să fie în acea locaţie.
5. Mutaţi locaţia particule vizualizate, prin ajustarea şuruburilor de centrarea situate pe obiectiv, până ce particula este aproximativ la jumătatea distantei dintre
locaţia originală şi centrul campului vizual.
6. Pentru a verifica noua centrare a obiectivului mutaţi proba montat astfel incat particula să fie in centrul câmpului vizual. Rotitii măsuţa CARE? şi notaţi
traseul particulei.
Continuaţi cu paşii 4 şi 5 până ce particula rămâne centrată atunci când se rotieşte masuţa CARE?
7. Se centreaza astfel toate obiectivele microscopului.

PARTEA IV: Reglarea iluminării Kohler

1. Se plaseaza o probă pe masuţa obiectului şi se focalizează imaginea folosind obiectivul 10X.
2. Se inchide diafragma de camp. Se poate inhide si diafragma de apertura pentru o mai buna vizualizare a diafragmei de camp.
Marginile a diafragmei de camp vor fi, foarte pobabil, neclare.
Se reglează pozitia condensorului (SUS – JOS) de sub masuţa obiectului pană cand marginile diafragmei de camp sunt focalizate clar.
3. Se centrează diafragma de apertură prin rotirea şuruburilor de centrare ale condensorului de sub măsuţa cu proba/platforma.
4. Deschideţi diafragma de câmp până când acesta este ajunge puţin în afara câmpului de vedere.
5. În cazul în care microscopul are un difuzor de sticla reglarea iluminării Kohler este terminată şi se trece la pasul 6. Dacă nu există nici un difuzor sau acesta
poate fi îndepărtat, continuaţi cu paşii următori.
a) Introduceti lentile Bertrand. Dacă nu există nici un obiectiv Bertrand, scoateţi unul din ocular. Acest lucru permite vizualizarea imaginii filamentului lămpii.
b) Focalizaţi si centraţi filamentului lămpii folosind butoanele de reglare.
c) Scoateţi lentilele Bertrand (sau reintroduceţi ocularul).
6. Reglaţi contrastul şi rezoluţia prin reglarea aperturii condensorului (reglarea aperturii = deschiderea sau inchiderea diafragmei de apertura) de sub măsuţa
cu proba/platforma În mod normal, aceasta este aproximativ 70-80% deschisă.
7. Reglarea iluminării Kohler trebuie efectuată pentru fiecare mărire (adica ptr orice obictiv de oice marire).

PARTEA V: Vizualizarea probelor/eşantioanelor cu microscopul optic compus:

1. Vizualizaţi cinci din următoarele: seminţe, fire de păr, părţi de insecte, paie, bumbac, sare de masă, şi rumeguş. Utilizaţi măriri diferite pentru a deveni
familiarizaţi cu microscopul. Selectaţi măriri care minimizează spaţiul alb din campul vizual dar care vă permit să vedeţi o parte semnificativă a probei.

CERINŢE PENTRU RAPORT:

Includeţi toate desenele, calculele, sau alte informaţii obţinute pe parcursul procedurii de laborator. Notiţele şi / sau desenele ar trebui să includă identificarea
eşantionului, mărirea utilizată şi un sistem complet descriere.

ÎNTREBĂRI (pentru raport)

4
1. Care sunt cele şase componente de bază ale unui microscop compus? Ce funcţie are fiecare
componentă într-un microscop compus?
2. Explicaţi optica utilizată într-un microscop optic compus.
3. Care sunt cele patru puncte de focalizare intr-un microscop optic compus?
4. Numiţi trei tipuri de probe care ar putea fi examinate cu un microscop compus. In ce ar consta examinarea.
5. Ce tipuri de probe nu pot fi examinate cu microscopul optic compus? De ce?
6. Care sunt cele două principalele beneficii ale microscopului optic compus?
7. Ce este apertura numerica?
8. Care este cel mai important factor in determinarea puterii de rezoluţie a unui microscop?
9. Descrieţi Iluminarea Kohler.

Experiment 2B: Măsurători Utilizand micrometrul ocular

OBIECTIVE
La finalizarea acestui exerciţiu practic, studentul va s-au dezvoltat o înţelegere de bază referitoare la:
1. calibrarea scarii micrometrului ocular
2. măsurători cu scara micrometrului ocular

INTRODUCERE
Evaluarea dimensiunilor unui eşantion/probă poate fi, de asemenea, o parte importantă a unui examen. Distantele liniare foarte mici pot fi măsurate cu precizie
cu ajutorul microscopului optic compus. Pentru a determina mărimea eşantionului/probei se introduc scari gradate (micrometre ocular) in interiorul ocularelor.
Astfel, ocularul are o scară mică transparentă (micrometru ocular) care este suprapusă pe imaginea obţinuta prin microscop. Această scară este arbitrară şi
prin urmare trebuie să fie calibrată pentru fiecare obiectiv. Calibrarea necesită o a doua scară gradată care sa fie pusa in locul probei (micrometru obiectiv).
Deşi există mai multe tipuri de micrometre obiectiv, cel mai comun este unul cel care are diviziunea de 0.01mm (consta dintr o scara gradata- rigla- cu
lungimea de 1 mm si impartita in 100 de diviziuni). Unitatea de lungime utilizată pentru măsurări la microscop este micrometrul (μm), deci în acest caz, fiecare
diviziune echivalează cu 10 micrometri.

1 μm = 10−6 meters
1mm = 10−3 meters
1mm = 1000 μm
1 μm = 1/1000 mm = 0.001 mm
10 μm = 10/1000 mm =1/100 mm= 0.01 mm

Pentru a calibra scala ocularului (micrometrul ocular), micrometrul obiectiv este plasat pe măsuţa cu proba/platformă astfel încât cele două scări sa fie paralele
si uşor depărtate una de alta, aşa cum este ilustrat în figura 2B-1. Aliniaţi cele două scări astfel incat să existe două linii de divizare care sunt in prelungire pe
cele doua scări (figura 2B-1). Numărul de diviziuni dintre aceste două linii este apoi luat numărat pentru ambele scări.

5
Figura 2B-1 Calibrarea scării ocularului (micrometrului ocular) folosind un micrometru obiectiv cu diviziuni de 0,01 mm. (pot exista diverse tipuri de scări iar
undele din ele nu au numere trecute pe ele).

!!! - Din motive de acurateţe cel mai bine este să alegeţi două poziţii cat mai departe una de alta - !!!. Deoarece scara micrometrului obiectiv este măsurată în
mm, această valoare trebuie să fie transformate în micrometri. În figura 2B-1 sunt 35 diviziuni între liniile 39 şi 74.
Numărul de micrometri este calculat apoi aşa cum se arată în următoarea ecuaţie:

Factorul de calibrare pentru scara ocularului (micrometrul ocular) este apoi determinată prin împărţirea numărului de diviziuni ale micrometrului obiectiv la
numărul de diviziuni de pa scara ocularului:

Acest lucru înseamnă că, atunci când scara ocularului (micrometrul ocular) este utilizată cu acest obiectiv, fiecare diviziune a
scării ocular este echivalentă la 12,5 micrometri. Se pot face acum măsurători precise de probe. De exemplu, o particulă observată cu acest obiectiv care
măsoară 8.5 diviziuni pe scara ocularului (div-oc) are dimensiunea de 8,5 x 12,5 μm/div-oc = 106.3 μm în diametru.
Această etalonare se aplică numai la acest obiectiv!. Dacă se schimbă obiectivul (cu unul de altă mărire), sau lungimea tubului microscopului sau orice altă
parte a sistemului de mărire a microscopului etalonarea trebuie refăcută.
Precizia măsurării depinde de recunoaşterea marginii particulei măsurate mai ales atunci când observăm imagini care pot fi uşor defocalizate. De asemenea
precizia depinde si de introduse de tipul şi calitatea sistemului de iluminare, precum şi erorile sistemului optic în sine.
Eroarea va fi minimizată dacă mărirea sistemului optic este suficientă de mare astfel incat particula măsurată să cuprindă cel puţin zece diviziuni de pe scara
ocular (micrometrul ocular). In aceste condiţii, marginea particulei poate fi estimată cu o precizie de ± 0,25 diviziuni-ocular (div-oc). Prin urmare, indicele de
eroare global de măsurare luand în considerare cele două laturi ale particulelor ar putea fi ± 0,5 divizuni sau 10% (pentru particulă ce cuprinde zece diviziuni).
Eroarea depinde, desigur, de mărimea particulei şi creşte rapid pe măsură ce dimensiunea acesteia scade la ordinul micrometrilor. Limita inferioară practică
pană la care se poate determina mărimea particulelor cu microscop optic este de aproximativ 0,5 μm.

Echipamente
• microscop optic compus cu obiectivele de măriri diferite (de exemplu, 4X, 10X, 20X, 40X)
•scara ocular
micrometru obiectiv (divixiuni de 0.01mm)

MĂSURI DE SIGURANŢĂ
Utilizaţi procedurile standard de laborator de protecţia muncii aşa cum sunt descrise în liniile directoare stabilite de către instructorul dumneavoastră. Fiţi
prudent cu nivelul de iluminare microscop pentru a evita deteriorarea ochilor. Fiţi conştienţi de măsurile de precauţie corespunzătoare, stabilite de instructor.
Aruncaţi sticla spartă într-un recipient adecvat.

PARTEA I: CALIBRAREA micrometrului ocular

Procedeu
1. După pornirea sursei de lumină, reglaţi microscopul pentru a obţine Iluminarea Kohler.
2. Folosind cea mai mică mărire, plasaţi un micrometru obiectiv pe platformă/măsuţa cu proba şi aduceţi scara în centrul campului vizual
3. Ajustaţi focalizarea micrometrului ocular, astfel încât ambele scări să poată fi vizualizate.
4. aliniaţi cele două scări astfel incat sa fie paralele si uşor depărtate una de alta. Acest lucru face mai uşor de citit valorile.
5. Selectaţi două locaţii pe fiecare scară care sunt in prelungire pe ambele scări. Este cel mai bine este să alegeţi o locaţie pe partea stangă a câmpului vizual
şi una pe partea dreaptă a câmpului vizual.
6. Număraţi diviziunile de pe micrometrul obiectiv intre cele doua diviziuni aliniate.
7. Număraţi diviziunile de pe scara ocular intre cele doua diviziuni aliniate
8. Fiecare micrometru ocular are o scară de 1mm subdivizată în 100 diviziuni, ceea ce face fiecare diviziune de 0.01mm sau 10 micrometri. Se calculează
factorul de calibrare pentru diviziunile de pe scara ocular pentru acest obiectiv.
9. Repetaţi paşii 2-5 pentru a calibra micrometrul ocular (scara ocular) pentru al doilea obiectiv. Rezultatele pot fi trecute intr-un tabel.

6
PARTEA II: MĂSURĂTORI UTILIZAND MICROMETRUL OCULAR CALIBRAT

Procedeu
1. se va utiliza un micrometru ocular calibrat pentru doua obiective cu măriri diferite pentru a determina diametrul unei fibre.
2. Utilizarand primul obiectiv măsuraţi diametrul fibrei in diviziuni pe micrometrul ocular. Efectuaţi patru citiri in patru puncte diferite ale fibrei. Focalizaţi
miaginea pentru a obţine marginea firului/fibrei clară. Convertiţi diviziunile citite in micrometri prin inmulţirea cu factorul de calibrare adecvat pentru primul
obiectiv.
3. Repetati aceasta masura cu al doilea obiectiv. Se obţine acelaşi diametru?
4. Selectaţi un obiectiv şi o mărire a microscopului care furnizează detalii maxime. (nu neaparat obiectivele cu care s a făcut calibrarea). Desenaţi ceea ce
vedeţi.

CERINŢE PENTRU RAPORT

Includeţi toate desenele, calculele sau alte informaţii obţinute pe parcursul procedurii de laborator. Notiţele şi / sau desenele trebuie să includă identificarea
eşantionului, mărirea utilizată şi o descriere.

ÎNTREBĂRI pentru RAPORT

1. Ce este un micrometru obiectiv? Cum se utilizează?
2. Ce este un micrometru ocular? Cum se utilizează?
3. De ce este neceşar să determinăm factorul de calibrare pentru fiecare obiectiv?
4. În cazul în care factorul de calibrare este 17.3 μm / div-oc pentru un obiectiv 10X, cum aţi estima factorul de calibrare pentru un obiectiv 20X?
5. În cazul în care micrometrul obiectiv a avut o etichetă pe care scria 0.05mm pe diviziune
şi dacă 17 div-ob au sunt echivalente cu 41 div-oc cat este factorul de calibrare exprimat in μm/div-oc ?
Dacă o particulă polen a are un diametrul de 2 div-oc cat este diametrul ei in micrometri? Prezentaţi şi calculele in raport.
6. Notaţi care a fost factorul de calibrare pentru fiecare obiectiv din partea I pentru că veţi continua să folosiţi aceasta calibrare şi la alte lucrări de laborator.